KR20110025993A - 단일-분자 전체 게놈 분석용 장치 및 방법 - Google Patents

단일-분자 전체 게놈 분석용 장치 및 방법 Download PDF

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밍 샤오
파릭쉬트 에이. 데쉬판데
한 차오
마이클 오스틴
칸다스와미 비자얀
알렉세이 와이. 샤로노브
마이클 보이스-자시노
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바이오나노매트릭스, 인크.
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Abstract

본원에는 단일 분자 게놈 분석용 장치 및 방법이 제공된다. 한 양태에서는, 이러한 방법으로, 이중 가닥 핵산을 프로세싱할 수 있고, 이러한 핵산을 명확히 규명하게 된다. 이들 방법은, 예를 들어 개체들 간의 구조적 변이 및 카피 수 변이를 결정하는 데에 유용하다.

Description

단일-분자 전체 게놈 분석용 장치 및 방법{Methods and devices for single-molecule whole genome analysis}
관련 출원
본 출원은 2008년 6월 30일자로 출원된 미국 특허원 제61/076,785호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 대한 우선권을 청구하고 있다.
<기술분야>
본 발명은 나노유체공학 분야 및 DNA 서열 분석 분야에 관한 것이다.
거대분자는 서로 결합된 많은 화학적 단위로 구성된 장쇄 중합체이다. 예를 들어, DNA 및 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 거대분자의 한 부류이다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 긴 서열로 구성된다.
뉴클레오티드의 서열은 유기체의 게놈 및 후-게놈 유전자 발현 정보와 직접적으로 관련이 있다. 서열 영역, 모티프, 및 기능성 단위, 예를 들어 오픈 리딩 프레임 (ORF), 비해독 영역 (UTR), 엑손, 인트론, 단백질 인자 결합 단위, 후생게놈 부위, 예를 들어 CpG 군집 (cluster), 마이크로RNA 부위, 소형 간섭 RNA (SiRNA) 부위, 대형 개재 비-암호화 RNA (lincRNA) 부위 및 기타 기능성 단위의 직접적인 서열 분석 및 지도화가 개체의 게놈 조성을 평가하는 데에 모두 중요하다.
많은 경우에 있어, 개체의 수명 동안 이들 뉴클레오티드 서열의 복합적인 재배열, 예를 들어 삽입, 결실, 역위 및 전위로 인해, 유전적 이상 또는 세포 악성 종양과 같은 질병 상태가 유발된다. 기타 경우에는, 개체들 간의 카피 수 변이 (CNV)에서와 같은 서열 차이는 해당 집단의 유전적 구성의 다양성, 및 환경적 자극 및 신호 (예: 약물 치료)에 대한 그들의 차별적 반응을 반영하고 있다. 기타 경우에, DNA 또는 DNA-단백질 상호 작용을 변형시키는 과정, 예를 들어 DNA 메틸화, 히스톤 변형, 염색질 폴딩 또는 기타 변화가 유전자 조절, 발현 및 궁극적인 세포성 기능에 영향을 미쳐 질병과 암을 발생시킨다.
게놈 구조적 변이 (SV)가 심지어 건강한 개체들 간에도, 기존에 생각된 것 보다 훨씬 더 확산되어 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 인간 건강 및 통상의 유전적 질병에 대한 구조적 변이 정보를 나타내는 게놈 서열을 이해하는 것이 중요하다는 사실이 점차적으로 명백해지고 있다.
기능성 단위 및 통상의 구조적 변이물은 수십개 염기 내지 메가 염기 이상을 포괄하는 것으로 여겨진다. 따라서, 대형 천연 게놈 분자를 따라 서브킬로 염기 내지 메가 염기의 해상도 규모 전반에 걸쳐 서열 정보 및 SV를 밝혀내는 직접적이고도 저렴하면서 유동적인 방법이, 기존에 명확히 규명하지 못했던 게놈 특징을 분류하기 위해 더 많은 개체의 서열을 분석하고 상세한 지도화 프로젝트를 수행하는 데에 있어서 고도로 바람직하다.
더우기, 특히 다배수체 유기체 (예: 인간)에게서 생물학적 시스템의 표현형별 다형증 또는 질병 상태는 모계 및 부계로부터 유전된 2개 반수체 게놈 간의 상호 작용에 따른 결과이다. 암은 특히, 종종 이배체 염색체 병변 중에서 이종 접합성의 상실에 따른 결과이다.
통상적인 세포유전적 방법, 예를 들어 핵형분석 (karyotyping), FISH (형광성 계내 혼성화)는 단일 세포 정도로 적은 수의 세포에서 게놈 조성에 관한 포괄적인 관점을 제공하였고, 이들 방법은 홀배수체 (aneuploidy)와 같은 게놈의 전반적인 변화, 수천 및 수백만 염기 쌍의 대형 단편의 증가, 손실 또는 재배열을 밝혀내는 데에 효과적이다. 그러나, 이들 방법은 중형 내지 소형 서열 모티프 또는 병변을 검출하는 데에 있어서 민감도와 해상도가 비교적 낮다. 이들 방법은 또한, 많은 노력을 요하기 때문에 속도가 제한되고 일치하지 않는 부분이 있다.
관심있는 서열 영역, 서열 모티프 및 SV를 검출하기 위한 보다 최근의 방법, 예를 들어 aCGH (어레이 비교 게놈 혼성화), fiberFISH 또는 대량 쌍-말단 서열 분석은 해상도와 처리능력 국면에서 개선되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 방법은 간접적이고, 많은 노력이 들며, 비용이 많이 들고, 기존의 참고 데이터베이스에 의존하고 있다. 추가로, 상기 방법은 제한된 고정 해상도를 나타낼 수 있고, 재어셈블리를 위해 참고 게놈을 다시 지도화하는 것에 의존하는 추론형 위치 정보, 또는 비교 세기 비 정보를 제공한다. 따라서, 이러한 방법은 균형을 맞춘 병변 현상, 예를 들어 역위 또는 전위를 밝혀낼 수 없다.
현재의 서열 분석 접근 방식은 이용 가능한 기술에 의해 제한되고, 대부분이 극히 제한된 반수체 정보를 지닌 평균 다배수체 게놈 물질로부터 유래된 샘플에 의거하고 있다. 이종 세포 집단으로부터 혼합된 이배체 게놈 물질을 추출하기 위해 현재 이용되고 있는 전방 말단 샘플 제조 방법은 상기 물질을 효과적으로 잘게 썰어 보다 작은 조각이 되도록 하여, 이배체 게놈의 천연상 결정적으로 중요한 구조적 정보을 파괴시킨다.
심지어 보다 최근에 개발된 차세대 방법도 처리 능력 면에서는 개선되긴 하였지만, 훨씬 더 짧은 서열 분석 판독물로부터의 보다 어려운 어셈블리 때문에, 복잡한 게놈 정보를 상세히 설명하는 것을 추가로 복잡하게 만든다.
일반적으로, 짧은 판독물은 복잡한 게놈 내에서 독특하게 정렬시키는 것이 보다 곤란하고, 짧은 표적 영역의 선형 순서를 판독하기 위해서는 부가의 서열 정보가 필요하다.
통상적인 BAC 및 소위 숏 건 생어 (shot gun Sanger) 서열 분석에서 필요한 8 내지 10배 적용 범위 대신 유사한 어셈블리 신뢰를 달성하기 위해서는 서열 분석 적용 범위에 있어서 대략 25배 개선이 필요하다 [참고: Wendl MC, Wilson RK Aspects of coverage in medical DNA sequencing, BMC Bioinformatics, 16 May 2008; 9:239]. 이러한 다수 배 서열 분석 적용 범위는 비용이 많이 들므로, $1,000 마르크 아래로 서열 분석 비용을 절감시키는 분야에서 대단히 중요한 목표를 효과적으로 좌절시켜 준다.
따라서, 본래의 대형 게놈 분자를 단일 분자 수준으로 분석하는 것은 클로닝 공정이나 증폭 없이도 서열 모티프를 계내에서 상세히 지도화함으로써 정확한 천연 게놈 구조를 보존할 수 있는 가능성을 제공한다. 게놈 단편이 더 클 수록 게놈 샘플 중의 샘플 집단은 덜 복잡해지는데, 예를 들어 이상적인 시나리오에서는 정상적인 전체 이배체 인간 게놈을 커버하기 위해 단일 분자 수준에서 분석하기 위해서는 단지 46 염색체 길이의 단편만이 필요하고, 이러한 접근 방식으로부터 유래된 서열은 선천적으로 본래의 반수체 정보를 갖고 있다. 추가로, 메가 염기-규모의 게놈 단편을 세포로부터 추출할 수 있고, 직접적인 분석을 위해 보존시킬 수 있는데, 이는 복잡한 알고리즘 및 어셈블리의 부담을 상당히 감소시켜 주고, 또한 그의 본래의 환경 내의 게놈 및/또는 후생게놈 정보를 개체의 세포성 표현형과 보다 직접적으로 상관짓게 해준다.
게놈학 이외에도, 후생게놈학 분야가 지난 20년간 더욱 인식되어 왔거나 암과 같은 인간 질병에 있어서의 그의 역할에 대해 뛰어나게 중요한 것으로서 인식되어 왔다. 게놈학과 후생게놈학 분야 둘 다에서의 지식이 축적됨에 따라, 주요 도전 과제는 게놈 및 후생게놈 인자가 인간 질병 및 악성 종양에서 다형증 또는 병리생리학적 상태를 발생시키는 데에 어떻게 직접 또는 간접적으로 상관이 있는 지를 밝혀내는 것이다. 전체 게놈 분석 개념은 게놈 서열 분석, 후생유전적 메틸화 분석 및 기능성 게놈학 분야를 상당 부분 보다 더 다면화된 전체론적 접근 방식으로 단리시켜 연구한 구획화된 접근 방식으로부터 점진적으로 발달하였다. DNA 서열 분석, 구조적 변이물 지도화, CpG 섬 메틸화 패턴, 히스톤 변형, 뉴클레오솜성 리모델링, 마이크로RNA 기능 및 전사 프로파일링이 계통적인 방식으로 보다 더 밀접하게 여겨져 왔지만, 세포의 분자 상태의 상기 국면 각각을 조사하는 기술은 종종, 단리되고, 지루하며 비-화합성이어서, 간섭성 실험 데이터 결과를 이용한 전체론적 분석을 심하게 피해간다.
따라서, 표적 샘플의 게놈 및 후생게놈 정보를 결정할 수 있도록 본래의 대형 천연 생물학적 샘플의 단일 분자 수준 분석을 가능하게 해주는 방법 및 장치가 당해 분야에 필요하다. 이러한 방법 및 장치는 연구자 및 임상의 등에게 매우 강력한 도구를 제공할 것이다.
<발명의 요약>
상기 언급된 도전 과제를 충족시키는 데에 있어서, 본원에 청구된 발명은 먼저, 제1 DNA 가닥과 제2 DNA 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA를 프로세싱하여, 제1 DNA 가닥의 혼성화되지 않은 플랩 (flap) 및 제2 DNA 가닥 상의 상응하는 영역을 생성시키는 단계 (혼성화되지 않은 플랩은 약 1 내지 약 1000개 염기를 포함함); 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 제1 DNA 가닥을 연장시키는 단계; 및 혼성화되지 않은 플랩의 적어도 일부, 상기 연장된 제1 DNA 가닥의 일부, 또는 둘 다를 표지하는 단계를 포함하는, DNA를 명확히 규명하는 방법을 제공한다.
또한, 제1 이중 가닥 DNA 상에서, 제1 DNA 상의 2개 이상의 서열-특이적 위치를 표지하는 단계; 제2 이중 가닥 DNA 상에서, 제2 DNA 상의 2개 이상의 상응하는 서열-특이적 위치를 표지하는 단계; 제1 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 제2 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 및 제1의 선형화된 이중 가닥 DNA 상의 2개 이상의 표지들 간의 거리를, 제2의 선형화된 이중 가닥 DNA 상의 상응하는 표지들 간의 거리와 비교하는 단계를 포함하는, DNA 간의 구조적 변이물을 확인하는 방법이 제공된다.
추가로, 제1 이중 가닥 DNA 상에서, 제1 DNA 상의 하나 이상의 서열-특이적 위치를 표지하는 단계; 제2 이중 가닥 DNA 상에서, 제2 이중 가닥 DNA 상의 상응하는 하나 이상의 서열-특이적 위치를 표지하는 단계; 제1 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 제2 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 및 제1의 선형화된 이중 가닥 DNA의 하나 이상의 표지의 신호 세기를, 제2의 선형화된 이중 가닥 DNA의 하나 이상의 표지의 신호 세기와 비교하는 단계를 포함하는, DNA로부터 구조적 정보를 수득하는 방법이 기재되어 있다.
부가적으로, 내부에 하나 이상의 협착이 배치된 채널을 따라 그로부터 연장되는 하나 이상의 플랩을 포함하는 거대분자를 전위시키는 단계; 및 상기 채널의 하나 이상의 협착을 통한 거대분자의 하나 이상의 플랩의 통과에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 거대분자로부터 구조적 정보를 수득하는 방법이 제공된다.
또한, 거대분자의 적어도 일부를 표지하는 단계; 이러한 거대분자를 고정화시키는 단계; 거대분자의 적어도 일부가 채널 내에서 선형화되도록 거대분자의 적어도 일부를 이러한 채널 내에 배치하는 단계; 및 거대분자의 표지된 일부와 관련된 하나 이상의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 거대분자로부터 구조적 정보를 수득하는 방법이 제공된다.
