JP6017458B2 - 大量並列連続性マッピング - Google Patents
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Description
本願は、2011年2月2に出願された米国特許仮出願第61/438,935号及び2011年4月7日に出願された米国特許仮出願第61/473,083号に対する優先権を主張するものであり、両出願の発明の内容は、全体が本明細書に記載された場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号3U54AI057141−06S1880509及び1R01HG006283−01の下、政府の支援を受けて為されたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
連続性情報を捕捉する方法が本明細書に提供される。連続性情報及びその情報を受け取る実施形態を、任意の適切な従来型又は第二世代のDNA配列決定技術とともに用いて、その技術とそれに関連する用途及び応用の効率及び精度を向上させ、かつその費用対効果を高めることができる。本明細書に記載の方法に従って使用することができる適切なDNA配列決定技術としては、特に限定されないが、「サイクリックアレイ(cyclic−array)」法(例えば、454パイロシーケンシング、Illumina Genome Analyzer、AB SOLiD及びHeliScope)、ナノポアシーケンシング法、DNA合成のリアルタイム監視、電子顕微鏡による配列決定、ジデオキシ停止/電気泳動法、微小電気泳動法、ハイブリダイゼーションによる配列決定ならびに質量分光測定法が挙げられる。
上述のように、標的DNA配列をトランスポザーゼで処理すると、標的DNAは、トランスポザーゼ処理前(すなわち、断片化前)には1つ以上の空間的関係により関連していた2つ以上のDNAフラグメントに分割され得る。一実施形態では、空間的関係は隣接関係であり、この関係では、DNAフラグメントが互いに直接隣接していた(すなわち、1つのDNAフラグメントの末端が第二のDNAフラグメントの末端と連結していた)。別の実施形態では、空間的関係は区画的関係であり得、この関係では、標的DNAが、区画として分けられた2つ以上の配列セグメントを含む。このような実施形態では、トランスポザーゼによる断片化前のDNAフラグメントは、標的DNAの同じセグメント内に存在していたが、必ずしも互いに隣接していなかったものであり得る。別の実施形態では、空間的関係は離れた関係であり、この関係では、DNAフラグメント同士は断片化前に連続しても隣接してもいなかったが、特定の距離又は配列長を間にして互いに関連し合っている。上に挙げた空間的関係は、本明細書に記載の方法を用いて連続性情報を捕捉することにより決定され得る。
短距離連続性に関する情報を捕捉するために、独立し元は隣接していたリードのペア間でのin silico「結合」を後で指定することができるようにvitro転移の改変スキームを提供し、このスキームでは、任意の断片化事象の各隣接部分に由来するショットガンライブラリー分子を対称的にかつ固有にタグ付けする方法において合成トランスポゾン内の縮重バーコードを使用する。ショットガンライブラリー及び対応するバーコードの配列決定後、隣接する断片化事象を共通のバーコード配列により同定することができる。この戦略により、一次配列の内容とはほぼ完全に独立して局所的な連続性の決定が可能であるという点が重要である。
長い高精度のSangerリードを用いても、特にセグメントが重複し構造が複雑な領域においては、高品質なヒトゲノムの参照アセンブリを得るためには、BACクローンを配列決定する階層的な方法が重要であった(Landerら,2001;Waterstonら,2003;Waterstonら,2002)。したがって、いくつかの実施形態では、ゲノムの同じフォスミド/BACスケール領域に由来するショート(すなわち「ショットガン」)リード(例えば、20〜200Kb)のグループ分けにより、中距離の適合性に関する情報を捕捉することが可能な方法が提供される。この方法については実施例2で詳細に述べる。
大量並列のショートリード配列決定技術を含めたハイスループットな方法には本質的に、ヒトゲノムのセグメント重複及び構造が複雑な領域の再配列決定、二倍体及び倍数体ゲノムのハプロタイプ情報の分解ならびに複雑なゲノムのde novoアセンブリを含めたいくつかの重要な目的に関して制限がある。配列決定の1塩基当たりのコストを更に削減しても、このような目的をほとんど前進させることはない。必要とされるのはむしろ、さまざまなスケールで連続性情報を得る等しく並列的な方法である。例えば、最初のヒト及びマウスゲノムのde novoアセンブリが、ショートリードのみに基づく低品質なアセンブリより配列のカバレッジが一桁少ないにもかかわらず、高品質を達成したということ(Landerら,2001;MSGC 2002)は主として、(a)長い最初のリード長、(b)プラスミド、フォスミド及びBAC由来のメイトペアリード、(c)階層的なクローンバイクローン配列決定法ならびに(d)遺伝子地図を含めた、連続性情報の広範囲にわたる補完的な入手源を採り入れた結果である。
本明細書に記載されている連続性情報を捕捉する方法は、上記配列決定技術の使用及び応用を向上させるのに有用である。本明細書に記載の方法に従って使用し得るDNA配列決定技術の適切な応用としては、特に限定されないが、DNAメチル化を決定するビサルファイト配列決定法、再配列決定、de novoアセンブリ、エクソーム配列決定法、RNA−Seq、ChIP−Seq、染色体立体配座の推定及び全ゲノムでのクロマチン相互作用マッピングが挙げられる。いくつかの実施形態では、連続性情報を捕捉する方法を、下の実施例に詳述するように、再配列決定、de novoアセンブリ又はその両方などの応用に「サイクリックアレイ(cyclic−array)」法とともに使用し得る。
ヒトゲノムの再配列決定は比較的単純なものになっている。例えば、Bentleyら(2008)は、Illumina GAプラットフォーム(Brantonら,2008)、すなわち、無秩序なPCRコロニーの高密度アレイ上での大量並列的な合成による配列決定(sequencing−by−synthesis)法でヨルバ族の男性のゲノムを約40倍のカバレッジまで配列決定し、約400万のSNPを同定した。現在、Illumina HiSeqプラットフォームでは、それぞれから約100万のマッピング可能なペアエンドの100bpリード(PE100)が得られる7つの配列決定レーン全体で、同じ量のデータ(135ギガバイト(Gb))を8日で作成することができる。例えば、1レーン当たり3,700ドルとすると、約40倍のヒトゲノム再配列決定の推定コストは25,000ドル余りである。
