JP2022518642A - フローセル - Google Patents

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Abstract

本発明によるフローセルの具体例は、基材を包含し、それは、その基材の表面に画定されたナノ窪みおよび前記ナノ窪みを分離する間隙領域を包含する。疎水性物質層は、前記間隙領域と少なくとも実質的に共表面であり、前記ナノ窪みの各サブセット周りに疎水性バリアを画定するように配置されている、表面を有する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１月２９日に出願され、その内容が、全体において出典明示により、本願に組み込まれる、とみなされる、米国仮出願第62/798,356号の利益を主張する。
生物学的または化学的研究における種々のプロトコルは、局所的サポート表面上または所定の反応チャンバー内で、多数の制御された反応を実行することを伴う。指定された反応を、次いで、観察または検出し、次なる分析が前記反応に関与する化学物質の特性を同定または明らかにすることができる。例えば、いくつかの多重アッセイにおいて、同定可能標識（例えば、蛍光標識）を有する未知の分析物を、制御された条件下、数千の公知のプローブに暴露することができる。公知の各プローブを、マイクロプレートの対応するウェル内に堆積させることができる。前記ウェル内で前記公知のプローブと前記未知の分析物との間で発生するいずれかの化学反応を観測することが、前記分析物を同定し、その特徴を明らかにする助けとなる。当該プロトコルの他の具体例は、シーケンス・バイ・シーケンス (Sequence by Synthesis; SBS)またはサイクリック－アレイ (cyclic-array)配列決定などの公知のDNA配列決定法を含む。ポリヌクレオチド配列決定技術で、前記分析は、前記反応に関与するポリヌクレオチドの特性を同定し、または、明らかにする助けとなる。
導入
ここに開示される第１局面は、基材であって、前記基材の表面に画定されたナノ窪み；および前記ナノ窪みを分離する間隙領域を包含する基材；ならびに、疎水性物質層であって、ｉ）前記間隙領域と、少なくとも実質的に共通する平面である表面を有し、かつ、ｉｉ）前記ナノ窪みの各サブセット周りに疎水性バリアを画定するように位置する疎水性物質層
を含むフローセルである。
第１局面の具体例において、前記基材は、さらに、前記ナノ窪みの各サブセットの各々を取り囲むバリア間隙を包含し；前記疎水性物質層は、前記バリア間隙上に画定され、約2 μm未満の厚みを有する。
第１局面の具体例において、前記基材は、さらに、前記ナノ窪みの各サブセットの各々を取り囲むバリア窪みを包含し；前記疎水性物質層は前記バリア窪みの中に位置する。
第１局面の具体例において、前記疎水性物質層は、約10 nmから約1 μmの範囲の厚みを有する。
第１局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第１局面の具体例において、前記フローセルは、さらに、前記ナノ窪み中のポリマー層；および前記ポリマー層に付着したプライマーを含む。
ここに開示されたフローセルのいかなる特徴も、いずれかの所望する様式および／または構成で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第２局面は、パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；および前記ナノ窪みを分離する間隙領域を包含するパターン化基材上に、疎水性物質を適用し；それによって、ｉ）前記ナノ窪み中に、およびｉｉ）前記間隙領域上に疎水性物質層を形成し、ここに、前記間隙領域上の前記疎水性物質層が約2 μm未満の厚みを有し；前記疎水性物質層の第１部分上に、マスク物質を適用して、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに、疎水性バリアのパターンを画定し、それによって、前記疎水性物質層の第２部分を前記各サブセットにて露出させ；前記疎水性物質層の第２部分を除去し、それによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットを露出させ；前記各サブセットのナノ窪みに、ゲル物質を付着させ；前記マスク物質を前記疎水性物質層の第１部分から除去して、前記疎水性バリアを露わにすること
を含む方法である。
第２局面の具体例において、前記パターン化基材は、さらに、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りのバリア間隙を包含し；前記疎水性バリアは前記バリア間隙上に形成される。
第２局面の具体例において、前記疎水性バリアは、いくつかの前記ナノ窪みの中、および、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットの間に位置するいくつかの前記間隙領域上に形成される。
第２局面の具体例において、前記ゲル物質の付着は、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記各サブセットの間隙領域上、ならびに、前記マスク物質上に、前記ゲル物質を堆積させることを要件とし；前記方法は、さらに、前記マスク物質から、および、前記各サブセットの間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む。
第２局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第２局面の具体例において、前記疎水性物質を適用する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングすることにより、前記パターン化基材を形成して前記ナノ窪みを形成することを含む。ある具体例において、前記パターニングは、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー、またはそれらの組合せを包含する。
第２局面の具体例において、前記マスク物質を前記疎水性物質層の第１部分から除去して、前記疎水性バリアを露わにすることは、前記ゲル物質を付着させる前に行われ；前記ゲル物質を付着させることは、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットの上、ならびに前記疎水性バリアの上に、前記ゲル物質を堆積させることを要件とし；前記方法は、さらに、前記疎水性バリアからおよび前記各サブセットの間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む。
この方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、前記方法および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せも、一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第３局面は、パターン化基材であって、前記パターン化基材のサブセットの表面に画定され、間隙領域によって分離されたナノ窪み；および前記サブセットの各々の周りの前記パターン化基材の表面に画定されたバリア窪みを包含するパターン化基材上に、疎水性物質を適用し；それによって、ｉ）前記バリア窪み中に、およびｉｉ）前記ナノ窪み中に、疎水性物質層を形成し；前記バリア窪み中の前記疎水性物質層上に、マスク物質を適用し；前記疎水性物質層を前記ナノ窪みから除去し；前記サブセットのナノ窪みに、ゲル物質を付着させ；前記マスク物質を前記バリア窪み中の前記疎水性物質層から除去して、疎水性バリアを露わにすることを含む方法である。
第３局面の具体例において、前記ゲル物質の付着は、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセットの上、ならびに前記マスク物質の上に、前記ゲル物質を堆積させることを要件とし；前記方法は、さらに、前記マスク物質から、および前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む。
第３局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマーおよびポリシロキサンよりなる群から選択される。
第３局面の具体例において、前記疎水性物質を適用する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングすることによって前記パターン化基材を形成して、前記ナノ窪みおよび前記バリア窪みを形成することを含む。ある具体例において、前記パターニングは、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー、またはそれらの組合せを包含する。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法、および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第４局面は、パターン化基材であって、前記パターン化基材のサブセットの表面に画定され、間隙領域によって分離されたナノ窪みであって、第１深さを有するナノ窪み；前記サブセットの各々の周りの前記パターン化基材の表面に画定され、前記第１深さよりも大きい第２深さを有するバリア窪みを包含するパターン化基材に、疎水性物質を適用し；それによって、ｉ）前記バリア窪み内に、およびｉｉ）前記ナノ窪み内に、前記疎水性物質を導入したパターン化基材上に、疎水性物質を導入し；前記ナノ窪みから、前記疎水性物質を除去し、それによって、少なくともいくらかの前記疎水性物質を、前記バリア窪み中に残し；前記バリア窪み中に残った前記少なくともいくらかの前記疎水性物質を硬化させることを含む方法である。
第４局面の具体例において、前記方法は、さらに、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセット上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することによって、前記ナノ窪みにゲル物質を付着させることを含む。
第４局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第４局面の具体例において、前記疎水性物質を適用する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングすることによって前記パターン化基材を形成して、前記ナノ窪みおよび前記バリア窪みを形成することを含む。ある具体例において、前記パターニングは、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー、またはそれらの組合せを包含する。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法、および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第５局面は、パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材上に、マスク物質を適用し、それによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに疎水性バリア用のパターンを画定し；前記パターンに従って疎水性物質層を適用し、それによって、前記疎水性バリアを形成し、ここに、前記疎水性物質層は、約2 μm未満の厚みを有し；前記マスク物質を除去することを含む方法である。
第５局面の具体例において、前記疎水性物質層も前記マスク物質上に適用され、ここに、前記マスク物質を除去することが、その上の前記疎水性物質層を除去する。
第５局面の具体例において、前記マスク物質の適用は、前記パターン化基材上に二層レジストを適用し、前記二層レジストは前記リフトオフ層および撮像層を包含し；前記撮像層中に前記パターンを画定し、それによって、前記リフトオフ層の部分を露わにし；前記リフトオフ層の露わにされた部分を除去することを含む。
第５局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第５局面の具体例において、前記マスク物質を適用する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から前記ゲル物質を除去することを含む。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法、および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第６局面は、パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、約2 μm未満の厚みを有する疎水性物質フィルムを積層し；乾燥した疎水性物質フィルムをフォトリソグラフィーに付して、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに疎水性バリアを形成することを含む方法である。
第６局面の具体例において、前記疎水性物質フィルムは、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第６局面の具体例において、前記疎水性物質フィルムを積層する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を付着させ；前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法、および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第７局面は、パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、疎水性物質をプリントし、ここに、前記疎水性物質をプリントして、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに疎水性バリアを形成し、約2 μm未満の厚みとすることを含む方法である。
第７局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第７局面の具体例において、前記疎水性物質をプリントする前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングし、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む。
第７局面の具体例において、前記プリントは、エアロゾルプリンティングを要件とする。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法、および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第８局面は、２枚の犠牲層；および約2 μm未満の厚みを有し、前記２枚の犠牲層の間に位置する疎水性物質層を含む多層プリカーサーをレーザーカッティングおよびウィーディング (weeding)し；それによって、前記２枚の犠牲層のうち第１のものを除去し、前記２枚の犠牲層のうち第２のものの上に位置する前記疎水性物質層中に、疎水性バリアのパターンを画定し；パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、前記パターン化疎水性物質を積層することを含む方法である。
第８局面の具体例において、前記方法は、さらに、前記２枚の犠牲層のうち第２のものを除去することを含む。
第８局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第８局面の具体例において、前記疎水性物質をプリントする前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から前記ゲル物質を除去することを含む。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
ここに開示される第９局面は、疎水性物質でスタンプをコーティングし、前記スタンプは、疎水性バリアのパターンを画定し；パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み、前記ナノ窪みを分離する間隙領域、および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、前記疎水性バリアのパターンで前記疎水性物質を転写し、それによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに、前記疎水性バリアを形成することを含み、前記疎水性バリアは約2 μm未満の厚みを有する、方法である。
第９局面の具体例において、前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される。
第９局面の具体例において、前記疎水性物質を転写する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から前記ゲル物質を除去することを含む。
前記方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法およびその他の方法、および／または前記フローセルの特徴のいかなる組合せを一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
第１０局面において、フローセルのもうひとつの具体例は、基材；前記基材上に位置するゲル物質のナノパッド；および、疎水性物質層であって、ｉ）前記間隙領域と少なくとも実質的に共通する平面である表面を有し、およびｉｉ）前記ナノパッドの各サブセット周りに疎水性バリアを画定するように位置する、疎水性物質層を含む。
第１０局面の具体例において、前記ナノパッドの各々は約2 μm未満の厚みを有し；前記疎水性物質層は約2 μm未満の厚みを有する。
第１０局面の具体例において、前記フローセルは、さらに、前記ナノパッドの各々に付着した複数のプライマーを含む。
このフローセルのいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、このフローセルおよび／または前記方法および／または他のフローセルの特徴のいずれの組合せも一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
第１１局面において、方法のもうひとつの具体例は、基材上にナノパッドの離散的なサブセットを形成し、前記ナノパッドの各々は約2 μm未満の厚みを有し；前記離散的なサブセットの各々周りに、前記基材上に疎水性物質を選択的に適用し、それによって、ｉ）前記離散的なサブセットの各々の周りに、ｉｉ）前記ナノパッドの表面と少なくとも実質的に共平面である表面を有し、かつ、ｉｉｉ）約2 μm未満の厚みを有する、疎水性バリアを形成することを含む。
第１１局面の具体例において、前記疎水性物質の選択的適用は、前記疎水性バリアのパターンで前記疎水性物質の前記基材への転写を要件とする。
第１１局面のもうひとつの具体例において、前記疎水性物質の選択的適用は、前記疎水性バリアのパターン中の前記疎水性物質の前記基材へのプリントを要件とする。
第１１局面のさらにもうひとつの具体例において、前記疎水性物質の選択的適用は、ナノパッドの前記離散的なサブセットへマスク物質を適用し、それによって、前記疎水性バリア用のパターンを画定し；前記パターンに従って前記疎水性物質を適用し、それによって、前記疎水性バリアを形成し；前記マスク物質することを含む。
第１１局面の具体例において、ナノパッドの前記離散的なサブセットの形成は、前記基材の表面上にゲル物質を適用し；前記ゲル物質上にマスク物質を配置し；前記マスク物質および前記ゲル物質中に空間を形成し；前記マスク物質を除去することを含む。
この方法のいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で、一緒に組み合わせることができる、と理解されるべきである。さらに、この方法および／またはその他の方法および／または前記フローセルの特徴のいかなる特徴も一緒に、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせて用いることができる、と理解されるべきである。
なおさらに、いずれかの前記方法および／またはいずれかの前記フローセルのいかなる特徴も、いずれかの所望する様式で一緒に用いることができ、および／または、ここに開示されたいずれかの具体例と組み合わせることができ、少なくとも、ここで開示されるような利益を達成することができる、と理解されるべきである。
本開示の具体的な特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照して明らかになる。同様の参照番号は、同様であるが、おそらく同一ではない構成要素に対応する。簡潔性のため、前述した機能を有する参照番号または特徴は、それらが出現する他の図面と関連して、記載されることも、記載されないことある。
図1は、ここに開示されたひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のひとつの具体例を例示する(i)から(vii)を含む概略フローダイアグラムである。
図2は、ここに開示されたもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のもうひとつの具体例を例示する(i)から(ix)を含む概略フローダイアグラムである。
図3は、ここに開示されたさらにもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のさらにもうひとつの具体例を例示する(i)から(vii)を含む概略フローダイアグラムである。
図4は、ここに開示されたなおもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のもうひとつの具体例を例示する(i)から(vi)を含む概略フローダイアグラムである。
図5は、ここに開示されたなおさらなる具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のなおさらなる具体例を例示する(i)から(viii)を含む概略フローダイアグラムである。
図6は、ここに開示されたさらにもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のさらにもうひとつの具体例を例示する(i)から(vi)を含む概略フローダイアグラムである。
図7は、ここに開示されたもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のもうひとつの具体例を例示する(i)から(v)を含む概略フローダイアグラムである。
図8は、ここに開示されたさらなる具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のさらなる具体例を例示する(i)から(iv)を含む概略フローダイアグラムである。
