JP2013535986A - 核酸の捕捉法および配列決定法 - Google Patents

核酸の捕捉法および配列決定法 Download PDF

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Abstract

標的核酸分子を捕捉し配列決定する方法が提供される。ゲノムＤＮＡのメチル化状態の決定法も提供される。

Description

（関連出願）
本出願は、２０１０年８月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／４０２，３５０号に対し米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、核酸の混合物から標的核酸分子を分離し、このような分子の配列を決定することに関する。
ヒトゲノムの全解読完了以降、ゲノム研究は「再配列決定」に方向転換しており、例えば疾患関連変異などの異形がゲノム全体にわたり同定される。対象となる例えばエキソンなどの特定領域を濃縮された「区分けされた」ゲノムの再配列決定は、それらの領域の「捕捉」と配列決定に関する複数の工程が必要である。例えば、あるマイクロアレイ法では、ゲノムＤＮＡは剪断されて特定の範囲の大きさの断片にされ、断片は末端修復され特定のアダプターにライゲートされて増幅され、次いで増幅断片は、対象となるリファレンスゲノム配列の相補的プローブを含むマイクロアレイを使用して捕捉され、捕捉（ハイブリダイズ）された断片は溶出されて増幅され、増幅断片は、例えば「次世代」配列決定技術または再配列決定アレイなどを使用して配列決定される。例えば、国際公開第２００８／１１５１８５号、Okouら(2007)のNature Methods 4:907-909、Hodgesら(2007)のNature Genetics 39:1522-1527などを参照されたい。対象となる核酸の分離および配列決定に要する工程が減少すれば、効率や確度が向上し、潜在的にコスト削減にもなろう。本発明は、この必要性を満たし、他の利点をもたらす。
シトシンのメチル化は一般にゲノムのＣｐＧジヌクレオチドで生じ、遺伝子制御やエピジェネティック遺伝で重要な役割を果たす。ゲノム領域のメチル化状態を決定する特定の既存法では、亜硫酸水素塩（bisulfite）処理を使用する。これらの方法では、変性ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素イオンに曝露すると、シトシンは脱アミノ化してウラシルになるが、メチル化シトシンはこの変換から保護される。変換現象の有無は、例えば次世代配列決定法によって、またはプローブアレイを使用して検出されうる。例えば国際公開第２０１０／０８５３４３号を参照されたい。このような方法はしばしば複数の工程、例えば、増幅、捕捉、溶出および亜硫酸水素塩処理を施したＤＮＡの配列決定という工程をとるか、あるいは対象となるゲノム領域すべてにおいて変換現象の有無を調査するためのプローブを設計する必要があるが、コストもかかり煩雑になりうる。さらに、このような方法では個々のＤＮＡ分子レベルでのメチル化状態を評価するのではなく、対象となる特定のゲノム領域に対する核酸分子群を調査する。本発明はゲノムＤＮＡのメチル化状態を評価する効率と確度の高い方法を提供し、当分野における必要性を満たし、他の利益をもたらす。
一態様では、標的核酸分子を捕捉し配列決定する方法が提供され、この方法は、（ａ）個体支持体をハイブリダイズ条件下で標的核酸分子を含む核酸混合物に曝露し、ここで標的核酸分子は、プライミング能力のある構造で個体支持体に固定されたプライマーと特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、（ｂ）個体支持体から非結合核酸および非特異的結合核酸を分離し、（ｃ）個体支持体を重合条件下でポリメラーゼおよびヌクレオチドに曝露し、（ｄ）標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによる固定されたプライマーからの核酸重合を検出することにより、標的核酸分子の核酸配列を決定することを含む。
一実施態様では、標的核酸分子はゲノムＤＮＡ領域に由来する。このような一実施態様では、標的核酸分子はエキソンをすべてまたは部分的に含む。別の実施態様では、標的核酸分子はＲＮＡであり、ポリメラーゼは逆転写酵素であり、プライマーは３’ポリ-Ｔ配列を含む。別の実施態様では、標的核酸分子はＤＮＡであり、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様では、ヌクレオチドは末端のリン酸に標識されている。このような一実施態様では、ポリメラーゼは、ＦＲＥＴドナーで標識されており、ヌクレオチドはＦＲＥＴアクセプターで標識されている。このような一実施態様では、ＦＲＥＴドナーは蛍光ナノ粒子である。
別の態様では、ゲノムＤＮＡ断片のメチル化状態を決定する方法が提供され、この方法は、（ａ）ゲノムＤＮＡを個体支持体に固定し、（ｂ）固定されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を検出することにより、個体支持体に固定されたＤＮＡ断片の核酸配列を決定し、（ｃ）固定されたゲノムＤＮＡ断片を亜硫酸水素塩処理に供し、（ｄ）固定された亜硫酸水素塩処理を施されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を検出することにより、個体支持体に固定された亜硫酸水素塩処理を施されたゲノムＤＮＡ断片の核酸配列を決定し、（ｅ）（ｂ）で決定された核酸配列を（ｄ）で決定された配列と比較することを含み、ここでゲノムＤＮＡ断片のシトシン残基の変換は、亜硫酸水素塩処理前にゲノムＤＮＡ断片の当該残基がメチル化されていなかったことを示し、ゲノムＤＮＡ断片のシトシン残基が変換されないことは、亜硫酸水素塩処理前にゲノムＤＮＡ断片の当該残基がメチル化されていたことを示す。
一実施態様では、ゲノムＤＮＡ断片は個体支持体にアダプターによって固定される。このような一実施態様では、アダプターはプライマー結合部位を含み、プライマー結合部位中のシトシンは保護される。このような一実施態様では、（ｂ）および／または（ｄ）のポリメラーゼは、プライマー結合部位にアニールされたプライマーからの核酸鎖を重合する。別の実施態様では、（ｂ）および／または（ｄ）の核酸重合は、標識ヌクレオチドの取り込みを検出することにより検出される。このような一実施態様では、標識ヌクレオチドはその末端のリン酸に標識される。このような一実施態様では、（ｂ）および／または（ｄ）のポリメラーゼは、ＦＲＥＴドナーで標識され、ヌクレオチドはＦＲＥＴアクセプターで標識される。このような一実施態様では、ＦＲＥＴドナーは蛍光ナノ粒子である。