再配列決定法とは対照的に、この技術を用いて高品質な哺乳動物ゲノムのde novoアセンブリを作製するまでにはまだ長い道のりがある。20Gb、すなわち2002年に2.5Gbのマウスゲノムを組み立てるのに使用された約8倍のカバレッジ(Sanger)(Waterstonら,2002)の作製が、現在ではIllumina HiSeqの1レーンで可能である(PE100、3,700ドル)。しかし、同様に複雑なヒトゲノムに約90倍のカバレッジで最高の「次世代」de novoアセンブリを行っても、N50コンティグ長が7.4Kb、N50スキャフォールド長が7.4Kb、シーケンスカバレッジがゲノムのわずか87%である(Liら,2010)。ショートリードデータでカバレッジを更に増加させたとしても、アセンブリの品質質がわずかに向上するだけであろう(Liら,2010)。それに比べて、一桁以上少ないデータに基づくマウスゲノムの最初のアセンブリでは、N50コンティグ長が25.9Kb、N50スキャフォールド長が18.6メガベース(Mb)、シーケンスカバレッジがゲノムの95%であった(Waterstonら,2002)。
DNAメチル化を測定するビサルファイト配列決定の方法が本明細書に提供される。DNAメチル化は、広く存在し多様な生物体のゲノムの調節にきわめて重要な役割を果たしているエピジェネティックな修飾である。最もよくみられ広く研究されている哺乳動物ゲノムにおけるDNAメチル化の形態は、通常はCpGジヌクレオチドとの関連でシトシン残基の5炭素位に生じるものである。マイクロアレイ及びごく最近では大量並列配列決定法により、全ゲノムスケールでシトシンメチル化(5mC)を調べることが可能になった(Zilberman及びHenikoff,2007)。しかし、例えば、特定の細胞型又は解剖学的構造におけるDNAメチル化その他のエピジェネティックな目印のin vivo研究は、最新のプロトコルで必要とされる投入材料の量が比較的多いことにより大幅に制限されている。
いくつかの実施形態により、染色体立体配座を推定する方法が提供される。この方法は、細胞内のDNAを架橋すること、クロマチン繊維を単離すること、クロマチンフラグメントを取り出し消化すること、クロマチンDNAフラグメントを精製すること、アダプターをクロマチンDNAフラグメントに連結させてクロマチンDNAフラグメント複合体を形成すること、及び隣接するクロマチンDNAフラグメント複合体のクラスター同士を対にすることにより三次元モデルを作製することを含み得る。一実施形態では、この方法は、(a)細胞内のDNAを架橋する段階と、(b)架橋DNAを細胞から単離する段階と、(c)架橋DNAを断片化する段階と、(d)断片化した架橋DNA分子の末端を表面結合プライマーに対応するアダプターで修飾する段階と、(e)断片化し末端修飾した標的DNA分子の末端を表面結合プライマーとハイブリダイズさせる段階と、(f)DNAトランスポザーゼと第二の表面結合プライマーに対応する配列とを含む非表面結合トランスポザーゼ複合体を用いて転移を実施する段階と、(g)クラスターの増幅を実施して、クローン化により生じた核酸のクラスターを作製する段階と、(h)クローン化により生じた核酸のクラスターを配列決定する段階と、(i)隣接するクラスター同士を対にすることにより、染色体上の位置間の物理的相互作用を明らかにする段階とを含み得る。いくつかの態様では、単離された架橋DNAは、架橋DNA−タンパク質複合体の一部であり得る。この場合、染色体の詳細な立体配座を推定する方法は、段階(c)の後、段階(d)の前に、1つ以上の特定の架橋DNA−タンパク質複合体を免疫沈降により濃縮する段階を更に含み得る。
連続性情報が主要な目的である
下に記載されている実施例の方法は、次世代配列決定法の分野における「盲点」に対処するものである。具体的には、この方法は、より大きい規模で連続性情報を明らかにする超低コストな方法が存在しないことに対処するものである。
連続性情報を捕捉するためのin vitro転移
実施例1〜6は技術的に多様であるが、その共通点は、さまざまな規模での連続性情報の回収を容易にする独創的な方法でゲノムDNAを物理的に粉砕する新規な手段である高密度でランダムなin vitro転移に依存していることである。この技術に対する最初の関心は、低コスト、低投入量、ショットガンライブラリーのin vitro調製に対するその潜在的有用性に基づくものであった。図1に示すように、改変Tn5トランスポザーゼが断片化及びアダプター組込みを5分間の1段階で触媒する。従来のin vitro転移では、トランスポゾンDNAに隣接する逆方向の19bpモザイク末端(ME)配列がトランスポザーゼに認識されて、溶液中で安定なホモ二量体の対合複合体を形成する。この「トランスポソーム」が標的DNA内にトランスポゾンを挿入する。ライブラリー調製に適用する場合、トランスポソームは代わりに、酵素とアダプターオーバーハングを有する遊離のME配列とで構成されるものとなる。不連続なトランスポゾンが挿入されると、非対称な5’アダプターオーバーハングを有するME配列の対称的な挿入を介して断片化が生じる。アダプターに相補的なプライマーを用いたPCR増幅により、ショットガンフラグメントライブラリーが得られる。
1.A.対称的かつ固有にタグ付けする断片化事象
ゲノムDNAを断片化すると、それが機械的方法によるものでも酵素的方法によるものでも、任意の1つの「切れ目」のどちらかの端に由来する分子の対形成に関する情報が完全に失われる。この情報を保存するために、vitro転移により導入された各切れ目に由来するフラグメントの両端に固有のバーコードを付加する方法を考案した(図4)。簡潔に述べれば、トランスポザーゼを用いて、きわめて少量のゲノムDNA内、すなわち、5個未満の一倍体ヒトゲノム相当物内への、切断制限酵素部位が隣接する縮重一本鎖「バブル」を含む合成トランスポゾンのin vitro挿入を触媒することができる。図1に記載されている方法とは対照的に、合成トランスポゾンは連続性であり、25bpの縮重配列に隣接する2つのエンドヌクレアーゼ切断部位とともに19bpのME配列を含んでいる。上の鎖と下の鎖との間で縮重領域が相補的でないため、一本鎖バブルが存在して柔軟性が増加し、2つのトランスポザーゼ単量体との対合複合体の形成を助ける。これらの合成トランスポゾンを高密度(35〜600bpごと)になるよう挿入した後、転移機序により生じた9bpの損傷部位をギャップフィル/連結反応により修復する。
隣接する断片化事象が配列決定により検出される可能性があるか否かを評価するために、10ピコグラムのヒトゲノムDNA(一倍体3個に相当)に由来するトランスポソーム断片化ショットガンライブラリーの配列決定から、約200万の固有にマッピングするリードペアを抽出した。各断片化事象の各末端で9bpの複製が生じるため、各事象のどちらかの末端に由来する分子を、9bpの重複をもたせてゲノムにマッピングするべきである。その結果、他のリードペアの「リード1」の開始部位から9bpのところで「リード2」のマッピング位置の明らかな増加がみられた(図5)。この超低投入量のライブラリーにおけるこの特徴は、これよりも多量の出発物質から作製されたライブラリーよりはるかに顕著なものであった。この9bpの重複を同じ切断点に由来するフラグメントの証拠として用いて、連続して隣接するフラグメントに由来する4〜6個のリードペアからなり、合計で約1Kb〜約2Kbにわたる鎖が同定された(図6)。
上記戦略(1.Aを参照)は、(1)断片化事象の対称的で固有なタグ付けを達成し、(2)分析時に、上記タグを利用して、隣接するトランスポソームインサートに由来する一連の配列リードペア同士を連続して繋ぐために考案した複数の関連する方法のうちの1つである。対称的なタグ付けの別のアプローチも開発されており、この方法では、タグ付けと断片化の両方が一段階でできるように、個々のトランスポザーゼに対称的にタグ付けされているが正式には不連続なオリゴヌクレオチド(すなわち、「オリゴ」)を負荷する。