図9は、ここに開示されたさらにもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のさらにもうひとつの具体例を例示する(i)から(v)を含む概略フローダイアグラムである。
図10は、ここに開示されたさらにもうひとつの具体例を形成するための、ここに開示される前記方法のさらにもうひとつの具体例を例示する(i)から(iv)を含む概略フローダイアグラムである。
図11は、図1から図10に記載された前記方法のいずれかによって形成された具体的なフローセルの部分の上面図である。
図12Aから12Cは、ここに開示される前記フローセルの具体例とともに用いることができるDNAビーズまたはハイドロゲル複合の異なる具体的な概略図である。
図13Aから13Fは、約2 μmの厚みを有する各疎水性物質層によって画定され、前記マイクロチャンバー形状内部のDNAクラスターをDNAインターカレーターダイ（例えば、SYTOX）で染色した後の様々な具体的な前記マイクロインターカレーターダイの白黒蛍光顕微鏡像である。
図14A(i)および(ii)、14B(i)および(ii)、ならびに14C(i)および(ii)は、流体がそこに導入されたとき（上面図、すなわち、14A(i)、14B(i)、および14C(i)）、ならびに、吸引が行われたとき（下面図、すなわち、14A(ii)、14B(ii)、および14C(ii)）の、ここに開示された前記マイクロチャンバー形状の具体例を包含する、フローセルの白黒蛍光顕微鏡像である。
図15は、配列決定ランの実行後の、具体的なフローセル上の様々なマイクロチャンバーのオリジナルカラー蛍光顕微鏡像の白黒表示である。
図16Aから16Eは、約1 μmの厚みを有する各疎水性物質層によって画定され、吸引が行われた後の様々な具体的な前記マイクロチャンバー形状の白黒蛍光顕微鏡像である。
図17Aから17Dは、約200 μmの厚みを有する各疎水性物質層によって画定され、吸引が行われた後の様々な具体的な前記マイクロチャンバー形状の白黒蛍光顕微鏡像である。
図18Aおよび18Bは、疎水性物質層によって画定され、A) 蛍光標識プライマーがグラフトされた後、およびB) 前記蛍光液体がオイルで置換された後の具体的な六角形マイクロチャンバー形状の白黒蛍光顕微鏡像である。
図19は、プリントされた疎水性物質層によって画定された具体的なマイクロチャンバーのマイクログラフである。
ここに開示される前記フローセルのいくつかの具体例は、間隙領域によって分離されたナノ窪みを有するパターン化基材を包含する。これらの具体例において、前記間隙領域と少なくとも実質的に共平面である疎水性物質層が前記ナノ窪みの１以上のサブセット周りに周縁を画定する。ここに開示される前記フローセルのその他の具体例は、前記基材上に位置するゲル物質のナノパッドを有する基材を包含する。これらの具体例において、前記疎水性物質層は、前記ナノパッドの表面と少なくとも実質的に共平面であり、前記ナノパッドの１以上のサブセット周りに周縁を画定する。前記具体的な全てにおいて、前記疎水性物質層が、前記サブセット周りに疎水性バリアを創出する。前記フローセルの使用中、前記疎水性バリアは、ナノ窪みまたはナノパッドのサブセットに向けて、より親水性の試薬およびサンプルを導く助けとなり得る。その結果、試薬およびサンプルは、より効率的に、反応領域（例えば、前記ナノ窪みまたは前記ナノパッド）に到達し、前記フローセルに渡る試薬およびサンプル残渣および／または汚染物質を低減するかまたは除去する助けとなり得る。配列決定反応中、前記疎水性バリアも、前記バリア内に放出された配列決定ライブラリーが、前記バリアの外部に拡散することを防止し得る。
上述したように、いくつかの具体例において、前記疎水性物質層は、前記間隙領域と少なくとも実質的に共平面であり；その他の具体例において、前記ナノパッドの表面と少なくとも実質的に共平面である。「少なくとも実質的に共平面」とは、前記疎水性物質層の表面が、前記間隙領域の表面または前記ナノパッドの表面を越えて、Z-方向に2 μmよりも外に飛び出ていないことをいう。Z-方向は三次元空間のデカる、と座標系のZ-軸をいう。いくつかの実例において、前記疎水性物質層および前記間隙領域またはナノパッド表面は、実質的に共平面である。前記間隙領域および前記疎水性物質層が実質的に共平面である一つの具体例において、前記疎水性物質層は単層であり、例えば、約10オングストロームの桁である。その他の実例において、前記疎水性物質層および前記間隙領域またはナノパッド表面は、共平面である。前記実質的に共平面の疎水性物質層は、撮像の間、オートフォーカスに影響しない。さらに、前記疎水性物質層が、前記間隙領域または前記ナノパッドの表面よりもZ-方向に高く外に飛び出していないとき、より高い部分（例えば、前記間隙領域または前記ナノパッドの表面の上方に飛び出した前記疎水性物質層の部分）の厚みは、前記疎水性物質層の側壁上のシードに対する配列決定ライブラリーにとって、非常に薄い。かくして、いくつかの具体例において、前記疎水性物質層の側壁に対する配列決定ライブラリーの喪失は、より厚い側壁で見られるであろう喪失と比較して、少なくとも減少している。具体例において、前記間隙領域または前記ナノパッドの表面の上方に飛び出した前記疎水性物質層の部分の厚みは、2 μmより少ない。いくつかの具体例において、前記間隙領域または前記ナノパッドの表面の上方に飛び出した前記疎水性物質層の部分の厚みは、約20 nmから約2 μm、例えば、約10 nmから約100 nm、約100 nmから約1 μm、または約1 μmから約2 μmの範囲である。他の値も可能である。
ここに開示された前記方法に用いられる前記疎水性物質は、水を弾くか水と混合しないいかなる物質をも包含する。
定義
ここで用いられる用語は、断りのない限り、関連技術における通常の意味を取る。ここで用いられるいくつかの用語およびそれらの意味は以下に記載される。
ここで用いられる、とき、単数形「不定冠詞 ‘‘a’’」、「不定冠詞 ‘‘an’’」および「定冠詞 ‘‘the’’」は、文脈が明確に異なることを示さない限り、単数および複数のいずれもいう。ここで用いられる用語「含む ‘‘comprising’’」は、「包含する ‘‘including’’」、「含有する ‘‘containing’’」、「特徴とする ‘‘characterized by’’」と同義であり、包括的または開放的であり、かつ、追加の記載されていない要素または工程を排除しない。
「ひとつの具体例」、「もうひとつの具体例」、「具体例」などに対する明細書全体の参照は、前記具体例に関連して記載される特定の要素（例えば、特徴、構造、組成、構成、および／または性質）が、ここに記載された少なくともひとつの具体例に包含され、その他の具体例において、存在していてもしていなくても構わないことを意味する。さらに、いかなる具体例についての記載された要素も、文脈が明確に異なることを示さない限り、前記種々の具体例において、いずれかの適切な様式で組み合わせることができる、と理解されるべきである。
この開示全体を通して用いられる用語「実質的に」および「約」は、特許請求の範囲も含めて、工程バラツキのような、小さな変動を記載し、考慮するために用いられる。例えば、これらの用語は、記述した値から±5%以内、例えば、記述した値から±2%以内、記述した値から±1%以内記述した値から±0.5%以内、記述した値から±0.2%以内、記述した値から±0.1%以内、記述した値から±0.05%以内を意味する。
アダプター：例えば、ライゲーション (ligation)またはタグメンテーションによって、核酸分子に融合し得る線状オリゴヌクレオチド配列。いくつかの具体例において、前記アダプターは、前記フローセルに導入されるいかなる標的配列の3’末端または5’末端に実質的に非-相補的である。適切なアダプター長は、約10ヌクレオチドから約100ヌクレオチド、または約12ヌクレオチドから約60ヌクレオチド、または約15ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲であってよい。前記アダプターは、ヌクレオチドおよび／または核酸のいかなる組合せも包含することができる。いくつかの具体例において、前記アダプターは、１以上の場所にて１以上の切断基を包含する。いくつかの具体例において、前記アダプターは、少なくともプライマーの部分、例えば、ユニバーサルヌクレオチド配列（P5またはP7配列のような）を包含するプライマーに相補的な配列を包含し得る。いくつかの具体例において、前記アダプターは、ダウンストリームエラー訂正、同定、または配列決定において支援するインデクスまたはバーコード配列を包含し得る。前記インデクスは、前記核酸分子（例えば、フラグメント）のサンプルまたは源に対してユニークであってよい。いくつかの具体例において、前記アダプターは、配列決定プライマー配列または配列決定結合部位を包含し得る。様々なアダプターの組み合わせは、DNAフラグメントのような、核酸分子に組み込むことができる。
捕捉部位：物理修飾および／または複合体の局在化を許容する化学特性で修飾されている、フローセル表面の部分。ある具体例において、前記捕捉部位は化学捕捉剤を包含することができる。
担体：その中に含有された配列決定ライブラリーを有することができるハイドロゲルサポート、または、その表面に付着したシーケンシング-レディ核酸フラグメントを有することができる固体サポート。
チャンバー：疎水性バリアによって画定された周縁内部にある前記フローセルの部分。前記疎水性バリアが前記チャンバーの周縁を画定するので、前記チャンバーは、物理的側壁を有していなくても、高さ2 μm未満の側壁を有していてもよい。
化学捕捉剤：標的分子（すなわち、複合体）に付着し、保持し、または結合することができる物質、分子または部分。ひとつの具体的な化学捕捉剤は、前記標的分子の、または、付着した標的核酸の少なくとも部分に相補的な捕捉核酸（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）を包含する。さらにもうひとつの具体的な化学捕捉剤は、前記標的分子（または、前記標的分子に付着した連結部分）に結合することができるレセプター-リガンド結合ペア（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合プロテイン、エピトープ、抗体など）のメンバーを包含する。前記化学捕捉剤のなおもうひとつの具体例は、前記標的分子と、静電相互作用、水素結合、または共有結合（例えば、チオール-ジスルフィド交換、クリックケミストリー (click chemistry)、ディールス-アルダーなど）を形成することができる化学試薬である。
複合体：ハイドロゲルサポートまたは固体サポートのような担体、ならびに前記担体に付着するか、その内部に含有されたシーケンシング-レディ核酸フラグメント。前記担体は、その他のメンバーが前記捕捉部位の一部である、結合ペアのひとつのメンバーも包含することができる。
外部固定化剤：前記フローセルチャンバーに導入されている複合体と相溶しない気体、液体または粘性媒体。気体外部固定化剤を用いて、複合体まわりに液滴を作り出すことができる。気体外部固定化剤の具体例は、適切なフローレートで前記フローセル全体に向けられた空気である。例えば、空気を用いて、前記フローセルから、複合体を含有する流体を吸引して、記複合体またはサンプルを含有する前記液体の液滴を形成することができる。前記形成した液滴は核酸バリアとして作用する。前記液体または粘性媒体を用いて、複合体から放出された配列決定ライブラリーの拡散を防止する。前記外部固定化剤は、前記配列決定ライブラリーまたはいかなる他のポリヌクレオチドも前記外部固定化剤において全くないしはほとんど溶媒和しないので、拡散バリアを形成できる。液体形態の具体的な外部固定化剤は、ミネラル油、シリコーン油、パーフルオロ化油、フッ素化炭素油（例えば、3MからのFLUORINERTTM FC40）、またはそれらの組合せのような疎水性油を包含する。粘性媒体形態の具体的な外部固定化剤は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなど）、デキストラン、スクロース、グリセロールなどを含有するバッファーを包含する。いくつかの具体例において、前記粘性媒体は温度応答性ゲルである。前記温度応答性ゲルは未シード温度にて非粘稠であり、シード温度にて粘性媒体になる。温度応答性ゲルの具体例は、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)およびポリエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシド-ポリエチレンオキシド (PEO-PPO-PEO)／ラポナイトナノ粒子コンポジットを包含する。
フラグメント：遺伝子物質（例えば、DNA、RNAなど）の部分またはピース。
ハイドロゲルまたはハイドロゲルマトリクス：共有、イオン、または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉して前記ゲルを形成する三次元オープンラティス構造を作り出す有機ポリマー（天然または合成）を包含するコロイド物質。ある具体例において、前記ハイドロゲルは、約60%から約90%の、水のような流体、および約10%から約30%ポリマーを包含する。前記ハイドロゲルは、多孔質であり、すなわち、オープン／ボイド空間を包含する。有孔率は、前記ハイドロゲルの体積分率（無次元）であり、すなわち、物質中の実測ボイド空間であり、0と100%との間のパーセンテージ（または、0と1との間の分率）として、総体積あたりの前記ボイド体積の分率である。ある具体例において、前記ハイドロゲルの有孔率は、約50% (0.5)から約99% (0.99)であってよい。前記有孔率は、試薬（例えば、酵素、化学物質、および、より小さいサイズのオリゴヌクレオチド（50未満の塩基対、例えば、プライマー）の拡散を許容するのに十分であるが、それより大きなサイズの核酸分子（例えば、サンプル、フラグメントなど）の拡散は禁止する。
ハイドロゲルサポート：少なくとも実質的に球形状であるハイドロゲル（例えば、ハイドロゲルビーズ）であって、その中に配列決定ライブラリーを含有し得る。
疎水性バリア：ナノ窪みのサブセット周りの構成における基材表面上または窪み中に適用される疎水性物質の層。
核酸分子：いかなる長さのヌクレオチドのポリマー形態は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの組合せ、またはそれらの混合物を包含することができる。その用語は、一本鎖らせんまたは二本鎖らせんポリヌクレオチドをいうこともできる。
「標的」または「テンプレート」核酸分子は、分析されるべき配列をいう。
核酸分子中のヌクレオチドは、天然産出ヌクレオチドおよびその機能性アナログを包含することができる。機能性アナログの具体例は、配列特異様式で核酸にハイブリダイズすることができるか、または特定のヌクレオチド配列の複製用テンプレートとして用いることができる。天然産出ヌクレオチドは、通常、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。アナログ構造は、様々な公知技術のいずれかを包含する代替骨格リンケージを有し得る。天然産出ヌクレオチドは、通常、デオキシリボース糖（例えば、DNAに見いだされる）またはリボース糖（例えば、RNAに見いだされる）を有する。アナログ構造は、様々な公知技術のいずれかを包含する代替糖部分を有し得る。ヌクレオチドは、ネイティブまたは非ネイティブ塩基を包含し得る。ネイティブDNSは、１以上のアデニン、チミン、シトシンおよび／またはグアニンを包含し得、ネイティブRNAは、１以上ののアデニン、ウラシル、シトシンおよび／またはグアニンを包含し得る。ロック核酸 (LNA)およびブリッジ核酸 (BNA)のような、いかなる非ネイティブ塩基を用いることができる。
プライマー：対象の標的配列にハイブリダイズし得る核酸分子。ある具体例において、プライマーは基材として機能し、その上では、ヌクレオチドがポリメラーゼによって高分子化され得る。例えば、増幅プライマーは、テンプレート増幅およびクラスター生成の開始点として働く。さらにもうひとつの具体例において、プライマーは、DNAまたはRNA合成の開始点として働き得る。例えば、配列決定プライマーは、合成核酸テンプレートらせんにハイブリダイズして、前記合成核酸テンプレートらせんに相補的な新たならせんをプライム (prime)合成し得る。プライマーは、ヌクレオチドまたはそれらの組合せのいかなる組合せも包含し得る。いくつかの具体例において、プライマーは、一本鎖らせんオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。
サンプル：細胞、微生物叢、または核酸など、いかなる遺伝子物質の起源。いくつかの具体例において、細胞は、原核または真核細胞を包含する単一細胞である。いくつかの具体例において、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、または細菌細胞である。いくつかの具体例において、核酸は、ウイルス核酸、細菌核酸、または哺乳動物核酸を包含する長鎖DNA分子である。いくつかの具体例において、サンプルは、挿入物を介して、例えば、固体サポート（例えば、ビーズ）の表面に結合したトランスポゾンに、（フラグメントとして）結合している。
シーケンシング-レディ (sequencing-ready)核酸フラグメント：3’および5’末端にアダプターを有する遺伝子物質の部分（フラグメント）。シーケンシング-レディ核酸フラグメントにおいて、各アダプターは、（例えば、少なくとも、フローセル上のプライマーの部分に相補的である）公知のユニバーサル配列および配列決定プライマー配列を包含する。前記アダプターの双方とも、インデクス（バーコードまたはタグ）配列を包含することもできる。ある具体例において、P5側はビーズインデクスを含有することができ、P7側はサンプルインデクスを含有することができる。シーケンシング-レディ核酸フラグメントは、固体サポート（例えば、ビーズ）の表面に結合したトランスポゾンの挿入を介して結合されているか、または、結合ペアその他の切断可能リンカーによって直接固定化されていてよい。シーケンシング-レディ核酸フラグメントは、ハイドロゲルサポート内に含有されることもある。
シーディング (Seeding)：ここに開示される前記フローセルの具体的なチャンバー中のアダプトされたフラグメントの固定化（例えば、シーケンシング-レディ核酸フラグメント）。
配列決定ライブラリー：１以上の標的核酸分子の核酸フラグメント、または前記フラグメントのコレクション。いくつかの具体例において、前記フラグメントは、１以上のアダプターに、それらの3’および5’末端にて連結される。いくつかの具体例において、配列決定ライブラリーは、１以上の標的核酸分子から調製され、複合体の一部である。その他の具体例において、配列決定ライブラリーは、サンプルを用いるフローセル表面上で調製される。
固体サポート：例えば、球体、楕円形、マイクロ球体その他の、定型または不定型な寸法を有する認識された粒子形状として特徴付けられる形状を有する剛直ないし半剛直物質で作成された小体。固体サポートは、そこに付着された配列決定ライブラリーを有し得る。固体サポートに有用な具体的な物質は、制限なく、ガラス；アクリル、ポリスチレンもしくはスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタンもしくはポリテトラフルオロエチレン（The Chemours CoからのTEFLON(R)など）などのプラスチック；アガロースまたはセファロースのような、多糖類または架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリコンおよび変性シリコンを包含するシリカもしくはシリカ-ベース物質；カーボンファイバー；金属；無機ガラス；光ファイバー束、または様々な他のポリマーを包含する。具体的な固体サポートは、制御されたポアガラスビーズ、常磁性その他の磁性ビーズ、ソリアゾル、セファロースビーズ、ナノクリスタルおよび、例えば、Bangs Laboratories, Fishers Ind.からのマイクロ球体検出ガイド (Microsphere Detection Guide)に記載するような他の公知技術を包含する。
タグメンテーション (tagmentation)：単一ステップで、前記核酸分子をフラグメント化し、かつ、前記フラグメントの5’および3’末端にアダプターをライゲートするとランスポソームによる、核酸分子（例えば、DNAまたはRNAサンプル）の修飾。タグメンテーション反応を用いて、前記固体サポートを包含する配列決定ライブラリー、特に、複合体を調製することができる。タグメンテーション反応は、ランダムサンプルフラグメント化と、アダプターライゲーションを単一ステップにひとまとめにし、それで、前記配列決定ライブラリー調製プロセスの呼応率を増大する。
トランスポソーム：インテグレーション酵素（例えば、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ）と、インテグレーション認識部位（例えば、トランスポザーゼ認識部位）を包含する核酸との間で形成される複合体。
ユニバーサルヌクレオチド配列：２以上の核酸分子に共通する配列の領域であり、前記分子は互いに相違する領域も有する。分子コレクションの異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル捕捉核酸（すなわち、少なくともプライマーの部分に相補的な配列を有する前記アダプター）の母集団を用いて、いくつかの異なる核酸の捕捉を許容し得る。同様に、分子コレクションの異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列決定結合部位（配列決定プライマー配列）の母集団を用いて、いくつかの異なる核酸の増幅または複製を許容し得る。
フローセルおよび方作成方法
ここに開示されたいくつかの具体例において、前記フローセルは：前記基材の表面および前記ナノ窪みを分離する間隙領域中に画定されたナノ窪みを包含する基材；および、ｉ）前記間隙領域と少なくとも実質的に共通平面である表面を有し、かつ、ｉｉ）前記ナノ窪みの各サブセット周りに疎水性バリアを画定するように位置する疎水性物質層を、包含する。様々な具体的なフローセル10A-10Iは、図1から図9に図示される。前記フローセル10A-10Iの種々の特徴は、図1から図9を併せて参照して説明され、次いで、各個別のフローセル10A-10Iの前記作成方法は、前記フローセル10A-10Iが図示された個別の図面を参照して説明される。
