JP2010035451A - タグ配列、タグ配列固定化バイオチップおよびタグ配列を用いた選択結合性物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】特定の配列および特定の配列と相補的な配列からなる群から選択される何れかの配列のポリヌクレオチドである、選択結合性物質を検出するためのタグ配列を提供する。
【解決手段】選択結合性物質が多型を含む核酸であるタグ配列。前記タグ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドが担体に固定化されたバイオチップ。前記タグ配列を結合させた前記選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する、選択結合性物質の検出方法。前記選択結合性物質が多型を含む核酸である、選択結合性物質の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、選択結合性物質を検出するためのタグ配列に関する。

遺伝子多型には、一塩基多型（ＳＮＰｓ：Single Nucleotide Polymorphism）のほか、二塩基から数十塩基を１単位とする繰り返し塩基配列の反復回数が異なるマイクロサテライト及びＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat）、あるいはＡ及びＴの連続塩基配列の個数が異なるＡｎＴｎなどがある。

ヒトのＳＮＰｓは、数百塩基に1つ程度の頻度で見られる遺伝子多型である。これらの変異は、コーディングリージョン、ノンコーディングリージョンを問わず広くゲノム上に散在しており塩基の置換のみならず挿入、欠失も見られる。ヒトゲノムの大きさは３０億塩基対であるから、１０００塩基に1カ所そのような多型があったとしても３００万のＳＮＰｓがあることになる。今のところ1つの薬剤や疾病の感受性と関係のあるＳＮＰｓセットは約３００万カ所のうち、多くて数百カ所、数十カ所程度のタイピングが必要であると考えられている。また、マイクロサテライトやＶＮＴＲ、ＡｎＴｎについても同時に検出しようとすると、サンガー法でＤＮＡシーケンサを用いてタイピングする方法があるが、これだけの数のタイピングを行うためにはシーケンシング反応の試薬や装置が高く、手間もかかるため操作の簡便化が望まれる。

一塩基伸長法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法は、一度の反応で多数の遺伝子多型を分析できる点で優れている。しかし、検出については、多型に応じて標識されたプライマーを、単に検出すべき標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いて捕捉するにすぎなかった。このため、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件が一定ではなく、偽陽性ハイブリダイゼーションが起こりやすいため、分析の精度に問題を有していた。加えて、従来は、検出すべき標的核酸の種類が変われば、新たにそれら核酸の相補塩基配列を固相化し直さなければならないので、極めて多種類の核酸が検出対象とされる臨床検査に適用するには汎用性が十分ではないという問題をも有していた。

これらの問題を解決するために、検出すべき標的核酸の各塩基配列に、任意に設計したタグ配列、即ちほぼ同じ長さを持ちかつほぼ同じ解離温度を有しさらに標的核酸中に結合しない塩基配列を付加したポリヌクレオチド断片をプライマーとして用い、これを捕捉する方法が開示されている（非特許文献１）。この方法においては、タグ配列を生物のゲノム配列と独立に設計することができるため、複数のタグと選択結合性物質間のハイブリダイゼーション条件を一定とするようなタグ配列の設計が可能であることから、汎用的に特異的なハイブリダイゼーションが可能になる。しかし、この方法においても、複数の多型を同時に分析しようとする場合、タグ配列間でのそれぞれの配列特異性を考慮しなければならない。タグ配列は、標的核酸の生物ゲノムに対して特異的であるだけでなく、同時にハイブリダイズする組み合わせにおいて、それぞれ独立でなくてなはならない。
タグ配列としては既に公知のものがいくつか存在するが（特許文献１、２参照）、上記のように1つの薬剤や疾病の感受性と関係のあるＳＮＰｓセットは数十カ所程度のタイピングが必要となることからその数に対応するタグ配列が必要である。タグ配列の設計方法としては、例えば、ほ乳類の多型分析時には捕捉プローブ配列として、ウイルスなどの遺伝的に遠い種の塩基配列で、ほ乳類に類似していない塩基配列を設計する方法が提案されている（特許文献３、４参照）。しかし、全てのタグ配列がほぼ同じ長さを持ちかつ同程度の解離温度を有し、同時に特異性も保つ条件を満たす必要があり、そのためタグ配列を設計するにはなお複雑な計算が必要であった。
Ｊ−Ｂ．ファン（J-B.Fan）、ゲノム・リサーチ（Genome Res.）、１０、８５３−８６０、２０００ 特開２００８−０４８７０５号公報 特開２００８−１２５４３９号公報 特表２００２−５３９８４９号公報 特表２００３−５２２５２７号公報

上述のように、タグ配列の設計が分析の精度に大きな影響を与えるため、複数のタグ配列を設計する際に解離温度を同程度にすること、標的核酸中に結合しない塩基配列であること、全てのタグ配列が特異性を保っていること等を確認する必要があることから、複数のタグ配列の獲得が大変煩雑であるという問題があった。

本発明は、標的核酸中の多型の塩基配列を多数、同時に分析する方法において、上記課題を解決するものである。すなわち本発明は次の（１）〜（６）で構成される。
（１）配列番号１〜７８に記載の配列および配列番号１〜７８と相補的な配列からなる群から選択されるいずれかの配列のポリヌクレオチドである、選択結合性物質を検出するためのタグ配列。
（２）前記選択結合性物質が多型を含む核酸である（１）に記載のタグ配列。
（３）前記タグ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドが担体に固定化されたバイオチップ。
（４）前記担体がその表面に凹凸部を有し、該凸部の上端面にタグ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドが固定化された（３）に記載のバイオチップ。
（５）前記タグ配列を結合させた前記選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する、選択結合性物質の検出方法。
（６）前記選択結合性物質が多型を含む核酸であって、
標的核酸中の多型の３’側に隣接する塩基配列に相補的な配列を有するプライマーの５’末端側に前記タグ配列を付加した塩基配列分析用プライマーを用い、該標的核酸と該塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、複合体を形成する第１の工程、
第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに該多型の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識された選択結合性物質を得る第２の工程、
第２の工程で得られた標識された選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する第３の工程、
該標識された選択結合性物質中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定し、該標識の存在又はシグナル強度を指標として多型の塩基配列を解析する第４の工程、
を含む、（５）に記載の選択結合性物質の検出方法。

本発明を用いることにより非常に簡便に選択結合性物質を精度良く分析することが可能になり、中でも一塩基配列の分析や繰り返し塩基配列の反復回数の検出など、塩基配列の分析などにも広く応用できる。

本発明は、配列番号１〜７８に記載の配列および配列番号１〜７８と相補的な配列からなる群から選択される何れかの配列のポリヌクレオチドである、選択結合性物質を検出するためのタグ配列である。