図１は、相補的オリゴヌクレオチドを使用しての、オリゴヌクレオチドアレイ上の剪断されたＤＮＡ選択領域の直接的捕捉と、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にする、ＤＮＡの捕捉に使用されるオリゴヌクレオチドの自由３’末端ならびに標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用しての、捕捉されたＤＮＡの直接的配列決定を示す図である。 図２は、相補的オリゴヌクレオチドで被覆したビーズを使用しての、剪断されたＤＮＡ選択領域の直接的捕捉と、その後のビーズ配置と、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にする、ＤＮＡの捕捉に使用されるオリゴヌクレオチドの自由３’末端ならびに標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用しての捕捉されたＤＮＡ配列決定を示す図である。 図３は、ポリ-ｄＴオリゴヌクレオチドアレイ上のＲＮＡの直接的捕捉と、捕捉されたＲＮＡをポリ-ｄＴオリゴヌクレオチドアレイの自由３’末端と逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換することにより、捕捉されたＲＮＡの配列を決定する図である。ｃＤＮＡ変換の後、ｃＤＮＡは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にする、ポリ-Ａプライマーならびに標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用して配列を決定される。あるいは、捕捉されたＲＮＡは、その配列を得るため、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）と逆転写酵素の直接的モニタリングを可能にする、標識逆転写酵素および標識ｄＮＴＰを使用して直接的に配列決定されうる。 図４は、ビーズに固定されたポリ-ｄＴオリゴヌクレオチドを使用してのＲＮＡの直接的捕捉を示す図であり、ビーズを表面に配置し、次いで捕捉したＲＮＡをポリ-ｄＴオリゴヌクレオチドの自由３’末端と逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換する。ｃＤＮＡ変換の後、ｃＤＮＡは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にする、ポリ-Ａプライマーならびに標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用して配列を決定される。あるいは、捕捉されたＲＮＡは、その配列を得るため、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）と逆転写酵素の直接的モニタリングを可能にする、標識逆転写酵素および標識ｄＮＴＰを使用して直接的に配列決定されうる。 図５は、２巡目の配列決定が、メチル化シトシンのウラシル変換を可能にする亜硫酸水素塩処理後に行われる、連続的な反応におけるアレイ上の同一ＤＮＡ分子配列決定により、核酸メチル化状態を決定する図である。適切なプライマー、標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にする。 図６は、２巡目の配列決定が、メチル化シトシンのウラシル変換を可能にする亜硫酸水素塩処理後に行われる、連続的な反応におけるビーズ上の同一ＤＮＡ分子配列決定により、核酸メチル化状態を決定する図である。適切なプライマー、標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基（配列）とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にする。
（Ｉ 定義）
「亜硫酸水素塩処理」は、核酸を亜硫酸水素イオン（例えば亜硫酸水素マグネシウムや亜硫酸水素ナトリウム）に未保護シトシンのウラシル変換に十分な濃度で曝露することを指す。「亜硫酸水素塩処理」はまた、核酸を、未保護シトシンをウラシルに変換するのに使用されうる他の試薬、例えば二亜硫酸塩および重亜硫酸塩などに適切な濃度で曝露することを指す。「亜硫酸水素塩処理」は一般に、核酸を亜硫酸水素イオンまたは他の試薬に曝露した後、例えばＮａＯＨなどの塩基に曝露することを含む。
「シトシン残基の変換」は、亜硫酸水素塩処理の結果としてシトシン残基がウラシル残基に変換することを指す。
「エキソン」は、ゲノムのコード領域を指す。
「ハイブリダイズ条件」は、相補的核酸鎖のハイブリダイゼーションを許容する条件を指す。
「核酸配列決定」は、標的核酸分子の少なくとも１個のヌクレオチドのアイデンティティを決定することを指し、いくつかの実施態様では、標的核酸分子の複数のヌクレオチドのアイデンティティを決定することを指す。
「固定された」および「固定する」は、相補的塩基対形成以外の方法により、直接的または間接的に、核酸を個体支持体に付着させることを指す。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、ある特異的ハイブリダイゼーション複合体の核酸の二本鎖のうち少なくとも一方が個体支持体に固定されていれば、上述のように個体支持体に固定されているとみなされる。
「標識」は、直接的または間接的に検出されうる任意の部分を指す。
「核酸」は、任意長のヌクレオチドのポリマーを指す。
「ヌクレオチド」は、伸長する核酸鎖にポリメラーゼによって取り込まれることができるヌクレオチドおよびそのアナログを指す。ヌクレオチドは、限定ではないが、一般にＤＮＡに取り込まれる４種類のヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）、一般にＲＮＡに取り込まれる４種類のヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル）、イノシン酸などの修飾塩基を有するヌクレオチドおよび標識されるかまたはそれ以外の修飾されたヌクレオチドを含む。
「ポリメラーゼ」は、重合条件下で伸長する核酸鎖にヌクレオチドを取り込むことができる、天然のまたは天然ではない酵素またはその酵素的活性断片を指し、限定ではないが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む。
「重合条件」は、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖に取り込むことを許容する条件を指す。
「プライマー」は、ポリメラーゼによりヌクレオチドが付加されうる核酸を指す。「付加される」は、ヌクレオチドがポリメラーゼによりプライマーに直接付加されることと、次いでヌクレオチドがプライマー由来の伸長する核酸鎖に付加されることを指す。
「プライミング能力のある（priming-competent）構造」は、プライマーが、ポリメラーゼがヌクレオチド付加に利用できる反応基を有することを指す。
「個体支持体」は、任意の個体支持体を指す。
「特異的ハイブリダイゼーション複合体」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でおよび／またはストリンジェントな洗浄条件下で形成可能かまたは実質的に維持される特異的ハイブリダイゼーション複合体を指す。
「標的核酸分子」は、対象となる任意の標的核酸分子を指す。
