JP2006340651A - Ｒｎａの調整方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
プローブ結合部位から５’末端までの長さが一律であり、アレイ上のプローブとより安定なハイブリッド体を形成するＲＮＡの調整方法を提供する。
【解決手段】
ｃＲＮＡを合成した後、ｃＲＮＡが有するポリＵ塩基配列を除去することでポリＵ塩基配列を持たないｃＲＮＡを調整する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ＲＮＡを調整する方法に関する。本発明で調整されたＲＮＡは、疾病関連遺伝子などのプローブが固相上に固定されたＤＮＡマイクロアレイの検体としても使用可能である。

ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子との関係が次々と調べられている。そして、遺伝子の有無やその存在量(発現量)を知ることで、例えば病気などのより詳細な特徴やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることが分かってきており、網羅的な発現解析によって疾病遺伝子を同定する研究が行われている。網羅的な解析を行う手段としては、近年ＤＮＡチップ(またはＤＮＡマイクロアレイともいう。以下同じ)が用いられるようになっている。ＤＮＡチップとは、ガラス等の固相上に高密度に多数の核酸配列を固定したものであり、検出対象とする遺伝子に特異的な配列(プローブ）を配置しておくことにより、一度に１万以上の遺伝子について調べることができる。ＤＮＡチップに、異なった検体をハイブリダイゼーションさせ、各検体に存在するそれぞれの遺伝子発現量を比較して、高発現あるいは低発現の遺伝子を分類することにより、膨大な遺伝子の中から機能や疾病などと関連した遺伝子を抽出することができる。ＤＮＡチップは遺伝子発現解析だけでなく、病気の診断、創薬等種々の領域において重要な役割を果たすことが期待されている。

ＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせる検体はＤＮＡやＲＮＡが用いられるが、血液や培養細胞からの抽出量だけでは十分な感度が得られないことが多い。そのため、ＤＮＡチップで検出する前に検体を増幅するのが一般的である。増幅方法によっては対象とする配列ごとに増幅効率が異なることがあり、増幅後に発現プロファイルが歪んだ結果、実際の状況を反映しない場合がある。しかし遺伝子の発現解析ではもとの発現プロファイルを保ったまま検体を増幅できることが望ましい。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法(ＩＶＴ法)は、遺伝子の発現プロファイルを保ったまま検体を増幅することができる手法である。ＩＶＴ法の増幅効率は１００倍程度で、ＰＣＲ(ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法より劣るものの、遺伝子の発現プロファイルを保ったまま増幅できるため、マイクロアレイで遺伝子発現量を定量する際の検体処理方法はＩＶＴ法が用いられることが多い。（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。

細胞などの生体試料をＩＶＴ法で調整する際、通常は次の手順で行われる。トータルＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列が付加されたプライマーを用いて逆転写反応により一本鎖のｃＤＮＡを合成する。その後ＤＮＡ合成酵素によって相補鎖を合成し、二本鎖のｃＤＮＡを合成する。二本鎖ｃＤＮＡに対し、ＲＮＡポリメラーゼで転写反応を行うことによって、ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列を始点としてｃＤＮＡからＲＮＡ(ｃＲＮＡ）の合成が行われる。材料となるリボ核酸が存在し酵素が活性を維持している範囲内では、ｃＤＮＡからＲＮＡが合成され続けるので、最終的には１分子のＤＮＡから約１００分子のＲＮＡが生成する。このｃＲＮＡ合成時に標識ヌクレオチドを添加して標識ｃＲＮＡを合成すれば、マイクロアレイの検体として用いることができる。

ところで、多くのマイクロアレイは、プローブの５’末端に導入された物質を介して固相上に固定されている。従って、プローブとハイブリッド体を形成するｃＤＮＡのうち、ハイブリッド部位より３’末端側は固相側、５’末端側は液相側に存在する。ハイブリッド部位から５’末端までの長さが長くなるほど、ハイブリッド体の安定性が低くなることが報告されている(例えば、非特許文献３参照。)。