別の実施形態では、細菌トランスポザーゼTn5を用いて、逆方向のモザイク末端(ME)配列が隣接した34bpの方向性のあるLoxP部位ならびに内部ビオチン化及び代替となる可能性のある配列決定プライマーを含むトランスポゾンを挿入し得る。目標挿入密度は、ほぼ10キロベースごとに1つの挿入である。
別の実施形態では、ライブラリー調製の方法として、従来のトランスポザーゼ触媒によるアダプター挿入の代わりにYアダプター法(図23)を用いてもよく、この方法で得られる種はA−B(50%)、A−A(25%)又はB−B(25%)であり、ここでA及びBは2つの異なるアダプターであり、分子の50%のみ配列決定の実行が可能である。
別の実施形態では、以下の例に示すような、2つの縮重バーコード(各鎖に)及び2組のプライマー部位ならびにいくつかの制限部位を含む合成トランスポゾンを高頻度でゲノムDNA内に挿入することができる:
ES−SbfI/AsiSI−N1/N2−バーコード−X/Y−NotI−X/Y−バーコード−N1/N2−SbfI/AsiSI−ES。
別の実施形態では、各負荷DNA配列が外側のフローセルプライマーと、縮重バーコードと、内側のシーケンシングプライマーと、二本鎖のトランスポザーゼ認識配列とからなる不連続なトランスポゾンを挿入し得る。目標挿入密度は1〜2kbごとであり得る。
別の実施形態では、サイズ選択が必要とされ得る、フラグメントサイズが約1〜2kbの標準的なバーコード付加トランスポザーゼに基づくライブラリー調製物を用いて、メイトペアライブラリーを形成し得る。
別の実施形態では、連続する合成トランスポゾンをゲノムDNA(gDNA)内に挿入した後、ギャップ修復を行い得る。次いで、DNAを40kb(又は約5kb)に剪断して使用し、それぞれ複雑なフォスミド(又はプラスミド)ライブラリーを作製する。これにより、固有のバーコードを有するか又は反復領域内への固有の挿入部位により同定されるゲノムの反復領域を、トランスポゾンにより分断することができる(図27)。
2.A.液滴特異的バーコードを用いるエマルジョンPCR法
エマルジョンPCR法は十分に確立された方法であるが、以下の方法は、液滴特異的バーコードを有するプライマーを含む試薬を含有する液滴を必要とするものである。上記試薬は、縮重配列に隣接する共通配列のエマルジョンPCRを行って、生成物をミクロン規模のビーズに回収することにより作製することができる(図8)(Dressmanら,2003)。具体的には、限界希釈を用いたエマルジョンPCR、次いでハイブリダイゼーションによる「増幅した」ビーズの濃縮により、多数のクローン的に増幅したビーズ(各ビーズは推定上固有のバーコードを有する)を作製し得る(Shendureら,2005)。このビーズを以下の方法で使用するために再び乳化することができる。クローン的に増幅したビーズを液滴1個当たり1つ含ませるとともに、共通配列及びエマルジョンPCRプライマーを適切に設計すれば、バーコード付加したアンプリコンがビーズ自体に捕捉されて回収が簡便になる。
一実施形態では(図9)、相補的な末端を有する2つの異なるサブ配列の5’ssDNA伸長を有するトランスポザーゼ認識配列を含むアダプターをトランスポソームに負荷する。これにより、関連するアダプター配列が密に散在するHMWゲノムDNAが得られる。次いで、この「予め転移を施した」分子を、液滴生成のハイスループット性を維持しつつ、剪断を最小限に抑えサイズを制御するマイクロ流体を用いて、限界希釈法でエマルジョンに区画化する(Zengら,2010)。液滴特異的バーコードを有するプライマーを用いたエマルジョンPCR法(上記2.A)により、同じHMW分子に由来する多数のフラグメントが各液滴内で増幅される。同じ液滴に由来する配列リードが最終ライブラリー内の同じバーコードと関連付けられて、20〜200Kbの各前駆体分子のin silicoグループ分け及び局所的なアセンブリが可能になる。
別の実施形態では(図10)、同様に剪断を最小限に抑えるマイクロ流体を、液滴内でのクローン化による等温での多重置換増幅(MDA)を補助する試薬とともに用いて、HMW DNAを直接エマルジョンに区画化する(Mazutisら,2009)。次いで、液滴特異的バーコードを有するプライマーを用いて、この液滴を標準的なトランスポソーム及びエマルジョンPCR用の試薬を含有する液滴と融合させる(比較的簡単で費用対効果の高いマイクロ流体装置を用いる)(上記2.A)。上にすでに記載した実施形態と同様に、得られたライブラリーの回収及び配列決定により、同じバーコードを共有するリードが同じ20〜200Kbの前駆体分子に由来することを見込んで、各分子上のショットガン一次配列及びバーコード配列の両方を調べることができる。
別の実施形態では、二本鎖DNA(dsDNA)トランスポザーゼ認識配列で終わりフローセルプライマーで始まる、プライマーが隣接する縮重単クローンバーコードオリゴヌクレオチド(すなわち「オリゴ」)でコートしたビーズを、高分子量ゲノムDNA及び遊離のトランスポザーゼを用いて乳化し得る。エマルジョン内でビーズ固定化オリゴ及び攻撃ゲノムDNAにトランスポザーゼを負荷し得る。得られたフラグメントはPCRの準備ができた状態であり、そのバーコードとともに配列決定することができる。次いで、バーコードによる関連付けを用いて、同じ前駆体分子に由来するリードをグループ分けすることができる。
別の実施形態では、内側に逆方向塩基を有し、したがって3’末端を2つ有するオリゴでビーズをコートする。ビーズから離れた方の逆方向塩基の3’側には、プライマー部位に隣接する縮重単クローンバーコード及び固定化アダプター配列(「N1プライム」)が存在する。これらを基質(例えば、HMW gDNA)及び予めオリゴ5’−N1−MEを負荷したトランスポザーゼとともに乳化する。次いで、各液滴内で転移が進行し、5’−N1−ME配列と共有結合したフラグメントが生じる。次いで、この混合物を加熱して、トランスポザーゼ酵素を不活性化し、断片化した基質を変性させる。徐冷後、転移により生じた5’−N1に隣接するフラグメントを、ビーズ結合オリゴの遊離末端にアニールさせる。次いで、各液滴内に存在する間又はエマルジョン破壊後に、耐熱性ポリメラーゼを用いてビーズ結合オリゴを伸長させる。次いで、バーコードによる関連付けを用いて、同じ前駆体分子に由来するリードをグループ分けする。
別の実施形態では、末端に連結したアダプターB’を有する長いゲノムDNA分子に、逆方向アダプターA配列がトランスポゾン認識配列の隣接したバブルを形成するバブルトランスポゾンのトランスポゾン挿入を施し得る。次いで、この分子を乳化することができ、この乳化では、微量反応物の一部が大型の分子、アダプターBで終わる単クローン縮重バーコードでコートしたビーズ及びアダプターAを含有する。次いで、PCRを実施することにより、連結したBアダプターを有する最も外側の末端がビーズ上で増幅され、固有のバーコードが付加される。