タグ配列を用いて複数の選択結合性物質を精度良く同時に分析しようとする場合、タグ配列は、標的核酸の生物ゲノムに対して特異的であるだけでなく、同時にハイブリダイズする組み合わせにおいて、タグ配列間でのそれぞれの配列特異性を考慮しなければならない。本発明のタグ配列は２０または２５塩基の配列のポリヌクレオチドであり、Ｂｌａｓｔ検索において哺乳類のゲノム配列との相同性が１５塩基以下であり、かつタグ配列間での相同性が９塩基以下になるように設計されている。また、各タグ配列の解離度を示すＴｍは、２０塩基の場合は５５℃〜６５℃、２５塩基の場合は６１℃〜６８℃となっており、ハイブリダイゼーション条件がほぼ一定に保たれている。

本発明のタグ配列中のヌクレオチドとしては、天然に存在するヌクレオチド（以下、天然型ヌクレオチドということがある。）もしくは、天然に存在しないヌクレオチド（以下、非天然型のヌクレオチドということがある。）のうち何れでもよい。

天然型ヌクレオチドとは、その糖部がＤ型のデオキシリボースからなる構造を有しているヌクレオチドである。

非天然型のヌクレオチドとは、その糖部、塩基部のいずれか又は両方に天然型核酸と結合しない修飾がなされたヌクレオチドを用いることが利用できる。これらのうち、糖部に修飾を施す場合は、例えば、糖の水酸基に適当な官能基を導入する方法や糖自体として非天然型の糖を用いる方法が挙げられる。これらのうち、非天然型のＬ型糖を有するヌクレオチド（以下、Ｌ型ヌクレオチドということがある。）好ましく用いることができ、Ｌ型リボース又はＬ型デオキシリボースなど非天然型の糖を有するヌクレオチドがより好ましく用いられる。また、Ｌ型リボースにさらに修飾されていても良く、例えば２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、２’−ｏ−メチルリボース等を用いることができる。核酸塩基に修飾がなされたヌクレオチドとしては、５−プロピニルウラシル、２−アミノアデニンなどが挙げられる。

前記Ｌ型ヌクレオチドは、公知の方法によって合成することが可能である。また、例えば、市販されているBeta-L-deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Thymidine CED phosphoramidite（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）等をそのまま用いることができる。非天然型ヌクレオチドとしては他にＰＮＡなども用いることができるが、その場合、通常の天然型ヌクレオチドと同様に、非天然型ヌクレオチドであるＬ型ヌクレオチドやＰＮＡの合成も専門の合成会社に合成を依頼することもできる。

ここで選択結合性物質とは、本発明のタグ配列が結合し得る物質であれば制限はなく、核酸、タンパク質やペプチドの他、低分子化合物、高分子化合物でも良い。選択結合性物質にタグ配列を結合する方法としては、特に制限はないが、例えば核酸にタグ配列を結合する方法としては、タグ配列部分に上述のＬ型ヌクレオチドもしくは通常の天然型ヌクレオチドを用い、選択結合性物質部分に通常の天然型ヌクレオチドを用いて、通常のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機、例えば、Applied Biosystems社製 392 DNA／RNA自動合成機を使用して、本発明の塩基配列分析用プライマーを合成することができる。天然型の核酸と上述の非天然型のタグ配列を連結させた合成は、通常の天然型ヌクレオチドのみから構成される場合と同様に、専門の合成会社に合成を依頼することもできる。また、例えばタンパク質またはペプチドにタグ配列を結合する場合には、５’末端もしくは３’末端にアミノ基を付加したタグ配列とタンパク質またはペプチドのカルボキシル基との縮合反応により得ることができる。低分子化合物としてはホルモンや生理活性物質、内分泌撹乱物質など挙げられ、これらの化合物内の官能基を介してタグ配列を結合することが可能である。例えば、ステロイドホルモンの一種であるグルココルチコイドの水酸基を、スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカーを介して、末端チオール化タグ配列を結合することが可能である。（スクシンイミド基は水酸基と、マレイミド基はチオール基と結合可能）また高分子へのタグ配列の結合としては、例えば、ポリメチルメタクリレートの側鎖を加水分解して、カルボニル基を形成させ、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて、末端アミノ化タグ配列を結合することが可能である。

本発明のタグ配列は、多型を含む核酸を検出するために好ましく用いられる。ここでいう多型とは、一塩基多型（ＳＮＰｓ：Single Nucleotide Polymorphism）のほか、二塩基から数十塩基を１単位とする繰り返し塩基配列の反復回数が異なるマイクロサテライト及びＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat）、あるいはＡ及びＴの連続塩基配列の個数が異なるＡｎＴｎなどが挙げられる。

また本発明は、前記タグ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド（以下、タグ捕捉プローブともいう）が担体に固定化されたバイオチップに関する。ここでいうバイオチップとは、生物の遺伝情報を解析するツールの総称であり、マクロアレイ、マイクロウェル、マイクロアレイ、ＤＮＡチップ等があるがこれに限らない。

本発明のバイオチップの構造は特に限定されないが、ノイズが低減し、ハイブリダイゼーション効率をあげる効果があることから、担体の表面が凹凸構造を有し、該凸部に前記タグ配列が固定化していることが好ましい。具体的には、図６に示すようなカバーと担体を有し、図７に示すような固定化領域に微細な凹凸構造を有する担体を用いて、該凹凸構造の凸部の上面にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップが好ましい。

前記担体の材質としては特に制限はないが、例えば、金、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ゲルなどのポリマー、ビーズ、繊維、中空糸などを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマーであり、ＰＭＭＡが、図７に示すような微細な凹凸構造と組み合わせて好適に用いられる。

前記担体へのタグ捕捉プローブの固定化は当業者にとって公知の方法によってなされるが、担体がポリマー製である場合、担体表面を化学処理し、タグ配列と結合可能な官能基、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを生成させ、これとタグ捕捉プローブとを化学結合させることによって行うことができる。例えば担体がＰＭＭＡ製である場合は、図８に例示するように、アルカリ性溶液及び／又は酸性溶液によって表面処理することにより担体表面にカルボキシ基を生成させ、図９に例示するように、３’末端をアミノ化したタグ捕捉プローブをこれと化学反応により縮合させることにより、固定化することができる。また、このような官能基の導入は、例えば該表面をプラズマ処理又は放射線処理（例えばγ線、電子線など）するか、これらの処理の後でさらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、或いは、ポリカチオン（例えばポリーＬ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることによって行うことができる。オリゴヌクレオチドの３’末端アミノ化は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機により、GLEN RESEARCH社の３’アミノ化修飾用ガラスビーズ担体（３’−PT Amino−Modifer C6 CPG）を用いることで行うことができる。

本発明のバイオチップは、通常、固定化領域（スポット）毎にタグ捕捉プローブをそれぞれ一種類ずつ固定化して作製する。例えば、図１０に一例を示すように、一つの担体に複数種類のタグ捕捉プローブを固定化しておくことにより、一塩基配列の分析と繰り返し塩基配列の分析を同時に行うことが可能である。

前記担体の表面を凹凸構造に成形する方法としてはとしては、ポリマー製の担体である場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法を用いることができる。また、シリコンの場合は、半導体プロセスで使用される公知の方法が挙げられる。

