JP7532455B2 - 連続性を維持した転位 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１０月１７日出願
の米国仮特許出願第６２／０６５，５４４号及び２０１５年５月５日出願の米国仮特許出
願第６２／１５７，３９６号の優先権を主張する。
本発明の実施形態は、核酸のシークエンシングに関する。具体的には、本明細書で提供
する方法及び組成物の実施形態は、核酸鋳型の調製及び核酸鋳型からの配列データの取得
に関する。
生体試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物の同定及び分類、感染
症の診断、遺伝子異常の検出及び特徴付け、癌に関連した遺伝子変化の同定、疾患への遺
伝的感受性の研究、並びに様々な種類の治療に対する反応の測定を行う方法として用いら
れてきた。生体試料中の特定の核酸配列を検出する一般的な技術は、核酸シークエンシン
グである。
核酸シークエンシング法は、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔが用いた化学分解法、及び
Ｓａｎｇｅｒが用いた鎖伸長法から著しく発展してきた。今日、核酸の並列処理を全て１
回のシークエンシングランで行うことを可能にする、いくつかのシークエンシング法が用
いられている。従って、１回のシークエンシングランから生成される情報は、膨大なもの
となる可能性がある。
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のバーコード化ＤＮＡフラグメントのライ
ブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、標的核酸を複数のトランスポソ
ーム複合体と接触させることを含むものであり、各トランスポソーム複合体は、トランス
ポゾン及びトランスポザーゼを含み、トランスポゾンは転移鎖及び非転移鎖を含む。トラ
ンスポソーム複合体の少なくとも１つのトランスポゾンは、相補的な捕捉配列にハイブリ
ダイズすることが可能なアダプター配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグ
メント化し、標的核酸の連続性（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ）を維持しながらフラグメントの
少なくとも１つの鎖の５’末端に複数の転移鎖を挿入する。標的核酸の複数のフラグメン
トを複数の固体支持体と接触させる。複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌク
レオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列を
含み、複数の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、複数の固体支
持体中の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる。バーコード配列の情報
を標的核酸のフラグメントに転移させ、それにより、同じ標的核酸の少なくとも２つのフ
ラグメントが同一のバーコード情報を受け取るように、少なくとも１つの鎖が第１のバー
コード配列で５’タグ化された、二本鎖フラグメントの固定化ライブラリーを作製する。
１つの態様において、本明細書は、標的核酸配列の連続性情報を決定する方法について
記載する。当該方法は、標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させることを含
むものであり、各トランスポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含
み、トランスポゾンは転移鎖及び非転移鎖を含み、トランスポソーム複合体のトランスポ
ゾンの少なくとも１つは、相補的な捕捉配列にハイブリダイズすることが可能なアダプタ
ー配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、標的核酸の連続性を
維持しながら複数の転移鎖を複数のフラグメントに挿入する。標的核酸の複数のフラグメ
ントを複数の固体支持体と接触させる。複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌ
クレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列
を含み、複数の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、複数の固体
支持体中の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる。バーコード配列情報
を、同じ標的核酸の少なくとも２つのフラグメントが同一のバーコード情報を受け取るよ
うに、標的核酸フラグメントに転移させる。標的核酸フラグメントの配列及びバーコード
配列を決定する。標的核酸の連続性情報を、バーコード配列を識別することにより決定す
る。いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼを転位（
ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）後に除去し、続いて、トランスポゾンのアダプター配列を
相補的な捕捉配列にハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態において、トランスポザ
ーゼをＳＤＳ処理により除去する。いくつかの実施形態において、トランスポザーゼをタ
ンパク質分解酵素処理により除去する。
１つの態様において、本明細書は、標的核酸配列のフェージング情報及びメチル化状態
を同時に測定する方法について記載する。当該方法は、標的核酸を複数のトランスポソー
ム複合体と接触させることを含むものであり、各トランスポソーム複合体は、トランスポ
ゾン及びトランスポザーゼを含み、トランスポゾンは転移鎖及び非転移鎖を含み、トラン
スポソーム複合体のトランスポゾンの少なくとも１つは、相補的な捕捉配列にハイブリダ
イズすることが可能なアダプター配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグメ
ント化し、標的核酸の連続性を維持しながら複数の転移鎖を標的核酸フラグメントに挿入
する。標的核酸の複数のフラグメントを複数の固体支持体と接触させ、複数の固体支持体
の各々は複数の固定化オリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉
配列及び第１のバーコード配列を含み、複数の固体支持体中の各固体支持体からの第１の
バーコード配列は、複数の固体支持体中の他の固体支持体からの第１のバーコード配列と
は異なる。バーコード配列情報を、同じ標的核酸の少なくとも２つのフラグメントが同一
のバーコード情報を受け取るように、標的核酸フラグメントに転移させる。バーコードを
含む標的核酸フラグメントを亜硫酸水素塩処理に付し、それにより、バーコードを含む亜
硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントを生成する。亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメン
トの配列及びバーコード配列を決定する。標的核酸の連続性情報を、バーコード配列を識
別することにより決定する。
１つの態様において、本明細書は、タグ化ＤＮＡフラグメントの固定化ライブラリーを
調製する方法について記載する。当該方法は、それに固定化されたトランスポソーム複合
体を有する複数の固体支持体を提供することを含み、トランスポソーム複合体は多量体で
あり、同じトランスポソーム複合体のトランスポソーム単量体単位は互いに結合し、トラ
ンスポソーム単量体単位は第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、
第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）トランスポゾン末端配列を含む３’部分、及び（ｉｉ
）第１のバーコードを含む第１のアダプターを含む。標的ＤＮＡを、標的ＤＮＡがトラン
スポソーム複合体によりフラグメント化され、第１のポリヌクレオチドの３’トランスポ
ゾン末端配列がフラグメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に転移する条件下で、複数
の固体支持体に適用する。それにより、少なくとも１つの鎖が第１のバーコードで５’タ
グ付けされた二本鎖フラグメントの固定化ライブラリーを作製する。
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のメチル化状態を決定するためのシークエ
ンシングライブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、標的核酸を２つ又
はそれ以上のフラグメントにフラグメント化することを含む。第１の共通アダプター配列
を標的核酸のフラグメントの５’末端に組み込み、アダプター配列は、第１のプライマー
結合配列及び親和性部分を含み、親和性部分は、結合ペアの１つのメンバーに存在する。
標的核酸フラグメントを変性させる。標的核酸フラグメントを固体支持体に固定化する。
固体支持体は、結合ペアの他のメンバーを含み、標的核酸の固定化は、結合ペアの結合に
より行う。固定化標的核酸フラグメントを亜硫酸水素塩処理に付す。第２の共通アダプタ
ー配列を亜硫酸水素塩処理した固定化標的核酸フラグメントに組み込み、第２の共通アダ
プターは、第２のプライマー結合部位を含む。固体支持体に固定化された亜硫酸水素塩処
理固定化標的核酸フラグメントを増幅し、それにより、標的核酸のメチル化状態を決定す
るためのシークエンシングライブラリーを作製する。
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のメチル化状態を決定するためのシークエ
ンシングライブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、それに固定化され
た固定化トランスポソーム複合体を含む複数の固体支持体を提供することを含む。トラン
スポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含み、トランスポゾンは、
転移鎖及び非転移鎖を含む。転移鎖は、（ｉ）トランスポザーゼ認識配列を含む３’末端
の第１の部分及び（ｉｉ）第１のアダプター配列及び結合ペアの第１のメンバーを含む５
’から第１の部分に位置する第２の部分を含む。結合ペアの第１のメンバーは、固体支持
体上で結合ペアの第２のメンバーに結合し、それにより、トランスポゾンを固体支持体に
固定化する。第１のアダプターはまた、第１のプライマー結合配列を含む。非転移鎖は、
（ｉ）トランスポザーゼ認識配列を含む５’末端の第１の部分及び（ｉｉ）３’末端の末
端ヌクレオチドがブロックされている第２のアダプター配列を含む３’から第１の部分に
位置する第２の部分を含む。第２のアダプターはまた、第２のプライマー結合配列を含む
。標的核酸を、固定化トランスポソーム複合体を含む複数の固体支持体と接触させる。標
的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、複数の転移鎖をフラグメントの少なく
とも１つの鎖の５’末端に挿入し、それにより、標的核酸フラグメントを固体支持体に固
定化する。フラグメント化された標的核酸の３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させ
る。非転移鎖を、フラグメント化された標的核酸の３’末端にライゲートする。固定化標
的核酸フラグメントを亜硫酸水素塩処理に付す。亜硫酸水素塩処理中に損傷を受けた固定
化標的核酸フラグメントの３’末端を、固定化標的核酸フラグメントの３’末端がホモポ
リマーテイルを含むように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる。第２のアダプター
配列を、亜硫酸水素塩処理中に損傷を受けた固定化標的核酸フラグメントの３’末端に導
入する。固体支持体に固定化された亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントを、第１及び
第２のプライマーを用いて増幅し、それにより、標的核酸のメチル化状態を決定するため
のシークエンシングライブラリーを作製する。
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のメチル化状態を決定するためのシークエ
ンシングライブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、標的核酸をトラン
スポソーム複合体と接触させることを含むものであり、トランスポソーム複合体は、トラ
ンスポゾン及びトランスポザーゼを含む。トランスポゾンは、転移鎖及び非転移鎖を含む
。転移鎖は、（ｉ）トランスポザーゼ認識配列を含む３’末端の第１の部分及び（ｉｉ）
第１のアダプター配列及び結合ペアの第１のメンバーを含む５’から第１の部分に位置す
る第２の部分を含み、結合ペアの第１のメンバーは、結合ペアの第２のメンバーに結合す
る。非転移鎖は、（ｉ）トランスポザーゼ認識配列を含む５’末端の第１の部分及び（ｉ
ｉ）３’末端の末端ヌクレオチドがブロックされている第２のアダプター配列を含む３’
から第１の部分に位置する第２の部分を含み、第２のアダプターは、第２のプライマー結
合配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、複数の転移鎖をフラ
グメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に挿入し、それにより、標的核酸フラグメント
を固体支持体に固定化する。トランスポゾン末端を含む標的核酸フラグメントを結合ペア
の第２のメンバーを含む複数の固体支持体に接触させ、結合ペアの第１のメンバーと結合
ペアの第２のメンバーとの結合により、標的核酸を固体支持体に固定化する。フラグメン
ト化された標的核酸の３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させる。非転移鎖を、フラ
グメント化された標的核酸の３’末端にライゲートする。固定化標的核酸フラグメントを
亜硫酸水素塩処理に付す。亜硫酸水素塩処理中に損傷を受けた固定化標的核酸フラグメン
トの３’末端を、固定化標的核酸フラグメントの３’末端がホモポリマーテイルを含むよ
うに、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる。第２のアダプター配列を、亜硫酸水素塩
処理中に損傷を受けた固定化標的核酸フラグメントの３’末端に導入する。固体支持体に
固定化された亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントを、第１及び第２のプライマーを用
いて増幅し、それにより、標的核酸のメチル化状態を決定するためのシークエンシングラ
イブラリーを作製する。
いくつかの実施形態において、第２のアダプターの３’末端の末端ヌクレオチドを、ジ
デオキシヌクレオチド、リン酸基、チオリン酸基、及びアジド基からなる群から選択され
る１つのメンバーによりブロックする。
いくつかの実施形態において、親和性部分を結合ペアのメンバーとすることができる。
いくつかのケースにおいて、修飾された核酸は、結合ペアの第１のメンバーを含んでいて
もよく、捕捉プローブは、結合ペアの第２のメンバーを含んでいてもよい。いくつかのケ
ースにおいて、捕捉プローブを固体表面に固定化してもよく、修飾された核酸は、結合ペ
アの第１のメンバーを含んでいてもよく、捕捉プローブは、結合ペアの第２のメンバーを
含んでいてもよい。そのようなケースでは、結合ペアの第１及び第２のメンバーの結合に
より、修飾された標的核酸を固体表面に固定化する。結合ペアの例としては、これに限定
されないが、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－ニュート
ラアビジン、リガンド－受容体、ホルモン－受容体、レクチン－糖タンパク質、オリゴヌ
クレオチド－相補的オリゴヌクレオチド、及び抗原－抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、第１の共通アダプター配列を、片側（ｏｎｅ－ｓｉｄｅ
ｄ）転位により標的核酸の５’末端フラグメントに組み込む。いくつかの実施形態におい
て、第１の共通アダプター配列を、ライゲーションにより標的核酸の５’末端フラグメン
トに組み込む。いくつかの実施形態において、第２の共通アダプター配列を亜硫酸水素塩
処理固定化標的核酸フラグメントに組み込むステップは、（ｉ）固定化標的核酸フラグメ
ントの３’末端を、ターミナルトランスフェラーゼを用いて伸長し、ホモポリマーテイル
を含ませるステップ、（ｉｉ）一本鎖ホモポリマー部分を含むオリゴヌクレオチドと、第
２の共通アダプター配列を含む二本鎖部分とをハイブリダイズさせるステップであって、
一本鎖ホモポリマー部分がホモポリマーテイルに相補的である、ステップ、及び（ｉｉｉ
）第２の共通アダプター配列を固定化標的核酸フラグメントにライゲートし、それにより
、第２の共通アダプター配列を亜硫酸水素塩処理固定化標的核酸フラグメントに組み込む
ステップを含む。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一の細胞に由来する。いくつかの実施形
態において、標的核酸は、単一の細胞小器官に由来する。いくつかの実施形態において、
標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、他の核酸
と架橋する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ホルマリン固定パラフィン包埋
（ＦＦＰＥ：ｆｏｒｍａｒｉｎ ｆｉｘｅｄ ｐａｒａｆｆｉｎ ｅｍｂｅｄｄｅｄ）サ
ンプルに由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、タンパク質と架橋する。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＤＮＡと架橋する。いくつかの実施形態にお
いて、標的核酸は、ヒストンに保護されたＤＮＡである。いくつかの実施形態において、
ヒストンを標的核酸から除去する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、無細胞腫
瘍ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、無細胞腫瘍ＤＮＡは、胎盤液から得る。
いくつかの実施形態において、無細胞腫瘍ＤＮＡは、血漿から得る。いくつかの実施形態
において、血漿は、血漿用採取ゾーンを有する膜分離装置を用いて全血から採取する。い
くつかの実施形態において、血漿用採取ゾーンは、固体支持体に固定化されたトランスポ
ソーム複合体を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ｃＤＮＡである。いく
つかの実施形態において、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態において、
複数の固体支持体は、複数のビーズであり、複数のビーズは、様々なサイズである。
いくつかの実施形態において、単一のバーコード配列が、各個々の固体支持体上の複数
の固定化オリゴヌクレオチドに存在する。いくつかの実施形態において、異なるバーコー
ド配列が、各個々の固体支持体上の複数の固定化オリゴヌクレオチドに存在する。いくつ
かの実施形態において、標的核酸フラグメントへのバーコード配列情報の転移は、ライゲ
ーションによる。いくつかの実施形態において、標的核酸フラグメントへのバーコード配
列情報の転移は、ポリメラーゼ伸長による。いくつかの実施形態において、標的核酸フラ
グメントへのバーコード配列情報の転移は、ライゲーション及びポリメラーゼ伸長の両方
による。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、ライゲートした固定化オリ
ゴヌクレオチドを鋳型として用い、非ライゲートトランスポゾン鎖の３’末端をＤＮＡポ
リメラーゼで伸長させることによる。いくつかの実施形態において、アダプター配列の少
なくとも一部は、第２のバーコード配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、多量体であり、各単量体単
位のトランスポゾンのアダプター配列は、同じトランスポソーム複合体の他の単量体単位
とは異なる。いくつかの実施形態において、アダプター配列は、第１のプライマー結合配
列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のプライマー結合部位は、捕捉配列
又は捕捉配列の相補体に対して、配列相同性を持たない。いくつかの実施形態において、
固体支持体上の固定化オリゴヌクレオチドは、第２のプライマー結合配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、多量体であり、トランスポ
ソーム単量体単位は、同じトランスポソーム複合体内で互いに結合する。いくつかの実施
形態において、トランスポソーム単量体単位のトランスポザーゼは、同じトランスポソー