「鋳型」は、ポリメラーゼが相補的核酸鎖を合成するのに使用できる、一本鎖の核酸か、または二本鎖の核酸の変性された領域を指す。
（ＩＩ 標的核酸分子の捕捉および配列決定）
一実施態様では、本発明は、個体支持体に固定された、例えばプライマーなどの相補的核酸を使用して、標的核酸分子を捕捉する方法に関する。ある実施態様では、次いで、標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによるプライマーからの核酸重合を検出することにより、標的核酸分子の核酸配列が決定される。検出は、単分子レベルで発生し、リアルタイムまたはほぼリアルタイムである。
（標的核酸分子）
様々な実施態様では、標的核酸分子はＤＮＡである。一実施態様では、標的核酸分子は、ヒトゲノムまたは他の任意の生物のゲノムなどのゲノムの任意の領域（「標的領域」）に相当しうる。標的領域は、１つまたは複数の複数メガベースの連続するブロック、１つまたは複数の染色体の全エキソンなどの複数のより小さい連続する領域または非連続の領域、またはＳＮＰを含むことがわかっている部位などでありうる。標的領域を含むゲノムは部分的であっても完全であってもよい。ゲノムは、患者試料またはプールされた患者試料、セルラインまたはセル培地、生検材料、正常な組織試料または腫瘍や他の疾患の組織および当業者が認めうる他の生物学的供給源などの任意の生物学的供給源に由来しうる。一実施態様では、標的核酸を含むゲノムＤＮＡは、例えば超音波処理または水力学的力により剪断され、一般に約２００〜６００塩基対の断片にされ、標的核酸分子はこれらの断片またはその分画部分から捕捉される。別の実施態様では、標的核酸分子は、コード配列または非コード配列でありうる。このような一実施態様では、標的核酸分子はエキソンであるか、またはその一部分である。
様々な実施態様では、標的核酸分子はＲＮＡである。一実施態様では、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ転写物であるか、またはその一部分である。このような一実施態様では、標的核酸分子は、ｍＲＮＡ転写物であるか、またはそのポリ-Ａテールを有する一部分である。ポリ-Ａテールの存在により、一般にプライマーの３’末端に十分な長さのポリ-Ｔ配列を含むプローブまたはプライマーにハイブリダイゼーションが可能になる。別の実施態様では、標的核酸分子は、例えば逆転写酵素などによりＲＮＡから生じたｃＤＮＡである。
（捕捉）
様々な実施態様では、標的核酸分子は、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）またはｃＤＮＡの分子などの核酸の混合物から捕捉される。一実施態様では、混合物中の核酸は、標的核酸分子の捕捉前に増幅される。これは、例えばユニバーサルなプライミング部位を含むアダプターを混合物中の核酸分子の末端にライゲートさせて得られ、末端はライゲーション前に随意に末端修復しうる。ユニバーサルプライマーは、混合物中の核酸増幅にこのように使用されうる。
様々な実施態様では、標的核酸分子は、個体支持体に固定された相補的核酸を使用して捕捉される。相補的核酸は、標的核酸分子に対し完全に相補的である必要はなく、標的核酸分子と相補的核酸分子が特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成可能である限りミスマッチを含有してよい。一実施態様において、相補的核酸はプライマーである。このような一実施態様では、プライマーは、プライミング能力がある構造で個体支持体に固定される。例えば、３’-ＯＨを有するプライマーは個体支持体に固定されており、３’-ＯＨはポリメラーゼがプライマーの３’末端にヌクレオチドを付加するのに利用できる。これは、プライマーにプライミング能力がある限り、例えばプライマーをその５’末端で、またはプライマーの内部領域で個体支持体に固定することで得られうる。プライマーは、標的核酸分子と特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成可能である限り、任意長でよく、ある実施態様では、プライマー長は、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００塩基対である。
当分野は、核酸を個体支持体に固定する方法に通じている。例えば、上記提供された相補的核酸などの核酸は、共有結合または非共有結合などで個体支持体に固定されうる。適切な化学的リンカーまたは他の結合法は、当業者には公知である。例えば、一実施態様では、固定される核酸はビオチン化され（例えば、１つまたは複数のビオチン化ヌクレオチドを含む）、個体支持体は、その表面にストレプトアビジンを有し、核酸のビオチン部分がストレプトアビジンに結合して核酸を固定する。別の実施態様では、上記の実施態様で提供された固定処理は、核酸を個体支持体に合成して得られる。例えば、プライマーは、個体支持体に対し遠位のプライマー末端に利用可能な３’-ＯＨを残して、ヌクレオチドを５’から３’の方向に重合させることにより個体支持体に合成されうる。高密度マイクロアレイなどの、オリゴヌクレオチドを個体支持体に５’から３’方向に合成する化学的方法は、当分野では公知であり、本明細書に記載の目的に使用されうる。その全体を本明細書に引用として組み込まれるAlbertら(2003)の「Light directed 5’→3’ synthesis of complex oligonucleotide microarrays」 Nucleic Acids Res. 31(7):e35を参照されたい。
様々な実施態様では、個体支持体は、核酸が固定されうる任意の基材（substrate）でよい。このような基材は、限定ではないが、ガラス（例えば顕微鏡ガラススライド）、金属、セラミック、高分子ビーズおよび他の基材を含む。ある実施態様では、個体支持体は、例えばマイクロアレイなどのアレイの形態でよい。ある実施態様では、核酸は例えばビーズなどの個体支持体に固定されてから捕捉されるか、または例えばガラススライドまたはマイクロアレイなどの別の個体支持体に固定されてよい。
ある実施態様では、相補的核酸が固定された個体支持体は、標的核酸分子を含む核酸の混合物にハイブリダイズ条件下で曝露される。標的核酸分子はこのようにして相補的核酸と特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成する。別の実施態様では、個体支持体は非結合核酸および非特異的結合核酸を除去するために洗浄され、これにより（特異的ハイブリダイゼーション複合体に含有される）標的核酸分子を混合物中の他の核酸から分離する。ある実施態様では、個体支持体を核酸混合物に曝露することおよび／または個体支持体を洗浄することは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下および／またはストリンジェントな洗浄条件下でそれぞれ行われる。
