TW202100247A - 流通槽 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種流通槽之實例，該流通槽包括基板，該基板包括界定於該基板之表面中之奈米凹陷，及隔開所述奈米凹陷之間隙區域。疏水性材料層具有與所述間隙區域至少實質上共平面之表面，且經定位以界定圍繞所述奈米凹陷之各別子集的疏水性障壁。

Description

流通槽

本發明關於一種流通槽。 相關申請案之交叉參考

本申請案主張2019年1月29日申請之美國臨時申請案第62/798,356號之權益，該申請案之內容以全文引用的方式併入本文中。

生物或化學研究中之各種方案涉及在局部支撐表面上或預界定之反應腔室內進行大量受控反應。接著可觀測或偵測到指定反應，且後續分析可幫助識別或揭露反應中所涉及之化學物質的特性。舉例而言，在一些多重分析中，具有可識別標記（例如螢光標記）之未知分析物可在受控條件下暴露於數千個已知探針。可將各已知探針沈積至微板之各別孔中。觀測在已知探針與孔內的未知分析物之間發生的任何化學反應可幫助識別或揭露分析物之特性。此等方案之其他實例包括已知DNA定序程序，諸如合成定序（sequencing-by-synthesis；SBS）或循環陣列定序。藉由多核苷酸測序技術，該分析可幫助識別或揭露反應中所涉及之多核苷酸之特性。

本文所揭示之第一態樣為一種流通槽，其包含：基板，其包括：界定於基板之表面中的奈米凹陷；及隔開奈米凹陷之間隙區域；及疏水性材料層，該疏水性材料層i）具有與間隙區域至少實質上共平面之表面，及ii）經定位以界定圍繞奈米凹陷之各別子集的疏水性障壁。

在第一態樣之一實例中，該基板進一步包括包圍奈米凹陷之各別子集中之每一者的障壁間隙；該疏水性材料層界定於障壁間隙上且具有小於約2 μm之厚度。

在第一態樣之一實例中，該基板進一步包括包圍奈米凹陷之各別子集中之每一者的障壁凹陷；且該疏水性材料層定位於該障壁凹陷中。

在第一態樣之一實例中，疏水性材料層具有約10 nm至約1 μm範圍內之厚度。

在第一態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。

在第一態樣之一實例中，流通槽進一步包含奈米凹陷中之聚合物層；及附著至聚合物層之引子(primer)。

應理解，本文所揭示之流通槽的任何特徵可以任何期望的方式及/或配置組合在一起。

本文所揭示之第二態樣為一種方法，其包含：將疏水性材料施加至圖案化基板，該圖案化基板包括：界定於圖案化基板的比表面中的奈米凹陷；及隔開奈米凹陷的間隙區域；由此i）在奈米凹陷中及ii）在間隙區域上形成疏水性材料層，其中間隙區域上的疏水性材料層具有小於2 μm的厚度；將遮罩材料施加於疏水性材料層之第一部分上以界定圍繞奈米凹陷之各別子集及間隙區域的疏水性障壁之圖案，從而疏水性材料層之第二部分暴露於各別子集處；移除疏水性材料層之第二部分，由此暴露奈米凹陷之各別子集及間隙區域；將凝膠材料附著至各別子集之奈米凹陷；且自疏水性材料層之第一部分移除遮罩材料以揭露疏水性障壁。

在第二態樣之一實例中，圖案化基板進一步包括圍繞奈米凹陷之各別子集及間隙區域的障壁間隙；且疏水性障壁形成於該障壁間隙上。

在第二態樣之一實例中，疏水性障壁形成於奈米凹陷中之一些中及位於奈米凹陷中之各別子集與間隙區域之間的間隙區域中之一些上。

在第二態樣之一實例中，凝膠材料之附著涉及：使各別子集之奈米凹陷及間隙區域矽烷化；且使凝膠材料沈積於各別子集之奈米凹陷及間隙區域上及遮罩材料上；且該方法進一步包含自遮罩材料及自各別子集之間隙區域移除凝膠材料。

在第二態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。

在第二態樣之一實例中，在施加疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷來形成圖案化基板。在一實例中，圖案化涉及蝕刻、奈米壓印微影或其組合。

在第二態樣之一實例中，在附著凝膠材料之前，發生從疏水性材料層之第一部分移除遮罩材料以揭露疏水性障壁；且附著凝膠材料涉及：使各別子集之奈米凹陷及間隙區域矽烷化；及將凝膠材料沈積於各別子集之奈米凹陷及間隙區域上及疏水性障壁上；且該方法進一步包含自疏水性障壁及各別子集之間隙區域移除凝膠材料。

應理解，此方法之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應理解，該方法及/或流通槽之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第三態樣為一種方法，其包含：將疏水性材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括：界定於圖案化基板之表面且藉由間隙區域隔開的奈米凹陷之子集；及界定於圍繞子集中之每一者的圖案化基板的表面中的障壁凹陷；由此i）在障壁凹陷中及ii）在奈米凹陷中形成疏水性材料層；將遮罩材料施加於障壁凹陷中之疏水性材料層上；自奈米凹陷移除疏水性材料層；將凝膠材料附著至子集之奈米凹陷；及自障壁凹陷中之疏水性材料層移除遮罩材料以揭露疏水性障壁。

在第三態樣之一實例中，凝膠材料之附著涉及：使子集之奈米凹陷及間隙區域矽烷化；且使凝膠材料沈積於子集之奈米凹陷及間隙區域上及遮罩材料上；且該方法進一步包含自遮罩材料及自間隙區域移除凝膠材料。

在第三態樣之一實例中，疏水性材料選自由氟化聚合物及聚矽氧烷組成之群。

在第三態樣之一實例中，其中在施加疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷及障壁凹陷來形成圖案化基板。在一實例中，圖案化涉及蝕刻、奈米壓印微影或其組合。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第四態樣為一種方法，其包含將疏水性材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括：界定於圖案化基板之表面且藉由間隙區域隔開的奈米凹陷之子集，奈米凹陷具有第一深度；及界定於圍繞子集中之每一者的圖案化基板之表面中的障壁凹陷，障壁凹陷具有大於第一深度的第二深度；由此將疏水性材料引入i）障壁凹陷中及ii）奈米凹陷中；至少自奈米凹陷移除疏水性材料，從而疏水性材料中之至少一些保留於障壁凹陷中；且固化保留在障壁凹陷中之疏水性材料中之至少一些。

在第四態樣之一實例中，該方法進一步包含藉由以下將凝膠材料附著至奈米凹陷：將所述子集之奈米凹陷及間隙區域矽烷化；及將凝膠材料沈積於子集之奈米凹陷及間隙區域上；且自間隙區域移除凝膠材料。

在第四態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。

在第四態樣之一實例中，在施加疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷及障壁凹陷來形成圖案化基板。在一實例中，圖案化涉及蝕刻、奈米壓印微影或其組合。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第五態樣為一種方法，其包含：將遮罩材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括：界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷；隔開奈米凹陷之間隙區域；及奈米凹陷中之凝膠材料；由此界定圍繞奈米凹陷之各別子集及間隙區域的疏水性障壁之圖案；根據該圖案施加疏水性材料層，由此形成疏水性障壁，其中疏水性材料層具有小於約2 μm之厚度；且移除遮罩材料。

在第五態樣之一實例中，疏水性材料層亦施加於遮罩材料上，且其中移除遮罩材料移除其上之疏水性材料層。

在第五態樣之一實例中，遮罩材料之該施加包括：在圖案化基板上施加雙層抗蝕劑，該雙層抗蝕劑包括剝離層及成像層；在成像層中界定圖案，由此暴露剝離層之部分；及移除剝離層之經暴露之部分。

在第五態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。

在第五態樣之一實例中，其中在施加遮罩材料之前，該方法進一步包含藉由以下形成圖案化基板：圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷；藉由使奈米凹陷及間隙區域矽烷化將凝膠材料附著至奈米凹陷；將凝膠材料沈積於奈米凹陷及間隙區域上；及自間隙區域移除凝膠材料。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第六態樣為一種方法，其包含將厚度小於約2 μm之疏水性材料膜層壓至圖案化基板上，該圖案化基板包括：界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷；隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及所述奈米凹陷中之凝膠材料；及將乾燥疏水性材料膜暴露於光微影以形成圍繞奈米凹陷之各別子集及間隙區域之疏水性障壁。

在第六態樣之一實例中，疏水性材料膜從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。

在第六態樣之一實例中，其中在層壓疏水性材料膜之前，該方法進一步包含藉由以下形成圖案化基板：圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷；及藉由以下方法將凝膠材料附著至奈米凹陷：將奈米凹陷及間隙區域矽烷化；將凝膠材料沈積於奈米凹陷及間隙區域上；及自間隙區域移除凝膠材料。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第七態樣為一種方法，其包含將疏水性材料印刷至圖案化基板，該圖案化基板包括：界定於圖案化基板之表面中的奈米凹陷；隔開奈米凹陷之間隙區域；及所述奈米凹陷中之凝膠材料；其中該疏水性材料經印刷以形成圍繞奈米凹陷之相應子集及間隙區域之疏水性障壁且具有小於約2 μm之厚度。

在第七態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。

在第七態樣之一實例中，其中在印刷疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成圖案化基板：圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷；及藉由以下方法將凝膠材料附著至奈米凹陷：將奈米凹陷及間隙區域矽烷化；將凝膠材料沈積於奈米凹陷及間隙區域上；及自間隙區域移除凝膠材料。

在第七態樣之一實例中，印刷涉及氣溶膠噴塗印刷。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第八態樣為一種方法，其包含雷射切割及清除(weeding)多層前驅物，其包括：兩個犧牲層；及定位於兩個犧牲層之間的具有小於約2 μm之厚度的疏水性材料層；由此移除兩個犧牲層中之第一層且界定定位於兩個犧牲層中之第二層上的疏水性材料層中的疏水性障壁之圖案；將圖案化疏水性材料層壓至圖案化基板，該圖案化基板包括：界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷；隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及所述奈米凹陷中之凝膠材料。

在第八態樣之一實例中，該方法進一步包含移除兩個犧牲層中之第二層。

在第八態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。

在第八態樣之一實例中，其中在印刷疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成圖案化基板：圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷；及藉由以下將凝膠材料附著至奈米凹陷：將奈米凹陷及間隙區域矽烷化；將凝膠材料沈積於奈米凹陷及間隙區域上；及自間隙區域移除凝膠材料。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

本文所揭示之第九態樣為一種方法，其包含用疏水性材料塗佈印模，該印模界定疏水性障壁之圖案；及將疏水性障壁之圖案中之疏水性材料轉移至圖案化基板，該圖案化基板包括：界定於圖案化基板之表面中的奈米凹陷；隔開奈米凹陷之間隙區域；及奈米凹陷中之凝膠材料；由此形成圍繞奈米凹陷之各別子集及間隙區域之疏水性障壁，該疏水性障壁具有小於約2 μm之厚度。

在第九態樣之一實例中，疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。

在第九態樣之一實例中，其中在轉移疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由以下形成圖案化基板：圖案化非圖案化支撐物以形成奈米凹陷；及藉由以下將凝膠材料附著至奈米凹陷：將奈米凹陷及間隙區域矽烷化；將凝膠材料沈積於奈米凹陷及間隙區域上；及自間隙區域移除凝膠材料。

應理解，該方法之任何特徵可以任何所期望之方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

在第十態樣中，流通槽之另一實例包含基板；定位於基板上之凝膠材料之奈米墊；及i）具有與奈米墊之表面至少實質上共平面的表面及ii）經定位以界定圍繞奈米墊之各別子集之疏水性障壁的疏水性材料層。

在第十態樣之一實例中，奈米墊中之每一者具有小於約2 μm之厚度；且該疏水性材料層具有小於約2 μm之厚度。

在第十態樣之一實例中，流通槽進一步包含複數個附著至奈米墊中之每一者的引子。

應理解，此流通槽之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應理解，此流通槽及/或方法及/或其他流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

在第十一態樣中，方法之另一實例包含：在基板上形成奈米墊之離散子集，奈米墊中之每一者具有小於約2 μm之厚度；及選擇性地將疏水性材料施加於圍繞所述離散子集中之每一者的基板上，由此形成i）圍繞所述離散子集中的每一者、ii）具有與奈米墊之表面至少實質上共平面的表面及iii）具有小於約2 μm之厚度的疏水性障壁。

在第十一態樣之一實例中，疏水性材料之選擇性施加涉及將疏水性障壁之圖案中之該疏水性材料轉移至基板。

在第十一態樣之另一實例中，疏水性材料之選擇性施加涉及將疏水性障壁之圖案中之該疏水性材料印刷至基板。

在第十一態樣的又一實例中，疏水性材料之選擇性施加涉及：將遮罩材料施加至奈米墊的離散子集上，由此界定疏水性障壁之圖案；根據該圖案施加疏水性材料，由此形成疏水性障壁；及移除遮罩材料。

在第十一態樣之一實例中，奈米墊之離散子集的形成涉及將凝膠材料施加於基板之表面上；將遮罩材料安置於凝膠材料上；在遮罩材料及凝膠材料中形成間隔；及移除遮罩材料。

應理解，此方法之任何特徵可以任何期望的方式組合在一起。此外，應理解，此方法及/或其他方法及/或流通槽之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。

再者，應理解，所述方法中之任一者及/或所述流通槽之任一者的任何特徵可以任何所要方式組合在一起，及/或可與本文所揭示之實例中之任一者組合以至少達成如本文中所描述之益處。

本文所揭示之流通槽之一些實例包括具有藉由間隙區域隔開之奈米凹陷的圖案化基板。在此等實例中，與間隙區域至少實質上共平面之疏水性材料層界定圍繞奈米凹陷之一或多個子集之周邊。本文所揭示之流通槽之其他實例包括具有定位於基板上之凝膠材料之奈米墊的基板。在此等實例中，疏水性材料層至少實質上與奈米墊之表面共平面，且界定圍繞奈米墊之一或多個子集之周邊。在所有實例中，疏水性材料層產生圍繞一或多個子集之疏水性障壁。在流通槽之使用期間，疏水性障壁可幫助導引更親水性的試劑及樣品朝向奈米凹陷或奈米墊之一或多個子集。因此，試劑及樣品可更有效地到達反應區（例如奈米凹陷或奈米墊），且可幫助減少或消除反應劑及樣品殘餘物及/或跨越流通槽之污染。在定序反應期間，疏水性障壁亦可防止障壁內釋放之定序庫擴散到障壁外。

如所提及，在一些實例中，疏水性材料層與間隙區域至少實質上共平面；且在其他實例中，疏水性材料層與奈米墊之表面至少實質上共平面。藉由「至少實質上共平面」，意謂疏水性材料層之表面不會在Z方向上朝外延伸超出間隙區域之表面或奈米墊之表面2 μm。Z方向係指用於三維空間之笛卡爾座標系（Cartesian coordinate system）之Z軸。在一些情況下，疏水性材料層及間隙區域或奈米墊表面實質上共平面。在間隙區域與疏水性材料層實質上共平面之一個實例中，疏水性材料層可為單層，例如約10埃。在其他情況下，疏水性材料層及間隙區域或奈米墊表面共平面。實質上共平面之疏水性材料層不會影響成像期間之自動聚焦。另外，當疏水性材料層在高於間隙區域或奈米墊表面之Z方向上朝外延伸時，較高部分之厚度（例如，在間隙區域或奈米墊表面上方延伸之疏水性材料層之部分）對於定序庫而言可能太薄而無法在疏水性材料層之側壁上接種。因此，在一些實例中，與可展現具有較厚側壁之損失相比，定序庫至疏水性材料層之側壁之損失至少減少。作為實例，在間隙區域或奈米墊表面上方延伸之疏水性材料層部分之厚度小於2 μm。在一些實例中，在間隙區域或奈米墊表面上方延伸之疏水性材料層部分之厚度在約20 nm至約2 μm範圍內，例如約10 nm至約100 nm、約100 nm至約1 μm或約1 μm至約2 μm。其他值亦為可能的。