具体的なフローセル10A-10Iの各々は、パターン化基材12を包含する。前記基材12は、通常、剛直であり、水性液体に不溶である。前記基材12は、単層または多層構造であってよい。適切な基材12の具体例は、エポキシシロキサン、ポリヘドラルオリゴメリックシルセスキオキサン (POSS)またはその誘導体、ガラス、変性ガラス、プラスチック、ナイロン、セラミック／セラミック酸化物、シリカ（酸化ケイ素 (SiO2)）、フューズドシリカ、シリカ-ベース物質、アルミナシリケート、シリコン、変性シリコン（例えば、ボロンドープドp+シリコン）、窒化ケイ素 (Si3N4)、五酸化タンタル (TaO5)その他の酸化タンタル (TaOx)、酸化ハフニウム (HaO2)、無機ガラスなどを包含する。前記基材12に対して適切なプラスチックのいくつかの具体例は、アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（The Chemours Co.からのTEFLON(R)など）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー (COP)（ZeonからのZEONOR(R)など）、ポリイミドなどを包含する。前記基材12は、その表面に酸化タンタルその他のセラミック酸化物のコーティング層を有するガラスまたはシリコンまたはPOSSであってもよい。前記基材12は、その表面にPOSSのコーティング層を有するガラスまたはシリコンであってもよい。
前記基材12の形態は、ウエハー、パネル、矩形シート、ダイ、その他のいかなる適切な構成であってよい。ある具体例において、前記基材12は、約2 mmから約300 mmの範囲の直径を有する円形ウエハーまたはパネルであってよい。より特別な具体例として、前記基材12は、約200 mmから約300 mmの範囲の直径を有するウエハーである。もうひとつの具体例において、前記基材12は、約10フィート（～ 3メートル）までの最大寸法を有する矩形シートまたはパネルであってよい。特別な具体例として、前記基材12は、約0.1 mmから約10 mmの範囲の幅を有するダイである。具体的な寸法を提示してきたが、いかなる適切な寸法を有する基材12を用いることができる、と理解されるべきである。
具体的なフローセル10A-10Iの各々は、前記ナノ窪み14も包含する。前記具体例の各々において、前記ナノ窪み14は、前記パターン化基材12中に画定される。前記ナノ窪み14は、前記基材12中に、「画定される」とみなされる。なぜならば、ｉ）前記基材表面S12が、前記ナノ窪み14を分離する前記間隙領域16を画定し、ｉｉ）もうひとつのｌ基材表面S’12が、前記ナノ窪み14の底面を画定し；かつ、ｉｉｉ）前記基材12が、前記ナノ窪み14の壁も画定するからである。
前記ナノ窪み14を生成するための方法は、図1から図9の各々を参照して、より詳細に説明される。
前記ナノ窪み14は、いかなる適切なパターンまたはレイアウトで、前記基材12全体に分散されていてもよい。前記ナノ窪み14のサブセット18A, 18Bは、疎水性バリア20A-20Iによって分離されていてもよい。各サブセット18A, 18Bにおけるナノ窪み14のパターンは、同一であってもよく；または、異なるサブセット18A, 18Bにおいて、異なるパターンのナノ窪み14を用いることもできる。多くの異なるパターン／レイアウトの前記ナノ窪み14が想定され、定型、繰り返しおよび、不定型パターンを包含する。ある具体例において、前記ナノ窪み14は、密充填および密度の向上のため六角形格子状に配置される。その他のレイアウトは、例えば、平行四辺形レイアウト（すなわち、長方形、正方形など）、三角形レイアウト、円形レイアウトなどを包含することができる。
各ナノ窪み14は、円形、楕円形、多角形（例えば、三角形、四角形、五角形など）などのいかなる適切な形状（および対応する三次元形状）も有することができる。
各ナノ窪み14のサイズは、その開口面積、直径、ならびに／または長さおよび幅で特徴付けることができる。ナノ窪み14なる用語をここで用いているが、窪み14の１以上の寸法は、ナノ-スケール（例えば、約1 nmから、含まれないが1000 nmまで）で、または、マイクロスケール（例えば、約1 μmから、含まれないが1000 μmまで）であってよい、と理解されるべきである。
各窪み開口で占められる面積は、複合体が前記ナノ窪み14に浸入できないように選択し得る。ある具体例において、各窪み開口の面積は、少なくとも約1×10－３ μm２、約1×10－２ μm２、約0.1 μm２、または約0.5 μm２、または約1 μm２、または約4 μm２であり得る。各窪み開口で占められる面積は、上記した値より小さいか、それらの間であり得る。
いくつかの実例において、各ナノ窪み14の直径、または長さおよび幅は、少なくとも約1 nm、50 nm、約100 nm、約500 nm、約2 μmまでであり得る。窪み直径の具体例は、約1 nmから約500 nmの範囲である。窪み直径のもうひとつの具体例は、約300 nmから約1 μmである。
前記ナノ窪み14は深さも有することができる。具体的には、各窪み16の深さは、少なくとも約10 nm、少なくとも約50 nm、少なくとも約1 μm、約10 μm、約50 μmまたはそれ以上であり得る。いくつかの具体例において、深さは約0.4 μmである。各ナノ窪み14の深さは、上記した値より大きいか、それらの間であり得る、理解されるべきである。
隣接するナノ窪み14は、所与のサブセット18A, 18B内の前記間隙領域16で分離される。前記サブセット18A, 18Bは、前記疎水性バリア20A-20Iの具体例によって分離される。平均窪みピッチは、ひとつのナノ窪み14の中心から隣接するナノ窪み14の中心までの間隔（センター－センター間隔）またはひとつのナノ窪み14の縁から隣接するナノ窪み14の縁までの間隔（エッジ－エッジ間隔）を表す。前記ナノ窪み14のレイアウトまたはパターンが規則的であって、平均ピッチに対する変動係数が小さいか、または、レイアウトまたはパターンが不規則的であって、変動係数が比較的大きい。いずれの場合も、平均ピッチは、前記疎水性バリア20A, 20B, 20C, 20Dの構成に依存して、例えば、少なくとも約10 nm、または少なくとも約0.1 μm、または少なくとも約0.5 μm、またはそれ以上であり得る。代替的にまたは付随的に、例えば、最大で約0.5 μm、または、最大で約0.1 μm、またはそれ未満であり得る。特定のパターンのナノ窪み14の平均ピッチは、上記範囲から選択される下限値のひとつと、上限値のひとつとの間であり得る。
前記疎水性バリア20A, 20B, 20C, 20Dの構成は、前記フローセル10A, 10B, 10C, 10Dの各々で異なる。これらの構成は、独立して、図1、図2、図3および図4を参照して、説明する。前記疎水性バリア20E-20I（図5から図9に図示される）の構成は、図2（2(vii)を参照せよ）に図示される前記疎水性バリア20Bと同様であるが、図5から図9に示される前記方法は、図1（1(vii)を参照せよ）に図示される前記疎水性バリア20Aを形成するのにも用いることができる、と理解されるべきである。前記構成のひとつの共通する特徴は、前記疎水性バリア20A-20Iが、各ナノ窪みのサブセット14周りに周縁を画定することである。前記周縁内の前記フローセル10A-10Iの部分（例えば、前記ナノ窪みのサブセット14が位置する部分）は、チャンバー24ということができる。
各チャンバー24のサイズは、その面積、直径、ならびに／または長さおよび幅で特徴付けることができる。前記チャンバー24は、少なくとも実質的に共平面の疎水性バリア20A-20Iで画定されるので、前記チャンバー24は、深さを有さず、深さを有している場合、約2 μm未満である、と理解されるべきである。
ある具体例において、各チャンバー24の面積は、少なくとも約1 μm2、約10 μm2、約100 μm2、またはそれ以上であり得る。各チャンバー24で占められる面積は、上記した値より大きいか、それらの間であり得る、理解されるべきである。
いくつかの実例において、各チャンバー24の直径または長さおよび幅は、少なくとも約1 μm、約10 μm、約20 μm、約30 μm、約40 μm、約50 μm、約100 μm、またはそれ以上であり得る。前記チャンバー24の直径の具体例は、約1 μmから約1000 μmの範囲である前記チャンバーの直径のもうひとつの具体例は、約10 μmから約50 μmの範囲である。前記チャンバー24が長さおよび幅を有する場合、長さおよび幅は、同一または異なっていてもよい、と理解されるべきである。
前記チャンバー24は、深さを有していても、いなくてもよい。この深さは、前記疎水性物質層22、および、かくして、前記疎水性バリア20が、前記間隙領域16の表面を超えてZ-方向外側に飛び出しているか否かに依存する。ここに開示されたいずれかの具体例において、深さは2 μmを超えない。
前記疎水性バリア20A-20Iの各具体例は、疎水性物質または疎水性物質層22も包含する。前記種々の方法を参照してより詳細に説明するように、疎水性物質を適用して、前記疎水性物質層22を形成する。ここに開示されたいずれかの具体例において、前記疎水性物質または疎水性物質層22は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマーおよびそれらの混合物よりなる群から選択される。具体例として、前記疎水性物質または疎水性物質層22は、アモルファスフルオロポリマー（その商業的に入手可能な具体例は、AGC ChemicalsからのCYTOP(R)シリーズ中のそれらを包含し、それらは、以下の末端機能基のひとつを有する：Aタイプ: -COOH, Mタイプ: -CONH-Si(OR)nまたはSタイプ: -CF3）、ポリテトラフルオロエチレン（その商業的に入手可能な具体例は、ChemoursからのTEFLON(R)である。）、パリレン、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー（その商業的に入手可能な具体例は、CytonixからのFLUOROPEL(R)などを包含する。）、フルオロシラン（例えば、トリクロロ(1H,1H,2H,2H-ペルフルオロオクチル)シラン (PFOTS)、ペルフルオロデシる、とリクロロシラン (FDTS)など）、プラズマ蒸着フルオロカーボン、ポリジメチルシロキサン、その他のシロキサン、またはそれらの混合物を包含することができる。もうひとつの具体例として、前記疎水性物質または疎水性物質層22は、1-ヘプタデシンのような疎水性炭化水素を包含することができる。
図1を参照すると、前記疎水性バリア20Aを形成するための前記方法の具体例が、概略的に描写されている。この具体的な方法において、パターン化基材12を用いるか（図1(ii)を参照せよ）、または、前記方法（図1(i)および図1(ii)を参照せよ）の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成する。図1(ii)において、前記パターン化基材12は、前記基材表面S12中に画定された前記ナノ窪み14、前記ナノ窪み14を分離する前記間隙領域16、および前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18Bの周りのバリア間隙26を包含する。
前記バリア間隙26は、最終的に形成される前記疎水性バリア20Aをサポートする前記基材表面S12の部分である。換言すれば、前記方法の間に、前記疎水性バリア20Aが前記バリア間隙26上に形成される。そうであるので、前記バリア間隙26は、前記疎水性バリア20について所望される形状／構成ならびにX-およびY-方向を有し、かつ、前記ナノ窪み14のサブセット18A, 18Bの各々の周りに周縁（例えば、図11を参照せよ）を画定する。
前記非パターン化基材化基材12’をパターニングして、種々の特徴14, 16, 26を形成することができる。パターニングは、ある程度、用いられる基材のタイプに依存して、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー (NIL)、またはそれらの組合せを要件とする。フォトリソグラフィー、スタンピング技術、エンボシング技術、モールディング技術、マイクロエッチング技術などの他のパターニングも用いることができる。
前記方法のこの具体例は、前記パターン化基材12上に疎水性物質を適用し（図1(iii)）、それによって、疎水性物質層22を、ｉ）前記ナノ窪み14中に、および、ｉｉ）前記間隙領域16, 26上に、形成することを包含し、ここに、前記間隙領域16, 26上の前記疎水性物質層22は、約2 μm未満の厚みを有する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も用いることができる。前記疎水性物質を薄膜として適用できる、いかなる適切な技術も用いることができる。具体的な堆積技術は、スピンコーティング、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スプレイコーティング、パドルディスペンシング、超音波スプレイコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾルプリンティング、スクリーンプリンティング、マイクロコンタクトプリンティングなどを包含する。
図1(iii)および図1(iv)に示すように、前記方法のこの具体例は、前記疎水性物質層22の第１部分30上にマスク物質28を適用して、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18B周りに前記疎水性バリア20Aのパターンを画定することも包含し、それによって、前記疎水性物質層22の第２部分32を前記各サブセット18A, 18Bにて露出させる。
いくつかの実例において、前記疎水性物質層22は、前記マスク物質28を堆積する前に、酸素プラズマ処理に暴露することができる。
前記マスク物質28は、特定の外部刺激に暴露したとき、溶解度の変化を示すいかなる適切な物質であってよい。ある具体例において、前記マスク物質28はフォトレジストである。フォトレジスト物質は、特定の光の波長に暴露したとき、現像液に対する溶解度が変化する。前記フォトレジストは、ポジティブフォトレジスト物質（暴露領域が溶解性になる）であるか、または、ネガティブフォトレジスト物質（暴露領域が不溶解性になる）であり得る。適切なポジティブフォトレジストの具体例は、MICROPOSIT(R) S1800シリーズまたはAZ(R) 1500シリーズを包含し、両方ともMicroChemicalsから入手可能である。適切なネガティブフォトレジストの具体例は、エポキシ-ベース SU-8フォトレジスト（MicroChemicalsから入手可能である）を包含する。その他の具体例において、前記マスク物質28は、二層レジストを包含することができ、ひとつの層（例えば、前記基材12上に直接堆積されている）が前記リフトオフ層であり、もうひとつの層（例えば、前記リフトオフ層上に堆積されている）が撮像層である。
図1(iii)および図1(iv)に示すように、前記マスク物質28の選択的付着は、前記疎水性物質層22上に前記物質28を堆積し（図1(iii)）、前記物質28を、例えば、フォトリソグラフィーによってパターニングして、前記疎水性物質層22の部分30を被覆したままで、前記疎水性物質層22の部分32を露出させること（図1(iv)）を要件とすることができる。この具体例において、パターニング後も被覆されたままの前記疎水性物質層22の部分30は、前記バリア間隙26上に位置し、パターニング後、露出している前記疎水性物質層22の部分32は、前記ナノ窪み14中および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18B上に位置する。前記マスク物質28がポジティブフォトレジスト物質のとき、前記疎水性物質層22の部分32に直接隣接する前記マスク物質28の領域を適切な波長の光に暴露して、それらを溶解性にすることができ、適切な現像液を用いて除去し得る。前記マスク物質28がネガティブフォトレジスト物質のとき、前記疎水性物質層22の部分30に直接隣接する前記マスク物質28の領域を適切な波長の光に暴露して、それらを不溶性にすることができる。光に暴露しなかった前記マスク物質28の部分が溶解性のままで、適切な現像液を用いて除去し得る。
前記方法のこの具体例は、前記疎水性物質層22の第２部分32を除去し（図1(v)に示す）、それによって、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18Bを暴露することも包含する。前記疎水性物質層22の第２部分32の除去は、エッチングを要件とすることができる。ある具体例において、空気または酸素 (O2)ガスでのプラズマエッチングを用いることができる。もうひとつの具体例において、酸素 (O2)ガスでのドライエッチングを用いることができる。前記マスク物質28および基材12は、前記疎水性物質層22とは異なるエッチ速度を有することができ、前記マスク物質28は、エッチングプロセスに影響を受けにくくなり、下層の基材12は、一旦、前記疎水性物質層22の第２部分32が除去されたら、エッチストップとして機能する。
図1(vi)に示すように、この具体的な方法は、ゲル物質34を前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14に付着させることも要件とする。いくつかの具体例において、リフトオフゲルパターニング方法を用いることができる。これらの具体例において、前記ゲル物質34を付着させることは、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記ゲル物質34を、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上、ならびに、前記マスク物質28の上に堆積することを要件とする。
シラン化は、シランまたはシラン誘導体を堆積することを包含してよい。前記シランまたはシラン誘導体は、前記ゲル物質34と共有結合を形成できる官能基を包含することができる。前記シランにおける官能基の具体例は、ビニル、アクリロイル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、ニトレン、アルデヒド、ヒドラジニル、グリシジルエーテル、エポキシ、カービン (carbine)、イソシアナートまたはマレイミド、または、所望により置換された変異体またはそれらの組合せを包含する。アミノ官能基を包含する前記シランまたはシラン誘導体の具体例は、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン (APTES)または(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン APTMSを包含する。適切な誘導体のひとつの具体例は、[(5-ビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-エニル)エチル]トリメトキシシランのようなノルボルネン誘導シランである。前記シランは、化学蒸着 (CVD)その他の適切なデポジション技術により蒸着することができる。前記シランまたはシラン誘導体は、前記マスク物質28に適用することができるが、前記マスク物質28に付着させてもさせなくてもよい。
この開示を通して、シラン化を説明しているが、シラン化の代わりに、他の活性化プロセスを用いることができる、と理解されるべきである。例えば、活性化は、前記ゲル物質34に接着し得る表面活性化剤（例えば、-OH基）を生成するプラズマアッシングを要件とすることができる。
次に、前記ゲル物質34を適用することができる。前記物質34として用いることができるポリマーの具体例は、ポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-co-アクリルアミド、PAZAMのようなアクリルアミドコポリマーを包含する。PAZAMおよび、アクリルアミドコポリマーいくつかの他の形態は、以下の構造（Ｉ）：
Figure 2022518642000002
 ［式中、
RAは、アジド、所望により置換されたアミノ、所望により置換されたアルケニル、所望により置換されたヒドラゾン、所望により置換されたヒドラジン、カルボキシ、ヒドロキシ、所望により置換されたテトラゾール、所望により置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールよりなる群から選択され；
RBは、Hまたは所望により置換されたアルキル；
RC、RD、およびREは、それぞれ、独立して、Hおよび所望により置換されたアルキルよりなる群から選択され；
-(CH2)p-の各々は、所望により置換され得；
pは、1から50の範囲の整数であり；
nは、1から50,000の範囲の整数であり；および
mは、1から100,000の範囲の整数である。］
で表される。当業者は、構造（Ｉ）中で繰り返し「ｎ」および「ｍ」特徴の配列は代表例であり、モノマーサブユニットは、前記ポリマー構造中でいかなる順序（例えば、ランダム、ブロック、パターン、またはそれらの組合せ)でも存在することができることを理解するであろう。
いくつかの具体例において、PAZAM線状ポリマーである。いくつかの他の具体例において、PAZAMは、軽く架橋されたポリマーである。
その他の具体例において、層26を形成するために用いることができるポリマーは、構造（Ｉ）の変異体である。ひとつの具体例において、アクリルアミドユニットは、N,N-ジメチルアクリルアミド
Figure 2022518642000003
 で置換することができる。この具体例において、構造（Ｉ）におけるアクリルアミドユニットは、
Figure 2022518642000004
 ［式中RD、RE、およびRFは、各々、HまたはC1-C6アルキルであり、RGおよびRHは、各々、C1-C6アルキル基（アクリルアミドの場合、Hの代わり）である。］で置換することができる。この具体例において、qは、1から100,000の範囲の整数であってよい。もうひとつの具体例において、N,N-ジメチルアクリルアミドを、アクリルアミドユニットに加えて、用いることができる。この具体例において、構造（Ｉ）は、
Figure 2022518642000005
 を包含することができ、繰り返し「n」および「m」特徴に加えて、RD、RE、およびRFは、各々、HまたはC1-C6アルキルであり、RGおよびRHは、各々、C1-C6アルキル基である。この具体例において、qは、1から100,000の範囲の整数であってよい。
他のポリマーまたは分子は、前記シランもしくはシラン誘導体またはその他の活性化表面基と相互作用するように機能化されている限り、前記ゲル物質34として用い、引き続き、プライマー36を適用することができる、と理解されるべきである。前記ゲル物質34に対する適切なポリマーの他の具体例は、アガロースのようなコロイド構造；または、ゼラチンのようなポリマーメッシュ構造；または、ポリアクリルアミドポリマーおよびコポリマー、シランフリーアクリルアミド (SFA)、もしくは、SFAのアジド化バージョンのような架橋ポリマー構造を有するそれらポリマーを包含する。適切なポリアクリルアミドポリマーの具体例は、アクリルアミドおよびアクリル酸もしくはビニル基を含有するアクリル酸から、または、[2+2]光環付加反応を形成するモノマーから、合成することができる。前記ゲル物質34に対する適切なポリマーのさらに他の具体例は、アクリルアミドおよびアクリル酸エステルの混合コポリマーを包含する。