또한, 폭 범위가 약 1 내지 약 100 나노미터인 하나 이상의 채널을 포함하고 하나 이상의 고정화 영역을 포함하는 기질을 포함하는 분석 시스템이 기재되어 있다.
추가로, 핵산 중합체의 하나 이상의 영역을 하나 이상의 서열-특이적 모티프 표지로 표지하는 단계; 하나 이상의 서열-특이적 모티프 표지로부터의 하나 이상의 신호를 핵산 중합체의 하나 이상의 서열-특이적 모티프 표지의 위치와 상관짓는 단계; 핵산 중합체의 하나 이상의 절편 (이러한 하나 이상의 절편은 핵산 중합체의 하나 이상의 서열 특이적 모티프 표지를 포함함)을 서열 분석하는 단계; 및 하나 이상의 서열 분석된 절편의 하나 이상의 신호를, 상기 표지된 핵산 중합체의 하나 이상의 상응하는 신호와 비교하여, 핵산 중합체 내에서 2개 이상의 서열 분석된 절편의 상대적 위치를 발생시키는 단계를 포함하는, 핵산 중합체를 명확히 규명하는 방법이 제공된다.
발명의 요약 뿐만 아니라 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 연계해서 판독한 경우에 추가로 이해된다. 본 발명을 예시할 목적으로, 본 발명의 예시 양태가 도면에 도시되었지만, 본 발명은 기재된 구체적 방법, 조성물 및 장치로 제한되지 않는다. 또한, 도면은 반드시 규모로 도시되지 않는다. 도면에서:
도 1은 청구된 플랩-표지화 방법의 도식도이다;
도 2는 플랩에 상응하는 제1 가닥의 영역 내에 있는 표지 및 제1 DNA 가닥으로부터 생성된 플랩과 혼성화된 표지된 프로브를 도시한 것이다;
도 3은 DNA "바코드"를 폴리핵산 위에 놓아두는 대체 양태를 도시한 것이다;
도 4는 게놈 영역을 따라 수행된 서열 분석을 도시한 것이다;
도 5는 동시의 병행 서열 분석 및 공간 어셈블리를 도시한 것이다;
도 6은 핵산 중합체로부터 게놈 어셈블리 정보를 수득하는 것을 도시한 것이다;
도 7은 영상 분석을 진행하고 있는 표지된 DNA 중합체의 소프트웨어 영상이다;
도 8은 본원에 청구된 발명에 따르는 광학적 및 비-광학적 검출 도식을 도시한 것이다;
도 9는 나노채널 또는 나노트랙 내에서 선형화된 표지된 핵산 중합체를 도시한 것이다;
도 10은 각종 수단에 의해, 나노채널에 인접하거나 나노채널 내에서 고정화된 핵산 중합체를 도시한 것이다;
도 11은 나노채널 또는 나노트랙 내에 배치된 핵산 중합체의 자기 및 광학적 트랩핑 (trapping)을 도시한 것이다.
<예시 양태의 상세한 설명>
본 발명은 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부된 도면 및 실시예와 연계해서 취한 다음 상세한 설명을 참고로 하여 보다 용이하게 이해될 수 있다. 본 발명이 본원에 기재되고/되거나 제시된 구체적인 장치, 방법, 적용, 조건 또는 파라미터로 제한되지 않고, 본원에 사용된 용어는 단지 예로써 특별한 양태를 기재할 목적이고, 본원에 청구된 발명을 제한하지 않는다는 것을 인지해야 한다. 또한, 첨부된 특허청구범위를 포함한 본 명세서에서 사용된 바와 같은 단수 형태는 복수 형태를 포함하고, 특별한 수치에 대한 언급은 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 적어도 바로 그 특별한 값을 포함하고 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "복수"는 1개 초과를 의미한다. 특정 범위의 값으로 표현된 경우, 또 다른 양태는 한 가지 특별한 값 및/또는 기타 특별한 값을 포함된다. 유사하게, 값이 "약"으로써 대략적인 수치로 표현된 경우, 이러한 특별한 값이 또 다른 양태를 형성한다는 것을 인지해야 할 것이다. 모든 범위는 포괄적이고 조합 가능하다.
명료하게 하기 위해 별개의 양태 맥락에서 본원에 기재되는 본 발명의 특정의 특징이 또한, 단일 양태와 조합해서 제공될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 역으로, 간략하게 하기 위해 단일 양태 맥락에서 기재되는 본 발명의 각종 특징은 또한, 별개의 또는 모든 서브-조합으로 제공될 수 있다. 추가로, 범위로 언급된 값에 대한 언급은 이러한 범위 내의 각각의 값 및 모든 값을 포함한다.
제1 국면에서, 본 발명은 제1 DNA 가닥과 제2 DNA 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA를 프로세싱하여, 제1 DNA 가닥의 혼성화되지 않은 플랩 및 제2 DNA 가닥 상의 상응하는 영역을 생성시키는 단계 (혼성화되지 않은 플랩은 약 1 내지 약 1000개 염기를 포함함); 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 제1 DNA 가닥을 연장시키는 단계; 및 혼성화되지 않은 플랩의 적어도 일부, 상기 연장된 제1 DNA 가닥의 일부, 또는 둘 다를 표지하는 단계를 포함하는, DNA를 명확히 규명하는 방법을 제공한다.
상기 플랩은 적합하게, 길이가 약 1 내지 약 1000개 염기이다. 플랩은 적합하게, 길이가 약 20 내지 약 100개 염기이거나, 또는 심지어 약 30 내지 약 50개 염기 범위이다.
상기 방법은 또한, 하나 이상의 대체 염기를 이중 가닥 DNA의 제1 가닥 내로 혼입하여 제1 DNA 가닥 (이로부터 플랩이 벗겨진다)을 연장시켜, 플랩의 형성에 의해 남겨진 갭 (즉, 이로써 생성된 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역)을 메워 제거하는 단계를 포함한다. 사용자는 하나 이상의 태그를 이용하여 상기 프로세싱된 이중 가닥 DNA의 적어도 일부 (제1 DNA 가닥, 제2 DNA 가닥, 플랩, 또는 그의 임의의 조합)를 표지할 수 있다. 플랩에 의해 남겨져서 메운 갭은 하나 이상의 표지된 일부를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서 (제시되지 않음), 플랩은 플랩-제거 효소를 이용하여 절제하면, 하나 이상의 뉴클레오티드가 혼입된 dsDNA가 잔존한다.
상기 프로세싱 단계는 이중 가닥 DNA의 제1 가닥을 닉킹 (nicking)함으로써 수행하는 것이 적합하다. 이러한 닉킹은 하나 이상의 서열-특이적 위치에서 수행하는 것이 적합하지만, 닉킹을 무작위 또는 비-특이적 위치를 포함한 하나 이상의 비-특이적 위치에서 수행할 수 있다.
닉킹은 이중 가닥 DNA 중합체를 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 닉카제 (nickase)에 노출시킴으로써 수행하는 것이 적합하다. 닉카제는 고도로 서열 특이적인 것이 적합한데, 이는 닉카제가 특별한 염기 서열 (모티프)과 고 특이도로 결합하는 것을 의미한다. 닉카제는, 예를 들어 다음 공급처 [New England BioLabs (www.neb.com)]로부터 입수 가능하다.
닉킹은 또한, DNA 가닥을 파단 또는 절단시키는 기타 효소에 의해 수행할 수 있다. 이러한 파단 또는 닉킹은 또한, 전자기 방사선 (예: 자외선), 하나 이상의 자유 라디칼 등에 노출시킴으로써 수행할 수 있다. 닉킹은 이들 기술 중의 하나 이상에 의해 수행할 수 있다.
대체 염기를 이중 가닥 DNA의 제1 가닥 (즉, 닉킹된 가닥) 내로 혼입시키는 것은 적합하게, DNA를 폴리머라제, 하나 이상의 뉴클레오티드, 리가제, 또는 그의 임의의 조합과 접촉시키는 것을 포함한다. 플랩 내에 존재하는 "박리 제거된" 염기를 대체시키는 기타 방법은 당업자에게 또한 공지될 것이다. 제1 DNA 가닥은 적합하게, 제2 DNA의 상응하는 영역을 따라 연장시키는데, 이러한 영역은 플랩의 형성에 의해 잔존/노출된다. 몇몇 양태에서, 폴리머라제는 닉카제와 동시에 작용하여 플랩을 생성시킨다.
이들 대체 염기의 혼입은 플랩의 형성 및 "박리"에 의해 잔존하는 갭을 메우는 것으로서 개념화될 수 있다. 갭을 메움으로써, 기존에 플랩에 의해 점유되던 위치는 플랩 내에 위치한 염기와 동일한 서열을 갖고 있는 염기 세트에 의해 점유된다. 이와 같이 메움으로써, 플랩이 기존에 결합하고 있었던 DNA의 제2 가닥에 플랩이 재혼성화되는 것을 방지할 수 있다.
표지하는 단계는 적합하게, (a) 하나 이상의 상보적 프로브 (이러한 프로브는 하나 이상의 태그를 포함함)를 플랩의 적어도 일부와 결합시키는 단계, (b) 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 연장된 제1 DNA 가닥의 일부인 대체 염기로서, 하나 이상의 태그를 포함하는 뉴클레오티드를 활용하는 단계, 또는 (a)와 (b)의 임의의 조합에 의해 수행된다. 이러한 방식으로, 플랩, 갭을 메우는 염기, 또는 둘 다를 표지할 수 있다.
프로브는 적합하게, 본원에 기재된 바와 같은 태그를 포함하는 핵산 (단일 또는 다중)이다. 프로브는 서열 특이적일 수 있지만 (예를 들어, AGGCTA, 또는 기타 몇몇 특별한 염기 서열), 프로브는 무작위로 생성될 수도 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 프로브는 관심있는 서열과 결합하거나 또는 한 가지 대체에서는, 특별한 DNA 중합체 상의 관심있는 서열 또는 기타 영역으로부터의 상류 또는 하류 서열과 결합하는 프로브 (즉, 관심있는 영역을 플랭킹 또는 브래킷하기 위해 결합되는 프로브)를 갖고자 하는 사용자의 요망에 기초하여 선택 또는 구축될 수 있다. 프로브는 플랩 만큼 길 수도 있다 (즉, 1000개 이하 염기). 프로브는 적합하게, 길이가 1 내지 약 100개 염기 범위, 또는 약 3 내지 50개 염기, 또는 심지어 길이가 약 5 내지 약 20개 염기 범위이다.
이들 방법의 도식도가 도 1에 도시되어 있다. 이 도면에서, 플랩의 창출 및 생성되는 갭의 뒤메움 (back-filling)이 도시되어 있다. 뒤메움은 소위 "핫" 또는 표지된 염기를 이용할 수 있고, 플랩을 이러한 플랩의 적어도 일부에 대해 상보적인 하나 이상의 프로브와 접촉시킬 수 있다. 서열 특이적 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 닉카제는 이중 가닥 DNA 상에 단일 가닥 절단 갭을 창출시키고, 폴리머라제는 이와 같이 닉킹된 부위와 결합하며 전위된 가닥 또는 소위 "박리된 플랩"을 동시에 생성하면서 가닥 연장을 시작한다. 이어서, 상기 박리된 플랩은 표지된 프로브와의 특이적 혼성화를 서열 분석하는 데에 이용 가능한 영역 (즉, 핵산 중합체의 제2 DNA 가닥 상의 혼성화되지 않은 상응하는 영역)을 창출시켜 검출 가능하고 확인 가능한 신호를 생성시킨다.
도 1b는 나노채널 내에서 선형적으로 폴딩되지 않은 표지된 대형 게놈 DNA를 도시하고 있다. 상기 도면의 바닥에 도시된 바와 같이, 형광성 표지된 플랩은 사용자가 거대분자의 보다 큰 환경 내에서 프로브의 위치를 가시화할 수 있게 해준다. 도시된 바와 같이, 닉킹된-표지된 거대분자는 나노채널 내에서 선형화할 수 있다. 태그로부터 신호들 간의 공간적 거리는 일치하고, 이때 정량화할 수 있어, 궁극적으로 분석 중인 영역에 관한 특이적 게놈 서열 정보를 반영하는 독특한 "바코딩" 시그네처 (signature) 패턴을 제공해준다. 람다 dsDNA (총 길이 48.5 kbp) 상의 다중 닉킹 부위가 특이적 효소에 의해 창출된 한 예로서 제시되었는데, 이러한 효소에는 Nb.BbvCI; Nb.BsmI; Nb.BsrDI; Nb.BtsI; Nt.AlwI; Nt.BbvCI; Nt.BspQI; Nt.BstNBI; Nt.CviPII 및 이들 모두의 조합 분해가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
예측되는 닉카제 창출된 위치와 혼성화된 형광성 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 도시하기 위한 선형화 단일 람다 DNA 영상이 포함된다. 긴 생물 중합체를 따라 기록된 상기 실제적 바코드가 본원에서 관측된 바코드로서 기재된다.
표지된 플랩, 표지된 갭, 또는 둘 다를 갖는 거대분자를 선형화함으로써, 사용자는 서로에 대한 표지의 상대적 위치를 결정할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 상대적 거리 정보는 진단 적용에 유용하고 핵산 중합체를 명확히 규명하는 데에 유용하다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 이중 가닥 DNA의 제1 DNA 가닥 내로 혼입된 하나 이상의 대체 염기, 플랩과 결합하는 하나 이상의 프로브, 또는 둘 다로부터 유래된 서열 정보를 수득하는 것을 더 포함한다. 이러한 서열 정보는 각종 방식으로 수득할 수 있다.