本発明のバイオチップにおいては、担体とカバーの間の凹部にビーズ６を含むことができる（図７参照）。ビーズ６が存在することによって、選択結合性物質を含む溶液の効率よい攪拌が可能となり、その結果、選択結合性物質検出反応促進効果がもたらされる。ビーズのサイズは、担体の凹部に複数個のビーズが自由に動きうるようなサイズであれば該凹部の形状に合わせて適宜選択できるが、例えば直径数十〜数百μｍである。ビーズの材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス等の金属、ナイロンやポリスチレンなどのポリマーなどが挙げられる。これらの中でも、化学的に安定であり比重も大きいことからセラミックのビーズが好ましい。

さらに本発明は、前記タグ配列を結合させた前記選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する、選択結合性物質の検出方法に関する。ここで、タグ配列と選択結合性物質を結合させる方法としては特に制限はなく、前述の方法によって結合される。また、「タグ配列を介して特異的に捕捉する」とは、選択結合性物質に結合したタグ配列と、タグ捕捉プローブをハイブリダイズさせることによって選択結合性物質を捕捉することであり、この場合のハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は、限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。

上述の通り捕捉された選択結合性物質は、当業者に公知の方法によって検出される。ここで選択結合性物質がタンパク質である場合には、例えば特異的に捕捉したタンパク質（選択結合性物質）と、識別可能な標識をした抗体を反応させることにより、その標識物を検出して選択結合性物質の種類を検出することができる。また、選択結合性物質が核酸である場合には、選択結合性物質と相補的な配列をもつ標識核酸をハイブリダイズするか、選択結合性物質そのものに標識を付加することにより種類を検出することができる。選択結合性物質に標識を付加する方法については、後に詳しく述べる。

識別可能な標識物としては、例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物が例示される。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのシアニン系蛍光色素のほか、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等の蛍光物質、が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。これらの中でも、酵素への取り込み効率を標識間で一定にするために、シアニン系蛍光色素や半導体微粒子を用いることが好ましい。

シアニン系蛍光色素としては、異なる励起、蛍光波長をもつＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが市販されている（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））。Ｃｙ２は一般式１において、Ｘ＝Ｏ、ｎ＝１で表され、Ｃｙ３は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２、ｎ＝２で表され、Ｃｙ７は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２、ｎ＝３で表され、Ｃｙ３．５は一般式２おいて、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５．５は一般式２おいて、ｎ＝２で表され、Ｃｙ３Ｂは一般式３で表される化学構造を有している。ここで、一般式１〜３においてＲおよびＲ’はヌクレオチドと結合する際に適宜選択されて用いられる官能基である。シアニン蛍光色素は、酵素の取り込み効率のばらつきを抑えることができることから好ましく用いることができる。本発明の検出方法で多型を含む核酸を検出する方法においては、励起、蛍光波長や蛍光シグナルの減衰を考慮すると、特にＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５を用いることが好適である。

半導体微粒子とは、III−V族原子やII−IV族原子から構成される半導体であって、量子ドットとも呼ばれる。量子サイズによって光学特性が変わることが知られており、多色蛍光標識物として用いられている。例えばZnSe、CdS、CdSe、CdTe、InAs、InP、PbS、Si等が挙げられるが、これに限定されるものではない。CdSeは、結晶径を変えるだけで青から赤まで任意の可視光の波長を作り出すことができるので、好ましく用いられる。また、ZnSe、CdS、CdSe、CdTe、InAs、InP、PbS、Si等は、ZnS、CdSによりコーティングすると蛍光消光が抑えられることから好ましい。

本発明の選択結合性物質の検出方法は、多型を含む核酸の検出において好ましく適用される。多型を含む核酸を検出する際の具体的な工程は次の通りである。

（第１の工程）標的核酸中の多型の３’側に隣接する塩基配列に相補的な配列を有するプライマーの５’末端側に前記タグ配列を付加した塩基配列分析用プライマーを用い、該標的核酸と該塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、複合体を形成する工程。

（第２の工程）第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに該多型の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識された選択結合性物質を得る工程。

（第３の工程）第２の工程で得られた標識された選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する工程。

（第４の工程）該標識された選択結合性物質中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定し、該標識の存在又はシグナル強度を指標として多型の塩基配列を解析する工程。

ここで塩基配列分析用プライマーとは、標的核酸中の多型の３’側に隣接する塩基配列に相補的な配列を有するプライマーでさらに該プライマーの５’末端側に前記タグ配列を付加した構造のものをいう。また、本発明の方法が適用できる標的核酸としては特に制限はなく、天然若しくは人工の任意の塩基配列を有する任意の核酸に適用可能である。ここでいう核酸には、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA又はRNAが含まれる。例えば、炎症性サイトカイン、薬剤代謝関連遺伝子、遺伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、その他様々な疾患関連遺伝子又はウイルス由来の核酸など、疾病、治療のマーカーとなり得る核酸は、とりわけ好ましい標的核酸である。また、標的核酸が由来する生物種としては特に制限はないが、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトまたはマウスまたはラットである。

標的核酸の試料には、血液、尿、唾液等の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解させればよい。上記の他にも、本発明の方法を適用する標的核酸の試料は、随意に変更することができる。例えば、細胞を株化して大量培養したり、血液を取得したりすることで本方法に必要なヒトゲノムDNAを大量に調製することにより、直接ゲノムDNA試料とすることができる。また、少量のゲノムDNAを取得し、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の試薬キットGenomiPhiのようなWGA法（Whole Genome Amplification ）で、非特異的にゲノムDNAを増幅した試料を用いてもよい。また、PCR法や、マルチプレックスPCR法、アシンメトリックPCR法のようなプライマーを用いて特定の塩基配列を増幅したものを試料としてもよい。特に、ゲノムDNAなどを用いる場合は、予め分析したい多型の塩基配列を含む領域をPCRなどで増幅しておいてもよい。例えば、酵素的に増幅する方法により得られた二本鎖試料の場合は、９５℃まで加熱してから４℃に急冷して１本鎖化したり、塩濃度のきわめて低い溶液中で９５℃まで加熱し断片化したり、超音波で断片化したり、制限酵素で切断したりして、１本鎖化及び／又は断片化操作を加えたものを試料としてもよい。

本発明の検出方法で多型を含む核酸を検出する方法について、各工程の順を追って具体的に説明する。

第１の工程は、標的核酸と塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、該塩基配列分析用プライマーと該標的核酸との複合体を形成する工程である。図１に、塩基配列分析用プライマーを説明するための模式図を示す。標的核酸の分析したい多型の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を持ち、かつ５’末端にはタグ配列が付加してある。当該相補的な塩基配列の長さは、通常５〜１００塩基が好ましく、ハイブリダイズの特異性と合成コストを考慮すると１０〜５０塩基がより好ましく、１５〜４０塩基がさらに好ましい。