ム複合体の別のトランスポソーム単量体単位のトランスポザーゼに結合する。いくつかの
実施形態において、トランスポソーム単量体単位のトランスポゾンは、同じトランスポソ
ーム複合体の別のトランスポソーム単量体単位のトランスポゾンに結合する。いくつかの
実施形態において、トランスポソーム単量体単位のトランスポザーゼは、同じトランスポ
ソーム複合体の別のトランスポソーム単量体単位のトランスポザーゼに共有結合により結
合する。いくつかの実施形態において、１つの単量体単位のトランスポザーゼは、同じト
ランスポソーム複合体の別のトランスポソーム単量体単位のトランスポザーゼにジスルフ
ィド結合により結合する。いくつかの実施形態において、トランスポソーム単量体単位の
トランスポゾンは、同じトランスポソーム複合体の別のトランスポソーム単量体単位のト
ランスポゾンに共有結合により結合する。
いくつかの実施形態において、標的核酸配列の連続性情報は、ハプロタイプ情報を示す
。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の連続性情報は、ゲノム変異を示す。いく
つかの実施形態において、ゲノム変異は、欠損、転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ）
、染色体間の遺伝子融合、重複、及びパラログからなる群から選択される。いくつかの実
施形態において、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドは、部分的二本鎖領域及
び部分的一本鎖領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの部分的
一本鎖領域は、第２のバーコード配列及び第２のプライマー結合配列を含む。いくつかの
実施形態において、バーコードを含む標的核酸フラグメントを、標的核酸フラグメントの
配列を決定する前に増幅する。いくつかの実施形態において、後続の増幅を、標的核酸フ
ラグメントの配列を決定する前に、単一の反応区画で行う。いくつかの実施形態において
、第３のバーコード配列を、増幅中に標的核酸フラグメントに導入する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、バーコードを含む標的核酸フラグメントを
、複数の第１のセットの反応区画から、バーコードを含む標的核酸フラグメントのプール
にまとめるステップ、バーコードを含む標的核酸フラグメントの前記プールを複数の第２
のセットの反応区画に再分配するステップ、及び標的核酸フラグメントを第２のセットの
反応区画内でシークエンシング前に増幅することにより、第３のバーコードを標的核酸フ
ラグメントに導入するステップをさらに含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、標的核酸をトランスポソーム複合体と接触
させる前にプレフラグメント化するステップをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施
形態において、標的核酸のプレフラグメント化は、超音波処理及び制限消化からなる群か
ら選択される方法により行われる。
トランスポソームをビーズ表面に結合させる方法の一例を示すフローチャートである。 図１の方法のステップを絵で示す図である。 ビーズ表面上でのタグメント化工程の一例を示す模式図である。 ＤＮＡ収量の一例を、図３のビーズベースタグメント化工程からのクラスター数の観点から示すデータ表である。 図３のビーズベースタグメント化工程の再現性の別例を、均一なサイズの観点から示すデータ表である。 図６Ａ及び６Ｂは、それぞれ、図５のインデックス付きサンプルのプール１の挿入サイズのプロット及びプール２の挿入サイズのプロットを示す図である。 リードの合計数及び図５に記載の実験のためにアラインしたリードの割合の再現性を示す棒グラフである。 図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃは、それぞれ、エクソーム濃縮アッセイにおける、コントロールライブラリーでの挿入サイズのプロット、ビーズベースタグメント化ライブラリーでの挿入サイズのプロット、及びサマリーデータ表を示す図である。 図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、それぞれ、エクソーム濃縮アッセイにおける、ｄｕｐｓ ＰＦ画分の棒グラフ、ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂａｓｅｓ画分の棒グラフ、及びＰＣＴ ｕｓａｂｌｅ ｂａｓｅｓ ｏｎ ｔａｒｇｅｔの棒グラフを示す図である。 ビーズ表面上でのトランスポソーム複合体の形成方法の一例を示すフローチャートである。 図１０の方法のステップを絵で示す図である。 図１０の方法のステップを絵で示す図である。 図１０の方法のステップを絵で示す図である。 図１３に示すトランスポソーム被覆ビーズを用いたタグメント化工程の模式図である。 固体支持体上でのトランスポソーム形成の例示的なスキームを示す図である。 固有インデックスを有する連結（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ライブラリー作製の例示的なスキームを示す図である。 固有インデックスを有する連結ライブラリー作製の例示的なスキームを示す図である。 ＣＰＴ－ＤＮＡがビーズに巻き付いている、単一のクローンインデックス付きビーズ上での単一のＣＰＴ－ＤＮＡの捕捉を表わす図である。 ＣＰＴ－ＤＮＡがビーズに巻き付いている、単一のクローンインデックス付きビーズ上での単一のＣＰＴ－ＤＮＡの捕捉を表わす図である。 固体表面に固定化したＹ－アダプターを、ライゲーション及びギャップ充填により標的ＤＮＡに結合させる例示的なスキームを示す図である。 ＣＰＴ－ＤＮＡと固体支持体上の固定化オリゴヌクレオチドとのライゲーションの間に、前記Ｙ－アダプターを作製する例示的なスキームを示す図である。 サイズ排除クロマトグラフィーによる連結ライブラリーからの遊離トランスポソームの除去を示す、アガロースゲル電気泳動を表わす図である。 特定のＤＮＡフラグメントのショットガン配列ライブラリーを生成する例示的なスキームを示す図である。 クローンインデックス付きシークエンシングライブラリーからの配列情報をアセンブルする例示的なスキームを示す図である。 ビーズ上の捕捉プローブ密度の最適化の結果を示す図である。 分子内ハイブリダイゼーションによるビーズ上でのＣＰＴ－ＤＮＡのインデックス付きシークエンシングライブラリーの調製の実現性を試験した結果を示す図である。 クローンインデックス化の実現性を試験した結果を示す図である。 タグメント化後の鋳型核酸に対して隣接して（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇ）アラインされたリードの島内（ｉｎｔｒａ）及び島間（ｉｎｔｒａ）の特定の距離に対する、シークエンシングリードの頻度を示すグラフである。 図２９Ａ及び２９Ｂは、固体支持体上の連続性情報を引き出す例示的なアプローチを示す図である。 単一の反応容器（ワンポット）におけるインデックス付きクローンビーズ転位の概略図及び転位結果を示す図である。 単一の反応容器（ワンポット）におけるインデックス付きクローンビーズ転位の概略図及び転位結果を示す図である。 ５’又は３’ビオチン化オリゴヌクレオチドを用いたビーズ上でのクローントランスポソームの作製を示す概略図である。 ビーズ上のトランスポソームに対するライブラリーサイズを示す図である。 挿入サイズに対するトランスポソーム表面密度の影響を示す図である。 サイズ分布に対するインプットＤＮＡの影響を示す図である。 ビーズベース及び溶液ベースのタグメント化反応を用いた島のサイズ及び分布を示す図である。 それぞれ固有インデックスを受け取った、いくつかの個々のＤＮＡ分子のクローンインデックス化を示す図である。 全血から血漿を分離する装置の略図である。 血漿を分離する装置及び分離された血漿のその後の使用を示す略図である。 血漿を分離する装置及び分離された血漿のその後の使用を示す略図である。 ゲノムの特定の領域を濃縮することによる標的フェージングの例示的なスキームを示す図である。 エクソン間のＳＮＰを用いたエクソームフェージングの例示的なスキームを示す図である。 フェージング及びメチル化の同時検出の例示的なスキームを示す図である。 フェージング及びメチル化の同時検出の別の例示的なスキームを示す図である。 単一アッセイにおいて、種々のサイズのクローンインデックス付きビーズを用いて種々のサイズのライブラリーを生成する、例示的なスキームを示す図である。 異なる長さスケールのライブラリーで遺伝的変異を決定する例示的なスキームを示す図である。 染色体１における６０ｋｂヘテロ接合欠損の検出結果を示す図である。 染色体１における６０ｋｂヘテロ接合欠損の検出結果を示す図である。 本願の方法を用いた遺伝子融合検出の結果を示す図である。 本願の方法を用いた遺伝子欠損検出の結果を示す図である。 亜硫酸水素塩変換前後のＭＥ配列を示す図である。 亜硫酸水素塩変換効率の最適化の結果を示す図である。 亜硫酸水素塩変換後の結果をＩＶＣプロット（各塩基当たりの強度対サイクル）で示す図である。 ＢＳＣの後のＰＣＲ後のインデックス付き結合ライブラリーのアガロースゲル電気泳動の画像を示す図である。 サイズ選択をしていない濃縮前の全ゲノムインデックス付き結合ＣＰＴ－ｓｅｑライブラリーのバイオアナライザートレースを示す図である。 濃縮後のライブラリーのアガロースゲル分析を示す図である。 標的化ハプロタイピングを染色体のＨＬＡ領域に適用した結果を示す図である。 ＭＥ交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）のいくつかの考え得るメカニズムを示す図である。 ＭＥ交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）のいくつかの考え得るメカニズムを示す図である。 Ｃｙｓで置換することができる例示的なアミノ酸残基Ａｓｐ４６８、Ｔｙｒ４０７、Ａｓｐ４６１、Ｌｙｓ４５９、Ｓｅｒ４５８、Ｇｌｙ４６２、Ａｌａ４６６、Ｍｅｔ４７０を有するＴｎ５トランスポザーゼの一部を示す図である。 システイン残基が２つの単量体単位間でジスルフィド結合を形成できるようにした、Ｓ４５８Ｃ、Ｋ４５９Ｃ、及びＡ４６６Ｃのアミノ酸置換を有するＴｎ５トランスポザーゼの一部を示す図である。 アミン被覆ナノ粒子を用いた二量体トランスポザーゼ（ｄＴｎｐ）ナノ粒子（ＮＰ）バイオコンジュゲート（ｄＴｎｐ－ＮＰ）の作製及び使用の例示的なスキームを示す図である。 トランスポソーム二量体とアミン被覆固体支持体とのコンジュゲーションの例示的なスキームを示す図である。 トランスポゾン末端が結合したＭｕトランスポソーム複合体を示す図である。 疑似遺伝子のアセンブリ／フェージングのためのインデックス付き結合リードの略図、及びより短いフラグメントを用いた疑似遺伝子の変異識別の利点を示す図である。 交換された（ｓｗａｐｐｅｄ）インデックスの割合（％）として示す、４つの別個の実験からのインデックス交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）のプロットを示す図である。 Ｔｓ－Ｔｎ５滴定のフラグメントサイズの、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる分析を示す図である。 亜硫酸水素塩処理後の破損したライブラリーエレメントを回復させる酵素法を用いて、Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑプロトコルのＤＮＡ収量を改善する、例示的なスキームを示す図である。 図６８Ａ～６８Ｃは、亜硫酸水素塩処理後の破損したライブラリーエレメントを回復させる酵素法を用いて、Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑプロトコルのＤＮＡ収量を改善する、いくつかの例示的なスキームを示す図である。 ランダムプライマー伸長を用いた鋳型救出（ｒｅｓｃｕｅ）の例示的なスキームを示す図である。 亜硫酸水素ナトリウム変換中のＤＮＡライブラリーのフラグメント化を示す図である。左のパネルは、磁性ビーズ上にタグメント化されたＤＮＡの一部を亜硫酸水素変換している最中のフラグメント化を示す。右のパネルは、ＣＰＴ－ｓｅｑ及びＥｐｉ－ＣＰＴ－ｓｅｑ（Ｍｅ－ＣＰＴ－ｓｅｑ）ライブラリーのバイオアナライザートレースを示す。 ＴｄＴ媒介ｓｓＤＮＡライゲーション反応の例示的なスキーム及び結果を示す図である。 ライブラリーに結合した亜硫酸水素ナトリウム変換ビーズのＴｄＴ媒介回復のスキーム及び結果を示す図である。左のパネルは、ＴｄＴ媒介ライゲーション反応を用いた損傷亜硫酸水素塩変換ＤＮＡライブラリーの救出の操作フローを示す。ＤＮＡライブラリー救出実験の結果を右のパネルに示す。 メチル－ＣＰＴ－ｓｅｑアッセイの結果を示す図である。 ＤＮＡのビーズベース亜硫酸水素塩変換の例示的なスキームを示す図である。 図７５Ａ及び７５Ｂは、亜硫酸水素塩変換効率の最適化の結果を示す図である。
本発明の実施形態は、核酸のシークエンシングに関する。具体的には、本明細書で提供
する方法及び組成物の実施形態は、核酸鋳型の調製及び核酸鋳型からの配列データの取得
に関する。
１つの態様において、本発明は、タグメント化（フラグメント化及びタグ化）した標的
核酸ライブラリーを構築するために、固体支持体上で標的核酸をタグメント化する方法に
関する。１つの実施形態において、固体支持体は、ビーズである。１つの実施形態におい
て、標的核酸は、ＤＮＡである。
１つの態様において、本発明は、標的核酸の連続性情報を引き出すことが可能な、固体
支持体、トランスポザーゼに基づく方法の、方法及び組成物に関する。いくつかの実施形
態において、組成物及び方法は、アセンブリ／フェージング情報を引き出すことができる
。
１つの態様において、本発明は、連結した転位標的核酸を固体支持体上に捕捉すること
により、連続性情報を引き出す方法及び組成物に関する。
１つの態様において、本明細書に開示する方法及び組成物は、ゲノム変異の分析に関す
る。例示的なゲノム変異としては、これに限定されないが、欠損、染色体間転位、重複、
パラログ、染色体間遺伝子融合が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に
開示する方法及び組成物は、ゲノム変異のフェージング情報の決定に関する。
１つの態様において、本明細書に開示する方法及び組成物は、標的核酸の特定の領域の
フェージングに関する。１つの実施形態において、標的核酸は、ＤＮＡである。１つの実
施形態において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的
核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いく
つかの実施形態において、標的核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ：ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ
ａｒｙ ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一の細胞に由来
する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、循環腫瘍細胞に由来する。いくつかの
実施形態において、標的核酸は、無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標
的核酸は、無細胞腫瘍ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ホルマ
リン固定パラフィン包埋組織サンプルに由来する。いくつかの実施形態において、標的核
酸は、架橋標的核酸である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、タンパク質に架
橋する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、核酸に架橋する。いくつかの実施形
態において、標的核酸は、ヒストンに保護されたＤＮＡである。いくつかの実施形態にお
いて、ヒストンに保護されたＤＮＡを、ヒストンに対する抗体を用いて細胞溶解物から沈
殿させ、ヒストンを除去する。
いくつかの態様において、インデックス付きライブラリーは、クローンインデックス付
きビーズを用いて、標的核酸から作製する。いくつかの実施形態において、タグメント化
標的核酸は、トランスポザーゼが標的ＤＮＡに結合したままで、クローンインデックス付
きビーズを用いて捕捉することができる。いくつかの実施形態において、特異的な捕捉プ
ローブを用いて、標的核酸中の目的の特異的な領域を捕捉する。標的核酸の捕捉された領
域は、種々のストリンジェンシーで洗浄し、任意選択的に増幅し、その後シークエンシン
グすることができる。いくつかの実施形態において、捕捉プローブは、ビオチン化しても
よい。ビオチン化捕捉プローブがインデックス付き標的核酸の特異的な領域にハイブリダ
イズした複合体は、ストレプトアビジンビーズを用いて分離することができる。標的フェ
ージングの例示的なスキームを図４１に示す。
いくつかの態様において、本明細書に開示する組成物及び方法は、エクソームのフェー
ジングに用いることができる。いくつかの実施形態において、エクソン、プロモーターを
濃縮することができる。マーカー、例えば、エクソン領域間のヘテロ接合ＳＮＰは、特に
エクソン間の距離が大きい場合に、エクソンのフェージングに役立つ可能性がある。例示
的なエクソームのフェージングを図４２に示す。いくつかの実施形態において、インデッ
クス付き結合リードは、隣接しているエクソンのヘテロ接合ＳＮＰに同時に及ぶ（カバー
する）ことができない。従って、２つ又はそれ以上のエクソンをフェージングすることは
困難である。本明細書に開示する組成物及び方法はまた、エクソン間のヘテロ接合ＳＮＰ
を濃縮し、例えば、エクソン１をＳＮＰ１に、ＳＮＰ２をエクソン２にフェージングする
。従って、ＳＮＰ１の使用を通じて、エクソン１及びエクソン２を、図４２に示すように
フェージングすることができる。
１つの態様において、本明細書に開示する組成物及び方法は、フェージング及び同時の
メチル化の検出に用いることができる。亜硫酸水素塩変換（ＢＳＣ：ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）によるメチル化検出は、ＢＳＣ反応がＤＮＡに対して厳しい（
ｈａｒｓｈ）ものであり、ＤＮＡをフラグメント化し、それにより連続性／フェージング
情報を除去するため、困難である。また、本願に開示する方法は、従来のＢＳＣアプロー
チで必要とされるのとは対照的に、更なる精製ステップを必要としないことにより、収率
を改善するため、さらに利点がある。
１つの態様において、本明細書に開示する組成物及び方法を用いて、異なるサイズのラ
イブラリーを１つのアッセイで調製することができる。いくつかの実施形態において、異
なるサイズのクローンインデックス付きビーズを用いて、異なるサイズのライブラリーを
調製することができる。図１は、トランスポザーゼをビーズ表面に結合させる方法１００
の一例のフローチャートを示す。トランスポザーゼは、トランスポゾンオリゴヌクレオチ
ド、トランスポザーゼ、及び固相に加えてもよい任意の化学物質を用いて、ビーズ表面に
結合させてもよい。１つの例において、トランスポソームを、ビオチン－ストレプトアビ
ジン結合複合体を介してビーズ表面に結合させる。方法１００は、これに限定されないが
、以下のステップを含む。
１つの実施形態において、トランスポゾンは、シークエンシングプライマー結合部位を
含んでいてもよい。シークエンス結合部位の例示的な配列としては、これに限定されない
が、ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（Ｐ５配列）及びＣ
ＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（Ｐ７配列）が挙げられる。いくつか
の実施形態において、トランスポゾンをビオチン化してもよい。
図１のステップ１１０において、Ｐ５及びＰ７ビオチン化トランスポゾンを生成する。
トランスポゾンはまた、１つ又はそれ以上のインデックス配列（固有の識別子）を含んで
いてもよい。例示的なインデックス配列としては、これに限定されないが、ＴＡＧＡＴＣ
ＧＣ、ＣＴＣＴＣＴＡＴ、ＴＡＴＣＣＴＣＴ、ＡＧＡＧＴＡＧＡ、ＧＴＡＡＧＧＡＧ、Ａ
ＣＴＧＣＡＴＡ、ＡＡＧＧＡＧＴＡ、ＣＴＡＡＧＣＣＴが挙げられる。別の例では、Ｐ５
トランスポゾンのみ又はＰ７トランスポゾンのみをビオチン化する。さらに別の例では、
トランスポゾンは、モザイク末端（ＭＥ：ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）配列のみ、又はＭＥ配
列に加えてＰ５及びＰ７配列ではない追加の配列を含む。この例では、Ｐ５及びＰ７配列
は、後続のＰＣＲ増幅ステップで付加する。
図１のステップ１１５において、トランスポソームをアセンブルする。アセンブルした
トランスポソームは、Ｐ５及びＰ７トランスポソームの混合物である。Ｐ５及びＰ７トラ
ンスポソームの混合物は、図１１及び１２と関連してより詳細に説明する。
図１のステップ１２０において、Ｐ５／Ｐ７トランスポソーム混合物を、ビーズ表面に
結合させる。この例では、ビーズは、ストレプトアビジン被覆ビーズであり、トランスポ
ソームを、ビオチン－ストレプトアビジン結合複合体を介してビーズ表面に結合させる。