用於本文所揭示之方法中之疏水性材料可包括排斥水或不能與水混合之任何材料。

定義

除非另外規定，否則本文所用之術語應理解為取其在相關技術領域中之普通含義。本文所用之若干術語及其含義闡述於下文中。

如本文所使用，除非上下文明確另外指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」係指單數以及複數兩者。如本文所使用之術語「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」或「特徵在於(characterized by)」同義，且為包括性的或開放性的且不排除未敍述之額外要素或方法步驟。

貫穿本說明書對「一個實例（one example）」、「另一實例（another example）」、「一實例（an example）」等等之參考意謂結合實例所描述之特定要素（例如，特徵、結構、組成、組態及/或特性）包括於本文中所描述之至少一個實例中，且可存在或可不存在於其他實例中。此外應理解，除非上下文另外明確規定，否則關於任何實例所描述之要素可在各種實例中以任何適合方式組合。

在本揭示內容（包括申請專利範圍）中所使用之術語「實質上（substantially）」及「約（about）」用於描述及解釋諸如歸因於處理之變化的小波動。舉例而言，此等術語可指小於或等於所述值±5%，諸如小於或等於所述值±2%、諸如小於或等於所述值±1%、諸如小於或等於所述值±0.5%、諸如小於或等於所述值±0.2%、諸如小於或等於所述值±0.1%、諸如小於或等於所述值±0.05%。

轉接子 ：可例如藉由接合或標籤化融合至核酸分子之線性寡核苷酸序列。在一些實例中，轉接子與引入至流通槽之任何目標序列之3'端或5'端實質上不互補。適合的轉接子長度可在約10個核苷酸至約100個核苷酸、或約12個核苷酸至約60個核苷酸、或約15個核苷酸至約50個核苷酸之範圍內。轉接子可包括核苷酸及/或核酸之任何組合。在一些實例中，轉接子在一或多個位置包括一或多個可裂解基團。在一些實例中，轉接子可包括與引子之至少一部分互補之序列，例如包括通用核苷酸序列（諸如P5或P7序列）之引子。在一些實例中，轉接子可包括幫助下游誤差校正、識別及定序之指數或條碼序列。指數對於核酸分子之樣品或來源（例如片段）可為獨特的。在一些實例中，轉接子可包括定序引子序列或定序結合部位。不同轉接子之組合可併入至核酸分子，諸如DNA片段中。

捕捉部位 ：流通槽表面之一部分，已經物理改質及/或化學性質改質以允許複合物定位。在一實例中，捕捉部位可包括化學捕捉劑。

載體 ：能夠具有其中所含之定序庫之水凝膠支撐物或能夠具有附著至其表面之定序就緒核酸片段的固體支撐物。

腔室 ：位於藉由疏水性障壁界定之周邊內的流通槽之一部分。因為疏水性障壁界定腔室的周邊，所以腔室可能不具有實體側壁，或可能具有小於2 μm高的側壁。

化學捕捉劑 ：能夠附著、保留或結合至目標分子（亦即複合物）之材料、分子或部分。一個實例化學捕捉劑包括與目標核酸之至少一部分互補或附著至目標分子之捕捉核酸（例如捕捉寡核苷酸）。另一實例化學捕捉劑包括能夠結合至目標分子（或附著至目標分子之連接部分）之受體配位體結合對（例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸結合蛋白、抗原決定基、抗體等）之成員。化學捕捉劑之另一實例為能夠與目標分子形成靜電相互作用、氫鍵或共價鍵（例如硫醇-二硫化物交換、點擊化學（click chemistry）、狄耳士-阿德爾（Diels-Alder）等）的化學試劑。

複合物 ：載體，諸如水凝膠支撐物或固體支撐物，及附著至或含於載體內之定序就緒核酸片段。載體亦可包括結合對之一個成員，其另一個成員為捕捉部位之一部分。

外部固定劑 ：與已引入至流通槽腔室之複合物不可混溶的氣態、液態或黏性介質。氣態外部固定劑可用以產生圍繞複合物之小液滴。氣態外部固定劑之實例為以適合流動速率引導通過流通槽之空氣。舉例而言，空氣可用以自流通槽吸入含有複合物之流體，該流體形成含有複合物或樣品之液態的小液滴。所形成之小液滴充當擴散障壁。液態或黏性介質用於防止自複合物釋放之定序庫之擴散。外部固定劑可形成擴散障壁，因為定序庫或任何其他多核苷酸在外部固定劑中具有極少至無溶合作用。呈液體形式之實例外部固定劑包括疏水性油，諸如礦物油、聚矽氧油、全氟化油、氟化碳油（例如來自3M之FLUORINERT™ FC40）或其組合。呈黏性介質形式之實例外部固定劑包括含有聚合物（例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮等）、聚葡萄糖、蔗糖、甘油及其類似物之緩衝液。在一些實例中，黏性介質為溫度反應性凝膠。溫度反應性凝膠在非接種溫度下為非黏性的，且在接種溫度下轉變成黏性介質。溫度反應性凝膠之實例包括聚(N-異丙基丙烯醯胺)及聚氧化乙烯--聚氧化丙烯-聚氧化乙烯（PEO-PPO-PEO）/合成鋰皂石(laponite)奈米粒子複合材料。

片段 ：遺傳物質（例如DNA、RNA等）之一部分或碎片。

水凝膠或水凝膠基質 ：包括有機聚合物（天然或合成）之膠體材料，該有機聚合物經由共價、離子或氫鍵交聯以產生截留水分子以形成凝膠之三維開放晶格結構。在一實例中，水凝膠包括約60%至約90%流體，諸如水及約10%至約30%聚合物。水凝膠可為多孔的，亦即包括開放/空隙空間。孔隙度為水凝膠之分率體積（無因次），亦即量測材料中之空隙空間且為總體積上空隙體積之分率，其為0與100%之間的百分比（或0與1之間的分率）。在一實例中，水凝膠之孔隙度可在約50%（0.5）至約99%（0.99）範圍內。孔隙度可足以允許試劑（例如酶、化學物質及尺寸較小之寡核苷酸（小於50個鹼基對，例如引子））擴散，但禁止較大尺寸核酸分子（例如樣品、片段等）之擴散。

凝膠支撐物 ：具有至少實質上球形形狀之水凝膠（例如，水凝膠珠粒），其可在其中含有定序庫。

疏水性障壁 ：一種疏水性材料層，其施加於基板表面上或包圍奈米凹陷之子集之組態的凹陷中。

核酸分子 ：任何長度之核苷酸之聚合形式，且可包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。該術語可指單股或雙股多核苷酸。

「目標」或「模板」核酸分子可指代待分析之序列。

核酸分子中之核苷酸可包括天然存在之核苷酸及其功能類似物。功能類似物之實例能夠以序列特異性方式與核酸混成軌域(hybridizing)或能夠用作用於複製特定核苷酸序列之模板。天然存在之核苷酸一般具有含有磷酸二酯鍵之主鏈。類似物結構可具有包括所屬技術領域中已知之變體中之任一者的替代性主鏈鍵聯。天然存在之核苷酸一般具有去氧核糖（例如發現於DNA中）或核糖（例如發現於RNA中）。類似物結構可具有包括所屬技術領域中已知之變體中之任一者的替代性糖部分。核苷酸可包括天然或非天然鹼基。天然DNS可包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及/或鳥嘌呤中之一或多者，且天然RNA可包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及/或鳥嘌呤中之一或多者。可使用任何非天然鹼基，諸如鎖核酸（locked nucleic acid；LNA）及橋聯核酸（bridged nucleic acid；BNA）。

引子 ：可與所關注之目標序列混成軌域之核酸分子。在一實例中，引子充當核苷酸可藉由聚合酶聚合於其上之基質。舉例而言，擴增引子充當用於模板擴增及群集產生之起始點。在另一實例中，引子可充當DNA或RNA合成之起始點。舉例而言，定序引子可與合成核酸模板股混成軌域以便引發與合成核酸模板股互補之新股之合成。引物可包括核苷酸或其類似物之任何組合。在一些實例中，引子為單股寡核苷酸或多核苷酸。

樣品 ：遺傳物質之任何來源，諸如細胞、微生物群落或核酸。在一些實例中，細胞為包括原核細胞或真核細胞之單細胞。在一些實例中，細胞為哺乳動物細胞、人類細胞或細菌細胞。在一些實例中，核酸為長DNA分子，包括病毒核酸、細菌核酸或哺乳動物核酸。在一些實例中，樣品經由插入結合（作為片段），例如結合至固體支撐物（例如珠粒）之表面之轉座子。

定序就緒核酸片段 ：在3'及5'端處具有轉接子之遺傳物質之一部分（片段）。在定序就緒核酸片段中，各轉接子包括已知通用序列（例如，其與流通槽上引子之至少一部分互補）及定序引子序列。兩種轉接子亦可包括指數（條碼或標籤）序列。在一實例中，P5側可含有珠粒指數且P7側可含有樣品指數。定序就緒核酸片段可經由結合至固體支撐物（例如珠粒）表面之轉座子插入結合，或經由結合對或其他可裂解連接子直接固定。定序就緒核酸片段亦可包含於水凝膠支撐物內。

接種 ：本文所揭示之流通槽之實例的腔室中的調適片段(例如定序就緒核酸片段)之固定。

定序庫 ：一或多個目標核酸分子之核酸片段或所述片段之擴增子的集合。在一些實例中，片段在其3'及5'端處鍵聯至一或多個轉接子。在一些實例中，定序庫係自一或多個目標核酸分子製備且為複合物之一部分。在其他實例中，定序庫係使用樣品在流通槽表面上製備。

固體支撐物 ：由具有表徵為例如球體、橢圓形、微球體或具有規則或不規則尺寸的其他可識別粒子形狀的形狀的剛性或半剛性材料製成的較小物體。固體支撐物可具有附著至其上之定序庫。適用於固體支撐物之實例材料包括但不限於玻璃；塑膠，諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂或聚四氟乙烯（諸如，來自Chemours公司之TEFLON®）；多醣或交聯多醣，諸如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠；耐綸；硝化纖維；樹脂；二氧化矽或基於矽之材料，包括矽及經改質之矽；碳纖維、金屬；無機玻璃；光纖束或多種其他聚合物。實例固體支撐物包括受控微孔玻璃珠粒、順磁性珠粒或其他磁性珠粒、氧化釷溶膠、瓊脂糖凝膠珠粒、奈米晶體及如描述於例如來自Fishers工業，Bangs實驗室之微球體檢測指南之所屬技術領域中已知之其他材料。

標籤化 ：藉由轉座體修飾核酸分子（例如DNA或RNA樣品）以將核酸分子片段化且在單一步驟中將轉接子接合至片段之5'及3'端。標籤化反應可用於製備定序庫，尤其包括固體支撐物之複合物。標籤化反應將隨機樣品片段化與轉接子接合組合至單一步驟中，其增加定序庫製備製程之效率。

轉座體 ：形成於整合酶（例如整合酶或轉座酶）與包括整合識別部位（例如轉座酶識別部位）之核酸之間的複合物。

通用核苷酸序列 ：兩個或更多個核酸分子共有之序列區域，其中所述分子亦具有彼此不同之區域。存在於分子集合之不同成員中的通用序列可允許使用通用捕捉核酸（亦即，具有與引子之至少一部分互補之序列的轉接子）之群體捕捉若干不同核酸。類似地，存在於分子集合之不同成員中之通用序列可允許使用通用定序結合部位（定序引子序列）之群體擴增或複製若干不同核酸。

流通槽及製備方法

在本文所揭示之實例中之一些中，流通槽包括：基板，其包括界定於基板表面中之奈米凹陷及隔開奈米凹陷之間隙區域；及疏水性材料層，其i）具有與間隙區域至少實質上共平面之表面，及ii）經定位以界定圍繞奈米凹陷之各別子集的疏水性障壁。流通槽10A-10I之不同實例展示於圖1至圖9中。將參考圖1至圖9一起描述流通槽10A-10I之各種特徵，且隨後將參考展示流通槽10A-10I之個別圖描述用於製備各個別流通槽10A-10I之方法。

實例流通槽10A-10I中之每一者包括圖案化基板12。基板12通常為剛性的且不可溶於水性液體中。基板12可為單層或多層結構。適合的基板12之實例包括環氧矽氧烷、多面體寡聚倍半矽氧烷（polyhedral oligomeric silsequioxanes；POSS）或其衍生物、玻璃、經改質之玻璃、塑膠、耐綸、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽（氧化矽（SiO2））、熔融二氧化矽、基於二氧化矽之材料、矽酸鋁、矽、經改質之矽（例如摻雜硼之p+矽）、氮化矽（Si₃ N₄ ）、五氧化鉭（TaO₅ ）或一或多種其他氧化鉭（TaO_x ）、氧化鉿（HaO₂ ）、無機玻璃或類似者。用於基板12之適合的塑膠之一些實例包括丙烯酸聚合物、聚苯乙烯、苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂、聚四氟乙烯（諸如，來自Chemours公司之TEFLON®）、環狀烯烴/環烯烴聚合物（COP）（諸如來自Zeon之ZEONOR®）、聚醯亞胺等。基板12亦可為玻璃或矽或POSS，其在表面具有氧化鉭或另一陶瓷氧化物之塗層。基板12亦可為玻璃或矽，其在表面處具有POSS塗層。

基板12之形式可為晶圓、面板、矩形薄片、晶粒或任何其他適合的組態。在一實例中，基板12可為直徑在約2 mm至約300 mm範圍內之圓形晶圓或面板。作為一更特定實例，基板12為直徑在約200 mm至約300 mm範圍內的晶圓。在另一實例中，基板12可為其最大尺寸至多約10尺（約3公尺）之矩形薄片或面板。作為一特定實例，基板12為寬度在約0.1 mm至約10 mm範圍內之晶粒。儘管已提供實例尺寸，但應瞭解，可使用具有任何適合尺寸之基板12。

實例流通槽10A-10I中之每一者亦包括奈米凹陷14。在所述實例中之每一者中，奈米凹陷14界定於圖案化基板12中。認為奈米凹陷14「界定於」基板12中，因為i）基板表面S₁₂ 界定隔開奈米凹陷14之間隙區域16，ii）另一基板表面S'₁₂ 界定奈米凹陷14之底表面，且iii）基板12亦界定奈米凹陷14之壁。

用於產生奈米凹陷14之方法將參考圖1至圖9中之每一者更詳細地描述。

奈米凹陷14可以任何適合之圖案或佈局跨越基板12分佈。奈米凹陷14之子集18A、18B可藉由疏水性障壁20A-20I隔開。各子集18A、18B中之奈米凹陷14的圖案可相同；或奈米凹陷14的不同圖案可用於不同的子集18A、18B中。可設想奈米凹陷14之多種不同圖案/佈局，包括規則、重複及不規則圖案。在一實例中，奈米凹陷14安置於六角柵格中以用於緊密堆積及改良之密度。其他佈局可包括例如平行四邊形佈局（亦即，矩形、正方形等）、三角形佈局、圓形佈局等。

各奈米凹陷14可具有任何適合之形狀（及對應的3維幾何形狀），諸如圓形、橢圓形、多邊形（例如三角形、四邊形、五邊形等）等。

各奈米凹陷14之大小可藉由其開口面積、直徑及/或長度及寬度表徵。儘管本文使用術語奈米凹陷14，但應理解，凹陷14之尺寸中之一或多者可為奈米級（例如，自約1 nm直至但不包括1000 nm）或微米級（例如，自約1 μm直至但不包括1000 μm）。

可選擇由各凹陷開口佔據之面積以使得複合物無法進入奈米凹陷14。在一實例中，各凹陷開口之面積可為至少約1×10^-3 μm² 、約1×10^-2 μm² 、約0.1 μm² 或約0.5 μm² 、或約1 μm² 、或約4 μm² 。各凹陷開口所佔據之面積可小於上文指定之值或介於所述值之間。