한 가지 예에서, 특이적 염기 서열에 대해 상보적인 표지된 프로브를 플랩에 도입하고, 사용자는 이러한 서열 특이적 프로브가 플랩과 결합하는 지를 결정한다. 이러한 공정은 상이한 서열 특이성을 지닌 프로브를 이용하여 수회 반복하여, 궁극적으로 사용자가 플랩 내에 있는 염기 서열을 결정할 수 있게 한다.
또 다른 예에서는, 플랩에 의해 잔존된 갭을 메워주는 염기 서열을 결정함으로써 서열 정보를 수득한다. 이는 하나 이상의 염기를 동일하거나 상이한 표지로 표지하고, 이들이 갭 내로 혼입됨에 따라 또는 갭 내로 혼입된 후에 염기에 의해 방출된 신호를 검정함으로써 수행할 수 있다. 기타 양태에서는, 사용자가 염기 서열을 결정하도록 갭 내로 염기를 혼입시키는 폴리머라제로부터 점진적으로 발달된 하나 이상의 신호를 모니터링할 수 있다.
서열 정보를 결정하는 것은 자유 용액 중에서 수행하거나 또는 나노채널에서 수행하여 단일 DNA 중합체를 고 해상도 분석할 수 있도록 한다. 플랩은 적당한 효소를 통하여 절제한 다음, 이와 같이 절제된 플랩 그 자체를 서열 분석할 수도 있었다.
서열 정보는 단일 플랩, 단일 갭 또는 둘 다로부터 수득할 수 있다. 그러나, 몇몇 양태에서 서열 정보는 둘 이상의 플랩 또는 갭으로부터 수득하여, 소정의 표적을 보다 신속하게 서열 분석할 수 있다. 서열 분석 정보는 또한, 서열 특이적 프로브를 사용하고, 이러한 프로브가 핵산 중합체의 일부와 결합하는 위치 및 결합하는 지의 여부를 결정함으로써 결정할 수 있다.
도 4는 비교적 긴 게놈 영역을 따라 서열 분석하는 것을 도시한 것이다. 이러한 도면에서, "부모" 핵산 중합체가 이러한 중합체의 제1 가닥에서의 서열 특이적 닉킹 엔도뉴클레아제 및 폴리머라제 연장에 의해 분해된 후에, 단일 가닥 플랩이 형성된다. 이러한 구조는 플랩이 제1 가닥과 결합하는 곳 (화살표로 도시됨)을 절단시키는, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 다시 분해될 수 있고, 이로써 생성되는 dsDNA는 닉킹 부위와 플랩 엔도뉴클레아제 절단 부위에 걸쳐 있는 단일 가닥 갭을 생성시키도록 적당한 조건 하에 변성시킬 수 있다. 이어서, 상기 갭을 특이적 프로브 및 효소를 이용한 폴리머라제 연장 또는 혼성화 및 연결을 이용하여 서열 분석 반응에 노출시킬 수 있다.
도 4b는 장 dsDNA을 따라 창출된 다중 닉킹 부위, 단일 가닥 플랩 부위 및 단일 가닥 갭 부위를 도시한 도식도이다. 이어서, 서열 분석 반응을, 폴리머라제 연장에 의해 수행된 서열 분석 또는 혼성화 또는 연결에 의한 서열 분석을 이용하여, 하나 이상의 닉킹, 플랩 서열 부위 또는 단일 가닥 갭 부위에서 개시한다.
각종 종이 본 발명의 방법을 위한 태그로서 제공될 수 있다. 태그에는, 예를 들어 형광단, 양자 도트, 덴드리머 (dendrimer), 나노와이어, 비드, 펩티드, 단백질, 자기 비드, 메틸 기, 메틸트랜스퍼라제, 비-절단성 제한 효소, 아연-핑거 단백질, 항체, 전사 인자, DNA 결합성 단백질, 헤어핀 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고데옥시뉴클레오티드, 펩티드 핵산 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 방법은 2가지 이상의 상이한 태그의 사용을 포함할 수 있고, 따라서 단일 분자는 다중 태그를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 하나 이상의 태그로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 신호에는 형광성 신호, 화학발광성 신호, 전자기 신호, 전기 신호, 전위차 등이 포함될 수 있다. 신호는 두 물체 간의 물리적 크기 차이에 관한 것일 수 있는데, 이는 예를 들어, DNA 표적에 부착된 비드가 이러한 비드 보다 단면적이 더 작은 협착에 포획되는 경우에 발달된 신호일 수 있다. 형광성 신호는 특히 형광성 분자가 염기, 프로브 또는 둘 다에 부착되는 양태에 특히 적합한 것으로 간주된다.
몇몇 양태에서, 신호는 플랩 상에 있는 프로브 상의 태그와 대체 염기 상의 태그 간에 전이된 에너지 (예: 형광 에너지 전이, "FRET")로부터 유래되거나, 플랩 상에 있는 프로브 상의 2개 이상의 태그 간의 형광 공명 에너지 전이에 의해 유래되거나, 또는 그의 임의의 조합에 의해 유래될 수 있다.
도 2는 본원에 청구된 발명에 따라서 제조된 핵산 중합체 상의 표지 및 프로브에 대한 예시 위치를 도시하고 있다. 상기 도면은 플랩의 형성 및 박리에 의해 잔존된 갭을 메우기 위해 연장된 DNA 가닥을 따라 플랩 및 프로브 (C로서 도시됨) 상에 배치된 프로브 (A 및 B로서 도시됨)를 도시하고 있다.
프로브에는, 예를 들어 유기 형광단, 양자 도트, 덴드리머, 나노와이어, 비드, Au 비드, 상자성 비드, 자기 비드, 폴리스티렌 비드, 폴리에틸렌 비드, 펩티드, 단백질, 합텐, 항체, 항원, 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘, 바이오틴, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 서열 특이적 결합성 인자, 예를 들어 공학 처리시킨 제한 효소, 메틸트랜스퍼라제, 아연 핑거 결합성 단백질 등이 포함된다. 도시된 바와 같이, 1개 초과의 프로브가 플랩 상에 배치될 수 있다. 샘플 양태에서는, 갭 내의 태그(들)가 여기 (excitation) 방사선에 의해 여기된다. 이어서, 이와 같이 여기된 갭-태그는 그 자체가 플랩 상에 배치되는 프로브 상에 배치된 탭 (tab)으로 에너지를 전이시킨다.
갭- 및 플랩-태그 중의 하나 또는 둘 다는 사용자가 검출할 수 있는 신호를 방출할 수 있다. 몇몇 양태에서, 갭 태그, 제1 플랩 태그, 또는 둘 다는 제2 플랩 태그를 여기할 수 있다. 이러한 방식으로, 사용자는 특이적 파장 또는 방사선 유형에 의해서만 여기되는 태그를 선택함으로써 고도로 특이적인 검출 시스템의 환경을 설정함으로써, 하나 이상의 전구체 태그가 적당한 위치에 있는 경우에만, 사용자에 의해 검출되는 태그가 여기되는 시스템을 창출할 수 있다. 따라서, 2개 이상의 표지 간의 에너지 전이에 의해 공동-국재화 현상을 검출할 수 있는데 (예를 들어, 가시화할 수 있음), 이는 결합 현상 검정의 특이성을 증강시켜 준다.
플랩 영역이 몇몇 경우에 선택되는데, 이는 플랩, 갭, 또는 둘 다가 이중 가닥 DNA 상의 관심있는 특이적 서열의 적어도 일부를 포함하고 있기 때문이다. 이러한 관심있는 서열에는, 예를 들어 특별한 단백질 또는 특별한 조건을 암호화하는 것으로 공지된 서열이 포함될 수 있다.
몇몇 양태에서, 플랩, 갭, 또는 둘 다는 이중 가닥 DNA 상의 관심있는 서열을 플랭킹하는 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 포함한다. 이는, 예를 들어 사용자가 해당 부위를 강조하기 위해 관심있는 특별한 유전자 또는 기타 부위의 위치를 브래킷하는 DNA 상의 영역을 표지하고자 하는 경우에 유용하다.
본원에 청구된 방법은 또한, 하나 이상의 플랩, 1개의 갭, 또는 둘 다를 포함하는 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 적어도 부분적으로 선형화 (예: 풀기)하는 단계를 포함한다. 사용자는 또한, 2개 이상의 플랩, 2개의 갭, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 적어도 부분적으로 선형화할 수 있다. 이러한 선형화는, 예를 들어 DNA가 채널 또는 기타 구조물 내의 물리적 국한 방식으로 선형화되도록 하는 치수의 채널 또는 기타 구조물을 통하여 DNA를 전위시킴으로써 달성할 수 있다.
사용자는 또한 몇몇 양태에서, 2개 플랩 간의 거리, 2개 이상의 플랩에 인접하게 배치된 2개 이상의 태그 간의 거리, 2개 이상의 갭 내에 배치된 2개 이상의 태그 간의 거리, 또는 그의 임의의 조합을 측정할 수 있다. 이어서, 이러한 거리를 DNA의 구조, 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 메틸화 패턴, cpG 섬의 위치, 후생게놈 패턴, 생리학적 특징, 또는 그의 임의의 조합과 상관짓는 것이 적합하다. 본원에 청구된 발명은 구조 및 기타 후생게놈 인자 (예를 들어, 메틸화 패턴, cpG 섬의 위치 등)을 연구 조사할 수 있게 하기 때문에, 사용자는 완전한 게놈 그림에 도달하기 위해 구조 및 후생게놈 패턴과 관련된 결과를 더할 수 있다.
본원에 청구된 발명의 한 가지 국면은 핵산 또는 기타 유전적 물질에 관한 게놈 (서열) 및 후생게놈 (초서열) 정보 둘 다를 제공할 수 있는 그의 능력이다. 보다 구체적으로 언급하면, 본원에 청구된 발명은 사용자가 서열 분석을 통하여, 특별한 유전자가 존재하는 지를 결정할 수 있고, 또한 후생게놈 정보를 수득함으로써, 해당 유전자의 활성을 결정할 수 있게 된다.
한 가지 비-제한적 예에서, 사용자는 특별한 유전자가 존재하는 지의 여부와 같은, 핵산 중합체에 관한 게놈 정보를 수득할 수 있다 (본원에 기재된 표지화 방법을 통함). 이어서, 사용자는 또한, 예를 들어 핵산 중합체를 따라 메틸의 위치를 확인하기 위해 표지된 메틸-결합성 단백질을 사용함으로써 핵산 중합체의 메틸화 패턴 (이는 메틸화에 근접하여 위치한 유전자 자리 활성의 지표이다)에 관한 후생게놈 정보를 수득할 수 있다. 이러한 메틸은 시토신 상에 상주할 수 있고 소위 cpG 섬 군집 내에 상주할 수 있는데, 이는 기능성 유전자 자리의 조절과 상관이 있을 수 있다. 기타 결합성 분자 (예: 전사 인자 결합 부위와 결합하는 분자 등)가 또한, 후생게놈 정보를 수득하는 데에 적합하다.
따라서, 사용자는 몇몇 양태에서, 하나 이상의 기능성 유전자의 존재와, 메틸에 의거한 후생게놈 정보를 통하여 상기 유전자가 활성인지의 여부를 동시에 결정할 수 있다. 한 가지 예에서, 사용자는 상기 유전자의 서열 정보를 제1 색상의 표지로 표지할 수 있고, 메틸화 영역을 제2 색상의 표지로 표지할 수도 있으므로, 유전자 위치/서열 및 유전자 활성 (즉, 메틸화 패턴)을 동시에 관찰할 수 있게 된다. 후생게놈 정보에는 또한, 전사 효소가 결합할 수 있거나 결합할 수 없는 위치가 포함될 수 있다.
후생게놈 정보의 유용성은 명백하다. 본원에 기재된 바와 같이, 게놈 정보의 유용성은 올리고머에 의거한 프로브 (또는 바코드를 포함하는 프로브 세트)가 연구 중인 핵산 중합체의 서열에 관한 "정적" 정보를 제공하는 것이다. 후생게놈 정보 (예를 들어, 메틸화 또는 전사 인자 결합성에 관한 정보)는 유전자 서열에 관한 동적 정보를 제공하여, 이러한 유전자에 관한 온/오프 정보를 효과적으로 제공한다. 따라서, 본 발명은 게놈 정보와 후생게놈 정보 둘 다를 동시에 수집할 수 있게 해준다.
한 가지 예시되는 비-제한적 예로서, 사용자는 제1 환자로부터의 DNA 상의 위치 (즉, 플랩, 메워진 갭, 또는 이들 둘의 몇몇 조합)를 표지할 수 있는데, 상기 위치는 DNA 상의 특별한 유전자, 예를 들어 유방암 유전자의 위치로부터 상류 및 하류 (즉, 플랭킹)가 되도록 선택한다. 표지된 DNA를 선형화시킨 후, 사용자는 이들 표지 간의 거리를, 유방암 유전자의 "적당한" 수의 카피를 갖는 것으로 공지된 대조군 대상체로부터의 DNA 상의 상응하는 표지들 간의 거리와 비교할 수 있다. 제1 환자에 대한 표지들 간의 거리가 대조군 대상체에 대한 표지들 간의 거리 보다 더 클 경우, 이러한 환자는 유방암 유전자의 부가의 또는 여분의 카피를 갖고 있고, 치료 섭생은 이에 따라 설계될 수 있는 것으로 공지되어 있다.