本明細書では、「ハイブリダイゼーション」は相補的核酸鎖の対形成を指す。ハイブリダイゼーションとその強度（すなわち核酸鎖間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、条件のストリンジェンシー、ハイブリダイゼーション複合体のＴｍおよび核酸のＧ：Ｃ比率といった要因の影響を受ける。本発明は特定のハイブリダイゼーション条件の組に限定されるものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が使用されうる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ルーチンな方法を使用して当業者が経験的に決定してよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、配列に依存すると同時に塩濃度および有機溶媒の存在などの環境的要因に依存する。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特異的核酸配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃から２０℃低く選択される。ある実施態様では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、相補的核酸に結合する特異的核酸の熱融解点よりも約５℃から１０℃低い。Ｔｍとは、核酸（例えば標的核酸分子）の５０％が完全適合するプライマーに（規定のイオン強度およびｐＨで）ハイブリダイズする温度である。
同様に、ストリンジェントな洗浄条件は、ルーチンな方法を使用して当業者が経験的に決定してよい。例えば、ストリンジェントな洗浄条件は、例えばアレイなどの個体支持体に固定された特異的ハイブリダイゼーション複合体から非特異的に結合した核酸を確実に分離しうる条件である。一実施態様では、アレイは、ハイブリダイゼーション条件（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）に曝露された後、順次低濃度となる塩を含むバッファーおよび／または高濃度の洗浄剤および／または上昇する温度で、特異的ハイブリダイゼーション対非特異的ハイブリダイゼーションのシグナル対ノイズ比率が、特異的ハイブリダイゼーション、例えば完全にまたは実質的に完全な相補性を共有する核酸鎖間のハイブリダイゼーションを容易に検出できるほど高くなるまで洗浄される。ある実施態様では、ストリンジェントな洗浄条件は、約３０℃、３７℃、４２℃、４５℃、５０℃または５５℃の温度を含む。ある実施態様では、ストリンジェントな洗浄条件の塩濃度は、≦１Ｍ、≦５００ｍＭ、≦２５０ｍＭ、≦１００ｍＭ、≦５０ｍＭまたは≦２５ｍＭを含むが、≧１０ｍＭは含まない。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸中４２℃である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．１×ＳＳＣ（ＥＤＴＡを含有）中５５℃である。
（配列決定）
標的核酸分子（特異的ハイブリダイゼーション複合体に含有される）は、混合物の他の核酸から分離された後、配列決定されうる。様々な実施態様では、この工程は一般に「再配列決定」と称され、リファレンスゲノムからの標的領域の配列は既知である。再配列決定の現行法では、標的核酸分子を増幅させた後、特異的ハイブリダイゼーション複合体から溶出させることが必要であり、増幅された標的核酸分子は次いで「次世代」配列決定技術（例えばパラレルで高スループットの配列決定ができる配列決定プラットフォーム）または再配列決定アレイ（核酸の個々のセグメントにおける変異の有無を特異的に検出するプローブを含むマイクロアレイ）を使用して配列が決定される。溶出工程および増幅工程の要件は時間とリソースを消費し、試料の欠失または標的核酸分子群内の個別の標的核酸分子のバイアス表示のおそれがある。
したがって、様々な実施態様では、特異的ハイブリダイゼーション複合体から標的核酸分子を溶出させることなく標的核酸分子の再配列決定を行う。これは、一実施態様では、特異的ハイブリダイゼーション複合体に含有される相補的核酸が、プライミング能力のある構造で個体支持体に固定されたプライマーである場合に達成される。例えば、プライマーは、標的核酸分子の特定領域に、当該核酸分子の残りの部分は一本鎖の形態で、ハイブリダイズされうる。したがって、ポリメラーゼは、標的核酸分子の一本鎖の（ハイブリダイズされていない）部分を鋳型として使用し、プライマーの利用可能な３’-ＯＨにヌクレオチドを付加することが可能になる。ポリメラーゼにより合成された核酸鎖は、標的核酸分子の配列を決定するのに使用される。
したがって、特異的ハイブリダイゼーション複合体がプライマーを通じて固定される個体支持体は、重合反応混合物に曝露されうる。一実施態様では、重合反応混合物は、ポリメラーゼとヌクレオチドを含む。ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素でよい。標的核酸分子がＲＮＡである場合、ポリメラーゼは逆転写酵素でよい。標的核酸分子がＤＮＡである別の実施態様では、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。ある例示的ＤＮＡポリメラーゼは、限定ではないが、細菌性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶならびにＤＮＡ ｐｏｌ ＩのＫｌｅｎｏｗ断片）、ウイルス性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴ４およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ）、古細菌性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばテルムス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、「ディープベント（Deep Vent）」ＤＮＡポリメラーゼ（New England BioLabs）、真核生物ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの操作または修飾した変異体などを含む。ある例示的ＲＮＡポリメラーゼは、限定ではないが、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼならびこれらの操作または修飾した変異体などを含む。ある例示的逆転写酵素は、限定ではないが、ＨＩＶ、ＭＭＬＶおよびＡＭＶからの逆転写酵素ならびにスーパースクリプト（Invitrogen, Carlsbad, CA）などの市販の逆転写酵素などを含む。