在一些情況下，各奈米凹陷14之直徑或長度及寬度可為至少約1 nm、50 nm、約100 nm、約500 nm、至多約2 μm。凹陷直徑之實例在約1 nm至約500 nm範圍內。凹陷直徑之另一實例在約300 nm至約1 μm範圍內。

奈米凹陷14亦可具有深度。作為實例，各凹陷16之深度可為至少約10 nm、至少約50 nm、至少約1 μm、約10 μm、約50 μm或更大。在一些實例中，深度為約0.4 μm。應理解，各奈米凹陷14之深度可大於、小於或介於上文指定值之間。

相鄰奈米凹陷14係藉由給定子集18A、18B內之間隙區域16隔開。子集18A、18B係藉由疏水性障壁20A-20I之實例隔開。平均凹陷間距表示自一個奈米凹陷14之中心至相鄰奈米凹陷14之中心（中心間間距）或自一個奈米凹陷14之邊緣至相鄰奈米凹陷14之邊緣（邊緣間間距）之間距。奈米凹陷14之佈局或圖案可為規則的，使得圍繞平均間距之變異係數較小，或佈局或圖案可為不規則的，在此情況下，變異係數可能相對較大。在任一狀況下，平均間距可為例如至少約10 nm、或至少約0.1 μm、或至少約0.5 μm或更大，此取決於疏水性障壁20A、20B、20C、20D的組態。替代地或另外，平均間距可為例如至多約0.5 μm、或至多約0.1 μm或更小。奈米凹陷14之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。

疏水性障壁20A、20B、20C、20D之組態在流通槽10A、10B、10C、10D中之每一者中不同。將參考圖1、圖2、圖3及圖4個別地描述此等組態。疏水性障壁20E-20I之組態（圖5至圖9中示出）類似於圖2中所展示之疏水性障壁20B（參見2(vii)），但應理解，描述於圖5至圖9可中之方法同樣可用以形成圖1中所展示之疏水性障壁20A（參見1(vii)）。所述組態之一個常見特性為疏水性障壁20A-20I界定圍繞奈米凹陷14之各子集之周邊。周邊內之流通槽10A-10I之部分（例如，奈米凹陷14之子組所定位之部分）可被稱作腔室24。

各腔室24之大小可藉由其面積、直徑及/或長度及寬度表徵。因為腔室24係藉由至少實質上共平面之疏水性障壁20A-20I界定，但應理解，腔室24可不具有深度，且當其具有深度時，其小於約2 μm。

在一實例中，各腔室24之面積可為至少約1 μm² 、約10 μm² 、約100 μm² 或更大。由各腔室24所佔據之面積可大於上文指定之值或介於上文指定之值之間。

在一些情況下，各腔室24之直徑或長度及寬度可為至少約1 μm、約10 μm、約20 μm、約30 μm、約40 μm、約50 μm、約100 μm或更大。腔室24直徑之實例在約1 μm至約1000 μm範圍內。腔室直徑之另一實例在約10 μm至約50 μm範圍內。當腔室24具有長度及寬度時，應理解，長度及寬度可相同或不同。

腔室24可具有或可不具有深度。此深度取決於疏水性材料層22及因此疏水性障壁20是否在超出間隙區域16之表面的Z方向上朝外延伸。在本文所揭示之實例中之任一者中，深度不超過2 μm。

疏水性障壁20A-20I之各實例亦包括疏水性材料或疏水性材料層22。如參考各種方法更詳細地描述，可施加疏水性材料以形成疏水性材料層22。在本文所揭示之實例中之任一者中，疏水性材料或疏水性材料層22從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。作為實例，疏水性材料或疏水性材料層22可包括非晶形含氟聚合物（其市售實例包括來自AGC化工之CYTOP®系列中之彼等非晶形含氟聚合物，其具有以下封端官能基中之一者：A型：-COOH，M型：-CONH-Si(OR)n或S型：-CF3）、聚四氟乙烯（其市售實例為來自Chemours之TEFLON®）、派瑞林（parylen）、氟化烴、氟丙烯酸共聚物（其市售實例包括如來自Cytonix之FLUOROPEL®）、氟矽烷（(例如三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)矽烷（PFOTS）、全氟辛基三氯矽烷（FDTS））、等離子沈積之碳氟化合物、聚二甲基矽氧烷、其他矽氧烷類或其混合物。作為另一實例，疏水性材料或疏水性材料層22可包括疏水性烴，諸如1-十七炔。

現參考圖1，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20A之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（參見圖1(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（參見圖1(i)及圖1(ii)）。在圖1(ii)中，圖案化基板12包括界定於基板表面S₁₂ 中之奈米凹陷14、隔開奈米凹陷14之間隙區域16及圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16之障壁間隙26。

障壁間隙26為基板表面S₁₂ 之支撐最終形成之疏水性障壁20A的部分。換言之，在該方法期間，疏水性障壁20A形成於障壁間隙26上。因此，障壁間隙26具有為疏水性障壁20所需之形狀/組態及X及Y尺寸，且界定圍繞奈米凹陷14之子集18A、18B中之每一者的周邊（參見例如圖11）。

非圖案化基板12'可經圖案化以形成各種特徵14、16、26。圖案化可涉及部分地取決於所使用之基板之類型的蝕刻、奈米壓印微影（NIL）或其組合。亦可使用其他圖案化技術，諸如光微影、衝壓技術、壓印技術、模製技術、微蝕刻技術等。

該方法之此實例包括將疏水性材料施加於圖案化基板12上（圖1(iii)），由此i）在奈米凹陷14中及ii）在間隙區域16、26上形成疏水性材料層22，其中間隙區域16、26上之疏水性材料層22厚度小於約2 μm。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例。可使用能夠施加疏水性材料作為薄膜之任何適合技術。實例沈積技術包括旋塗、化學氣相沈積、浸漬塗佈(dip coating)、浸塗(dunk coating)、噴塗、覆液施配、超音波噴塗、刮刀塗佈、氣溶膠噴塗印刷、網板印刷、微接觸印刷等。

如圖1(iii)及圖1(iv)處所展示，方法之此實例亦包括將遮罩材料28施加於疏水性材料層22之第一部分30上以界定圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16之疏水性障壁20A之圖案，其中疏水性材料層22之第二部分32暴露於各別子集18A、18B處。

在一些情況下，疏水性材料層22可在沈積遮罩材料28之前暴露於氧電漿處理。

遮罩材料28可為在曝露於特定外部刺激時展現溶解度改變之任何適合材料。在一實例中，遮罩材料28為光阻劑。當曝露於某些波長之光時，光阻劑材料相對於顯影劑溶液改變溶解度。光阻劑可為正型光阻材料（暴露區域變得可溶）或負型光阻材料（暴露區域變得不可溶）。適合的正型光阻劑之實例包括MICROPOSIT® S1800系列或AZ® 1500系列，兩者均可購自MicroChemicals。適合的負型光阻劑之實例包括環氧基SU-8光阻劑（購自MicroChemicals）。在其他實例中，遮罩材料28可包括雙層抗蝕劑，其中一層（例如，直接沈積於基板12上）為剝離層且另一層（例如，沈積於剝離層上）為成像層。

如圖1(iii)及圖1(iv)中所展示，遮罩材料28之選擇性施加可涉及將材料28沈積於疏水性材料層22上（圖1(iii)），及例如藉由光微影圖案化材料28使得疏水性材料層22之一或多個部分30保持經覆蓋且疏水性材料層22之一或多個部分32經暴露（圖1(iv)）。在此實例中，在圖案化之後保持覆蓋的疏水性材料層22之一或多個部分30定位於障壁間隙26上，且在圖案化之後暴露的疏水性材料層22之一或多個部分32定位於各子集18A、18B之奈米凹陷14中及間隙區域16上。當遮罩材料28為正型光阻材料時，直接鄰近於疏水性材料層22之一或多個部分32的遮罩材料28之區域可暴露於適合波長之光使得其變得可溶且可使用適合的顯影劑溶液移除。當遮罩材料28為負型光阻材料時，直接鄰近於疏水性材料層22之一或多個部分30的遮罩材料28之區域可暴露於適合波長之光使得其變得不可溶。未暴露於光之遮罩材料28之部分保持可溶且可使用適合的顯影劑溶液移除。

方法之此實例亦包括移除疏水性材料層22之第二部分32（如圖1(v)處所展示），由此使奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16暴露。疏水性材料層22之一或多個第二部分32之移除可涉及蝕刻。在一實例中，可使用具有空氣或氧氣（O₂ ）之電漿蝕刻。在另一實例中，可使用具有氧氣（O₂ ）之乾式蝕刻。遮罩材料28及基板12相較於疏水性材料層22可具有不同蝕刻速率，以使得遮罩材料28對於蝕刻製程不靈敏，且一旦疏水性材料層22之一或多個第二部分32經移除，底層基板12充當蝕刻終止層。

如圖1(vi)處所展示，此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至各別子集18A、18B之奈米凹陷14。在一些實例中，可使用剝離凝膠圖案化方法。在此等實例中，附著凝膠材料34涉及使各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且將凝膠材料34沈積於各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16上及遮罩材料28上。

矽烷化可包括沈積矽烷或矽烷衍生物。矽烷或矽烷衍生物可包括能夠與凝膠材料34形成共價鍵之官能基。矽烷中之官能基之實例包括乙烯基、丙烯醯基、烯基、環烯基、雜環烯基、炔基、環炔基、雜環炔基、氮烯（nitrene）、醛、肼基、縮水甘油醚、環氧基、碳烯（carbine）、異氰酸酯或順丁烯二醯亞胺，或視情況經取代之變體或其組合。包括胺基官能基之矽烷或矽烷衍生物之實例包括(3-胺丙基)三乙氧基矽烷（APTES）或(3-胺丙基)三甲氧基矽烷APTMS。適合的衍生物之一個實例為降冰片烯衍生之矽烷，諸如[(5-雙環[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基矽烷。矽烷可經由化學氣相沈積（CVD）或另一適合之沈積技術來沈積。矽烷或矽烷衍生物可施加至遮罩材料28，但可或可不附著至遮罩材料28。

雖然在本公開中描述矽烷化，但應理解，可使用其他活化製程替代矽烷化。舉例而言，活化可涉及電漿灰化以產生可黏附至凝膠材料34之一或多種表面活化劑（例如，-OH基團）。

接著可施加凝膠材料34。可用作材料34之聚合物之實例包括丙烯醯胺共聚物，諸如聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共聚-丙烯醯胺，PAZAM。PAZAM及一些其他形式之丙烯醯胺共聚物由以下結構（I）表示

其中： R^A 從以下組成之群組中選擇：疊氮基、視情況經取代之胺基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之腙、視情況經取代之肼、羧基、羥基、視情況經取代之四唑、視情況經取代之四嗪、氧化腈、硝酮及硫醇； R^B 為H或視情況經取代之烷基； R^C 、R^D 及R^E 各自獨立地選自由H及視情況經取代之烷基組成之群； -(CH₂ )_p -中之每一者可視情況經取代；p為1至50範圍內之整數；n為1至50,000範圍內之整數；且m為1至100,000範圍內之整數。 所屬領域中具有通常知識者將認識到，結構（I）中重複的「n」及「m」個特徵的排列為代表性的，且單體次單元可以任何順序存在於聚合物結構中（例如無規、嵌段、圖案化或其組合）。

在一些實例中，PAZAM為線性聚合物。在一些其他實例中，PAZAM為輕度交聯聚合物。

在其他實例中，可用以形成層26之聚合物可為結構(I)之變體。在一個實例中，丙烯醯胺單元可經N,N-二甲基丙烯醯胺（

）置換。在此實例中，結構(I)中之丙烯醯胺單元可經

置換，其中R^D 、R^E 及R^F 各自為H或C1-C6烷基，且R^G 及R^H 各自為C1-C6烷基（而非如同丙烯醯胺之情況為H）。在此實例中，q可為1至100,000範圍內之整數。在另一實例中，除丙烯醯胺單元以外可使用N,N-二甲基丙烯醯胺。在此實例中，除重複的「n」及「m」個特徵以外，結構（I）可包括

，其中R^D 、R^E 以及R^F 各自為H或C1-C6烷基，且R^G 及R^H 各自為C1-C6烷基。在此實例中，q可為1至100,000範圍內之整數。

應理解，其他聚合物或分子可用作凝膠材料34，只要其經官能化以與矽烷或矽烷衍生物或其他活化表面基團相互作用，且隨後施加引子36即可。適用於凝膠材料34之聚合物之其他實例包括具有膠態結構之彼等聚合物，諸如瓊脂糖；或具有聚合物網狀結構之彼等聚合物，諸如明膠；或具有交聯聚合物結構之彼等聚合物，諸如聚丙烯醯胺聚合物及共聚物、無矽烷丙烯醯胺（SFA）或SFA之疊氮化形式。適合的聚丙烯醯胺聚合物之實例可由丙烯醯胺及丙烯酸或含有乙烯基之丙烯酸合成，或由形成[2+2]光環加成反應之單體合成。適用於凝膠材料34之聚合物的其他實例包括丙烯醯胺與丙烯酸酯之混合共聚物。

凝膠材料34可使用旋塗或浸漬或浸漬塗佈或另一適合之技術施加。凝膠材料34亦可暴露於固化製程。固化條件將視所使用之凝膠材料34之類型而定。在一實例中，固化可在室溫（例如約25℃）至約95℃範圍內之溫度下進行約1毫秒至約若干天範圍內之時間。在另一實例中，時間可在10秒至至少24小時之範圍內。在另一實例中，時間可在約5分鐘至約2小時之範圍內。

凝膠材料34可共價附著至矽烷或矽烷衍生物之層。

該方法之一些實例進一步包括自遮罩材料28及間隙區域16移除凝膠材料34。該方法之此等實例亦包括自疏水性材料層22之一或多個第一部分30移除遮罩材料28以揭露疏水性障壁20A（圖1(vii)）。

在一些實例中，可經由洗滌移除直接上覆於遮罩材料28之矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34之部分。在一些情況下，矽烷或矽烷衍生物不附著（例如，經由鍵結）至遮罩材料28，且因此凝膠材料34亦不附著至遮罩材料28。因此，矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34之此等部分可易於使用水洗掉遮罩材料28。應理解，凝膠材料34之剩餘部分附著至矽烷或矽烷衍生物之層，其確實附著至基板表面S₁₂ （例如間隙區域16處）及S'₁₂ （例如奈米凹陷14中），且因此直接上覆於此等特徵14、16之凝膠材料34未經由洗滌移除。

因為凝膠材料34之剩餘部分固定在間隙區域16處及奈米凹陷14中，所以可隨後移除或剝離遮罩材料28而不有害地影響凝膠材料34。遮罩材料28可藉由各種試劑移除，視所使用之遮罩材料28之類型而定。一些適合之移除劑包括1-甲基-2-吡咯啶酮、二甲亞碸或可購自MicroChemicals之彼等移除劑，彼等移除劑之實例為在商品名AZ® 100移除劑（能夠移除AZ®光阻劑）下出售。移除遮罩材料28會暴露疏水性材料層22之一或多個底層部分30，且揭露疏水性障壁20A。

在其他實例中，可與遮罩材料28同時移除直接上覆於遮罩材料28之矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34之部分。在此等實例中，剝離方法可用以移除遮罩材料28及其上之矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34中之任一者。

凝膠材料34之剩餘部分可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34且不有害地影響疏水性障壁20A。拋光製程可用溫和化學漿料（包括例如研磨劑、緩衝液、螯合劑、界面活性劑及/或分散劑）進行。可替代地，拋光可用不包括研磨例子之溶液進行。化學漿料可用於化學機械拋光系統中以拋光間隙區域16之表面。一或多個拋光頭/墊或一或多種其他拋光工具能夠拋光來自間隙區域16之凝膠材料34同時保留凹陷14中之材料34。

