KR102171865B1 - 패턴화된 소수성 표면을 사용한 자가 조립된 패터닝 - Google Patents

패턴화된 소수성 표면을 사용한 자가 조립된 패터닝 Download PDF

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Abstract

본원에 제공된 실시형태는 예를 들어 디지털 유체공학 장치를 위한 패턴화된 흐름 셀 또는 패턴화된 표면을 포함하는 서열 분석을 위해 패턴화된 표면을 제조하는 자가 조립된 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 포토리쏘그래피 공정 동안 산소 플라즈마 처리의 필요 없이 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 복수의 마이크로스케일 또는 나노스케일 윤곽을 갖는 패턴화된 표면을 생성하기 위해 포토리쏘그래피를 이용한다. 또한, 상기 방법은 윤곽에 대한 겔 재료의 증착 이후에 임의의 화학적 또는 기계적 연마 단계의 사용을 회피한다.

Description

패턴화된 소수성 표면을 사용한 자가 조립된 패터닝
일반적으로, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드 서열분석 분야를 위해 마이크로- 또는 나노-패턴화된 표면을 제조하기 위한 포토리쏘그래피 패터닝 공정의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 출원은 흐름 셀 또는 디지털 유체공학 장치를 위해 패턴화된 표면을 제조하는 자가 조립된 방법에 관한 것이다.
흐름 셀은 기판 내에 채널 또는 웰을 통해 유체가 흐르게 하는 장치이다. 핵산 분석 방법에서 유용한 패턴화된 흐름 셀은 불활성 개재성 영역 내에 활성 표면을 갖는 별개의 웰을 포함한다. 흐름 셀의 표면은 보통 하기 단계를 이용하여 제작된다: (1) 웰을 초기에 균일한 기판에 에칭하고; (2) 웰 및 개재성 영역을 실란 및 겔 재료에 의해 작용기화하고; (3) 개재성 영역을 커버하는 과량의 겔 재료를 연마 공정을 통해 제거하고; (4) 이후 웰에서의 겔 재료를 단일 가닥 프라이머 DNA에 의해 그래프팅하여 하류 서열분석 분야를 위한 흐름 셀 표면을 제공한다. 이러한 경우에, 겔 재료 중 일부는 제작 워크플로우의 연마 단계에서 폐기된다. 또한, 개재성 영역의 표면 에너지는 주로 시작 기판에 따라 달라진다.
실시형태는 서열분석 분야를 위한 패턴화된 표면을 제조하기 위한 자가 조립된 방법에 관한 것이다. 패턴화된 표면은 디지털 유체공학 장치를 위한 예를 들어 패턴화된 흐름 셀 또는 패턴화된 표면을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 포토레지스트의 증착 전에 산소 플라즈마 표면 또는 다른 처리의 필요를 제거하면서, 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 복수의 마이크로스케일 또는 나노스케일 윤곽(contour)을 갖는 패턴화된 표면을 생성하기 위한 포토리쏘그래피를 이용한다. 또한, 몇몇 실시형태는 윤곽 위로 겔 재료의 증착 후 화학적 또는 기계적 연마 단계의 사용을 피한다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 연속 소수성 코팅층을 포함하는 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 고체 지지체의 소수성 코팅층 상에 포토레지스트를 배치하여 소수성 코팅층을 커버하는 단계; 및 포토리쏘그래피(또는 당해 분야에 공지되고/되거나, 본 명세서에 기재된 다른 적합한 방법)에 의해 포토레지스트 층을 패턴화하여 표면 상에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성하는 단계; 및 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽 내에 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합할 수 있는 겔 재료의 층을 증착시키는 단계를 포함하는, 겔 코팅된 윤곽을 갖는 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 소수성 코팅층의 일부를 에칭함으로써 형성된다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 소수성 코팅층을 포함하는 소수성 개재성 영역에 의해 서로 분리된다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽의 적어도 일부는 소수성 코팅이 없다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 포토레지스트를 배치하기 전에 표면의 플라즈마 표면 개질 처리(예를 들어, 디스큠(descum) 또는 산소 플라즈마 처리, 코로나 처리, 가열, 화학 또는 액체 활성화, 또는 표면 에너지를 증가시키고 결합 특징을 개선하기 위해 이용된 다른 처리)를 