前記ゲル物質34は、スピンコーティング、またはディッピングもしくディップコーティング、または別の適切な技術を用いて、適用することができる。前記ゲル物質34は、硬化プロセスに付すこともできる。硬化の条件は、用いられるゲル物質34のタイプに依存する。ある具体例において、硬化は、室温（例えば、約25℃）から約95℃の範囲の温度にて、約1ミリ秒から約数日間の範囲の時間で行うことができる。もうひとつの具体例において、前記時間は、10秒から少なくとも24時間の範囲であってよい。具体例さらにもうひとつの具体例において、前記時間は、約5分から約2時間の範囲であってよい。
前記ゲル物質34は、シランまたはシラン誘導体の層に共有結合させることができる。
前記方法のいくつかの具体例は、さらに、前記マスク物質28および前記間隙領域16から、前記ゲル物質34を除去することを包含する。前記方法のこれらの具体例は、前記疎水性物質層22の第１部分30から前記マスク物質28を除去して、前記疎水性バリア20A（図1(vii)）を露わにすることも包含する。
いくつかの具体例において、前記マスク物質28の直接上にあるシラン／シラン誘導体層および前記ゲル物質34の部分は、洗浄によって除去することができる。いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体は、前記マスク物質28に（例えば、結合によって）付着せず、かくして、前記ゲル物質34も前記マスク物質28に付着しない。そうなので、前記シラン／シラン誘導体層および前記ゲル物質34のこれらの部分は、水を用いて、前記マスク物質28から容易に洗い流すことができる。前記ゲル物質34の残部は、シランまたはシラン誘導体の層に付着し、それは前記基材表面S12（例えば、前記間隙領域16にて）に、およびS’12（例えば、前記ナノ窪み14中で）に付着せず、これらの特徴14, 16の直接上にある前記ゲル物質34は洗浄によって除去されない、と理解されるべきである。
前記ゲル物質34の残部は、前記間隙領域16に、および前記ナノ窪み14中に、固定化されるので、前記マスク物質28は、次いで、前記ゲル物質34に悪影響を与えることなく、除去またはリフトオフすることができる。前記マスク物質28は、用いられるマスク物質28のタイプに依存して、種々の試薬によって除去することができる。いくつかの適切なリムーバーは、1-メチル-2-ピロリドン、ジメチルスルホキシド、または、MicroChemicalsから入手可能なものを包含し、その具体例は、（AZ(R)フォトレジストを除去できる）AZ(R) 100リムーバーの商標名で販売されている。前記マスク物質28の除去は、前記疎水性物質層22の下にある部分30を露出させ、前記疎水性バリア20Aを露わにする。
その他の具体例において、前記マスク物質28の直接上にあるシラン／シラン誘導体層および前記ゲル物質34の部分は、前記マスク物質28と共に同時に除去することができる。これらの具体例において、リフトオフ方法を用いて、前記マスク物質28ならびに、前記シラン／シラン誘導体層およびその上の前記ゲル物質34のいずれも除去することができる。
前記ゲル物質34の残部をポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Aに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングプロセスは、緩和な化学物質スラリー（例えば、研磨剤、バッファー、キレート化剤、界面活性剤、および／または分散剤を包含する。）で実行することができる。あるいは、ポリッシングは、研磨粒子を包含しない溶液で実行することができる。前記化学物質スラリーを化学機械的ポリッシング系において用いて、前記間隙領域16の表面をポリッシュすることができる。ポリッシングヘッド／バッグまたはその他のポリッシングツールは、窪み14中の前記物質を残しつつ、前記間隙領域16から前記ゲル物質34をポリッシングできる。
前記疎水性バリア20Aは、ポリッシングの間やその後、無傷を維持できる。この具体例において、疎水性バリア20Aは、前記バリア間隙26上に形成され、かくして、前記間隙領域16のZ-方向上方に若干外側に飛び出す。前記疎水性物質を適用して前記疎水性物質層22を形成する間、間隙領域26上に形成された部分30が約2 μm未満となるように、厚みを制御する。この部分30が前記疎水性バリア20Aを形成するので、前記疎水性バリア20Aの厚みT20Aも約2 μmである。
図1(vii)に示される前記フローセル10Aの部分は、窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。グラフト化プロセスを実行して、プライマー36をグラフトすることができる。ある具体例において、グラフト化は、堆積（例えば、仮止めリッドを用いる）、ダンクコーティング、スプレイコーティング、パドルディスペンシングによる、または、前記プライマー36を窪み13中の前記ゲル物質34に付着させるもうひとつの適切な方法による、フローを要件とすることができる。これらの具体的な技術の各々は、溶液または混合物を利用することができ、それらは、前記プライマー、水、バッファー、および触媒を包含していてもよい。前記グラフト化方法のいずれかで、前記プライマー36は、窪み14中の前記ゲル物質34の群と反応し、前記間隙領域16または前記疎水性バリア20Aとの親和性は有さない。
ある具体例において、前記プライマー36は、前記プライマー36の5’末端での、または、その近辺での一点共有結合によって、前記ゲル物質34に固定化し得る。この結合は、ｉ）前記プライマー36の前記アダプター特異的部分を、その同族シーケンシング-レディ核酸フラグメントにアニーリングすることから解放し；および、ｉｉ）その3’ヒドロキシル基をプライマー伸長から解放したままにする。いずれかの適切な共有結合をこの目的に用いることができる。用いることができる終端化プライマーの具体例は、アルキン終端化プライマー、テトラジン終端化プライマー、アジド終端化プライマー、アミノ終端化プライマー、エポキシまたはグリシジル終端化プライマー、チオフォスファート終端化プライマー、チオール終端化プライマー、アルデヒド終端化プライマー、ヒドラジン終端化プライマー、ホスホロアミダイト終端化プライマー、およびトリアゾリンジオン終端化プライマーを包含する。いくつかの具体例において、２つの異なるプライマー36を用いる。適切なプライマー36の特定の具体例は、HISEQTM, HISEQXTM, MISEQTM, MISEQDXTM, MINISEQTM, NEXTSEQTM, NEXTSEQDXTM, NOVASEQTM, GENOME ANALYZERTM上で配列決定するためのIllumina Inc.によって販売される市販のフローセルその他の機器フラットフォームの表面に用いることができるP5およびP7プライマーを包含する。
図2を参照すると、前記疎水性バリア20Bを形成する方法の２つの具体例が概略的に描写されている（図2(vii)）。これらの具体的な方法において、パターン化基材12を用いるか（図2(ii)）、または、前記方法の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成する（図2(i)から図2(ii)）。前記パターン化基材12は、前記基材表面S12および、前記ナノ窪み14を分離する前記間隙領域16中に画定された前記ナノ窪み14を包含する（図2(ii)）。
非パターン化基材化基材12’をパターニングして、種々の特徴14, 16を形成することができる。パターニングは、図1を参照してここに記載されるいずれかの具体例を用いることを要件とすることができる。
前記方法のこれらの具体例は、疎水性物質を前記パターン化基材12上に適用し（（図2(iii)）、それによって、ｉ）前記ナノ窪み14中に、およびｉｉ）前記間隙領域16上に疎水性物質層22を形成することを包含し、ここに、前記間隙領域16上の前記疎水性物質層22は、約2 μm未満の厚みを有する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例を用いることができ、前記疎水性物質を適用するためのいずれかの適切な技術を用いることができる。
前記方法のこれらの具体例は、前記疎水性物質層22の第１部分30上にマスク物質28を適用して、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18B周りに、前記疎水性バリア20Bのパターンを画定し、それによって、前記疎水性物質層22の第２部分32を前記各サブセット18A, 18Bにて露わにすることも包含する。
ここに開示された前記マスク物質28のいかなる具体例も用いることができる。
図2に示すように、前記マスク物質28の選択的付着は、前記疎水性物質層22上に前記物質28を堆積させ（図2(iii)）、前記物質28を、例えば、フォトリソグラフィーによってパターニングし、前記疎水性物質層22の部分30が被覆されたまま、前記疎水性物質層22の前記部分32を露わにすること （図2(iv)）を要件とすることができる。これらの具体例において、前記マスク物質28のパターニングは、前記サブセット18A, 18Bを画定する。特に、前記マスク物質28によって被覆されたままの前記疎水性物質層22の部分30は、前記疎水性バリア20Bを画定する。そうであるので、この具体例において、前記部分30は、前記疎水性バリア20Bに所望される形状／構成ならびにX-およびY-方向を有し、前記ナノ窪み14のサブセット18A, 18Bの各々の周りに周縁を画定する。マスク物質28のパターニングは、図1を参照して記載されるように、実行することができる。
図2(iv)に示すように、前記方法のこの具体例は、前記疎水性物質層22の第２部分32を除去し、それによって、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18Bを露わにすることも包含する。前記疎水性物質層22の第２部分32の除去は、エッチングを要件とすることができる。具体例において、空気または酸素 (O2)ガスでのプラズマエッチングを用いることができ、または、酸素 (O2)ガスでのドライエッチングを用いることができる。前記マスク物質28および基材12は、前記疎水性物質層22とは異なるエッチ速度を有することができ、前記マスク物質28は、エッチングプロセスに影響を受けにくくなり、下層の基材12は、一旦、前記疎水性物質層22の第２部分32が除去されると、エッチストップとして機能する。
図1に示された前記方法とは異なり、いくつかの前記ナノ窪み14は、前記疎水性物質層22で満たされたまま維持される。なぜならば、これらのナノ窪み14は、前記マスク物質28の前記部分30によって被覆されているからである。これは、図2(iv)に示される。
図2（2(v)-2(vii)を包含し、「1」とラベルされた矢印で指示される）に示される前記方法のひとつの具体例において、ゲル物質34が前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14に付着される（図2(vi)）。図1を参照して記載されるリフトオフゲルパターニング方法は、この具体的な方法に用いることができる。具体例として、前記ゲル物質34の付着は、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上、および、残ったマスク物質28の上に、前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。
この方法のいくつかの具体例は、前記マスク物質28から、および、前記間隙領域16から、前記ゲル物質34を除去し；前記疎水性物質層22から前記第１部分30から前記マスク物質28を除去して前記疎水性バリア20Bを露わにすることを、さらに包含する。この方法の他の具体例は、前記マスク物質28およびその上のいかなるゲル物質34も同時に除去することを包含する。
いくつかの具体例において、前記マスク物質28の直接上にあるシラン／シラン誘導体層および前記ゲル物質34の部分は、洗浄によって除去することができる。前記ゲル物質34の残部は、前記サブセット18A, 18Bの前記間隙領域16におよび前記ナノ窪み14の中に固定化されているので、前記マスク物質28を、次いで、前記ゲル物質34に悪影響を与えることなく、除去またはリフトオフすることができる。前記マスク物質28は、ここで開示されたいずれかの適切な試薬を用いて除去することができる。前記マスク物質28の除去は、前記疎水性物質層22の下にある部分30を露出させ、前記疎水性バリア20Bを露わにする。その他の具体例において、前記マスク物質28ならびに、前記マスク物質28の直接上にあるいかなるシラン／シラン誘導体層およびゲル物質34を同時に除去することができる。
前記ゲル物質34の残部をポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えることなく、かつ、前記疎水性バリア20Bに悪影響を与えることなく、前記間隙領域16から除去できる（図2(vii)）。ポリッシングは、図1を参照してここで開示されるように実行することができる。
図2（図2(viii)から図2(ix)および図2(vii)を包含し、「2」とラベルされた矢印で指示される）に示される前記方法のもうひとつの具体例において、前記マスク物質28は、前記ゲル物質34の適用前に除去される。前記マスク物質28は、図1を参照して記載されるように除去することができる。前記疎水性物質層22の第１部分(s) 30からの前記マスク物質28の除去は、前記疎水性バリア20Bを露わにする（図2(viii)を参照せよ）。
図2(ix)に示される前記方法のこの具体例において、前記ゲル物質34は、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14に付着される。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16上、および前記疎水性バリア20Bの上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。この方法の具体例は、前記疎水性バリア20Bから、および、前記間隙領域16から、前記ゲル物質34を除去することを、さらに包含する。ゲル物質34の除去は、ポリッシングを要件とすることができる。このプロセスは、図2(vii)に示すように、前記ナノ窪み14中で、前記ゲル物質34を無傷のままにし、前記疎水性バリア20Bも無傷のままにする。
図2に示される具体例のいずれにおいても、前記疎水性バリア20Bは、ポリッシング後に無傷のままにできる。これらの具体例において、疎水性バリア20Bは、各サブセット18A, 18Bの間に位置する、いくつかの前記窪み14中に、および、いくつかの前記間隙領域16の上に形成される。図2(vii)に描写されるように、前記疎水性バリア20Bの部分は、前記間隙領域16のZ-方向上方に若干外側に飛び出す。前記疎水性物質を適用して前記疎水性物質層22を形成する間、間隙領域26上に形成された部分30が約2 μm未満となるように、厚みを制御する。この部分30が前記疎水性バリア20Bを形成するので、前記厚みT20Bも約2 μmである。この具体例において、総厚みは、前記疎水性バリア20B全体にわたり変化するが（例えば、前記間隙領域16上よりも窪み14中で厚い）、前記間隙領域16の上方に飛び出た前記疎水性バリア20Bの部分の厚みT20Bは、一貫して、約2 μm未満である。
図2(vii)に示される前記フローセル10Bの部分は、前記サブセット18A, 18Bの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載されるいずれかの前記プライマー36およびグラフト化プロセスを用いることができる。
次に、図3を参照すると、前記疎水性バリア20Cを形成するための前記方法の具体例が、概略的に描写されている。この方法の具体例において、パターニングされた基材12を用いるか（図3(ii)）、または、前記方法の一部として非パターン化基材化基材12’から生成させる（図3(i)から図3(ii)）。
図3(ii)に示すように、前記パターン化基材12は、前記基材表面S12中に画定されたナノ窪み14のサブセット18A, 18B、前記ナノ窪み14を分離する前記間隙領域16、および、前記サブセット18A, 18Bの各々の周りの前記パターン化基材12の表面S12中に画定されたバリア窪み38を包含する。
前記バリア窪み38は、前記基材表面S12の部分に画定され、形成される前記疎水性バリア20Cを、最終的に支持する。換言すれば、前記方法の間、前記疎水性バリア20Cは、前記バリア窪み38中に形成される。そうであるので、前記バリア窪み38は、前記疎水性バリア20Cに所望される形状／構成ならびにX-およびY-方向を有し、前記ナノ窪み14の前記サブセット18A, 18Bの各々の周りに周縁を画定する（例えば、図11を参照せよ）。
前記非パターン化基材化基材12をパターニングして、種々の特徴14, 16, 38を形成することができる。パターニングは、図1を参照してここに記載されるいずれかの具体例を要件とすることができる。
前記方法のこの具体例は、前記パターン化基材12上に疎水性物質を適用し、それによって、ｉ）前記バリア窪み38中に、およびｉｉ）前記ナノ窪み14中に疎水性物質層22を形成することを包含する（図3(iii)を参照せよ）。この具体例において、前記疎水性物質が前記間隙領域16の上に飛び出さないように、窪み14, 38を充填またはアンダーフィルすることが望ましい。この具体例において、前記疎水性物質層22は、前記間隙領域16と共平面であってよい。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も用いることができ、前記疎水性物質を選択的適用するいかなる適切な技術も用いることができる。特定の具体例において、前記疎水性物質は、CYTOP(R)シリーズのうちのポリマーのひとつである。
前記方法のこの具体例は、図3(iii)に示すように、前記バリア窪み38中の前記疎水性物質層22上にマスク物質28を適用することも包含する。
ここに開示された前記マスク物質28のいかなる具体例も用いることができる。
図3（(iii)および(iv)にて）に示すように、前記マスク物質28の選択的付着は、前記疎水性物質層22（前記ナノ窪み14および前記バリア窪み38中にある）に前記物質28を堆積させ（図3(iii)）、前記物質28を、例えば、フォトリソグラフィーによってパターニングすることを包含することができ、前記バリア窪み38中の前記疎水性物質層22を被覆したまま維持し、前記ナノ窪み 22の各々中の前記疎水性物質層22を露出させる（図3(iv)）。前記マスク物質28のパターニングは、図1を参照して記載されるように実行することができる。
前記方法のこの具体例は、図3(v)に示すように、前記ナノ窪み14から前記疎水性物質層22を除去することも包含する。この除去プロセスは、前記ナノ窪み14を露出させる。前記ナノ窪み14からの前記疎水性物質層22の除去は、エッチングを要件とすることができる。具体例において、空気または酸素 (O2)ガスでのプラズマエッチングを用いることができ、または、酸素 (O2)ガスでのドライエッチングを用いることができる。前記マスク物質28および基材12は、前記疎水性物質層22とは異なるエッチ速度を有することができ、前記マスク物質28は、エッチングプロセスに影響を受けにくくなり、下層の基材12は、一旦、前記疎水性物質層22が前記ナノ窪み14から除去されると、エッチストップとして機能する。
この具体的な方法は、図3(vi)に示すように、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14にゲル物質34を付着させることも要件とする。図1を参照して記載されるリフトオフゲルパターニング方法を、この方法の具体例に用いることができる。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16上に、および、残ったマスク物質28上に、前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。
前記方法のいくつかの具体例は、さらに、前記マスク物質28から、および、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去し；前記バリア窪み38中の前記疎水性物質層22から前記マスク物質28を除去して、前記疎水性バリア20Cを露わにすることを包含する。前記方法の他の具体例は、前記マスク物質28および、その上のいかなるゲル物質34も同時に除去することを包含する。図3(vii)は、前記物質28および34が除去された後の前記フローセル10Cを示す。
いくつかの具体例において、前記マスク物質28の直接上にあるシラン／シラン誘導体層および前記ゲル物質34の部分は、洗浄で除去することができる。前記ゲル物質34の残部は、前記サブセット18A, 18Bの前記間隙領域16に、および、前記ナノ窪み14中に固定化されているので、前記マスク物質28は、次いで、前記ゲル物質34に悪影響を与えることなく、除去またはリフトオフすることができる。前記マスク物質28は、ここで開示されるいずれかの適切な試薬を用いて除去することができる。前記マスク物質28の除去は、前記バリア窪み38中の前記疎水性物質層22下にある部分を露出させ、前記疎水性バリア20Bを露わにする（図3(vii)）。その他の具体例において、前記マスク物質28の直接上にある前記マスク物質28およびいかなるシラン／シラン誘導体層およびゲル物質34は、同時に除去することができる。
前記ゲル物質34の残部は、次いで、ポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えることなく、かつ、前記疎水性バリア20Cに悪影響を与えることなく、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、図1を参照してここで開示されるように、実行することができる。
前記疎水性バリア20Cは、ポリッシング後、無傷を維持することができる。この具体例において、疎水性バリア20Cは、前記バリア窪み38中に形成される。図3(vii)に描写されるように、前記疎水性バリア20Cの表面S20Cは、前記間隙領域16のZ-方向上方に外側に飛び出さず、かくして、前記疎水性バリア20Cは、前記間隙領域16と共平面である。この具体例において、前記疎水性バリア20Cの厚みは、前記バリア窪み38の深さに対応し、前記間隙領域16を越えて飛び出す厚みの部分はない。
図3(vii)に示す前記フローセル10Cの部分は、前記サブセット18A, 18Bの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36を有する。図1を参照して記載される前記プライマー36のいずれかおよびグラフト化プロセスを用いることができる。
次に、図4を参照すると、前記疎水性バリア20Dを形成するための前記方法の具体例が概略的に描写されている。この具体的な方法において、パターン化基材12を用いるか（図4(ii)）、または、前記方法の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成する（図4(i)から図4(ii)）。