逆転写の際に一般的に用いられるＴ７−ｏｌｉｇｏ (ｄＴ)２４ プライマーはＴが２４塩基連続する配列を有しているが、ポリＡテイルの長さが２５塩基以上である場合、どの部分に結合するか確定できないため、合成後のｃＤＮＡのポリＴ塩基配列長は一律ではない。従って、このｃＤＮＡを鋳型として合成されるｃＲＮＡの５’末端のポリＵ塩基配列も一律の長さにはならない。

従来のＩＶＴ法でｃＲＮＡを合成した場合、５’末端側のポリＵ塩基配列長が一律にならないため、同じ細胞に由来するサンプルであっても、ポリＵ配列が長い場合には輝度が低くなったり、ハイブリッド体の安定性が一定しないという課題が生じる。ランダムに断片化したｃＲＮＡを検体として用いている場合もあるが、断片化しても５’末端側の長さは一律にはならず、ハイブリッド体の安定性には課題が残る。

この課題を解決するために、例えば特許文献１には、３'末端に混合塩基を有するＴ７−ｏｌｉｇｏ (ｄＴ)２４プライマーを用いてｃＤＮＡ増幅する方法が開示されている。しかし、該方法では増幅中のｃＤＮＡ合成段階においてハイブリダイズ可能な場所の条件を厳しくするものであり、条件によっては正確な増幅が行われない場合がある。
「Gene Chip プロトコール」 Affymetrix社 「CodeLink Expression Bioarray System」 Amersham Bioscience社 監修 高木利久、編集 東京大学理学部生物情報科学学部教育特別プログラム「東京大学 バイオインフォマティクス集中講義」 羊土社 特開２００２−６５２６３号公報

本発明は以上の点に着目してなされたもので、より好適なＲＮＡの調整方法を提供するものである。また、本発明はプローブ結合部位から５’末端までの長さが一律であり、アレイ上のプローブとより安定なハイブリッド体を形成するＲＮＡの調整方法を提供するものである。

本発明は、従来の方法によってｃＲＮＡを合成した後、ｃＲＮＡが有するポリＵ塩基配列を除去することでポリＵ塩基配列を持たないｃＲＮＡを調整するよう考案したものである。本発明によって調整されたｃＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイに供した場合に、ｃＲＮＡとプローブとが形成するハイブリッド体の安定性を高める効果がある。

本発明によるｃＲＮＡ調整方法は、任意の長鎖のポリＵ塩基配列を有するｃＲＮＡに対して、ポリＡオリゴヌクレオチドをｃＲＮＡにアニールさせてＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド体を形成するステップと、ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド体を含む前記ｃＲＮＡからＲＮＡ−ＤＮＡ結合部分のＲＮＡを除去するステップとを有することを特徴とする。

ＲＮＡ分解酵素の中には、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体を形成しているＲＮＡだけを特異的に分解する性質を持つものが存在する。このような性質をもつＲＮＡ分解酵素を用いれば、ｃＲＮＡ末端のポリＵ配列に相補的なＤＮＡプライマー(以下、ポリＡプライマーと記載)をアニールさせた後、ポリＵ塩基配列のみ切断することが可能である。長いポリＵ塩基配列を有するｃＲＮＡの場合、ポリＡプライマーはポリＵ塩基配列中にランダムにアニールする。そして必ずしもポリＵ塩基配列の３’末端にアニールするとは限らないため、上記ＲＮＡ分解酵素による切断後でも短いポリＵ塩基配列を有したｃＲＮＡが残存する可能性がある。

これを回避しポリＵ塩基配列の３’末端にプライマーを結合させるためには、５’末端にＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ｔ（チミジン）のいずれかの塩基が付加されたポリＡプライマー用いることが好ましい。ｃＲＮＡの塩基配列においてポリＵ塩基配列終末の３’末側の隣接塩基は必ずＧ、ＣまたはＡ（アデニン）のいずれかである。５’末端にＧ、ＣまたはＴを有するポリＡプライマーをそれぞれ等濃度混合させたものをｃＲＮＡのアニールステップに用い、ＲＮａｓｅＨ処理を行えばポリＵ塩基配列を完全に除去できる。