이러한 기술을 이용하여 둘 이상의 개체 간의 카피 수 변이물 (이들 중의 어느 것도 "대조군"이 아니다)를 결정할 수 있거나 또는 심지어 단일 환자 내에서의 카피 수 변이물을 결정할 수 있다 (즉, 2가지 상이한 시점에서 해당 환자로부터 취한 DNA를 비교함으로써 수행된다). 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 단일 대상체 또는 보다 큰 집단 절편으로부터 DNA 또는 기타 거대분자를 신속하게 분석하고 명확히 규명할 수 있게 해준다.
사용자는 또한, 플랩에 인접하여 배치된 하나 이상의 태그, 갭 내에 배치된 태그, 또는 둘 다로부터 하나 이상의 신호 세기를 측정할 수 있다. 이어서, 사용자는 하나 이상의 신호 세기를 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 생리학적 특징, 또는 본원에 기재된 기타 특징 (예: 후생게놈 패턴)과 상관지을 수 있다. 이로써, 사용자는 핵산 중합체 공급원의 병리생리학적 상태의 완전한 그림을 생성시킬 수 있다.
이는 비제한적 도 5c에 도시되어 있다. 이 도면은 후생게놈 바코드 패턴을 생성시키기 위해 게놈 영역을 따라 관심있는 하나 이상의 후생게놈 부위를 위치시키기 위해 항-메틸-항체 또는 메틸-결합성 단백질 (MBP)과 같은 표지된 결합성 인자 (BF)의 사용을 도식적으로 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 사용자는 또한, 몇몇 경우에 기재된 방법을 동시에 사용하여 동일한 영역을 "바코딩"하여 (예를 들어, 서열-특이적 프로브를 이용함) 게놈 영역의 구조를 결정한다. 게놈 프로브는 상이한 파장에서 또는 후생게놈 분석과 연관된 모든 표지와 구별 가능한 신호를 이용하여 방출 또는 여기시킬 수 있다. 한 양태에서, 후생게놈 바코드에는 전사 인자 결합 부위 또는 siRNA 또는 LincRNA 결합 부위로부터 유래된 패턴이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이는 정적 게놈 서열 및 구조 정보를, 실시간으로 및 단일 분자 수준에서 직접적인 영상화를 이용한 동일한 측면에서 동적 조절성 및 기능적 정보와 동시에 상관지을 수 있는 본원에 청구된 발명의 능력을 입증해준다.
또 다른 비-제한적 예로서, 사용자는 관심있는 유전자 (예: 유방암) 내에 있는 제1 환자로부터의 DNA의 영역에 상응하는 하나 이상의 플랩 (또는 매워진 갭)을 표지할 수 있다. 이어서, 사용자는 이들 표지로부터 점진적으로 발달된 하나 이상의 신호 세기를 결정한다. 이어서, 사용자는 "대조군" 또는 제2 대상체로부터의 DNA 상의 상응하는 표지로부터 점진적으로 발달된 하나 이상의 신호 세기를 측정한다. 제1 환자로부터의 신호(들) 세기가 대조군으로부터의 신호(들) 세기와 상이한 경우, 사용자는 두 대상체가 상이한 유전자 카피 수를 갖고 있다는 몇몇 지표를 가질 것이다. 신호 세기는 또한, 소정의 중합체 중의 단일 염기 또는 특별한 염기 서열의 우세와 상관이 있을 수 있다. 신호 세기는 또한, 신호를 방출하는 표지를 보유하고 있는 프로브에 대해 상보적인 서열의 공간 밀도에 관한 정보를 제공할 수 있다.
도 7은 본원에 청구된 발명에 따르는 핵산 중합체 상에서 수행된 영상 분석을 예시한 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 상기 도면은 포착된 "미가공" DNA 영상을 도시하고 있는데, 말단 대 말단 윤곽 길이 및 세기 정보는 실시간으로 추출되고 측정된다. DNA의 이종 혼합물로부터 비롯되는 판독치를 입증하도록 크기 분포도 히스토그램이 도시되어 있다.
본원에 청구된 발명은 또한, 다수의 DNA를 명확히 규명하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 제1 이중 가닥 DNA 상에서, 제1 DNA 상의 2개 이상의 위치 (서열 특이적, 무작위, 또는 둘 다)를 표지하는 단계; 제2 이중 가닥 DNA 상에서, 제2 DNA 상의 2개 이상의 상응하는 서열-특이적 위치를 표지하는 단계; 제1 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 제2 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 및 제1의 선형화된 이중 가닥 DNA 상의 2개 이상의 표지들 간의 거리를, 제2의 선형화된 이중 가닥 DNA 상의 상응하는 표지들 간의 거리와 비교하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 표지하는 단계는 본원에 기재된 바와 같이, (a) 이중 가닥 DNA로부터 분리되는 제1 가닥의 플랩, 및 (b) 이중 가닥 DNA의 제1 가닥과 플랩의 연결부 부위 및 닉킹 부위에 의해 규정된 이중 가닥 DNA의 제1 가닥 내의 갭을 생성시키도록 이중 가닥 DNA의 제1 가닥을 닉킹함으로써 수행된다.
상기 방법은 프로브의 적어도 일부에 대해 상보적인 표지된 프로브에 플랩을 노출시키는 단계, 하나 이상의 표지된 염기를 갭 내로 삽입하는 단계, 또는 이들 둘 다의 것을 더 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 표지하는 단계는 제1 및 제2 이중 가닥 DNA를 비-절단성 제한 효소, 메틸트랜스퍼라제, 아연-핑거 단백질, 항체, 전사 인자, DNA 결합성 단백질, 헤어핀 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고데옥시뉴클레오티드, 펩티드 핵산 등에 노출시킴으로써 수행하는 것이 적합하다. 비-절단성 제한 효소에는 태그가 포함될 수 있다. 이어서, 거리는 적합하게, 본원에 기재된 바와 같이 DNA의 구조, 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 메틸화 패턴, 생리학적 특징, cpG 섬의 위치, 후생게놈 패턴, 또는 이들의 임의의 조합과 상관이 있다.
이들 방법의 한 가지 양태가 도 5에 도시되어 있는데, 이는 병행 서열 분석과 공간적 어셈블리를 동시에 보여주는 도식적 예시이다. 장 게놈 영역을 따라 많은 서열 개시 부위가 서열 모티프 특이적 방식으로 창출될 수 있는데, 본 경우에는 GCTGAxxxx가 창출될 수 있고, 이들 부위의 신체 위치를 검출하고, 신체 지도 상에 등록한다. 후속 판독치를 폴리머라제 연장를 이용한 서열 분석 또는 특이적 프로브와의 혼성화 및 연결에 의해, 서열 분석 화학에 의해 기록한다.
서열 분석 판독치 이외에도, 이들 다중 서열 분석 판독치의 공간적 거리 및 위치, 및 상응하는 선형 순서를 기록하고, 신체 지도 상으로 동시에 어셈블리한다. 이러한 지도에 의거한 서열 분석 도식은 궁극적으로, 기존의 방법에 비해 보다 우수한 어셈블리 정확도, 효율 및 비용 절감을 제공해 준다.
도 5b는 제한 효소의 결합성 도메인 만을 보유하고 있지만 이러한 효소의 DNA 절단 기능이 결여된, 유전 공학 처리시킨 비기능성 제한 효소를 포함한 DNA 결합성 인자 (BF)의 사용을 보여주는 도식적 예시이다. 기타 효소, 아연 핑거 단백질, 서열 모티프 특이적으로 DNA와 결합하는 전사 인자, 기타 DNA 연합 인자 특이적 (이차 결합성) 방식으로 메틸화 특이적 부위와 결합하는 메틸 결합성 단백질 또는 항-메틸 항체와 마찬가지로, 서열 특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이와 결합하는 DNA 메틸트랜스퍼라제가 또한 유용하다. 예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제 (MTase)에는 M.BseCI (5'-ATCGAT-3' 서열 내의 N6에서의 아데닌을 메틸화한다), M.TaqI (5'-TCGA-3' 서열 내의 N6에서의 아데닌을 메틸화한다) 및 M.HhaI (5'-GCGC-3' 서열 내의 C5에서의 제1 시토신을 메틸화한다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 이와 같이 적합하게 결합하는 물체의 목록에는 이중 가닥 DNA를 절단하지 않고서도 이러한 이중 가닥 DNA와 결합하는 (예를 들어, 서열 특이적 방식으로) 물체가 포함된다. 상기 도면에서는, 각종 별표가 상이한 표지화 태그, 예를 들어 QD (양자 도트), 형광성 표지 등을 나타낸다. 이들 태그 간의 공간적 거리 및 이들 "스트링 상의 도트" 바코드 패턴의 세기를 이용하여 기타 생물학적 기능, 예를 들어 활성 전사 부위, ORF (오픈 리딩 프레임), 저-메틸화 및 고-메틸화 부위 등을 연구할 수 있다.
또 다른 국면에서, 본원에 청구된 발명은 DNA로부터 구조적 정보를 수득하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 제1 이중 가닥 DNA 상에서, 제1 DNA 상의 하나 이상의 서열 특이적 위치를 표지하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한, 제2 이중 가닥 DNA 상에서, 이러한 제2 이중 가닥 DNA 상의 상응하는 하나 이상의 서열-특이적 위치를 표지하는 단계; 제1 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 제2 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 및 제1의 선형화된 이중 가닥 DNA의 하나 이상의 표지의 신호 세기를, 제2의 선형화된 이중 가닥 DNA의 하나 이상의 표지의 신호 세기와 비교하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 표지하는 단계는 적합하게, (a) 이중 가닥 DNA로부터 분리되는 제1 가닥의 플랩, 및 (b) 이중 가닥 DNA의 제1 가닥과 플랩의 연결부 부위 및 닉킹 부위에 의해 규정된, 플랩에 상응하는 이중 가닥 DNA의 제1 가닥 내의 갭을 생성시키도록 이중 가닥 DNA의 제1 가닥을 닉킹함으로써 수행된다. 플랩을 적합하게는, 프로브의 적어도 일부에 대해 상보적인 표지된 프로브에 노출시키거나, 하나 이상의 표지된 염기를 갭 내로 삽입하거나, 또는 이들 둘 다를 수행하여 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 제1 가닥을 연장시킨다. 이때, 신호 세기는 핵산 중합체의 공여체의 하나 이상의 생리학적 특징과 상관이 있다. 신호 세기는 또한, 핵산 중합체의 구조적 특징, 후생게놈 패턴, 또는 둘 다와 관계가 있을 수 있다.
본 발명은 사용자에게 소정의 중합체로부터 구조적 정보와 후생게놈 정보 둘 다를 수득하고 분석할 수 있는 능력을 제공해준다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 청구된 발명은 핵산 중합체 영역이 독특한 시그네처를 제공하는 "바코딩" 기술을 제공한다. 이러한 바코드는 구조 (예를 들어, 서열 특이적 모티프를 수반하는 표지에 의함, 제1 바코드) 및 후생게놈 패턴 (후생게놈 지표, 예를 들어 메틸화 부위, cpG 섬 등에 대해 특이적인 표지에 의함, 제2 바코드)에 관한 정보를 제공하도록 적용될 수 있다 (본원에 기재된 바와 같음). 제1 바코드와 제2 바코드 둘 다로부터 모은 정보를 활용함으로써, 사용자는 소정의 핵산 중합체에 관한 구조적 및 후생게놈 정보를 수득할 수 있다.
또한, 거대분자, 예를 들어 이중 가닥 DNA로부터 구조적 정보를 수득하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 내부에 하나 이상의 협착이 배치된 채널을 따라 그로부터 연장되는 하나 이상의 플랩을 포함하는 거대분자를 전위시키는 단계; 및 상기 채널의 하나 이상의 협착을 통한 거대분자의 하나 이상의 플랩의 통과에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, 플랩은 표지되고, 기타 양태에서는 표지되지 않으며, 신호는 협착을 지나온 "드러난" 플랩의 통과와 관련이 있다.
적합한 채널은 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 미국 특허원 제10/484,293호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재된 채널이 있다. 몇몇 양태에서, 플랩, 또는 플랩에 인접한 거대분자의 영역은 표지를 포함한다. 몇몇 양태에서, 표지는 본원에 기재된 바와 같이 플랩이 형성될 때 잔존한 메워진 갭 내에 배치된다.
신호는 적합하게, 광학 신호, 전기 신호, 전자기 신호, 또는 심지어 이들의 몇몇 조합이다. 신호는 협착을 통한 플랩의 통과와 관련이 있을 수 있거나, 또는 협착을 통한 표지의 통과와 관련이 있을 수 있다. 플랩은 협착을 통하여 1회 넘게 전위될 수 있다.
이들 방법의 예시되는 비-제한적 양태가 도 8에 도시되어 있다. 이 도면은 첫째 (도 8a), 광학적 검출 방법과 비-광학적 검출 방법 둘 다를 활용하여, 핵산 중합체로부터 표지된 바코드 정보를 수득하기 위한 시스템을 도시하고 있다.
도시된 바와 같이, 표지된 장 핵산 분자는 하나 이상의 협소한 협착점을 갖는 나노채널 내에서 신장되고 선형화되는 것으로 도시된다 [나노게이트 또는 나노노즐로서 공지됨; 참고: 미국 특허원 제12/374,141호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)].