ある実施態様では、重合反応混合物中のヌクレオチドおよび／またはポリメラーゼは標識される。一実施態様では、１、２、３または４種類のヌクレオチドが区別して標識される。このような一実施態様では、４種類のヌクレオチドが異なる４つの標識で標識される。例えば、ｄＮＴＰの場合、アデニン（またはその機能的に同等のアナログ）、グアニン（またはその機能的に同等のアナログ）、シトシン（またはその機能的に同等のアナログ）およびチミン（またはその機能的に同等のアナログ）はそれぞれ、例えば異なるフルオロフォアなどの別々の標識で標識される。同様に、ｒＮＴＰの場合、アデニン（またはその機能的に同等のアナログ）、グアニン（またはその機能的に同等のアナログ）、シトシン（またはその機能的に同等のアナログ）およびウラシル（またはその機能的に同等のアナログ）はそれぞれ、例えば異なるフルオロフォアなどの別々の標識で標識される。適切な標識は、限定ではないが、発光性の、光ルミネセンスの、エレクトロルミネセンスの、バイオルミネセンスの、化学ルミネセンスの、蛍光のおよび／またはリン光性の標識を含む。蛍光の標識は、限定ではないが、キサンチン染料、フルオレセイン、シアニン、ローダミン、クマリン、アクリジン、テキサスレッド染料、ＢＯＤＩＰＹ、ＡＬＥＸＡ、ＧＦＰおよびそれらの変更を含む。標識は、ヌクレオチドに直接付着させるか、または適切なリンカーを介して付着させてよい。標識は、ポリメラーゼが伸長する核酸鎖にヌクレオチドを取り込む能力に有意に干渉しない、任意の位置に付着させてよい。一実施態様では、標識をヌクレオチドのリン酸、例えばヌクレオチドの末端のリン酸に付着させるので、ヌクレオチドのリン酸鎖および標識は、伸長する核酸鎖にヌクレオチドが取り込まれると切断される。標識ヌクレオチドおよび／またはポリメラーゼは、ポリメラーゼに合成された核酸鎖の検出を可能にしうる。
ある実施態様では、標的核酸分子の配列は、ポリメラーゼによって伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドを、取り込まれる順に同定することで決定される。一実施態様は、伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドの標識を、ヌクレオチドが取り込まれる順に、直接的または間接的に検出することと、検出された標識をヌクレオチドのアイデンティティと相関させることで伸長する核酸鎖の配列を確認することを含む。このように、標的核酸分子（または、プライマーが標的核酸分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のどちらにハイブリダイズするかによって、その相補鎖）の配列が決定される。このような実施態様では、標識の検出および基本的には標的核酸分子の配列決定は、リアルタイムかつ「単分子」レベルで行われる。上述し、また以下にも例示するが、ヌクレオチドが伸長する核酸鎖に取り込まれるのと同時に標識は除去されるので、得られる核酸鎖は標識されない。
伸長する核酸鎖に取り込まれる標識ヌクレオチドを検出するいくつかの方法は、国際公開第２０１０／００２９３９号に記載されている。このような方法は、分子同士が違いに十分近い距離にあるときの「ドナー」分子（ＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移）ドナー）と「アクセプター」分子（ＦＲＥＴアクセプター）間のＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移に依拠する。特定の実施態様では、ポリメラーゼは、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアで標識され、ヌクレオチドはＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアで標識されている。ポリメラーゼがヌクレオチドを伸長する核酸鎖に取り込むと、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアおよびＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアは互いに近づき、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアからＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアへのエネルギーの移動が可能になる。エネルギー移動により、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアからの発光強度は低減し、ＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアの発光強度は増加する。ＦＲＥＴアクセプターの発光スペクトルの検出は、取り込まれているヌクレオチドのアイデンティティを示す。一実施態様では、ポリメラーゼに付着したＦＲＥＴドナーは、国際公開第２０１０／００２９３９号に記載のように、蛍光ナノ粒子、例えばナノ結晶、より具体的には量子ドットである。ＦＲＥＴドナーは、ドナー発光が生成されるレーザーなどの励起源で照射しうる。別の実施態様では、異なるＦＲＥＴアクセプターが１つまたは複数の種類のヌクレオチドそれぞれに、より具体的には３種類または４種類のヌクレオチドそれぞれに付着している。ＦＲＥＴアクセプターは、上述のどの蛍光標識であってもよい。
標識は、限定ではないが、電荷結合素子および全反射顕微鏡などの任意適切な方法または装置を使用して検出されうる。
標的核酸分子がポリ-ＲＮＡである実施態様では、標的核酸分子はポリ-Ｔ配列を含むプライマーを使用して捕捉される。ｃＤＮＡは、逆転写酵素を使用してプライマーから合成される（が配列は決定されない）。標的核酸分子は次いで、新たに合成されたｃＤＮＡ鎖を残して個体支持体の特異的ハイブリダイゼーション複合体から変性され、プライマーを介して個体支持体に固定される。個体支持体は次いで、新たに合成されたｃＤＮＡにハイブリダイズする、ポリ-Ａを含むプライマーに曝露される。新たに合成されたｃＤＮＡは、上述のように、個体支持体を重合反応混合物に曝露することにより配列決定され、ＤＮＡポリメラーゼが核酸鎖をポリＡプライマーから合成する。
上記の方法を用いて、複数の標的核酸分子は、対象となる標的核酸分子のそれぞれに特異的なプライマーを選択し、例えばマイクロアレイなどの個体支持体の個々の区域にプライマーを固定することにより、分離され配列決定されうる。このようにして、対象となる標的核酸分子は、高スループットで分離され配列決定されうる。
（ＩＩＩ メチル化状態の決定）
別の態様では、本発明は、ゲノムＤＮＡ断片内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態をゲノムＤＮＡ断片を個体支持体に固定することにより決定し、固定されたゲノムＤＮＡ断片の核酸配列をゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用するポリメラーゼによるヌクレオチド重合の検出により決定し、固定されたゲノムＤＮＡ断片を新たに合成された核酸鎖から変性させ、個体支持体を亜硫酸水素塩に曝露し、ゲノムＤＮＡ断片の核酸配列を、標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによるヌクレオチド重合の検出により決定する方法に関する。
（ゲノムＤＮＡ断片）