疏水性障壁20A在拋光期間及之後亦能夠保持完好。在此實例中，疏水性障壁20A形成於障壁間隙26上，且因此在略微高於間隙區域16之Z方向上朝外延伸。在施加疏水性材料以形成疏水性材料層22期間，控制厚度以使得形成於間隙區域26上之部分30小於約2 μm。因為此部分30形成疏水性障壁20A，所以疏水性障壁20A之厚度T_20A 亦小於約2 μm。

圖1(vii)中所展示之流通槽10A之部分亦具有接枝至凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可進行接枝製程以接枝引子36。在一實例中，接枝可涉及經由沈積（例如使用暫時結合之蓋子）、浸塗、噴塗、覆液施配或藉由將一或多種引子36附著至凹陷13中之凝膠材料34之另一適合方法流動。此等實例技術中之每一者可利用引子溶液或混合物，其可包括一或多種引子、水、緩衝液及催化劑。藉由接枝方法中之任一者，引子36與凹陷14中之凝膠材料34之反應性基團反應且對間隙區域16或疏水性障壁20A無親和力。

在一實例中，可藉由在引子36之5'端處或附近之單點共價附著將引子36固定至凝膠材料34。此附著保留i）引子36之轉接子特異性部分不黏合其同源定序就緒核酸片段及ii）不含引子延伸之3'羥基。出於此目的，可使用任何適合之共價附著。可使用之封端引子之實例包括炔烴封端之引子、四嗪封端之引子、疊氮基封端之引子、胺基封端之引子、環氧基或縮水甘油基封端之引子、硫代磷酸酯封端之引子、硫醇封端之引子、醛封端之引子、肼封端之引子、胺基磷酸酯封端之引子及三唑啉二酮封端之引子。在一些實例中，使用兩種不同引子36。適合的引子36之特定實例包括由Illumina公司出售之商業流通槽表面上所用之P5及P7引子用於在HISEQ™、HISEQX™、MISEQ™、MISEQDX™、MINISEQ™、NEXTSEQ™、NEXTSEQDX™、NOVASEQ™、GENOMEANALYZER™及其他儀器平臺上之定序。

現參考圖2，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20B（圖2(vii)）之方法的兩個實例。在此等實例方法中，使用圖案化基板12（圖2(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（圖2(i)至圖2(ii)）。圖案化基板12包括界定於基板表面S₁₂ 中之奈米凹陷14及隔開奈米凹陷14之間隙區域16（圖2(ii)）。

非圖案化基板12'可經圖案化以形成各種特徵14、16。圖案化可涉及使用參考圖1之本文所闡述之實例中之任一者。

該方法之此等實例包括將疏水性材料施加於圖案化基板12上（圖2(iii)），由此i）在奈米凹陷14中及ii）在間隙區域16上形成疏水性材料層22，其中間隙區域16上之疏水性材料層22之厚度小於約2 μm。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例，且可使用施加疏水性材料之任何適合的技術。

該方法之此等實例亦包括將遮罩材料28施加於疏水性材料層22之第一部分30上以界定圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16之疏水性障壁20B之圖案，從而疏水性材料層22之第二部分32暴露於各別子集18A、18B處。

可使用本文所揭示之遮罩材料28之任何實例。

如圖2中所示，遮罩材料28之選擇性施加可涉及將材料28沈積於疏水性材料層22上（圖2(iii)），及例如藉由光微影圖案化材料28使得疏水性材料層22之一或多個部分30保持經覆蓋且疏水性材料層22之一或多個部分32經曝露（圖2(iv)）。在此等實例中，遮罩材料28之圖案化界定子集18A、18B。特定言之，保持疏水性材料層22之一或多個部分30由遮罩材料28覆蓋將界定疏水性障壁20B。因此，在此實例中，部分30具有疏水性障壁20B所需之形狀/組態及X及Y尺寸，且界定圍繞奈米凹陷14之子集18A、18B中之每一者之周邊。遮罩材料28之圖案化可如參考圖1所描述來進行。

如圖2(iv)處所示，該方法之此實例亦包括移除疏水性材料層22之一或多個第二部分32，由此暴露奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16。疏水性材料層22之一或多個第二部分32之移除可涉及蝕刻。在實例中，可使用具有空氣或氧氣（O₂ ）之電漿蝕刻，或可使用具有氧氣（O₂ ）之乾式蝕刻。遮罩材料28及基板12相較於疏水性材料層22可具有不同蝕刻速率，以使得遮罩材料28對於蝕刻製程不靈敏，且一旦疏水性材料層22之一或多個第二部分32經移除，底層基板12充當蝕刻終止層。

不同於圖1中所展示之方法，奈米凹陷14中之一些保持填充有疏水性材料層22，因為此等奈米凹陷14由遮罩材料28之一或多個部分30覆蓋。此展示於圖2(iv)中。

在圖2（包括2(v)-2(vii)且表示為標記「1」之箭頭)中所展示之方法之一個實例中，將凝膠材料34附著至各別子集18A、18B之奈米凹陷14（圖2(vi)）。參考圖1所描述之剝離凝膠圖案化方法可用於此實例方法中。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且將凝膠材料34沈積於各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16上及殘留遮罩材料28上。

此方法之一些實例進一步包括自遮罩材料28及間隙區域16移除凝膠材料34；及自疏水性材料層22之一或多個第一部分30移除遮罩材料28以揭露疏水性障壁20B。此方法之其他實例包括同時移除遮罩材料28及其上之任何凝膠材料34。

在一些實例中，可經由洗滌移除直接上覆於遮罩材料28之矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34之部分。因為凝膠材料34之剩餘部分固定在間隙區域16處及子集18A、18B之奈米凹陷14中，所以可隨後移除或剝離遮罩材料28而不有害地影響凝膠材料34。可使用如本文所描述之任何適合試劑移除遮罩材料28。移除遮罩材料28會暴露疏水性材料層22之一或多個底層部分30，且揭露疏水性障壁20B。在其他實例中，可同時移除遮罩材料28及直接地上覆於遮罩材料28之任何矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34。

凝膠材料34之剩餘部分可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34且不有害地影響疏水性障壁20B（圖2(vii)）。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

在圖2（包括圖2(viii)至圖2(ix)及圖2(vii)）且表示為標記「2」之箭頭）中所展示之方法之另一實例中，在施加凝膠材料34之前移除遮罩材料28。可如參考圖1所描述移除遮罩材料28。自疏水性材料層22之一或多個第一部分30移除遮罩材料28揭露疏水性障壁20B（參見圖2(viii)）。

在圖2(ix)中所展示之方法之此實例中，使凝膠材料34附著至各別子系集18A、18B之奈米凹陷14。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且將凝膠材料34沈積於各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16上及疏水性障壁20B上。此方法之實例進一步包括自疏水性障壁20B及間隙區域16移除凝膠材料34。凝膠材料34移除可涉及拋光。此製程使膠凝材料34完整保留在奈米凹陷14中且亦使疏水性障壁20B完整保留，如圖2(vii)中所示。

在展示於圖2中之兩個實例中，疏水性障壁20B在拋光之後能夠保持完整。在此等實例中，疏水性障壁20B形成於凹陷14中之一些中及定位於各別子集18A、18B之間的間隙區域16中之一些上。如圖2(vii)中所描繪，疏水性障壁20B之一部分在略微高於間隙區域16之Z方向朝外延伸。在施加疏水性材料以形成疏水性材料層22期間，控制厚度以使得形成於間隙區域16上之部分30小於約2 μm。因為此部分30形成疏水性障壁20B，所以厚度T_20B 亦小於約2 μm。在此實例中，跨越疏水性障壁20B之總厚度變化（例如其在凹陷14中比在間隙區域16上更厚），但延伸於間隙區域16上方之疏水性障壁20B之部分的厚度T_20B 始終小於約2 μm。

圖2(vii)中所展示之流通槽10B之部分亦具有接枝於子集18A、18B之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖3，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20C之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖3(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（圖3(i)至圖3(ii)）。

如圖3(ii)中所展示，圖案化基板12包括界定於基板表面S₁₂ 中之奈米凹陷14的子集18A、18B、隔開奈米凹陷14之間隙區域16及界定於圍繞子集18A、18B中之每一者的圖案化基板12之表面S₁₂ 中的障壁凹陷38。

障壁凹陷38界定於基板表面S₁₂ 之一部分中且最終支撐所形成之疏水性障壁20C。換言之，在本方法期間，疏水性障壁20C形成於障壁凹陷38中。因此，障壁凹陷38具有為疏水性障壁20C所需之形狀/組態及X及Y尺寸，且界定圍繞奈米凹陷14之子集18A、18B中之每一者的周邊（參見例如圖11）。

非圖案化基板12'可經圖案化以形成各種特徵14、16、38。圖案化可涉及參考圖1之本文所闡述之實例中之任一者。

該方法之此實例包括將疏水性材料施加於圖案化基板12上，由此i）在障壁凹陷38中及ii）在奈米凹陷14中形成疏水性材料層22（參見圖3(iii)）。在此實例中，需要填充或底部填充凹陷14、38以使得疏水性材料不延伸至間隙區域16上。在此實例中，疏水性材料層22可與間隙區域16共平面。 可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例，且可使用選擇性地施加疏水性材料之任何適合技術。在一特定實例中，疏水性材料為CYTOP®系列中之聚合物中之一者。

該方法之此實例亦包括將遮罩材料28施加於障壁凹陷38中之疏水性材料層22上，如圖3(iii)中所示。

可使用本文所揭示之遮罩材料28之任何實例。

如圖3（在(iii)及(iv)處）中所展示，遮罩材料28之選擇性施加可涉及將材料28沈積於疏水性材料層22上（亦即，在奈米凹陷14及障壁凹陷38中）（圖3(iii)），且例如藉由光微影圖案化材料28，使得障壁凹陷38中之疏水性材料層22保持覆蓋，且暴露奈米凹陷22中之每一者中的疏水性材料層22（圖3(iv)）。遮罩材料28之圖案化可如參考圖1所描述來進行。

該方法之此實例亦包括自奈米凹陷14移除疏水性材料層22，如圖3(v)中所示。此移除製程暴露奈米凹陷14。自奈米凹陷14移除疏水性材料層22可涉及蝕刻。在實例中，可使用具有空氣或氧氣（O₂ ）之電漿蝕刻，或可使用具有氧氣（O₂ ）之乾式蝕刻。遮罩材料28及基板12相較於疏水性材料層22可具有不同蝕刻速率，以使得遮罩材料28對於蝕刻製程不靈敏，且一旦自奈米凹陷14移除疏水性材料層22，底層基板12充當蝕刻終止層。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至各別子集18A、18B之奈米凹陷14，如圖3(vi)中所示。參考圖1所描述之剝離凝膠圖案化方法可用於此實例方法中。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且將凝膠材料34沈積於各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16上及殘留遮罩材料28上。

該方法之一些實例進一步包括自遮罩材料28及自間隙區域16移除凝膠材料34；及自障壁凹陷38中之疏水性材料層22移除遮罩材料28以揭露疏水性障壁20C。該方法之其他實例包括同時移除遮罩材料28及其上之任何凝膠材料34。圖3(vii)展示在移除材料28及34之後的流通槽10C。

在一些實例中，可經由洗滌移除直接上覆於遮罩材料28之矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34之部分。因為凝膠材料34之剩餘部分固定在間隙區域16處及子集18A、18B之奈米凹陷14中，所以可隨後移除或剝離遮罩材料28而不有害地影響凝膠材料34。 可使用如本文所描述之任何適合試劑移除遮罩材料28。遮罩材料28之移除暴露障壁凹陷38中之疏水性材料層22之一或多個底層部分，且揭露疏水性障壁20B（圖3(vii)）。在其他實例中，可同時移除遮罩材料28及直接地上覆於遮罩材料28之任何矽烷/矽烷衍生物層及凝膠材料34。

凝膠材料34之剩餘部分可隨後暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34且不有害地影響疏水性障壁20C。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

疏水性障壁20C在拋光之後能夠保持完好。在此實例中，疏水性障壁20C形成於障壁凹陷38中。如圖3(vii)中所描繪，疏水性障壁20C之表面S_20C 不在間隙區域16上方的Z方向上朝外延伸，且因此疏水性障壁20C與間隙區域16共平面。在此實例中，疏水性障壁20C之厚度與障壁凹陷38之深度對應，且厚度中無部分延伸超過間隙區域16。

圖3(vii)中所展示之流通槽10C之部分亦具有接枝於子集18A、18B之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖4，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20D之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖4(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（圖4(i)至圖4(ii)）。

圖案化基板12包括界定於基板表面S₁₂ 中之奈米凹陷14的子集18A、18B、隔開奈米凹陷14的間隙區域16及界定於圍繞子集18A、18B中之每一者的圖案化基板12之表面S₁₂ 中的障壁凹陷38。障壁凹陷38之深度可小於或類似於用於拋光之漿料中之拋光珠粒的大小。若障壁凹陷38太深，則拋光機無法移動珠粒以自間隙區域16拋光凝膠材料34。在一些實例中，障壁凹陷38之深度大於奈米凹陷14之深度（如圖4(ii)中所示）。作為一實例，障壁凹陷38之深度為奈米凹陷14之深度的至少2倍。作為其他實例，障壁凹陷38之深度為奈米凹陷14之深度的至少10倍或至少100倍。

障壁凹陷38界定於基板表面S₁₂ 之一部分中且最終支撐所形成之疏水性障壁20D。換言之，在本方法期間，疏水性障壁20D形成於障壁凹陷38中。因此，障壁凹陷38具有為疏水性障壁20D所需之形狀/組態及X及Y尺寸，且界定圍繞奈米凹陷14之子集18A、18B中之每一者的周邊（參見例如圖11）。

非圖案化基板12'可經圖案化以形成各種特徵14、16、38。圖案化可涉及參考圖1之本文所闡述之實例中之任一者。

該方法之此實例包括將疏水性材料施加於圖案化基板12上，由此將疏水性材料22i）引入至障壁凹陷38中，及ii）引入至奈米凹陷14中。在此實例中，需要填充或底部填充凹陷14、38以使得疏水性材料不延伸至間隙區域16上。在此實例中，疏水性材料22可與間隙區域16共平面。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例，且可使用選擇性地施加疏水性材料之任何適合技術。在一特定實例中，疏水性材料為CYTOP®系列中之聚合物中之一者。

該方法之此實例亦包括至少自奈米凹陷14移除疏水性材料22，從而疏水性材料22中之至少一些保留在障壁凹陷38中。自奈米凹陷14移除疏水性材料22可涉及蝕刻。在實例中，可使用具有空氣或氧氣（O₂ ）之電漿蝕刻，或可使用具有氧氣（O₂ ）之乾式蝕刻。基板12可具有與疏水性材料層22不同的蝕刻速率，使得一旦自其移除疏水性材料層22之一或多個第二部分32，底層基板12（例如，在奈米凹陷14處）則充當蝕刻終止層。

此移除製程暴露奈米凹陷14（如圖4(iv)中所示）且可自障壁凹陷38移除疏水性材料22中之一些。然而，歸因於障壁凹陷38相對於奈米凹陷14之增加之深度，應理解，蝕刻並不自障壁凹陷38移除所有疏水性材料22。

暴露於蝕刻可使得障壁凹陷38中之疏水性材料22更具親水性。在恢復疏水性之一個實例中，該方法涉及將障壁凹陷38中之疏水性材料22之表面暴露於高溫製程。視所使用之疏水性材料而定，此製程可涉及將疏水性材料22暴露於約80℃至約200℃範圍內的溫度。恢復製程可為涉及溶劑之回流製程，其可含有經沈積以引入材料22之相同疏水性材料。溶劑回流可作為液相製程或作為氣相製程進行。液相回流可涉及在高溫度（例如，180℃）下將疏水性材料溶液沈積於障壁凹陷38中之疏水性材料層22上，且隨後在較低溫度（例如，50℃）下固化。氣相回流可涉及將基板12（具有障壁凹陷38中之疏水性材料22）置放於其中具有某些量之疏水性材料溶液之真空密封乾燥器中。疏水性由於恢復或回流製程而復原，且形成疏水性障壁20D。亦可在沈積及拋光凝膠材料34之後進行高溫恢復或回流，因為回流並不有害地影響用於定序之凝膠材料34。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至各別子集18A、18B之奈米凹陷14，如圖4(v)中所示。舉例而言，附著凝膠材料34涉及使各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且使凝膠材料34沈積於各別子集18A、18B之奈米凹陷14及間隙區域16上。該方法之此實例進一步包括自間隙區域16移除凝膠材料34，如圖4(vi)中所示。在此實例中，凝膠材料34可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34且不有害地影響疏水性障壁20D。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