몇몇 양태에서, DNA 이동과 현재의 측정은 유체공학 장치 및 외부 저장고와 접속되는 전기 회로에 의해 제어된다. 바코드 패턴의 광학 영상 및 표지의 비-광학적 레코딩 (즉, 균일한 중합체를 따라 물리적 "범프"의 전기적 레코딩)이 도 8b 및 도 8c에 도식적으로 도시되어 있다. 광학적 및 비-광학적 결과는 보다 우수한 데이터 정확도를 위해 서로 상관이 있을 수 있거나 서로에 대항하여 비교할 수 있다.
도 8d는 나노게이트-포함 유체공학 장치를 도시한 것이다. 기존에 보고된 방법에 의해 생성된 일련의 "플랩"이 도시되어 있는데, 이러한 플랩은 부가의 표지화 태그를 포함할 수 있다. 플랩, 그들의 태그, 또는 둘 다는 나노게이트를 통한 통과 동안 직접적으로 검출되는데, 이러한 동안에는 플랩, 태그 또는 둘 다가 검출 가능한 전자 신호, 예를 들어 표적 게놈 영역을 반영하는 이온성 전류 시그네처를 생성시킨다. 표지된 염기는 본원에 기재된 바와 같이, 플랩에 의해 비워진 영역 내의 핵산 중합체에 존재할 수도 있다. 이러한 염기는 이들이 나노게이트에 의해 통과됨에 따라 검출할 수도 있다.
또한, 거대분자로부터 구조적 정보를 수득하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 거대분자의 적어도 일부를 표지하는 단계; 이러한 거대분자를 고정화시키는 단계; 거대분자의 적어도 일부가 채널 내에서 선형화되도록 거대분자의 적어도 일부를 이러한 채널 내에 배치하는 단계; 및 거대분자의 표지된 일부와 관련된 하나 이상의 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
도 9는 서열 영상화 분석용 기질의 표면 상의 나노채널 또는 나노트랙 내부의 한쪽 말단 또는 양 말단에 구속된 핵산을 도시한 것이다. 이러한 도면에 도시된 바와 같이, 핵산 중합체 영역을 변형시켜 구속시킬 수 있는데, 이러한 핵산 중합체는 표지되거나 다중 위치에서 분석되는 서열 (R2)을 갖는다.
비-제한적 예로서, R2는 특별한 질병에 대한 유전자 내에 있는 것으로 공지될 수 있고, 중합체 내에 다중 R2 서열이 존재하는 것은 이러한 서열의 비정상적 (또는 정상적) 카피 수를 입증해준다. 중합체는 하나의 저장고로부터 또 다른 저장고까지 채널을 따라 전위될 수 있고, 그의 전위 경로를 따라 어떠한 지점에서도 중지되거나 고정화될 수 있다.
고정화는 수 많은 방식으로 달성할 수 있다. 한 양태에서, 도 10a에 도시된 바와 같이 거대분자가 하나 이상의 비드와 결합되는데, 하나 이상의 비드에 의해 고정화되는 분자는 비드 보다 단면적인 작은 협착에 의해 유발된다. 고정화는 거대분자를 표면에 화학적으로 구속하거나, 거대분자를 자기적으로 고정화시키거나, 거대분자를 광학적으로 트랩핑하거나, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 달성될 수도 있다.
비드를 포함한 양태에서는, 그의 유효 직경이 나노채널의 하나 이상의 단면적 치수 보다 더 크도록 비드를 선택한다. 변형된 핵산 분자가 나노채널 내로 유동함에 따라, 그의 유동이 지연되는데, 이는 변형되는 비드가 나노채널의 적어도 일부 보다 더 크기 때문이다. 이어서, 핵산 분자의 변형되지 않은 부분을 선형화시킬 수 있고, 이는 서열 분석에 이용 가능하다. 비드는 중합체성, 자기, 반도체성, 유전성, 금속성 또는 그의 임의의 조합일 수 있고, 핵산 분자의 변형은 공유 결합 또는 비-공유 결합 상호 작용 (단백질 상호 작용 포함)에 기초할 수 있으며, 중간 연쇄를 포함할 수 있다. 구속 또는 고정화의 모든 방식에 있어서, 적용되는 유동 또는 구배 장을 조정하여 구속시킬 수 있거나 구속을 풀 수 있다.
구속하기 위한 변형성 종은 나노채널 내의 핵산 분자의 결합 성질이 자기적, 전기적, 광학적, 화학적, 마찰, 유동에 의거, 물리적 폐쇄 또는 그의 임의의 조합이 되도록 선택할 수 있다.
또 다른 양태에서, 핵산 분자는 비제한적 도 10b에 도시된 바와 같이, 이러한 분자의 한쪽 말단에서 또는 그 근처에서 화학적으로 변형시킨다. 이러한 화학적 변형은 핵산 분자를 구속시키고 그것이 나노채널을 통하여 유동되는 것을 방지시키기에 충분한 강도의 나노채널 물질과 변형성 종 간에 공유 또는 비-공유 상호 작용이 일어나도록 선택된다.
화학적 변형제의 예에는 티올 기, 실란 기, 카복시 기, 아민 기, 알킬 쇄, 포스페이트 기, 광 절단 가능한 기, 단백질, 바이오틴, 아미노산 잔기, 금속성 기, 또는 그의 임의의 조합이 포함된다. 몇몇 경우에, 나노채널 표면은 변형성 종과의 상호 작용을 촉진시켜 주는 몇몇 화학적 변형을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 핵산 분자는 도 11a에 도시된 바와 같이, 이러한 분자의 한쪽 말단에서 또는 그 근처에서 자기적으로 변형시킨다. 이러한 자기적 변형은 자기 비드, 상자성 입자, 초상자성 입자, 또는 서열 분석 기간 동안 자기 쌍극자를 지속시킬 수 있는 기타 부분일 수 있다. 이러한 경우, 자기력은 나노채널 장치 내로 또는 그 근처로 통합될 수 있거나, 또 다른 한편으론, 도 11a에 도시된 바와 같이 외적으로 적용된 자기장의 결과일 수 있다.
또 다른 양태에서, 핵산은 광학 핀셋의 존재 하에 유전력 구배를 경험할 수 있는 입자 또는 부분을 이용하여 분자의 한쪽 말단에서 또는 그 근처에서 변형시킨다. 이는 비제한적 도 11b에 도시되어 있다.
도시된 바와 같이, 광학 핀셋을 이용하여, 입자가 나노채널을 통하여 유동하는 경우에 빔의 테두리 내에 입자를 포획하여, 부착된 핵산 분자가 나노채널 내에서 선형화될 수 있도록 한다. 광학 핀셋을 이용하여 표적을 이동시킬 수 있을 뿐만 아니라 이를 고정화시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 다중 물리력을 이용하여 DNA를 고정화시키거나 구속시킨다. 예를 들어, 반대되는 유체 유동과 전기장을 동시에 이용하여 분자가 분석 부위 내에 연신되고 정지되도록 할 수 있다.
선형화는 적합하게 물리적-엔트로피 국한에 의해, 거대분자의 선형화를 수행하도록 적절한 크기로 만든 채널에 의해 수행되는 것이 적합하다.
또한, 분석 시스템이 제공된다. 본원에 청구된 발명에 따르는 시스템은 폭이 약 1 내지 약 500 나노미터의 범위인 하나 이상의 채널을 포함하는 기질을 포함하는데, 이러한 기질은 하나 이상의 고정화 영역을 포함한다. 상기 채널은 적합하게, 폭의 범위가 약 10 내지 약 200 nm, 또는 약 20 내지 약 100 nm, 또는 심지어 약 50 nm이다. 채널의 깊이는 동일한 범위일 수 있지만, 특별한 채널의 폭과 깊이가 반드시 동일할 필요는 없다. 채널은 10 nm에서 수 센티미터까지 사실상 어떠한 길이일 수 있다. 이러한 채널은 적합하게, 길이가 밀리미터 범위이지만, 소정의 적용에 대한 최적의 길이는 당해 분야의 사용자에게 명백할 것이다.
고정화 영역은 거대분자를 고정화시킬 수 있다. 거대분자는 플랩, 비드, 유전체 변형물, 자기 입자 등을 포함할 수 있는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 시스템 및 거대분자 변형은 서로의 친화도를 근거로 하여 협력하여 선택할 수 있다. 예시되는 고정화 영역에는 도 10 및 도 11에 도시된 바와 같이, 자기 영역, 화학적 활성 영역, 협착 등이 포함된다.
몇몇 양태에서는, 도 10 및 도 11에 도시된 바와 같이, 중합체를 고정화시키고, 채널 내에 중합체의 적어도 일부가 배치되도록 구배를 적용한다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 바와 같이 표지할 수 있는 중합체를 선형화시킬 수 있고, 채널 내에서의 그의 국한을 통하여, 선형 형태를 유지할 수 있다.
본 도면에 도시되지는 않았지만, 본 발명은 또한, 표지된 중합체를 고정화 또는 구속시킨 다음, 중합체 상에 배치된 하나 이상의 표지 (또는 플랩)가 중합체의 특징을 검출할 수 있고 이와 상관이 있도록 하기 위해 구배 (압력, 전기적 등)를 적용함으로써 선형시키는 양태를 포함한다. 이러한 중합체는 상기 구배를 지속적으로 적용함으로써 또는 이것이 구배에 의해 일단 선형화되면 기질에 부착됨으로써 선형 형태로 유지될 수 있다 (즉, 중합체는 선형화된 다음, 그의 선형화된 형태로 기질 아래에 부착된다).
또한, 핵산 중합체를 명확히 규명하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 핵산 중합체의 하나 이상의 영역을 하나 이상의 서열 특이적 모티프 표지로 표지하는 단계; 하나 이상의 서열 특이적 모티프 표지로부터의 하나 이상의 신호를 핵산 중합체의 하나 이상의 서열 특이적 모티프 표지의 위치와 상관짓는 단계; 핵산 중합체의 하나 이상의 절편을 서열 분석하는 단계 (이러한 하나 이상의 절편은 핵산 중합체의 하나 이상의 서열 특이적 모티프 표지를 포함함); 및 하나 이상의 서열 분석된 절편의 하나 이상의 신호를, 표지된 핵산 중합체의 하나 이상의 상응하는 신호와 비교하여, 2개 이상의 서열 분석된 절편의 핵산 중합체 내에서의 상대적 위치를 발생시키는 단계를 포함한다.
본원에 청구된 방법의 표지화 국면은 적합하게, 본원에 기재된 표지화 방법에 의해 수행되는데, 즉 핵산 중합체 내에 플랩을 형성하고, 이러한 플랩, 플랩에 의해 비워진 영역 또는 이의 임의의 조합을 표지함으로써 수행된다. 적합한 표지 및 태그는 본원에 기재되어 있다.
상관짓는 단계는 적합하게, 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부를 선형화시켜 준다. 이러한 선형화는 중합체의 표지된 일부를 적합한 크기의 나노채널 내에서 선형화시키거나, 구배 (예를 들어, 유체, 전기적)를 중합체에 적용함으로써 수행할 수 있다. 기타 양태에서, 중합체는 구속시키거나 고정화시키고, 구배 (압력, 전기적 등)를 적용함으로써 선형화시킨다. 절편은 핵산 중합체를 무작위 또는 서열 특이적 절단시킴으로써 생성시킬 수 있다.
상관짓는 단계는, 예를 들어 2개 이상의 표지 간의 거리를 측정하는 단계, 2개 이상의 표지로부터 점진적으로 발달한 신호 세기를 비교하는 단계 등을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에는 "콘틱 (contig)"으로서 공지된 중합체의 절편을 서열 분석하는 것은 당해 분야에 공지된 각종 기술에 의해 수행할 수 있다. 이들 기술에는, 예를 들어 생어 (Sanger) 서열 분석, 맥삼-길버트 (Maxam-Gilbert) 서열 분석, 염료 종결인자 서열 분석, 시험관내 클로날 증폭, 혼성화에 의한 서열 분석 등이 포함된다. 절편은 적합하게, 길이가 30 kb 또는 심지어 50 kb 이하이지만, 이러한 kb 길이 범위가 적합하다.
표지된 절편의 신호(들)를 표지된 핵산 중합체의 상응하는 신호와 비교하는 것은, 예를 들어 표지되고 서열 분석된 절편의 서열 특이적 모티프 표지가 표지된 핵산 중합체의 상응하는 서열 특이적 모티프 표지와 일치하여 놓여지도록, 하나 이상의 표지되고 서열 분석된 절편을 표지된 핵산 중합체에 대항하여 정렬시킴으로써 수행한다. 이로써, 사용자는 개개의 절편을 확인시켜 줄 수 있는 "바코드"로서 상기 절편 상의 표지를 효과적으로 활용할 수 있게 된다. 따라서, "부모" 핵산 중합체 상의 상응하는 바코드에 대항하여 바코드된 콘틱을 매칭시킴으로써, 사용자는 "부모" 핵산 중합체 내의 바코드된 콘틱의 위치 (및 배향)를 결정할 수 있다.
이러한 방식으로, 상기 절편 상의 표지로부터의 하나 이상의 신호를 "모" 중합체 상의 상응하는 표지와 정렬시킴으로써, 사용자는 해당 절편의 적당한 정렬을 결정할 수 있다. 이러한 공정을 다중 절편에 대해 반복함으로써, 사용자는 이러한 절편의 적당한 순서 및 배향을 결정하여 핵산 중합체를 대규모로 병행 서열 분석할 수 있게 된다.
상기 공정이 도 6에 추가로 도시되어 있는데, 이 도면은 핵산 중합체로부터 게놈 스캐폴딩 (scaffolding) (예: 서열) 어셈블리 정보를 수득하는 본 발명의 방법이 도시되어 있다.