ゲノムＤＮＡ断片は、ヒトゲノムまたは他の任意の生物由来のゲノムなどの任意のゲノムから得られうる。ゲノムは部分的であっても完全であってもよい。ゲノムは、患者試料またはプールされた患者試料、セルラインまたはセル培地、生検材料、正常な組織試料または腫瘍や他の疾患の組織および当業者が認めうる他の生物学的供給源などの任意の生物学的供給源に由来しうる。一実施態様では、ゲノムＤＮＡは、例えば超音波処理または水力学的力により剪断され、一般に約２００〜６００塩基対の断片にされる。別の実施態様では、ゲノムＤＮＡは酵素消化により断片化される。
（ゲノムＤＮＡ断片の固定）
ゲノムＤＮＡ断片は、様々な方法のうち任意の方法で個体支持体に固定されうる。ゲノムＤＮＡ断片は、共有結合または非共有結合などで個体支持体に直接的または間接的に固定されうる。適切な化学的リンカーまたは他の結合法が当業者には公知である。特定の実施態様では、ゲノムＤＮＡ断片は変性され、個体支持体に一本鎖の形態で固定される。ゲノムＤＮＡ断片、例えば一本鎖のゲノムＤＮＡ断片は、結合用の核酸またはアダプターを介して個体支持体に固定される。例えば、アダプターは個体支持体に固定された状態で、ゲノムＤＮＡ断片の一端または両端にライゲートされうる。アダプターは、例えばオリゴヌクレオチドなどの一本鎖でありうる。ある実施態様では、アダプターは最初にゲノムＤＮＡ断片にライゲートされ、次いで個体支持体に固定されるか、あるいは、アダプターは最初に個体支持体に固定され、次いでゲノム断片が個体支持体上のアダプターにライゲートされる。別の実施態様では、アダプターはビオチン化され（例えば、１つまたは複数のビオチン化ヌクレオチドを含む）、個体支持体は、その表面にストレプトアビジンを有し、ビオチン部分がストレプトアビジンに結合してアダプターを固定する。
固定されたゲノムＤＮＡ断片の方向は、個体支持体から５’→３’でも、個体支持体から３’→５’でもよい。一実施態様では、固定されたゲノムＤＮＡ断片は、個体支持体から３’→５’に向けられる。別の実施態様では、固定されたゲノムＤＮＡ断片は一本鎖である。別の実施態様では、一本鎖ゲノム断片は、例えばオリゴヌクレオチドなどのアダプターを介して個体支持体に固定される。特定の実施態様では、ゲノムＤＮＡ断片は一本鎖であり、個体支持体に固定されたアダプターにライゲートされ、アダプターとゲノムＤＮＡ断片は、個体支持体から３’→５’に向けられる。
（配列決定）
固定されたゲノムＤＮＡ断片の配列は、個体支持体上で決定される。ある実施態様では、ゲノムＤＮＡ断片は、一本鎖の形態で個体支持体に固定されるか、または二本鎖の形態で個体支持体に固定され、その全体または一部は個体支持体に固定されたままの一本鎖に変換可能である。
ある実施態様では、個体支持体は、ハイブリダイゼーション条件下でプライマーに曝露され、プライマーとゲノムＤＮＡ断片は特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ある別の実施態様では、個体支持体は、ハイブリダイゼーション条件下でプライマーに曝露され、プライマーとアダプターは特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成する。このような一実施態様では、アダプターはゲノムＤＮＡ断片がライゲートされるオリゴヌクレオチドであり、アダプターは個体支持体に固定される。前述の実施態様では、ゲノムＤＮＡ断片またはアダプター中のプライマーが結合する核酸配列中のシトシンは、亜硫酸水素塩処理の結果の脱アミノ化から、例えば保護基を有することにより保護される。保護基は例えばメチル基でよく、保護されるシトシンは５-メチルシトシンでありうる。
別の実施態様では、個体支持体は重合反応混合物に曝露される。一実施態様では、重合反応混合物はＤＮＡポリメラーゼとヌクレオチドを含み、ＤＮＡポリメラーゼはゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用してプライマーから核酸鎖を合成する。このような一実施態様では、ＤＮＡポリメラーゼは、アダプターと特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成するプライマーから核酸鎖を合成し、アダプター（随意）とゲノムＤＮＡ断片は鋳型として使用される。例えば、アダプターとゲノムＤＮＡ断片が個体支持体から３’→５’方向に向いており、アダプターがゲノムＤＮＡ断片を個体支持体に結合させている場合、プライマーは個体支持体から５’→３’方向にアダプターにハイブリダイズしうるので、プライマーは、ポリメラーゼによるアダプターおよび（随意で）ゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用する５’→３’方向の合成をプライミングする。別のこのような実施態様では、ＤＮＡポリメラーゼは、ゲノムＤＮＡ断片と特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成するプライマーから核酸鎖を合成し、ゲノムＤＮＡ断片は鋳型として使用される。
適切なＤＮＡポリメラーゼは、限定ではないが、細菌性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶならびにＤＮＡ ｐｏｌ ＩのＫｌｅｎｏｗ断片）、ウイルス性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴ４およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ）、古細菌性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばテルムス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、「ディープベント（Deep Vent）」ＤＮＡポリメラーゼ（New England BioLabs）、真核生物ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの操作または修飾した変異体などを含む。
ある実施態様では、重合反応混合物中のヌクレオチドおよび／またはポリメラーゼは標識される。一実施態様では、１、２、３または４種類のヌクレオチドが区別して標識される。このような一実施態様では、４種類のヌクレオチドが異なる４つの標識で標識される。例えば、ｄＮＴＰの場合、アデニン（またはその機能的に同等のアナログ）、グアニン（またはその機能的に同等のアナログ）、シトシン（またはその機能的に同等のアナログ）およびチミン（またはその機能的に同等のアナログ）はそれぞれ、例えば異なるフルオロフォアなどの別々の標識で標識される。適切な標識は、限定ではないが、発光性の、光ルミネセンスの、エレクトロルミネセンスの、バイオルミネセンスの、化学ルミネセンスの、蛍光のおよび／またはリン光性の標識を含む。蛍光の標識は、限定ではないが、キサンチンダイ、フルオレセイン、シアニン、ローダミン、クマリン、アクリジン、テキサスレッドダイ、ＢＯＤＩＰＹ、ＡＬＥＸＡ、ＧＦＰおよびそれらの変更を含む。標識は、ヌクレオチドに直接付着させるか、または適切なリンカーを介して付着させてよい。標識は、ポリメラーゼが伸長する核酸鎖にヌクレオチドを取り込む能力に有意に干渉しない、任意の位置に付着させてよい。一実施態様では、標識をヌクレオチドのリン酸、例えばヌクレオチドの末端のリン酸に付着させるので、ヌクレオチドのリン酸鎖および標識は、伸長する核酸鎖にヌクレオチドが取り込まれると切断される。標識ヌクレオチドおよび／またはポリメラーゼは、ポリメラーゼに合成された核酸鎖の検出を可能にしうる。