疏水性障壁20D在拋光之後能夠保持完好。在此實例中，疏水性障壁20D形成於障壁凹陷38中。如圖4(vi)中所描繪，疏水性障壁20D之表面S_20D 不在間隙區域16上方的Z方向上朝外延伸，且因此疏水性障壁20D與間隙區域16共平面。在此實例中，疏水性障壁20D之厚度與障壁凹陷38之深度對應，且無厚度部分延伸超過間隙區域16。

圖4(vi)中所展示之流通槽10D之部分亦具有接枝於子集18A、18B之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖5，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20E之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖5(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（圖5(i)至圖5(ii)）。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至奈米凹陷14及間隙區域16上，如圖5(iii)中所示。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且使凝膠材料34沈積於奈米凹陷14及間隙區域16上。該方法之此實例進一步包括自間隙區域16移除凝膠材料34，如圖5(vi)中所示。在此實例中，凝膠材料34可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

隨後將遮罩材料28施加於奈米凹陷14中之具有凝膠材料34之圖案化基板12上，如圖5(v)中所示。可施加遮罩材料28以界定圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16之疏水性障壁之圖案P，如圖5(vi)中所示。

在一實例中，遮罩材料28之選擇性施加可涉及將材料28沈積於奈米凹陷14中之凝膠材料34上及間隙區域16上，且例如藉由光微影圖案化材料28以使得界定圖案P。在一個實例中，遮罩材料28之圖案化可如參考圖1所描述來進行。在另一實例中，遮罩材料28為包括剝離層及成像層之雙層抗蝕劑。可使用光微影圖案化成像層，且接著可藉由灰化製程移除在圖案P處暴露的剝離層之任何部分。此將暴露圖案化基板12之一些部分。

該方法之此實例包括根據圖案P來施加疏水性材料，如圖5(vii)中所示。根據圖案P沈積之疏水性材料22在圖案化基板12之暴露部分上形成疏水性障壁20E。疏水性材料22經沈積以具有小於約2 μm之厚度，且因此疏水性障壁20E具有小於約2 μm之厚度。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例，且可使用施加疏水性材料之任何適合的技術。

如圖5(vii)中所展示，疏水性材料22亦可沈積於殘留遮罩材料28上。遮罩材料28可經由本文參考圖1所描述之技術中之任一者移除，且遮罩材料28上之疏水性材料22亦可在此製程期間移除（參見圖5(viii)）。遮罩材料28（及其上之任何疏水性材料22）之移除揭露其中具有凝膠材料34之奈米凹陷14之子集。

圖5中所展示之流通槽10E之部分亦具有接枝於子集18A、18B之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖6，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20F之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖6(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（圖6(i)至圖6(ii)）。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至奈米凹陷14及間隙區域16上，如圖6(iii)中所示。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且使凝膠材料34沈積於奈米凹陷14及間隙區域16上。該方法之此實例進一步包括自間隙區域16移除凝膠材料34，如圖6(vi)中所示。在此實例中，凝膠材料34可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

在此實例中，如圖6(v)中所示，疏水性材料層22為可層壓至具有奈米凹陷14中之凝膠材料之圖案化基板12的膜。該疏水性材料層/膜22具有小於約2 μm之厚度。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例。

接著可使用光微影圖案化疏水性材料層/膜22以形成圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B及間隙區域16之疏水性障壁20F。此展示於圖6(vi)中。

圖6(vi)中所展示之流通槽10F之部分亦具有接枝於子集18A、18B之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖7，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20G之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖7(ii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生（圖7(i)至圖7(ii)）。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至奈米凹陷14及間隙區域16上，如圖7(iii)中所示。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且使凝膠材料34沈積於奈米凹陷14及間隙區域16上。該方法之此實例進一步包括自間隙區域16移除凝膠材料34，如圖7(vi)中所示。在此實例中，凝膠材料34可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

在此實例中，疏水性材料藉由印刷沈積，如圖7(v)中所示。疏水性材料可分散於適合載體液體中，且隨後使用氣溶膠噴塗印刷或噴墨印刷來印刷。疏水性材料係以疏水性障壁20G所需之圖案印刷。疏水性障壁20G具有小於約2 μm之厚度。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例。

圖7(v)中所展示之流通槽10G之部分亦具有接枝於子集18A、18B之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖8，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20H之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖8(iii)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至奈米凹陷14及間隙區域16上（圖8(iii)）。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且使凝膠材料34沈積於奈米凹陷14及間隙區域16上。該方法之此實例進一步包括自間隙區域16移除凝膠材料34（圖8(iii)）。在此實例中，凝膠材料34可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

此實例方法利用轉移層壓製程以形成疏水性障壁20H。

如圖8(i)處所展示，多層前驅物54包括兩個犧牲層56及定位於兩個犧牲層56之間的疏水性材料層22（具有小於約2 μm之厚度）。可使用本文所揭示之疏水性材料的任何實例，且犧牲層之實例包括可自疏水性材料剝離的黏著材料。在一實例中，犧牲層56包括聚對苯二甲酸伸乙酯（PET）。可使用雷射切割及清除處理此多層前驅物54。雷射切割可涉及直接寫入方法或遮罩投影（mask-projection）方法。雷射切割及清除製程移除犧牲層56中之第一層且界定疏水性材料層22中的疏水性障壁20H的圖案，其定位於犧牲層56之第二層上，如圖8(ii)中所示。

使圖案化疏水性材料層22與奈米凹陷14中之具有凝膠材料34的圖案化基板12接觸，如圖8(iii)中所示。將圖案化疏水性材料層22轉移至圖案化基板12，且犧牲層56之第二層可隨後藉由將其剝離而移除。轉移形成圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B、18C及間隙區域16之疏水性障壁20H，如圖8(iv)中所示。

圖8(iv)中所展示之流通槽10H之部分亦具有接枝於子集18A、18B、18C之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

現參考圖9，示意性地描繪用於形成疏水性障壁20I之方法之實例。在此實例方法中，使用圖案化基板12（圖9(v)），或作為該方法之一部分由非圖案化基板12'產生。

此實例方法亦涉及將凝膠材料34附著至奈米凹陷14及間隙區域16上（圖9(v)）。作為一實例，附著凝膠材料34涉及使奈米凹陷14及間隙區域16矽烷化，且使凝膠材料34沈積於奈米凹陷14及間隙區域16上。該方法之此實例進一步包括自間隙區域16移除凝膠材料34（圖9(v)）。在此實例中，凝膠材料34可暴露於拋光。拋光可自間隙區域16移除凝膠材料34，且在一些情況下，移除矽烷或矽烷衍生物之至少一部分，而不有害地影響奈米凹陷14中之凝膠材料34。拋光可如本文參考圖1所描述進行。

此實例方法利用轉移製程以形成疏水性障壁20I。

如圖9(i)處所展示，使用具有疏水性障壁20I所需之相同圖案的主模板60。主模板60可為矽。

工作印模材料62可接著沈積於主模板60上且經固化以形成工作印模64，如圖9(ii)至圖9(iii)中所示。工作印模材料可包括丙烯酸矽單體、聚二甲基矽氧烷（PDMS）等。可移除工作印模64，且可將疏水性材料22之薄層施加至工作印模64，如圖9(iv)中所示。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例，且薄層具有2 μm或更小之厚度。

將工作印模64上之疏水性材料22之部分與具有奈米凹陷14中之凝膠材料34之圖案化基板12接觸。工作印模64將疏水性材料層22之部分轉移至圖案化基板12。轉移形成圍繞奈米凹陷14之各別子集18A、18B、18C及間隙區域16之疏水性障壁20I，如圖9(v)中所示。

圖9(v)中所展示之流通槽10I之部分亦具有接枝於子集18A、18B、18C之凹陷14中之凝膠材料34的引子36。可使用參考圖1所描述之引子36及接枝製程中之任一者。

流通槽10J之另一實例展示於圖10(iv)中。在此實例中，流通槽10J包括：基板12、定位於基板12上之凝膠材料34之奈米墊33；及i）具有與奈米墊33之表面至少實質上共平面之表面及ii）經定位以界定圍繞奈米墊33之各別子集35A、35B之疏水性障壁20J的疏水性材料層22。在一實例中，奈米墊33中之每一者具有小於約2 μm之厚度，且疏水性材料層22（疏水性障壁20J）具有小於約2 μm之厚度。

本文所描述之基板12之任何實例可用於此實例流通槽10J中。

奈米墊33為在空間上彼此分離之凝膠材料34之島狀物（例如形狀為圓形、三角形、矩形等，例如自俯視圖）。本文所揭示之凝膠材料34之任何實例可用於奈米墊33中。一或多種引子36亦可附著至奈米墊33中之每一者。可使用本文所揭示之引子36之任何實例。

奈米墊33可以任何適合之圖案或佈局跨越基板12分佈。奈米墊33之子集35A、35B可由疏水性障壁20J隔開。各子集35A、35B中之奈米墊33的圖案可相同；或可在不同子集35A、35B中使用不同圖案之奈米墊33。可設想奈米墊33之多種不同圖案/佈局，包括規則、重複及不規則圖案。在一實例中，奈米墊33安置於六角柵格中以用於緊密堆積及改良之密度。其他佈局可包括例如平行四邊形佈局（亦即，矩形、正方形等）、三角形佈局、圓形佈局等。

各奈米墊33可具有任何適合之形狀（及對應的3維幾何形狀），諸如圓形、橢圓形、多邊形（例如三角形、四邊形、五邊形等）等。

各奈米墊33之大小可藉由其直徑及/或長度及寬度而被特徵化。在一些情況下，各奈米墊33之直徑或長度及寬度可為至少約1 nm、50 nm、約100 nm、約500 nm、至多約2 μm。奈米墊33直徑之實例在約1 nm至約500 nm範圍內。奈米墊33直徑之另一實例在約300 nm至約1 μm範圍內。

奈米墊33亦可具有厚度。作為實例，各奈米墊33之厚度可小於2 μm。

相鄰奈米墊33藉由給定子集35A、35B內之間隙區域16隔開。子集35A、35B係藉由疏水性障壁20J之實例隔開。平均奈米墊間距表示自一個奈米墊33之中心至相鄰奈米墊33之中心（中心間間距）或自一個奈米墊33之邊緣至相鄰奈米墊33之邊緣（邊緣間間距）之間距。本文對於奈米凹陷所描述之間距中之任一者可適用於奈米墊。

流通槽10J之此實例亦包括疏水性障壁20J。可使用本文所揭示之疏水性材料之任何實例。可使用能夠施加疏水性材料作為薄膜之任何適合技術。

共同地，圖10(i)至圖10(iv)說明用於製備流通槽10J之方法的實例。在此實例中，該方法包含在基板12上形成奈米墊33之離散子集35A、35B，所述奈米墊33中之每一者具有小於約2 μm之厚度（參見圖10(i)至圖10(iii)）；及選擇性地施加疏水性材料22於圍繞離散子集35A、35B中之每一者的基板12上，由此形成i）圍繞離散子集35A、35B中之每一者、ii）具有與奈米墊33之表面至少實質上共平面的表面及iii）具有小於約2 μm之厚度的疏水性障壁20J。

任何適合之技術可用於形成奈米墊33之離散子集。在一個實例中，該方法涉及將凝膠材料34施加於基板12之表面上（圖10(i)）；將遮罩材料28安置於凝膠材料34上（圖10(i)）；在遮罩材料28及凝膠材料34中形成間隔37；及移除遮罩材料28（圖10(iii)）。

施加凝膠材料34可如使用本文所揭示之技術中之任一者所描述進行。舉例而言，基板12之表面可經矽烷化且凝膠材料34可使用本文所揭示之技術中之任一者沈積。隨後使用本文所揭示之技術中之任一者將遮罩材料28施加於凝膠材料34上。

隨後在遮罩材料28及底層凝膠材料34中形成間隔37（其變成奈米墊之間的間隙區域16或其上形成疏水性障壁20J之障壁間隙26）。間隔37可藉由圖案化材料28（例如，藉由光微影）且使用顯影劑溶液移除經圖案化部分而形成。此時，移除遮罩材料28之部分且暴露間隔37處之凝膠材料34之底層部分。蝕刻可用以移除凝膠材料34之此等部分且完全界定間隔37（如圖10(ii))中所示）。遮罩材料28之剩餘部分可根據本文所闡述之實例中之任一者（例如，使用適合的試劑）剝離。

如圖10(iii)中所展示，遮罩材料28之移除暴露奈米墊33。可接著使用本文所揭示之實例接枝技術中之任一者附著引子36。

該方法之此實例包括將疏水性材料22施加於圍繞奈米墊33之離散子集35A、35B中之每一者的基板12上，由此形成如圖10(iv)中所示之疏水性障壁20J。在一實例中，疏水性材料22之選擇性施加涉及將疏水性障壁20J之圖案中之疏水性材料22轉移至基板12。此實例利用如參考圖8所描述之轉移層壓製程或如圖9中所定義之轉移製程。在另一實例中，疏水性材料22之選擇性施加涉及將疏水性障壁之圖案中之疏水性材料印刷至基板。此實例利用如參考圖7(v)所描述之印刷製程。在另一實例中，疏水性材料22之選擇性施加涉及在奈米墊33之離散子集35A、35B上施加（第二）遮罩材料（圖中未示），由此界定用於疏水性障壁20J之圖案；根據該圖案施加疏水性材料22，由此形成疏水性障壁20J；及移除遮罩材料。此實例利用參考圖5(vi)至圖5(viii)所描述之製程。在此特定實例中，在疏水性障壁20J之後，可能需要接枝引子36。

圖11描繪經由本文所描述之方法形成之實例流通槽10A-10J中之任一者之一部分的俯視圖。如所說明，疏水性障壁20A-20I中之每一者（通常展示為圖11中之「20」）界定其中界定奈米凹陷14之腔室24之周邊，且疏水性障壁20J（同樣通常展示為「20」）界定其中界定奈米墊33之腔室24之周邊。

雖然未在圖1至圖11中展示，應理解，流通槽10A-10J中之每一者亦可在各腔室24中包括捕捉部位。捕捉部位在物理上及/或化學上能夠固定特定腔室24內之複合物。捕捉部位可定位於腔室24內之任何適合位置處，其可視奈米凹陷14或奈米墊33之排列而定。跨越基板12或12'之捕捉部位之位置可為均勻的（例如，各捕捉部位係在各腔室24內之實質上相同位置（例如，中心、左側等）中）或可為不均勻的（例如，捕捉部位係在不同腔室24內之不同位置中）。捕捉部位可具有任何適合之形狀、幾何形狀及尺寸，其可至少部分地取決於捕捉部位之組態（例如，間距、槽、突起等)、形成捕捉部位之腔室24的尺寸及待由捕捉部位捕捉之複合物的類型。

在一些實例中，捕捉部位為施加於間隙區域14之一部分上的化學捕捉劑。可使用本文所揭示之化學捕捉劑之任何實例。在一個實例中，可使用微接觸印刷或另一適合技術將化學捕捉劑沈積於所需位置中。

在其他實例中，捕捉部位包括界定於基板12之表面S₁₂ 中的槽。所述槽可使用蝕刻或銘印（視所使用之基板12而定）形成於表面S₁₂ 中。在一實例中，所述槽可與奈米凹陷14同時形成，或可在奈米墊33之前形成。所述槽可具有任何適合之形狀及幾何形狀，且可大於奈米凹陷14或奈米墊33但小於腔室24。