ビーズは、種々のサイズであってもよい。１つの例において、ビーズは、２．８μｍビー
ズであってもよい。別の例において、１μｍビーズであってもよい。１μｍビーズの懸濁
液（例えば、１μＬ）は、体積当たり大きな表面積をトランスポソーム結合にもたらす。
トランスポソーム結合に用いることができる表面積により、反応当たりのタグメント化生
成物の数が増加する。
図２は、図１の方法１００のステップ１１０、１１５、及び１２０を絵で示す。この例
では、トランスポゾンを二本鎖で示す。別の例（図示しない）では、ヘアピン等の別の構
造、即ち、二本鎖を形成することができる自己相補的な領域を有する単一のオリゴヌクレ
オチドを用いてもよい。
方法１００のステップ１１０において、複数のビオチン化Ｐ５トランスポゾン２１０ａ
及び複数のＰ７トランスポゾン２１０ｂを生成する。Ｐ５トランスポゾン２１０ａ及びＰ
７トランスポゾン２１０ｂをビオチン化する。
方法１００のステップ１１５において、Ｐ５トランスポゾン２１０ａ及びＰ７トランス
ポゾン２１０ｂをトランスポザーゼＴｎ５ ２１５と混合し、複数のアセンブルしたトラ
ンスポソーム２２０を形成する。
方法１００のステップ１２０において、トランスポソーム２２０を、ビーズ２２５に結
合させる。ビーズ２２５は、ストレプトアビジン被覆ビーズである。トランスポソーム２
２０を、ビオチン－ストレプトアビジン結合複合体を介してビーズ２２５に結合させる。
１つの実施形態において、トランスポソームの混合物を、図１０、１１、１２、及び１
３に示すように、ビーズ表面等の固体支持体上で形成してもよい。この例では、Ｐ５及び
Ｐ７オリゴヌクレオチドを、トランスポソーム複合体のアセンブリ前に、初めにビーズ表
面に結合させる。
図３は、ビーズ表面上におけるタグメント化工程３００の例の模式図を示す。工程３０
０において、トランスポソーム２２０が結合した図２のビーズ２２５を示す。ＤＮＡ３１
０の溶液をビーズ２２５の懸濁液に加える。ＤＮＡ３１０がトランスポソーム２２０に接
触すると、ＤＮＡがタグメント化（フラグメント化及びタグ化）され、トランスポソーム
２２０を介してビーズ２２５に結合する。結合及びタグメント化されたＤＮＡ３１０をＰ
ＣＲ増幅して、溶液中（ビーズを含まない）で増幅産物３１５のプールを生成してもよい
。増幅産物３１５は、フローセル３２０の表面に転移させてもよい。クラスター生成プロ
トコル（例えば、ブリッジ増幅プロトコル、又はクラスター生成に使用することができる
任意のその他の増幅プロトコル）を用いて、複数のクラスター３２５をフローセル３２０
の表面上に生成してもよい。クラスター３２５は、タグメント化ＤＮＡ３１０のクローン
増幅産物である。これでクラスター３２５は、シークエンシングプロトコルの次のステッ
プ用に準備できたことになる。
別の実施形態において、トランスポソームは、マイクロ遠心チューブの壁等の任意の固
体表面に結合してもよい。
ビーズ表面上にトランスポソーム複合体の混合物を形成する別の実施形態において、オ
リゴヌクレオチドは、トランスポソームのアセンブリ前に、初めにビーズ表面に結合させ
る。図１０は、ビーズ表面上でトランスポソーム複合体を形成する方法１０００の一例の
フローチャートを示す。方法１０００は、これに限定されないが、以下のステップを含む
。
ステップ１０１０において、Ｐ５及びＰ７オリゴヌクレオチドを、ビーズ表面に結合さ
せる。１つの例において、Ｐ５及びＰ７オリゴヌクレオチドは、ビオチン化し、ビーズは
、ストレプトアビジン被覆ビーズである。このステップはまた、図１１の模式図１１００
に絵で示す。ここで、図１１を参照すると、Ｐ５オリゴヌクレオチド１１１０及びＰ７オ
リゴヌクレオチド１１１５は、ビーズ１１２０の表面に結合する。この例においては、１
つのＰ５オリゴヌクレオチド１１１０及び１つのＰ７オリゴヌクレオチド１１１５が、ビ
ーズ１１２０の表面に結合しているが、任意の数のＰ５オリゴヌクレオチド１１１０及び
／又はＰ７オリゴヌクレオチド１１１５が、複数のビーズ１１２０の表面に結合してもよ
い。１つの例において、Ｐ５オリゴヌクレオチド１１１０は、Ｐ５プライマー配列、イン
デックス配列（固有の識別子）、リード１シークエンシングプライマー配列、及びモザイ
ク末端（ＭＥ）配列を含む。この例において、Ｐ７オリゴヌクレオチド１１１５は、Ｐ７
プライマー配列、インデックス配列（固有の識別子）、リード２シークエンシングプライ
マー配列、及びＭＥ配列を含む。別の例（図示せず）において、インデックス配列は、Ｐ
５オリゴヌクレオチド１１１０のみに存在する。さらに別の例（図示せず）において、イ
ンデックス配列は、Ｐ７オリゴヌクレオチド１１１５のみに存在する。さらに別の例（図
示せず）において、インデックス配列は、Ｐ５オリゴヌクレオチド１１１０及びＰ７オリ
ゴヌクレオチド１１１５のいずれにも存在しない。
ステップ１０１５において、相補的モザイク末端（ＭＥ’）オリゴヌクレオチドを、ビ
ーズ結合Ｐ５及びＰ７オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。このステップはまた
、図１２の模式図１２００に絵で示す。ここで、図１２を参照すると、相補的ＭＥ配列（
ＭＥ’）１１２５は、Ｐ５オリゴヌクレオチド１１１０及びＰ７オリゴヌクレオチド１１
１５にハイブリダイズする。相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）１１２５（例えば、相補的ＭＥ配
列（ＭＥ’）１１２５ａ及び相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）１１２５ｂ）は、Ｐ５オリゴヌク
レオチド１１１０及びＰ７オリゴヌクレオチド１１１５のＭＥ配列にそれぞれハイブリダ
イズする。相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）１１２５は、典型的には、約１５塩基長であり、５
’末端でリン酸化されている。
ステップ１０２０において、トランスポザーゼ酵素をビーズ結合オリゴヌクレオチドに
添加し、ビーズ結合トランスポソーム複合体の混合物を形成する。このステップはまた、
図１３の模式図１３００に絵で示す。ここで図１３を参照すると、トランスポザーゼ酵素
が添加されて、複数のトランスポソーム複合体１３１０を形成する。この例において、ト
ランスポソーム複合体１３１０は、トランスポザーゼ酵素、２つの表面結合オリゴヌクレ
オチド配列、及びそれらにハイブリダイズした相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）１１２５を含む
二本鎖構造である。例えば、トランスポソーム複合体１３１０ａは、相補的ＭＥ配列（Ｍ
Ｅ’）１１２５にハイブリダイズしたＰ５オリゴヌクレオチド１１１０及び相補的ＭＥ配
列（ＭＥ’）１１２５にハイブリダイズしたＰ７オリゴヌクレオチド１１１５（即ち、Ｐ
５：Ｐ７）を含み、トランスポソーム複合体１３１０ｂは、相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）１
１２５にハイブリダイズした２つのＰ５オリゴヌクレオチド１１１０（即ち、Ｐ５：Ｐ５
）含み、トランスポソーム複合体１３１０ｃは、相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）１１２５にハ
イブリダイズした２つのＰ７オリゴヌクレオチド１１１５（即ち、Ｐ７：Ｐ７）含む。Ｐ
５：Ｐ５、Ｐ７：Ｐ７、及びＰ５：Ｐ７トランスポソーム複合体の割合は、例えば、２５
：２５：５０であってもよい。
図１４は、図１３のトランスポソーム被覆ビーズ１１２０を用いたタグメント化工程の
例示的な模式図１４００を示す。この例において、トランスポソーム複合体１３１０を有
するビーズ１１２０を、タグメント化バッファー中のＤＮＡ１４１０の溶液に加え、タグ
メント化を生じさせ、ＤＮＡをビーズ１１２０の表面にトランスポソーム１３１０を介し
て結合させる。ＤＮＡ１４１０の連続したタグメント化により、トランスポソーム１３１
０間に複数のブリッジ分子１４１５が生じる。ブリッジ分子１４１５の長さは、ビーズ１
１２０の表面におけるトランスポソーム複合体１３１０の密度に依存する可能性がある。
１つの例において、ビーズ１１２０の表面上のトランスポソーム複合体１３１０の密度は
、図１０の方法１００のステップ１０１０においてビーズ１１２０の表面に結合するＰ５
及びＰ７オリゴヌクレオチドの量を変化させることにより調整してもよい。別の例におい
て、ビーズ１１２０の表面上のトランスポソーム複合体１３１０の密度は、図１０の方法
１０００のステップ１０１５において、Ｐ５及びＰ７オリゴヌクレオチドにハイブリダイ
ズする相補的ＭＥ配列（ＭＥ’）の量を変化させることにより、調整してもよい。さらに
別の例において、ビーズ１１２０の表面上のトランスポソーム複合体１３１０の密度は、
図１の方法１０００のステップ１０２０において加えるトランポザーゼ酵素の量を変化さ
せることにより、調整してもよい。
ブリッジ分子１４１５の長さは、タグメント化反応で用いられた、トランスポソーム複
合体１３１０が結合したビーズ１１２０の量に依存しない。同様に、タグメント化反応に
おいてより多い又はより少ないＤＮＡ１４１０を加えることは、最終的なタグメント化産
物のサイズを変えないが、反応の収率に影響を与える可能性がある。
１つの例において、ビーズ１１２０は、常磁性ビーズである。この例では、タグメント
化反応の精製は、ビーズ１１２０を磁石で固定化し、洗浄することにより容易に行うこと
ができる。従って、タグメント化及びその後のＰＣＲ増幅を、単一の反応区画（「ワンポ
ット（ｏｎｅ－ｐｏｔ）」）での反応で実施してもよい。
１つの態様において、本発明は、固体支持体上で標的核酸の連続性情報を引き出すこと
が可能なトランスポザーゼに基づく方法の、方法及び組成物に関する。いくつかの実施形
態において、組成物及び方法は、アセンブリ／フェーズ情報を引き出すことができる。１
つの実施形態において、固体支持体は、ビーズである。１つの実施形態において、標的核
酸は、ＤＮＡである。１つの実施形態において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いく
つかの実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｒ
ＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、トランスポゾンを、ビーズ等の固体支持体に二量体とし
て固定化し、その後トランスポザーゼをトランスポゾンに結合してトランスポソームを形
成してもよい。
いくつかの実施形態において、固相化トランスポゾン及びトランスポザーゼの添加によ
る、固相でのトランスポソームの形成に特に関連して、２つのトランスポゾンを、固体支
持体において互いにごく近接して（好ましくは、一定の距離で）固定化してもよい。この
アプローチには、いくつかの利点がある。１つ目としては、好ましくは、２つのトランス
ポゾンがトランスポソームを効率良く形成するのに最適なリンカー長及び方向で、２つの
トランスポゾンが、常に同時に固定化されることになる。２つ目としては、トランスポソ
ームの形成効率が、トランスポゾン密度の関数とはならないであろうことである。２つの
トランスポゾンが、トランスポソームを形成するのに適切な方向及び両者間の距離で、常
に利用できることになる。３つ目としては、表面上のランダムな固定化トランスポゾンに
より、トランスポゾン間に種々の距離が形成され、それにより、１つの画分のみがトラン
スポソームを効率良く形成するのに最適な方向及び距離を有する。結果として、全てのト
ランスポゾンがトランスポソームに変換するのではなく、固相化非複合体化トランスポゾ
ンが存在することになる。これらのトランスポゾンは、ＭＥ部分が二本鎖ＤＮＡであるた
め、転位の標的となり易い。これにより、転位効率の低下をもたらし、望ましくない副産
物を形成する可能性がある。従って、続けて使用して、タグメント化及びシークエンシン
グを通じて連続性情報を導き出すことができる固体支持体上に、トランスポソームを調製
してもよい。例示的なスキームを図１５に示す。いくつかの実施形態において、トランス
ポゾンは、化学的結合以外の手法で固体支持体に固定化してもよい。固体支持体上にトラ
ンスポゾンを固定化する例示的な方法としては、これに限定されないが、ストレプトアビ
ジン－ビオチン、マルトース－マルトース結合タンパク質、抗原－抗体、ＤＮＡ－ＤＮＡ
又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション等の親和結合が挙げられる。
いくつかの実施形態において、トランスポソームは、プレアセンブルした後、固体支持
体に固定化することができる。いくつかの実施形態において、トランスポゾンは、固有の
インデックス、バーコード、及び増幅プライマー結合部位を含む。トランスポザーゼを、
トランスポゾンを含む溶液に添加し、固体支持体上に固定化することが可能なトランスポ
ソーム二量体を形成することができる。１つの実施形態において、各セットが固定化トラ
ンスポゾンに由来する同じインデックスを有し、それによりインデックス付きビーズを生
成する、複数のビーズセットを生成することができる。図２９Ａに示すように、標的核酸
を、インデックス付きビーズの各セットに添加することができる。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、インデックス付きビーズの各セットに添加
することができ、タグメント化及びその後のＰＣＲ増幅を別々に行ってもよい。
いくつかの実施形態において、標的核酸、インデックス付きビーズ、及びトランスポソ
ームは、多くの液滴が、１つのビーズと１つ又はそれ以上のＤＮＡ分子及び十分なトラン
スポソームとを含むように、液滴内で組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、インデックス付きビーズをプールすることができ、プー
ルに標的核酸を加えることができ、タグメント化及びその後のＰＣＲ増幅を単一の反応区
画（「ワンポット」）で行ってもよい。
１つの態様において、本発明は、連結転位標的核酸を固体支持体上に捕捉することによ
り、連続性情報を引き出す方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、連続
性保存転位（ＣＰＴ：ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｓ
ｉｔｉｏｎ）をＤＮＡ上で行うが、ＤＮＡは、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のままであり（ＣＰ
Ｔ－ＤＮＡ）、従って、連結ライブラリーを形成する。連続性情報は、トランスポザーゼ
を用いて標的核酸に隣接した鋳型核酸フラグメントの関連性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）
を維持することにより、保存することができる。ＣＰＴ－ＤＮＡは、固体支持体、例えば
、ビーズに固定化された、固有のインデックス又はバーコードを有する相補的オリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションにより捕捉することができる（図２９Ｂ）。いくつか
の実施形態において、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドは、バーコードに加
えて、プライマー結合部位、固有分子インデックス（ＵＭＩ：ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｉｎｄｉｃｅｓ）をさらに含んでいてもよい。
有利なことに、このようにトランスポソームを用いて、フラグメント化された核酸の物
理的近接性を保つことにより、同じ起源の分子、例えば、染色体からのフラグメント化さ
れた核酸が、同じ固有のバーコード及びインデックス情報を固体支持体に固定化されたオ
リゴヌクレオチドから受け取る可能性が増える。これにより、固有のバーコードを有する
連結シークエンシングライブラリーが得られることになる。連結シークエンシングライブ
ラリーをシークエンスして、連続配列情報を引き出すことができる。
図１６及び１７は、固有のバーコード又はインデックスを有する連結ライブラリーを作
製する本発明の上記態様の、例示的な実施形態の模式図を示す。例示的な方法は、ＣＰＴ
－ＤＮＡと、固有のインデックス及びバーコードを有する固体支持体上の固定化オリゴヌ
クレオチドとのライゲーション、及び鎖置換ＰＣＲを活用して、シークエンシングライブ
ラリーを生成する。１つの実施形態において、クローンインデックス付きビーズは、ラン
ダム又は特定のプライマー及びインデックス等の固定化ＤＮＡ配列で生成してもよい。連
結ライブラリーは、固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションとその後のラ
イゲーションにより、クローンインデックス付きビーズ上に捕捉することができる。分子
内ハイブリダイゼーション捕捉は、分子間ハイブリダイゼーションよりもはるかに速いた
め、連続転位ライブラリーが、ビーズに「巻き付く（ｗｒａｐ ａｒｏｕｎｄ）」ことに
なる。図１８及び１９は、クローンインデックス付きビーズ上でのＣＰＴ－ＤＮＡの捕捉
及び連続性情報の保存を示す。鎖置換ＰＣＲは、クローンビーズインデックス情報を個々
の分子に転移することができる。従って、各連結ライブラリーは、特異的にインデックス
付けされることになる。
いくつかの実施形態において、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドは、一方
の鎖は固体支持体に固定化され、もう一方の鎖は、固定化された鎖に部分的に相補的であ
ることによりＹ－アダプターとなるような、部分的二本鎖構造を含むことができる。いく
つかの実施形態において、固体支持体に固定化されたＹ－アダプターは、ライゲーション
及びギャップ充填により連結タグメント化ＤＮＡに結合する。図２０に示す。
いくつかの実施形態において、Ｙ－アダプターは、ビーズ等の固体支持体上のプローブ
／インデックスを用いた、ＣＰＴ－ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉を通じて、形成
される。図２１は、このようなＹ－アダプターを作製する例示的なスキームを示す。これ
らのＹ－アダプターを使用することにより、潜在的に各フラグメントがシークエンシング
ライブラリーになる可能性があることを確かにする。これにより、シークエンシング当た
りの適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）が増加する。
いくつかの実施形態において、遊離トランスポソームを、ＣＰＴ－ＤＮＡから分離して
もよい。いくつかの実施形態において、遊離トランスポソームの分離は、サイズ排除クロ
マトグラフィーによる。１つの実施形態において、分離は、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ－４
００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ペンシルバニア州ピッツバーグ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により行ってもよい。図２２は、遊離トランスポ
ソームから分離したＣＰＴ－ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す。
ハイブリダイゼーションを通じた連結転位標的核酸の固体支持体上への捕捉には、いく
つかの特有の利点がある。１つ目としては、方法は、ハイブリダイゼーションに基づくも
のであり、転位に基づくものではない。分子内ハイブリダイゼーション率＞＞分子間ハイ
ブリダイゼーション率である。従って、単一の標的ＤＮＡ分子の連続転位ライブラリーが
固有インデックス付きビーズに巻き付く可能性は、２つ又はそれ以上の異なる単一の標的
ＤＮＡ分子が固有インデックス付きビーズに巻き付くのに比べてはるかに高い。２つ目と
しては、ＤＮＡの転位及び転位したＤＮＡのバーコード化は、２つの別個のステップで生
じる。３つ目としては、ビーズ上の活性化トランスポソームのアセンブリ及び固体表面上
のトランスポゾンの表面密度の最適化に関連した課題を、回避することができる。４つ目
としては、自己転位産物をカラム精製により除去することができる。５つ目としては、連
結転位ＤＮＡがギャップを含むため、ＤＮＡがより柔軟であり、それ故、トランスポソー
ムをビーズに固定化する方法に比べて、転位密度（挿入サイズ）への負荷が少ない。６つ
目としては、方法に、組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）バーコードスキームを
用いることができる。７つ目としては、インデックス付きオリゴをビーズに共有結合させ
るのが容易である。従って、インデックス交換の可能性が少ない。８つ目としては、タグ
メント化及びその後のＰＣＲ増幅を多重化してもよく、単一反応区画（「ワンポット」）
反応で行うことができるため、各インデックス配列に対して個々の反応を行う必要がなく
なる。
いくつかの実施形態において、転位の間に、複数の固有のバーコードを標的核酸全体に
わたって挿入してもよい。いくつかの実施形態において、各バーコードは、間にフラグメ
ント化部位が配置された第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含む。第１の
バーコード配列及び第２のバーコード配列は、互いにペアとなるように同定又は設計する