상기 도면에 도시된 바와 같이, 사용자는 중합체 (1 kb 내지 100 mb 이하 또는 그 초과)로부터 비교적 긴 게놈 DNA 분자를 추출하고; 예를 들어, 분자 게놈의 특별한 영역을 나타내는 시그네처 "관찰된 바코드" ("Raw Images of OBSERVED BARCODE"로서 도시됨)를 생성하기 위해 선형화된 장 중합체를 따라 검출 및 기록되는 서열 특이적 신호를 창출시키도록 본원에 기재된 표지화 방법에 따라서 해당 분자를 표지하며; 상기 분자는 게놈을 나타낼 수 있다. 이어서, 개개의 분자로부터 관찰된 바코드를 비교적 긴 스캐폴드 내로 어셈블리할 수 있는데, 스캐폴드는 본래 게놈의 크기 정도일 수 있다.
별개의 절편 (몇몇 양태에서는 "콘틱"이다; 약 5 내지 약 30 kb)은 현재의 서열 분석 기술에 의해 생성된 부분 중복성 짧은 염기 판독물을 기준으로 하여 컴퓨터 이용하여 어셈블리할 수 있다. 이러한 콘틱은 무작위일 수 있거나 또는 서열 특이성을 기준으로 하여 생성될 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 게놈을, 예를 들어 50 bp 내지 1000 bp 이하의 콘틱이 되도록 단편화시킬 수 있다. 이때, 사용자는 약 35 내지 약 850 bp의 수 많은 (백만개) 짧은 판독물을 생성시킬 수 있다.
하나 이상의 콘틱을, 일련의 바코드를 생성시키기 위해 "부모" 핵산 중합체를 표지하는 데 사용되어 온 서열 특이적 모티프와 동일한 서열 특이적 모티프 (예: Nb.BbvCI 부위, GCTGAGG)로 표지하는 것이 적합하다. 이러한 콘틱을 사실상 표지한 경우 (즉, 컴퓨터를 통하여 이루어짐), 바코드는 컴퓨터 내에서의 바코드로 간주된다.
이어서, 사용자는 콘틱 (절편)의 바코드를, 실험적으로 구축된 스캐폴드의 상응하는 관찰된 바코드에 대항하여 정렬시키고, 이러한 정렬은 스캐폴드 내에서의 콘틱의 적당한 배향과 함께, 스캐폴드 내에서의 콘틱의 물리적 위치를 사용자에게 제공해준다. 이로써 결국에는, 스캐폴드 (및 상응하는 게놈)에 관한 정보, 예를 들어 스캐폴드 내에서의 서열의 카피 수, 구조적 정보 (예: 해독) 등이 산출된다. 따라서, 개개의 콘틱을 게놈 상으로 정확하게 지도화하여, 분석 중인 특이적 중합체의 정확하면서도 진짜 게놈 서열 분석 정보를 생성시킨다.
이들 방법은 기존의 서열 분석 기술에 비해 수많은 이점을 지니고 있는데, 이에는 카피 수에 관한 정보를 제공할 수 있는 능력 및 서로에 대해 적당한 위치/순서로 콘틱을 배치시킬 수 있는 능력이 포함된다. 이로써 결국에는, 진짜 서열 분석 정보가 제공되고; 본원에 기재된 바코딩 기술을 사용하지 않고서도, 특히 (신생 서열 분석)에 대항하여 비교하기 위한 선행 참고 데이터베이스가 존재하지 않을 경우에는, 분석된 게놈을 따라 놓여진 콘틱의 선형 순서가 공지되어 있지 않을 것이다. 카피 수 변이 (CNV) 및 구조적 변이 (SV)를 나타내는 대형 게놈은 고도로 복잡하기 때문에, 특히 신생 서열 분석 또는 고도로 스크램블된 암 게놈에 대해 보다 더 짧은 무작위 판독물로부터 직접 독립적으로 어셈블리하는 것은 점점 더 어려워지고 에러가 생기는 것으로 밝혀졌다.
한 가지 비제한적 예로서, (공지된 서열의) 제1 절편은 바코드 A, B, 및 C를 포함할 수도 있는데, 이러한 바코드 각각은 절편 상의 서열 특이적 표지의 위치, 서열 특이적 표지의 세기 또는 둘 다에 상응한다. 따라서, 표지된 절편은 A, B 및 C 바코드에 기초한 독특한 프로파일을 제시한다. (공지된 서열의) 제2 표지된 절편은 바코드 C, D, 및 E를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 절편을, 이로부터 절편을 절단시킨 "모" 중합체에 대항하여 정렬시킴으로써, 사용자는 2개의 절편이 바코드 C에서 중복되는 것을 결정할 수 있고, 2개 절편의 서열을 합함으로써 (바코드 C에 상응하는 서열을 이중-계수하지 않음), 이러한 2개 절편이 유래되는 "모" 중합체의 서열을 결정할 수 있다. 이러한 공정이 다중 절편에 동시에 초점을 맞추도록 크기 조정함으로써, 본 발명의 방법은 장 핵산 중합체에 대한 서열 정보를 결정할 수 있게 된다.
한 가지 유사한 양태가 도 3에 도시되어 있다. 이 도면은 람다 DNA를 이용한 예를 예시하고 있고, 닉카제 Nb.BbvC I에 의해 예측된 닉킹 부위가 서열 모티프에 제시되고, 긴 DNA 분자를 따라 화살표로써 표시된다. 닉킹 부위는 닉킹 부위에 혼입되는 (그린 색상으로 제시됨) 형광성 (Alexa) 뉴클레오티드 T로 표지하는데, 이는 천연 T 염기가 전위되고 대체되기 때문이다.
이러한 모델 시스템에서, 표지화의 관찰된 시그네처 "바코드" 패턴은 도 3b에 도시된 바와 같이, 80 nm x 80 nm 폭 채널 내에서 저 염 조건 하에 100% 신장된 람다 DNA를 기준으로 하여 컴퓨터 내에서 닉킹 효소 분해 (본원에서 컴퓨터 내에서의 BARCODE로 명명됨)를 이용하여 생성된 게놈의 예측된 서열 모티프 지도와 일치한다. 17개의 표지된 부위 (형광성 색상) 전반에 걸쳐 완전히 신장되는 (약 170 Kbp) 선형화 인간 BAC 클론 DNA 상에 제시된 유사한 바코드 결과가 또한 제시된다.
<부가의 예 및 양태>
부가의 양태
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 청구된 발명은 특히, DNA 지도화 및 서열 분석에 관한 방법을 제공하는데, 이에는 장 게놈 DNA를 제조하는 방법; 개개의 DNA 분자의 직접적인 영상화 및 나노채널 (직경 <500 nm) 내부의 단일 DNA 분자 상의 다형성 부위 또는 다중 서열 모티프의 국재화에 기초한 DNA 바코딩 전략 및 서열 특이적 태그화 방법이 포함된다. 상기 방법은 또한, DNA 지도의 환경 내에서, 지속적인 염기별 서열 분석 정보를 제공한다. 기존의 방법과 비교해서, 본원에 청구된 DNA 지도화 방법은 개선된 표지화 효율, 보다 안정적인 표지화, 고 민감도 및 보다 우수한 해상도를 제공하고; 본 발명의 DNA 서열 분석 방법은 장 주형 환경 하에 염기 판독물을 제공하고, 어셈블리가 용이하며, 기타 서열 분석 기술로부터 입수 가능하지 않은 정보 (예: 반수체, 및 구조적 변이)를 제공해준다.
DNA 지도화 적용에서는, 개개의 게놈 DNA 분자 또는 장-범위 PCR 단편을 특이적 서열 모티프에서 형광성 염료로 표지한다. 이와 같이 표지한 DNA 분자를 나노채널 (본원에 기재됨) 내부에서 선형 형태가 되도록 신장시키고, 형광 현미경검사법을 이용하여 영상화한다. DNA 주쇄를 기준으로 하여 형광성 표지의 위치를 결정하고, 몇몇 경우에는 형광성 표지의 색상을 결정함으로써, 패키지 상의 바코드와 유사한 정확도로 서열 모티프의 분포도를 확립시킬 수 있다. 이러한 DNA 바코딩 방법을 람다 파아지 DNA 분자의 확인 및 인간 bac-클론에 적용한다.
dsDNA 상의 특이적 서열 부위에서의 닉을 활용하는 한 가지 양태는
a) 장 (예를 들어, 2 kb 초과) 이중 가닥 게놈 DNA 분자의 1개 가닥을 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제로 닉킹하여 특이적 서열 모티프에 닉을 도입하는 단계;
b) DNA 폴리머라제를 이용하여 닉에 형광성 염료-표지된 뉴클레오티드를 혼입하는 단계;
c) 상기 표지한 DNA 분자를 나노채널 내부에서 선형 형태가 되도록 신장시키는 단계 (상기 분자는 채널을 통하여 유동되거나 또는 분자의 일부가 고정화되어 DNA의 한쪽 말단이 채널 내부에 배치되도록 한다); 및
d) 형광 현미경검사법을 이용하여 DNA 주쇄를 기준으로 한 형광성 표지의 위치를 결정하여 이러한 DNA의 지도 또는 바코드를 수득하는 단계
를 포함한다.
서열 특이적 닉킹 부위에 플랩 서열을 수반한 또 다른 양태는
a) 장 (>2 kb) 이중 가닥 게놈 DNA 분자의 1개 가닥를 닉킹 엔도뉴클레아제로 닉킹하여 특이적 서열 모티프에 닉을 도입하는 단계;
b) DNA 폴리머라제를 이용하여 닉에 형광성 염료-표지된 뉴클레오티드 또는 비-형광성 염료-표지된 뉴클레오티드를 혼입하여, 하류 가닥을 전위시켜 플랩 서열을 생성시키는 단계;
c) 표지된 뉴클레오티드의 폴리머라제 혼입에 의해, 또는 형광성 프로브의 직접적인 혼성화에 의해, 또는 형광성 프로브를 리가제로 연결시킴으로써, 플랩 서열을 표지하는 단계;
d) 상기 표지한 DNA 분자를 본원에 기재된 바와 같이 선형 형태가 되도록 신장시키는 단계; 및
e) 형광 현미경검사법을 이용하여 DNA 주쇄를 기준으로 한 형광성 표지의 위치를 결정하여 이러한 DNA의 지도 또는 바코드를 수득하는 단계
를 포함한다.
서열 특이적 닉킹 부위에 ssDNA 갭을 활용하는 또 다른 양태는
a) 장 (>2 kb) 이중 가닥 게놈 DNA 분자의 1개 가닥를 닉킹 엔도뉴클레아제로 닉킹하여 특이적 서열 모티프에 닉을 도입하는 단계;
b) DNA 폴리머라제를 이용하여 닉에 형광성 염료-표지된 뉴클레오티드 프로브 또는 비-형광성 염료-표지된 뉴클레오티드를 혼입하여, 하류 가닥을 전위시켜 하나 이상의 플랩 서열을 생성시키는 단계;
c) 닉킹 엔도뉴클레아제를 이용하여 새로이 연장된 가닥을 닉킹하고 새로이 형성된 플랩 서열을 플랩 엔도뉴클레아제로 절단하는 단계 (분리된 ssDNA는, 예를 들어 그들의 결합이 방출되도록 온도를 상승시킴으로써 제거할 수 있다);
d) 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 통하여, 또는 형광성 프로브의 직접적인 혼성화에 의해, 또는 형광성 프로브를 리가제로 연결시킴으로써, ssDNA 갭 (닉킹 및 후속 플랩의 형성에 의해 발달됨)을 표지하는 단계;
e) 상기 표지한 DNA 분자를 본원에 기재된 바와 같이 선형 형태가 되도록 신장시키는 단계; 및
f) 형광 현미경검사법을 이용하여 DNA 주쇄를 기준으로 한 형광성 표지의 위치를 결정하여 이러한 DNA의 지도 또는 바코드를 수득하는 단계
를 포함한다.
기타 DNA 서열 분석 적용에서는, 개개의 게놈 DNA 분자 또는 장-범위 PCR 단편을 특이적 서열 모티프에서 형광성 염료로 표지한다. 이어서, 이와 같이 표지한 DNA 분자를 나노채널 내부에서 선형시킨 다음, 형광 현미경검사법을 이용하여 영상화한다. DNA 주쇄를 기준으로 하여 형광성 표지의 위치 및 색상을 결정함으로써, 바코드를 판독하는 것과 유사한 방식으로 정확하게 서열 모티프의 분포도를 확립시킬 수 있다. 단일 또는 다중 염기 정보를 DNA 지도의 맥락 하에 수득한다.
게놈 DNA에 적용 가능한 상기 서열 분석 방법의 한 가지 양태는
a) 장 (>2 kb) 이중 가닥 게놈 DNA 분자의 1개 가닥를 닉킹 엔도뉴클레아제로 닉킹하여 특이적 서열 모티프에 닉을 도입하는 단계;
b) 닉-혼입, 플랩 표지화, ssDNA 갭 표지화, 또는 이의 몇몇 조합을 통하여, 닉킹 부위를 형광성 염료 분자로 태그화하는 단계;
c) 상기 표지한 DNA 분자를 본원에 기재된 바와 같이 선형 형태가 되도록 신장시키는 단계;
d) 형광 현미경검사법을 이용하여 DNA 주쇄를 기준으로 한 형광성 표지의 위치를 결정하여 이러한 DNA의 지도 또는 바코드를 수득하는 단계; 및
e) 닉킹 부위를 서열 분석 반응의 개시 지점으로서 사용하는 단계 (다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 상이한 DNA 구조가 DNA 서열 분석에 유용하다)
를 포함한다.