標的核酸と塩基配列分析用プライマーのハイブリダイゼーション反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でプライマーと標的核酸のアニール反応が行われる通常の条件で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応の温度は、用いる塩基配列分析用プライマーの特異性が保たれる範囲であればよく、好ましくは酵素の熱耐性、溶液の塩濃度などに応じて設定する。通常は３０℃から７０℃で実施できる。

第２の工程は、第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに多型の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識された選択結合性物質を得る工程である。

塩基伸長反応は、通常のＰＣＲで行われる条件であればよい。塩基伸長反応の温度は、用いる塩基配列分析用プライマーの特異性が保たれ、かつ酵素の至適活性範囲であればよいが、好ましくは酵素の熱耐性、溶液の塩濃度などに応じて設定する。通常は３０℃から７０℃で実施できる。

付加する標識ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、即ちｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ若しくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、又は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、即ちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰである。ジデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのデオキシリボースの３’位の水酸基が水素基になっている物質で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれるとそれ以上相補鎖が合成されなくなり、特異的なターミネーターの役割を果たす。

分析したい標的核酸中の多型の塩基配列が一塩基配列である場合には、図２に一例を示すように、４種類のｄｄＮＴＰのみを用い、これらのうち少なくとも１種類には識別可能な標識を付加したｄｄＮＴＰを用いる。塩基配列分析用プライマーから伸長反応が進行し、多型の塩基に相補的なｄｄＮＴＰ（図２ではｄｄGＴＰ）が取り込まれて塩基伸長反応は一塩基で停止する。この際に取り込まれたｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該多型の塩基配列を分析することができる。塩基伸長反応時に、相互に識別可能な複数の標識をそれぞれｄｄＮＴＰに付加してあれば、取り込まれたそれぞれの標識の存在を測定することにより、１種類から４種類の同時塩基配列分析も可能である（図２では４種類の全てのｄｄＮＴＰが標識されている）。

分析したい標的核酸中の多型の塩基配列が、数十塩基を１単位とする繰返し塩基配列である場合には、繰返し配列の５’末端に相補的な配列を有する塩基配列分析用プライマーと４種類のｄｄＮＴＰのみを用い、これらのうち少なくとも２種類には識別可能な標識を付加したｄｄＮＴＰを用いる。図３に示すように、繰り返し塩基配列を有する核酸は、ｎ個の繰り返し配列単位を有している。図３（ａ）に示すように各繰り返し配列単位の３’末端の核酸（この図の例では、Ｔ）と繰り返し配列の５’末端外に存在する核酸（図３の例では、Ａ）とは、一般に核酸の種類が異なる。繰返し配列の５’末端に相補的な配列を有する塩基配列分析用プライマー（図３（ｂ））から伸長反応が進行し、多型の塩基に相補的なｄｄＮＴＰ（図３ではｄｄＡＴＰまたはｄｄＴＴＰ）が取り込まれて塩基伸長反応は一塩基で停止する（図３（ｃ））。この際に取り込まれたｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在を測定し両者のシグナル強度比をとる。図３の例では、Ａが導入された塩基配列分析用プライマーのシグナル強度は、（ｎ−１）個分のシグナル強度となり、Ｔが導入された塩基配列分析用プライマーの与えるシグナル強度を１としてＡが導入された塩基配列分析用プライマーのシグナル強度比を計算することにより、反復数を測定することができる（特開２００８−１２５４３９号公報）。

分析したい標的核酸中の多型の塩基配列が、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン若しくはウラシルからなる群から選ばれる１乃至３種類の塩基からなる繰り返し塩基配列、例えばマイクロサテライトなどの繰り返し塩基配列である場合には、図４に一例を示すように、相互に識別可能な標識を付加した、繰り返し塩基配列に含まれる塩基と相補的な全てのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と、繰り返し塩基配列に含まれる塩基と相補的でない全てのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いる。塩基配列分析用プライマーから塩基伸長反応が進行し、多型に相補的な標識ｄＮＴＰ（図４ではｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ）が取り込まれる。やがて繰り返し塩基配列の後に続く繰り返し塩基配列に存在しない塩基が出現した時点で、ｄｄＮＴＰ（図４ではｄｄＴＴＰ又はｄｄＧＴＰ）が取り込まれて塩基伸長反応は停止する。識別可能な標識を付加したｄＮＴＰのシグナル強度を測定することにより、多型の繰り返し塩基配列における繰り返し回数を検量することができる。

第２の工程で用いるｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰに付加する識別可能な標識は、前述の公知の標識物が使用可能である。標識物は、プライマーの塩基伸長反応に影響を与えることがなければ、ｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰのどの位置に結合させてもよい。例えば、アデニン、グアニンの場合はプリン骨格の７位または８位、シトシンはピリミジン骨格の５位または６位、チミンはピリミジン骨格の６位、ウラシルのピリミジン骨格の５位または６位に結合させることができる。標識物の結合方法としては特に制限はなく、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の「ＣｙＤｙｅカタログ」（２２頁）に記載されているような一般的な方法で標識体を結合することができる。また、市販されているＣｙ３標識ｄｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）、Ｃｙ３標識ｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）など、入手可能又は既知の標識物が結合されているｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰを用いることも出来る。

塩基伸長反応にはポリメラーゼを用いるが、好ましくは耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いる。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、取り込み効率の向上を図ることができる。より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率の高いことから、Thermo Sequenase DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））またはSequenase Version 2.0 T7 DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））が用いられる。

第３の工程は、第２の工程で得られた標識された選択結合性物質を、該標識された選択結合性物質中に含まれる塩基配列分析用プライマーのタグ配列を介して特異的に捕捉する工程である。

標識された選択結合性物質の捕捉は、塩基配列分析用プライマーにおけるタグ配列部分と相補的な配列を含むタグ捕捉プローブを用いることで実施できる。図５に一例を示すように、タグ捕捉プローブを用いて、塩基配列分析用プライマーをタグ配列を介して特異的に捕捉する。このタグ捕捉プローブは、担体に固定化し、バイオチップとして用いることが可能である。即ち、タグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップを用いることで、簡便に標識された選択結合性物質を捕捉することができる。ここで、タグ捕捉プローブは、タグ配列と特異的に結合すればよく、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドもしくは、非天然型のデオキシリボヌクレオチドのうち何れでもよい。非天然型のデオキシリボヌクレオチドとしては、前述のL型ヌクレオチド、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）でも良い。

第４の工程は、第３の工程で捕捉した標識された選択結合性物質中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定することにより、標識の存在又はシグナル強度を指標として多型の塩基配列を解析する工程である。

分析したい標的核酸中の多型の塩基配列が一塩基である場合には、ｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該多型の塩基配列を分析することができる。つまり、多型の塩基に相補的なｄｄＮＴＰの標識の存在、即ち相補的なｄｄＮＴＰの標識シグナルが測定されれば、該多型に該塩基が存在すると判断することができる。