ことができる。第１のバーコードと第２のバーコードとが関連するようにペアを作ること
は、有益（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）である可能性がある。有利なことに、ペアとなった
バーコード配列を用いて、シークエンシングデータを鋳型核酸のライブラリーからアセン
ブルすることができる。例えば、第１のバーコード配列を含む第１の鋳型核酸、及び第１
のバーコード配列とペアとなる第２のバーコード配列含む第２の鋳型核酸を同定すること
は、第１及び第２の鋳型核酸が、標的核酸の配列表示において互いに隣接した配列を表す
ことを意味する。このような方法を用いて、参照ゲノムを必要とすることなく、標的核酸
の配列表示をデノボで（新たに）アセンブルすることができる。
１つの態様において、本発明は、特定のＤＮＡフラグメントのショットガン配列ライブ
ラリーを生成する方法及び組成物に関する。
１つの実施形態において、クローンビーズインデックス付きビーズを、固定化オリゴヌ
クレオチド配列：ランダム又は特異的なプライマー及び固有のインデックスで生成する。
標的核酸を、クローンインデックス付きビーズに加える。いくつかの実施形態において、
標的核酸は、ＤＮＡである。１つの実施形態において、標的ＤＮＡを変性させる。標的Ｄ
ＮＡは、固体表面（例えば、ビーズ）に固定化された固有のインデックスを含むプライマ
ーにハイブリダイズし、続いて、同じインデックスを有する別のプライマーにハイブリダ
イズする。ビーズ上のプライマーは、ＤＮＡを増幅させる。１つ又はそれ以上の更なる増
幅ラウンドを行ってもよい。１つの実施形態において、増幅は、３’ランダムｎ量体配列
を有するビーズ固定化プライマーを用いて、全ゲノム増幅により行ってもよい。好ましい
実施形態において、ランダムｎ量体は、増幅中のプライマー－プライマー相互作用を防ぐ
ために、疑似相補的塩基（２－チオチミン、２－アミノｄＡ、Ｎ４－エチルシトシン等）
を含む（Ｈｏｓｈｉｋａ，Ｓ；Ｃｈｅｎ，Ｆ；Ｌｅａｌ，ＮＡ；Ｂｅｎｎｅｒ，ＳＡ，Ａ
ｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９（３２）５５５４－５５５７（２０１０））。
図２３は、特定のＤＮＡフラグメントのショットガン配列ライブラリーを生成する例示的
なスキームを示す。クローンインデックス付きシークエンシングライブラリー及び増幅産
物のライブラリーを生成することができる。１つの実施形態において、このようなライブ
ラリーは、転位により生成することができる。インデックス情報を指針として用いること
により、クローンインデックス付きライブラリーの配列情報を用いて、連続性情報をアセ
ンブルすることができる。図２４は、クローンインデックス付きシークエンシングライブ
ラリーから配列情報をアセンブルする例示的なスキームを示す。
上記実施形態の方法には、いくつかの利点がある。ビーズ上での分子内増幅は、ビーズ
間増幅よりもはるかに速い。従って、ビーズ上の生成物は、同じインデックスを有するこ
とになる。特定のＤＮＡフラグメントのショットガンライブラリーを、作製することがで
きる。ランダムプライマーは、ランダムな場所で鋳型を増幅するため、同じインデックス
を有するショットガンライブラリーを特定の分子から生成することができ、インデックス
付き配列を用いて配列情報をアセンブルすることができる。上記実施形態の方法の大きな
利点は、反応を単一の反応（ワンポット反応）で多重化することができ、多くの個別のウ
ェルを用いる必要がなくなることである。多くのインデックス付きクローンビーズを調製
することができ、そのため、多くの異なるフラグメントを固有にラベルすることができ、
同じゲノム領域に対して親対立遺伝子を識別することができる。多数のインデックスを用
いることにより、父親のＤＮＡコピー及び母親のＤＮＡコピーが同じゲノム領域に対して
同じインデックスを受け取る可能性は低い。当該方法は、内（ｉｎｔｒａ）反応が間（ｉ
ｎｔｅｒ）反応よりもはるかに速いという事実を利用するものであり、ビーズは、大きな
物理的区画において実質的な仕切りを基本的に作り出す。
本発明の全ての上記態様のうちのいくつかの実施形態において、方法を、無細胞ＤＮＡ
（ｃｆＤＮＡ：ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ）アッセイにおいてｃｆＤＮＡに用いてもよ
い。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡは、血漿、胎盤液から得る。
１つの実施形態において、血漿は、膜ベースの沈降支援血漿分離器を用いて無希釈の全
血から得ることができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｎｏｖ
５；８５（２１）：１０４６３－７０）。１つの実施形態において、血漿分離器におけ
る血漿採取ゾーンは、トランスポソームを含む固体支持体を含んでいてもよい。トランス
ポソームを含む固体支持体は、血漿が全血から分離される時に、単離された血漿からｃｆ
ＤＮＡを捕捉してもよく、ｃｆＤＮＡの濃縮及び／又はＤＮＡのタグメント化を行うこと
ができる。いくつかの実施形態において、タグメント化は、固有のバーコードをさらに導
入することにより、続いて分離（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）を、ライブラリープー
ルのシークエンシング後に行うことを可能にするであろう。
いくつかの実施形態において、分離器の採取ゾーンは、ＰＣＲマスターミックス（プラ
イマー、ヌクレオチド、バッファー、金属）及びポリメラーゼを含んでいてもよい。１つ
の実施形態において、マスターミックスは、血漿が分離器から出てくる時に再構成される
ように、乾燥状態であってもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、ランダ
ムプライマーである。いくつかの実施形態において、プライマーは、特定の遺伝子に対す
る特異的プライマーであってもよい。ｃｆＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果として、分離された
血漿から直接ライブラリーを生成することになる。
いくつかの実施形態において、分離器の採取ゾーンは、ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス
（プライマー、ヌクレオチド、バッファー、金属）、逆転写酵素、及びポリメラーゼを含
んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、ランダムプライマー又は
オリゴｄＴプライマーである。いくつかの実施形態において、プライマーは、特定の遺伝
子に対する特異的プライマーであってもよい。得られたｃＤＮＡは、シークエンシングに
用いることができる。或いは、ｃＤＮＡは、配列ライブラリー調製のために、固体支持体
に固定化されたトランスポソームで処理してもよい。
いくつかの実施形態において、血漿分離器は、バーコード（１Ｄ又は２Ｄバーコード）
を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、分離装置は、採血装置を有していて
もよい。これにより、血液を血漿分離器及びライブラリー調製装置に直接送ることになる
。いくつかの実施形態において、装置は、下流配列分析器を有していてもよい。いくつか
の実施形態において、配列分析器は、単回使用シークエンサーである。いくつかの実施形
態において、シークエンサーは、まとめてシークエンシングする前に、サンプルの列を作
ることができる。或いは、シークエンサーは、サンプルがシークエンシング領域に送達さ
れる、ランダムアクセス機能を有していてもよい。
いくつかの実施形態において、血漿用採取ゾーンは、無細胞ＤＮＡが濃縮されるように
、シリカ基質を含んでいてもよい。
フェージング及びメチル化の同時検出
５－メチルシトシン（５－Ｍｅ－Ｃ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ヒドロ
キシ－Ｃ）は、エピジェネティック（Ｅｐｉ）修飾としても知られ、細胞代謝、分化、及
び癌増殖において重要な役割を果たす。本願の発明者らは、驚くべきことに、且つ予想外
にも、フェージング及び同時のメチル化の検出が、本願の方法及び組成物を用いて可能で
あることを見出した。本願の方法は、ビーズ上でのＣＰＴシークエンシング（ＣＰＴ－ｓ
ｅｑ）（インデックス付き連結ライブラリー）とＤＮＡメチル化検出とを組み合わせるこ
とを可能にするものである。例えば、ビーズ上に生成された個々のライブラリーを亜硫酸
水素塩で処理して、非メチル化ＣをＵに変換するが、メチル化ＣはＵに変換しないことに
より、５－Ｍｅ－Ｃの検出を可能にすることができる。ヘテロ接合ＳＮＰを用いた更なる
フェージング分析を通じて、Ｅｐｉ－メチル化－フェージングブロックを複数のメガ塩基
領域で確立することができる。
いくつかの実施形態において、分析されるＤＮＡのサイズは、約１００塩基～約複数メ
ガ塩基まで可能である。いくつかの実施形態において、分析されるＤＮＡのサイズは、約
１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩
基、８００塩基、９００塩基、１０００塩基、１２００塩基、１３００塩基、１５００塩
基、２０００塩基、３０００塩基、３５００塩基、４０００塩基、４５００塩基、５００
０塩基、５５００塩基、６０００塩基、６５００塩基、７０００塩基、７５００塩基、８
０００塩基、８５００塩基、９０００塩基、９５００塩基、１０，０００塩基、１０，５
００塩基、１１，０００塩基、１１，５００塩基、１２，０００塩基、１２，５００塩基
、１３，０００塩基、１４，０００塩基、１４，５００塩基、１５，０００塩基、１５，
５００塩基、１６，０００塩基、１６，５００塩基、１７，０００塩基、１７，５００塩
基、１８，０００塩基、１８，５００塩基、１９，０００塩基、１９，５００塩基、２０
，０００塩基、２０，５００塩基、２１，０００塩基、２１，５００塩基、２２，０００
塩基、２２，５００塩基、２３，０００塩基、２３，５００塩基、２４，０００塩基、２
４，５００塩基、２５，０００塩基、２５，５００塩基、２６，０００塩基、２６，５０
０塩基、２７，０００塩基、２７，５００塩基、２８，０００塩基、２８，５００塩基、
２９，５００塩基、３０，０００塩基、３０，５００塩基、３１，０００塩基、３１，５
００塩基、３２，０００塩基、３３，０００塩基、３４，０００塩基、３５，０００塩基
、３６，０００塩基、３７，０００塩基、３８，０００塩基、３９，０００塩基、４０，
０００塩基、４２，０００塩基、４５，０００塩基、５０，０００塩基、５５，０００塩
基、６０，０００塩基、６５，０００塩基、７０，０００塩基、７５，０００塩基、８０
，０００塩基、８５，０００塩基、９０，０００塩基、９５，０００塩基、１００，００
０塩基、１１０，０００塩基、１２０，０００塩基、１３０，０００塩基、１４０，００
０塩基、１５０，０００塩基、１６０，０００塩基、１７０，０００塩基、１８０，００
０塩基、２００，０００塩基、２２５，０００塩基、２５０，０００塩基、３００，００
０塩基、３５０，０００塩基、４００，０００塩基、４５０，０００塩基、５００，００
０塩基、５５０，０００塩基、６００，０００塩基、６５０，０００塩基、７００，００
０塩基、７５０，０００塩基、８００，０００塩基、８５０，０００塩基、９００，００
０塩基、１，０００，０００塩基、１，２５０，０００塩基、１，５００，０００塩基、
２，０００，０００塩基、２，５００，０００塩基、３，０００，０００塩基、４，００
０，０００塩基、５，０００，０００塩基、６，０００，０００塩基、７，０００，００
０塩基、８，０００，０００塩基、９，０００，０００塩基、１０，０００，０００塩基
、１５，０００，０００塩基、２０，０００，０００塩基、３０，０００，０００塩基、
４０，０００，０００塩基、５０，０００，０００塩基、７５，０００，０００塩基、１
００，０００，０００塩基、又はそれ以上である。
５－ヒドロキシ－Ｃ、ＤＮＡ酸化生成物、ＤＮＡアルキル化生成物、ヒストン末端（ｈ
ｉｓｔｏｎｅ－ｆｏｏｔ）プリンティング等の他のＥｐｉ修飾はまた、本願に開示する方
法及び組成物を用いてフェージングの中で分析することもできる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、初めに、固体支持体上でインデックス付き結
合ライブラリーに変換される。元のＤＮＡよりもはるかに小さい個々のインデックス付き
ライブラリーは、個々のライブラリーがより小さいため、フラグメント化され難い。イン
デックス付きライブラリーの小画分が消失したとしても、フェージング情報は、インデッ
クス付きＤＮＡ分子の全長にわたって依然として維持される。例えば、１００ｋｂの分子
の場合、従来の亜硫酸水素塩変換（ＢＳＣ）では半分にフラグメント化され、連続性はも
はや５０ｋｂに制限される。本明細書に開示する方法では、１００ｋｂのライブラリーは
、初めにインデックス化され、個々のライブラリーの画分が消失しても、連続性は、依然
として～１００ｋｂである（全ライブラリーがＤＮＡ分子の一端から消失する稀な事態を
除いて）。また、本明細書に開示する方法は、従来の亜硫酸水素塩変換アプローチでは必
要とされるのとは対照的に、更なる精製ステップが必要とされないことにより、収率が上
がるため、さらに利点を有する。本明細書に開示する方法では、ビーズは、亜硫酸水素塩
変換の後に洗浄するだけである。さらに、ＤＮＡが固相に結合しているままで、ＤＮＡ（
インデックス付きライブラリー）の最小限の消失及び少ない手間でバッファー交換を容易
に行うことができる。
フェージング及びメチル化の同時検出の例示的なスキームを図４３に示す。操作フロー
は、ビーズ上でのＤＮＡのタグメント化、９塩基対の反復領域のギャップ充填ライゲーシ
ョン、ＳＤＳによるＴｎ５の除去、及びビーズ上の個々のライブラリーの亜硫酸水素塩変
換からなる。隣接する相補的ライブラリーが再アニールしないことを確実にするために、
亜硫酸水素塩変換を変性条件下で行い、それにより、亜硫酸水素塩変換効率を低下させる
。ＢＳＣは、非メチル化ＣをＵに変換し、メチル化Ｃは、変換されない。
図４４は、フェージング及びメチル化の同時検出の別の例示的なスキームを示す。転位
後にシークエンシングライブラリーを調製した後、一本鎖鋳型を調製するために、ギャッ
プ充填ライゲーションしたライブラリーの画分を分解する。一本鎖鋳型は、既に鋳型が、
ライブラリーの消失を低減すること又は亜硫酸水素塩変換効率を改善することができる一
本鎖であるため、亜硫酸水素塩変換に対してより穏やかな条件を必要とする。１つの実施
形態において、３’チオ保護トランスポゾン（Ｅｘｏ抵抗性）及び非保護トランスポゾン
の混合物を、同じビーズ上で用いる。酵素、例えば、Ｅｘｏ Ｉを用いて、非チオ保護ラ
イブラリーを分解し、それらを一本鎖ライブラリーに変換することができる。チオ保護ト
ランスポゾン：非保護トランスポゾンが５０：５０である混合物を用いることにより、ラ
イブラリーの５０％を一本鎖ライブラリーに変換し（５０％では、ライブラリーの１つの
トランスポゾンは保護されており、１つのトランスポゾン（相補鎖）は保護されていない
）、２５％は変換せず（両方のトランスポゾンがチオ保護されている）、２５％は両方と
も変換してライブラリー全体を除去する（両方のトランスポゾンが保護されていない）。
ストレプトアビジン磁性ビーズ等の固相に結合したＤＮＡの亜硫酸水素塩変換を行う上
での１つの課題は、ＤＮＡが結合したビーズを、亜硫酸水素ナトリウムにより高温で長時
間処理することで、ＤＮＡ及びビーズの両方に損傷を与えることである。ＤＮＡ損傷の回
復を助けるため、キャリアＤＮＡ（即ち、ラムダＤＮＡ）を亜硫酸水素塩処理前に反応混
合物に加える。キャリアＤＮＡが存在しても、当初のＤＮＡの約８０％が消失することが
予測された。結果として、ＣＰＴＳｅｑ連続性ブロックは、従来のＣＰＴＳｅｑプロトコ
ルよりも少ないメンバーを有する。
従って、本明細書において、Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑプロトコルのＤＮＡ収量を改善する
ためのいくつかのストラテジーを提案する。第１のストラテジーは、ストレプトアビジン
ビーズにトランスポソーム複合体をより密集させることで、ライブラリー挿入サイズを小
さくすることに依拠する。ライブラリーサイズを小さくすることにより、より少ない割合
のライブラリーエレメントが亜硫酸水素塩処理により分解される。
Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑプロトコルのＤＮＡ収量を改善するための第２のストラテジーは
、破損したライブラリーエレメントを酵素により回復させることである。回復ストラテジ
ーの目的は、ライブラリー増幅に必要な３’共通配列を、亜硫酸水素塩処理中に３’部分
が分解及び消失したビーズ結合ライブラリーエレメントに再び加えることである。３’共
通配列を加えた後は、これらのエレメントをＰＣＲ増幅及びシークエンシングすることが
できる。図６７及び６８は、このストラテジーの例示的なスキームを示す。二本鎖ＣＰＴ
Ｓｅｑライブラリーエレメントを変性し、亜硫酸水素塩変換する（上段）。亜硫酸水素塩
変換の間に、ＤＮＡ鎖の１つが損傷を受け（中段）、３’末端上のＰＣＲ共通配列が消失
する。鋳型救出ストラテジーにより、ＰＣＲ増幅に必要な３’共通配列（緑色）を回復さ
せる（下段）。１つの例において、３’リン酸化アテニュエーターオリゴ、即ち、シーク
エンシングアダプターとそれに続くオリゴｄＴストレッチを含む配列の存在下で、ターミ
ナルトランスフェラーゼを使用する（図６８Ａ）。簡単に言えば、ＴｄＴが、１０～１５
ｄＡのストレッチを、アテニュエーターオリゴのオリゴｄＴ部分にアニールする破損ライ
ブラリーエレメントの３’末端に、加える。このＤＮＡハイブリッドの形成により、Ｔｄ
Ｔ反応が停止し、破損ライブラリーエレメントの３’末端をＤＮＡポリメラーゼにより結
果的に伸長させるための鋳型をもたらす。
別の操作フロー（図６８Ｂ）では、ＴｄＴテーリング反応を、一本鎖オリゴｄＴ部分及
び５’リン酸化二本鎖シークエンシングアダプター部分を有する部分的二本鎖アテニュエ
ーターオリゴの存在下で行う。ＴｄＴ反応の終結時、最後に付加されたｄＡと５’リン酸
化アテニュエーターオリゴとの間のニックを、ＤＮＡリガーゼで封止する。
記載した操作フローのどちらも、近年開発された制御可能なＴｄＴテーリング反応に依
拠しており、米国特許出願公開第２０１５／００８７０２７号明細書に記載されている。
共通シークエンシングアダプターはまた、近年導入されたＭＭＬＶ ＲＴのｓｓＤＮＡ鋳
型スイッチング活性により、破損ライブラリーエレメントの３’末端に付加することがで
きる。つまり、ＭＭＬＶ ＲＴ及び鋳型スイッチオリゴ（ＴＳオリゴ：ｔｅｍｐｌａｔｅ
ｓｗｉｔｃｈ＿ｏｌｉｇｏ）を、損傷ＤＮＡに加える（図６８Ｃ）。この反応の最初の
ステップにおいて、逆転写酵素は、一本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端にいくつかの追
加のヌクレオチドを付加し、これらの塩基は、ＴＳオリゴの１つの３’末端に存在するオ
リゴ（Ｎ）配列とペアを作る。次いで、逆転写酵素の鋳型スイッチング活性により、アニ
ールされた共通プライマーの配列をＢＳＣ破損ライブラリーエレメントの３’末端に付加
し、共通シークエンシングプライマーによるＰＣＲで増幅される能力を回復させる。
第３のストラテジーの一部として、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社のＥｐｉＧｅｎｏｍｅキット
「ポスト亜硫酸水素塩変換」ライブラリー構築法を用いて、亜硫酸水素塩変換中に３’末
端の共通配列を消失したライブラリーエレメントを救出することができる。図６９に示す
ように、このライブラリー救出法は、共通配列及びそれに続く短いストレッチのランダム
配列を有する３’リン酸化オリゴを利用する。これらの短いランダム配列は、亜硫酸水素
塩処理一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、続いて共通配列が、ＤＮＡポリメラーゼにより
破損ライブラリー鎖に複製される。
図７４は、ビーズ上での亜硫酸水素塩シークエンシング法を改良する第４のストラテジ
ーを示す。捕捉タグを含む第１の共通配列を、ＤＮＡの５’末端に共有結合させる。第１
の共通配列は、片側転位（図示する）、アダプターライゲーション、又は米国特許出願公
開第２０１５／００８７０２７号明細書に記載されたターミナルトランスフェラーゼ（Ｔ
ｄＴ）アダプターライゲーションを含む、種々の方法を用いてＤＮＡに結合させることが
できる。
次に、ＤＮＡを変性させ（例えば、高熱でのインキュベーション）、固体支持体に結合
させる。ビオチンをＣＳ１上の捕捉タグとして使用する場合は、例えば、ＤＮＡは、スト
レプトアビジン磁性ビーズ（図示する）を用いて結合させることができる。固体支持体に
結合してしまえば、バッファー交換を容易に行うことができる。
次のステップにおいて、ｓｓＤＮＡの亜硫酸水素塩変換を行う。一本鎖の形では、ＤＮ
Ａは、亜硫酸水素塩変換に容易に利用できるはずであり、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＭｅｔｈｙ
ｌ Ｅｄｇｅ ＢＳＣキットの改良版を用いて変換効率９５％まで観察した（図７５）。
亜硫酸水素塩変換後、第２の共通配列を、固体支持体に結合したｓｓＤＮＡの３’末端
に共有結合させる。オリゴをｓｓＤＮＡに共有結合させるためのいくつかの方法を、上述