前記パターン化基材12は、前記基材表面S12中に画定されたナノ窪み14、前記ナノ窪み14を分離する前記間隙領域16のサブセット18A, 18B、および、前記サブセット18A, 18Bの各々の周りで、前記パターン化基材12の表面S12中に画定された前記バリア窪み38を包含する。前記バリア窪み38の深さは、ポリッシングに用いるスラリー中のポリッシングビーズのサイズよりも小さいか同等であってよい。前記バリア窪み38が深すぎると、ポリッシャーが、ビーズを動かして、前記間隙領域16から前記ゲル物質34をポリッシュできない。いくつかの具体例において、前記バリア窪み38は、前記ナノ窪み14の深さよりも大きな深さを有する（図4(ii)に示すように）。具体例として、前記バリア窪み38は、前記ナノ窪み14の深さの少なくとも２倍大きな深さを有する。他の具体例として、前記バリア窪み38は、前記ナノ窪み14の深さの少なくとも１０倍、または少なくとも１００倍大きな深さを有する。
前記バリア窪み38は、前記基材表面S12の部分中に画定され、最終的に形成された前記疎水性バリア20Dを最終的に支持する。換言すれば、前記方法の間、前記疎水性バリア20D は、前記バリア窪み38中に形成される。そうであるので、前記バリア窪み38は、前記疎水性バリア20Dに所望される形状／構成ならびにX-およびY-方向を有し、前記ナノ窪み14のサブセット18A, 18Bの各々の周りに周縁（例えば、図11を参照せよ）を画定する。
非パターン化基材化基材12’をパターニングして、種々の特徴14, 16, 38を形成することができる。パターニングは、図1を参照して記載されるいずれかの具体例を要件とすることができる。
前記方法の具体例は、前記パターン化基材12上に疎水性物質を適用し、それによって、ｉ）前記バリア窪み38中に、およびｉｉ）前記ナノ窪み14中に、前記疎水性物質22を導入することを包含する。この具体例において、前記疎水性物質が前記間隙領域16の上に飛び出さないように、窪み14, 38を充填またはアンダーフィルすることが望ましい。この具体例において、前記疎水性物質22は、前記間隙領域16と共平面である。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も用いることができ、前記疎水性物質を選択的にするためのいずれかの適切な技術を用いることができる。特定の具体例において、前記疎水性物質は、CYTOP(R)シリーズのうちのポリマーのひとつである。
前記方法のこの具体例は、少なくとも前記ナノ窪み14から前記疎水性物質22を除去することも包含し、それによって、少なくともいくつかの前記疎水性物質22が前記バリア窪み38に残留する。前記ナノ窪み14からの前記疎水性物質22の除去は、エッチングを要件とすることができる。具体例において、空気または酸素 (O2)ガスでのプラズマエッチングを用いることができ、または、酸素 (O2)ガスでのドライエッチングを用いることができる。前記基材12は、前記疎水性物質層22とは異なるエッチ速度を有することができ、下にある基材12（例えば、前記ナノ窪み14にて）は、一旦、前記疎水性物質層22の第２部分32がそこから除去されると、エッチストップとして働く。
この除去プロセスは、前記ナノ窪み14を露出させ（図4(iv)に示されるように）、前記バリア窪み38からいくつかの前記疎水性物質22を除去することができる。しかしながら、前記ナノ窪み14と比較して増大した深さの前記バリア窪み38のため、エッチングは、前記バリア窪み38から前記疎水性物質22の全てを除去しない、と理解されるべきである。
エッチングに付すことは、前記バリア窪み38中の前記疎水性物質22をより親水性にする。疎水性を回復するためのひとつの具体例において、前記方法は、前記バリア窪み38中の前記疎水性物質22の表面を高温プロセスに付すことを要件とする。このプロセスは、用いる前記疎水性物質に依存して、約80℃から約200℃の範囲の温度に前記疎水性物質22を付すことを要件とすることができる。回復（リカバリー）プロセスは、前記物質22に導入するために堆積した同一の疎水性物質を含有することができる溶媒を要件とするリフロープロセスであってよい。溶媒リフローは、液相プロセスとして、または気相プロセスとして、実行することができる。液相リフローは、前記バリア窪み38中の前記疎水性物質層22上に、高温（例えば、180℃）で前記疎水性物質溶液を堆積し、次いで、低温（例えば、50℃）で硬化することを要件とすることができる。気相リフローは、その中にある量の前記疎水性物質溶液が入った真空封止デシケーター中に、前記基材12（前記バリア窪み38中の前記疎水性物質22付き）を配置することを要件とすることができる。疎水性は、前記リカバリーまたはリフロープロセスの結果として修復され、前記疎水性バリア20Dが形成される。高温リカバリーまたはリフローは、前記ゲル物質34を堆積させ、ポリッシュした後に実行することもできる。そのとき、リフローは、配列決定のための前記ゲル物質34に良くない影響を与えない。
この具体的な方法は、図4(v)に示すように、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14にゲル物質34を付着させることも要件とする。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記各サブセット18A, 18Bの前記ナノ窪み14および前記間隙領域16上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。前記方法のこの具体例は、図4(vi)に示すように、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去することを、さらに包含する。この具体例において、前記ゲル物質34をポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Dに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、ここで開示されるように図1を参照して、実行することができる。
前記疎水性バリア20Dは、ポリッシング後に、無傷のままにできる。この具体例において、疎水性バリア20Dは前記バリア窪み38中に形成される。図4(vi)に描写されるように、前記疎水性バリア20Dの表面S20Dは、前記間隙領域16のZ-方向上方に外側に飛び出さず、かくして、前記疎水性バリア20Dは、前記間隙領域16と共表面である。この具体例において、前記疎水性バリア20Dの厚みは、前記バリア窪み38の深さに対応し、前記間隙領域16を越えて飛び出す厚みの部分はない。
図4(vi)に示される前記フローセル10Dの部分は、前記サブセット18A, 18Bの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載される前記プライマー36およびグラフト化プロセスのいずれかを用いることができる。
次に、図5を参照すると、前記疎水性バリア20Eを形成するための前記方法の具体例が概略的に描写されている。この方法の具体例において、パターン化基材12を用いるか（図5(ii)）、または、前記方法の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成される（図5(i)から図5(ii)）。
この具体的な方法は、図５(iii)に示すように、前記ナノ窪み14に、および、前記間隙領域16の上に、ゲル物質34を付着させることを要件とすることもできる。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。前記方法のこの具体例は、さらに、図5(iv)に示すように、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去することを包含する。この具体例において、前記ゲル物質34は、ポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Dに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、ここで開示されるように図1を参照して、実行することができる。
前記マスク物質28は、次いで、図5(v)に示すように、前記ナノ窪み14中に前記ゲル物質34を有する前記パターン化基材12上に適用する。前記マスク物質28を適用して、図5(vi)に示すように、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18B周りに疎水性バリア用のパターンPを画定することができる。
ある具体例において、前記マスク物質28の選択的付着は、前記パターンPが画定されるように、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34上、および、前記間隙領域16の上に、前記物質28を堆積させ、前記物質28を、例えば、フォトリソグラフィーによって、パターニングすることを要件とすることができる。ひとつの具体例において、前記マスク物質28のパターニングは、図1を参照して記載するように、実行することがでできる。もうひとつの具体例において、前記マスク物質28は、前記リフトオフ層および撮像層を包含する二層レジストである。フォトリソグラフィーを用いて、前記撮像層をパターニングすることができ、前記パターンPで露出した前記リフトオフ層のいかなる部分もアッシングプロセスによって除去し得る。これは、前記パターン化基材12のいくらかの部分を露出する。
前記方法のこの具体例は、図5(vii)に示されるように、前記パターンPに従って疎水性物質を適用することを包含する。前記パターンPに従って堆積された前記疎水性物質22は、前記パターン化基材12の露出した部分上に前記疎水性バリア20Eを形成する。前記疎水性物質22は、約2 μm未満の厚みを有するように堆積され、かくして、前記疎水性バリア20Eは約2 μm未満の厚みを有する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例を用いることができ、前記疎水性物質を適用適用するいずれかの適切な技術を用いることができる。
図5(vii)に示されるように、前記疎水性物質22は、残りのマスク物質28上に堆積させることもできる。前記マスク物質28は、ここで図1を参照して記載される技術のいずれかにより除去することができ、前記マスク物質28上の前記疎水性物質22も、このプロセスの間に除去することができる（図5(viii)を参照せよ）。前記マスク物質28（およびその上のいかなる疎水性物質22）の除去は、その中に前記ゲル物質34を有する前記ナノ窪み14のサブセットを露わにする。
図5に示される前記フローセル10Eの部分は、前記サブセット18A, 18Bの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載されるいずれかの前記プライマー36およびグラフト化プロセスを用いることができる。
次に、図6を参照すると、前記疎水性バリア20Fを形成するための前記方法の具体例が概略的に描写されている。この方法の具体例において、パターン化基材12を用いるか（図6(ii)）、または、前記方法の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成される（図6(i)から図6(ii)）。
この具体的な方法は、図6(iii)に示すように、前記ナノ窪み14に、および、前記間隙領域16の上に、ゲル物質34を付着させることを要件とすることもできる。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。前記方法のこの具体例は、さらに、図6(iv)に示すように、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去することを包含する。この具体例において、前記ゲル物質34は、ポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Dに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、ここで開示されるように図1を参照して、実行することができる。
この具体例において、図6(v)に示されるように、前記疎水性物質層22は、前記ナノ窪み中にゲル物質14を有する前記パターン化基材12に積層できるフィルムである。前記疎水性物質層／フィルム22は約2 μm未満の厚みを有する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も用いることができる。
次いで、フォトリソグラフィーを用いて、前記疎水性物質層／フィルム22をパターニングして、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18Bの周りに前記疎水性バリア20Fを形成する。これは、図6(vi)に示される。
図6(vi)に示される前記フローセル10Fの部分は、前記サブセット18A, 18Bの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載されるいずれかの前記プライマー36およびグラフト化プロセスを用いることができる。
次に、図7を参照すると、前記疎水性バリア20Gを形成するための前記方法の具体例が概略的に描写されている。この方法の具体例において、パターニングされた基材12を用いるか（図7(ii)）、または、前記方法の一部として非パターン化基材化基材12’から生成させる（図7(i)から図7(ii)）。
この具体的な方法は、前記ナノ窪み14に、および、前記間隙領域16の上に、ゲル物質34を付着させることを要件とすることもできる。具体例として、図7(iii)に示されるように、前記ゲル物質34を付着させることは、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。前記方法のこの具体例は、さらに、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去することを包含する。この具体例において、図7(iv)に示されるように、前記ゲル物質34は、ポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Dに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、ここで開示されるように図1を参照して、実行することができる。
この具体例において、前記疎水性物質は、図7(v)に示されるように、プリンティングによって堆積される。前記疎水性物質は、適切な担体液体に分散し、次いで、エアロゾルプリンティングまたはインクジェットプリンティングを用いてプリンティングすることができる。前記疎水性物質は、前記疎水性バリア20Gに所望されるパターンでプリンティングされる。前記疎水性バリア20Gは、約2 μm未満の厚みを有する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も用いることができる。
図7(v)に示される前記フローセル10Gの部分は、前記サブセット18A, 18Bの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載されるいずれかの前記プライマー36およびグラフト化プロセスを用いることができる。
次に、図8を参照すると、前記疎水性バリア20Hを形成するための前記方法の具体例が、概略的に描写されている。この具体的な方法において、パターン化基材12を用いるか（図8(iii)）、または、前記方法の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成する。
この具体的な方法は、前記ナノ窪み14に、および、前記間隙領域16の上に、ゲル物質34を付着させることを要件とすることもできる（図8(iii)）。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。前記方法のこの具体例は、さらに、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去することを包含する（図8(iii)）。この具体例において、前記ゲル物質34は、ポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Dに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、ここで開示されるように図1を参照して、実行することができる。
この具体的な方法は、転写積層法 (a transfer lamination process)を利用して、前記疎水性バリア20Hを形成する。
図8(i)に示されるように、多層プリカーサー54は、２つの犠牲層56および、前記２つの犠牲層56の間に位置する前記疎水性物質層22（約2 μm未満の厚みを有する）を包含する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例、および前記犠牲層の具体例は、前記疎水性物質を剥がせる接着物質を包含する。ある具体例において、前記犠牲層56は、ポリエチレンテレフタラート (PET)を包含する。この多層プリカーサー54は、レーザーカッティングおよびウィーディング (weeding)を用いて加工することができる。レーザーカッティングは、直接描写法またはマスクプロジェクション法を要件とすることができる。レーザーカッティングおよびウィーディングプロセスは、図8(ii)に示されるように、第１の前記犠牲層56を除去し、第２の前記犠牲層56上に位置する前記疎水性物質層22中に疎水性バリアのパターン20Hを画定する。
前記パターン化疎水性物質層22は、図8(iii)に示されるように、前記ナノ窪み14中に前記ゲル物質34を有する前記パターン化基材12と接触するように載置する。前記パターン化疎水性物質層22は、前記パターン化基材12に転写し、前記第２の前記犠牲層56は、次いで、それを剥がすことによって除去できる。前記転写は、図8(iv)に示されるように、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18B, 18Cの周りに前記疎水性バリア20Hを形成する。
図8(iv)に示される前記フローセル10Hの部分は、前記サブセット18A, 18B, 18Cの窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載されるいずれかの前記プライマー36およびグラフト化プロセスを用いることができる。
次に、図9を参照すると、前記疎水性バリア20Iを形成するための前記方法の具体例が、概略的に描写されている。この具体的な方法において、パターン化基材12を用いるか（図9(v)）、または、前記方法の一部として、非パターン化基材化基材12’から生成する。
この具体的な方法は、前記ナノ窪み14に、および、前記間隙領域16の上に、ゲル物質34を付着させることを要件とすることもできる（図9(v)）。具体例として、前記ゲル物質34を付着させることは、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16をシラン化し、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の上に前記ゲル物質34を堆積させることを要件とする。前記方法のこの具体例は、さらに、前記間隙領域16から前記ゲル物質34を除去することを包含する（図9(v)）。この具体例において、前記ゲル物質34は、ポリッシングに付すことができる。ポリッシングは、前記ゲル物質34、および、いくつかの実例において、前記シランまたはシラン誘導体の少なくとも一部を、前記ナノ窪み14中の前記ゲル物質34に悪影響を与えず、かつ、前記疎水性バリア20Dに悪影響を与えずに、前記間隙領域16から除去できる。ポリッシングは、ここで開示されるように図1を参照して、実行することができる。
この具体的な方法は、転写法を利用して、前記疎水性バリア20Iを形成する。
図9(i)に示すように、マスターテンプレート60を用い、それは、前記疎水性バリア20Iに所望される同一のパターンを有する。前記マスターテンプレート60はシリコンシリコンであってよい。
ワーキングスタンプ物質62を、次いで、図9(ii)から図9(iii)に示されるように、マスターテンプレート60上に堆積させて、硬化して、ワーキングスタンプ64を形成する。前記ワーキングスタンプ物質は、シリコンアクリラートモノマー、ポリジメチルシロキサン (PDMS)等を包含することができる。図9(iv)に示されるように、前記ワーキングスタンプ64を除去することができ、前記疎水性物質22の薄層を、その上に適用することができる。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も用いることができ、前記薄層は、2 μmまたはそれより小さい厚みを有する。
前記ワーキングスタンプ64上の前記疎水性物質22の部分を、前記ナノ窪み14中に前記ゲル物質34を有する前記パターン化基材12と接触するように載置する。前記ワーキングスタンプ64は、前記疎水性物質層22の部分を前記パターン化基材12に転写する。前記転写は、図9(v)に示されるように、前記ナノ窪み14および前記間隙領域16の各サブセット18A, 18B, 18Cの周りに前記疎水性バリア20Iを形成する。
図9(v)に示される前記フローセル10Iの部分は、前記サブセット18A, 18B, 18Cの前記窪み14中の前記ゲル物質34にグラフトされたプライマー36も有する。図1を参照して記載されるいずれかの前記プライマー36およびグラフト化プロセスを用いることができる。
もうひとつの具体例のフローセル10Jを図10(iv)に示す。この具体例において、前記フローセル10Jは：基材12、前記基材12上に位置するゲル物質34のナノパッド33；および、ｉ）前記ナノパッド33の表面と少なくとも実質的に共平面である表面を有し、かつ、ｉｉ）前記ナノパッド33の各サブセット35A, 35B周りに疎水性バリア20Jを画定するように位置する疎水性物質層を包含する。ある具体例において、前記ナノパッド33の各々は、約2 μm未満の厚みを有し、前記疎水性物質層22（疎水性バリア20J）は約2 μm未満の厚みを有する。
ここに記載される前記基材12のいずれの具体例もこの具体的なフローセル10Jに用いることができる。
前記ナノパッド33は、お互いに空間的に分離されたゲル物質34の島（例えば、上面からの形状において、例えば、円形、三角形、長方形などである。）である。ここに開示された前記ゲル物質34のいかなる具体例も、前記ナノパッド33に用いることができる。プライマー36は、前記ナノパッド33の各々に付着させることもできる。ここに開示された前記プライマー36のいかなる具体例も用いることができる。