また、プライマーのポリＡプライマーの長さは１５ｍｅｒから４０ｍｅｒに設定する。遺伝子特異的配列の中にはＡやＴが連続して１１塩基並ぶものもあり、ポリＡ塩基配列長が１０以下ではその部分でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体を形成し、ｃＲＮＡの末端以外の部分まで切断する場合がある。逆にポリＡ塩基配列長が極端に長い場合、ＤＮＡ融解温度(Ｔｍ値)の上昇によってプライマー５’末端のＧ、ＣまたはＴがポリＡ塩基配列にミスマッチし、結果としてポリＵ塩基配列は十分に除去されない可能性が高い。このため、ポリＡ塩基配列の適切な長さとして１５ｍｅｒから４０ｍｅｒを選択する。

またこの調整方法を用いて調製したｃＲＮＡは、固相上のプローブとハイブリダイゼーションした時の安定性が高い。ｃＲＮＡを調整した後、このｃＲＮＡをマイクロアレイ上のプローブにハイブリダイゼーションさせ、特定の核酸を標識している化合物の蛍光量を測定することで、ｃＲＮＡのハイブリダイゼーション量を定量する。ハイブリダイゼーションした量を測定するには、ポリＵ塩基配列除去後のｃＲＮＡを形成する塩基のうち少なくとも一塩基は蛍光標識されている必要がある。本発明は、核酸の標識方法が合成時の取り込み式であれば標識物質の種類を限定しない。

本発明に係る方法で調整したｃＲＮＡは、発現解析用の検体としてＤＮＡマイクロアレイに用いることができる。この方法で調整したｃＲＮＡをマイクロアレイに用いれば、固相上のプローブとｃＲＮＡが形成するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体の安定性が向上し、再現性および精度の高い結果を得ることが可能である。

また、増幅されたｃＲＮＡに対してポリＵの除去が行われるため、増幅条件等に影響を与えることがない。すなわち、より精度の高い結果を得ることができる。

以下、本発明について詳しく説明するが、いずれの記述も本発明内容を好適に実施するための一例であり、本発明によるほかの実施形態を制限するものではない。

本発明により提供されるｃＲＮＡ調整方法は、ｃＲＮＡの５’末端に存在するポリＵ塩基配列とポリＡプライマーをアニールさせ、上記ＲＮＡ分解酵素を用いてＤＮＡ−ＲＮＡ結合部位を除去することによって実施される。このポリＡプライマーの５’末端はＧ，Ｃ，Ｔの何れかの塩基を有し、ｃＲＮＡのポリＡ塩基配列の３’末端隣接塩基を始点として結合することで、ｃＲＮＡのポリＵ塩基配列を確実に除去する。

図１と図２に本発明の実施の形態を示した。

Ａのみの配列を持つプライマーをｃＲＮＡのポリＵ塩基配列にアニールさせると、どの部分から伸長反応が始まるか確定できないため、合成後のｃＲＮＡのポリＵ塩基配列長は一律にならない。ここで５’末端にはＧ、ＣまたはＴが付加されているポリＡプライマーを用いると、ポリＵ塩基配列の３’末を始点としてポリＡプライマーをアニールさせることができる(図１)。ＲＮＡ分解酵素の一つであるＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡの中でもＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体を形成しているＲＮＡだけを特異的に分解する性質をもつ。図２は、上記ＲＮＡ分解酵素を用いて、ポリＡプライマーにアニールしたポリＵ塩基配列を３’末端から完全に除去した状態を示す。

本発明の調整方法で調製されたｃＲＮＡは、マイクロアレイに供するのに有効である。マイクロアレイに用いる際には予め核酸を標識しておく必要があり、ｃＲＮＡ合成時に標識を行うことが望ましい。標識物質には蛍光物質等を用いる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ(アマシャムバイオサイエンス社製)は核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において好適に用いられる。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（モレキュラープローブ社製）もＣｙＤｙｅ同様、本発明において好適に用いられる。また、ビオチン、アミノアリル等も本発明の核酸標識には有効である。ビオチンはＣｙ３に比べて分子の大きさが小さいので、ＩＶＴの際の立体障害は比較的少ない。ビオチン自体は蛍光を発さないが、ビオチン標識されたｃＲＮＡをマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせた後、ストレプトアビジンで標識された蛍光色素と反応させると、ｃＲＮＡがハイブリダイゼーションしたスポットのみ蛍光検出することができる。