してきた。ＴｄＴアテニュエーター／アダプターライゲーション法を用いて、＞９５％の
ライゲーション効率を達成した。結果として、提案したメチルシークエンシング（Ｍｅｔ
ｈｙｌＳｅｑ）操作フローを用いた最終ライブラリーの収量は、既存の方法よりも高くな
るはずである。
最終ステップにおいて、ＰＣＲを行ってライブラリーを増幅し、ライブラリーを固体支
持体から除去する。ＰＣＲプライマーは、シークエンシングアダプター等の追加の共通配
列を、ＭｅｔｈｙｌＳｅｑライブラリーの末端に付加するようにデザインすることができ
る。
単一アッセイにおける様々なサイズのライブラリーの調製
ゲノムのアセンブリの精度は、様々な長さスケールの技術の使用次第である。例えば、
ショットガン（数百ｂｐ）－メイトペア（～３Ｋｂ）から－Ｈｉ－Ｃ（Ｍｂスケール）は
全て、アセンブリ及びコンティグ長を経時的に改良する方法である。課題は、これを行う
ために多重アッセイが必要であり、多層アプローチを扱い難く且つ費用が掛かるものとし
ていることである。本明細書に開示する組成物及び方法は、単一のアッセイで複数の長さ
スケールに対応することができる。
いくつかの実施形態において、ライブラリー調製を、サイズの異なる固体支持体、例え
ば、ビーズを用いて単一アッセイで達成することができる。各ビーズのサイズは、ビーズ
の物理的サイズがライブラリーサイズを決定し、特定のライブラリーサイズ又はサイズ範
囲をもたらすことになる。様々なサイズのビーズは全て、ライブラリーに転移する固有の
クローンインデックスを有する。従って、様々なサイズのライブラリーが、固有にインデ
ックス付けされた異なる各ライブラリースケール長で生成される。様々な長さスケールの
ライブラリーを同じ物理的区画で同時に調製するため、コストが減り、操作フロー全体を
改善する。いくつかの実施形態において、各特定の固体支持体サイズ、例えば、ビーズサ
イズは、固有のインデックスを受け取る。いくつかの他の実施形態において、同じ固体支
持体サイズ、例えば、同じビーズサイズの複数の異なるインデックスもまた調製すること
で、複数のＤＮＡ分子をそのサイズ範囲に対してインデックス区分することができる。図
４５は、単一アッセイで、様々なサイズのクローンインデックス付きビーズを用いて様々
なサイズのライブラリーを生成する例示的なスキームを示す。
いくつかの実施形態において、生成されるライブラリーのサイズは、約５０塩基、７５
塩基、１００塩基、１５０塩基、２００塩基、２５０塩基、３００塩基、３５０塩基、４
００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１０００塩
基、１２００塩基、１３００塩基、１５００塩基、２０００塩基、３０００塩基、３５０
０塩基、４０００塩基、４５００塩基、５０００塩基、５５００塩基、６０００塩基、６
５００塩基、７０００塩基、７，５００塩基、８０００塩基、８５００塩基、９０００塩
基、９５００塩基、１０，０００塩基、１０，５００塩基、１１，０００塩基、１１，５
００塩基、１２，０００塩基、１２，５００塩基、１３，０００塩基、１４，０００塩基
、１４，５００塩基、１５，０００塩基、１５，５００塩基、１６，０００塩基、１６，
５００塩基、１７，０００塩基、１７，５００塩基、１８，０００塩基、１８，５００塩
基、１９，０００塩基、１９，５００塩基、２０，０００塩基、２０，５００塩基、２１
，０００塩基、２１，５００塩基、２２，０００塩基、２２，５００塩基、２３，０００
塩基、２３，５００塩基、２４，０００塩基、２４，５００塩基、２５，０００塩基、２
５，５００塩基、２６，０００塩基、２６，５００塩基、２７，０００塩基、２７，５０
０塩基、２８，０００塩基、２８，５００塩基、２９，５００塩基、３０，０００塩基、
３０，５００塩基、３１，０００塩基、３１，５００塩基、３２，０００塩基、３３，０
００塩基、３４，０００塩基、３５，０００塩基、３６，０００塩基、３７，０００塩基
、３８，０００塩基、３９，０００塩基、４０，０００塩基、４２，０００塩基、４５，
０００塩基、５０，０００塩基、５５，０００塩基、６０，０００塩基、６５，０００塩
基、７０，０００塩基、７５，０００塩基、８０，０００塩基、８５，０００塩基、９０
，０００塩基、９５，０００塩基、１００，０００塩基、１１０，０００塩基、１２０，
０００塩基、１３０，０００塩基、１４０，０００塩基、１５０，０００塩基、１６０，
０００塩基、１７０，０００塩基、１８０，０００塩基、２００，０００塩基、２２５，
０００塩基、２５０，０００塩基、３００，０００塩基、３５０，０００塩基、４００，
０００塩基、４５０，０００塩基、５００，０００塩基、５５０，０００塩基、６００，
０００塩基、６５０，０００塩基、７００，０００塩基、７５０，０００塩基、８００，
０００塩基、８５０，０００塩基、９００，０００塩基、１，０００，０００塩基、１，
２５０，０００塩基、１，５００，０００塩基、２，０００，０００塩基、２，５００，
０００塩基、３，０００，０００塩基、４，０００，０００塩基、５，０００，０００塩
基、６，０００，０００塩基、７，０００，０００塩基、８，０００，０００塩基、９，
０００，０００塩基、１０，０００，０００塩基、１５，０００，０００塩基、２０，０
００，０００塩基、３０，０００，０００塩基、４０，０００，０００塩基、５０，００
０，０００塩基、７５，０００，０００塩基、１００，０００，０００塩基、又はそれ以
上である。
いくつかの実施形態において、上述の複数の長さスケールのライブラリーを、１つの大
きな長さスケールを有する代わりに、疑似遺伝子、パラログ等のアセンブリに用いること
ができる。いくつかの実施形態において、複数の長さスケールのライブラリーを、単一ア
ッセイで同時に調製する。利点は、少なくとも１つの長さスケールが、疑似遺伝子又は遺
伝子のみを有し、両方は有さない固有領域に結合することである。従って、この長さスケ
ールで検出される変異は、遺伝子又は疑似遺伝子のどちらかに変異を一意的に決めること
ができる。同じことがコピー数の変異、パラログ等にも当てはまる。アセンブリの長所は
、異なる長さスケールの使用である。本明細書に開示する方法を用いることにより、異な
る長さスケールのインデックス付き結合ライブラリーを、異なる長さスケールのための個
々の異なるライブラリー調製を行わずに、単一のアッセイで生成することができる。図４
６は、異なる長さスケールのライブラリーで遺伝子変異を決定する例示的なスキームを示
す。
遺伝子変異の分析
本明細書に開示する組成物及び方法は、遺伝子変異の分析に関する。例示的な遺伝子変
異としては、これに限定されないが、欠損、染色体間転位、重複、パラログ、染色体間遺
伝子融合が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する組成物及び方
法は、遺伝子変異のフェージング情報の決定に関する。以下の表は、例示的な染色体間遺
伝子融合を示す。
Figure 0007532455000001
表２は、染色体１における例示的な欠損を示す。
Figure 0007532455000002
いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的核酸をトランスポソームに曝す前にフ
ラグメント化することができる。例示的なフラグメント化法としては、これに限定されな
いが、超音波処理、機械的剪断、及び制限消化が挙げられる。タグメント化（フラグメン
ト化及びタグ化）前の標的核酸のフラグメント化は、疑似遺伝子（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６
）のアセンブリ／フェージングに有利である。インデックス付き結合リードの長い島（＞
３０ｋｂ）は、図６４に示すように、疑似遺伝子Ａ及びＡ’に及ぶであろう。高い配列相
同性のため、どの変異が遺伝子Ａ及び遺伝子Ａ’に属するのかを決定することが課題とな
るであろう。より短い変異は、固有の周囲配列で疑似遺伝子の１つの変異に結合するであ
ろう。そのようなより短い島は、タグメント化前に標的核酸をフラグメント化することに
より達成することができる。
結合トランスポソーム
いくつかの実施形態において、トランスポザーゼは、トランスポソーム複合体中で多量
体であり、例えば、二量体、四量体等をトランスポソーム複合体中で形成する。本願の発
明者らは、驚くべきことに、且つ予想外にも、多量体トランスポソーム複合体中の単量体
トランスポザーゼを結合させること、又は多量体トランスポソーム複合体中のトランスポ
ソーム単量体のトランスポゾン末端を結合させることには、いくつかの利点があることを
見出した。１つ目としては、トランスポザーゼ又はトランスポゾンの結合は、より安定し
た複合体をもたらし、大きな画分が活性化状態にある。２つ目としては、より低い濃度の
トランスポソームを、転位反応によるフラグメント化において用いることができる可能性
がある。３つ目としては、結合により、トランスポソーム複合体のモザイク末端（ＭＥ）
の交換が少なくなり、それにより、バーコード又はアダプター分子の混合が少なくなる。
そのようなＭＥ末端の交換は、複合体がバラバラになり、再編成する場合、又は、トラン
スポソームがストレプトアビジン／ビオチンにより固体支持体上に固定化され、ストレプ
トアビジン／ビオチン相互作用が壊れて再編成する場合、又は、コンタミネーションの可
能性がある場合に、生じる可能性がある。本願の発明者らは、種々の反応条件下で、ＭＥ
末端の重大な交換（ｓｗａｐ又はｅｘｃｈａｎｇｅ）があることに気付いた。いくつかの
実施形態において、交換は、１５％にまで達する可能性がある。交換は、高塩濃度バッフ
ァーで顕著であり、グルタミン酸バッファーでは低下する。図５７及び５８は、ＭＥ交換
のいくつかの考え得るメカニズムを示す。
いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体中のトランスポザーゼのサブユ
ニットは、共有及び非共有手段により互いに結合させることができる。いくつかの実施形
態において、トランスポザーゼ単量体は、トランスポソーム複合体を形成する前に（トラ
ンスポゾンが加わる前に）結合させることができる。いくつかの実施形態において、トラ
ンスポザーゼ単量体は、トランスポソームの形成後に結合させることができる。
いくつかの実施形態において、天然アミノ酸残基を多量体界面でシステイン（Ｃｙｓ）
アミノ酸で置換し、ジスルフィド結合の形成を促進していてもよい。例えば、Ｔｎ５トラ
ンスポザーゼにおいて、Ａｓｐ４６８、Ｔｙｒ４０７、Ａｓｐ４６１、Ｌｙｓ４５９、Ｓ
ｅｒ４５８、Ｇｌｙ４６２、Ａｌａ４６６、Ｍｅｔ４７０をＣｙｓで置換して、単量体サ
ブユニット間のジスルフィド結合を促進していてもよい。図５９及び６０に示す。Ｍｏｓ
－１トランスポザーゼに関して、システインで置換することができる例示的なアミノ酸と
しては、これに限定されないが、Ｌｅｕ２１、Ｌｅｕ３２、Ａｌａ３５、Ｈｉｓ２０、Ｐ
ｈｅ１７、Ｐｈｅ３６、Ｉｌｅ１６、Ｔｈｒ１３、Ａｒｇ１２、Ｇｌｎ１０、Ｇｌｕ９が
挙げられる。図６１に示す。いくつかの実施形態において、システインで置換されたアミ
ノ酸残基を有する修飾トランスポザーゼは、マレイミド又はピリジルジチオール反応基を
用いた化学架橋剤を用いて、互いに化学的に架橋させることができる。例示的な化学架橋
剤は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から市販されている。
いくつかの実施形態において、トランスポソーム多量体複合体は、固体支持体に共有結
合させることができる。例示的な固体支持体としては、これに限定されないが、ナノ粒子
、ビーズ、フローセル表面、カラムマトリックスが挙げられる。いくつかの実施形態にお
いて、固体表面は、アミン基で被覆されていてもよい。システインで置換されたアミノ酸
残基を有する修飾トランスポザーゼは、そのようなアミン基に対し、アミン－スルフヒド
リル架橋剤（即ち、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－
１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ））を用いて、化学的に架橋させることができる。例示
的なスキームを図６２に示す。いくつかの実施形態において、マレイミド－ＰＥＧ－ビオ
チン架橋剤を用いて、ｄＴｎｐをストレプトアビジン被覆固体表面に結合させてもよい。
いくつかの実施形態において、トランスポザーゼ遺伝子は、単一のポリペプチドで多量
体タンパク質を発現するように、修飾することができる。例えば、Ｔｎ５又はＭｏｓ－１
遺伝子は、単一のポリペプチドで、２つのＴｎ５又はＭｏｓ－１タンパク質を発現するよ
うに修飾することができる。同様に、Ｍｕトランスポザーゼ遺伝子は、単一のポリペプチ
ドで、４つのｍｕトランスポザーゼユニットをコードするように修飾することができる。
いくつかの実施形態において、トランスポソーム単量体単位のトランスポゾン末端を結
合させて、結合トランスポソーム多量体複合体を形成することができる。トランスポゾン
末端を結合させることにより、プライマー部位を挿入することができ、シークエンシング
プライマー、増幅プライマー、又は任意のロール（ｒｏｌｅ）ＤＮＡが、標的ＤＮＡをフ
ラグメント化することなくｇＤＮＡに働くことができる。そのような機能性の挿入は、情
報を無傷分子から抽出する必要があるか又はサブサンプリングが重要である、ハプロタイ
プアッセイ又は結合部タグ化アッセイにおいて、利点である。いくつかの実施形態におい
て、Ｍｕトランスポソームのトランスポゾン末端は、「ループ状の」Ｍｕトランスポザー
ゼ／トランスポゾン構造に結合させることができる。Ｍｕは四量体であるため、これに制
限されないが、Ｒ２ＵＪ及び／又はＲ１ＵＪをＲ２Ｊ及び／又はＲ１Ｊに結合させること
により、種々の構造が可能である。これらの構造において、Ｒ２ＵＪ及びＲ１ＵＪは、Ｒ
２Ｊ及びＲ１Ｊと、それぞれ結合することができる又は結合しない。図６３は、トランス
ポゾン末端が結合したＭｕトランスポソーム複合体を示す。いくつかの実施形態において
、Ｔｎ５のトランスポゾン末端又はＭｏｓ－１トランスポソームのトランスポゾン末端を
、結合させることができる。
本明細書で用いる場合、用語「トランスポゾン」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応におい
て機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と複合体を形成するのに必要なヌク
レオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す、二本鎖ＤＮＡを意味する。ト
ランスポゾンは、トランスポゾンを認識し、且つ結合するトランスポザーゼ又はインテグ
ラーゼとともに、「複合体」又は「シナプス複合体」又は「トランスポソーム複合体」又
は「トランスポソーム組成物」を形成する。複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応におい
て一緒にインキュベートする標的ＤＮＡに、トランスポゾンを挿入又は転位することが可
能である。トランスポゾンは、「転移トランスポゾン配列」すなわち「転移鎖」、及び「
非転移トランスポゾン配列」すなわち「非転移鎖」からなる２つの相補的配列を示す。例
えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応において活性がある機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼ
（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソン、
ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とともに複合体を形成する１
つのトランスポゾンは、以下の「転移トランスポゾン配列」を示す転移鎖：
５’ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３’
及び以下の「非転移トランスポゾン配列」を示す非転移鎖：
５’ＣＴＧＴＣＴ ＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ３’
を含む。
転移鎖の３’末端は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応において、標的ＤＮＡに結合又は転移
する。非転移鎖は、転移トランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン配列を示し、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応において、標的ＤＮＡに結合又は転移しない。いくつかの実施
形態において、トランスポゾン配列は、以下の配列うちの１つ又はそれ以上を含んでいて
もよい：バーコード、アダプター配列、タグ配列、プライマー結合配列、捕捉配列、固有
分子識別（ＵＭＩ：ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列。
本明細書で用いる場合、用語「アダプター」は、バーコード、プライマー結合配列、捕
捉配列、捕捉配列に相補的な配列、固有分子識別（ＵＭＩ）配列、親和性部分、制限部位
を含むことができる核酸配列を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「連続性情報」は、共有情報に基づいた、２つ又はそれ以
上のＤＮＡフラグメント間の空間的関係を指す。情報の共有態様は、隣接関係、区画関係
、及び距離空間関係に関するものとすることができる。これらの関係に関する情報は、順
に、ＤＮＡフラグメントに由来する配列リードの階層的なアセンブリ又はマッピングを容
易にする。この連続性情報は、そのようなアセンブリ又はマッピングの効率及び精度を改
善する。なぜなら、従来のショットガンシークエンシングと関連して用いられる伝統的な
アセンブリ又はマッピング法では、個々の配列リードが由来した２つ又はそれ以上のＤＮ
Ａフラグメントの空間的関係に関して、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標
を考慮に入れないからである。従って、本明細書に記載する実施形態によれば、連続性情
報を捕捉する方法を、隣接空間関係を決定する短距離連続性法、区画空間関係を決定する
中距離連続性法、又は距離空間関係を決定する長距離連続性法により行ってもよい。これ
らの方法は、ＤＮＡ配列アセンブリ又はマッピングの精度及び質を高める。また、これら
の方法は、上述のシークエンシング法等の任意のシークエンシング法とともに用いてもよ
い。
連続性情報は、個々の配列リードが由来した２つ又はそれ以上のＤＮＡフラグメントの
空間的関係に関して、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を含む。いくつか
の実施形態において、連続性情報は、非重複配列リードからの配列情報を含む。
いくつかの実施形態において、標的核酸配列の連続性情報は、ハプロタイプ情報を示す
。いくつかの実施形態において、標的核酸配列の連続性情報は、ゲノム変異を示す。
本明細書で用いる場合、用語「標的核酸の連続性の維持」は、核酸のフラグメント化と
の関連において、同じ標的核酸からのフラグメントの核酸配列の順番を維持することを意
味する。
本明細書で用いる場合、用語「少なくとも一部」及び／又はその文法的等価物は、全量
のうちの任意の分量を指すことができる。例えば、「少なくとも一部」は、全量の少なく
とも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０
％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、又は１００％を指
すことができる。
本明細書で用いる場合、用語「約」は、±１０％を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「シークエンシングリード」及び／又はその文法的等価物
は、ポリマー中の単量体の順序を示すシグナルを得るために行われる物理的又は化学的ス
テップの繰り返し工程を指すことができる。シグナルは、単一の単量体解像度又はより低
い解像度で単量体の順序を示すことができる。特定の実施形態において、ステップを、核
酸標的に対して開始し、核酸標的中の塩基の順序を示すシグナルを得るために行うことが
できる。工程は、典型的な完了まで行うことができ、典型的な完了とは、通常、工程から
のシグナルが、合理的なレベルの確実性で、標的の塩基をそれ以上区別することができな
い時点までと定義される。所望する場合、例えば、所望の配列情報量が得られるまで等、
より早く完了することができる。シークエンシングリードは、単一の標的核酸分子に対し
て、又は同じ配列を有する標的核酸分子群に対して同時に、又は異なる配列を有する標的
核酸群に対して同時に行うことができる。いくつかの実施形態において、シークエンシン
グリードは、シグナルが、シグナル取得が開始された１つ又はそれ以上の標的核酸分子か
らそれ以上は得られない時点で、終了する。例えば、シークエンシングリードは、固相基
質上に存在する１つ又はそれ以上の標的核酸分子に対して開始し、１つ又はそれ以上の標
的核酸分子を基質から除去した時点で終了させることができる。或いは、シークエンシン
グは、シークエンシングランを開始した時に基質上に存在していた標的核酸の検出を中止
することにより、終了することができる。例示的なシークエンシング方法は、その全体が
参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０２９，１０３号明細書に記載され