別の実施形態では、一方の側にT7ターミネーターが隣接し、他方の側にT7プロモーターが隣接するバブル構造をトランスポソームに負荷する。この構造をバルク転移により基質(例えば、HMW gDNA)内に1キロベース当たり少なくとも1か所の組込みという密度で組み込む。次いで、得られた材料を、T7 RNAポリメラーゼと、プライミング部位が隣接しT7ターミネーターより前で、組み込まれたバブル構造の一部分に相補的な配列(X)で終わる単クローン縮重バーコードを含むビーズとともに乳化する。各液滴内でin vitro転写を行い、X’で終わる得られたRNA分子をビーズに結合したその相補的な配列とハイブリダイズさせる。次いで、各液滴内で、又はエマルジョン破壊後に、逆転写を行ってビーズ結合オリゴを伸長させる。次いで、バーコードによる関連付けを用いて、同じ前駆体分子に由来するリードをグループ分けする。
別の実施形態では、「バブル」を形成するトランスポゾンを挿入してもよく、ここでは、トランスポゾン内のバブルが2つの同じアダプターを逆方向に含んでいる。逆方向の同じアダプターを使用することにより「バブル」構造を維持する。約1,000bpの頻度でバブルを挿入し得る。
別の実施形態では、各ビーズに対して単クローンの縮重バーコード及びクローンでない完全な縮重短k−mer(k=5〜9)を有するプライマー配列又はその鋳型でビーズをコートする。このプライマーは、ビーズからの固定化DNAオリゴの切出しにより、あるいは固定化DNAオリゴのRNAプライマーへのin vitro転写により放出される。ビーズ上に固定するオリゴは、得られるDNA又はRNAプライマーが次のような構造になるように設計する:
5’−[共通1]−[クローンバーコード]−[共通2]−[ランダム_k−mer]−3’OH。
配列決定フローセル表面でのきわめて高分子量(HMW)のゲノムDNAへのin situ転移による長距離連続性(例えば、100Kb〜10Mb)のための方法は、上記のように連続性情報をバーコードに捕捉するのではなく、空間的情報(すなわち、物理的に関連する配列決定鋳型が固定化されている相対的座標)を用いて開発される。
制限酵素を用いる光学マッピングにより、ゲノムアセンブリのための長距離連続性マップを作製することに成功している(Zhouら,2009;Zhouら,2007;Linら,1999;Limら,2001;Laiら,1999;Schwartzら,1993)。しかし、この方法は、スター活性及び非効率的な切断に起因する偽陽性及び陰性の切断部位によって制限を受けるものであり、コンセンサスマップを作製するのに同じ領域から複数の光学マップを必要とする。また、制限酵素認識部位の不均一な分布により、反復領域又は複雑度の低い領域に由来する有用な情報の量が制限される可能性もある。
ライブラリー合成
大腸菌(Eschericia coli)B型細胞のゲノムDNAをUSB(Part#14380)から入手し、Bioruptor(Diagenode)で30秒間、物理的に剪断した。次いで、DNAを100Vで2時間実施する1%アガロースゲルでサイズ選択し、精製し(Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit)、末端修復した(End−It、Epicentre)。ヘアピンアダプターを自己アニールさせ、次いで、Fast−Link Ligase(Epicentre)を用いて一晩、平滑末端連結した。エキソヌクレアーゼIII(NEB)及びVII(Epicentre)による処理を施して、連結されていないゲノムDNA及びアダプターを除去した。次いで、分子をウラシルに特異的な切出し試薬(USER(商標))(NEB)で処理して、一本鎖のフローセルに相補的な3’テールを得た。
トランスポザーゼモザイク、プライマー部位及びフローセルアダプター配列を含む合成DNAオリゴヌクレオチドをIDT社から入手した。室温で20分間、混合及びインキュベートすることにより、アダプターをアニールさせ、トランスポザーゼ(Tn5、Epicentre)に負荷した。
特注のクラスター作製プロトコルを作製して、標準的なIllumina Cluster Stationに負荷する鋳型及びトランスポソームを適合させた。最初にフローセルをハイブリダイゼーション緩衝液でプライムし、次いで、1℃/秒の速度で96℃に加熱した。96℃で、標準的なIllumina配列決定ライブラリーを対照として単独の1つのレーンに負荷し、他の7つのレーンにはハイブリダイゼーション緩衝液を加えた。2分間のインキュベーション後、温度を0.05℃/秒で65℃に下げて、対照ライブラリーとハイブリダイズさせた。この時点で、フローセルの入力側と出力側両方にあるマニフォールドの管を取り外した。大腸菌(E.coli)ライブラリーを15μL/分で2.5分間、各レーンに加えた後、フローセルを0.02℃/秒で40℃に徐冷した。5分間のインキュベーション後、フローセルを1℃/秒で55℃に加熱した。次いで、負荷されたトランスポソームを、大腸菌(E.coli)を含むレーンに15μL/分加えた。フローセルを55℃で5分間インキュベートして転移を生じさせた後、40℃に冷却した。次いで、新しいマニフォールドをクラスターステーションに取り付け、Illumina洗浄/増幅緩衝液をフローセル全体に行きわたるように注入した。ライブラリー特異的DNAポリメラーゼを用いて、最初の鎖合成を65℃で5分間、74℃で5分間実施した。次いで、製造者のプロトコルに従って標準ヒト対照ライブラリーを各大腸菌(E.coli)のレーンとハイブリダイズさせた。35サイクルのブリッジ増幅でクラスターを作製した。製造者のプロトコルに従って、RTA 1.8及びSBS v5を備えたIllumina Genome Analyzer Iixにより、別個の単一末端の36bp(SE36)のリードが2つ得られた。
特注のPerlスクリプトを用いて、fastqファイルからリード1及びリード2由来の各クラスターのX−Y座標を抽出した。このデータを使用して、MATLABのnormxcorr2機能を用いて画像オフセットを計算し、それに基づきリード2のX−Y座標を補正した。次いで、Burrows−Wheeler Aligner(BWA)を用いてリードを個別に大腸菌(E.coli)ゲノムにマッピングし、特注のPerlスクリプトを用いてリード1とリード2の間で隣接するクラスターの同一性を決定した。
in vitro及びin situライブラリー構築及び配列決定
一本鎖のフローセル適合性3’テールを含むHMW DNAライブラリーを作製する効率的な方法を本明細書に記載する。簡潔に述べれば、大腸菌(Eschericia coli)のゲノムDNAを物理的に剪断し、1、2又は3kbのサイズの分子をサイズ選択し、精製し、末端対形成させた。ヘアピンのループ付近にウラシル塩基を3個含むヘアピンアダプター(図31a)を自己アニールさせた後、サイズ選択ライブラリーに平滑末端結合させた。エキソヌクレアーゼIII及びVIIによる処理を行って、結合しなかったゲノムDNA及びアダプターを除去し、両端にヘアピンアダプターを有する分子の濃縮された集団を得た。次いで、分子をUSER(商標)で処理して、ヘアピンループを開き、一本鎖のフローセルに相補的な3’テールを解放した。次いで、わずかに修正したサーマルサイクリングプロトコルを用いて、分子の両端を標準的なIlluminaフローセル表面とハイブリダイズさせた。フローセルにフローセル適合性アダプターを負荷したTn5トランスポザーゼを加えて、ランダムな断片化及びHMW分子へのアダプター付加を行うことにより、LMW配列決定の準備ができている鋳型を作製した(図31b)。Illumina GAIIxで、各大腸菌(E.coli)ライブラリーをヒト対照ライブラリーとともに単独のレーンにプールし、別個のシングルエンドの36bpリード(SE36)を2つ得た。