요하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 윤곽은 웰이다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 분석 분야를 위한 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 연속 소수성 코팅층을 포함하는 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 고체 지지체의 소수성 코팅층 상에 포토레지스트를 배치하여 소수성 코팅층을 커버하는 단계; 포토리쏘그래피(또는 다른 적합한 방법)에 의해 포토레지스트 층을 패턴화하여 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 표면 상에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성하는 단계; 포토레지스트를 제거하는 단계; 및 결합 재료의 층, 예컨대 실란층을 표면에 도포하여 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 겔 재료를 결합 재료, 예컨대 실란의 층에 공유 부착하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드를 겔 재료에 공유 부착하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 겔 재료를 결합 재료, 예컨대 실란의 층에 비공유 부착하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 겔 재료의 층을 결합 재료 층 또는 실란의 층에 도포하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 분석 분야를 위한 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 연속 소수성 코팅층을 포함하는 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 고체 지지체의 소수성 코팅층 상에 포토레지스트를 배치하여 소수성 코팅층을 커버하는 단계; 포토리쏘그래피(또는 다른 적합한 방법)에 의해 포토레지스트 층을 패턴화하여 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 표면 상에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성하는 단계; 실란의 층을 표면에 도포하여 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버하는 단계; 및 겔 재료를 결합 재료 층 또는 실란의 층에 공유 부착하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 포토레지스트를 제거하여 소수성 개재성 영역에 소수성 층을 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 결합 재료는 겔 재료를 소수성 코팅층 및/또는 고체 지지체에 공유로 또는 비공유로 부착시킨다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료는 결합 재료, 예를 들어 실란에 공유 결합된다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합할 수 있는 겔 재료에 의해 코팅된 마이크로스케일 및/또는 나노스케일 윤곽을 포함하는 패턴화된 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계(표면은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 제조됨); 및 복수의 제1 올리고뉴클레오타이드 및 복수의 제2 올리고뉴클레오타이드를 겔 재료에 공유 부착시키는 단계를 포함한다.
도 1은 기판의 패턴화된 표면 위에 소수성 개재성 영역을 생성하기 위해 사용될 수 있는 과불화 중합체(CYTOP-A, CYTOP-M 및 CYTOP-S)의 3개의 유형을 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 2a는 복수의 웰 및 소수성 개재성 영역을 포함하는 유리 기판의 패턴화된 표면의 부분 단면도이다.
도 2b는 유리 슬라이드의 상부 위의 재료의 3개의 층을 보여주는 도 2a의 확대도이다.
도 2c는 Typhoon 장치로부터의 3개의 그래프팅된 유리 표면의 형광 영상이다.
도 3은 화학 처리 전 및 후의 대조군 표면과 비교하여 CYTOP-M 및 CYTOP-S 처리된 유리 표면의 접촉 각을 예시한다.
도 4는 패턴화된 표면을 생성하기 위한 통상적인 워크플로우의 단면도를 예시한다.
도 5는 패턴화된 표면을 생성하기 위한 개선된 워크플로우의 하나의 실시형태를 예시한다.
도 6a 및 도 6b는 14㎛ 마이크로웰을 갖는 패턴화된 장치 표면의 형광성 영상이다.
도 6c는 700㎚ 직경 마이크로웰에서의 패턴화된 DNA 클러스터의 형광성 영상이다.
도 7은 패턴화된 표면을 생성하기 위한 개선된 직접 패터닝 워크플로우의 하나의 실시형태를 예시한다.