標識されるリボヌクレオチドとしては、ウラシルが一般に良く用いられ、対応する標識試薬も多く市販されており、本発明はそれを好適に用いることができる。

本発明の検体調整方法により調整されたターゲット核酸は、固相上あるいは固相表面に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによって２本鎖を形成させ、標識物質のシグナルを測定することによって高感度に検出することができる。固相ハイブリダイゼーションを利用した高感度な検出デバイスとしては、様々な物質、形態が知られているが、本発明は制限なく適用可能である。このうち、ガラス基板に核酸を固定化したＤＮＡマイクロアレイはその代表例であり、本発明の検体調整方法によって作製されたターゲット核酸の検出に特に好適である。固相に用いられる材質としてはその他にも、樹脂、金属、金属薄膜、繊維などがある。またその概観上の形態も、微粒子、光ファイバー先端、多孔質材料、繊維などがある。

固相へのプローブの結合様式としては吸着、化学結合など様々な方式が存在するが、いずれの結合様式でも、本発明のターゲット核酸の検出に適用可能である。例えば、イオン結合では、アミノ基をコートしてあるガラス基板あるいは樹脂表面に対し、通常の核酸を供するだけでイオン的に結合させることができる。また、５’末端、３’末端にアミノ基、チオール基等の官能基を修飾した修飾オリゴヌクレオチドを用いて固定化することも可能である。例えばアミノ基を利用する場合、固相表面にアミノ基と効率的に反応するスクシイミド基を予め結合させておき、５’末端、もしくは３’末端にアミノ基を修飾したオリゴヌクレオチドを固相表面に供給することにより、容易に共有結合を形成させることができ、本発明のターゲット核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。またチオール基を用いる場合には、例えば固相にマレイミド基を結合させておくことにより、アミノ基の場合と同様、共有結合を容易に形成し、本発明のターゲット核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。

固相への供給方法としては、インクジェット法によってＤＮＡ溶液を固相に印字する方法などがある。このインクジェット法で作製されたＤＮＡマイクロアレイは、プローブのスポットが小さいことが特長であり、検出にはＳ／Ｎ比も重要なファクターになるが、本発明の検体調整方法によるターゲット核酸は、ターゲット当たりの標識量が多いためＳ／Ｎ比の向上の効果もあり、特に効果的である。

また、本発明に係る調整された検体は、種々の分析に用いることができる。例えばノーザンハイブリダイゼーション実験、インサイチュハイブリダイゼーション実験などの検体として用いることができる。

また、本発明は上述の試薬を組み合わせた検体調整用のキットをも提供する。

従来の手法で合成されたｃＲＮＡが有する、５’末端に少なくとも二以上連続したウラシル配列を除去するため、ポリＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド体の結合部分におけるＲＮＡを特異的に分解する分解酵素とを含有するキットを挙げることができる。また、この調製キットとマイクロアレイを組み合わせ、検体検出キットとして提供することができる。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
プラスミドＤＮＡを用いて、ポリＵ塩基配列を持たないｃＲＮＡを以下の手順により調製した。

（１）プラスミドＤＮＡの調整
ヒト遺伝子ＴＦＦ１(ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ １)のクローンを有する大腸菌(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)を１．５ｍｌの２ｘＹＴ／ａｍｐ液体培地(組成は表１を参照)で一晩培養し、プラスミドＤＮＡ精製キット：ＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社)を用いて精製し、５０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を得た(手順は表２を参照)。このプラスミドＤＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ５０５ｎｇ／ｕｌだった。なお、表２中のＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ〜IIIは、上記プラスミドＤＮＡ精製キットに含まれる試薬を表す。