在一些實例中，槽不具有添加至其中之額外化學捕捉劑。在此等實例中，開口尺寸使得複合物能夠藉由尺寸排阻自組裝至槽中且在一些實例中而不是凹陷14中。在其他實例中，槽確實具有添加至其中之額外化學捕捉劑。

捕捉部位之其他實例包括在其表面上具有化學捕捉劑之槽及捕捉珠粒。捕捉珠粒可經尺寸化以適配至槽中且在一些實例中而不是凹陷14。在一些實例中，捕捉珠粒可與相鄰間隙區域16共平面或略微在相鄰間隙區域16上方延伸以使得最終附著至其上之複合物不限於槽內。在一實例中，捕捉珠粒從以下組成之群組中選擇：二氧化矽、超順磁材料、聚苯乙烯及丙烯酸酯。本文所揭示之化學捕捉劑之任何實例可用於捕捉珠粒之表面上，且可在將其引入槽中之前塗佈在捕捉珠粒上。

捕捉部位槽之深度可視是否將化學捕捉劑引入至其中及是否將捕捉珠粒引入至其中而變化。深度可經選擇以至少容納此等材料（亦即，材料包含於槽30內）。在一實例中，槽之深度在約1 nm至約5 μm之範圍內。

此外，儘管圖1至圖10中未展示，應理解，蓋子或第二基板12可直接結合至基板12，或可經由疏水性障壁20A-20J結合至基板12。蓋子可經定位，使得其界定單一流動通道（與複數個腔室24流體連通）或多個流體隔開的流動通道（其中之每一者與複數個腔室24之子集流體連通）。

蓋子可為對朝向一或多個奈米凹陷14中導引之激發光透明的任何材料。作為實例，蓋子可為玻璃（例如硼矽酸鹽、熔融二氧化矽等）、塑膠或其類似物。適合之硼矽酸鹽玻璃的市售實例為可購自Schott North America公司之D 263®。適合之塑膠材料（亦即環烯烴聚合物）的市售實例為可購自Zeon Chemicals有限公司之ZEONOR®產品。

蓋子或第二基板12可使用任何適合之技術結合，諸如雷射結合、擴散結合、陽極結合、共晶結合、電漿活化結合、玻璃料結合、UV固化或其他黏著劑或所屬技術領域中已知之其他方法。在一實例中，分隔層可用於將蓋子結合至疏水性障壁20A、20B、20C、20Dl之部分。分隔層可為將疏水性障壁20A、20B、20C、20D及蓋子中之至少一些密封在一起的任何材料。

儘管圖中未示，但應理解，一或多個額外層可併入於基板12與蓋子或第二基板12之間，或基板12與奈米凹陷14之間。此等一或多個額外層可經選擇以充當用於使用消逝場激發奈米凹陷14之平面波導。

用於流通槽之複合物

流通槽10A-10J可適合於與本文所揭示之複合物之實例一起使用。如本文所指出，複合物包括載體（例如水凝膠支撐物或固體支撐物）及附著至或含於載體內之定序就緒核酸片段。適合複合物之實例展示於圖12A至圖12C中。儘管描述用於製備複合物之一些實例方法，但應理解，可使用其他方法，只要定序就緒核酸片段附著至載體或包含於載體內即可。

圖12A說明包括固體支撐物42及附著至固體支撐物42之定序就緒核酸片段44之複合物40A。

在一個實例中，為形成此複合物40A，轉接子序列（52、52'）經由結合對之一個成員46結合至固體支撐物42。在一實例中，此轉接子序列包括第一定序引子序列（例如讀段1定序引子序列）、與流通槽10A-10I上之引子36中之一者之至少一部分互補的第一序列（例如P5'序列）。如所提及，此轉接子序列結合至結合對（例如生物素）之一個成員46，使得其可結合至固體支撐物42（其包括結合對之其他成員（例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等））之表面。此轉接子序列亦可包括指數序列。

可將Y-轉接子與轉座酶（例如兩個Tn5分子）混合以形成轉座體。Y-轉接子可包括彼此混成軌域之兩個嵌合末端序列。嵌合末端序列中之一者可附著至第二定序引子序列（例如，讀段2定序引子序列）、與流通槽10A-10I上之引子36中之一者之至少一部分互補的第二序列（例如，P5'序列）及視情況指數/條碼序列。第二定序引子序列及第二序列共同構成轉接子序列48、48'。

標籤化製程可隨後執行。包括樣品（例如DNA）之流體（例如標籤化緩衝液）可添加至轉座體且添加至具有結合至其上之轉接子序列之固體支撐物42。當樣品接觸轉座體時，DNA標籤化（用固體支撐物42上之轉接子序列52、52'分段且標記）且結合至Y-轉接子（例如經由接合自由嵌合末端序列）。樣品之連續標籤化在轉座體之間產生複數個橋聯分子。為完成定序就緒片段，進行進一步延伸及接合以確保片段50、50'附著至序列48及48'。轉座酶可隨後經由十二烷基硫酸鈉（SDS）處理或熱或蛋白酶K消化移除。

所得複合物40A展示於圖12A中。橋聯分子為定序就緒核酸片段44，其中之每一者包括在任一末端附著之片段50、50'及轉接子序列48及52或48'及50'。轉接子序列52、52'為最初結合至固體支撐物42之轉接子序列，且包括第一定序引子序列、與流通槽引子互補之第一序列及結合複合物之一個成員46。轉接子序列48、48'選自Y-轉接子，且包括與另一流通槽引子互補之第二序列及第二定序引子序列。因為各定序就緒核酸片段44包括用於擴增（例如橋式擴增）及定序之適合的轉接子，所以不進行PCR擴增。因此，此等片段44為定序就緒的。此外，因為庫片段44來自同一樣品，所以片段44可能適用於鍵聯之長讀段應用。

圖12B說明包括固體支撐物42及附著至固體支撐物42之定序就緒核酸片段44'的另一複合物40B。在一個實例中，在管中產生無PCR核苷酸庫，且隨後使庫混成軌域至管中之固體支撐物42。在圖12B中所展示之實例中，將具有結合對之一個成員的引子添加至管中之庫片段，且隨後使定序就緒核酸片段44'結合至固體支撐物42。在另一實例中，固體支撐物42可具有經由結合對（例如該支撐物42上之抗生物素蛋白及附著至引子之生物素）附著至其上之引子。這些引子與庫片段混成軌域（且因此引子及結合對成員位於片段之一個末端且不位於另一個末端）。在另一實例中，延伸可使用股置換酶進行。此將產生完全雙股庫（例如無叉形或Y轉接子，如圖12B中所示)。定序就緒核酸片段44'可經由變性釋放於流通槽10A-10I上。因為庫片段44'在附著至固體支撐物42之前產生，所以片段44'可不來自同一樣品，且因此可能不適合於鍵聯長讀段(linked long read)應用。

圖12C說明包括水凝膠支撐物70及含於水凝膠支撐物70內之定序就緒核酸片段44''之複合物40C之實例。

為形成此複合物40C，在樣品（例如遺傳物質）存在下混合含有一或多種水凝膠單體及/或一或多種聚合物之流體、一或多種自由基源及一或多種交聯劑。此流體可裝載至礦物油或另一適合疏水性流體中，且乳化以產生小液滴。可添加自由基引發劑以聚合及/或交聯一或多種水凝膠單體及/或一或多種聚合物且形成水凝膠支撐物70。

一或多種適合之單體之實例包括丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、二丙烯酸酯、二烯丙胺、三烯丙胺、二乙烯碸、乙二醇二烯丙醚、二丙烯酸乙二醇酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化二丙烯酸三羥甲酯、乙氧基化四丙烯酸季戊四醇酯、膠原蛋白單體或其組合。

一或多種適合的聚合物之實例包括聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、二丙烯酸聚乙二醇酯、聚乙二醇（例如重量平均分子量在約100到約200,000範圍內）、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內酯、聚(乙烯磺酸)、聚(L-天冬胺酸)、聚(L-麩胺酸)、聚離胺酸、瓊脂、瓊脂糖、海藻酸酯、肝素、海藻酸硫酸酯、硫酸葡聚糖、玻尿酸、果膠、角叉菜膠、明膠、聚葡萄胺糖、纖維素、膠原蛋白聚合物或其組合。

自由基源為在分解時產生自由基之分子。在一實例中，自由基源從以下組成之群組中選擇：過硫酸鉀、過硫酸銨、4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)、1,1'-偶氮雙(環己烷甲腈)、偶氮二異丁腈、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)、過氧化物、核黃素、3-(二甲胺基)丙腈及其組合。

適合的交聯劑之實例可為可逆的，因為其可視其暴露於之化學物質而交聯及非交聯。在實例中，可逆交聯劑為含有雙硫鍵之雙丙烯醯胺交聯劑，其可與還原劑（諸如DTT、TCEP或THP（膦））一起分解。在一實例中，交聯劑從以下組成之群組中選擇：丙烯醯胺、N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺、雙丙烯醯胺、1,4-二乙醯哌嗪、N,N'-二烯丙基L-酒石二醯胺及N-N-(1,2-二羥基伸乙基)-雙丙烯醯胺。引發劑可為光引發劑（其在暴露於適當波長之光之後引發交聯），或當與自由基源組合時引發交聯之自由基引發劑。此類型自由基引發劑之實例為四甲基乙二胺（TEMED）。

樣品變得囊封於水凝膠支撐物內，因為其大小足以使得其無法穿過水凝膠珠粒之孔隙。在一些實例中，樣品為DNA或RNA且長度為至少約100個核苷酸（例如1,000個核苷酸或更多、10,000個核苷酸或更多、500,000個核苷酸或更多等）。在一些實例中，水凝膠支撐物70之孔隙大小係指基於複數個孔隙之量測，孔隙之橫截面之平均直徑或平均有效直徑。不為圓形之橫截面之有效直徑等於具有與非圓形橫截面之橫截面面積相同的橫截面面積之圓形橫截面之直徑。在一實例中，孔隙大小在約10 nm至約100 nm範圍內。

庫製備可隨後在水凝膠支撐物70內進行。多重試劑交換可通過水凝膠支撐物70之孔隙發生。樣品及由其產生之任何庫片段保持在水凝膠基質內。庫製備可涉及使樣品分段且添加將產生序列就緒片段44''之轉接子。

在一實例中，庫製備可經由在水凝膠支撐物70內進行之標籤化來進行。所得複合物40C在圖12C中展示。轉接子序列包括用於橋式擴增及定序之適合的轉接子，且因此所得片段44''係定序就緒的。在另一實例中，可使用產生雙股庫之聚合酶延伸來進行庫製備。此實例庫需要在釋放形成水凝膠支撐物70及接種之前變性。

涉及所述複合物之方法

本文所揭示之方法之實例利用本文所揭示之流通槽10A-10J及複合物40A、40B或40C中之任一者之實例。如上文所描述，複合物40A、40B或40C中之每一者可包括獲自遺傳物質之相同樣品的序列就緒片段。當複合物40A、40B或40C中之一者或幾個在各別腔室內隔離時，獲得來自同一樣品之庫的空間共定位。

在此實例方法中，複合物40A、40B或40C例如經由一或多個輸入埠引入至流通槽10A-10J中。複合物40A、40B或40C可與流體，諸如Tris-HCl緩衝液或0.5倍生理食鹽水檸檬酸鈉（SSC）緩衝液一起引入。

由於複合物40A、40B或40C引入流體（例如，水性流體）中，疏水性障壁20A-20J可有助於改良複合物40A、40B或40C與腔室24（其可比疏水性障壁20A-20J更具親水性）之隔離度。

在各實例流通槽10A-10J中，間隙區域16或奈米墊33之表面上方之疏水性障壁20A-20J之厚度（且因此各腔室24之深度）小於約2 μm。藉由此淺度或不存在的深度，可包括捕捉部位以進一步輔助單個複合物40A、40B或40C在單個腔室24中固定。儘管各腔室24可具有一個捕捉部位，但應理解，腔室24中的一些在本方法的任何給定運行期間可不接納複合物40A、40B或40C。此外，單個腔室24可包括多個捕捉部位。在此實例中，各別捕捉部位及複合物40A、40B或40C為結合對之成員，使得一個複合物40A、40B或40C結合至腔室24中之每一者內的一個捕捉部位。更特定言之，捕捉部位可包括結合對之第一成員且複合物40A、40B或40C中之每一者可包括結合對之第二成員。作為一個特定實例，捕捉部位為捕捉部位引子（例如捕捉寡核苷酸），且複合物40A、40B或40C中之每一者包括可與捕捉部位引子混成軌域之互補引子。作為另一特定實例，捕捉部位可包括抗生物素蛋白且生物素可附著至複合物40A、40B或40C之表面。

此實例方法隨後包括自流通槽10A-10J洗掉非固定複合物40A、40B或40C。洗滌可涉及將任何適合之緩衝液引入至流通槽10A-10J中。流動可推動未附著至捕捉部位或另外被限制在腔室24內穿過流通槽10A-10J之出口埠的任何複合物40A、40B或40C。

該方法之一些實例接著包括將外部固定劑引入至流通槽10A-10J，且特定言之，引入至複數個腔室24。外部固定劑為空氣，或液體介質或黏性介質，其不可與已引入至流通槽腔室24之流體之複合物40A、40B、40C或40D混溶。使用空氣將洗滌流體自流通槽10A-10J抽出可產生包圍複合物40A、40B或40C之液體小滴且形成擴散障壁。液體或黏性介質外部固定劑至少部分地包圍附著在腔室24內之複合物40A、40B或40C。在一實例中，外部固定劑位於腔室24中之流體上。藉由至少部分地包圍複合物40A、40B或40C，當釋放片段44、44'或44''時，外部固定劑有助於抑制定序就緒核酸片段44、44'或44''在腔室24外部擴散。

應理解，可使用本文所揭示之任何外部固定劑，但在一個實例中，外部固定劑為從以下組成之群組中選擇的液體擴散障壁：礦物油及聚矽氧油、選自由甘油及蔗糖組成之群的黏性介質擴散障壁及其組合。當外部固定劑為溫度反應性材料時，升高溫度至接種溫度可使得試劑更黏稠且呈可防止庫擴散之形式。

方法之此實例隨後包括促使經截留複合物40A、40B或40C之載體（例如固體支撐物42或水凝膠支撐物70）將定序就緒核酸片段44、44'或44''釋放至各固定複合物40A、40B或40C經截留之各別腔室24中。在此實例中，藉由疏水性障壁20A-20J及外部固定劑（若使用）限制定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種。

由於載體（亦即支撐物42或70）釋放定序就緒核酸片段44、44'或44''可改變，視所使用之複合物40A、40B或40C而定。

在一些實例中，載體為固體支撐物42，且引起涉及將裂解劑引入至流通槽10A-10I。裂解劑可引發自固體支撐物42化學、酶或光化學釋放之定序就緒核酸片段44或44'。在此等實例中，另一刺激，諸如熱或光可觸發裂解劑自固體支撐物42釋放庫片段44或44'。作為一個實例，自由生物素可作為裂解劑引入，且加熱至約92°C可以用於誘導自固體支撐物42之生物素-寡核苷酸釋放。

在其他實例中，使用複合物40C且因此載體為水凝膠支撐物70。在此等其他實例中，引起庫釋放可涉及加熱流通槽10A-10J、將裂解劑引入流通槽10A-10J或其組合。加熱以自水凝膠支撐物70釋放庫片段44''可涉及加熱至約90°C之溫度。可加熱整個流通槽10A-10J，且當複合物40C加熱時，水凝膠支撐物70可降解以釋放片段44''。在一些實例中，裂解劑可包括一或多種組分，該一或多種組分可使水凝膠支撐物70解聚合且自其釋放定序就緒片段44''。作為實例，裂解劑包括二硫蘇糖醇（DTT）、參-(2-羧基乙基)膦（TCEP）或參-(3-羥丙基)膦（THP）。在其他實例中，裂解劑為光。在此等實例中，用於形成水凝膠支撐物70之交聯劑可包括光可裂解部分，且腔室14中之複合物40C暴露於適當波長之光可裂解此部分且使水凝膠支撐物70降解。