分析したい標的核酸中の多型の塩基配列がマイクロサテライトなどの繰り返し塩基配列である場合には、相互に識別可能な標識を付加したｄＮＴＰのシグナル強度を測定することにより、該多型の繰り返し塩基配列における繰り返し回数を検量することができる。例えば、図１１に一例を示すように縦軸にシグナル強度、横軸に標的核酸の繰り返し回数をとった検量線を用い、測定して得られた標識を付加したｄＮＴＰのシグナル強度から繰り返し回数を検量することができる。

本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されないものとする。

以下の実施例、比較例に用いた多型の存在する遺伝子領域を増幅する増幅用プライマー、及び該一塩基多型を検出するための塩基配列分析用プライマーは、全てのヌクレオチドが天然型ヌクレオチドから構成されものであり、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼し合成した。

（実施例１）
（１）ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３、（２）ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２、（３）ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３、（４）ヒトＭＤＲ１のＥｘｏｎ１２に含まれる一塩基多型、（５）ヒトＭＤＲ１のＥｘｏｎ２１に含まれる一塩基多型、（６）ヒトＭＤＲ１のＥｘｏｎ２６に含まれる一塩基多型を同時に分析した。

分析は、以下の手順（１）〜（８）に沿って行った。

手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号７９及び８０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号８１及び８２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号８３及び８４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ１２を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号８５及び８６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号８７及び８８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２６を含む核酸領域を増幅するプライマーとして、配列番号８９及び９０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。

また、ここでは、特異的なタグ配列が付加されている塩基配列分析用プライマーを用いた。すなわち、ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３を標的核酸の多型の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして配列番号９１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２を標的核酸の多型の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして、配列番号９２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３を標的核酸の多型の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして配列番号９３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ１２を標的核酸の多型の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして配列番号９４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１を標的核酸の多型の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして配列番号９５及び９６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２６を標的核酸の多型の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして配列番号９７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。

ここで、配列番号９１〜９７のオリゴヌクレオチドは、５’末端から２５塩基がタグ配列である。配列番号９１の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号１の配列である。同様に配列番号９２の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号２の配列である。同様に配列番号９３の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号３の配列である。同様に配列番号９４の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号４の配列である。同様に配列番号９５の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号５の配列である。同様に配列番号９６の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号６の配列である。同様に配列番号９７の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号７の配列である。

シグナル補正用コントロールとして、コントロール１（ｃｏｎｔ１Ａ、ｃｏｎｔ１Ｇ、ｐｒｉｍｅｒ１）、コントロール２（ｃｏｎｔ２Ｔ、ｃｏｎｔ２Ｃ、ｐｒｉｍｅｒ２）を合成した。ｃｏｎｔ１Ａとして配列番号９８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｃｏｎｔ２Ｃとして配列番号９９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｐｒｉｍｅｒ１として配列番号１００に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｃｏｎｔ２Ｔとして配列番号１０１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｃｏｎｔ２Ｃとして配列番号１０２に示す塩基配列からなるヌクレオチド、ｐｒｉｍｅｒ２として配列番号１０３に示す塩基配列からなるヌクレオチドを合成した。ｃｏｎｔ１Ａとｃｏｎｔ１Gは、１００ｍｅｒの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基（ＡまたはＧ）以外完全に同じ配列である。ｐｒｉｍｅｒ１は、ｃｏｎｔ１Ａ及びｃｏｎｔ１Ｇの中央の一塩基の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列であるプライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。ｃｏｎｔ２Ｔとｃｏｎｔ２Ｃは、１００ｍｅｒの任意の塩基配列からなり、中央の一塩基（ＴまたはＣ）以外完全に同じ配列である。ｐｒｉｍｅｒ２は、ｃｏｎｔ２Ｔ及びｃｏｎｔ２Ｃの中央の一塩基の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列であるプライマー配列部分と、標的核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列部分とからなる。

ここで、配列番号１００及び配列番号１０３のオリゴヌクレオチドは、５’末端から２５塩基がタグ配列である。配列番号１００の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号８の配列である。同様に配列番号１０３の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号９の配列である。

また、タグ配列が付加した核酸を検出するために、７８種類のタグ捕捉プローブ（３’末端アミノ化）を作成した。即ち、配列番号１〜７８にそれぞれ相補的な配列をもつタグ捕捉プローブを合成した。

手順（２）タグ捕捉プローブ固定化担体の作製
手順（１）で用意したタグ捕捉プローブを固定化する担体を以下のようにして作製した。

公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製のタグ捕捉プローブ固定化用の担体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させており、支持体は黒色である。この黒色支持体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、支持体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。

担体（図６及び図７の符号１）の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、支持体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央に、縦・横２２ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を１２９６（３６×３６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（１２９６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、１２９６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．５ｍｍであった。

手順（３）タグ捕捉プローブの固定化
手順（２）で得たＰＭＭＡ担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。この反応スキームを図８に示す。

配列番号１〜７８で示される塩基配列に相補的な配列を有するタグ捕捉プローブ（３’末端アミノ化）を、それぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ―ＩＩ）で担体凸部上面の全てにスポットした。次いで、担体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図９に示す。

手順（４）カバーの作製、及び装着、ビーズの装填
射出成型法により貫通孔（図６及び図７の符号４）を４つ有するカバー（図６及び図７の符号２；外周部にオーバーハング構造有り）を作製した。手順（３）で得られたタグ捕捉プローブ（図６及び図７の符号５）を固定化した担体にＰＤＭＳを塗布し（図６及び図７の符号３）、その上に作製したカバー２を装着して４２℃で２時間硬化させ、タグ捕捉プローブを固定化したバイオチップを作製した（図６）。このバイオチップに、カバーの貫通孔４から直径１８０μｍのジルコニアビーズ（図７の符号６；東ソー（株）製；ＴＺＢ１８０）を２０ｍｇ装填した（図７）。

手順（５）特定すべき一塩基多型を含む領域のＰＣＲによる増幅
ヒトの血液からＷｉｚａｒｄ（Ｒ） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡは、２０ｎｇ／μＬになるように純水で希釈し、使用するまで−３０℃で凍結保存した。得られたヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、手順（１）の配列番号７９〜９０のプライマーセットを用いて特定すべき一塩基多型を含む領域をＰＣＲにより増幅した。

ＰＣＲにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で３５サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、このＰＣＲは単に標的核酸中の特定領域を増幅することが目的であるため、ＰＣＲの方法や酵素の種類に特段の制限はない。

ここで、ＰＣＲには常法に従い、以下の試薬を含む５０μＬ水溶液を調製した。各ＳＮＰｓを含む領域を増幅するフォワードプライマー（配列番号７９，８１，８３，８５，８７，８９）：各１５ｐｍｏL、リバースプライマー（配列番号８０，８２，８４，８６，８８，９０）：各１５ｐｍｏＬ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ―Ｖｅｒｓ．２：5 μL、２ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ：８μＬ、２５ｍＭＭｇＳＯ_４：５μＬ、ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ―：１Ｕ、ゲノムＤＮＡ：１００ ｎｇ
また、ＰＣＲは、９４℃・２分、９４℃・３０秒／５８℃・３０秒／６８℃・１分を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。その後、ＧＦＸ PＣR ＤＮＡ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））により精製し、余剰のｄＮＴＰｓを除いた。