（２）ｃＲＮＡの合成、精製
プラスミドＤＮＡにはＴ７プロモーターが組み込まれているので、(１)で精製・溶出したＤＮＡに対し、Ｔ７ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ(Ａｍｂｉｏｎ社)を用いてｃＲＮＡを合成した。表３の順に以下の試薬を加え、３７℃で４時間インキュベートした。ｃＲＮＡの合成後、ＲＮＡ精製キット：Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて精製し、５０μｌのｃＲＮＡ溶液を得た(手順は表４を参照）。このｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、３８６ｎｇ／ｕｌだった。

（３）ｃＲＮＡのポリＵ塩基配列の除去
（２）で合成したｃＲＮＡのポリＵ塩基配列を除去するため、この配列に特異的にアニールするプライマーを合成した。合成されたプライマーの塩基配列を以下に示す。
５’TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ３’(配列番号：１)
ｃＲＮＡ溶液１０μｌに上記プライマー(１００μＭ)を１．５μｌ加え、９４℃で２分間、５５℃で４５秒間加熱してアニールさせた。アニール後氷上で急冷し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ｂｕｆｆｅｒ ８７．５μｌ、ＲｎａｓｅＨ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)１μｌを加え、３７℃で５分間加熱し、プライマーと結合している部位を切断した。その後、ＲＮＡ精製キットであるＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて精製し、５０μｌのｃＲＮＡ溶液を得た(手順は表４を参照)。ナノドロップ分光光度計(ＮａｎｏＤｒｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)を用いてこのｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、３８０ｎｇ／ｕｌだった。

（４）ｃＲＮＡ全長の測定
ポリＵ塩基配列除去前と除去後でそれぞれｃＲＮＡの全長を測定した。ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏアッセイキット(Ａｇｉｌｅｎｔ社)で電気泳動を用い、アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で検出した(手順はキットに付録されるマニュアルを参照）。

（５）実験結果
ＴＦＦ１のｃＲＮＡ全長は５６４ｍｅｒであり、そのうちポリＡ塩基配列は９０ｍｅｒである。上記バイオアナライザーで検出した結果、核酸の長さを表すピークの位置は除去前で５４４、除去後で４５５であった。ポリＡプライマーの長さが２５ｍｅｒ(ポリＡ塩基配列 ２４ｍｅｒ＋Ｇ、ＣまたはＴ)、除去された配列長が９１ｍｅｒであることから、ポリＡプライマーはｃＲＮＡのポリＵ塩基配列と３’末側の隣接塩基まで切断されたことがわかる。このことからポリＡプライマーとＲＮａｓｅＨによって、ｃＲＮＡのポリＵ塩基配列は除去されることが示された。ポリＡプライマーを下記の通り３種類用意することにより、この手法はＴＦＦ１のｃＲＮＡのみならずＩＶＴ法で増幅された遺伝子のｃＲＮＡすべてに用いることができる。
５’ TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ３’
５’ GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ３’（配列番号：２）
５’ CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ３’（配列番号：３）。

＜実施例２＞
ＤＮＡアレイとＩＶＴ法を用いて、胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩにおける遺伝子発現解析を以下の手順で行った。

Ｉ．ＩＶＴ法による検体調整
（１）細胞からトータルＲＮＡの抽出
胃癌標準細胞ＫＡＴＯＩＩＩ(大日本製薬社)の懸濁液に、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡ抽出キットであるＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒとＲＮＡ精製キット：Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出、精製した。

まず、細胞懸濁液(１×１０⁶個／１００μｌ)にβメルカプトエタノールを含むＲＬＴ緩衝液を６００μｌ加え、混合液をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒに添加した。１５０００ｒｐｍで１分間遠心後、抽出液に７０％エタノールを３５０μｌ加えて、Ｒｎｅａｓｙのカラムに添加した。１２０００ｒｐｍで１５秒間遠心後、廃液を捨ててからカラムにＲＷ１緩衝液を７００μｌ添加した。１２０００ｒｐｍで１５秒間遠心後、新しいチューブにカラムをセットし、ＲＰＥ緩衝液を５００μｌ添加した。１２０００ｒｐｍで２分間遠心後廃液を捨て、何も添加せずに１５０００ｒｐｍで１分間遠心した。新しいチューブにカラムをセットし、Ｒｎａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを５０μｌ加えて１分間静置後、１２０００ｒｐｍで１分間遠心してＲＮＡを溶出した。