如所提及，在實例方法中定序就緒核酸片段44、44'或44''之轉運及接種受單獨疏水性障壁20A-20J或與外部固定劑組合限制。因此，任何特定複合物40A、40B或40C之片段44、44'或44''將受限於特定複合物40A、40B或40C經限制之腔室24，因為疏水性障壁20A-20J且在一些情況下，外部固定劑至少部分地包圍複合物40A、40B或40C。

在本文所揭示之流通槽10A-10J之情況下，奈米凹陷14中或奈米墊33上之引子36可接種所釋放之定序就緒核酸片段44、44'或44''。接種係經由在片段44、44'或44''之第一或第二序列與引子36中之互補序列之間與腔室24混成軌域來實現。接種可在片段44、44'或44''及一或多個引子36之適合混成軌域溫度下進行。

定序就緒核酸片段44、44'或44''在各別腔室24內之接種位置部分地視奈米凹陷14或奈米墊33之組態而定。在此等實例中，定序就緒核酸片段44、44'、44''或44'''跨越奈米墊33中之每一者之奈米凹陷14中之每一者內的凝膠材料34接種。

接著可使用叢集產生(cluster generation)來擴增經接種之定序庫。

在叢集生成之一個實例中，使用高保真(high-fidelity)DNA聚合酶藉由3'延伸自混成軌域引子36複製定序就緒核酸片段44、44'或44''。使初始定序就緒核酸片段44、44'或44''變性，使複本固定在腔室24內。等溫橋式擴增或一些其他擴增形式可用於擴增經固定之複本。舉例而言，複製之模板循環以與相鄰的互補引子36混成軌域，且聚合酶複製經複製之模板以形成雙股橋，其變性以形成兩個單股之股。此等兩股於相鄰互補引子36上方循環且與相鄰互補引子36混成軌域並且再次延伸以形成兩個新的雙股環。藉由等溫變性及擴增之循環在各模板複本上重複該製程以產生密集的純系叢集。使各雙股橋之叢集變性。在一實例中，反向股藉由特異性鹼基裂解移除，留下正向模板多核苷酸股。應理解，簇聚導致在各奈米凹陷14內或在各腔室24內之各奈米墊33上形成若干模板定序就緒核酸片段。簇聚之此實例為橋式擴增，且為可執行之擴增之一個實例。應理解，可使用其他擴增技術，諸如排除擴增（ExAmp）工作流（Illumina公司）。

在叢集產生之後，可執行定序。本文所揭示之流通槽10A-10J之任何實例可用於多種定序方法或技術，包括常常被稱作合成定序（SBS）、循環陣列定序、接合定序、焦磷酸定序等等之技術。

作為一個實例，藉由合成定序（SBS）反應可在諸如以下之系統上進行：HISEQ™、HISEQX™、MISEQ™、MISEQDX™、MINISEQ™、NOVASEQ™、NEXTSEQDX™、NEXTSEQ™或來自Illumina（加利福尼亞州，聖地亞哥）的其他定序器系統。

可引入與模板多核苷酸股上之互補序列混成軌域之定序引子。此定序引子使得模板多核苷酸股呈現準備好進行定序。在SBS中，監測沿模板定序就緒核酸片段（模板多核苷酸股）定序引子之延伸以確定模板中之核苷酸序列。可阻斷模板之3'末端及任何經流通槽結合之引子36（不附著至複本）以防止對定序反應之干擾，且特定言之，防止不合需要之引發。基本化學方法可為聚合（例如，藉由聚合酶之催化）或接合（例如，藉由接合酶之催化）。

在特定的基於聚合酶之SBS製程中，將經螢光標記之核苷酸以模板依賴性方式添加至定序引子（由此使定序引子延伸）中，以使得可使用偵測添加至定序引子中之核苷酸的次序及類型來確定模板之序列。更特定言之，核苷酸中之一者藉由藉由聚合酶併入至延伸定序引子且與模板多核苷酸股互補之新生股中。舉例而言，為起始第一SBS循環，可將一或多種經標記之核苷酸、DNA聚合酶等遞送至流通槽10A-10J中/通過流通槽10A-10J，其中定序引子延伸導致經標記之核苷酸併入至與模板互補之新生股中。此併入可經由成像事件偵測。在成像事件期間，照明系統（圖中未示）可將激勵光提供至流通槽10A-10J。

在一些實施例中，經螢光標記之核苷酸可進一步包括可逆終止特性，一旦核苷酸已添加至模板，則該特性即終止進一步引子延伸。舉例而言，具有可逆終止子部分之核苷酸類似物可添加至模板，以使得後續延伸無法進行，直至遞送去阻斷劑以移除該部分。因此，對於使用可逆終止之實例，可將去阻斷試劑遞送至流通槽等（在偵測進行之後）。

在各種流體遞送步驟之間可進行一或多次洗滌。SBS循環接著可重複n次以使模板延伸n個核苷酸，由此偵測長度n之序列。

儘管已詳細描述SBS，但應瞭解，本文所述之流通槽10A-10J可與其他定序方案一起用於基因分型或用於其他化學及/或生物學應用中。

為進一步說明本發明，本文給出實施例。應理解，此等實施例係出於說明目的而提供且不欲理解為限制本發明的範圍。 實施例

實施例 1

本文所揭示之流通槽之實例根據本文所描述之方法中之一者製備。

採用玻璃基板且其中蝕刻有圓形奈米凹陷。

CYTOP®S用作疏水性聚合物。疏水性障壁在間隙區域上方之Z方向上延伸約1 μm至約2 μm。疏水性障壁亦界定不同形狀之腔室，諸如直徑為50 μm、寬度為50 μm之方形，長度及寬度各自為50 μm之十字形，及對角線為50 μm之六邊形。

凝膠材料為PAZAM，且P5及P7引子附著至PAZAM。

將標準變性PhiX對照庫（6 pM負載濃度）添加至各流通槽中用於接種及藉由橋式擴增產生叢集。13A至13F說明藉由疏水性障壁界定之腔室中之一些的奈米凹陷中之庫。此等影像係在腔室幾何結構內部之DNA叢集用DNA嵌入劑染料（例如SYTOX）染色之後拍攝。如此等圖式中所觀測，藉由較淺疏水性障壁界定之腔室並不導致任何自動聚焦問題，且未觀測到庫至較淺側壁之損失。

實施例 2

玻璃基板塗佈有CYTOP® S以形成如實施例1所描述之疏水性障壁。疏水性障壁具有約2 μm之厚度，且藉由疏水性障壁界定之微腔室具有約40 μm之直徑。形成三個不同疏水性障壁，改變微腔室之間的間距。間距在微腔室之直徑之1.15倍至1.5倍的範圍內變化。玻璃基板塗佈有PAZAM且經拋光以自該疏水性障壁移除凝膠材料。進行引子接枝以使P5及P7引子附著至微腔室中之PAZAM。使用UV可固化黏著劑黏結蓋子以形成流通槽。

將含有螢光染料之液體引入至流通槽中。在流通槽上發射藍色激發波長，且在引入液體之後拍攝流通槽頂部之螢光影像。此等影像在圖14A(i)、圖14B(i)及圖14C(i)展示為頂部影像。如所描繪，液體覆蓋表面，包括微腔室及疏水性障壁。

液體以約200 μL/分鐘（線速度為約16 cm/s）至約2 mL分鐘（線速度為約80 cm/s）之流動速率用空氣排出。在流通槽上發射藍色激發波長，且在引入空氣之後拍攝流通槽頂部之螢光影像。此等影像在圖14A(ii)、圖14B(ii)、及圖14C(ii)展示為底部影像。如所描繪，空氣之引入導致液體被限制在微腔室內。圖14A(i)及(ii)、圖14B(i)及(ii)以及圖14C(i)及(ii)中之影像之放大倍數為20倍。

實施例 3

如實施例1中所描述製備流通槽，其中疏水性障壁界定圍繞奈米凹陷之子集的若干圓形微腔室。

製備與展示於圖12A中之彼等複合物類似的複合物。特定珠粒上之片段來自同一個長DNA分子。庫片段經由具有與生物素相比更弱親和力的去硫生物素寡核苷酸附著至固體支撐物。將複合物裝載至微腔室中。複合物附著至微腔室表面係藉由錨定物（例如具有與附著至凝膠材料之P5引子混成軌域的生物素的互補引子或使用點擊化學將烷基-PEG-生物素連接子共價附接至凝膠材料上之自由疊氮化合物）來實現。引入含游離生物素之具有十二烷基硫酸鈉之生理食鹽水檸檬酸鈉緩衝液，且加熱流通槽至約80℃以自各別複合物釋放庫。通過流通槽抽吸空氣以將自有生物素溶液推出。由於疏水性/親水性表面結構，當液體藉由空氣推出時，小液滴形成於微腔室內部。小液滴防止庫片段擴散至鄰近微腔室。

隨後使所釋放之庫片段與微腔室中之表面引子混成軌域，且進行延伸步驟以產生互補複本。藉由橋式擴增進行叢集產生。隨後對流通槽進行定序。

圖15說明在定序操作之資料分析之後的流通槽之一部分。原始顏色表示島狀物或基於其在參考基因組上之接近度分組在一起之短讀段。因為各別顏色分離至特定微腔室，推斷給定微腔室中之短讀段為來自同一片基因組DNA的碎片且因此來自同一種複合物。此等結果指示微腔室能夠限制各別腔室內之複合物及所釋放之庫片段。

實施例 4

玻璃基板塗佈有CYTOP® S以形成如實施例1所描述之疏水性障壁。疏水性障壁具有約1 μm之厚度，且藉由疏水性障壁界定之微腔室具有不同形狀。圓形微腔室之直徑為約40 μm，且正方形或六邊形微腔室之長度及寬度或對角線分別在約180 μm至約200 μm範圍內。玻璃基板塗佈有PAZAM且經拋光以自該疏水性障壁移除凝膠材料。進行引子接枝以使P5及P7引子附著至微腔室中之PAZAM。使用UV可固化黏著劑黏結蓋子以形成流通槽。

將含有螢光染料之液體引入至流通槽中。液體以約200 μL/分鐘（線速度為約16 cm/s）至約2 mL分鐘（線速度為約80 cm/s）之流動速率用空氣排出。在流通槽上發射藍色激發波長，且在引入空氣之後拍攝流通槽頂部之螢光影像。此等影像展示於圖16A至圖16E中。如所描繪，空氣之引入導致液體被限制在微腔室內。圖16A至圖16E中之影像之放大倍數為10倍。

實施例 5

玻璃基板塗佈有CYTOP® S以形成如實施例1所描述之疏水性障壁。疏水性障壁具有約200 nm之厚度，且藉由疏水性障壁界定之微腔室具有不同形狀。圓形微腔室之直徑為約40 μm，且正方形或六邊形微腔室之長度及寬度或對角線分別在約180 μm至約200 μm範圍內。玻璃基板塗佈有PAZAM且經拋光以自該疏水性障壁移除凝膠材料。進行引子接枝以使P5及P7引子附著至微腔室中之PAZAM。使用UV可固化黏著劑黏結蓋子以形成流通槽。

將含有螢光染料之液體引入至流通槽中。液體以約200 μL/分鐘（線速度為約16 cm/s）至約2 mL分鐘（線速度為約80 cm/s）之流動速率用空氣排出。在流通槽上發射藍色激發波長，且在引入空氣之後拍攝流通槽頂部之螢光影像。此等影像展示於圖17A至圖17D中。如所描繪，空氣之引入導致液體被限制在微腔室內。圖17A至圖17D中之影像之放大倍數為10倍。

實施例 6

本文所揭示之流通槽之實例根據本文所描述之方法中之一者製備。

採用玻璃基板且其中蝕刻有圓形奈米凹陷。經暴露之奈米凹陷接著用降冰片烯矽烷化且用凝膠材料PAZAM塗佈。進行拋光以自間隙區域移除PAZAM。

將正型光阻劑施加至圖案化基板。使正型光阻劑暴露且顯影以界定疏水性障壁之六邊形圖案。接著進行氧電漿灰化以自圖案化部分移除降冰片烯及PAZAM且根據六邊形圖案暴露圖案化基板。

三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)矽烷（PFOTS）為疏水性材料。疏水性材料根據六邊形圖案沈積於正型光阻劑上方及圖案化基板的暴露部分上。剝離製程接著用以移除剩餘光阻劑及光阻劑上之任何疏水性材料。此揭露了由各微腔室內的疏水性障壁及奈米凹陷的子集界定的微腔室。疏水性障壁為塗佈奈米槽表面之分子單層及六邊形圖案區域中之間隙區域。

進行引子接枝以使P5及P7引子附著至奈米凹陷中之PAZAM。

拍攝流通槽表面之CFR影像且展示於圖18A中。此影像展示PAZAM根據六邊形圖案自圖案化基板之暴露部分有效地移除。

將含有螢光素之液體引入至流通槽中。隨後將空氣以100 μL/分鐘之流動速率引入至流通槽中以抽吸液體。亦引入FLUORINERT™ FC-40（來自3M）。在引入FC40油之後拍攝流通槽表面之螢光影像。此影像展示於圖18B中。如所描繪，油之引入導致含有螢光素之液體被限制在微腔室內。圖18A中之結果支持疏水性材料成功地沈積。

實施例 7

製備(十三氟-1,1,2,2-四氫辛基)三氯矽烷於甲苯中之分散液。分散液之濃度為10%。將分散液印刷在具有帶有150 μm噴嘴之OPTOMEC AJ印刷機的玻璃基板上以形成疏水性障壁。線寬為約20 μm。圖19描繪印刷的疏水性障壁。

此外，應理解，本文所提供之範圍包括所陳述範圍及在所陳述範圍內之任何值或子範圍，如同其明確敍述一般。舉例而言，由約2 mm至約300 mm表示之範圍應解釋為不僅包括自約2 mm至約300 mm之明確敍述限值，而且包括個別值，諸如約15 mm、22.5 mm、245 mm等，及子範圍，諸如約20 mm至約225 mm等。

應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合（限制條件為此等概念並不彼此不相容）預期作為本文中所揭示之發明主題的部分。特定言之，在本發明結尾處出現之所主張主題的全部組合預期為本文所揭示之發明性主題的部分。亦應瞭解，本文明確採用之術語亦可出現在以引用的方式併入之任何揭示內容中，應符合與本文所揭示之特定概念最一致的含義。

雖然已詳細地描述若干實例，但應理解，可修改所揭示之實例。因此，前述描述應被視為非限制性的。

10A-10J:流通槽 12:基板 12':非圖案化基板 S₁₂:基板表面 S'₁₂:另一基板表面 14:奈米凹陷 16:間隙區域 18A:子集 18B:子集 16:間隙區域 20A-20J:疏水性障壁 22:疏水性材料層/膜 24:腔室 26:障壁間隙 26:層 28:遮罩材料 30:第一部分 32:第二部分 33:奈米墊 34:凝膠材料 35A:子集 35B:子集 36:引子 37:間隔 38:障壁凹陷 40A:複合物 40B:複合物 40C:複合物 42:固體支撐物 44:定序就緒核酸片段 44':定序就緒核酸片段 44'':定序就緒核酸片段 46:成員 48:轉接子序列 48':轉接子序列 50:片段 50':片段 52:轉接子序列 52':轉接子序列 54:多層前驅物 56:犧牲層 60:主模板 62:工作印模材料 64:工作印模 70:水凝膠支撐物 P:圖案 T_20A:厚度 T_20B:厚度