上記のように構築した1、2及び3kbのライブラリーのマッピングリードの分布を下の表1に示す。
この配列決定のハイブリダイゼーション効率を向上させ、パラダイムの応用を更に探究する努力において、in situでの伸展及びHMW分子の断片化をIlluminaフローセル内で成功させた。簡潔に述べれば、Piranha溶液を用いてフローセルを洗浄し、2%の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)で処理し、JOJO−1染色したラムダDNAを負荷した。次いで、フローセルに6M KClを負荷し、15V/cmの電場を入力及び出力ポートに90秒間印加した。表面をIllumina GA2シーケンサーで直接画像化して(図35a)、単一の48.5Kb分子の末端が画像化スペースの約40ピクセルにわたって物理的に伸展され得ることを示した。次いで、表面をトランスポソームによりin situで処理し、再び画像化した(図35b)。個々の分子が複数の位置で明らかに断片化されていたが、このことは、表面に固定化された鋳型上でも酵素が高い活性レベルを維持することが可能であることを示している。上に挙げた方法を基礎にして、クラスターが長い鋳型の末端で生じるように、そのままのフローセルでの断片化の前に「ロックダウン」ブリッジに流すことを組み込むことは容易であるはずである。
現在、光学マッピング(Schwartzら,1993)、ナノチャネル内での単一分子の伸展(Riehnら,20057)、単一染色体のソーティング(Fanら,2011)、ロングリード単一分子配列決定法(Eidら,2009)、大型インサートのクローン化(Kitzmanら,2011)及び透過型電子顕微鏡法を含めた、さまざまな長さの規模で連続性情報を明らかにする多様な技術が存在する。しかし、上に挙げた技術はすべて、資本設備のコストがかかることや、実施にあたり専門知識が必要とされることから、大規模で使用するのは難しい。上記の実験では、HMW DNA分子のin situライブラリー調製により既存の配列決定法プラットフォーム上で最大3kb離れた長距離の配列情報を捕捉することが可能になることを成功裏に示した。本明細書に記載の方法は、既存の配列決定ハードウェア及び一段階の酵素ベースのin situライブラリー調製を利用することによって、上に挙げた制限を克服し得るものである。更に、本明細書に記載の方法は、環状化を行わずにペアエンド配列決定を遂行し得ることを示した。
in situ転移の前に伸展を行えば、ランダムコイル法より優れた多くの利点が得られる。第一に、伸展を行うと、共線的なクラスター間の物理的距離が平方根に比例するのではなく、リード間の距離に直接比例することにより、分解能が高くなることが期待される。第二に、伸展は、完全長の任意の長さの単一DNA分子に沿って多数の独立したリードを作製するというこの目的の第二の目標に対応させるのが容易である。図15に図示されている1つのスキームでは、伸展した単一分子に、一本鎖バブルを含む配列により連結された19bpのME配列を含む合成の連続性トランスポゾンによるin vitro転移を施す。これは、縮重配列ではなくバブルの各腕が、フローセルをコートするプライマーの順方向又は逆方向の配列と連結されていることを除けば、図4の戦略の第一段階とほぼ同じものである。この合成の連続性トランスポゾンが高密度(35〜600bpごと)で挿入されると、高度に分散した単一分子が電流によりフローセル上で伸展される(9bpの損傷部位を修復する必要がないように、トランスポソーム複合体を除去することなく)。各バブルからのハイブリダイゼーション及びクラスターPCR開始が中程度であると仮定すれば、これにより、伸展した各分子の全長にわたって複数の配列決定リードが得られる可能性がある。
1)配列リードは、情報量がde novoアセンブリ及びハプロタイプ分解の両方の制限酵素部位よりはるかに多いデータポイントを表す;
2)この方法では、制限酵素のスター活性及び不完全な消化など、光学マッピングに影響を及ぼす問題が生じない;
3)伸展したDNA分子の全長に沿ったデータポイントの位置が制限酵素切断部位の分布に依存するものではなく、ランダムなものである。
別の実施形態では、図24に示すように、トランスポザーゼに5’リン酸化A’で終わる不連続なオリゴ、次いでB及びdsDNAトランスポザーゼ認識配列を負荷し得る。転移後の変性により、5’リン酸で終わるssDNA、A’、B、ME、次いでゲノムDNAが生じる。次にssDNA環状化を実施し、次いで、フローセルに結合したA及びBプライマーを用いるローリングサークル増幅法(RCA)により、多重置換分岐化ローリングサークル増幅法及びポロニー(すなわち、ポリメラーゼコロニー)形成が生じる。
別の実施形態では、環状化したssDNA鋳型を、約100bpのフィラーDNA配列を散在させた4つのプライマー(A、B、C及びD)を用いて調製し、環状化し得る(dsDNA付着末端環状化の後、一方の鎖の選択的消化)。次いで、ローリングサークル増幅法(RCA)により、フィラーDNA配列が散在し、A、B、C及びDプライマー部位が反復する長いssDNA分子が得られる。
別の実施形態では、上記のトランスポゾンなどの「バブル」を形成するトランスポゾンを挿入してもよく、ここでは、トランスポゾン内のバブルは、バブルアダプターとしてフローセル結合プライマーに相補的なプライマーを含む。
別の実施形態では、フローセルを再プログラムして、(1)トランスポザーゼ認識配列で終わるオリゴ又は(2)トランスポザーゼ認識配列で終わるハイブリダイズしたブリッジオリゴを含ませる。次いで、トランスポザーゼを負荷緩衝液に加え、フローセル結合オリゴに負荷させる。
上記のように、トランスポザーゼに基づくin vitroショットガンライブラリー構築法(「タグメンテーション」)は、大幅に量を削減したDNAからの配列決定ライブラリーの構築を可能にするものである(図36a)(Adeyら,2010)。簡潔に述べれば、この方法では、不連続な合成オリゴヌクレオチドを負荷したTn5トランスポザーゼの高活性な誘導体を用いて、ゲノムDNAの断片化とアダプター付加を同時に行う。得られた生成物をPCR増幅、次いでハイスループットな配列決定に供する。ゲノムDNAから実行可能なアンプリコンへの変換効率の上昇及び段階数の大幅な減少により、50ナノグラム未満のゲノムDNAから低バイアスできわめて複雑なライブラリーを構築することが可能となる。
tn5mC−seqライブラリー構築及び配列決定