ている。
本明細書で用いる場合、用語「シークエンシング表示」及び／又はその文法的等価物は
、ポリマー中の単量体単位の順序及び種類を示す情報を指すことができる。例えば、情報
は、核酸中のヌクレオチドの順序及び種類を示すことができる。情報は、例えば、描写、
画像、電子メディア、一連の記号、一連の数字、一連の文字、一連の色等を含む、任意の
種々の形式であってよい。情報は、単一の単量体解像度又はより低い解像度であってもよ
い。例示的なポリマーは、ヌクレオチド単位を有するＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸である。
一連の「Ａ」、「Ｔ」、「Ｇ」、及び「Ｃ」文字は、単一のヌクレオチド解像度でＤＮＡ
分子の実際の配列と相関性があるＤＮＡに対する周知の配列表示である。その他の例示的
なポリマーは、アミノ酸単位を有するタンパク質、及び糖単位を有する多糖類である。
固体支持体
本明細書全体を通じて、固体支持体及び固体表面は、交換可能に用いられる。いくつか
の実施形態において、固体支持体又はその表面は、管又は容器の内表面又は外表面等、非
平面である。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを
含む。本明細書において、「ミクロスフェア」又は「ビーズ」又は「粒子」又はその文法
的等価物は、小さな分散粒子を意味する。適切なビーズ組成物としては、これに限定され
ないが、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリル
ポリマー、常磁性物質、トリアゾル（ｔｈｏｒｉａ ｓｏｌ）、カーボングラファイト、
二酸化チタン、ラテックス、又は、セファロース等の架橋デキストラン、セルロース、ナ
イロン、架橋ミセル、及びテフロンが挙げられ、同様に、固形支持体として本明細書で概
説する任意の他の材料を全て使用することができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社（インディアナ州フィッシャーズ）の「ミクロスフェア検出ガイド（Ｍｉｃｒｏｓ
ｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ）」は、役立つガイドである。特定の実施
態様において、ミクロスフェアは、磁性ミクロスフェア又はビーズである。いくつかの実
施形態において、ビーズは、色分けされていてもよい。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（テキ
サス州オースティン）のＭｉｃｒｏＰｌｅｘ（登録商標）ミクロスフェアを用いてもよい
。
ビーズは球状である必要はなく、不規則粒子を用いてもよい。代わりに又は加えて、ビ
ーズは多孔質であってもよい。ビーズのサイズは、直径で、ナノメートル即ち約１０ｎｍ
から、ミリメートル即ち１ｍｍに及び、約０．２ミクロン～約２００ミクロンのビーズが
好ましく、約０．５～約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、いくつかの実施態様にお
いて、より小さい又はより大きいビーズを用いてもよい。いくつかの実施態様において、
ビーズは、直径が約０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０
．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５
μｍ、２．８μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６
μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１
０μｍ、１０．５μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ
、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ
、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、又は２００μｍであっても
よい。
トランスポソーム
「トランスポソーム」は、インテグラーゼ又はトランスポザーゼ等の組み込み（インテ
グレーション）酵素、及びトランスポザーゼ認識部位等の組み込み認識部位を含む核酸を
含む。本明細書で提供する実施形態において、トランスポザーゼは、転位反応を触媒する
ことが可能なトランスポザーゼ認識部位とともに機能的複合体を形成することができる。
トランスポザーゼは、「タグメント化」と称することもある工程において、トランスポザ
ーゼ認識部位に結合し、トランスポザーゼ認識部位を標的核酸に挿入する可能性がある。
いくつかのそのような組み込み事象において、トランスポザーゼ認識部位の１つの鎖が、
標的核酸に転移してもよい。１つの例において、トランスポソームは、２つのサブユニッ
トを含む二量体トランスポザーゼ、及び２つの非連続トランスポゾン配列を含む。別の例
において、トランスポソームは、２つのサブユニットを含む二量体トランスポザーゼを含
むトランスポザーゼ、及び連続トランスポゾン配列を含む。
いくつかの実施形態は、機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポザ
ーゼ認識部位（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７３：７３６７（１９９８））、又は、ＭｕＡトランスポザーゼ、及びＲ１及び
Ｒ２末端配列を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ
，３５：７８５，１９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１４
：４８９３，１９９５）の使用を含めることができる。機能亢進性Ｔｎ５トランスポザー
ゼと複合体を形成する例示的なトランスポザーゼ認識部位（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５（商標
）トランスポザーゼ、ウィスコンシン州マディソン、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は、以下の１９塩基の転移鎖（時に、「Ｍ」又は「ＭＥ」）及び
非転移鎖：それぞれ、５′ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３′、５′ＣＴＧＴ
ＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ３′を含む。ＭＥ配列はまた、当業者により最適化され
て、使用されてもよい。
本明細書で提供する組成物及び方法の特定の実施形態とともに使用することができる転
位システムの更なる例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ）Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１
８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ＆Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４、及び国際公開第
９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．
２７１：１５１２，１９９６；Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔ
ｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６）、Ｔｎ
／Ｏ及びＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６）、マリナートランスポ
ザーゼ（Ｌａｍｐｅ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１
９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ Ｒ Ｈ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１２５－４３，１９９６）、Ｐエレメント（Ｇｌｏ
ｏｒ，Ｇ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：９７－１１４，２００４
）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ ＆ Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５
：１８８２９－３２，１９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ＆Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕ
ｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６）、
レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９）、及び酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋ
ｅ＆Ｃｏｒｃｅｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９
８９）が挙げられる。更なる例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、
カタバミ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）、ＳＰＩＮ、ｈＡＴ、ピギーバック（Ｐｉ
ｇｇｙＢａｃ）、ハーミス（Ｈｅｒｍｅｓ）、Ｔｃバスター（ＴｃＢｕｓｔｅｒ）、Ａｅ
バスター１（ＡｅＢｕｓｔｅｒ１）、Ｔｏｌ２、及び改変型トランスポザーゼファミリー
酵素（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００
６８９．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｏｃｔ １６；Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ（２００７
）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１：３３２－５）が挙げられる。
本明細書で提供する方法及び組成物とともに使用することができるインテグラーゼの更
なる例としては、レトロウイルスインテグラーゼ、及びレトロウイルスインテグラーゼに
対するインテグラーゼ認識配列が挙げられ、例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、
ＰＦＶ－１、ＲＳＶのインテグラーゼが挙げられる。
バーコード
一般に、バーコードは、１つ又はそれ以上の特定の核酸を同定するために使用すること
ができる１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を含むことができる。バーコードは、人工
配列であってもよく、或いは、転位の際に生成する自然発生配列、例えば、以前に並置さ
れたＤＮＡフラグメントの末端にある同一のフランキングゲノムＤＮＡ配列（ｇコード）
等であってもよい。いくつかの実施形態において、バーコードは、標的核酸配列にはない
人工配列であり、１つ又はそれ以上の標的核酸配列を同定するのに用いることができる。
バーコードは、少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個
、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個
、２０個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形
態において、バーコードは、少なくとも約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６
０個、７０個、８０個、９０個、１００個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含む
。いくつかの実施形態において、バーコードを含む核酸群におけるバーコードの少なくと
も一部は、異なっている。いくつかの実施形態において、バーコードの少なくとも約１０
％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９
％が、異なっている。更なるそのような実施形態において、バーコードの全てが異なって
いる。バーコードを含む核酸群において、異なるバーコードの多様性は、ランダムに又は
非ランダムに生成することができる。
いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、少なくとも１つのバーコードを
含む。２つの非連続トランスポゾン配列を含むトランスポソーム等、いくつかの実施形態
において、第１のトランスポゾン配列は、第１のバーコードを含み、第２のトランスポゾ
ン配列は、第２のバーコードを含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列
は、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列を含むバーコードを含む。前述の実
施形態のいくつかにおいて、第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列とペアにな
るように同定又は設計することができる。例えば、互いにペアとなることが知られている
複数の第１及び第２のバーコード配列を含む参照表を用いて、既知の第１のバーコード配
列が既知の第２のバーコード配列とペアになることを知ることができる。
別の例において、第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列と同じ配列を含んで
いてもよい。別の例において、第１のバーコード配列は、第２のバーコード配列の逆相補
配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第１のバーコード配列及び第２
のバーコード配列は、異なる。第１及び第２のバーコード配列は、バイコード（ｂｉ－ｃ
ｏｄｅ）を含んでいてもよい。
本明細書に記載する組成物及び方法のいくつかの実施形態において、バーコードは、鋳
型核酸の調製に用いる。当然のことながら、膨大な数の利用可能なバーコードにより、各
鋳型核酸分子は、固有の識別を含むことができる。鋳型核酸の混合物における各分子の固
有の識別は、いくつかの用途に用いることができる。例えば、固有に識別された分子は、
例えば、ハプロタイプシークエンシング、親対立遺伝子の識別、メタゲノムシークエンシ
ング、及びゲノムのサンプルシークエンシングにおいて、複数の染色体を有するサンプル
、ゲノム、細胞、細胞型、細胞の病状、及び種における、個々の核酸分子の同定に応用す
ることができる。
例示的なバーコード配列としては、これに限定されないが、ＴＡＴＡＧＣＣＴ、ＡＴＡ
ＧＡＧＧＣ、ＣＣＴＡＴＣＣＴ、ＧＧＣＴＣＴＧＡ、ＡＧＧＣＧＡＡＧ、ＴＡＡＴＣＴＴ
Ａ、ＣＡＧＧＡＣＧＴ、及びＧＴＡＣＴＧＡＣが挙げられる。
プライマー部位
いくつかの実施形態において、トランスポゾン配列は、「シークエンシングアダプター
」又は「シークエンシングアダプター部位」、言い換えれば、プライマーにハイブリダイ
ズすることができる１つ又はそれ以上の部位を含む領域を含むことができる。いくつかの
実施形態において、トランスポゾン配列は、増幅及びシークエンシング等に有用な少なく
とも第１のプライマー部位を含むことができる。配列結合部位の例示的な配列としては、
これに限定されないが、ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ
（Ｐ５配列）及びＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（Ｐ７配列）が挙
げられる。
標的核酸
標的核酸としては、任意の目的の核酸を挙げることができる。標的核酸としては、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、モルフォリノ核酸、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオ
ース核酸、核酸の混合サンプル、倍数性ＤＮＡ（即ち、植物ＤＮＡ）、これらの混合物、
及びこれらのハイブリッドを挙げることができる。好ましい実施形態において、ゲノムＤ
ＮＡ又はその増幅コピーを、標的核酸として用いる。別の好ましい実施形態において、ｃ
ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は葉緑体ＤＮＡを用いる。いくつかの実施形態におい
て、標的核酸は、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一の細胞由来、又は単一の細胞の画分由
来である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一の細胞小器官由来である。例
示的な単一の細胞小器官としては、これに限定されないが、単一の核、単一のミトコンド
リア、及び単一のリボソームが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルに由来する。いくつかの実施形態に
おいて、標的核酸は、架橋核酸である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、タン
パク質と架橋する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、架橋ＤＮＡである。いく
つかの実施形態において、標的核酸は、ヒストンに保護されたＤＮＡである。いくつかの
実施形態において、ヒストンは、標的核酸から除去される。いくつかの実施形態において
、標的核酸は、ヌクレオソーム由来である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、
核タンパク質が除去されたヌクレオソーム由来である。
標的核酸は、任意のヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態におい
て、標的核酸は、ホモポリマー配列を含む。標的核酸はまた、繰り返し配列を含むことが
できる。繰り返し配列は、例えば、２ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド
、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００
ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、又は
それ以上を含めた任意の種々の長さとすることができる。繰り返し配列は、連続又は非連
続して、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、
２０回、又はそれ以上を含めた、任意の種々の回数の繰り返しとすることができる。
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、単一の標的核酸を使用することができる。
他の実施形態は、複数の標的核酸を使用することができる。そのような実施形態において
、複数の標的核酸としては、複数の同じ標的核酸、いくつかの標的核酸は同じである複数
の異なる標的核酸、又は全ての標的核酸が異なる複数の標的核酸を挙げることができる。
複数の標的核酸を使用する実施形態は、例えば、１つ又はそれ以上のチャンバー又はアレ
イ表面で試薬が標的核酸に同時に送られるように、多重型式で行うことができる。いくつ
かの実施形態において、複数の標的核酸としては、実質的に全ての特定の生命体のゲノム
を挙げることができる。複数の標的核酸としては、例えば、ゲノムの少なくとも約１％、
５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％，又は９９％
を含めた、特定の生命体のゲノムの少なくとも一部を挙げることができる。特定の実施形
態において、当該一部は、ゲノムの最大で約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９５％，又は９９％である上限を有することができる。
標的核酸は、あらゆる供給源から得ることができる。例えば、標的核酸は、単一の生命
体から得られる核酸分子、又は１つ又はそれ以上の生命体を含む自然源から得られる核酸
分子群から調製してもよい。核酸分子の供給源としては、これに限定されないが、細胞小
器官、細胞、組織、臓器、又は生命体が挙げられる。標的核酸分子の供給源として用いら
れてもよい細胞は、原核細胞（バクテリア細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、サルモネア（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クラミジア
（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐ
ｏｎｅｍａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇ
ｅｎｅｒａ）；クレン古細菌門（ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）、ナノ古細菌門（ｎａｎ
ｏａｒｃｈａｅｏｔａ）、又はユリ古細菌門（ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔｉａ）等の古細
菌細胞；又は真菌（例えば、酵母）、植物、原生動物や他の寄生生物、及び動物（昆虫（
例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、線形動物（例えば、線
虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、及び哺乳動物（例えば、ラット
、マウス、サル、非ヒト霊長類、及びヒト）を含む）等の真核細胞であってもよい。標的
核酸及び鋳型核酸は、当該技術分野でよく知られている種々の方法を用いて、目的とする
特定の配列を濃縮することができる。そのような方法の例は、その全体が参照により本明
細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１０８８６４号において提供されている。いく
つかの実施形態において、核酸は、鋳型ライブラリーの調製方法の間に、さらに濃縮させ
てもよい。例えば、核酸は、トランスポソームの挿入前、トランスポソームの挿入後、及
び／又は核酸の増幅後に、特定の配列について濃縮させてもよい。
また、いくつかの実施形態において、標的核酸及び／又は鋳型核酸は、高度に精製する
ことができ、例えば、核酸は、本明細書で提供する方法で用いる前に、混入物を少なくと
も約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％
含まないものとすることができる。いくつかの実施形態において、当該技術分野で知られ
ている標的核酸の質及びサイズを維持する方法を用いることは有益であり、例えば、標的
ＤＮＡの単離及び／又は直接転位を、アガロースプラグを用いて行ってもよい。転位はま
た、細胞群、ライセート、及び未精製ＤＮＡを用いて、細胞で直接行うことができる。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、生体サンプル又は患者サンプルから得ても
よい。本明細書で用いる場合、用語「生体サンプル」又は「患者サンプル」は、組織及び
体液等のサンプルを含む。「体液」としては、これに限定されないが、血液、血清、血漿
、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙液、乳管液（ｌａｃｔａｌ ｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ）、リ
ンパ液、喀痰、尿、羊水、及び精液が挙げられる。サンプルは、「無細胞」である体液を
含んでいてもよい。「無細胞体液」は、約１％（質量／質量）未満の全細胞物質を含む。
血漿又は血清は、無細胞体液の例である。サンプルは、天然又は合成由来（即ち、無細胞
となるように調製された細胞サンプル）の標本を含んでいてもよい。
上記に開示した方法のいくつかの実施形態において、標的核酸は、標的核酸をトランス
ポソームに曝す前に、（例えば、超音波処理、制限消化、他の機械的手段により）フラグ
メント化することができる。
本明細書で用いる場合、用語「血漿」は、血液で見られる無細胞液体を指す。「血漿」
は、当技術分野で知られている方法（例えば、遠心分離及びろ過等）により、血液から全
細胞物質を除去することにより、血液から得てもよい。
特段の定めがない限り、用語「ａ」又は「ａｎ」は、本明細書全体を通じて、「１つ又
はそれ以上」を意味する。
用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」、「等（ｓｕｃ
ｈ ａｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含めて（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、又は
それらの変形が本明細書で用いられる場合、これらの用語は、限定の用語であるとは見な
されないものであり、「これに限定されるものではないが」又は「限定されずに」を意味
すると解釈されるものである。
以下の実施例は、説明のための実施例を提供するものであり、決して本明細書で提供す
る発明を制限するものではない。
実施例１ ビーズベースタグメント化工程からのＤＮＡクラスターの収量
図３のビーズベースタグメント化工程からのＤＮＡクラスターの収量を評価し、図４の
表に示した。本実施例において、５０ｎｇ、２５０ｎｇ、１０００ｎｇのヒトＮＡ１２８
７８ ＤＮＡを、同じバッチのタグメント化ビーズ（２．８μｍビーズ）を用いてタグメ
ント化した。第２の５０ｎｇ分量のＮＡ１２８７８ ＤＮＡを、第２のバッチのタグメン
ト化ビーズ（完全リピート：２．８μｍビーズ）を用いてタグメント化した。ビーズ結合
タグメント化ＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅し、精製した。一定分量（５．４μＬ）の各精
製ＰＣＲ産物（未定量）を２７０倍希釈し、約５０ｐＭのストックサンプル溶液を作製し
た。各サンプルに対し、５０ｐＭストック溶液を１５ｐＭ、１９ｐＭ、２１ｐＭ、及び２
４ｐＭに希釈した。希釈したサンプルを、クラスター生成及びシークエンシングのために
フローセルにロードした。データによれば、同じ希釈液（～５０ｐＭ）から始めて、クラ
スター数は、同じセットのビーズを用いた３つの異なるインプットレベル（即ち、５０ｎ
ｇ、２５０ｎｇ、１０００ｎｇ）に対して、１００～１１４％の間であることが分かる。
５０ｎｇ完全リピートでのクラスター数（異なるバッチのビーズを用いた）は、８１％で
あった。異なる希釈液（１５ｐＭ、１９ｐＭ、２１ｐＭ、及び２４ｐＭ）は、約１０％以
内の同数のクラスターを産生する。データによれば、ビーズが収量を大きく制御し、収量
は、異なるＤＮＡインプット及び異なるリピートで再現性があることが分かる。
実施例２ ビーズベースタグメント化工程の再現性
図３のビーズベースタグメント化工程の再現性を図５に示す。本実施例において、「同
じ」トランスポソーム密度で作製した６種類の異なるインデックス付きビーズ（インデッ
クス１～６；２．８μｍビーズ）調製物を、５０ｎｇ及び５００ｎｇのインプットＮＡ１
２８７８ ＤＮＡを用いたタグメント化ＤＮＡの調製に用いた。タグメント化ＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅し、精製した。２つのＨｉＳｅｑレーン用に、１２種類の精製ＰＣＲ産物をプー
ルして、６種類ずつの２つの混合物（プール１及びプール２）にした。各プールは、１レ
ーン当たり３～５０ｎｇ及び３～５００ｎｇのサンプルを含む。データ表５００は、各イ
ンデックス付きサンプルの挿入サイズ中央値及び挿入サイズ平均値を示す。
実施例３ プール１の挿入サイズ及びプール２の挿入サイズ
図５のインデックス付きサンプルのプール１の挿入サイズ及びプール２の挿入サイズを
、それぞれ図６Ａ（プロット６００）及び図６Ｂ（プロット６５０）に示す。データはま
た、挿入サイズが、６種類の異なるインデックス付きビーズ調製物の間で均一であること
を示す。ビーズベースタグメント化は、挿入サイズ及びＤＮＡ収量を制御するメカニズム
をもたらす。
実施例４ リードの合計数の再現性
図５に記載の実験に関して、リードの合計数及びアラインされたリードの割合の再現性
を図７（棒グラフ７００）に示す。両方のインプット（５０ｎｇ及び５００ｎｇ）で、リ
ードの合計数は、同じインデックス付きビーズ調製物に対して同様である。６種類のイン
デックス付きビーズ調製物のうちの４種類（インデックス１、２、３、及び６）で、極め
て近い収量を示し、インデックス付きビーズ調製物４及び５では、インデックス配列によ
るものである可能性がある、幾分のばらつきが見られた。
１つの応用において、ビーズベースタグメント化工程は、タグメント化ステップを含む
エクソーム濃縮アッセイ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）急
速捕捉濃縮プロトコルに用いてもよい。現在のエクソーム濃縮アッセイ（即ち、Ｉｌｌｕ
ｍｉｎａ社のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）急速捕捉濃縮プロトコル）では、溶液ベースの
タグメント化（Ｎｅｘｔｅｒａ）をゲノムＤＮＡのフラグメント化に用いる。その後、遺
伝子特異的プライマーを用いて、目的とする特異的遺伝子フラグメントをプルダウンする
。２回の濃縮サイクルを行った後、プルダウンしたフラグメントをＰＣＲ及びシークエン
シングにより濃縮する。
エクソーム濃縮アッセイにおけるビーズベースタグメント化工程の使用を評価するため
、ヒトＮＡ１２８７８ ＤＮＡを、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２０
０ｎｇ、及び５００ｎｇのインプットＤＮＡを用いてタグメント化した。コントロールラ
イブラリー（ＮＡ００５３６）を、標準プロトコルに従って、５０ｎｇのインプットＤＮ
Ａから調製した。各ＤＮＡインプットは、異なるインデックス（固有識別子）を有した。
標準方法に合わせるため、且つ、十分な量のフラグメントがプルダウン用に存在すること
を確実にするために、濃縮ポリメラーゼマスターミックス（ＥＰＭ：ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）を用いた１０サイクルのＰＣＲを行った。
増幅プロトコルは、７２℃で３分、９８℃で３０秒、続いて９８℃で１０秒を１０サイク
ル、６５℃で３０秒、及び７２℃で１分とした。その後、サンプルを１０℃で保持した。
次に、サンプルを、エクソーム濃縮プルダウン工程及びシークエンシングを通じて処理し
た。
実施例５ エクソーム濃縮アッセイにおけるコントロールライブラリー及びビーズベース
タグメント化ライブラリーの挿入サイズ
図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃは、それぞれ、エクソーム濃縮アッセイにおける、コントロー
ルライブラリーでの挿入サイズのプロット８００、ビーズベースタグメント化ライブラリ
ーでの挿入サイズのプロット８２０、及びサマリーデータ表８４０を示す。データによれ
ば、ビーズベースタグメント化ライブラリーは、コントロールライブラリーに比べて、広
い挿入サイズ分布を有するが、挿入サイズは、サンプルのＤＮＡインプットに関係なく極
めて近いことが分かる。
実施例６ リード配列の質
図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、それぞれ、図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃのエクソーム濃縮アッ
セイにおける、フィルターを通過した複製物（ｄｕｐｓ ＰＦ：ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ
ｐａｓｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒｓ）の割合の棒グラフ９００、ＰＣＴ ｓｅｌｅｃｔｅｄ
ｂａｓｅｓの棒グラフ９２０、及びＰＣＴ ｕｓａｂｌｅ ｂａｓｅｓ ｏｎ ｔａｒ
ｇｅｔの棒グラフ９４０を示す。図９Ａを参照すると、ｄｕｐｓ ＰＦの割合（％）は、
いくつのリードがフローセルの他の部分で複製されているかを示す尺度である。この数値
は、全てのクラスターが結果に対して有益なデータをもたらすことを確実にするためには
、理想的には、（ここで示すように）低くなるものである。
図９Ｂは、ＰＣＴ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂａｓｅｓを示し、濃縮工程の間に濃縮されて
いたはずの目的の部位に又はその近くに配列するリードの割合の尺度である。理想的には
、この数値は、濃縮工程の成功を反映して１に近くなるものである。また、この数値は、
濃縮されるべきではないリードが工程を終えていないことを示す。
図９Ｃは、ＰＣＴ ｕｓａｂｌｅ ｂａｓｅｓ ｏｎ ｔａｒｇｅｔを示し、濃縮され
た領域内で目的とする特定の塩基上に実際に配列しているリードの割合の尺度である。理
想的には、全ての濃縮リードが濃縮されたリード内の目的とする塩基上に配列するもので
あるが、タグメント化のランダム性及び様々な挿入長さのために、目的とする領域上で配
列し終えていないリードが濃縮される可能性がある。
２つの技術を使用して挿入サイズ分布を最適化してもよい。一例を挙げれば、ＳＰＲＩ
クリーンアップを用いて小さ過ぎる又は大き過ぎるフラグメントを除去してもよい。ＳＰ
ＲＩクリーンアップは、サイズ及び所望の沈澱又は非沈澱ＤＮＡの保持（即ち、第１ステ
ップは、所望のサイズよりも大きいＤＮＡのみを沈澱させ、可溶な小さいフラグメントを
保持する）に基づいた選択的ＤＮＡ沈澱により、所望のサイズよりも大きい又は小さいフ
ラグメントを除去する工程である。その後、小さいフラグメントをさらに沈澱させ、この
時、望まない極めて小さいフラグメント（まだ溶液中にある）を除去し、沈澱したＤＮＡ
を保持し、洗浄した後、再可溶化して所望のサイズ範囲のＤＮＡを得る。別の例を挙げれ
ば、ビーズ表面上の活性化トランスポソームのスペーシングを用いて、挿入サイズ分布を
制御してもよい。例えば、ビーズ表面上のギャップを不活性トランスポソーム（例えば、
不活性トランスポゾンを有するトランスポソーム）で充填してもよい。
ビーズベースのタグメント化工程の連続性を評価した。表３は、インデックスを共有す
る１０００ｂｐウィンドウ内で０回、１回、２回、又は３回のリードが起きた回数を示す
。ビーズを９種類の異なるインデックス付きトランスポソームで生成し、少量のヒトＤＮ
Ａのタグメント化に用いた。リードを生成させ、アラインし、同じインデックスを共有す
る１０００ｂｐ又は１０Ｋｂウィンドウ内のリードの数について分析した。インデックス
を共有する小さいウィンドウ内のリードの中には、偶然生成するものがあってもよく、こ
れが何回起こる可能性があるかという予測を、表３及び表４の「ランダム」列に示す。「
ビーズ」列の数は、インデックスを共有する１０００ｂｐ（表３）又は１０Ｋｐ（表４）
ウィンドウの実際の数を示す。表３及び表４に示すように、同じインデックスが１０００
ｂｐ又は１０Ｋｐウィンドウ内で見つかった実際の回数は、ランダムケースでの予測より
も顕著に多い。「０」枠は、特定の１０００ｂｐウィンドウがそれにマッピングするイン
デックスリードを有さない全ての回数を示す。数値は、極少量のヒトゲノムのみがシーク
エンシングされ、大半のウィンドウがそれらにアラインされるリードを有さないため、こ
こでは最も大きい。「１」は、ただ１つのリードが１０００ｂｐ（又は１０Ｋｐ）ウィン
ドウにマップする回数であり、「２」は、１０００ｂｐ（又は１０Ｋｐ）ウィンドウ内で
２つのリードがインデックスを共有する回数である、等である。このデータは、１４００
超のケースにおいて、同じピースのＤＮＡ（１０Ｋｐ超）が、約１５０００回のタグメン
ト化事象の中で、同じビーズにより、少なくとも２回から５回までタグメント化されてい
ることを示唆している。フラグメントは、インデックスを共有しているため、それらが偶
然にそこに存在する可能性は低く、同じビーズに由来している。
表４は、インデックスを共有する１０Ｋｐウィンドウ内のリード数（５個まで）を示す
。
実施例７ ＣＰＴ－ＤＮＡからの遊離トランスポソームの分離
転位の後、ＣＰＴ－ＤＮＡ及び遊離トランスポソームを含む反応混合物を、Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ－４００及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００サイズ排除クロマトグラフィ
ーを用いたカラムクロマトグラフィーにかけた。図２２に示す。ＣＰＴ－ＤＮＡは、ＮＣ
Ｐ ＤＮＡと表示する。
実施例８ ビーズ上の捕捉プローブ密度の最適化
捕捉プローブＡ７及びＢ７の密度を、１μｍビーズ上で最適化し、結果を図２５に示し
た。レーン１（Ａ７）及びレーン３（Ｂ７）は、高いプローブ密度を有し、レーン２（Ａ
７）及びレーン４（Ｂ７）は、１ｕｍビーズ当たり推定１０，０００～１００，０００の
プローブ密度を有した。標的分子に対する捕捉プローブのライゲーション産物を、アガロ
ースゲルで評価した。ビーズ当たり約１０，０００～１００，０００のプローブ密度は、
より高いプローブ密度よりも良好なライゲーション効率を有した。
実施例９ 分子内ハイブリダイゼーションによるビーズ上でのＣＰＴ－ＤＮＡのインデッ
クス付きシークエンシングライブラリーの調製の実現性試験
トランスポソームを、ビーズ上のＡ７及びＢ７捕捉配列に相補的なＡ７’及びＢ７’捕
捉配列を有するトランスポゾンと機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼとを混合することに
より、調製した。高分子量ゲノムＤＮＡをトランスポソームと混合し、ＣＰＴ－ＤＮＡを
生成する。それとは別に、ビーズを、固定化オリゴヌクレオチド：Ｐ５－Ａ７、Ｐ７－Ｂ
７、又はＰ５－Ａ７＋Ｐ７－Ｂ７で調製する。ここで、Ｐ５及びＰ７は、プライマー結合
配列であり、Ａ７及びＢ７は、それぞれＡ７’及びＢ７’配列に相補的な捕捉配列である
。Ｐ５－Ａ７単独、Ｐ７－Ｂ７単独、Ｐ５－Ａ７＋Ｐ７－Ｂ７、又はＰ５－Ａ７ビーズ及
びＰ７－Ｂ７ビーズの混合物を含むビーズを、ＣＰＴ－ＤＮＡで処理し、反応混合物にリ
ガーゼを添加して、固定化オリゴの転位ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの効率を
決定した。結果を図２６に示す。シークエンシングライブラリーは、アガロースゲル上で
高分子量バンドにより示されるように、Ｐ５－Ａ７及びＰ７－Ｂ７がともに１つのビーズ
上に固定化されている場合（レーン４）のみで作製される。結果は、高効率の分子内ハイ
ブリダイゼーションを示し、また、分子内ハイブリダイゼーションによるビーズ上でのＣ
ＰＴ－ＤＮＡのインデックス付きシークエンシングライブラリーの調製の実現性を証明し
た。
実施例１０ クローンインデックス化の実現性試験
いくつかのトランスポソームセットを調製した。１つのセットにおいて、機能亢進性Ｔ
ｎ５トランスポザーゼを、５’ビオチンを有するトランスポゾン配列Ｔｎｐ１と混合し、
トランスポソーム１を調製する。別のセットにおいて、５’ビオチンを有する固有インデ
ックス２を有するＴｎｐ２で、トランスポソーム２を調製する。別のセットにおいて、ト
ランスポソーム３の調製のため、機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼを、５’ビオチンを
有するトランスポゾン配列Ｔｎｐ３と混合する。別のセットにおいて、固有インデックス
４及び５’ビオチンを有するＴｎｐ４でトランスポソーム４を調製する。トランスポソー
ム１及び２、並びにトランスポソーム３及び４を、それぞれ別々にストレプトアビジンビ
ーズと混合し、ビーズセット１及びビーズセット２を生成する。次に、２つのセットのビ
ーズを混合し、ゲノムＤＮＡ及びタグメント化バッファーとともにインキュベートして、
ゲノムＤＮＡのタグメント化を促進する。この後、タグメント化配列のＰＣＲ増幅を行う
。増幅したＤＮＡをシークエンシングし、インデックス配列の挿入を分析する。タグメン
ト化がビーズに限定される場合、大多数のフラグメントは、Ｔｎｐ１／Ｔｎｐ２及びＴｎ
ｐ３／Ｔｎｐ４インデックスでコードされることになる。分子内ハイブリダイゼーション
がある場合には、フラグメントは、Ｔｎｐ１／Ｔｎｐ４、Ｔｎｐ２／Ｔｎｐ３、Ｔｎｐ１
／Ｔｎｐ３、及びＴｎｐ２／Ｔｎｐ４インデックスでコードされることになる。５サイク
ル及び１０サイクルのＰＣＲ後のシークエンシング結果を図２７に示した。コントロール
は、混合され、ビーズ上に固定化された、４種類全てのトランスポゾンを有する。結果は
、大多数の配列がＴｎｐ１／Ｔｎｐ２又はＴｎｐ３／Ｔｎｐ４インデックスを有すること
を示し、クローンインデックス化が実現可能であることを示している。コントロールは、
インデックスを区別しないことを示す。
実施例１１ 単一反応におけるインデックス付きクローンビーズ転位
９６種類のインデックス付きトランスポソームビーズを調製する。個々のインデックス
付きトランスポソームは、５’末端のＴｎ５モザイク末端配列（ＭＥ）及びインデックス
配列を有するオリゴヌクレオチドを含むトランスポゾンを混合して、調製した。個々のイ
ンデックス付きトランスポソームを、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用によりビー
ズ上に固定化した。ビーズ上のトランスポソームを洗浄し、ビーズ上の９６種類全ての個
々にインデックス化されたトランスポソームをプールした。ＭＥ配列に相補的でインデッ
クス配列を有するオリゴヌクレオチドを、固定化オリゴヌクレオチドにアニールし、固有
のインデックスを有するトランスポゾンを作製した。９６種類のクローンインデックス付
きトランスポソームビーズセットを混ぜ合わせ、高分子量（ＨＭＷ：ｈｉｇｈ ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）ゲノムＤＮＡとともに、Ｎｅｘｔｅｒａタグメント化バッフ
ァーの存在下、単一のチューブでインキュベートした。
ビーズを洗浄し、反応混合物を０．１％ＳＤＳで処理することにより、トランスポザー