도 8a는 리프트-오프 방법을 이용하여 패턴화된 표면을 생성하기 위한 개선된 패터닝 워크플로우의 하나의 실시형태를 예시한다.
도 8b는 도 8a에 예시된 리프트-오프 워크플로우를 이용한 14㎛ 직경 마이크로웰 구조에서의 패턴화된 PAZAM 및 DNA 클러스터의 형광성 영상을 예시한다.
도 9a는 액상 리플로우 공정의 예를 예시한다.
도 9b는 기상 리플로우 공정의 예를 예시한다.
도 10a는 O2 플라즈마 처리 후 PAZAM 코팅된 CYTOP-S 나노웰(700㎚ 내지 1.1㎛의 직경)의 광학 현미경 영상이다.
도 10b는 액상 용매 리플로우 후 도 10a에서의 PAZAM 코팅된 CYTOP-S 나노웰의 광학 현미경 영상이다.
도 10c는 형광성 다이에 의한 수성 액적의 습윤/탈습윤 후 도 10b의 PAZAM 코팅된 CYTOP-S 나노웰의 형광 영상이다.
도 11a는 마이크론이하 크기의 웰에서 DNA 클러스터 패터닝을 도시한다. 밝은 스팟은 형광성 염료 표지된 DNA 클러스터이다. "t" 형상 구역에서, 재료는 패터닝 없는 SiO2이고, 클러스터는 무작위로 분포된다. 영상은 도 11b에 도시된 위상배치를 이용하여 생성되었다.
도 11b는 패턴화된 기판에 대한 단면 예시를 도시한다. 웰은 1.75 마이크로 피치에 의해 어레이된 0.7 마이크론 직경을 갖는다.
도 11c는 바이오-시약의 교환을 수월하게 하도록 MiSeq(등록상표) 흐름 셀 포맷에서 패턴화된 기판 어셈블리를 보여준다. 사진은 도 11b에 도시된 위상배치를 이용하여 생성되었다.
도 12a 및 도 12b는 DNA 클러스터 크기 및 강도가 상이한 웰 크기에 의해 조율 가능하다는 것을 보여준다. 도 12a는 도 11b에 도시된 바와 같은 표면 층을 갖는 0.7 마이크론 직경 웰 및 1.75 마이크론 피치에서 성장한 SYTOX(등록상표) 염색된 클러스터를 보여준다. 도 12b는 0.9 마이크론 직경 웰 및 1.75 마이크론 피치에서 성장한 SYTOX(등록상표) 염색된 클러스터를 보여준다.
도 13a 내지 도 13c는 CYTOP 패턴화된 표면(웰 직경 0.7 마이크론; 피치 1.75 마이크론)으로부터의 서열분석 결과를 보여준다. 도 13a는, 연마 무 패터닝 방법을 이용하여 얻은 CYTOP 나노웰 내의 클러스터의 패터닝을 나타내는, 중첩된 C 및 T 채널 및 원형 기점을 보여주는 제1 염기 영상이다. 도 13b는 이 실행의 판독 1 및 판독 2에 대한 미스매치율(오차율)(각각 150회 사이클)을 보여준다. 달성된 오차율은 MiSeq 실행으로부터 예측된 것과 유사하다(150회 사이클의 종료 시 대략 2%). 이 도면은 또한 쌍 지은 말단 턴-어라운드가 연마 무 패터닝 방법에 의해 적합하다는 것을 입증한다. 도 13c는 실행을 위한 사이클의 함수로서 판독의 q-점수(품질 점수)를 보여주는 한편, 염기 아웃풋에 품질의 측정치를 제공한다. CYTOP 패터닝은 서열분석 화학에 적합하고 튼튼하여서, 2 x 150bp 서열분석을 마감하기 위해 수천 개의 흐름 교환을 느리게 하는 것으로 보여졌다. 이 실험에 대한 상세사항은 실시예 3에 기재되어 있다.