10μMのtn5mC−A1(tn5mC−A1top:5’−GAT[5mC]TA[5mC]A[5mC]G[5mC][5mC]T[5mC][5mC][5mC]T[5mC]G[5mC]G[5mC][5mC]AT[5mC]AGAGATGTGTATAAGAGACAG−3’、IDT(配列番号1)と、tn5mC−A1bot:5’−[Phos]−CTGTCTCTTATACACA−3’、IDT(配列番号2)を、100μMの各オリゴ10μlとEB(QIAGen)80μlを95℃で2分間インキュベートした後、0.1℃/秒でRTに冷却することにより、アニールさせたもの)2.5μlを、100%グリセロール2.5μl及びEz−Tn5トランスポザーゼ(Epicentre−Illumina)5μlとともにRTで20分間インキュベートすることにより、トランスポソーム複合体を作製した。
最初に、hg19参照ゲノムの上側(CをTに変換、C2T)及び下側(GをAに変換、G2A)の鎖をともにin silicoでビサルファイト変換した。機器のバルブの不具合により品質が低下する、又は主として「N」塩基からなるリードが生じるレーンで複数のライブラリーを実行したため、アライメント前に、まずリードを実行指標に基づくフィルターにかけた。次に、最初の75塩基中に3個以下の「N」を含むようにリードにフィルターをかけ、次いで、BWAをデフォルトパラメータで用いて、C2T及びG2A鎖の両方に対してアラインした。両鎖に対してアラインされたリードを取り出した。次いで、両方がどちらの鎖に対してもアラインされなかったリードペアを取り出して76bpにトリミングし(SE36実行を除く)、C2T及びG2A鎖の両方に対して再度アラインした。ライブラリーFでは、これらのサイクルの間の機器のバルブ不具合により、リード2の始めから25bpの最初のトリミングが行われた。重複リード(リード1及び2の両方の同じ開始位置を共有するペア)を取り出し、複雑度を決定した。次いで、アライメントスコアが10未満のリードを二次解析の前にフィルターにかけて除外した。固有のリードからアラインされた総塩基数を分子に、ゲノムのアライン可能な総塩基数(1鎖当たり3Gbをわずかに下回る)を分母に用いて、総カバレッジの倍数を計算した。
Listerら(2009)に記載されているように、二項分布を用いてメチル化シトシンをコールしたが、ここでは、試行回数として位置をカバーするリード数を、また成功としてシトシン状態を維持しているリード数を用いて、各メチル化関係(CpG、CHG、CHH)の確率質量関数を計算し、成功の確率は、非変換率と配列決定エラー率の合計により決定された総エラー率に基づくものであった。最初は、総エラー率を非メチル化ラムダDNAスパイクインにより決定したが、本発明者らは、リードのギャップ修復部分からエラー率を推定すると(本文中に記載するように)、ラムダ推定よりわずかに高く、より包括的な推定ができることに気付いたため、控えめな推定をするために、最も高く決定された0.009のエラー率を用いた。確率がMの値を下回った場合(ここで、M*(非メチル化CpGの総数)<0.01*(メチル化CpGの総数))、その位置はメチル化としてコールし、位置の1%以下がエラー率によるものとした。
超低投入量のトランスポザーゼに基づくWGBSライブラリーの性能
1ナノグラム〜200ナノグラムの投入ゲノムDNAから構築されたライブラリーを用いて、tn5mC−seqを実施し、リンパ芽球様細胞株(NA20847)のメチロームを配列決定した。各ライブラリーをPCR増幅時にバーコード付けし、Illumina HiSeq2000(PE100;v2 chemistry)でのスパイクイン(5%)又は多数(80〜90%)の配列決定レーンに供した。そのデータを下の表3にまとめる。
**リード2の完全なバルブ不具合。
約4,600万の5mC位置(1%FDR;方法を参照)が検出され、カバレッジを有する総シトシンの4.2%を占めていた。メチル化の大部分はCpG関連でみられ(97.1%)、全体のCpGメチル化レベルは69.1%であった。このレベルは、Listerらにより配列決定された胎児線維芽細胞株IMR90のもの(Listerら,2009)(67.7%)と同等であり、分化した細胞型ではCpGメチル化レベルが低下するという観察結果と一致する。更に、CHG及びCHHメチル化レベルはそれぞれ0.36%及び0.37%で、ES細胞よりかなり低く、これも分化した細胞型と一致するものであった。染色体規模では、テロメア長を制御するように働くmiRNA仲介性経路により予想されるように(Benettiら,2008)、メチル化はサブテロメア領域で多くみられた(図36d)。機能注釈の付いた遺伝子領域の分析により、CpGメチル化がプロモーター領域では大幅に減少し、次いで5’UTRでは小幅に増加し、次いで遺伝子本体の全体、特にイントロンではメチル化のレベルが上昇することが明らかになったが(図36e、36f)、これは、既に記載されているCpGメチル化プロファイル(Listerら,2009)と一致するものである。
WGBSのための複雑なショットガンビサルファイト配列決定ライブラリーを迅速に調製する新規な方法としてtn5mC−seqを開発した。簡潔に述べれば、この方法は、DNA−seqライブラリーの構築ですでに明らかにされているように、高活性なTn5トランスポザーゼ誘導体を用いて、一段階でゲノムDNAを断片化してアダプターを付加するものである(Adeyら,2010)。ライブラリー分子がビサルファイト処理に耐えるように、アダプターをすべてのシトシン残基の部分でメチル化し、オリゴヌクレオチド置換戦略を用いて、アダプターが共有結合により隣接している各一本鎖を作製する。効率の高いトランスポザーゼ及び損失を伴う段階の全体的な減少により、わずか10ngの投入DNAから高品質なビサルファイト配列決定ライブラリーの構築が、また1ngの投入DNAから有効な配列の構築が可能となる。
最近の研究では、ゲノム内の遺伝要素間の物理的相互作用の重要性及び複雑性が示されている。このような相互作用を測定することは、離れたシス及びトランス調節DNAが遺伝子調節においてどのように役割を果たしているか(どの遺伝子がどのエンハンサーの影響を受けているのか、染色体が細胞内でどのように配置されているのか、how AR及びERのような特定の転写因子がどのように結合し遺伝子発現に影響を及ぼすのかを含む)を説明するのに役立ち得る。また、それにより癌その他の遺伝子疾患に関与する再編成及び逆位形成の手掛かりを得ることも可能である。
一実施形態では、実施例3Aに記載した技術(本明細書では、「インフィニペア(inifinpair)」技術と呼ぶ)を改変したものを用いて、例えばエストロゲン受容体にみられるような、転写因子(TF)結合部位間の相互作用を同定し得る。図29に示すように、ホルモン(約10ng)により約104個の細胞を誘導し、次いで細胞のクロマチン免疫沈降を行う。次に、細胞を1%ホルムアルデヒドで架橋し超音波処理することにより、クロマチン繊維を破壊する。次いで、ER/AR/受容体特異的抗体を用いて、結合クロマチンフラグメントを濃縮する。
別の実施形態では、インフィニペア(infinipair)技術を用いて、少数の細胞において染色体立体配座をモデル化する。Hi−C法などのこれまでの方法では、多数の細胞(約107個の細胞;約50μmのDNA)が必要である。図30に示すように、ゲノムDNAを架橋する。ホモジナイザーを用いて細胞を溶解させた後、クロマチンを遠沈する。1%SDS、次いでTritonX−100中でインキュベートすることにより、クロマチンタンパク質を除去する。次いで、HindIII中で一晩インキュベートすることによりクロマチンを消化する。