參考以下實施方式及圖式，本發明之實例之特徵將變得顯而易見，在以下實施方式及圖式中，類似的圖式元件符號對應於類似但或許不相同的組件。出於簡潔起見，具有先前所描述功能之圖式元件符號或特徵可以或可以不結合出現所述圖式元件符號或特徵之其他附圖來描述。 [圖1]為包括(i)至(vii)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之一個實例的方法之一個實例； [圖2]為包括(i)至(ix)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之另一實例的方法之另一實例； [圖3]為包括(i)至(vii)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之再一實例的方法之再一實例； [圖4]為包括(i)至(vi)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之又一實例的方法之又一實例； [圖5]為包括(i)至(viii)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之又另一實例的方法之又另一實例； [圖6]為包括(i)至(vi)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之再另一實例的方法之再另一實例； [圖7]為包括(i)至(v)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之另一實例的方法之另一實例； [圖8]為包括(i)至(iv)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之又一實例的方法之又一實例； [圖9]為包括(i)至(v)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之再一實例的方法之再一實例； [圖10]為包括(i)至(iv)之示意性流程圖，其說明本文所揭示以形成本文所揭示之流通槽之再另一實例的方法之再另一實例； [圖11]為藉由圖1至圖10中所描述之方法中之任一者形成之實例流通槽之一部分的俯視圖； [圖12A至12C]為可與本文中所揭示之流通槽之實例一起使用的DNA-珠粒或水凝膠複合物之不同實例之示意圖； [圖13A至13F]為在用DNA嵌入染料(例如SYTOX)染色微腔室幾何結構內部之DNA群集之後，由厚度為約2 μm之各別疏水性材料層界定的微腔室幾何結構之不同實例的黑色及白色螢光顯微鏡影像； [圖14A(i)及(ii)、14B(i)及(ii)及14C(i)及(ii)]為當流體引入至其中時（頂部影像，即14A(i)、14B(i)及14C(i)）且在執行抽吸時（底部影像，即14A(ii)、14B(ii)及14C(ii)），包括本文所揭示之微腔室幾何形狀之實例的流通槽之黑色及白色螢光顯微鏡影像； [圖15]為在進行定序操作之後，實例流通槽上之不同微腔室之初始彩色螢光顯微鏡影像的黑色及白色表示； [圖16A至16E]為在執行抽吸之後，由厚度約1 μm之各別疏水性材料層界定的微腔室幾何形狀之不同實例的黑色及白色螢光顯微鏡影像； [圖17A至17D]為在進行抽吸之後，由厚度約200 nm之各別疏水性材料層界定的微腔室幾何形狀之不同實例之黑色及白色螢光顯微鏡影像； [圖18A及18B]為A）在接枝螢光標記引子之後且B）在螢光液體經油置換之後，由疏水性材料層界定之實例六角微腔室幾何形狀之黑色及白色螢光顯微鏡影像；及 [圖19]為由印刷疏水性材料層界定之實例微腔的顯微圖。

10A:流通槽

12:基板

12':非圖案化基板

14:奈米凹陷

16:間隙區域

18A:子集

18B:子集

20A:疏水性障壁

22:疏水性材料層/膜

24:腔室

26:障壁間隙/層

28:遮罩材料

30:第一部分

32:第二部分

34:凝膠材料

36:引子

S₁₂:基板表面

S'₁₂:另一基板表面

T_20A:厚度

Claims (52)

1. 一種流通槽，其包含： 基板，其包括： 界定於該基板之表面中之奈米凹陷；及 隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及 疏水性材料層，所述疏水性材料層i）具有與所述間隙區域至少實質上共平面之表面及ii）經定位以界定圍繞所述奈米凹陷之各別子集的疏水性障壁。
2. 如請求項1之流通槽，其中： 該基板進一步包括包圍所述奈米凹陷之所述各別子集中之每一者的障壁間隙；且 該疏水性材料層界定於該障壁間隙上且具有小於約2 μm之厚度。
3. 如請求項1之流通槽，其中： 該基板進一步包括包圍所述奈米凹陷之所述各別子集中之每一者的障壁凹陷；且 該疏水性材料層定位於該障壁凹陷中。
4. 2或3中任一項之流通槽，其中該疏水性材料層具有約10 nm至約1 μm範圍內之厚度。
5. 2、3或4中任一項之流通槽，其中疏水性材料從以下組成之群組中選擇組：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及前述材料之混合物。
6. 2、3、4或5中任一項之流通槽，其進一步包含：所述奈米凹陷中之聚合物層；及 附著至該聚合物層之引子。
7. 一種方法，其包含： 將疏水性材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷；及 隔開所述奈米凹陷之間隙區域； 由此i）在所述奈米凹陷中及ii）在所述間隙區域上形成疏水性材料層，其中在所述間隙區域上之該疏水性材料層具有小於約2 μm之厚度； 將遮罩材料施加於該疏水性材料層之第一部分上以界定圍繞所述奈米凹陷之各別子集及所述間隙區域的疏水性障壁之圖案，從而該疏水性材料層之第二部分暴露於所述各別子集處； 移除該疏水性材料層之該第二部分，由此暴露所述奈米凹陷之所述各別子集及所述間隙區域； 將凝膠材料附著至所述各別子集之所述奈米凹陷；且 自該疏水性材料層之該第一部分移除該遮罩材料以揭露該疏水性障壁。
8. 如請求項7之方法，其中： 該圖案化基板進一步包括圍繞所述奈米凹陷之所述各別子集及所述間隙區域的障壁間隙；且 該疏水性障壁形成於該障壁間隙上。
9. 如請求項7之方法，其中該疏水性障壁形成於所述奈米凹陷中之一些中及形成於定位於所述奈米凹陷之各別子集與所述間隙區域之間的所述間隙區域中之一些上。
10. 8或9中任一項之方法，其中： 該凝膠材料之該附著涉及： 使所述各別子集之所述奈米凹陷及間隙區域矽烷化；及 將該凝膠材料沈積於所述各別子集之所述奈米凹陷及間隙區域上及該遮罩材料上；及 該方法進一步包含自該遮罩材料及所述各別子集之所述間隙區域移除該凝膠材料。
11. 8、9或10中任一項之方法，其中該疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。
12. 8、9、10或11中任一項之方法，其中在施加該疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷來形成該圖案化基板。
13. 如請求項12之方法，其中該圖案化涉及蝕刻、奈米壓印微影或其組合。
14. 8、9、10、11、12或13中任一項之方法，其中： 該遮罩材料自該疏水性材料層之該第一部分的移除以揭露該疏水性障壁發生於附著該凝膠材料之前；且 附著該凝膠材料涉及： 使所述各別子集之所述奈米凹陷及間隙區域矽烷化；及 將該凝膠材料沈積於所述各別子集之所述奈米凹陷及間隙區域上及該疏水性障壁上；及 該方法進一步包含自該疏水性障壁及所述各別子集之所述間隙區域移除該凝膠材料。
15. 一種方法，其包含： 將疏水性材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化之基板之表面中且藉由間隙區域隔開之奈米凹陷之子集；及 界定於圍繞所述子集中之每一者的該圖案化基板之該表面中的障壁凹陷； 由此i）在該障壁凹陷中及ii）在所述奈米凹陷中形成疏水性材料層； 將遮罩材料施加於該障壁凹陷中之該疏水性材料層上； 自所述奈米凹陷移除該疏水性材料層； 將凝膠材料附著至所述子集之所述奈米凹陷；及 自該障壁凹陷中之該疏水性材料層移除該遮罩材料以揭露疏水性障壁。
16. 如請求項15之方法，其中： 該凝膠材料之該附著涉及： 使所述子集之所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化；及 將該凝膠材料沈積於所述子集之所述奈米凹陷及所述間隙區域上及該遮罩材料上；及 該方法進一步包含自該遮罩材料及所述間隙區域移除該凝膠材料。
17. 如請求項15或16中任一項之方法，其中從氟化聚合物及聚矽氧烷所組成之群組中選擇該疏水性材料。
18. 如請求項15、16或17中任一項之方法，其中在施加該疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷及該障壁凹陷來形成該圖案化基板。
19. 如請求項18之方法，其中該圖案化涉及蝕刻、奈米壓印微影或其組合。
20. 一種方法，其包含： 將疏水性材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化之基板之表面中且藉由間隙區域隔開的奈米凹陷之子集，所述奈米凹陷具有第一深度；及 界定於圍繞所述子集中之每一者的該圖案化基板之該表面中的障壁凹陷，該障壁凹陷具有大於該第一深度的第二深度； 由此將該疏水性材料引入i）該障壁凹陷中及ii）所述奈米凹陷中； 至少自所述奈米凹陷移除該疏水性材料，從而該疏水性材料中之至少一些保留於該障壁凹陷中；且 固化保留在該障壁凹陷中之該疏水性材料中之至少一些。
21. 如請求項20之方法，其進一步包含： 藉由以下方法將凝膠材料附著至所述奈米凹陷： 使所述子集之所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化；及 將該凝膠材料沈積於所述子集之所述奈米凹陷及所述間隙區域上；及 自所述間隙區域移除該凝膠材料。
22. 如請求項20或21中任一項之方法，其中該疏水性材料從以下組成之群中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。
23. 如請求項20、21或22中任一項之方法，其中在施加該疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷及該障壁凹陷來形成該圖案化基板。
24. 如請求項23之方法，其中該圖案化涉及蝕刻、奈米壓印微影或其組合。
25. 一種方法，其包含： 將遮罩材料施加於圖案化基板上，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷； 隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及 所述奈米凹陷中之凝膠材料； 由此界定圍繞所述奈米凹陷之各別子集及所述間隙區域的疏水性障壁之圖案； 根據該圖案施加疏水性材料層，由此形成該疏水性障壁，其中該疏水性材料層具有小於約2 μm之厚度；及 移除該遮罩材料。
26. 如請求項25之方法，其中該疏水性材料層亦施加於該遮罩材料上，且其中移除該遮罩材料移除其上之該疏水性材料層。
27. 如請求項25或26中任一項之方法，其中該遮罩材料之該施加包括： 在該圖案化基板上施加雙層抗蝕劑，該雙層抗蝕劑包括剝離層及成像層； 在該成像層中界定該圖案，由此暴露該剝離層之部分；及 移除該剝離層之經暴露之部分。
28. 如請求項25、26或27中任一項之方法，其中該疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物及其混合物。
29. 如請求項25、26、27或28中任一項之方法，其中在施加該遮罩材料之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成該圖案化基板： 圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷；及藉由以下方法將該凝膠材料附著至所述奈米凹陷： 使所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化； 將該凝膠材料沈積於所述奈米凹陷及所述間隙區域上；及 自所述間隙區域移除該凝膠材料。
30. 一種方法，其包含： 將厚度小於約2 μm之疏水性材料膜層壓至圖案化基板上，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷； 隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及 在所述奈米凹陷中之凝膠材料；並且 將乾燥疏水性材料膜暴露於光微影以形成圍繞所述奈米凹陷之各別子集及所述間隙區域之疏水性障壁。
31. 如請求項30之方法，其中該疏水性材料膜從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。
32. 如請求項30或31中任一項之方法，其中在層壓該疏水性材料膜之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成該圖案化基板： 圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷；及 藉由以下方法將該凝膠材料附著至所述奈米凹陷： 使所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化； 將該凝膠材料沈積於所述奈米凹陷及所述間隙區域上；及 自所述間隙區域移除該凝膠材料。
33. 一種方法，其包含： 將疏水性材料印刷至圖案化基板，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷； 隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及 所述奈米凹陷中之凝膠材料； 其中該疏水性材料經印刷以形成圍繞所述奈米凹陷之相應子集及所述間隙區域之疏水性障壁且具有小於約2 μm之厚度。
34. 如請求項33之方法，其中該疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。
35. 如請求項33或34中任一項之方法，其中在印刷該疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成該圖案化基板： 圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷；及 藉由以下方法將該凝膠材料附著至所述奈米凹陷： 使所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化； 將該凝膠材料沈積於所述奈米凹陷及所述間隙區域上；及 自所述間隙區域移除該凝膠材料。
36. 如請求項33、34或35中任一項之方法，其中該印刷涉及氣溶膠噴塗印刷。
37. 一種方法，其包含： 雷射切割及清除多層前驅物，該多層前驅物包括： 兩個犧牲層；及 定位於該兩個犧牲層之間的具有小於約2 μm之厚度的疏水性材料層； 由此移除該兩個犧牲層中之第一層且界定定位於該兩個犧牲層中之第二層上的該疏水性材料層中的疏水性障壁之圖案； 將圖案化疏水性材料層壓至圖案化基板，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷； 隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及 所述奈米凹陷中之凝膠材料。
38. 如請求項37之方法，其進一步包含移除該兩個犧牲層中之該第二層。
39. 如請求項37或38中任一項之方法，其中該疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。
40. 如請求項37、38或39中任一項之方法，其中在印刷該疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成該圖案化基板： 圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷；及 藉由以下方法將該凝膠材料附著至所述奈米凹陷： 使所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化； 將該凝膠材料沈積於所述奈米凹陷及所述間隙區域上；及 自所述間隙區域移除該凝膠材料。
41. 一種方法，其包含： 用疏水性材料塗佈印模，該印模界定疏水性障壁之圖案；及 將該疏水性障壁之該圖案中之該疏水性材料轉移至圖案化基板，該圖案化基板包括： 界定於該圖案化基板之表面中的奈米凹陷； 隔開所述奈米凹陷之間隙區域；及 所述奈米凹陷中之凝膠材料； 由此形成圍繞所述奈米凹陷之各別子集及所述間隙區域之該疏水性障壁，該疏水性障壁具有小於約2 μm之厚度。
42. 如請求項41之方法，其中該疏水性材料從以下組成之群組中選擇：氟化聚合物、全氟聚合物、矽聚合物、矽烷及其混合物。
43. 如請求項41或42中任一項之方法，其中在轉移該疏水性材料之前，該方法進一步包含藉由以下方法形成該圖案化基板： 圖案化非圖案化支撐物以形成所述奈米凹陷；及藉由以下方法將該凝膠材料附著至所述奈米凹陷： 使所述奈米凹陷及所述間隙區域矽烷化； 將該凝膠材料沈積於所述奈米凹陷及所述間隙區域上；及 自所述間隙區域移除該凝膠材料。
44. 如請求項41、42或43中任一項之方法，其進一步包含從主模板形成該印模。
45. 一種流通槽，其包含： 基板； 定位於該基板上之凝膠材料之奈米墊；及 疏水性材料層，該疏水性材料層i）具有與所述奈米墊之表面至少實質上共平面的表面及ii）經定位以界定圍繞所述奈米墊之各別子集之疏水性障壁。
46. 如請求項45之流通槽，其中： 所述奈米墊中之每一者具有小於約2 μm之厚度；且 該疏水性材料層具有小於約2 μm之厚度。
47. 如請求項45或46中任一項之流通槽，其進一步包含複數個附著至所述奈米墊中之每一者的引子。
48. 一種方法，其包含： 在基板上形成奈米墊之離散子集，所述奈米墊中之每一者具有小於約2 μm之厚度；及 選擇性地將疏水性材料施加於圍繞所述離散子集中之每一者的該基板上，由此形成疏水性障壁，所述疏水性障壁i）圍繞所述離散子集中的每一者、ii）具有與所述奈米墊之表面至少實質上共平面的表面並且iii）具有小於約2 μm之厚度。
49. 如請求項48之方法，其中該疏水性材料之該選擇性施加涉及將該疏水性障壁之圖案中之該疏水性材料轉移至該基板。
50. 如請求項48之方法，其中該疏水性材料之該選擇性施加涉及將該疏水性障壁之圖案中之該疏水性材料印刷至該基板。
51. 如請求項48之方法，其中該疏水性材料之該選擇性施加涉及： 將遮罩材料施加至奈米墊的所述離散子集上，由此界定該疏水性障壁之圖案； 根據該圖案施加該疏水性材料，由此形成該疏水性障壁；及 移除該遮罩材料。
52. 如請求項48、49、50或51中任一項之方法，其中奈米墊之所述離散子集之該形成涉及： 將凝膠材料施加於該基板之表面上； 將遮罩材料安置於該凝膠材料上； 在該遮罩材料及該凝膠材料中形成間隔；及 移除該遮罩材料。

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