前記ナノパッド33は、いかなる適切なパターンまたはレイアウトで前記基材12全体にわたって分散していてもよい。前記ナノパッド33のサブセット35A, 35Bは、前記疎水性バリア20Jによって分離される。各サブセット35A, 35Bにおけるナノパッド33の前記パターンは同一であるか；または、異なるサブセット35A, 35Bにおいて異なるパターンのナノパッド33を用いることができる。多くの異なるパターン／レイアウトの前記ナノパッド33が想定され、定型、繰り返し、および不定形パターンを包含する。ある具体例において、前記ナノパッド33は、密充填および密度の向上のため六角形格子状に配置される。その他のレイアウトは、例えば、平行四辺形レイアウト（すなわち、長方形、正方形など）、三角形レイアウト、円形レイアウトなどを包含することができる。
各ナノパッド33は、円形、楕円形、多角形（例えば、三角形、四辺形、アッシングなど）のような、いかなる適切な形状（および対応する三次元形状）を有していてもよい。
各ナノパッド33のサイズは、その直径、ならびに／または長さおよび幅で特徴付けることができる。いくつかの実例において、各ナノパッド33の直径または長さおよび幅は、少なくとも約1 nm、50 nm、約100 nm、約500 nm、約2 μmまでであり得る。前記ナノパッド33の直径の具体例は、約1 nmから約500 nmの範囲である。前記ナノパッド33の直径のもうひとつの具体例は、約300 nmから約1 μmの範囲である。
前記ナノパッド33は、厚みを有していてもよい。具体例として、各ナノパッド33の厚みは、2 μm未満であり得る。
隣接するナノパッド33は、所定のサブセット35A, 35B内の前記間隙領域16によって分離される。前記サブセット35A, 35Bは、前記疎水性バリア20Jの具体例によって分離される。平均ナノパッドピッチは、ひとつのナノパッド33の中心から隣接するナノパッド33の中心までの間隔（センター－センター間隔）またはひとつのナノパッド33の縁から隣接するナノパッド33の縁までの間隔（エッジ－エッジ間隔）を表す。前記ナノ窪みについてここに記載されるピッチのいずれも、前記ナノパッドに適用可能である。
この具体的な前記フローセル10Jは、前記疎水性バリア20Jも包含する。ここに開示された疎水性物質のいかなる具体例も使用することができる。薄膜として前記疎水性物質を適用できるいずれかの適切な技術を用いることができる。
一緒に、図10 (i)から図10 (iv)は、前記フローセル10Jを作成するための方法の具体例を例示する。この具体例において、前記方法は、前記基材12上のナノパッド33の離散的なサブセット35A, 35Bを形成し、ここに、前記ナノパッド33の各々は約2 μm未満の厚みを有し（図10 (i)から図10(iii)を参照せよ）；前記離散的なサブセット35A, 35Bの各々の周りの前記基材12上に疎水性物質22を選択的に適用し、それによって、ｉ）離散的サブセット35A, 35Bの各々の周りに、ｉｉ）前記ナノパッド33の表面と少なくとも実質的に共平面である表面を有し、かつ、ｉｉｉ）約2 μm未満の厚みを有するように、疎水性バリア20Jを形成することを含む。
いずれかの適切な技術を用いてナノパッド33の前記離散的サブセットを形成することができる。ひとつの具体例において、前記方法は、前記基材の表面12上にゲル物質34を適用し（図10(i)）；前記ゲル物質34上にマスク物質28を配置し（図10(i)）；前記マスク物質28および前記ゲル物質34の中に空間37を形成し；前記マスク物質28を除去すること（図10(iii)）を要件とする。
前記ゲル物質34を適用することは、ここに開示されたいずれかの技術を用いて記載されるように実行することができる。例えば、前記基材の表面12をシラン化し、前記ゲル物質34を、ここに開示されたいずれかの技術を用いて堆積することができる。前記マスク物質28は、次いで、ここに開示されたいずれかの技術を用いて前記ゲル物質34上に適用する。
前記空間37（その上に前記疎水性バリア20Jが形成される前記ナノパッドまたはバリア間隙26間の間隙領域16となる）を、次いで、前記マスク物質28およびその下のゲル物質34の中に形成する。前記空間37は、パターニングすることによって、例えば、フォトリソグラフィーによって、前記物質28を形成することができ、現像液を用いて前記パターン化された部分を除去することができる。この点、前記マスク物質28の部分を除去し、前記ゲル物質34の下にある部分を前記空間37にて露出させる。エッチングを用いて、前記ゲル物質34のこれらの部分を除去し、前記空間37を完全に画定することができる（図10(ii)に示される）。前記マスク物質28の残った部分は、ここに記載された具体例のいずれかに従って（例えば、適切な試薬を用いて）、リフトオフすることができる。
図10(iii)に示されるように、前記マスク物質28の除去は、前記ナノパッド33を露出させる。次いで、ここに開示された具体的なグラフト化技術のいずれかを用いて、プライマー36を付着させることができる。
前記方法のこの具体例は、図10(iv)に示されるように、前記ナノパッド33の離散的なサブセット35A, 35Bの各々の周りで前記基材12の上に、疎水性物質22を適用し、それによって、疎水性バリア20Jを形成することを包含する。ある具体例において、前記疎水性物質22の選択的付着は、前記疎水性バリア20Jのパターンで前記疎水性物質22を前記基材12に転写することを要件とする。この具体例は、図8を参照して記載される転写積層法または図9で定義される転写法を利用する。もうひとつの具体例において、前記疎水性物質22の選択的付着は、前記疎水性バリアのパターンで前記疎水性物質をプリンティングすることを要件とする。この具体例は、図7(v)を参照して記載されるように、プリンティング法を利用する。もうひとつの具体例において、前記疎水性物質22の選択的付着は、（第２の）マスク物質（図示せず）を、前記ナノパッド33の離散的なサブセット35A, 35B上に適用し、それによって、前記疎水性バリア20J用のパターンを画定し；前記パターンに従って前記疎水性物質22を適用し、それによって、前記疎水性バリア20Jを形成し；前記マスク物質を除去することを要件とする。この具体例は、図5(vi)から図5(viii)を参照して記載される方法を利用する。この特定の具体例において、前記疎水性バリア20Jの後に、前記プライマー36にグラフトすることが望ましいかもしれない。
図11は、ここに記載される前記方法によって形成された具体的なフローセル10A-10Jのいずれかの部分の上面図である。例示するように、前記疎水性バリア20A-20Iの各々（図11において、概略的に、「20」と示す）は、前記ナノ窪み14が画定されたチャンバー24の周縁を画定し、前記疎水性バリア20J（概略的に、「20」と示す）は、前記ナノパッド33が画定されたチャンバー24の周縁を画定する。
図1から図11には図示されないが、前記フローセル10A-10Jの各々は、各チャンバー24において捕捉部位も包含することができる、と理解されるべきである。前記捕捉部位は、特定のチャンバー24内部に複合体を物理的および／または化学的に固定化できる。前記捕捉部位は、前記チャンバー24のいかなる適切な場所に位置させることができ、それは、前記ナノ窪み14またはナノパッド33の配置に依存するであろう。前記基材12または12’にわたる前記捕捉部位の位置は、均一（例えば、各捕捉部位は、各チャンバー24内部で、実質的に同一の位置（例えば、中心、左端など）にあるか、または、前記捕捉部位は、不均一（例えば、異なるチャンバー24内部で、異なる位置にある）であってよい。前記捕捉部位は、いかなる適切な形状、幾何および寸法を有していてもよく、それは、少なくともある程度、前記捕捉部位の構成（例えば、パッチ、ウェル、突起など）、前記捕捉部位が形成された前記チャンバー24の寸法、および、前記捕捉部位に捕捉される複合体のタイプに依存する。
いくつかの具体例において、前記捕捉部位は、前記間隙領域14の部分の上に適用された化学捕捉剤である。ここに開示された前記化学捕捉剤のいかなる具体例も使用することができる。ひとつの具体例において、前記化学捕捉剤は、マイクロコンタクトプリンティングその他の適切な技術を用いて、所定の場所に堆積させることができる。
その他の具体例において、前記捕捉部位は、前記基材12の表面S12に画定されたウェルを包含する。前記ウェルは、用いる前記基材12に依存して、エッチングまたはインプリンティングを用いて、前記表面S12に形成することができる。ある具体例において、前記ウェルは、前記ナノ窪み14と同時に形成するか、または、前記ナノパッド33の前に形成することができる。前記ウェルは、いかなる適切な形状および幾何を有することができ、前記ナノ窪み14または前記ナノパッド33よりも大きいが、前記チャンバー24よりも小さいであろう。
いくつかの具体例において、前記ウェルは、そこに添加された付随的な化学捕捉剤を有さない。これらの具体例において、開口寸法は、前記複合体が前記ウェル内に自己組織化できるようにし、いくつかの具体例において、窪み14がサイズ排除によらないようにする。その他の具体例において、前記ウェルは、そこに添加された付随的な化学捕捉剤を有さない。
前記捕捉部位の他の具体例は、前記ウェルおよび、表面上に化学捕捉剤を有する捕捉ビーズを包含する。前記捕捉ビーズは、前記ウェル内にフィットするようなサイズであってよく、いくつかの具体例において、窪み14ではない。いくつかの具体例において、前記捕捉ビーズは、隣接する間隙領域16と共平面であるか、または、わずかに上方に飛び出すことができ、そこに最終的に付着する前記複合体が前記ウェル内部に閉じ込められないようにする。ある具体例において、前記捕捉ビーズは、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレンおよびアクリラートよりなる群から選択される。ここに開示された前記化学捕捉剤のいかなる具体例も、前記捕捉ビーズの表面上に使用することができ、それが前記ウェル内に導入される前に、前記捕捉ビーズ上にコートすることができる。
前記捕捉部位ウェルの深さは、前記化学捕捉剤が、そこに導入されるか否か、および、前記捕捉ビーズがそこに導入されるか否かに依存して、変化するであろう。前記深さは、少なくともこれらの物質を収容する（すなわち、前記物質が前記ウェル30内部に含有される）ように選択することができる。ある具体例において、前記ウェルの前記深さは、約1 nmから約5 μmの範囲にある。
図1から図10には図示しないが、リッドすなわち第２の基材12は、前記基材12に直接結合させるか、または、前記疎水性バリア20A-20Jにより前記基材12に結合させることができる、と理解されるべきである。前記リッドは、それが、単一のフローチャネル（複数のチャンバー24と流体連結にある）または多数の流体的に分離されたフローチャネル（それら各々が複数のチャンバー24のサブセットと流体連結にある）を画定するように、位置することができる。
前記リッドは、前記ナノ窪み14に向けられる励起光に対して透明ないかなる物質であり得る。具体例として、前記リッドは、ガラス（例えば、ボロシリケート、フューズドシリカなど）、プラスチックなどでよい。適切なボロシリケートガラスの商業的に入手可能な具体例はD 263(R)であり、Schott North America, Inc.から入手可能である。適切なプラスチック物質、すなわち、シクロオレフィンポリマーの商業的に入手可能な具体例は、ZEONOR(R)製品であり、Zeon Chemicals L.P.から入手可能である。
前記リッドすなわち第２の基材12は、レーザー接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、プラズマ活性化接合、ガラスフリット接合、UV硬化型その他の接着剤、または分野公知のその他の方法を用いて、接合することができる。ある具体例において、スペーサー層を用いて、前記リッドを前記疎水性バリア20A, 20B, 20C, 20Dlの部分に接合することができる。前記スペーサー層は、少なくともいくつかの前記疎水性バリア20A, 20B, 20C, 20Dと前記リッドとを一緒に密封するいかなる物質でよい。
図示しないが、１以上の付随的な層を、前記基材12と前記リッドすなわち第２の基材12との間、または、前記基材12と前記ナノ窪み14との間に組み込むことができる、と理解されるべきである。これらの付随的な層は、エバネッセント野で前記ナノ窪み14の励起に対する平板導波管として機能するように選択することができる。
フローセルで使用する複合体
前記フローセル10A-10Jは、ここに開示された前記複合体の具体例で使用するのに適切であろう。ここに注釈するように、複合体は、担体（例えば、ハイドロゲルサポートまたは固体サポート）および、前記担体に付着したまたは内部に含有されたシーケンシング-レディ核酸フラグメントを包含する。適切な複合体の具体例を図12Aから図12Cに示す。前記複合体を作成するいくつかの具体的な方法を記載したが、前記担体に付着したまたは内部に含有されたシーケンシング-レディ核酸フラグメントである限り、他の方法も用いることができる、と理解されるべきである。
図12Aは、固体サポート42および、前記固体サポート42に付着したシーケンシング-レディ核酸フラグメント44を包含する複合体40Aを例示する。
ひとつの具体例において、この複合体40Aを形成するために、アダプター配列 (52, 52’)を、結合ペアのひとつのメンバーにより前記固体サポート42に結合させる。ある具体例において、このアダプター配列は、第１の配列決定プライマー配列（例えば、リード１配列決定プライマー配列）、前記フローセル10A-10I上の前記プライマー36のひとつの少なくとも部分に相補的な第１の配列（例えば、P5’配列）を包含する。上記したように、このアダプター配列は、前記結合ペアのひとつのメンバー46（例えば、ビオチン）に結合して、前記結合ペアの他方のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンなど）を包含する）前記固体サポート42の表面に結合し得る。このアダプター配列は、インデクス配列も包含することができる。
Y-アダプターをトランスポザーゼ酵素（例えば、ふたつのTn5分子）と混合して、トランスポソームを形成する。前記Y-アダプターは、互いにハイブリダイズするふたつのモザイク末端配列を包含することができる。モザイク末端配列のひとつは、第２の配列決定プライマー配列（例えば、リード２配列決定プライマー配列）、前記フローセル10A-10I上の前記プライマー36のひとつの少なくとも部分に相補的な第２の配列（例えば、P5’配列）、および、所望によりインデクス／バーコード配列に付着することができる。一緒に、前記第２の配列決定プライマー配列および前記第２の配列は、アダプター配列48, 48’を作りあげる。
タグメンテーションプロセスを、次に、実行する。サンプル（例えば、DNA）を包含する流体（例えば、タグメンテーションバッファー）を、前記トランスポソームに、および、そこに結合した前記アダプター配列を有する前記固体サポート42に添加することができる。前記サンプルが前記トランスポソームに接触すると、DNAはタグメントされ（断片化され前記固体サポート42上の前記アダプター配列52, 52’でタグ付けされ）、そして、Y-アダプターに（例えば、自由モザイク末端配列のライゲーションにより）結合する。前記サンプルの連続的タグメンテーションは、トランスポソーム間に複数の架橋分子をもたらす。シーケンシング-レディフラグメントを完了するために、さらなる伸長およびライゲーションが行われ、フラグメント50, 50’が配列48および48’に付着したことを保証する。前記トランスポザーゼ酵素は、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)処理または加熱またはプロテイナーゼK消化によって除去する。
得られた複合体40Aを図12Aに示す。前記架橋された分子がシーケンシング-レディ核酸フラグメント44であり、その各々が、フラグメント50, 50’ならびに、それらのいずれかに付着したアダプター配列48および52または48’および50’を包含する。前記アダプター配列52, 52’が最初に固体サポート42に結合し、第１の配列決定プライマー配列、前記フローセルプライマーに相補的な第１の配列、および結合複合体のひとつのメンバー46を包含する。前記アダプター配列48, 48’は前記Y-アダプターに由来し、もうひとつのフローセルプライマーに相補的な第２の配列および第２の配列決定プライマー配列を包含する。各シーケンシング-レディ核酸フラグメント44は、増幅（例えば、ブリッジ増幅）および配列決定に適切なアダプターを包含するので、PCR増幅は実行されない。これらのフラグメント44は、かくして、シーケンシング-レディとなる。さらに、前記ライブラリーフラグメント44は、同一サンプルに由来するので、前記フラグメント44は、リンクド・ロング・リード・アプリケーション (linked long read applications)に適切であろう。
図12Bは、固体サポート42および、前記固体サポート42に付着したシーケンシング-レディ核酸フラグメント44’を含む、もうひとつの複合体40Bを例示する。ひとつの具体例において、PCR-フリーヌクレオチドライブラリーが、管内に作り出され、次いで、前記ライブラリーを、前記管内で前記固体サポート42にハイブリダイズする。図12Bに示す具体例において、結合ペアのひとつのメンバーを有するプライマーを、前記管中の前記ライブラリーフラグメントに添加し、次いで、前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44’が前記固体サポート42に結合する。もうひとつの具体例において、前記固体サポート42は、結合ペア（例えば、サポート42上のアビジンおよび前記プライマーに付着したビオチン）を介して、そこに付着したプライマーを有することができる。これらのプライマーは、ライブラリーフラグメント（および、かくして、前記プライマーおよび結合ペアメンバーは、前記フラグメントのひとつの末端にあり、他方にはない。）にハイブリダイズする。もうひとつの具体例において、伸長は、酵素を置き換えるらせんを用いて実行することができる。これは、全ての二本鎖らせんライブラリー（例えば、図12Bに示されるように、フォークなしかまたはY-アダプター）をもたらす。前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44’は、変性により、前記フローセル10A,-10I上に放出されるであろう。前記ライブラリーフラグメント44’は、前記固体サポート42に付着される前に、作り出されるので、前記フラグメント44’は、同一サンプル由来しなくてもよく、かくして、リンクド・ロング・リード・アプリケーション (linked long read applications)に適切ではないであろう。
図12Cは、ハイドロゲルサポート70および、前記ハイドロゲルサポート70内に含有されるシーケンシング-レディ核酸フラグメント44’’を包含する前記複合体40Cの具体例を例示する。
この複合体40Cを形成するために、ハイドロゲルモノマーおよび／またはポリマー、ラジカル源、および架橋剤を含有する流体を前記サンプル（例えば、遺伝子物質）の存在下、混合する。この流体をミネラル油その他の適切な疎水性流体に充填し、乳化して液滴を生成することができる。ラジカル開始剤添加して、前記ハイドロゲルモノマーおよび／またはポリマーを重合および／または架橋し、前記ハイドロゲルサポート70を形成する。
適切なモノマーの具体例は、アクリルアミド、N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン、ビスアクリルアミド、ジアクリラート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、エチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールアクリラート、トリメチロールプロパントリメタクリラート、エトキシル化トリメチロールジアクリラート、エトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリラート、コラーゲンモノマー、またはそれらの組合せを包含する。
適切なポリマーの具体例は、ポリエチレングリコール-チオール、ポリエチレングリコール-アクリラート、ポリエチレングリコールジアクリラート、ポリエチレングリコール（例えば、約100から約200,000の範囲の重量平均分子量を有する）、ポリプロピレンオキシド、ポリアクリル酸、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリカプロラクトン、ポリ(ビニルスルホン酸)、ポリ(L-アスパラギン酸)、ポリ(L-グルタミン酸)、ポリリシン、寒天、アガロース、アルギン酸塩、ヘパリン、アルギン酸硫酸塩、デキストラン硫酸塩、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲンポリマー、またはそれらの組合せを包含する。
前記ラジカル源は、壊れたときにラジカルを発生する分子である。ある具体例において、前記ラジカル源は、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、4,4’-アゾビス(4-シアノ吉草酸)、1,1’-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)、アゾビスイソブチロニトリル、2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、ペルオキシド、リボフラビン、3-(ジメチルアミノ)プロピオニトリル、およびそれらの組合せよりなる群から選択される。
適切な架橋剤の具体例は、それが暴露される化学物質に依存して、架橋および非架橋し得る点で、可逆的であってよい。具体例において、前記可逆的架橋剤は、ジスルフィド結合を含有するビスアクリルアミド架橋剤であり、それは、DTT、TCEP、またはTHP（ホスフィン）のような還元剤で壊し得る。ある具体例において、前記架橋剤は、アクリルアミド、N,N’-ビス(アクリロイル)シスタミン、ビスアクリルアミド、1,4-ジアクロイルピペラジン、N-N’-ジアリルL-タルタルジアミド、およびN-N’-(1,2-ジヒドロキシエチレンン)-ビス-アクリルアミドよりなる群から選択される。前記開始剤は、光開始剤（適当な波長の光への暴露により架橋を開始する）)、または前記ラジカル源と組み合わさったときに架橋を開始するラジカル開始剤であってよい。このタイプのラジカル開始剤の具体例は、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)である。
前記サンプルは、前記ハイドロゲルサポート内に内包され始める。なぜならば、そのサイズは、前記ハイドロゲルビーズの孔を通り抜けできない点で、十分である。いくつかの具体例において、前記サンプルは、DNAまたはRNAであり、長さにおいて少なくとも約100ヌクレオチド（例えば、1,000ヌクレオチド以上、10,000ヌクレオチド以上、500,000ヌクレオチド以上など）である。いくつかの具体例において、前記ハイドロゲルサポート70の孔径は、複数の孔の測定に基づいて、前記孔の断面の平均直径または平均有効径をいう。円形ではない断面の有効径は、当該非円形断面の断面積と同一の断面積を有する円形断面の直径と同等である。ある具体例において、前記孔径は、約10 nmから約100 nmの範囲である。