ある実施態様では、ゲノムＤＮＡ断片の配列は、ポリメラーゼによって伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドを、取り込まれる順に同定することで決定される。一実施態様は、伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドの標識を、ヌクレオチドが取り込まれる順に、直接的または間接的に検出することと、検出された標識をヌクレオチドのアイデンティティと相関させることで伸長する核酸鎖の配列を確認することを含む。このように、ゲノムＤＮＡ断片（または、ゲノムＤＮＡ断片のセンス鎖またはアンチセンス鎖のどちらが固定されるかによって、その相補鎖）の配列が決定される。このような実施態様では、標識の検出および基本的にはゲノムＤＮＡ断片の配列決定は、リアルタイムかつ「単分子」レベルで行われる。上述し、また以下にも例示するが、ヌクレオチドが伸長する核酸鎖に取り込まれるのと同時に標識は除去されるので、新たに得られる核酸鎖は標識されない。
伸長する核酸鎖に取り込まれる標識ヌクレオチドを検出するいくつかの方法は、国際公開第２０１０／００２９３９号に記載されている。このような方法は、分子同士が違いに十分近い距離にあるときの「ドナー」分子（ＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移）ドナー）と「アクセプター」分子（ＦＲＥＴアクセプター）間のＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移に依拠する。特定の実施態様では、ポリメラーゼは、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアで標識され、ヌクレオチドはＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアで標識されている。ポリメラーゼがヌクレオチドを伸長する核酸鎖に取り込むと、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアおよびＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアは互いに近づき、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアからＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアへのエネルギーの移動が可能になる。エネルギー移動により、ＦＲＥＴドナーフルオロフォアからの発光強度は低減し、ＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアの発光強度は増加する。ＦＲＥＴアクセプターの発光スペクトルの検出は、取り込まれているヌクレオチドのアイデンティティを示す。一実施態様では、ポリメラーゼに付着したＦＲＥＴドナーは、国際公開第２０１０／００２９３９号に記載のように、蛍光ナノ粒子、例えばナノ結晶、より具体的には量子ドットである。ＦＲＥＴドナーは、ドナー発光が生成されるレーザーなどの励起源で照射しうる。別の実施態様では、異なるＦＲＥＴアクセプターが１つまたは複数の種類のヌクレオチドそれぞれに、より具体的には３種類または４種類のヌクレオチドそれぞれに付着している。ＦＲＥＴアクセプターは、上述のどの蛍光標識であってもよい。
標識は、限定ではないが、電荷結合素子および全反射顕微鏡などの任意適切な方法または装置を使用して検出しうる。
上記の方法を用いて、複数のゲノムＤＮＡ断片は、例えばマイクロアレイなどの個体支持体の個々の区域にゲノムＤＮＡ断片を固定することにより、分離され配列決定されうる。このようにして、対象となるゲノムＤＮＡ断片は、高スループットで固定され配列決定されうる。
（亜硫酸水素塩処理および処理後の配列決定）
ゲノムＤＮＡ断片の配列決定に次いで、新たに合成されたＤＮＡ鎖とゲノムＤＮＡ断片からなる特異的ハイブリダイゼーション複合体は（例えば熱または塩基の変性により）変性され、新たに合成されたＤＮＡ鎖がゲノムＤＮＡ断片から分離される。個体支持体上のゲノムＤＮＡ断片は亜硫酸水素塩処理に供される。亜硫酸水素塩処理の実施法は当分野では公知であり、例えばHermanら（1996）の Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826に記載されている。ゲノムＤＮＡ断片の未保護（非メチル化）シトシンは、こうしてウラシルに変換される。ゲノムＤＮＡ断片は、次いで上述のような配列決定プロトコールに供される。得られた配列は亜硫酸水素塩処理前に得られた配列と比較され、配列決定プロトコールにより生成された新たに合成された鎖に、例えばグアニンの代わりにチミンが存在することに示されるように、ゲノムＤＮＡ断片中でウラシル残基に変換されたシトシン残基が同定される。変換された残基はゲノムＤＮＡ断片中の非メチル化状態を示すが、変換されなかった残基はゲノムＤＮＡ断片中の保護された、すなわちメチル化状態を示す。このようにして、ゲノムＤＮＡ断片のメチル化状態が決定される。
[ａ]ＤＮＡ分子の直接的捕捉およびリアルタイムの配列決定
対象となる標的核酸分子を含むＤＮＡ（例えば、対象となるタンパク質コード領域を有するゲノムＤＮＡ）が、図１Ｂおよび図２Ｂに示すように適切な大きさに剪断される。対象となる領域の相補的オリゴヌクレオチドを収容する、例えばアレイ（図１Ａに示す）またはビーズ（図２Ａに示す）などの基材が使用される。対象となる領域は、例えばエキソンでありうる。剪断されたＤＮＡからの該当領域を含む核酸が、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを通じて基材上で捕捉される。図１では、剪断されたＤＮＡからの該当する領域を含む核酸が、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによりアレイ上で捕捉されている。図２では、剪断されたＤＮＡからの該当する領域を含む核酸が、ビーズ上の溶液に捕捉されている。非結合ＤＮＡおよび非特異的結合ＤＮＡは洗い流される。図２Ｃでは、ビーズは、例えば規則的アレイまたは不規則的アレイなどの別の基材に載置される。捕捉されたＤＮＡは、図１Ｃおよび図２Ｃに示すように、直接的配列決定に供される。これは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にするオリゴヌクレオチドの自由３’末端（プライマーとして機能する）、標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用して得られる。
[ｂ]ＲＮＡ分子の直接的捕捉およびリアルタイムの配列決定