この実施例の焦点には、1)実施例1〜3で開発されたマウスゲノムの高品質なde novoアセンブリの方法の統合;2)ヒトゲノムのハプロタイプ分解的再配列決定の上記方法の統合;及び3)他の次世代配列決定パラダイムの適合性の拡張が含まれる。
本明細書に記載の方法の重要な側面は、そのコストが、それが統合される配列決定法プラットフォームのコストにほぼ全面的に依存しているという点である。「X」をゲノム再配列決定のコストとすれば、本明細書に記載の方法のコストは「a+bX」に要約され、上式中、「a」は連続性情報捕捉の1サンプル当たりの固定コスト(例えば、in situ転移反応のコスト)であり、「b」は、ゲノム再配列決定に対するその情報を回収するのに必要な配列決定の割合である。「a」の見積もりは低い、すなわち1方法当たり30ドル未満である。これは、in situ転移及びPCRなどの反応では、ゲノムDNAが単一の試薬体積内でまとめて操作されるからである。更に、縮重オリゴヌクレオチドなどの試薬及びマイクロ流体装置は比較的安価であり、多く使用することでそのコストを償却することができる。それに比べて「b」の値は予測が困難であり、各方法の実施及び最適化がどれだけ成功するかに左右される。しかし、バーコード自体は、それがcisの状態にある一次リードに比べれば短い(例えば、SE25バーコード対PE76一次リード)ことが注目される。
上記の方法から得られた連続性情報を用いて、哺乳動物ゲノムの高品質なde novoアセンブリをde novoで入手し得る。これを達成するために、従来型又は「次世代」のde novoアセンブリ(Schatzら,2010)のための既存のツールをこれらのデータに転用及び適用し、必要に応じて追加のソフトウェアを開発する。品質をあまり落とさずコストを最小限に抑えるために、連続性マッピング法の最適な組合せ(すなわち、さまざまな規模で)を決定する。これには、例えば、各方法からのデータがさまざまな割合で含まれるように各連続性マッピング法でゲノムをオーバーサンプリングし、次いでダウンサンプリングし、de novoアセンブリの品質に対する影響を評価することが必要となり得る。テストケースとしてマウスゲノムのde novoアセンブリに焦点を当てると、最初のアセンブリの連続性(すなわち、24.8KbのコンティグN50;N5016.9Mbのスーパーコンティグ)を40×再配列決定に必要なデータ(2.5Gb×40=約100Gb)と同量のデータで上回ることになる、すなわち「b≒1」となる。最初、配列決定のコストの方が高くなる、すなわち「bX>>a」となるが、これが変化しても、全規模の連続性マッピング法を用いても(すなわち、短距離、中距離及び長距離の連続性)、調製反応の合計コスト(「a」)が100ドル未満に抑えられるべきである。
予備データ(2.D)は、適度な量の連続性情報により広範囲のハプロタイプ分解能が得られることを示している。このデータには、ハプロタイプ分解的ゲノム再配列決定に必要なソフトウェアがすでに開発されているか、又はこれから開発する。更に、一倍体遺伝子型を正確にコールするのに必要な配列決定の量は、二倍体遺伝子型のコールの半分に満たないため、同じデータを用いてSNP解析ハプロタイプを発見するアルゴリズムを開発する。連続性マッピング法を統合して、HapMapデータとの一致をD’>0.90で99.5%超に維持しながら、N50が少なくとも1Mbのハプロタイプ分解ブロックにおいて95%超のカバレッジを目標に、ヒトゲノムを再配列決定すると同時にハプロタイプ分解を行う。マウスゲノムのde novoアセンブリと同様に、これは、40×のハプロタイプ検出不能なヒトゲノムの再配列決定法に必要とされるであろう同じ量の配列決定(3Gb×40=約120Gb)、すなわち「b≒1」で達成され得る。
本明細書に記載されている連続性情報を捕捉する方法は、それと統合する配列決定技術との使用を対象にしたものであるが、このような方法を他の配列決定技術のために及び他の配列決定法プラットフォームとともに開発してもよい。これらには、他のサイクリックアレイ(cyclic−array)プラットフォーム(例えば、Polonator、SOLiD)及びナノポアシーケンシングなどの新たなパラダイムが含まれる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕連続性情報を捕捉する方法であって、以下の工程、
標的DNA配列をトランスポザーゼで処理して1つ以上の断片化事象又は挿入事象を生じさせる工程、
前記標的DNA配列に1つ以上の認識配列を、(i)前記トランスポザーゼ処理の間又は(ii)後の増幅の間に付加又は挿入する工程、
前記処理されたDNAを配列決定する工程、
共通の特性を有する標的DNA配列又は認識配列を同定することにより、連続性情報を捕捉する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔2〕前記1つ以上の断片化事象又は挿入事象により、前記標的DNAに由来する標的核酸分子のライブラリーの形成が生じる、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記1つ以上の認識配列が、各断片化事象又は挿入事象に隣接する配列に対称的にタグ付けされる1つ以上のバーコードである、前記〔2〕に記載の方法。
〔4〕前記1つ以上のバーコードの前記共通の特性が、同一のバーコード配列又は相補的なバーコード配列である、前記〔3〕に記載の方法。
〔5〕前記標的DNA配列が、一組の標的DNAフラグメントを含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔6〕前記トランスポザーゼで処理する前又は後に、前記標的DNAフラグメントをエマルジョン又は希釈剤で区画化し、標的DNAフラグメントの区画を2つ以上生じさせることを更に含む、前記〔5〕に記載の方法。
〔7〕前記1つ以上の認識配列が、それぞれ前記区画化段階で生じた前記1つ以上の区画に対応する1つ以上の区画特異的バーコードである、前記〔6〕に記載の方法。
〔8〕前記1つ以上のプライマー配列の前記共通の特性が、同一の区画特異的バーコードである、前記〔7〕に記載の方法。
〔9〕区画特異的バーコードを有するプライマーを用いて核酸増幅を実施することを更に含む、前記〔7〕に記載の方法。
〔10〕前記1つ以上の認識配列が、前記標的DNA配列又は前記標的DNA配列内のインサートの末端を修飾する1つ以上のアダプター配列である、前記〔1〕に記載の方法。
〔11〕前記1つ以上のアダプター配列が、1つ以上の表面結合プライマーに相補的である、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記トランスポザーゼが、第二の表面結合プライマーに相補的な核酸と結合している、前記〔11〕に記載の方法。
〔13〕前記1つ以上のアダプター配列を前記1つ以上の表面結合プライマーとハイブリダイズさせることを更に含む、前記〔11〕に記載の方法。
〔14〕前記共通の特性が、拘束された物理的位置である、前記〔13〕に記載の方法。
〔15〕前記トランスポザーゼが、表面結合認識配列と結合して表面結合トランスポザーゼ複合体を形成する、前記〔1〕に記載の方法。
〔16〕前記共通の特性が、拘束された物理的位置である、前記〔15〕に記載の方法。