ライブラリー調製を、次いで、前記ハイドロゲルサポート70内で行い得る。複数の試薬交換が前記ハイドロゲルサポート70の孔を通して起こるであろう。前記サンプルおよびそこから発生するいかなるライブラリーフラグメントは、前記ハイドロゲルマトリクス内で維持される。ライブラリー調製は、前記サンプルを断片化し、シーケンシング-レディフラグメント44’’をもたらすアダプターを添加することを要件とすることができる。
ある具体例において、ライブラリー調製は、前記ハイドロゲルサポート70内で起こるタグメンテーションにより実行することができる。得られた複合体40Cを図12Cに示す。前記アダプター配列は、ブリッジ増幅および配列決定に対する適切なアダプターを包含し、かくして得られたフラグメント44’’はシーケンシング-レディである。もうひとつの具体例において、ライブラリー調製は、ポリメラーゼ伸長を用いて実行し、それは二本鎖らせんライブラリーをもたらす。この具体的なライブラリーは、前記ハイドロゲルサポート70からの放出およびシーディングの前に、変性されることが要求される。
前記複合体を要件とする方法
ここに開示された前記方法の具体例は、ここに開示された前記フローセル10A-10Jの具体例および前記複合体40A, 40B, または40Cのいずれか一つを利用する。上記したように、前記複合体40A, 40B,または40Cの各々は、遺伝子物質の同一サンプルから得られたシーケンシング-レディフラグメントを包含することができる。１または小数の前記複合体40A, 40B, または40Cが各チャンバー内に隔離されたとき、前記同一サンプルからのライブラリーの空間的共局所化が達成される。
この方法の具体例において、前記複合体40A, 40B, または40Cを、例えば１以上の入力口から、前記フローセル10A-10Jを導入する。前記複合体40A, 40B, または40Cは、トリス-HClバッファーまたは0.5xクエン酸ナトリウム生理食塩 (SSC)バッファーのような流体と共に導入することができる。
前記複合体40A, 40B, または40Cは、流体（例えば、水性流体）で導入されるので、前記疎水性バリア20A-20Jは、前記チャンバー24（前記疎水性バリア20A-20Jより親水性であってよい）に対する前記複合体40A, 40B, または40Cの隔離を向上する助けとなり得る。
各具体的なフローセル10A-10Jにおいて、前記間隙領域16または前記ナノパッド33の表面の上方の前記疎水性バリア20A-20Jの厚み（および、かくして、各チャンバー24の深さ）は、約2 μm未満である。この浅いまたは存在しない深さで、前記捕捉部位を包含して、単一チャンバー24中の単一複合体40A, 40B, または40Cの固定化をさらに支援することができる。各チャンバー24は、ひとつの捕捉部位を有するが、いくつかの前記チャンバー24は、前記方法のいかなる所定のランの間に、複合体40A, 40B, または40Cを受領することはない、と理解されるべきである。さらに、単一チャンバー24は多数の捕捉部位を包含することができる。この具体例において、それぞれの捕捉部位および複合体40A, 40B, または40Cは結合ペアのメンバーであり、ひとつの複合体40A, 40B, または40Cが前記チャンバー24の各々内のひとつの捕捉部位に結合する。より詳しくは、前記捕捉部位は、前記結合ペアの第１のメンバーを包含することができ、前記複合体40A, 40B, または40Cの各々は、前記結合ペアの第２のメンバーを包含することができる。ひとつの特定の具体例として、前記捕捉部位は、捕捉部位プライマー（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）であり、前記複合体40A, 40B, または40Cの各々は、前記捕捉部位プライマーにハイブリダイズできる相補的プライマーを包含する。もうひとつの特定の具体例として、前記捕捉部位はアビジンを包含することができ、ビオチンが、前記複合体40A, 40B, または40Cの表面に付着することができる。
この具体的な方法は、そして、前記フローセル10A-10Jから、非固定化複合体40A, 40B, または40Cを洗い流すことを包含する。洗い流しは、前記フローセル10A-10Jにいかなる適切なバッファーを導入することを要件とする。フローは前記捕捉部位に付着してない、または、チャンバー24内に閉じ込められたいかなる複合体40A, 40B, または40Cも前記フローセル10A-10Jの出口を通して押し出すことができる。
前記方法のいくつかの具体例は、そして、前記フローセル10A-10Jに、特に、複数のチャンバー24に、外部固定化剤を導入することを包含する。前記外部固定化剤は、空気、または液体媒体、または粘性媒体であり、前記フローセルチャンバー24に導入されている流体の前記複合体40A, 40B, 40C, または40Dと混和しない。空気を用いて、前記フローセル10A-10Jから洗い流した流体を吸引することは、前記複合体40A, 40B, または40Cを取り巻く液滴を作り出し、拡散バリアを形成する。前記液体または粘性媒体の外部固定化剤は、前記チャンバー24内に付着した前記複合体40A, 40B, または40Cを少なくとも部分的に取り巻く。ある具体例において、前記外部固定化剤は、前記チャンバー24中の流体に乗っかる。前記複合体40A, 40B, または40Cを少なくとも部分的に取り巻くことによって、前記外部固定化剤は、前記フラグメント44, 44’, または44’が放出されたとき、前記チャンバー24の外側へのシーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’の拡散を阻害する助けとなる。
ここに開示された前記外部固定化剤のいずれかを用いることができるが、ひとつの具体例において、前記外部固定化剤は、ミネラル油およびシリコーン油よりなる群から選択される液体拡散バリア、グリセロールおよびスクロースよりなる群から選択される粘性媒体拡散バリアならびにそれらの組合せである、と理解されるべきである。前記外部固定化剤が温度応答性物質である、とき、温度をシーディング温度に上昇させることは、試薬をより粘稠にし、ライブラリー拡散を防止できる形態にすることができる。
前記方法のこの具体例は、そして、捕捉された複合体40A, 40B, または40Cの前記担体（例えば、前記固体サポート42または前記ハイドロゲルサポート70）を生じて、前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’を、各チャンバー24に放出することを包含し、そこで、各固定化された複合体40A, 40B, または40Cが捕捉される。この具体例において、前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’の輸送及びシーディングは、前記疎水性バリア20A-20Jおよび前記外部固定化剤（使用されている場合）によって制限される。
前記担体（すなわち、サポート42たは70)を生じて、前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’を放出することは、使用される前記複合体40A, 40B, または40Cに依存して、変化するであろう。
いくつかの具体例において、前記担体は前記固体サポート42であり、前記生じることは、前記フローセル10A-10Iに切断試薬を導入することを要件とする。前記切断試薬は、前記固体サポート42からの前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, または44’の化学的、酵素的または光化学的放出を開始することができる。これらの具体例において、熱または光のような別の刺激が、前記切断試薬をきっかけとして、前記固体サポート42から前記ライブラリーフラグメント44, または44’を放出することができる。ひとつの具体例として、遊離ビオチンを前記切断試薬として導入することでき、約92℃に加熱することを用いて、前記固体サポート42から、ビオチン-オリゴ放出を誘発することができる。
その他の具体例において、前記複合体40Cを用い、かくして、前記担体は前記ハイドロゲルサポート70である。これらの他の具体例において、ライブラリー放出を生じることは、前記フローセル10A-10Jを加熱し、前記フローセル10A-10Jに切断試薬を導入し、または、それらの組合せを要件とすることができる。加熱して、前記ハイドロゲルサポート70から前記ライブラリーフラグメント44’’を放出することは、約90℃の温度に加熱することを要件とすることができる。前記フローセル10A-10Jの全体を加熱し、前記複合体40Cが加熱したとき、前記ハイドロゲルサポート70が崩壊して前記フラグメント44’’を放出するであろう。いくつかの具体例において、前記切断試薬は、前記ハイドロゲルサポート70を重合し、そこから前記シーケンシング-レディフラグメント44’’を放出できる１以上の成分を包含することができる。具体例として、前記切断試薬は、ジチオトレイトール (DTT)、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP)、またはトリス-(3-ヒドロキシプロピル)ホスフィン (THP)を包含する。その他の具体例において、前記切断試薬は光である。これらの具体例において、前記ハイドロゲルサポート70を形成するために用いる架橋剤は、光切断部分を包含し、前記チャンバー14の前記複合体40Cを適切な波長の光に暴露して、この部分を切断し、前記ハイドロゲルサポート70を崩壊する。
上記したように、具体的な方法での前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’の輸送およびシーディングは、前記疎水性バリア20A-20Jのみで、または前記外部固定化剤と組み合わさって、制限される。そうであるので、いかなる特定の複合体40A, 40B, または40Cの前記フラグメント44, 44’, または44’’も前記特定の複合体40A, 40B, または40Cが閉じ込められた前記チャンバー24に閉じ込められるであろう。なぜならば、疎水性バリア20A-20J、および、いくつかの実例において、前記外部固定化剤が、前記複合体40A, 40B, または40Cを少なくとも部分的に取り巻くからである。
ここに開示された前記フローセル10A-10Jで、前記ナノ窪み14中または前記ナノパッド33上の前記プライマー36は、前記放出シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’をシーディングし得る。シーディングは、前記チャンバー24内で、前記フラグメント44, 44’, または44’’の前記第１または第２の配列と、前記プライマー36の相補的なものとの間のハイブリダイゼーションにより完了する。シーディングは、前記フラグメント44, 44’, または44’’および前記プライマー36に対して適切なハイブリダイゼーション温度にて実行することができる。
前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’が、各チャンバー24内部でシーディングする場所は、ある程度、前記ナノ窪み14または前記ナノパッド33の構成に依存する。これらの具体例において、前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, 44’’, または44’’’は、前記ナノパッド33の各々の前記ナノ窪み14の各々の内部前記ゲル物質34全体にシーディングする。
前記シーディングされた配列決定ライブラリーは、次いで、クラスター生成を用いて増幅し得る。
クラスター生成のひとつの具体例において、前記シーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’は、ハイフィデリティDNAポリメラーゼを用いる3’伸長によって、前記ハイブリダイズされたプライマー36からコピーされる。元のシーケンシング-レディ核酸フラグメント44, 44’, または44’’は変性され、前記チャンバー24内部に前記コピーを固定化されたままにする。等温ブリッジ増幅またはいくつかの他の形態の増幅を用いて、固定化されたコピーを増幅することができる。例えば、前記固定化されたテンプレートは、ループオーバーして隣接する相補的プライマー36にハイブリダイズし、ポリメラーゼは、前記コピーされたテンプレートをコピーして、二本鎖らせんブリッジを形成し、それは、変性されて二つの一本鎖らせんを形成する。これらの二つのらせんは、ループオーバーし、隣接する相補的プライマー36にハイブリダイズし、再度伸長して、二つの新たな二本鎖らせんループを形成する。前記プロセスは、等温変性および増幅のサイクルによって各テンプレートコピーに対して繰り返され、密度の高いクローンクラスターを作り出す。二本鎖らせんブリッジの各クラスターは変性される。ある具体例において、前記逆方向らせんは、特定の塩基切断によって除去され、順方向テンプレートポリヌクレオチドらせんはそのままにする。クラスター化は、各チャンバー24内の各ナノ窪み14内での、または、各ナノパッド33上でのいくつかのテンプレートシーケンシング-レディ核酸フラグメントの形成をもたらす、と理解されるべきである。クラスター化のこの具体例は、ブリッジ増幅であり、実行することができる増幅のひとつの具体例である。伸長増幅 (ExAmp) ワークフロー (Illumina Inc.)のような他の増幅技術も使用できる、と理解されるべきである。
クラスター生成後、配列決定を実行することができる。ここに開示された前記フローセル10A-10Jにいかなる具体例も、シーケンシング-バイ-シンセシス (SBS)、サイクリック-アレイシーケンシング、シーケンシング-バイ-ライゲーション、パイロシーケンシングなどと、よく言われる技術を包含する、様々な配列決定手法または技術を用いることができる。
具体例ひとつの具体例として、シーケンシング-バイ-シンセシス (SBS)反応を、Illumina (Sandiego, CA)からのHISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NOVASEQTM、NEXTSEQDXTM、NEXTSEQTM、または他のシーケンサーシステムのようなシステムで実行することができる。
配列決定プライマー導入することができ、それは、前記テンプレートポリヌクレオチドらせん上の相補的配列にハイブリダイズする。この配列決定プライマーは、前記テンプレートポリヌクレオチドらせんを配列決定につきレディ状態にする。SBSにおいて、前記テンプレートシーケンシング-レディ核酸フラグメント（前記テンプレートポリヌクレオチドらせん）に沿った配列決定プライマーの伸長を観察して、前記テンプレート中のヌクレオチドの配列を決定する。前記テンプレートの3’末端およびいかなるフローセル-結合プライマー36（コピーに付着していない）をブロックして、シーケンシング反応との干渉を防止し、特に、望ましくないプライミングを防止することができる。基礎をなす化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素による触媒）またはライゲーション（例えば、リガーゼ酵素による触媒）である。
特定のポリメラーゼ-ベースSBSプロセスにおいて、蛍光標識ヌクレオチドを、テンプレート依存様式の前記配列決定プライマー（それによって前記配列決定プライマーを伸長する）に添加し、前記配列決定プライマーに添加したヌクレオチドの桁およびタイプの検出を用いて、前記テンプレートの配列を決定できるようにする。より詳しくは、前記ヌクレオチドのひとつを、前記配列決定プライマーを伸長し、かつ、前記テンプレートポリヌクレオチドらせんに相補的な新生らせんに、各ポリメラーゼによって、取り込む。例えば、第１のSBSサイクルを開始するために、１以上の標識ヌクレオチド、DNAポリメラーゼなどを前記フローセル10A-10J中に／通じて送達することができ、そこで、配列決定プライマー伸長は、標識ヌクレオチドが、前記テンプレートに相補的な新生らせんに取り込ませる。この取り込みは、撮像イベントにより検出できる。撮像イベントの間、照明システム（図示せず）が前記フローセル10A-10Jに励起光を提供することができる。
いくつかの具体例において、前記蛍光標識ヌクレオチドは、さらに、一旦、ヌクレオチドが前記テンプレートに添加されれば、さらなるプライマー伸長を停止する、可逆的停止特性をさらに包含し得る。例えば、可逆的停止部位を有するヌクレオチドアナログを前記テンプレートに添加して、脱ブロック剤が送達されて前記部位が除去されるまで、つぎなる伸長が発生できないようにすることができる。かくして、可逆的停止を用いる例として、脱ブロック剤が前記フローセルなど（検出発生後）に送達され得る。
洗浄は、種々の流体の送達ステップ間を行うことができる、前記SBSサイクルを、次いで、ｎ回繰り返してｎ個のヌクレオチドによって前記テンプレートを伸長し、それによって、配列長ｎを検出することができる。
SBSが詳細に記載されてきたが、遺伝子型決定のため、または、他の化学的および／または生物学的アプリケーションにおいて、ここに記載された前記フローセル10A-10Jを他の配列決定プロトコルで利用することができる、と理解されるべきである。
本開示をさらに例示するため、具体例をここに与える。これらの具体例は、例示目的で提供され、本開示の範囲を限定すると解釈されない、と理解されるべきである。
実施例１
ここに開示される前記フローセルの具体例は、ここに記載される前記方法のひとつに従って調製した。
ガラス基材を利用し、その中に、円形ナノ窪みをエッチングした。
CYTOP(R) Sを疎水性ポリマーとして用いた。前記疎水性バリアは、前記間隙領域のZ-方向上方に約1 μmから約2 μm飛び出していた。前記疎水性バリアは、50 μmの直径を持つ円形、50 μmの幅を持つ正方形、各々50 μmの幅を長さと幅を持つ十字型、および50 μmの対角線を持つアッシングのような異なる形状のチャンバーも画定する。
前記ゲル物質はPAZAMであり、P5およびP7プライマーを、前記PAZAMに付着させた。
標準変性PhiX対照ライブラリー（6 pM充填濃度）を、シーディングおよび、ブリッジ増幅によるクラスター生成のために、各フローセルに添加した。図13Aから図13Fは、前記疎水性バリアにより画定されたいくつかの前記チャンバー中の前記ナノ窪みにおけるライブラリーを例示する。前記チャンバー幾何内部の前記DNAクラスターがDNAインターカレーターダイ（例えば、SYTOX）で染色された後に、これらの像を撮像した。これらの図に観察されるように、浅い疎水性バリアによって画定された前記チャンバーは、いかなるオートフォーカス問題も引き起こさず、浅い側壁に対するライブラリーの喪失も観察されなかった。
実施例２
ガラス基材をCYTOP(R) Sで被覆して、実施例１に記載されるように疎水性バリアを形成した。前記疎水性バリアは約2 μmの厚みを有し、前記疎水性バリアによって画定される前記マイクロチャンバーは約40 μmの直径を有する。前記マイクロチャンバー間のピッチが異なる３つの異なる疎水性バリアを形成した。前記ピッチは、前記マイクロチャンバーの直径の1.15から1.5倍で変化した。前記ガラス基材をPAZAMでコートし、ポリッシュして前記疎水性バリアから前記ゲル物質を除去した。プライマーグラフト化を実行して、P5およびP7プライマーを前記マイクロチャンバー中で、前記PAZAMに付着させた。UV硬化型接着剤を用いてリッドを接合して、フローセルを形成した。
蛍光ダイ含有液体を前記フローセルに導入した。青色発光波長を前記フローセル上に発光し、前記液体を導入した後、前記フローセルの上部の蛍光像を撮像した。これらの像は、図14A(i), 図14B(i), および図14C(i)にて上面像として示される。描写されるように、前記液体は、前記マイクロチャンバーおよび前記疎水性バリアを包含する表面を被覆した。
前記液体を約200 μL/分（約16 cm/sの線速度）から約2 mL/分（約80 cm/sの線速度）のフローレートにて、空気と置換した。青色発光波長を前記フローセル上に発光し、前記空気を導入した後、前記フローセルの上部の蛍光像を撮像した。これらの像は、図14A(ii), 図14B(ii), および図14C(ii)にて、底面像として示される。描写されるように、空気の導入は、前記マイクロチャンバー内部に前記液体が閉じ込められるようにした。図14A(i)および(ii)、図14B(i)および(ii)ならびに図14C(i)および(ii)における像は２０倍の倍率である。
実施例３
フローセルを、実施例１に記載されるように、ナノ窪みのサブセット周りのいくつかの円形マイクロチャンバーを画定する前記疎水性バリアで調製した。
図12Aに示されるものと同様の複合体を調製した。特定のビーズ上の前記フラグメントは、同一の長鎖DNA分子由来である。前記ライブラリーフラグメントを、ビオチンよりも弱い親和性を有するデスチオビオチンオリゴを介して、前記固体サポートに付着した。前記複合体を前記マイクロチャンバーに充填した。前記複合体の前記マイクロチャンバー表面への付着を、アンカー（例えば、前記ゲル物質またはアルキン-PEG-ビオチンリンカーに付着した前記P5プライマーにハイブリダイズしたビオチンに相補的なプライマーは、クリックケミストリーを用いて、前記ゲル物質上の遊離アジドに共有結合させた）で達成した。ドデシル硫酸ナトリウム入りクエン酸ナトリウム生理食塩水バッファー中の遊離ビオチンを導入し、前記フローセルを約80℃に加熱して、各複合体から前記ライブラリーを放出した。空気を、前記フローセルを通じて吸引して、遊離ビオチン溶液を押し出した。前記疎水性／親水性表面構造のため、前記液体が空気で押し出されたとき、前記マイクロチャンバー内部に液滴が形成された。前記液滴は、前記ライブラリーフラグメントが、隣のマイクロチャンバーに拡散することを防止した。
前記放出されたライブラリーフラグメントは、次いで、前記マイクロチャンバー内の前記表面プライマーにハイブリダイズさせ、伸長ステップを実行して、相補的コピーを作り出した。クラスター生成をブリッジ増幅によって実行した。配列決定を、次いで、前記フローセル上で実行した。
図15は、配列決定ランのデータ分析後の前記フローセルの部分を例示する。オリジナルの色は、参照ゲノムに対する近似性に基づき、一緒にグループ化されたアイランドまたはショートリードを表す。各色は、特定のマイクロチャンバーに分離されているので、所与のマイクロチャンバーにおけるショートリードはゲノムDNAの同一ピース由来であり、かくして、同一複合体由来である。これらの結果は、前記マイクロチャンバーが、前記複合体および放出されたライブラリーフラグメントを各チャンバーに閉じ込めることができたことを示す。
実施例４