한 가지 서열 분석 양태에서, 폴리머라제는 닉킹 부위의 3' 말단에 형광성 뉴클레오티드를 혼입하여, 이와 같이 혼입된 표지를 각 닉킹 부위에서 순차적으로 검출하여 서열 정보를 수득한다. 이러한 공정을 반복/주기화하여 많은 염기에 대한 "판독치"를 순차적으로 수득한다.
또 다른 양태에서는, 서열 분석 프라이머를 플랩 서열과 혼성화하고, 폴리머라제를 이용하여 연장시켜 형광성 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 이들 혼입된 각종 형광성 뉴클레오티드의 색상을 판독함으로써, 서열 정보를 추론한다. 이러한 공정을 반복/주기화하여 많은 염기 판독치를 순차적으로 수득한다.
또 다른 양태에서는, 1개의 짧은 형광성 올리고뉴클레오티드를 플랩 서열과 직접적으로 혼성화하고, 이와 같이 혼성화된 올리고의 존재로부터 서열 정보를 추론할 수 있다. 이러한 공정을 반복/주기화하여 많은 염기 판독치를 순차적으로 수득한다.
또 다른 양태에서는, 2개의 짧은 올리고뉴클레오티드를 서로 바로 옆의 플랩 서열과 혼성화한 다음, 예를 들어 리가제와 함께 연결시킨다. 연결 생성물로부터 서열 정보를 추론할 수 있다. 이러한 공정을 반복/주기화하여 많은 염기 판독치를 순차적으로 수득한다.
또 다른 양태에서는, 1개의 짧은 형광성 올리고뉴클레오티드를 닉킹 부위의 3' 말단 바로 옆과 직접적으로 혼성화한 다음, 연결한다. 이어서, 이와 같이 연결된 올리고뉴클레오티드의 존재로부터 서열 정보를 추론한다. 이러한 공정을 반복/주기화하여 많은 염기 판독치를 순차적으로 수득한다.
본 발명의 방법은 나노채널 어레이와 연계해서 수행할 수 있다. 이러한 어레이는 적합하게, 표면 물질 내에 복수 개의 채널을 갖고 있고, 이러한 채널은 트렌치 (trench) 폭이 약 500 나노미터 미만이고, 트렌치 깊이가 500 나노미터 미만이다. 적어도 몇몇 채널은 적합하게, 밀봉 재료가 위에 얹혀있어 상기 채널이 적어도 실질적으로 밀폐되도록 한다.
몇몇 양태에서, 본원에 청구된 발명은 카트릿지 또는 기타 모듈 장치를 포함한다. 이러한 카트릿지에는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 본 발명에 따르는 나노유체공학적 칩이 포함될 수 있다. 상기 카트릿지는 삽입되어 사용되고 제거될 수 있다. 본 발명의 시스템이 아닌 분석적 시스템에 유용한 카트릿지 역시 본 발명의 범위 내에 있다.
나노채널은 몇몇 양태에서, 거대분자를 그의 길이 전체에 걸쳐 수송할 수 있다. 본원에 청구된 발명의 장치는 거대분자 수송을 수행하는 데에 유용한 하나 이상의 성분을 포함할 수 있는데, 이러한 수송은 채널 전체에 걸친 압력 또는 진공 구배, 전기침투 및 동전기학에 의해 수행될 수 있다.
나노채널의 표면 물질은 거의 모든 기질 물질, 예를 들어 도체 물질, 반도체 물질, 또는 비-도체 물질로부터 형성될 수 있다. 도체 물질의 예에는 금속, 예를 들어 알루미늄, 금, 은 및 크롬이 포함된다. 반도체 물질의 예에는 도핑 이산화규소 및 비화갈륨이 포함된다. 비-도체 물질의 예에는 융합 실리카, 이산화규소, 질화규소, 유리, 세라믹, 및 합성 중합체가 포함된다. 전술된 것은 단지 예시일 뿐이다.
몇몇 양태에서는, 핵산 분자를 한쪽 말단에서 또는 그 근처에서 변형시킨 다음, 이를 나노채널 또는 나노트랙 (유체 통과를 제지하는 경계, 예를 들어 소수성 경계로써 한정된 영역) 내로 배치시킨다. 이러한 변형으로 인해 적합하게는, 핵산이 나노채널의 입구 또는 나노채널 내에 구속될 수 있다.
이어서, 나노채널로 인한 선형화 형태를 차용하도록 상기 핵산을 제한한다. 핵산은 적합하게, DNA 또는 RNA, 예를 들어 dsDNA이다. 나노채널은 2000개 초과 염기를 수반한 선형화 핵산을 수용할 수 있는 길이, 바람직하게 <500 nm, 보다 바람직하게 <300 nm, 가장 바람직하게 <150 nm를 갖는다.
다음 양태가 또한 나노트랙에 적용되는데, 이는 화학적 또는 위상기하학적으로 미리 한정된 표면 패턴 상에 한정된 선형 영역이다.
본 발명의 시스템에 의해 분석될 수 있는 유체에는 포유류로부터의 유체 (예: DNA, 세포, 혈액, 생검 조직), 합성 거대분자, 예를 들어 중합체, 및 자연계에서 발견되는 물질 (예: 식물, 동물 및 기타 생명체 형태로부터 유래된 물질)이 포함된다. 이러한 유체는 본 발명의 자동화 또는 수동 부하 장치를 이용하여 관리, 부하 및 주사할 수 있다.
< 실시예 >
실시예 1: 이중 가닥 DNA 분자 상에 단일 가닥 DNA 플랩을 생성시킴
게놈 DNA 샘플을 닉킹 반응에 사용하기 위해 50 ng이 되도록 희석시켰다. 10 ㎕의 람다 DNA (50 ng/㎕)를 0.2 ml PCR 원심분리용 튜브에 가한 다음, 2 ㎕의 10X NE 완충제 #2 및 3 ㎕의 닉킹 엔도뉴클레아제, 비제한적으로 예를 들어 Nb.BbvCI; Nb.BsmI; Nb.BsrDI; Nb.BtsI; Nt.AlwI; Nt.BbvCI; Nt.BspQI; Nt.BstNBI; Nt.CviPII를 가하였다. 이 혼합물을 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다.
닉킹 반응을 완료한 후, 닉킹 부위에서 제한된 폴리머라제 연장으로 실험을 진행하여 3' 하류 가닥을 전위시키고 단일 가닥 플랩을 형성하였다. 플랩 생성 반응 혼합물은 2 ㎕의 10 X 완충제, 0.5 ㎕의 폴리머라제 [이에는 vent(엑손-), Bst 및 Phi29 폴리머라제가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다] 및 1 μM 내지 1 mM의 각종 농도의 1 ㎕ 뉴클레오티드를 함유하는 5 ㎕의 혼입 혼합물 및 15 ㎕의 닉킹 생성물로 이루어졌다. 플랩 생성 반응 혼합물을 55℃ 하에 항온 배양하였다. 플랩의 길이는 항온 배양 시간, 이용된 폴리머라제 및 사용된 뉴클레오티드의 양에 의해 제어되었다.
실시예 2: 이중 가닥 DNA 분자 상에 단일 가닥 DNA 갭을 생성시킴
플랩 생성 후, 본래의 닉킹 엔도뉴클레아제를 사용하여 충전된 이중 가닥 DNA를 닉킹하였고, 플랩 엔도뉴클레아제 (FEN1이 비제한적으로 포함된다)를 사용하여 플랩 서열을 절단하였다. 온도를 증가시킴으로써, 닉킹된 단일 가닥 DNA 분자를 이중 가닥 DNA 분자로부터 제거하여 이중 가닥 DNA 분자 상에 단일 가닥 DNA 갭을 생성시켰다.
실시예 3: 장 단일 가닥 DNA 분자를 생성시킴
닉킹 반응을 완료한 후, 닉킹 부위에서 완전한 폴리머라제 [이에는 Phi29, Bst 폴리머라제가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다] 연장으로 실험을 진행하여 3' 하류 가닥을 전위시키고 단일 가닥 DNA 분자를 형성하였다.
실시예 4: 이중 가닥 DNA 분자 상에서 서열 특이적 닉을 형광성 표지하는 방법
게놈 DNA 샘플을 닉킹 반응에 사용하기 위해 50 ng이 되도록 희석시켰다. 10 ㎕의 람다 DNA (50 ng/㎕)를 0.2 ml PCR 원심분리용 튜브에 가한 다음, 2 ㎕의 10X NE 완충제 #2 (공급처: New England BioLabs, www.neb.com) 및 3 ㎕의 닉킹 엔도뉴클레아제, 비제한적으로 예를 들어 Nb.BbvCI; Nb.BsmI; Nb.BsrDI; Nb.BtsI; Nt.AlwI; Nt.BbvCI; Nt.BspQI; Nt.BstNBI; Nt.CviPII를 가하였다. 이 혼합물을 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다.
닉킹 반응을 완료한 후, 폴리머라제 연장으로 실험을 진행하여 염료 뉴클레오티드를 닉킹 부위 상으로 혼입하였다. 한 양태에서는, 단일 형광성 뉴클레오티드 종결인자를 혼입하였다. 또 다른 양태에서는, 다중 형광성 뉴클레오티드를 혼입하였다.
혼입 혼합물은 2 ㎕의 10 X 완충제, 0.5 ㎕의 폴리머라제 [이에는 vent(엑손-)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다], 1 ㎕ 형광성 염료 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 종결인자 [이에는 cy3, 알렉사 (alexa) 표지된 뉴클레오티드가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다]를 함유하는 5 ㎕의 혼입 혼합물 및 15 ㎕의 닉킹 생성물로 이루어졌다. 이러한 혼입 혼합물을 55℃ 하에 약 30분 동안 항온 배양하였다.
실시예 5: 이중 가닥 DNA 분자 상에 단일 가닥 DNA 플랩을 서열 특이적 표지하는 방법
일단 플랩 서열이 생성되면, 이러한 플랩을 형광성 염료 분자로 표지할 수 있는데, 이에는 다음 방법이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 프로브의 혼성화, 폴리머라제를 이용한 형광성 뉴클레오티드의 혼입 및 형광성 프로브의 연결.
실시예 6: 이중 가닥 DNA 분자 상에 단일 가닥 DNA 갭을 서열 특이적 표지하는 방법
염색된 게놈 DNA를 함유하는 완충제 용액과의 모세관 작용을 이용하여 폭, 깊이, 또는 둘 다가 500 nm 이하인 나노유체공학적 칩을 충전시켜 DNA 거대분자를 전기장이 있는 채널 내로 끌어당겼다. 세균 파아지 DNA 분자 람다 (48.5 kb) 및 인간 BAC 클론 (170 kb)을 염료 YOYO-1로 염색하였다. 이러한 염색된 DNA의 용액을, 항산화제로서 0.1 M 디티오트레이톨을 함유하고 항부착제로서 사용된 0.1%의 선형 아크릴아미드를 함유하는 0.5 X TBE 내로 희석시켜 0.5 ㎍/ml이 되도록 하였다.
100X (N.A.1.35) 오일 침지 대물렌즈가 장착된 올림푸스 (Olympus) Ix-71 도립 현미경을, 상이한 여기 파장 (예를 들어, YOYO-1 염료의 경우에는 473 nm)을 가질 수 있는 고체-상태 레이저 (예: 다이오드 펌핑된 고체 상태 레이저)와 함께 사용하였다. 기타 레이저 (예: 알렉사 시리즈의 염료, Cy3, Cy5 등)에는 532 nm DPSS 레이저, 635 레이저 다이오드 레이저, 543 nm 기체 레이저, 591 nm DPSS 레이저 및 633 nm 기체 레이저가 포함된다. 512 X 512 픽셀 (pixel) 어레이 및 16 비트 디지털 출력을 나타내는 ANDOR 쿨링된-EMCCD 카메라를 사용하여 분자를 영상화하였다. J-영상 및 기타 분석 소프트웨어에 의해 데이터 프로세서를 이용하여 디지털 영상을 분석하였다.
실시예 7: 검출 도식
검출 도식의 한 가지 예에서, 유동 방식으로 움직이는 DNA의 비디오 영상을 시간 지연 및 통합 (TDI) 카메라로 포착하였다. 이러한 양태에서는, DNA의 움직임이 TDI와 동시에 일어난다.
검출 도식의 또 다른 예에서는, 유동 방식으로 움직이는 DNA의 비디오 영상을 CCD 또는 CMOS 카메라로 포착하고, 프레임을 소프트웨어 또는 하드웨어에 의해 통합시켜 DNA의 영상을 확인하고 재구축하였다.
검출 도식의 또 다른 예에서는, 별개 세트의 센서 상에서 상이한 파장을 동시에 포착함으로써, DNA의 비디오 영상을 수집하였다. 이는 하나의 카메라 및 이중 또는 다중-시각 스플리터 (splitter)를 이용하거나 또는 필터 및 다중 카메라에 의해 사용함으로써 수행하였다. 카메라는 TDI, CCD 또는 CMOS 검출 시스템일 수 있다.