실시형태는 관심 대상의 분석물질, 예컨대 세포, 세포이하 성분 및 분자(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 생물학적 성분의 분석 및 합성에 사용될 수 있는 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 생물학적 분자는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 다당류, 당, 대사물질, 효소 보인자 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 패턴화된 표면이 사용될 수 있는 특히 유용한 분석 공정은 예를 들어 핵산 서열분석 분야를 포함한다. 일 실시형태에서, 패턴화된 표면은 흐름 셀 또는 일렉트로웨팅 유체공학 장치의 일부이다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 복수의 마이크로스케일 또는 나노스케일 윤곽을 갖는 패턴화된 표면을 생성하기 위해, 나노제작 기법, 예컨대 포토에칭, 사진제판 또는 포토리쏘그래피 또는 다른 패터닝 방법, 예컨대 e-빔 리쏘그래피, 나노 임플란트 리쏘그래피, 나노-스탬핑 또는 직접적인 삭마를 사용한다. 포토리쏘그래피가 본 명세서에서 패터닝 기법으로 언급된 경우, 이 다른 방법은 또한 표면을 패턴화하도록 사용될 수 있다. 패턴화된 표면은 포토리쏘그래피 전에 기판 표면의 산소 플라즈마 처리의 필요 없이 제조될 수 있다. 겔 재료는 표면 상에 증착될 수 있고, 표면 상의 윤곽 및 개재성 영역의 차등 소수성/친수성 특징은, 원하는 특징부에서 겔 재료를 보유하면서, 표면의 일부 영역으로부터 겔 재료를 편리하게 제거하도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 겔 재료는 실란화된 웰에서 보유되고 웰 주위의 소수성 개재성 영역으로부터 제거될 수 있다. 이러한 실시형태는 표면 위로 겔 재료의 증착 후 개재성 영역으로부터 겔 재료를 제거하도록 가혹한 화학적 또는 기계적 연마 단계의 사용을 피함으로써 특히 유리할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 개재성 영역은 과불화 중합체, 예컨대 CYTOP-S를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 헤딩 부문은 오직 체계화 목적을 위한 것이고, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
표면 제조
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 미리 결정된 위치에서 분석물질, 예컨대 핵산 분자에 결합하도록 구성된 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이고, 패턴화된 표면에 관한 것이다. 예를 들어, 패턴화된 표면은 차등 소수성 및 친수성 특징을 갖는 영역 또는 윤곽을 가질 수 있다. 이것은 표면 화학물질이 표면에 차등으로 도포되게 할 수 있다. 예를 들어, 표면 상에 형성된 윤곽, 웰 또는 다른 특징부는 서로로부터의 윤곽, 웰 또는 다른 특징부를 분리하는 개재성 영역으로부터 부재한 겔 재료 및/또는 반응성 실란을 함유하도록 처리될 수 있다. 일 실시형태에서, 윤곽 또는 웰은 분석물질 예컨대 핵산 분자에 결합할 수 있거나 이에 결합된 겔 또는 유사한 중합체 재료에 의해 코팅된다. 이 실시형태에서, 패턴화된 표면은 연속 소수성 코팅층을 갖는 표면을 포함하는 고체 지지체에 의해 시작함으로써 생성될 수 있다. 이후, 포토레지스트의 층은 고체 지지체의 소수성 코팅층 상에 증착되어서 소수성 코팅층을 커버할 수 있다. 이후, 포토레지스트 층은 복수의 마이크로-스케일 및/또는 나노-스케일 패턴을 포함하는 포토마스크를 사용하여 포토리쏘그래피에 의해 패턴화될 수 있어서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 패턴은 표면으로 전사되어서 소수성 코팅층 상에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성한다. 이후, 겔 재료의 층은 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽 내에 증착될 수 있고, 겔 재료는 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합할 수 있다.