図３Ｂおよび４Ｂに示すように、ポリ-Ａテールを含むＲＮＡが使用されうる。ポリ-ｄＴを含むオリゴヌクレオチドを含む、例えばアレイ（図３Ａに示す）またはビーズ（図４Ａに示す）などの基材も使用される。ＲＮＡは、図３Ｃおよび図４Ｃに示すように、ポリ-Ａテールがポリ-ｄＴを含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを通じて基材に捕捉される。非結合ＲＮＡおよび非特異的結合ＲＮＡは洗い流され、捕捉されたＲＮＡは、ポリ-ｄＴの自由３’末端と逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換される。ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換後、ｃＤＮＡ配列が決定される。ｃＤＮＡ配列決定の一実施態様では、オリゴヌクレオチドアダプターが新たに合成されたｃＤＮＡの自由３’末端にライゲートされ、次いでプライマーがそのアダプターにアニールされる。ｃＤＮＡは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にする当該プライマー、標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用して、配列決定される。あるいは、捕捉されたＲＮＡは、リアルタイムのｃＤＮＡ合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にする標識逆転写酵素および標識ｄＮＴＰを使用して、直接的に配列決定されうる。（図３Ｃ及び４Ｃを参照されたい。）
[ｃ]同一鋳型の再帰的配列決定によるメチル化状態決定
ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）のメチル化状態を決定するため、最初にＤＮＡは適切な大きさに剪断され、好ましくは図５Ｂおよび図６Ｂに示すように一本鎖に変換される。メチル化オリゴヌクレオチド（すなわちメチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド）を含む、例えばアレイ（図５Ａに示す）またはビーズ（図６Ａに示す）などの基材が使用される。剪断されたＤＮＡは、図５Ｃおよび図６Ｃに示すように、メチル化オリゴヌクレオチドにライゲートされる。ライゲートされたＤＮＡは、次いでリアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にする、アレイまたはビーズ上のメチル化オリゴヌクレオチドの相補的プライマー、標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用して、配列決定される。ライゲートされたＤＮＡの配列決定後、図５Ｄおよび図６Ｄに示すように、新たに合成された鎖は除去され、もとのＤＮＡはメチル化シトシンのウラシル変換が可能になるように亜硫酸水素塩で処理される。処理されたＤＮＡは、リアルタイムのＤＮＡ合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にするプライマー、標識ポリメラーゼおよび標識ｄＮＴＰを使用して、配列決定される。同一分子から得られた亜硫酸水素塩処理前と後の配列を比較することで、ＤＮＡのメチル化状態が決定できる。
本明細書内で引用されるすべての特許および刊行物は参照により組み込まれる。

Claims (16)

  1. 標的核酸分子を捕捉し配列決定する方法であって、
    （ａ）個体支持体を、ハイブリダイズ条件下で標的核酸分子を含んでなる核酸の混合物に曝露し、ここで標的核酸分子はプライミング能力のある構造で個体支持体に固定されたプライマーと特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、
    （ｂ）個体支持体から非結合核酸および非特異的結合核酸を分離し、
    （ｃ）個体支持体を重合条件下でポリメラーゼおよびヌクレオチドに曝露し、
    （ｄ）標的核酸分子の核酸配列を、標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を固定されたプライマーから検出することにより決定することを含む、方法。
  2. 標的核酸分子がゲノムＤＮＡ領域に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 標的核酸分子がエキソンをすべてまたは部分的に含む、請求項２に記載の方法。
  4. 標的核酸分子がＲＮＡであり、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、プライマーが３’ポリ-Ｔ配列を含む請求項１に記載の方法。
  5. 標的核酸分子がＤＮＡであり、ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
  6. ヌクレオチドが末端のリン酸に標識されている請求項１に記載の方法。
  7. ポリメラーゼがＦＲＥＴドナーで標識されており、ヌクレオチドがＦＲＥＴアクセプターで標識されている請求項６に記載の方法。
  8. ＦＲＥＴドナーが蛍光ナノ粒子である請求項７に記載の方法。
  9. ゲノムＤＮＡ断片のメチル化状態を決定する方法であって、
    （ａ）ゲノムＤＮＡ断片を個体支持体に固定し、
    （ｂ）個体支持体に固定されたゲノムＤＮＡ断片の核酸配列を、固定されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を検出することにより決定し、
    （ｃ）固定されたゲノムＤＮＡ断片を亜硫酸水素塩処理に供し、
    （ｄ）固定された亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡ断片の核酸配列を、固定された亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を検出することにより決定し、
    （ｅ）（ｂ）で決定された核酸配列を（ｄ）で決定された配列と比較し、ここでゲノムＤＮＡ断片中のシトシン残基の変換は該残基が亜硫酸水素塩処理前はメチル化されていなかったことを示し、ゲノムＤＮＡ断片中のシトシン残基が変換されないことは該残基が亜硫酸水素塩処理前にメチル化されていたことを示す、方法。
  10. ゲノムＤＮＡ断片が個体支持体にアダプターによって固定される請求項９に記載の方法。
  11. アダプターがプライマー結合部位を含み、プライマー結合部位中のシトシンが保護される請求項１０に記載の方法。
  12. （ｂ）および／または（ｄ）のポリメラーゼが、プライマー結合部位にアニールされたプライマーから核酸鎖を重合する請求項１１に記載の方法。
  13. （ｂ）および／または（ｄ）の核酸重合が、標識ヌクレオチドの取り込みを検出することにより検出される請求項９に記載の方法。
  14. 標識ヌクレオチドが末端のリン酸に標識されている請求項１３に記載の方法。
  15. （ｂ）および／または（ｄ）のポリメラーゼがＦＲＥＴドナーで標識されており、ヌクレオチドがＦＲＥＴアクセプターで標識されている請求項１４に記載の方法。
  16. ＦＲＥＴドナーが蛍光ナノ粒子である請求項１５に記載の方法。
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