手順（６）特異的なｄｄＮＴＰの取り込み反応
ＰＣＲ産物を一塩基伸長反応の鋳型とし、配列番号９１〜９７の塩基配列分析用プライマーを用いて一塩基伸長反応を行った。

手順（５）で得られたＰＣＲ産物に、配列番号９１〜９７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されたｄｄＮＴＰ（Ｃｙ３−ｄｄＮＴＰまたはＣｙ５−ｄｄＮＴＰ）、非標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを加え、ｄｄＮＴＰの取り込みを行った。検出したい塩基種がＣまたはＴである場合、Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ、Ｃｙ３−ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰを、検出したい塩基種がＧまたはＡである場合、Ｃｙ５−ｄｄＧＴＰ、Ｃｙ３−ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰを使用した。ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはサンガー法に広く使用されている改変型Ｔ７ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。

一塩基伸長反応は、２つの系に分けて行った。チューブ１にはヒトＭＤＲ１Ｅｘ１２、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２６に含まれるＳＮＰｓとヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３のＳＮＰｓを検出する系（Ｃ／Ｔ判別系）を、チューブ２にはヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１とヒトＣＹＰ３Ａ５＊３、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２のＳＮＰｓを検出する系（Ｇ／Ａ判別系）を構築した。それぞれのチューブには、蛍光シグナル補正用コントロールを含む。

蛍光シグナル補正用コントロールは、ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号１００）とｃｏｎｔ１Ａ（配列番号９８）、ｃｏｎｔ１Ｇ（配列番号９９）の組み合わせ（チューブ１）と、ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号１０３）とｃｏｎｔ２Ｔ（配列番号１０１）、ｃｏｎｔ２Ｃ（配列番号１０２）の組み合わせ（チューブ２）を設定した。なお、蛍光シグナル補正用コントロールは全てのサンプルにおいて同量加えているので、理論上は常に同じ蛍光シグナル強度を与えるものであり、チューブ１または２中の反応を反映する蛍光シグナル強度を与えると見なされる。

ここで、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応には、Ｃ／Ｔ判別系（チューブ１）として、一塩基伸長反応用プライマー：｛ヒトＭＤＲ1Ｅｘ１２プライマー（Ｅｘ１２、配列番号９４）、ヒトＭＤＲ1Ｅｘ２１プライマー（Ｅｘ２１−１、配列番号９５）、ヒトＭＤＲ1Ｅｘ２６（Ｅｘ２６、配列番号９７）、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３プライマー（配列番号９１）｝各０．３ｐｍｏＬ、１０μＭ Ｃｙ３標識ｄｄＣＴＰ：１μＬ、１０μＭ Ｃｙ５標識ｄｄＵＴＰ：１μＬ、１０μＭ ｄｄＧＴＰ：１μＬ、１０μＭ ｄｄＡＴＰ：１μＬ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ：２μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：５Ｕ、精製後ＰＣＲ産物２μＬ、ｃｏｎｔ１Ａ（配列番号９８）：５ｎｇ、ｃｏｎｔ１Ｇ（配列番号９９）：５ｎｇ、ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号１００）：０．１５ｐｍｏＬを、純粋で２０μLにメスアップしたものを用いた。

ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応がＧ／Ａ判別系（チューブ２）としては、一塩基伸長反応用プライマー：｛ヒトＭＤＲ1Ｅｘ２１プライマー（Ｅｘ２１−２、配列番号９６）、ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３プライマー（配列番号９１）、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２プライマー（配列番号９２）｝各０．３ｐｍｏＬ、１０μＭ Ｃｙ３標識ｄｄＡＴＰ：１μＬ、１０μＭ Ｃｙ５標識ｄｄＧＴＰ：１μＬ、１０μＭ ｄｄＣＴＰ：１μＬ、１０μＭ ｄｄＴＴＰ：１μＬ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ：２μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：５Ｕ、精製後ＰＣＲ産物２μＬ、ｃｏｎｔ２Ｔ（配列番号１０１）：５ｎｇ、ｃｏｎｔ２Ｃ（配列番号１０２）：５ｎｇ、ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号１０３）：０．１５ｐｍｏＬを、純水で２０μLにメスアップしたものを用いた。

また、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応は、９５℃・２分、９５℃・２０秒／６０℃・１５秒を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。

手順（７）ハイブリダイゼーション
手順（６）の取り込み反応液９．６μＬ（Ｃ／Ｔ判別系（チューブ１）反応溶液４．８μＬ、及びＧ／Ａ判別系（チューブ２）反応溶液４．８μＬの混合溶液）を９５℃で５分間熱変性し、氷中で急冷した。これにハイブリダイゼーション用反応液（３０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１５×ＳＳＣ、０．３ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（上記各濃度は、いずれも終濃度）を含む水溶液）を３０．４μＬ加え、マイクロピペットを用いて貫通孔より注入した。ここで１５×ＳＳＣは、２０×ＳＳＣ（０．３Ｍクエン酸ナトリウム二水和物, ３Ｍ ＮａＣｌ溶液：シグマ社製）を純水にて３／４に希釈したものを意味する。その後、封止材としてＰＥＴテープで貫通孔を塞ぎ、チャンバー（ＴａＫａＲa製、ＴａＫａＲａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ ５ Ｎｏ．ＴＸ７１１）にセットした。シェイカー（ＥＹＥＬＡ製、Ｍｕｌｔｉ Ｓｈａｋｅｒ ＭＭＳ）にチャンバーを固定化し、４２℃、３時間インキュベートした。シェイカーの回転数は２５０ｒｐｍとし、シェイカーの回転面とチャンバーが平衡になるようにした。

インキュベート後、担体からカバーとＰＤＭＳを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。

手順（８）蛍光シグナル強度の測定
ＤＮＡチップ用のスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ, ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ, Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）に手順（７）の処理後の担体をセットし、蛍光シグナル強度の測定を行った。測定条件は、レーザー出力７０％、フォトマルチプレイヤーを適度に調整した。ここでの蛍光シグナル強度とはスポット内の蛍光シグナル強度の平均値である。

その結果、検出すべき配列番号９１〜９７の各塩基配列分析用プライマーを捕捉する配列番号１〜７に相補的な配列を有する各タグ捕捉プローブのスポットならびに配列番号１００および配列番号１０３の各蛍光シグナル補正用プライマーを捕捉する配列番号８および９に相補的な配列を有する各タグ捕捉プローブのスポットにおいて特異的な蛍光シグナルを検出した。一方、配列番号１０〜７８に相補的な配列を有するタグ捕捉プローブのスポットからは蛍光シグナルは検出されず、配列番号１〜７８のタグ捕捉プローブのセットは多型の特異的な検出において有効であることが確認された。