포토리쏘그래피 동안, 포토레지스트는 패턴화된 포토마스크를 사용함으로써 광(예를 들어, UV 광)의 패턴에 노출된다. 광에 대한 노출은 현상제 용액에 의해 제거되도록 노출된 포토레지스트의 일부가 밑에 있는 소수성 코팅층의 패치를 노출시키게 하는 화학 변경을 발생시킨다. (예를 들어, 공정에 사용된 특정한 포토레지스트 생성물에 대한 표준 레시피를 따름으로써) 포토레지스트가 현상된 후, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 표면 상의 노출된 소수성 코팅층의 일부를 에칭함으로써 형성된다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 소수성 코팅층을 포함하는 소수성 개재성 영역에 의해 서로 분리된다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽의 적어도 일부는 소수성 코팅이 없다. 몇몇 실시형태에서, 윤곽은 함몰부, 예컨대 채널 또는 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 윤곽은 돌출부, 예컨대 리지(ridge), 포스트 또는 콘(예를 들어, 나노포스트 또는 나노콘)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법의 몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 불화 중합체, 과불화 중합체 또는 실리콘 중합체, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 중합체 골격은 탄소 또는 실리콘, 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 불화 중합체는 예를 들어 비결정질 플루오로중합체(임의로 펜던트 작용기, 예컨대 카복실, 실릴화 아마이드 또는 트라이플루오로메틸 말단을 갖는 임의로 2,3-연결된 과불화 THF 단량체, 예를 들어 CYTOP-M, CYTOP-S, CYTOP-A, 도 1 참조), 폴리테트라플루오로에틸렌(예컨대, 테플론(Teflon)), 파릴렌(예를 들어, 등급 A, F, HT), 불화 탄화수소, 플루오로아크릴릭 공중합체(예컨대, 사이토닉스 플루오로펠(Cytonix Fluoropel)), 플루오로실란, 또는 플라즈마 증착된 플루오로카본이다. 몇몇 실시형태에서, 실리콘 중합체는 폴리다이메틸실록산 또는 실록산이다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 과불화 중합체를 포함한다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 과불화 중합체는 CYTOP-M, CYTOP-S 또는 CYTOP-A로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 과불화 중합체는 CYTOP-S이거나 이를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 과불화 중합체는 CYTOP-M을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 과불화 중합체는 CYTOP-S 및 CYTOP-A의 혼합물이다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 표면과 직접 접촉한다. 직접 접촉은 공유 또는 비공유 결합을 통해서일 수 있다. 몇몇 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 제1 접착 촉진 층을 통해 표면과 접촉한다. 일 예에서, 제1 접착 촉진 층은 작용기화된 실란 또는 접착 촉진자를 포함하고; 예시적인 제1 접착 층은 CYTOP-A, (3-아미노프로필)트라이메톡시실란(APTMS) 또는 (3-아미노프로필)트라이에틸옥시실란(APTES), 또는 이들의 조합을 포함한다.
포토리쏘그래피를 위해 소수성 코팅층 상에 포토레지스트를 배치하는 것은 대개 소수성 코팅층과 이것 위에 증착되는 포토레지스트 층 사이에 표면 에너지에서 약간의 일치 정도를 요한다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 산소 플라즈마 처리를 사용하여 포토레지스트 분야를 위해 제조된다. 몇몇 경우에, 산소 플라즈마 처리(예컨대, 디스큠 처리)는 소수성 코팅층의 화학 구조를 손상시킬 수 있다. 본 방법은 2개의 대안적인 공정을 제공함으로써 포토레지스트를 배치하기 전에 표면의 전처리의 필요를 제거하거나 감소시킨다.
일 대안에서, 포토레지스트는 산소 플라즈마 전처리 없이 소수성 코팅층과 직접적으로 접촉하도록 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 포토레지스트는 포지티브 포토레지스트이다. 다른 실시형태에서, 포토레지스트는 네가티브 포토레지스트이다. 몇몇 실시형태에서, 포토레지스트는 Shipley S1800(상표명) 시리즈 포토레지스트, 예를 들어 Shipley S1818(MICROPOSIT(상표명) S1818(상표명)) 및 Shipley S1805(MICROPOSIT(상표명) S1805(등록상표))로부터 선택된다.