〔17〕前記標的DNA配列の処理が、複数の表面結合トランスポザーゼ複合体を前記標的DNA配列に曝すことを含む、前記〔15〕に記載の方法。
〔18〕ビサルファイト配列決定の方法であって、以下の工程、
a)それぞれが二本鎖DNAトランスポザーゼ認識配列と、メチル化シトシン(C)残基を有する一本鎖DNAアダプターオーバーハングとを含むトランスポザーゼ複合体を用いて、標的DNA分子内へのin vitro転移を実施する工程、
b)転移済みの標的DNA分子にビサルファイト処理を施す工程、
c)核酸増幅を実施する工程、
d)得られた核酸ライブラリーを配列決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔19〕工程(a)の後かつ工程(b)の前に、第二のアダプターを標的DNAに由来する核酸フラグメントに組み込むことを更に含み、前記第二のアダプターが、工程(c)での核酸増幅を容易にするように設計されている、前記〔18〕に記載の方法。
〔20〕工程(b)の後かつ工程(c)の前に、第二のアダプターを標的DNAに由来する核酸フラグメントを組み込むことを更に含み、前記第二のアダプターが、工程(c)での核酸増幅を容易にするように設計されている、前記〔18〕に記載の方法。
〔21〕染色体立体配座を推定する方法であって、以下の工程、
a)細胞内のDNAに架橋を施す工程、
b)架橋DNAを細胞から単離する工程、
c)前記架橋DNAを断片化する工程、
d)断片化された架橋DNA分子を、第一の表面結合プライマーに相補的であるか、又は第一の表面結合プライマーに対応するアダプターで末端修飾する工程、
e)前記断片化し末端修飾した標的DNA分子の末端を前記第一の表面結合プライマーとハイブリダイズさせる工程、
f)それぞれがDNAトランスポザーゼと、第二の表面結合プライマーに対応する1つ以上の配列とを含む非表面結合トランスポザーゼ複合体を用いて、転移を実施する工程、 g)クラスターの増幅を実施して、クローン化により生じた核酸のクラスターを調製する工程、
h)クローン化により生じた核酸のクラスターを配列決定する工程、
i)隣接するクラスター同士を対にすることにより、染色体上の位置間の物理的相互作用を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔22〕前記単離された架橋DNAが、架橋DNA−タンパク質複合体の一部である、前記〔21〕に記載の方法。
〔23〕工程(c)の後かつ工程(d)の前に、1つ以上の特定の架橋DNA−タンパク質複合体を免疫沈降により濃縮することを更に含む、前記〔22〕に記載の方法。
以下に挙げる参考文献、特許及び公開特許出願ならびに上記明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書に記載された場合と同様に、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
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Claims (17)
- 連続性情報を捕捉する方法であって、以下の工程、
標的DNA配列をトランスポザーゼで処理して1つ以上の断片化事象又は挿入事象を生じさせる工程、
前記標的DNA配列に1つ以上の認識配列を、(i)前記トランスポザーゼ処理の間又は(ii)後の増幅の間に付加又は挿入する工程、
前記処理されたDNAを配列決定する工程、及び
共通の特性を有する標的DNA配列又は認識配列を同定することにより、連続性情報を捕捉する工程、
を含み、前記連続性情報が、前記標的DNA配列の2つ以上の断片間の空間的関係であり、前記空間的関係が、
(i)隣接関係であり、前記標的DNA配列の前記2つ以上の断片が、前記1つ以上の断片化事象又は挿入事象の前に互いに直接隣接していたか、
(ii)区画的関係であり、前記標的DNA配列の前記2つ以上の断片が、前記1つ以上の断片化事象又は挿入事象の前に前記標的DNA配列の同じセグメント内であったか、又は
(iii)離れた関係であり、前記標的DNA配列の前記2つ以上の断片が、前記1つ以上の断片化事象又は挿入事象の前に非連続かつ非隣接であったが、互いの間の特定の距離又は配列長により関連しており、
連続性情報を捕捉する該方法は、前記標的DNA配列の一次配列の内容とは独立していることを特徴とする方法。 - 前記1つ以上の断片化事象又は挿入事象により、前記標的DNAに由来する標的核酸分子のライブラリーの形成が生じる、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の認識配列が、各断片化事象又は挿入事象に隣接する配列に対称的にタグ付けされる1つ以上のバーコードである、請求項2に記載の方法。
- 前記1つ以上のバーコードの前記共通の特性が、同一のバーコード配列又は相補的なバーコード配列である、請求項3に記載の方法。
- 前記標的DNA配列が、一組の標的DNAフラグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼで処理する前又は後に、前記標的DNAフラグメントをエマルジョン又は希釈剤で区画化し、標的DNAフラグメントの区画を2つ以上生じさせることを更に含む、請求項5に記載の方法。
- 前記1つ以上の認識配列が、それぞれ前記区画化段階で生じた前記1つ以上の区画に対応する1つ以上の区画特異的バーコードである、請求項6に記載の方法。
- 前記1つ以上のプライマー配列の前記共通の特性が、同一の区画特異的バーコードである、請求項7に記載の方法。
- 区画特異的バーコードを有するプライマーを用いて核酸増幅を実施することを更に含む、請求項7に記載の方法。
- 前記1つ以上の認識配列が、前記標的DNA配列の末端を修飾するか又は前記標的DNA配列内に挿入する1つ以上のアダプター配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上のアダプター配列が、1つ以上の表面結合プライマーに相補的である、請求項10に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼが、第二の表面結合プライマーに相補的な核酸と結合している、請求項11に記載の方法。
- 前記1つ以上のアダプター配列を前記1つ以上の表面結合プライマーとハイブリダイズさせることを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 前記共通の特性が、拘束された物理的位置である、請求項13に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼが、表面結合認識配列と結合して表面結合トランスポザーゼ複合体を形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記共通の特性が、拘束された物理的位置である、請求項15に記載の方法。
- 前記標的DNA配列の処理が、複数の表面結合トランスポザーゼ複合体を前記標的DNA配列に曝すことを含む、請求項15に記載の方法。
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