ゼを除去する。タグメント化ＤＮＡをインデックス付きプライマーで増幅し、ＰＥ Ｈｉ
Ｓｅｑフローセルｖ２で、ＴｒｕｅＳｅｑ ｖ３クラスターキットを用いてシークエンシ
ングし、シークエンシングデータを分析する。
リードのクラスター、すなわち島を観察する。各配列に対するリード間の最近隣距離の
プロットは、主要なピーク、１つはクラスター内からのもの（近位）ともう１つはクラス
ター間からのもの（遠位）、を基本的に示す。方法及び結果の模式図を、図３０及び３１
に示す。島のサイズは、約３～１０ｋｂの範囲である。カバーされた塩基の割合は、約５
％～１０％である。ゲノムＤＮＡの挿入サイズは、約２００～３００塩基である。
実施例１２ ビーズ上のトランスポソームに対するライブラリーサイズ
初めに、ＭＥ’配列を有する第１のオリゴヌクレオチド、ＭＥ－バーコード－Ｐ５／Ｐ
７配列を有する第２のオリゴヌクレオチド、及びＴｎ５トランスポザーゼを混合すること
により、トランスポソームを溶液中にアセンブルした。第１のセットにおいて、ＭＥ’配
列を有する第１のオリゴヌクレオチドを、３’末端でビオチン化する。第２のケースにお
いて、ＭＥ－バーコード－Ｐ５／Ｐ７配列を有するオリゴヌクレオチドを、５’末端でビ
オチン化する。種々の濃度（１０ｎＭ、５０ｎＭ、及び２００ＮＭ）の得られた各トラン
スポソームセットに対し、ストレプトアビジンビーズを添加して、トランスポソームがス
トレプトアビジンビーズに固定化されるようにする。ビーズを洗浄し、ＨＭＷゲノムＤＮ
Ａを加え、タグメント化を行う。いくつかのケースでは、タグメント化ＤＮＡを０．１％
ＳＤＳで処理し、他のケースでは、タグメント化ＤＮＡを処理しない。タグメント化ＤＮ
Ａを５～８サイクルでＰＣＲ増幅し、シークエンシングする。模式図を図３２に示す。
図３３に示すように、ＳＤＳ処理により増幅効率及びシークエンシングの質が改善され
る。３’ビオチンを有するオリゴヌクレオチドは、トランスポソームに対してより良いラ
イブラリーサイズを有する。
図３４は、挿入サイズに対するトランスポソーム表面密度の影響を示す。５’ビオチン
を有するトランスポソームは、より小さいサイズのライブラリー及びより多くの自己挿入
副産物を示す。
実施例１３ インプットＤＮＡの滴定
種々の量の標的ＨＭＷ ＤＮＡを、５０ｍＭのＴｎ５：トランスポゾン密度を有するク
ローンインデックス付きビーズに加え、３７℃で１５分間若しくは６０分間、又は室温で
６０分間インキュベートした。トランスポソームは、３’ビオチンを有するオリゴヌクレ
オチドを含んだ。タグメント化を行い、反応混合物を０．１％ＳＤＳで処理し、ＰＣＲ増
幅させた。増幅したＤＮＡをシークエンシングした。図３５は、サイズ分布に対するイン
プットＤＮＡの影響を示す。１０ｐｇのインプットＤＮＡによる反応は、最小シグナルを
示した。サイズ分布パターンは、２０ｐｇ、４０ｐｇ、及び２００ｐｇのＤＮＡインプッ
トで同様であった。
実施例１４ 溶液ベース及びビーズベースの方法を用いた島のサイズ及び分布
溶液ベース及びビーズベースの方法を用いて、島のサイズ及び分布を比較した。溶液ベ
ースアプローチにおいて、トランスポゾンにそれぞれ固有のインデックスを有する９６種
類のトランスポソームを、９６穴プレートにアセンブルする。ＨＭＷゲノムＤＮＡを添加
し、タグメント化反応を行う。反応生成物を０．１％ＳＤＳで処理し、ＰＣＲ増幅させる
。増幅したＤＮＡをシークエンシングした。
ビーズベースアプローチにおいて、トランスポゾンにそれぞれ固有インデックスを有す
る９６種類のトランスポソームを、９６穴プレートにアセンブルした。オリゴヌクレオチ
ドは、３’末端ビオチンを含んだ。ストレプトアビジンビーズを９６穴プレートの各々に
添加し、トランスポソームがストレプトアビジンビーズに固定化されるようにインキュベ
ートする。ビーズをそれぞれ洗浄してプールし、ＨＭＷゲノムＤＮＡを添加し、タグメン
ト化反応を単一反応容器（ワンポット）内で行う。反応生成物を０．１％ＳＤＳで処理し
、ＰＣＲ増幅させる。増幅産物をシークエンシングした。
ネガティブコントロールでは、最初に、それぞれ固有のインデックスを有する９６種類
全てのトランスポゾン配列を混合する。オリゴヌクレオチドは、３’末端ビオチンを含ん
だ。トランスポソームを個々の混合インデックス付きトランスポゾンから調製する。スト
レプトアビジンビーズを混合物に添加する。ＨＭＷゲノムＤＮＡを添加し、タグメント化
反応を行う。反応生成物を０．１％ＳＤＳで処理し、ＰＣＲ増幅させる。増幅産物をシー
クエンシングした。
島内リードの数を島のサイズに対してプロットする。図３６に示す結果は、島（近位リ
ード）が、溶液ベースの方法と同様に、ワンポットクローンインデックス付きビーズで観
られることを示している。インデックス付きトランスポゾンをトランスポソーム形成前に
混合した場合、島（近位リード）は観られなかった。トランスポソーム形成前にトランス
ポゾンを混合することにより、ビーズ当たり異なるインデックス／トランスポソームを有
する、即ちクローンではないビーズが得られる。
実施例１５ ＣＰＴ－ｓｅｑを用いた構造変異の分析
６０ｋｂヘテロ接合欠損の検出
シークエンシングデータをｆａｓｔｑファイルとして抽出し、分離（デマルチプレック
ス）工程を行って、各バーコードに対する個々のｆａｓｔｑファイルを生成する。ＣＰＴ
シークエンシングからのｆａｓｔｑファイルを、インデックスに従って分離し、重複を除
去した参照ゲノムにアラインする。スキャンウィンドウ内の任意のリードを示すインデッ
クスの数を記録する、５ｋｂ／１ｋｂウィンドウにより、染色体をスキャンする。統計的
には、ヘテロ接合欠損領域のため、隣接領域と比較して、半量のＤＮＡしかライブラリー
生成に利用できない。従って、インデックスの数も隣接領域の約半分となるべきである。
ＮＡ１２８７８ ｃｈｒ１の６０ｋｂヘテロ接合欠損を、９２１６個のインデックス付き
ＣＰＴシークエンシングデータから５ｋｂウィンドウにスキャンすることにより、図４７
Ａ及び４７Ｂに示す。
遺伝子融合の検出
ＣＰＴシークエンシングからのｆａｓｔｑファイルを、インデックスに従って分離し、
重複を除去した参照ゲノムにアラインする。染色体を２ｋｂウィンドウにスキャンする。
各２ｋｂウィンドウは、３６８６４ベクターであり、固有インデックスからのリードがこ
の２ｋｂウィンドウでいくつ見つかったかを各エレメントが記録する。ゲノムにわたり、
２ｋｂウィンドウペア（Ｘ、Ｙ）毎に、重み付けジャッカード（ｗｅｉｇｈｔｅｄ－Ｊａ
ｃｃａｒｄ）インデックスを計算する。このインデックスは、事実上、サンプルの（Ｘ、
Ｙ）間の距離を示す。これらのインデックスを、図４８に示すヒートマップとして表示す
る。各データポイントは、２ｋｂスキャンウィンドウのペアを表わし、左上の四角は、と
もに領域１からのＸ、Ｙであり、右下は、ともに領域２からのＸ、Ｙであり、右上は、領
域１から領域２にわたる領域からのＸ、Ｙである。遺伝子融合シグナルは、このケースで
は中央の横線として示される。
欠損の検出
ＣＰＴシークエンシングからのｆａｓｔｑファイルを、インデックスに従って分離し、
重複を除去した参照ゲノムにアラインする。染色体を１ｋｂウィンドウにスキャンする。
図４９は、遺伝子欠損の検出結果を示す。
実施例１６ フェージング及びメチル化検出
亜硫酸水素塩変換効率の最適化
ビーズ上のインデックス付き結合ＣＰＴ－ｓｅｑライブラリーに対して、ＭＥ（モザイ
クエレメント領域）及びｇＤＮＡ領域で、変換を評価した。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＭｅｔｈ
ｙｌＥｄｇｅ亜硫酸水素塩変換システムを最適化して、効率を改善した。
ＭＥ配列を分析して、亜硫酸水素塩変換処理の効率を決定した。図５０に示す。ビーズ
に付着したインデックス付き結合ライブラリーのうち、９５％が亜硫酸水素塩変換（ＢＳ
Ｃ）した。亜硫酸水素塩条件間で、同様のＰＣＲ収量が観察された。＞より厳しい亜硫酸
水素塩処理でも、ライブラリーを分解しないように思われた。図５１に示す。ビーズ上の
インデックス付き結合ライブラリーの約９５％でＢＳＣが観察された。ＢＳＣを改良（Ｃ
＞Ｕ）するために研究した変数は、温度及びＮａＯＨ濃度（変性）であった。６０℃及び
１ＭのＮａＯＨ、又は℃及び０．３ＭのＮａＯＨで良い結果となった。
ビーズライブラリーでのＢＳＣ変換ＣＰＴ－ｓｅｑのシークエンシング後、期待したシ
ークエンシングリード構造が観察された。塩基の割合（％）の計測値を、ＩＶＣプロット
とともに図５２に示す。
図５３は、亜硫酸水素塩変換後のＰＣＲの後の、インデックス付き結合ライブラリーの
アガロースゲル電気泳動の画像を示す。２００～５００ｂｐの期待したサイズ範囲のライ
ブラリーが観察された。ＤＮＡ無しでの反応では、インデックス付き結合ライブラリーを
産生しない。
実施例１７ 標的フェージング
全ゲノムインデックス付き結合ＣＰＴ－ｓｅｑライブラリーを濃縮した。図５４は、サ
イズ選択をしない濃縮前の全ゲノムインデックス付き結合ＣＰＴ－ｓｅｑライブラリーの
バイオアナライザートレースを示す。図５５は、濃縮後のライブラリーのアガロースゲル
分析を示す。
ＨＬＡ領域に対する濃縮統計を以下に示す。
図５６は、染色体のＨＬＡ領域に対して標的化ハプロタイピングを適用した結果を示す
。全ゲノムインデックス付き結合リードライブラリーの濃縮の図解を左に示す。小さいバ
ーは、各々インデックス付き短ライブラリーを示す。インデックス付きライブラリーのク
ラスターは、単一ビーズ上で同じインデックスでクローンインデックス付けされた領域で
ある「島」であり、従って、ゲノムスケール上でリードの近位性（「島」性）を示す。標
的領域におけるライブラリーの濃縮（国際公開第２０１２／１０８８６４号「核酸の選択
的濃縮（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｓ）」を参照）を右に示す。リードは、ＨＬＡ領域で濃縮される。さらに、リードがイン
デックスで選別され、ゲノムにアラインされる場合、リードは、インデックス付き結合リ
ードから連続性情報が維持されていることを示す「島」構造を再び示す。
実施例１８ インデックス交換
トランスポソーム複合体のモザイク末端（ＭＥ）の交換を評価するため、異なるインデ
ックスを有するビーズを調製した。混合後、ライブラリーをシークエンシングし、各ライ
ブラリーのインデックスをレポートすることにより、インデックス交換を決定した。「交
換（ｓｗａｐｐｅｄ）」の割合（％）を、（Ｄ４＋Ｄ５＋Ｅ３＋Ｅ５＋ｆ４）／（全９６
種の合計）で計算した。図６５に示す。
実施例１９ トランスポソーム複合体をストレプトアビジンビーズにより密集させること
によるライブラリー挿入サイズの縮小
ストレプトアビジン磁性ビーズを、１倍、６倍、及び１２倍濃度のＴｓＴｎ５トランス
ポソーム複合体とともにロードした。各ビーズタイプに対して、Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑプ
ロトコルを実施した。分析のため、最終ＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙ
ｚｅｒ上にロードした。図に示す。Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑライブラリーフラグメントは、
比較的小さく、ビーズ上にＴｓＴｎ５を多くロードするほど多く産生した。
実施例２０ 亜硫酸水素塩変換中のＤＮＡライブラリーのフラグメント化
亜硫酸水素塩変換後、ＤＮＡは損傷を受け、結果としてＰＣＲ増幅に必要な共通配列（
ＣＳ２）が減少する。ＤＮＡフラグメントＣＰＴＳｅｑ及びＥｐｉ－ＣＰＴＳｅｑ（Ｍｅ
－ＣＰＴＳｅｑ）ライブラリーを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで分析した。亜硫酸水素塩変
換中のＤＮＡ損傷により、Ｅｐｉ－ＣＰＴＳｅｑライブラリーは、図７０に示すように、
ＣＰＴＳｅｑライブラリーと比較して、５倍低い収量であり、小さいライブラリーサイズ
分布を有する。
実施例２１ ＴｄＴ媒介ｓｓＤＮＡライゲーション反応
ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ライゲーションによるＤＮＡ末端修復の
実現性を試験した。簡単には、５ｐｍｏｌのｓｓＤＮＡ鋳型を，ＴｄＴ（１０／５０Ｕ）
、アテニュエーター／アダプター二本鎖（０／１５／２５ｐｍｏｌ）、及びＤＮＡリガー
ゼ（０／１０Ｕ）とともに、３７℃で１５分間インキュベートした。伸長／ライゲーショ
ンのＤＮＡ産物を、ＴＢＥ－Ｕｒｅａゲルで分析し、結果を図７１に示した。全ての反応
成分を添加した結果、アダプター分子のほぼ完全なライゲーションが行われた（レーン５
～８）。
ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ライゲーションによるＤＮＡ末端修復の
実現性を、亜硫酸水素ナトリウム変換ビーズ結合ライブラリーに対して試験した。図７２
に示す。簡単には、ＤＮＡをビーズ上でタグメント化し（最初の２レーン）、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社のＭｅｔｈｙｌＥｄｇｅ亜硫酸水素塩変換キットで処理し（レーン３及び４）、Ｄ
ＮＡ救出プロトコルを行った（レーン５及び６）。救出反応後のＤＮＡライブラリーの収
量及びサイズは、明らかに増加している。また、挿入トランスポゾン（ＳＩ）の存在量も
増加しており、アダプター分子の効率的なライゲーションを示している。
メチル－ＣＰＴＳｅｑアッセイの結果を図７３に示す。

Claims (20)

  1. （ａ）それぞれその上に複数のトランスポソーム複合体を固定化している複数の固体支持体を提供するステップであって、前記トランスポソーム複合体の各々は２つ以上のトランスポソームの単量体単位を含み、前記トランスポソームの単量体単位が互いに結合してトランスポソーム複合体を形成しており、前記トランスポソームの各単量体単位が、ポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記ポリヌクレオチドは、
    （ｉ）トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
    （ｉｉ）第１のバーコード配列を含む第１のアダプターと
    を含む、ステップと、
    （ｂ）二本鎖の標的核酸を、前記二本鎖の標的核酸が前記トランスポソーム複合体により二本鎖の標的核酸フラグメントにフラグメント化され、前記ポリヌクレオチドの前記トランスポゾン末端配列が前記二本鎖の標的核酸フラグメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に転移される条件下で、前記複数の固体支持体に適用し、それにより、少なくとも１つの鎖が前記第１のバーコード配列で５’タグ化されている二本鎖の標的核酸フラグメントの固定化ライブラリーを作製するステップと、
    を含む、タグ化核酸フラグメントの固定化ライブラリーを調製する方法。
  2. （ａ）それぞれその上に複数のトランスポソーム複合体を固定化している複数の固体支持体を提供するステップであって、前記トランスポソーム複合体の各々は２つ以上のトランスポソームの単量体単位を含み、前記トランスポソームの単量体単位が互いに結合してトランスポソーム複合体を形成しており、前記トランスポソームの各単量体単位が、ポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記ポリヌクレオチドは、
    （ｉ）トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
    （ｉｉ）第１のバーコード配列を含む第１のアダプターと
    を含む、ステップと、
    （ｂ）二本鎖の標的核酸を、前記標的核酸の連続性を維持しながら、前記二本鎖の標的核酸が前記トランスポソーム複合体により二本鎖の標的核酸フラグメントにフラグメント化され、前記ポリヌクレオチドの前記トランスポゾン末端配列が前記二本鎖の標的核酸フラグメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に転移される条件下で、前記複数の固体支持体に適用し、それにより、少なくとも１つの鎖が前記第１のバーコード配列で５’タグ化されている二本鎖の標的核酸フラグメントの固定化ライブラリーを作製するステップであり、ある固体支持体上の前記第１のバーコード配列は同じ核酸配列を含み、前記複数の固体支持体中のある固体支持体からの第１のバーコードの核酸配列は、前記複数の固体支持体中の他の固体支持体からの第１のバーコードの核酸配列とは異なる、ステップと、
    （ｃ）前記標的核酸のフラグメントの配列及び関連した前記第１のバーコード配列を決定するステップと、
    （ｄ）前記第１のバーコード配列を識別することにより、前記標的核酸の連続性情報を決定するステップと
    を含む、標的核酸配列の連続性情報を決定する方法。
  3. トランスポソーム単量体単位の前記トランスポザーゼが、同じ前記トランスポソーム複合体の別のトランスポソーム単量体単位の別のトランスポザーゼに結合している、請求項１又は２に記載の方法。
  4. トランスポソーム単量体単位の前記トランスポゾン末端配列が、同じ前記トランスポソーム複合体の別のトランスポソーム単量体単位の別のトランスポゾン末端配列に結合している、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記トランスポソーム複合体中の前記トランスポザーゼのサブユニットが、共有及び非共有結合により互いに結合している、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記トランスポソーム単量体単位の前記トランスポザーゼが、トランスポゾンが加わってトランスポソーム複合体が形成される前に互いに結合する、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 前記トランスポソーム単量体単位の前記トランスポザーゼが、トランスポソーム複合体の形成後に互いに結合する、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 前記第１のアダプターが、第１のプライマー結合配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 標的核酸配列の前記連続性情報が、ハプロタイプ情報を示す、請求項２に記載の方法。
  10. 標的核酸配列の前記連続性情報が、欠損、転位、染色体間遺伝子融合、重複、及びパラログからなる群から選択されるゲノム変異を示す、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記バーコードを含む標的核酸フラグメントが、前記標的核酸フラグメントの配列を決定する前に増幅される、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記標的核酸をトランスポソーム複合体と接触させる前に、前記標的核酸をプレフラグメント化するステップをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記標的核酸が単一の細胞から得られる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記標的核酸が単一の細胞小器官から得られる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記標的核酸がゲノムＤＮＡを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記標的核酸が他の核酸に架橋する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記標的核酸が無細胞腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記標的核酸がｃＤＮＡを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記固体支持体がビーズを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. （ａ）それぞれその上に複数のトランスポソーム複合体を固定化している複数の固体支持体であって、前記トランスポソーム複合体の各々は２つ以上のトランスポソームの単量体単位を含み、前記トランスポソームの単量体単位が互いに結合してトランスポソーム複合体を形成しており、前記トランスポソームの各単量体単位が、ポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、前記ポリヌクレオチドは、
    （ｉ）トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
    （ｉｉ）第１のバーコード配列を含む第１のアダプターと
    を含む、複数の固体支持体と、
    （ｂ）前記固体支持体に固定化された二本鎖の標的核酸であって、前記二本鎖の標的核酸は前記トランスポソーム複合体により二本鎖の標的核酸フラグメントにフラグメント化されており、前記ポリヌクレオチドの前記トランスポゾン末端配列が前記二本鎖の標的核酸フラグメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に転移され、少なくとも１つの鎖が前記第１のバーコード配列で５’タグ化されている、二本鎖の標的核酸と、
    を含む、標的核酸のバーコード化核酸フラグメントのライブラリーを調製するための組成物。
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