또 다른 대안에서, 접착 촉진 층은 소수성 코팅층과 포토레지스트 층 사이에 표면 에너지 미스매치를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접착 촉진 층은 불화 계면활성제를 포함한다. 몇몇 이러한 실시형태에서, 불화 계면활성제는 Surflon S-651, Novec FC-4430, Novec FC-4432, Novec FC-4434, Novec FC-5210, Zonyl FSN-100, Zonyl FS-300, Zonyl FS-500, Capstone FS-10, Capstone FS-30, Capstone FS-60, Capstone FS-61, Capstone FS-63, Capstone FS-64 또는 Capstone FS-65, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 불화 계면활성제는 Surflon S-651을 포함한다.
직접 겔 패터닝
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 직접 겔 패터닝 방법에 의해 분석 분야를 위해 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이다. 직접 겔 패터닝 방법에서, 표면을 갖는 고체 지지체는 연속 소수성 코팅층이 제공된다. 포토레지스트는 소수성 코팅층에 배치된다. 이후, 포토레지스트 층은 복수의 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 패턴을 포함하는 포토마스크를 사용하여 포토리쏘그래피에 의해 패턴화되어서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 패턴은 표면에 전사되어서, 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 표면에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성한다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 소수성 코팅층의 부분을 에칭함으로써 형성되고, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 소수성 코팅층을 포함하는 소수성 개재성 영역에 의해 서로 분리된다. 이후, 포토레지스트는 제거되고, 실란의 층은 표면에 도포되어 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버한다. 이후, 겔은 표면에 첨가된다. 핵산은 표면에 대한 겔의 부착 전에, 후에 또는 동안에 겔에 부착될 수 있다. 이 방법은 직접 패터닝 방법으로서 또한 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 직접 패터닝 방법에서, 광에 노출되지 않은 남은 포토레지스트는 임의의 화학 변화를 겪을 필요가 없고, 현상 공정 후 소수성 개재성 영역에 남을 수 있다. 남은 포토레지스트는 사용된 포토레지스트의 유형에 따라 다양한 시약에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 포토레지스트 리프트-오프 레지스트(lift-off resist: LOR)는 MICROCHEM Remover PG에 의해 제거될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 남은 포토레지스트는 아세톤에 의해, 예를 들어 아세톤 용액 중의 음파처리에 의해 제거된다. 제2 접착 촉진 층은 포토레지스트에 의해 동시에 제거될 수 있다. 대안적으로, 제2 접착 촉진 층은 상이한 제거 시약을 사용하여 포토레지스트에 후속하여 제거된다. 소수성 개재성 영역을 커버하는 남은 포토레지스트의 제거 후, 노출된 소수성 코팅층은 후속하는 실란 증착으로 처리될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 겔 재료는 실란의 층에 공유 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 겔 재료를 경화시키는 단계를 추가로 포함한다. 경화 공정은, 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 것처럼, 사용된 겔 재료의 유형에 따라 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 경화는 오븐 내에 실란층에 증착된 겔 재료를 항온처리함으로써 수행된다. 몇몇 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 소수성 개재성 영역이 실질적으로 겔 재료를 포함하지 않도록 과량의 겔 재료를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료의 제거는 물 중에 세정함으로써 단순하게 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 또한 겔 재료의 증착 후 화학적 또는 기계적 연마의 필요를 제거한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)을 겔 재료에 공유 부착시키는 단계를 추가로 포함한다.