手順（９）多型の検出
次に、本方法では以下のように各ＳＮＰに対応する蛍光シグナルの色（取り込まれた蛍光標識ｄｄＮＴＰｓ）及び強度から多型の塩基配列の分析を行った。まず各反応チューブに一定量加えたコントロールの蛍光シグナル（コントロール１または２）による補正を行った。チューブ１では、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３とヒトＭＤＲ１Ｅｘ１２、２１、２６に含まれる各ＳＮＰｓを検出するために、配列番号９１、９４、９５、９７を捕捉するそれぞれのタグ捕捉プローブを固定化したスポットから得られる各蛍光シグナル強度から、コントロール１のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を１と補正した場合のＲ=Ｃｙ３の蛍光シグナル強度／Ｃｙ５の蛍光シグナル強度を得た。

また、同様にチューブ２は、ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１に含まれるＳＮＰｓを検出するために、配列番号９１、９２、９６を捕捉するそれぞれのタグ捕捉プローブを固定化した各スポットから得られる蛍光強度から、コントロール２のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光強度を１と補正した場合のＲ=Ｃｙ３の蛍光シグナル強度／Ｃｙ５の蛍光シグナル強度を得た。

ここで、蛍光シグナル強度の値としてはブランクスポット（スポット溶液のみをスポットした部分）のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を引いた値を用いている。この補正は、遺伝子多型を診断するＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を普遍的な数値に変換することを目的としている。Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度の普遍性を失わせる要因としては、Ｃｙ３，Ｃｙ５標識ｄｄＮＴＰの退色、チューブごとの反応性のばらつき、スキャナーのレーザーパワーなどのばらつき、各実験間に一般的に含まれるばらつきが考えられる。この補正によりこれらの要因を加味した数値に変換することができる。求めたＲ値については、底２をとったｌｏｇ値に変換し、−２＜Ｒ＜４の範囲のときをヘテロとし、Ｒ≦−２の時は、Ｇ／Ａ判定系のシグナルはＧＧと判定し、Ｃ／Ｔ判定系のシグナルはＴＴホモと判定した。Ｒ≧４の時は、Ｇ／Ａ判定系のシグナルはＡＡと判定し、Ｃ／Ｔ判定系のシグナルはＣＣホモと判定した。但し、ヒトＭＤＲ１のＥｘ２１の多型はＣまたはＴまたはＡであり、Ｅｘ２１−２によるヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１のＳＮＰ検出においては、ＳＮＰがＡに変異している場合のみＣｙ３のシグナルを検出するため、Ｃｙ３のシグナルがコントロールのＣｙ３シグナルを１としたときに０．５以上である場合にのみ、Ａへの変異を検出するシグナルとみなした。

手順（１０）ヒトの塩基配列の比較
手順（５）のＰＣＲ増幅後に得られたＤＮＡ試料は一部を電気泳動したところ目的とする領域が各々増幅されていることが確認できたほか、通常の塩基配列決定方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３はＧＡへテロ、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２はＧＡへテロ、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３はＣＣホモ、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ１２はＣＣホモ、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１はＣＡへテロ、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２６はＣＣホモであることを確認した。

各測定値ｌｏｇ_２(Ｒ）を表１に示す。ヒトＣＹＰ３Ａ５＊３のｌｏｇ_２（Ｒ）は０．６であり、ＧＡへテロと判定した。ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊２のｌｏｇ_２（Ｒ）は−０．５であり、ＧＡへテロと判定した。ヒトＣＹＰ２Ｃ１９＊３のｌｏｇ_２（Ｒ）は９．０でありＣＣホモと判定した。ヒトＭＤＲ１Ｅｘ１２のｌｏｇ_２（Ｒ）は８．９でありＣＣホモと判定した。ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１のＣ／Ｔ判定系におけるＥｘ２１−１（配列番号９５）プライマー由来のｌｏｇ_２（Ｒ）は８．７でありＣＣホモと判定した。さらに、ヒトＭＤＲ1Ｅｘ２１のＧ／Ａ判定系におけるＥｘ２１−２（配列番号９６）プライマー由来のシグナルは、コントロール２のＣｙ３シグナルを１としたときに、１．２であることから、シグナルであると判定し、一塩基多型はＡであると判定した。即ち、ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２１は、ＣＡへテロと判定した。ヒトＭＤＲ１Ｅｘ２６のｌｏｇ_２（Ｒ）は６．２でありＣＣホモと判定した。以上の結果を表１に示す。

以上の結果より、蛍光シグナル強度による検出結果と通常の塩基配列決定法による結果が一致し、本発明のタグ配列を用いる多型の検出方法が有効であることがわかった。

（実施例２）
ヒトＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）に含まれるＶＮＴＲの反復数を分析した。分析は、以下の手順（１）〜（８）に沿って行った。

手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ＩＬ−１ｒａに含まれるＶＮＴＲ領域（配列番号１０４）を増幅するため、この配列番号１０４の繰り返し領域を網羅できるフォワードプライマー（配列番号１０５）、リバースプライマー（配列番号１０６）を合成した。このプライマーは、反復数が２〜６回のいずれのＶＮＴＲを持つ領域であっても増幅可能である。また、繰り返し配列単位に対する塩基配列分析用プライマー（配列番号１０７）を合成した。ここで、配列番号１０７の５’末端から２５塩基に使用されている配列は配列番号１１の配列である。

手順（２）タグ捕捉プローブ固定化担体の作製
実施例１の手順（２）〜（４）で得られるものと同じタグ捕捉プローブ固定化担体を作製した。

手順（３）ＶＮＴＲ配列を含む領域のＰＣＲによる増幅
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞由来）細胞およびＨＬ６０（ヒト前骨髄性白血病細胞由来）細胞を用いて、核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（（株）キアゲン製）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡは、２０ｎｇ／μＬになるように純水で希釈し、使用するまで−３０℃で凍結保存した。得られたヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、手順（１）の配列番号１０４〜１０５のプライマーセットを用いてＩＬ−１ｒａに含まれるＶＮＴＲ領域をＰＣＲにより増幅した。

ＰＣＲにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で３０サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、このＰＣＲは単に標的核酸中の特定領域を増幅することが目的であるため、ＰＣＲの方法や酵素の種類に特段の制限はない。

ここで、ＰＣＲには常法に従い、以下の試薬を含む５０μＬ水溶液を調製した。ＶＮＴＲ領域を増幅するフォワードプライマー（配列番号１０４）１５ｐｍｏL、リバースプライマー（配列番号１０５）１５ｐｍｏＬ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ―Ｖｅｒｓ．２：5 μL、２ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ：８μＬ、２５ｍＭＭｇＳＯ_４：５μＬ、ＫＯＤ―Ｐｌｕｓ―：１Ｕ、ゲノムＤＮＡ：１００ ｎｇ
また、ＰＣＲは、９５℃・5分、９５℃・３０秒／５５℃・３０秒／６８℃・３０秒を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。その後、ＧＦＸ PＣR ＤＮＡ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））により精製し、余剰のｄＮＴＰｓを除いた。