（２）逆転写によるｃＤＮＡの合成、精製
（１）で調整したｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液１１μｌにＴ−７−（ｄＴ） ２４ Ｐｒｉｍｅｒ(タカラバイオ社）１μｌを加えた後、７０℃で１０分間インキュベートした。その後表５の試薬を表記順に加え、４２℃で１時間インキュベートし、逆転写反応を行った。

さらに表６の試薬を表記順に加え、１６℃で２時間インキュベートし、２本鎖ＤＮＡを合成した。

最後にＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｅｍｅｒａｓｅ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社) ２μｌを加えて１６℃で５分間インキュベートし、両端の一本鎖の部分を二本鎖に調整した。続いてＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ(ＰＬＧ)(ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社)を用いてＤＮＡを精製し、５０μｌのＤＮＡ溶液を得た(手順は表７参照）。

（３）標識ｃＲＮＡの合成、精製
ｃＲＮＡの合成にはＴ７ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ(Ａｍｂｉｏｎ社)を用いた。表８の順に以下の試薬を加え、３７℃で４時間インキュベートした。ｃＲＮＡの合成後、ＲＮＡ精製キットであるＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて精製し、５０μｌのｃＲＮＡ溶液を得た。ナノドロップ分光光度計(ＮａｎｏＤｒｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)を用いてこのｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、４０４ｎｇ／ｕｌだった。

（４）ｃＲＮＡの５’ポリＵ塩基配列の除去
（３）で合成したｃＲＮＡのポリＵ塩基配列を除去するため、実施例１(３)と同様の方法で行い、５０μｌのｃＲＮＡ溶液を得た。このｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、４００ｎｇ／ｕｌだった。尚コントロールとして、ＲＮａｓｅＨを添加せずに実施例１(３）と同様の処理を行い、対照となる５０μｌのｃＲＮＡ溶液を得た。コントロールｃＲＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、４０２ｎｇ／ｕｌだった。

ＩＩ．ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）プローブの設計および合成
ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ(ＡＣＴＢ)、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ(ＧＡＰＤＨ)の発現を調べるため、プローブを設計した。各遺伝子の配列を取得し、設計した部分塩基配列を特異的に認識できるよう、配列、ＧＣ％、融解温度(Ｔｍ値)に十分配慮して設計を行った。

設計されたプローブの塩基配列およびＴｍ値を表９に示す。

このプローブ設計においては、ｃＲＮＡ鎖がプローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成する。

（２）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板(サイズ(Ｗ×Ｌ×Ｔ)：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調整した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。

（３）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３(信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の表面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。

一方、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド(Ｎ−(６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ)ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ)；以下、ＥＭＣＳと略す)(同仁化学研究所社製)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調整したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

（４）プローブ用ＤＮＡの合成
上記(１)で設計したプローブを合成した。プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。

得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

（５）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ(川研ファインケミカル社製)１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度(１０μＭ)となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター(商品名：ＢＪＦ−８５０、キヤノン(株)社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面にプローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作を行った。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、プローブ毎に１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作製し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基(−ＳＨ)とを反応させた。

（６）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液(ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＮＡマイクロアレイ型ＤＮＡチップを得た。

ＩＩＩ．ハイブリダイゼーション反応
ＩＩで作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてＩで調整したＩＶＴ増幅産物を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。

（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
上記Ｉ(４)で調整したｃＲＮＡで、ＲＮａｓｅＨを加えて処理した検体をＲＮａｓｅＨ(＋）、ＲＮａｓｅＨを加えずに同様の処理を行った検体をＲＮａｓｅＨ(−）とする。下記表１０の通り、各ｃＲＮＡに対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。

（２）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置(Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ． ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ)にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記表１１に示す手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

（４）蛍光染色
ハイブリダイゼーション反応終了後、下記表１２の通り調整した蛍光試薬を基板のアレイ上に添加し、室温で３０分間遮光して反応させた。

反応後、２×ＳＳＣに５分間浸し、０．１×ＳＳＣでリンスしてスピン・ドライ乾燥した。

（５）蛍光測定
蛍光染色反応後、ＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置(Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００Ｂ)を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。