ガラス基材をCYTOP(R) Sでコートして、実施例１に記載するように、疎水性バリアを形成した。前記疎水性バリアは約1 μmの厚みを有し、前記疎水性バリアによって画定された前記マイクロチャンバーは異なる形状を有した。前記円形マイクロチャンバーは約40 μmの直径を有し、前記正方形またはアッシングマイクロチャンバーは、それぞれ、約180 μmから約200 μmの範囲の長さおよび幅または対角線を有していた。前記ガラス基材をPAZAMでコートし、ポリッシュして、前記疎水性バリアから前記ゲル物質を除去した。プライマーグラフト化を実行して、P5およびP7プライマーを前記マイクロチャンバー中の前記PAZAMに付着させた。UV硬化型接着剤を用いてリッドを接合して、フローセルを形成した。
蛍光ダイ含有液体を前記フローセルに導入した。前記液体を約200 μL/分（約16 cm/sの線速度）から約2 mL/分（約80 cm/sの線速度）のフローレートにて、空気と置換した。青色発光波長を前記フローセル上に発光し、前記空気を導入した後、前記フローセルの上部の蛍光像を撮像した。これらの像は図16Aから図16Eに示される。描写されるように、空気の導入は、前記マイクロチャンバー内部に前記液体が閉じ込められるようにした。図16Aから図16Eにおける像は１０倍の倍率である。
実施例５
ガラス基材をCYTOP(R) Sで被覆して、実施例１に記載されるように疎水性バリアを形成した。前記疎水性バリアは約200 nmの厚みを有し、前記疎水性バリアによって画定された前記マイクロチャンバーは異なる形状を有した。前記円形マイクロチャンバーは約40 μmの直径を有し、前記正方形またはアッシングマイクロチャンバーは、それぞれ、約180 μmから約200 μmの範囲の長さおよび幅または対角線を有していた。前記ガラス基材をPAZAMでコートし、ポリッシュして、前記疎水性バリアから前記ゲル物質を除去した。プライマーグラフト化を実行して、P5およびP7プライマーを前記マイクロチャンバー中の前記PAZAMに付着させた。UV硬化型接着剤を用いてリッドを接合して、フローセルを形成した。
蛍光ダイ含有液体を前記フローセルに導入した。前記液体を約200 μL/分（約16 cm/sの線速度）から約2 mL/分（約80 cm/sの線速度）のフローレートにて、空気と置換した。青色発光波長を前記フローセル上に発光し、前記空気を導入した後、前記フローセルの上部の蛍光像を撮像した。これらの像は図17Aから図17Dに示される。描写されるように、空気の導入は、前記マイクロチャンバー内部に前記液体が閉じ込められるようにした。図17Aから図17Dにおける像は１０倍の倍率である。
実施例６
ここに開示される前記フローセルの具体例は、ここに記載された前記方法のひとつに従って調製した。
ガラス基材を利用し、その中に、円形ナノ窪みをエッチングした。露出したナノ窪みを、次いで、ノルボルネンでシラン化し、前記ゲル物質、PAZAMでコートした。ポリッシングを実行して、前記疎水性バリアから前記PAZAMを除去した。
ポジティブフォトレジストを前記パターン化基材に適用した。前記ポジティブフォトレジストを露光し、現像して、前記疎水性バリア用の六角形パターンを画定した。酸素プラズマアッシングを、次いで、実行して、前記パターン化部分から前記ノルボルネンおよびPAZAMを除去し、六角形パターンに従って前記パターン化基材を露出させる。
トリクロロ(1H,1H,2H,2H-ペルフルオロオクチル)シラン (PFOTSは前記疎水性物質であった。前記ポジティブフォトレジスト全体および前記パターン化基材の露出させた部分上に、六角形パターンに従って、前記疎水性物質を堆積させた。次に、リフトオフプロセスを用いて、残ったフォトレジストおよび前記フォトレジスト上のいかなる疎水性物質も除去した。これは、前記疎水性バリアによって画定される前記マイクロチャンバーおよび、各マイクロチャンバー内の前記ナノ窪みのサブセットを露わにした。前記疎水性バリアは、六角形パターンの領域にある前記ナノウェルおよび前記間隙領域の表面をコーティングする単分子層であった。
プライマーグラフト化を実行して、前記ナノ窪み中の前記PAZAMにP5およびP7プライマーを付着させた。
前記フローセル表面のCFR像を撮像し、図18Aに示す。この像は、六角形パターンに従ってパターン化基材の露出した部分から前記PAZAMが効率的に除去されたことを示す。
フルオレッセイン含有液体を前記フローセルに導入した。次に、空気を100 μL/分のフローレートにて前記フローセルに導入して、前記液体を吸引した。FLUORINERTTM FC-40（3Mから）も導入した。前記フローセル表面の蛍光像は、FC40オイルが導入された後、撮像した。この像は図18Bに示される。描写されるように、オイルの導入は、前記フルオレッセイン含有液体がほとんどの前記マイクロチャンバー内に閉じ込められるようにした。図18Aにおける結果は、前記疎水性物質がうまく堆積されたことを指示する。
実施例７
トルエン中の(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)トリクロロシランの分散体を調製した。前記分散体の濃度は10%であった。150 μmノズル付きのOPTOMEC AJプリンターで、前記分散体をガラス基材上にプリントして、疎水性バリアを形成した。前記ライン幅は約20 μmであった。図19は、前記印刷された疎水性バリアを描写する。
さらに、ここに提供された範囲は、上述の範囲ならびに前記上述の範囲内のいかなる値およびその下位範囲を、あたかもそれらが明示的に記載されていたかのように、包含する、と理解されるべきである。例えば、約2 mmから約300 mmによって表される範囲は、明示的に記載された約2 mmから約300 mmの限定のみならず、約15 mm、22.5 mm、245 mmなどの個別の値および、約20 mmから約225 mmなどの下位範囲も包含する、と解釈されるべきである。
前述した概念および以下により詳細に議論される更なる概念（ただし、そのような概念は互いに矛盾しない）の全ての組合せは、ここに開示された発明特定事項の一部である、と考慮される、と考えられるべきである。特に、この開示の最後にある特許請求された特定事項の全ての組合せが、ここに開示された発明特定事項の一部である、と考慮される。ここに明示的に採用され、出典明示してここに組み込まれるいかなる開示にも現れるであろう用語は、ここに開示された特定の概念に最も一致する意味に合致する、と考えられるべきである。
いくつかの具体例が詳細に説明されてきたが、開示された具体例は修飾することができる、と理解されるべきである。それゆえ、上述の説明は非限定的である、と考慮されるべきえある。

Claims (52)

  1. 基材であって、前記基材の表面に画定されたナノ窪み；および前記ナノ窪みを分離する間隙領域を包含する基材；ならびに、疎水性物質層であって、ｉ）前記間隙領域と、少なくとも実質的に共通する平面である表面を有し、かつ、ｉｉ）前記ナノ窪みの各サブセット周りに疎水性バリアを画定するように位置する疎水性物質層を含むフローセル。
  2. 前記基材は、さらに、前記ナノ窪みの各サブセットの各々を取り囲むバリア間隙を包含し；前記疎水性物質層は、前記バリア間隙上に画定され、約2 μm未満の厚みを有する、請求項１に記載のフローセル。
  3. 前記基材は、さらに、前記ナノ窪みの各サブセットの各々を取り囲むバリア窪みを包含し；前記疎水性物質層は前記バリア窪みの中に位置する、請求項１に記載のフローセル。
  4. 前記疎水性物質層は、約10 nmから約1 μmの範囲の厚みを有する、請求項１、２または３に記載のフローセル。
  5. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１、２、３または４に記載のフローセル。
  6. 前記フローセルは、さらに、前記ナノ窪み中のポリマー層；および前記ポリマー層に付着したプライマーを含む、請求項１、２、３、４または５に記載のフローセル。
  7. パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；および前記ナノ窪みを分離する間隙領域を包含するパターン化基材上に、疎水性物質を適用し；それによって、ｉ）前記ナノ窪み中に、およびｉｉ）前記間隙領域上に疎水性物質層を形成し、ここに、前記間隙領域上の前記疎水性物質層が約2 μm未満の厚みを有し；前記疎水性物質層の第１部分上に、マスク物質を適用して、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに、疎水性バリアのパターンを画定し、それによって、前記疎水性物質層の第２部分を前記各サブセットにて露出させ；前記疎水性物質層の第２部分を除去し、それによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットを露出させ；前記各サブセットのナノ窪みに、ゲル物質を付着させ；前記各サブセットのナノ窪みに、ゲル物質を付着させ；前記マスク物質を前記疎水性物質層の第１部分から除去して、前記疎水性バリアを露わにすること
    を含む方法。
  8. 前記パターン化基材は、さらに、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りのバリア間隙を包含し；前記疎水性バリアは、前記バリア間隙上に形成される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記疎水性バリアは、いくつかの前記ナノ窪みの中、および、前記ナノ窪みの各サブセットと前記間隙領域との間に配置されるいくつかの前記間隙領域上に形成される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記ゲル物質の付着は、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記各サブセットの間隙領域上、ならびに、前記マスク物質上に、前記ゲル物質を堆積させることを要件とし；前記方法は、さらに、前記マスク物質から、および、前記各サブセットの間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む、請求項７、８または９に記載の方法。
  11. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項７、８、９または１０に記載の方法。
  12. 前記疎水性物質を適用する前に、さらに、非パターニングサポートをパターニングすることにより、前記パターン化基材を形成して前記ナノ窪みを形成することを含む、請求項７、８、９、１０または１１に記載の方法。
  13. 前記パターニングは、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー、またはそれらの組合せを包含する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記マスク物質を前記疎水性物質層の第１部分から除去して、前記疎水性バリアを露わにすることは、前記ゲル物質を付着させる前に行われ；前記ゲル物質を付着させることは、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセットの上、ならびに前記疎水性バリアの上に、前記ゲル物質を堆積させることを要件とし；前記方法は、さらに、前記疎水性バリアからおよび前記各サブセットの間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む、請求項７、８、９、１０、１１，１２または１３に記載の方法。
  15. パターン化基材であって、前記パターン化基材のサブセットの表面に画定され、間隙領域によって分離されたナノ窪み；および前記サブセットの各々の周りの前記パターン化基材の表面に画定されたバリア窪みを包含するパターン化基材上に、疎水性物質を適用し；それによって、ｉ）前記バリア窪み中に、およびｉｉ）前記ナノ窪み中に、疎水性物質層を形成し；前記バリア窪み中の前記疎水性物質層上に、マスク物質を適用し；前記疎水性物質層を前記ナノ窪みから除去し；前記サブセットのナノ窪みに、ゲル物質を付着させ；前記マスク物質を前記バリア窪み中の前記疎水性物質層から除去して、疎水性バリアを露わにすることを含む方法。
  16. 前記ゲル物質の付着は、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセットの上、ならびに前記マスク物質の上に、前記ゲル物質を堆積させることを要件とし；前記方法は、さらに、前記マスク物質から、および前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマーおよびポリシロキサンよりなる群から選択される、請求項１５または１６の記載の方法。
  18. 前記疎水性物質を適用する前に、さらに、非パターニングサポートをパターニングすることによって前記パターン化基材を形成して、前記ナノ窪みおよび前記バリア窪みを形成することを含む、請求項１５、１６または１７に記載の方法。
  19. 前記パターニングは、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー、またはそれらの組合せを包含する、請求項１８に記載の方法。
  20. パターン化基材であって、前記パターン化基材のサブセットの表面に画定され、間隙領域によって分離されたナノ窪みであって、第１深さを有するナノ窪み；前記サブセットの各々の周りの前記パターン化基材の表面に画定され、前記第１深さよりも大きい第２深さを有するバリア窪みを包含するパターン化基材に、疎水性物質を適用し；それによって、ｉ）前記バリア窪み内に、およびｉｉ）前記ナノ窪み内に、前記疎水性物質を導入したパターン化基材上に、疎水性物質を導入し；前記ナノ窪みから、前記疎水性物質を除去し、それによって、少なくともいくらかの前記疎水性物質を、前記バリア窪み中に残し；前記バリア窪み中に残った前記少なくともいくらかの前記疎水性物質を硬化させることを含む方法
  21. さらに、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセットをシラン化し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域のサブセット上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することによって、前記ナノ窪みにゲル物質を付着させることを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 前記疎水性物質を適用する前に、さらに、非パターニングサポートをパターニングすることによって前記パターン化基材を形成して、前記ナノ窪みおよび前記バリア窪みを形成することを含む、請求項２０、２１または２２に記載の方法。
  24. 前記パターニングは、エッチング、ナノインプリンティングリソグラフィー、またはそれらの組合せを包含する、請求項２３に記載の方法。
  25. パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材上に、マスク物質を適用し、それによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに疎水性バリア用のパターンを画定し；前記パターンに従って疎水性物質層を適用し、それによって、前記疎水性バリアを形成し、ここに、前記疎水性物質層は、約2 μm未満の厚みを有し；前記マスク物質を除去することを含む方法
  26. 前記疎水性物質層も前記マスク物質上に適用し、前記マスク物質を除去することは、その上の前記疎水性物質層を除去することである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記マスク物質の適用は、前記パターン化基材上に二層レジストを適用し、前記二層レジストは前記リフトオフ層および撮像層を包含し；前記撮像層中に前記パターンを画定し、それによって、前記リフトオフ層の部分を露わにし；前記リフトオフ層の露わにされた部分を除去することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
  29. 前記マスク物質を適用する前に、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から前記ゲル物質を除去することを含む、請求項２５、２６、２７または２８に記載の方法。
  30. 約2 μm未満の厚みを有する疎水性物質フィルムを、パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み、前記ナノ窪みを分離する間隙領域および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に積層し；前記乾燥疎水性物質フィルムをフォトリソグラフィーに付して、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに疎水性バリアを形成することを含む、方法。
  31. 前記疎水性物質フィルムは、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記疎水性物質フィルムを積層する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を付着させ；前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、疎水性物質をプリントし、ここに、前記疎水性物質をプリントして、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに疎水性バリアを形成し、約2 μm未満の厚みとすることを含む方法。
  34. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記疎水性物質をプリントする前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングし、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から、前記ゲル物質を除去することを含む、請求項３３、または３４に記載の方法。
  36. 前記プリンティングがエアロゾルプリンティングを要件とする、請求項３３、３４または３５に記載の方法。
  37. ２枚の犠牲層；および約2 μm未満の厚みを有し、前記２枚の犠牲層の間に位置する疎水性物質層を含む多層プリカーサーをレーザーカッティングおよびウィーディングし；それによって、前記２枚の犠牲層のうち第１のものを除去し、前記２枚の犠牲層のうち第２のものの上に位置する前記疎水性物質層中に、疎水性バリアのパターンを画定し；パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み；前記ナノ窪みを分離する間隙領域；および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、前記パターン化疎水性物質を積層することを含む方法
  38. さらに、前記２枚の犠牲層のうち第２のものを除去することを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記疎水性物質をプリントする前に、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から前記ゲル物質を除去することを含む、請求項３７、３８または３９に記載の方法。
  41. 疎水性物質でスタンプをコーティングし、前記スタンプは、疎水性バリアのパターンを画定し；パターン化基材であって、前記パターン化基材の表面に画定されたナノ窪み、前記ナノ窪みを分離する間隙領域、および前記ナノ窪み中のゲル物質を包含するパターン化基材に、前記疎水性バリアのパターンで前記疎水性物質を転写し、それによって、前記ナノ窪みおよび前記間隙領域の各サブセット周りに、前記疎水性バリアを形成することを含み、前記疎水性バリアは約2 μm未満の厚みを有する、方法
  42. 前記疎水性物質は、フッ素化ポリマー、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、シラン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記疎水性物質を転写する前に、前記方法は、さらに、非パターニングサポートをパターニングして、前記ナノ窪みを形成することによって、前記パターン化基材を形成し；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域をシラン化することによって、前記ナノ窪みに、前記ゲル物質を付着させ；前記ナノ窪みおよび前記間隙領域上に、前記ゲル物質を堆積させ；前記間隙領域から前記ゲル物質を除去することを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. マスターテンプレートから前記スタンプを形成することを含む、請求項４１、４２または４３に記載の方法。
  45. 基材；前記基材上に位置するゲル物質のナノパッド；および、疎水性物質層であって、ｉ）前記間隙領域と少なくとも実質的に共通する平面である表面を有し、およびｉｉ）前記ナノパッドの各サブセット周りに疎水性バリアを画定するように位置する、疎水性物質層を含むフローセル。
  46. 前記ナノパッドの各々は約2 μm未満の厚みを有し；前記疎水性物質層は約2 μm未満の厚みを有する、請求項４５に記載の方法。
  47. さらに、前記ナノパッドの各々に付着した複数のプライマーを含む、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 基材上にナノパッドの離散的なサブセットを形成し、前記ナノパッドの各々は約2 μm未満の厚みを有し；前記離散的なサブセットの各々周りに、前記基材上に疎水性物質を選択的に適用し、それによって、ｉ）前記離散的なサブセットの各々の周りに、ｉｉ）前記ナノパッドの表面と少なくとも実質的に共平面である表面を有し、かつ、ｉｉｉ）約2 μm未満の厚みを有する、疎水性バリアを形成することを含む、方法。
  49. 前記疎水性物質の選択的適用は、前記疎水性バリアのパターンで前記疎水性物質の前記基材への転写を要件とする、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記疎水性物質の選択的適用は、前記疎水性バリアのパターン中の前記疎水性物質の前記基材へのプリントを要件とする、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記疎水性物質の選択的適用は、ナノパッドの前記離散的なサブセットへマスク物質を適用し、それによって、前記疎水性バリア用のパターンを画定し；前記パターンに従って前記疎水性物質を適用し、それによって、前記疎水性バリアを形成し；前記マスク物質することを含む、請求項４８に記載の方法。
  52. ナノパッドの前記離散的なサブセットの形成は、前記基材の表面上にゲル物質を適用し；前記ゲル物質上にマスク物質を配置し；前記マスク物質および前記ゲル物質中に空間を形成し；前記マスク物質を除去することを含む、請求項４８、４９、５０または５１に記載の方法。
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