리프트- 오프 겔 패터닝
본 명세서에 기재된 몇몇 추가의 실시형태는 리프트-오프 겔 패턴화 방법에 의해 패턴화된 표면을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 연속 소수성 코팅층을 갖는 고체 지지체를 사용하는 단계 및 소수성 코팅층 상에 포토레지스트 층을 배치하는 단계를 포함할 수 있다. 이후, 포토레지스트는 복수의 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 패턴을 포함하는 포토마스크를 사용하여 포토리쏘그래피에 의해 패턴화될 수 있어서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 패턴은 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 표면 상에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성하도록 표면에 전사된다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 소수성 코팅층의 일부를 에칭함으로써 형성된다. 이후, 실란의 층은 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버하도록 표면에 도포될 수 있고, 겔 재료는 실란의 층에 공유 부착될 수 있다. 이들 방법은 또한 리프트-오프 방법으로 공지되어 있다.
기재된 리프트-오프 방법에서, 직접적인 패터닝 공정에 기재된 것과 같은 패턴 전사 후 바로 포토레지스트를 제거하기보다는, 상기 방법은 실란의 층을 표면에 직접적으로 도포할 수 있어서, 포토레지스트의 존재 하에 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버한다. 이후, 겔 재료는 실란의 층에 공유 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 겔 재료를 경화시키는 단계를 추가로 포함한다. 경화 공정은, 당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 사용된 겔 재료의 유형에 따라 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 경화는 오븐에서 실란층 상에 증착된 겔 재료를 항온처리함으로써 수행된다.
겔 재료를 실란층에 부동화한 후, 이후 개재성 영역에서 남은 포토레지스트는 제거 또는 "리프트-오프"될 수 있어서, 밑에 있는 소수성 코팅층을 노출시킨다. 남은 포토레지스트를 사용된 포토레지스트의 유형에 따라 다양한 시약에 의해 제거할 수 있다. 예를 들어, 포토레지스트 LOR은 MICROCHEM Remover PG에 의해 제거될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 남은 포토레지스트는 아세톤, 예를 들어 아세톤 용액 중의 음파처리에 의해 제거된다. 제2 접착 촉진 층은 동시에 포토레지스트에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 제2 접착 촉진 층은 상이한 제거 시약을 사용하여 포토레지스트에 후속하여 제거된다. 일 실시형태에서, 포토레지스트 및 제2 접착 촉진 층은 둘 다 아세톤에 의해 제거된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 실란층에 부동화되지 않은 과량의 겔 재료를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)을 겔 재료에 공유 부착하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물(예를 들어, 표면 제조, 직접적인 패터닝 및 리프트-오프 방법)에서, 본 명세서에 사용된 실란은 겔 재료와 공유 결합을 형성하기 위한 작용기를 포함할 수 있다. 실란 내의 작용기의 비제한적인 예는 비닐, 아크릴로일, 알케닐, 사이클로알케닐, 헤테로사이클로알케닐, 알키닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클로알키닐, 니트렌, 알데하이드, 하이드라지닐, 글라이시딜 에터, 에폭시, 카르벤, 아이소사이아네이트 또는 말레이미드, 또는 임의로 치환된 변형 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 실란은 아미노기(예컨대, APTES 또는 APTMS)를 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 실란은 노르보르넨 유도체화 실란을 포함한다. 일 실시형태에서, 실란은 [(5-바이사이클로[2.2.1]헵트-2-엔일)에틸]트라이메톡시실란을 포함한다. 실란은 화학 증기 증착을 통해 고체 지지체의 표면 상에 증착될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물(예를 들어, 표면 제조, 직접적인 패터닝 및 리프트-오프 방법)에서, 사용될 수 있는 겔 재료는 하이드로겔 또는 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유용한 하이드로겔은 실란 비함유 아크릴아마이드(SFA) 중합체, 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)(PAZAM), 예를 들어 WO 제00/31148호(본 명세서에서 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 아크릴아마이드 및 아크릴산 또는 비닐기를 함유하는 아크릴산으로부터 형성된 폴리아크릴아마이드 중합체; WO 제01/01143호 또는 WO 제03/014392호(각각은 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 [2+2] 광-중부가 반응을 형성하는 단량체로부터 형성된 폴리아크릴아마이드 중합체; 또는 미국 특허 제6,465,178호, WO 제01/62982호 또는 WO 제00/53812호(각각은 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 기재된 폴리아크릴아마이드 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 겔 재료의 화학적으로 처리된 변형, 예컨대 상응하는 반응성 기를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 반응할 수 있는 반응성 자리를 갖는 하이드로겔이 또한 유용하다(예를 들어, PAZAM은 5'- 또는 3'-알키닐 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응할 수 있음). 다른 유용한 겔은 액체로부터 젤라틴성의 상태로 온도 의존적 변경에 의해 형성된 것이다. 예는 한천, 아가로스 또는 젤라틴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료는 실란층에 공유 부착된다.