輝度の算出にあたっては、ＤＮＡチップ上、プローブＤＮＡのスポットのない部分において観測される蛍光輝度をバックグラウンド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグラウンド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。

（６）結果
以下表１３にＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨの蛍光強度の実測値を示す。Ｉ(４)で調整したｃＲＮＡで、ＲＮａｓｅＨを加えて処理した検体をＲＮａｓｅＨ(＋)、ＲＮａｓｅＨを加えずに同様の処理を行った検体をＲＮａｓｅＨ(−）とする。

表１３の結果から、ＲＮａｓｅで処理したｃＲＮＡもＤＮＡチップで検出され、固相上のプローブとハイブリッド体を形成していることが示された。

本実施例の検体調整法により、ポリＡプライマーとＲＮａｓｅＨを用いて５’末端にポリＵ塩基配列をもたないｃＲＮＡを調整することができた。

また、上述の実測を複数回にわたって行った結果を表１４に示す。

表１４の結果から、ＲＮａｓｅＨ処理によって輝度のばらつきが抑えられたことが示された。

本実施例の検体調整法によって５’末端のポリＵ塩基配列をもたないｃＲＮＡを調整することで、ＤＮＡチップの検出精度を向上させることができた。

５’末端にＧまたはＣまたはＴが付加されているポリＡプライマーを用いるときの、ポリＵ塩基配列の３’末を始点としてポリＡプライマーをアニールさせることを示す図である。 ＲＮａｓｅＨを用いて、ポリＡプライマーにアニールしたポリＵ塩基配列を３’末端から完全に除去した状態を示す図である。

Claims (15)

1. ５’末端にＵ（ウラシル）が少なくとも２以上連続した塩基配列を有するＲＮＡにおいて、前記５’末端に連続したＵを除去する工程を有するＲＮＡの調整方法。
2. 前記ＲＮＡはｃＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡの調整方法。
3. ポリＡオリゴヌクレオチドを前記ｃＲＮＡにアニールさせてＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド体を形成するステップと、
   ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド体を含むｃＲＮＡからＲＮＡ−ＤＮＡ結合部分のＲＮＡを除去するステップと、
   を有する、請求項２に記載のＲＮＡの調整方法。
4. 前記ポリＡオリゴヌクレオチドは、３’末端にＧ、ＣまたはＴの少なくともいずれかを有するポリＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載のＲＮＡの調整方法。
5. 前記ポリＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、ポリＡの塩基長が１５ｍｅｒ以上４０ｍｅｒ以下である、請求項４に記載のＲＮＡの調整方法。
6. 前記ｃＲＮＡが、標識物質で標識されたオリゴヌクレオチドを少なくとも１塩基含む、請求項２〜４のいずれかに記載のＲＮＡの調整方法。
7. 前記標識物質がＣｙ３である、請求項６に記載のＲＮＡの調整方法。
8. 前記標識物質がＣｙ５である、請求項６に記載のＲＮＡの調整方法。
9. 前記標識物質がビオチンである、請求項６に記載のＲＮＡの調整方法。
10. 前記標識物質がアミノアリルである、請求項６に記載のＲＮＡの調整方法。
11. 前記標識物質がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒである、請求項６に記載のＲＮＡの調整方法。
12. 前記ｃＲＮＡが固相上のハイブリダイゼーションに供せられる、請求項６〜１１のいずれかに記載のＲＮＡの調整方法。
13. 前記固相がＤＮＡマイクロアレイである、請求項１２に記載のＲＮＡの調整方法。
14. 請求項１に記載の、５’末端に少なくとも２以上連続したＵ（ウラシル）塩基配列を有するＲＮＡから、５’末端に連続したＵを除去するためのキットであって、
    ３’末端にＧ，ＣまたはＴのいずれかの塩基を有し、且つ少なくとも２以上の連続したポリＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
    ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド体の結合部分におけるＲＮＡを特異的に分解する分解酵素と、
    を包含するキット。
15. 請求項１４に記載のＲＮＡ増幅キットと、マイクロアレイとを包含する、検体検出用キット。

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