또 다른 예에서는, 동시의 다중 파장 비디오 검출을 이용하여, 주쇄 염료를 사용하여 독특한 DNA 단편을 확인하고, 표지를 마커로서 사용하여 DNA 움직임을 주시하였다. 이는 DNA의 길이가 카메라의 시야 보다 더 클 경우에 유용하고, 마커는 재구축된 DNA 영상을 지도화하는 것을 도와주는 작용을 할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BIONANOMATRIX, INC. Xiao, Ming Deshpande, Parikshit A. Cao, Han Austin, Michael D. Vijayan, Kandaswamy Sharonov, Alexey Boyce-Jacino, Michael <120> METHODS AND DEVICES FOR SINGLE-MOLECULE WHOLE GENOME ANALYSIS <130> BNMX-0032 <140> PCT/US 09/049244 <141> 2009-06-30 <150> 61/076,785 <151> 2008-06-30 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 tgaggtttgc accggtgtgg ctccggaagt taacgctaaa gcactggcct g 51 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 caccctgctt gctgaggttt gcaccggtgt ggctccggaa gttaacgcta aagcactggc 60 ctggggaaaa cagtacg 77 <210> 3 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 3 gtgggacgaa cgactccaaa cgtggccaca ccgaggcctt caattgcgat ttcgtgaccg 60 gacccctttt gtcatgc 77 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 caccctgctt gc 12 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 gggaaaacag tacg 14 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 acgtgggaaa 10

Claims (58)

  1. 제1 DNA 가닥과 제2 DNA 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA를 프로세싱하여, 제1 DNA 가닥의 혼성화되지 않은 플랩 (flap) 및 제2 DNA 가닥 상의 상응하는 영역을 생성시키는 단계 (혼성화되지 않은 플랩은 1 내지 약 1000개 염기를 포함함);
    제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 제1 DNA 가닥을 연장시키는 단계; 및
    혼성화되지 않은 플랩의 적어도 일부, 상기 연장된 제1 DNA 가닥의 일부, 또는 둘 다를 표지하는 단계
    를 포함하는, DNA를 명확히 규명하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 프로세싱이 제1 DNA 가닥을 닉킹 (nicking)하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 닉킹을 하나 이상의 서열 특이적 위치에서 수행하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 닉킹을 하나 이상의 비-특이적 위치에서 수행하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 이중 가닥 DNA를 닉킹 엔도뉴클레아제, 전자기 방사선, 자유 라디칼, 또는 그의 임의의 조합에 노출시킴으로써 닉킹을 수행하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 제1 DNA 가닥을 연장시키는 단계가 제1 DNA 가닥을 폴리머라제, 하나 이상의 뉴클레오티드, 리가제, 또는 그의 임의의 조합과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표지하는 것을 (a) 하나 이상의 태그를 포함하는 하나 이상의 상보적 프로브를 혼성화되지 않은 플랩의 적어도 일부와 결합시키는 것, (b) 하나 이상의 태그를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 이용하여, 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 제1 DNA 가닥을 연장시키는 것, 또는 (a)와 (b)의 임의의 조합에 의해 수행하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 태그로부터 유래된 서열 정보를 수득하는 것을 더 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 서열 정보가 이중 가닥 DNA 상의 2개 이상의 위치로부터 유래되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 표지하는 것이 형광단, 양자 도트, 덴드리머 (dendrimer), 나노와이어, 비드, 펩티드, 단백질, 자기 비드, 메틸 기, 메틸트랜스퍼라제, 비-절단성 제한 효소, 아연-핑거 단백질, 항체, 전사 인자, DNA 결합성 단백질, 헤어핀 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고데옥시뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 태그를 부착시키는 것을 포함하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 하나 이상의 태그로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 신호가 형광성 신호, 화학발광성 신호, 전자기 신호, 전기 신호, 전위차, 물리적 크기 차이, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 신호가 제1 DNA 가닥을 연장시키기 위해 사용된 염기 상의 태그와 플랩 상에 있는 프로브 상의 태그 간의 형광 공명 에너지 전이로부터 유래되거나, 플랩 상에 있는 프로브 상의 2개 이상의 태그 간의 형광 공명 에너지 전이에 의해 유래되거나, 또는 그의 임의의 조합에 의해 유래되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 플랩이 이중 가닥 DNA 상의 관심있는 염기 서열의 적어도 일부를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 제1 DNA 가닥의 혼성화되지 않은 플랩, 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역, 또는 둘 다가 이중 가닥 DNA 상의 관심있는 염기 서열을 플랭킹하는 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 포함하는 것인 방법.
  16. 제10항에 있어서, 혼성화되지 않은 플랩, 제1 DNA 가닥의 연장된 영역의 일부, 또는 둘 다를 포함하는 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 적어도 부분적으로 선형화시키는 것을 더 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 2개 이상의 태그 간의 거리를 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 거리를 구조, 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 메틸화 패턴, cpG 섬의 위치, 후생게놈 패턴, 생리학적 특징, 또는 그의 임의의 조합과 상관짓는 것을 더 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, DNA를 채널 내에 국한시켜 선형화를 수행하는 방법.
  20. 제10항에 있어서, 하나 이상의 태그로부터 하나 이상의 신호 세기를 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 신호 세기를 구조, 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 메틸화 패턴, 생리학적 특징, cpG 섬의 위치, 후생게놈 패턴, 또는 그의 임의의 조합과 상관짓는 것을 더 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, DNA로부터 후생게놈 정보를 수득하는 것을 더 포함하는 방법.
  23. 제1 이중 가닥 DNA 상에서, 제1 DNA 상의 2개 이상의 서열-특이적 위치를 표지하는 단계;
    제2 이중 가닥 DNA 상에서, 제2 DNA 상의 2개 이상의 상응하는 서열-특이적 위치를 표지하는 단계;
    제1 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계;
    제2 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 및
    제1의 선형화된 이중 가닥 DNA 상의 2개 이상의 표지들 간의 거리를, 제2의 선형화된 이중 가닥 DNA 상의 상응하는 표지들 간의 거리와 비교하는 단계
    를 포함하는, DNA를 명확히 규명하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 표지하는 단계를 (a) 제1 가닥의 혼성화되지 않은 플랩 및 (b) 이중 가닥 DNA의 제2 가닥에 상응하는 영역을 생성시키도록 이중 가닥 DNA의 제1 가닥을 닉킹함으로써 수행하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 플랩을 프로브의 적어도 일부에 대해 상보적인 표지된 프로브에 노출시키는 것; 하나 이상의 표지된 염기를 이용하여 제2 가닥의 상응하는 영역을 따라 DNA의 제1 가닥을 연장시키는 것, 또는 둘 다를 더 포함하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 표지하는 단계를, 제1 및 제2 이중 가닥 DNA를 비-절단성 제한 효소, 메틸트랜스퍼라제, 아연-핑거 단백질, 항체, 전사 인자, DNA 결합성 단백질, 헤어핀 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고데옥시뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 또는 그의 임의의 조합에 노출시킴으로써 수행하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 비-절단성 제한 효소가 태그를 포함하는 것인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 거리를 DNA의 구조, 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 메틸화 패턴, 생리학적 특징, cpG 섬의 위치, 후생게놈 패턴, 또는 그의 임의의 조합과 상관짓는 것을 더 포함하는 방법.
  29. 제23항에 있어서, DNA로부터 후생게놈 정보를 수득하는 것을 더 포함하는 방법.
  30. 제1 이중 가닥 DNA 상에서, 제1 이중 가닥 DNA 상의 하나 이상의 서열-특이적 위치를 표지하는 단계;
    제2 이중 가닥 DNA 상에서, 제2 이중 DNA 상의 하나 이상의 상응하는 서열-특이적 위치를 표지하는 단계;
    제1 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계;
    제2 이중 가닥 DNA의 적어도 일부를 선형화시키는 단계; 및
    제1의 선형화된 이중 가닥 DNA의 표지의 신호 세기를, 제2의 선형화된 이중 가닥 DNA의 표지의 신호 세기와 비교하는 단계
    를 포함하는, DNA를 명확히 규명하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 표지하는 단계를 (a) 제1 가닥의 혼성화되지 않은 플랩 및 (b) 이중 가닥 DNA의 제2 가닥에 상응하는 영역을 생성시키도록 이중 가닥 DNA의 제1 가닥을 닉킹함으로써 수행하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 플랩을 프로브의 적어도 일부에 대해 상보적인 표지된 프로브에 노출시키는 것; 하나 이상의 표지된 염기를 이용하여 제2 DNA 가닥의 상응하는 영역을 따라 DNA의 제1 가닥을 연장시키는 것, 또는 둘 다를 더 포함하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 신호 세기를 DNA의 구조, 서열 어셈블리, 유전자 또는 세포유전자 지도, 메틸화 패턴, 생리학적 특징, cpG 섬의 위치, 후생게놈 패턴, 또는 그의 임의의 조합과 상관짓는 것을 더 포함하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, DNA로부터 후생게놈 정보를 수득하는 것을 더 포함하는 방법.
  35. 내부에 하나 이상의 협착이 배치된 채널을 따라 그로부터 연장되는 하나 이상의 플랩을 포함하는 거대분자를 전위시키는 단계; 및
    상기 채널의 하나 이상의 협착을 통한 거대분자의 하나 이상의 플랩의 통과에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계
    를 포함하는, 거대분자를 명확히 규명하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 플랩이 표지를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 거대분자가 표지를 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 신호가 광학 신호, 전기 신호, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 거대분자가 이중 가닥 DNA 또는 염색질 섬유를 포함하는 것인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 하나 이상의 협착을 통하여 하나 이상의 플랩을 1회 넘게 전위시키는 것을 더 포함하는 방법.
  41. 거대분자의 적어도 일부를 표지하는 단계;
    이러한 거대분자를 고정화시키는 단계;
    거대분자의 적어도 일부가 채널 내에서 선형화되도록 거대분자의 적어도 일부를 이러한 채널 내에 배치하는 단계; 및
    거대분자의 표지된 일부와 관련된 하나 이상의 신호를 검출하는 단계
    를 포함하는, 거대분자를 명확히 규명하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 거대분자가 하나 이상의 비드와 결합하고, 이 하나 이상의 비드에 의해 고정화되는 분자는 비드 보다 단면적이 더 작은 협착에 의해 유발되는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 고정화시키는 단계를, 거대분자를 표면에 화학적으로 구속하거나, 거대분자를 자기적으로 고정화시키거나, 거대분자를 광학적으로 트랩핑하거나, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수행하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 거대분자가 하나 이상의 유전체 변형을 포함하고, 광학적 트랩에 의해 고정화되는 것인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 채널이 거대분자의 선형화를 수행하도록 크기 조정되는 것인 방법.
  46. 폭 범위가 약 1 내지 약 100 나노미터인 하나 이상의 채널을 포함하는 기질을 포함하고, 상기 기질은 주변 매질과 비교해서 거대분자를 선택적으로 고정화시킬 수 있는 하나 이상의 영역을 포함하는 것인, 분석 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 채널이 폭 범위가 약 10 내지 약 50 나노미터인 분석 시스템.
  48. 제46항에 있어서, 고정화 영역이 자기 영역, 화학적 활성 영역, 협착, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 분석 시스템.
  49. 제46항에 있어서, 선택적으로 고정화된 거대분자의 적어도 일부가 하나 이상의 채널 내로 배치되도록 구배를 적용할 수 있는 장치를 더 포함하는 분석 시스템.
  50. 핵산 중합체의 하나 이상의 영역을 하나 이상의 서열-특이적 모티프 표지로 표지하는 단계;
    하나 이상의 서열-특이적 모티프 표지로부터의 하나 이상의 신호를 핵산 중합체의 하나 이상의 서열-특이적 모티프 표지의 위치와 상관짓는 단계;
    핵산 중합체의 하나 이상의 절편 (이러한 하나 이상의 절편은 핵산 중합체의 하나 이상의 서열 특이적 모티프 표지를 포함함)을 서열 분석하는 단계; 및
    하나 이상의 서열 분석된 절편의 하나 이상의 신호를, 상기 표지된 핵산 중합체의 하나 이상의 상응하는 신호와 비교하여, 2개 이상의 서열 분석된 절편의 핵산 중합체 내에서의 상대적 위치를 발생시키는 단계
    를 포함하는, 핵산 중합체를 명확히 규명하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 표지하는 단계를, 핵산 중합체에 플랩을 형성시키고, 이러한 플랩, 이 플랩에 의해 비워진 영역, 또는 그의 임의의 조합을 표지함으로써 수행하는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상관짓는 단계가 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부를 선형화시키는 것을 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 선형화시키는 것이 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부를, 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부를 선형화시킬 수 있는 채널에 배치하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제48항에 있어서, 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부를 선형화시키도록 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부에 구배를 적용하여, 핵산 중합체의 하나 이상의 표지된 일부를 선형 형태로 유지시키는 것, 또는 그의 임의의 조합을 더 포함하는 방법.
  55. 제50항에 있어서, 상관짓는 단계가 2개 이상의 표지들 간의 거리를 결정하는 것, 2개 이상의 표지로부터 점진적으로 발달된 신호 세기를 비교하는 것, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  56. 제50항에 있어서, 서열 분석이 생어 (Sanger) 서열 분석, 맥삼-길버트 (Maxam-Gilbert) 서열 분석, 염료 종결인자 서열 분석, 시험관내 클로날 증폭, 합성에 의한 서열 분석, 혼성화에 의한 서열 분석, 연결에 의한 서열 분석, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  57. 제50항에 있어서, 절편이 약 5 내지 약 30 킬로염기를 포함하는 것인 방법.
  58. 제47항에 있어서, 비교가, 표지되고 서열 분석된 절편의 서열 특이적 모티프 표지가 표지된 핵산 중합체의 상응하는 서열 특이적 모티프 표지와 일치하여 놓여지도록, 하나 이상의 표지되고 서열 분석된 절편을 표지된 핵산 중합체에 대항하여 정렬시키는 것을 포함하는 방법.
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