手順（４）アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物長確認
手順（３）で得られたＰＣＲ産物の長さを電気泳動により評価した。電気泳動の条件は、２％アガロースゲルを、２０×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ（（株）インビトロジェン製）を２０倍希釈した展開液を用いて、１００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液で核酸を染色し、増幅したＰＣＲ産物の長さを求めた。その結果、ＨＥＫ２９３細胞由来のＰＣＲ産物断片は８５１ｂｐ／１０２３ｂｐに、ＨＬ６０細胞由来のＰＣＲ産物断片は１０２３ｂｐであった。配列番号１０４及び配列番号１０５によって増幅される領域は繰返し回数が２回のとき８５１ｂｐであり、繰返し単位あたり８６ｂｐであることから、繰返し回数が３回のとき９３７ｂｐ、４回のとき１０２３ｂｐ、５回のとき１１０９ｂｐ、６回のとき１１９５ｂｐとなる。このことから、ＨＥＫ２９３細胞のゲノムの反復数は２回と４回のヘテロであり、ＨＬ６０細胞のゲノムの反復数は４回のホモであると確認された。

手順（５）特異的なｄｄＮＴＰの取り込み反応
実施例１の手順（６）のチューブ１の配列番号９１〜９７の代わりに、配列番号１０７を用いたこと、配列番号９９の代わりに配列番号１０８を用いたことと、標識ラベルにＣｙ３−ｄｄＡＴＰ、Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ、非標識ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰを用いたこと以外は、実施例１の手順（６）と同様に行った。

手順（６）ハイブリダイゼーション
取り込み反応液を手順（５）の取り込み反応液９．６μＬにした以外は、実施例１の手順（７）と同様に行った。

手順（７）蛍光シグナル強度の測定
ＤＮＡチップ用のスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ, ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ, Ｂｏｓｔｏｎ, ＭＡ）に手順（６）の処理後の担体をセットし、蛍光シグナル強度の測定を行った。測定条件は、レーザー出力７０％、フォトマルチプレイヤーを適度に調整した。ここでの蛍光シグナル強度とはスポット内の蛍光シグナル強度の平均値である。

その結果、検出すべき配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０７の各塩基配列分析用プライマーを捕捉する配列番号８、配列番号９および配列番号１１に相補的な配列を有する各タグ捕捉プローブのスポットにおいて特異的に蛍光シグナルを検出した。一方、配列番号１〜７、配列番号１０および配列番号１２〜７８に相補的な配列を有する各タグ捕捉プローブのスポットからは蛍光シグナルは検出されず、配列番号１〜７８のタグ捕捉プローブのセットは多型の特異的な検出において有効であることが確認された。

手順（８）多型の検出
次に、本方法では以下のように各ＶＮＴＲに対応する蛍光シグナルの色（取り込まれた蛍光標識ｄｄＮＴＰｓ）及び強度から多型の塩基配列の分析を行った。まず反応チューブに一定量加えたコントロールの蛍光シグナル（コントロール１）による補正を行った。繰り返し配列単位の反復数を検出するために、配列番号１００、１０３、１０７のプライマーを捕捉するタグ捕捉プローブを固定化したスポットから得られる各蛍光シグナル強度から、コントロール１のＣｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナル強度を１と補正した場合のＲ=（Ｃｙ３の蛍光シグナル強度／Ｃｙ５の蛍光シグナル強度）を得た。ここで、蛍光シグナル強度の値としてはブランクスポット（スポット溶液のみをスポットした部分）のＣｙ３およびＣｙ５の蛍光シグナル強度を引いた値を用いている。

ＨＥＫ２９３細胞の結果は、Ｒ＝２．３、ＨＬ６０細胞の結果は、Ｒ＝３．１であった。
手順（４）からＨＥＫ２９３細胞は２回と４回のヘテロであることから、理論的にＲ＝Ｃｙ３／Ｃｙ５＝４／２＝２であることが期待される。またＨＬ６０は４回のホモであることから理論的には、Ｒ＝６／２＝３である。

この結果から、本発明のタグ配列によって塩基配列分析用プライマーのシグナルを検出することにより、繰り返し塩基配列の反復数を正確に定量できることがわかった。

塩基配列分析用プライマーの模式図と、該塩基配列分析用プライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションを例示する模式図である。 塩基配列分析用プライマーに、多型の一塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。 数十塩基を１単位とする繰返し塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。 塩基配列分析用プライマーに、多型の繰り返し塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。 担体に固定化されたタグ捕捉プローブを用いて、塩基配列分析用プライマーを含む標識された選択結合性物質を特異的に捕捉する工程を例示する模式図である。 担体とカバーとを含むタグ捕捉プローブが固定化された本発明のバイオチップの概略を例示する斜視図及び断面図である。 本発明のタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップの一例の断面図である。 ＰＭＭＡ担体の表面処理により担体表面にカルボキシ基を生成させ化学反応スキームである。 ＰＭＭＡ担体表面のカルボキシ基とアミノ化プローブＤＮＡとの縮合反応スキームである。 担体に固定化された複数のタグ捕捉プローブを用いて、塩基配列分析用プライマーを含む標識された選択結合性物質を特異的に捕捉する工程を例示する模式図である。 繰り返し塩基配列の繰り返し回数とシグナル強度の関係を示すグラフである。

符号の説明

１ 担体
２ カバー
３ 接着層（ＰＤＭＳ）
４ 貫通孔
５ 担体に固定化されたタグ捕捉プローブ
６ ビーズ

Claims (6)

1. 配列番号１〜７８に記載の配列および配列番号１〜７８と相補的な配列からなる群から選択されるいずれかの配列のポリヌクレオチドである、選択結合性物質を検出するためのタグ配列。
2. 前記選択結合性物質が多型を含む核酸である請求項１に記載のタグ配列。
3. 前記タグ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドが担体に固定化されたバイオチップ。
4. 前記担体がその表面に凹凸部を有し、該凸部の上端面にタグ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドが固定化された請求項３に記載のバイオチップ。
5. 前記タグ配列を結合させた前記選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する、選択結合性物質の検出方法。
6. 前記選択結合性物質が多型を含む核酸であって、
   標的核酸中の多型の３’側に隣接する塩基配列に相補的な配列を有するプライマーの５’末端側に前記タグ配列を付加した塩基配列分析用プライマーを用い、該標的核酸と該塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、複合体を形成する第１の工程、
   第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに該多型の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識された選択結合性物質を得る第２の工程、
   第２の工程で得られた標識された選択結合性物質を、該タグ配列を介して特異的に捕捉する第３の工程、
   該標識された選択結合性物質中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定し、該標識の存在又はシグナル強度を指標として多型の塩基配列を解析する第４の工程、
   を含む、請求項５に記載の選択結合性物質の検出方法。

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