몇몇 실시형태에서, 사용되는 겔 재료는 반응성 부위를 포함할 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "반응성 부위"는 화학 반응 또는 분자 상호작용에 의해 하나 이상의 분자를 겔 재료에 부착시키고/시키거나, 겔 재료를 표면에 부착시키기 위해 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 겔에서의 부위를 의미한다. 반응성 부위의 비제한적인 예는 아지도, 임의로 치환된 아미노, Boc-보호된 아미노, 하이드록시, 티올, 알키닐, 알케닐, 할로, 에폭시, 테트라지닐 또는 알데하이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료는 반응성 부위로서 아지도 작용기를 갖는 중합체를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 겔 재료는 PAZAM을 포함한다. PAZAM은 촉매 비함유 스트레인 촉진된 중부가를 통해 공유 결합을 형성하기 위해 노르보르넨 유도체화된 실란과 반응할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료의 반응성 부위는 프라이머 그래프팅의 목적을 위해 또한 작용기화된 올리고 뉴클레오타이드와 공유 결합을 형성할 수 있다. 몇몇 대안적인 실시형태에서, 겔 재료는 실란층과 반응하기 전에 프라이머에 의해 예비-그래프팅된다.
몇몇 다른 실시형태에서, 겔 형성(예를 들어, 중합 가능한) 재료는 액체 상태로 표면에 제공되고, 후속하여 겔로 전환될 수 있다. 중합 가능한 재료의 예는, 제한 없이, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, N-비닐 피롤리디논, 또는 이의 유도체를 포함한다. 이러한 재료는 하이드로겔을 제조하기에 유용하다. 몇몇 실시형태에서, 중합 가능한 재료는 공중합체를 형성하는 화합물의 2개 이상의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, N-비닐 피롤리디논, 또는 이의 유도체의 2개 이상의 상이한 종은 공중합체 하이드로겔을 형성하도록 중합하는 공단량체로서 작용할 수 있다.
패턴화된 표면 및 고체 지지체
연속 소수성 코팅층을 포함하는 표면;
고체 지지체의 소수성 코팅층 상의 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 포함하는 포토레지스트 층; 및
마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽 내의 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합할 수 있는 겔 재료의 층
을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 겔 코팅된 윤곽을 갖는 패턴화된 표면이 본 명세서에 기재된다.
몇몇 실시형태에서, 윤곽은 소수성 개재성 영역에 의해 분리되고, 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버하는 결합 재료의 층(예컨대, 실란의 층)을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽의 적어도 일부는 소수성 코팅이 없다. 몇몇 실시형태에서, 윤곽은 웰을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 표면은 소수성 코팅층, 고체 지지체의 소수성 코팅층 상의 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 포함하는 포토레지스트 층; 윤곽의 적어도 일부 및 소수성 개재성 영역의 적어도 일부를 커버하는 결합 재료 또는 실란의 층을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 불화 중합체, 과불화 중합체 또는 실리콘 중합체, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 비결정질 플루오로중합체, CYTOP-M, CYTOP-S, CYTOP-A, 폴리테트라플루오로에틸렌, 테플론, 파릴렌, 불화 탄화수소, 플루오로아크릴릭 공중합체, 사이토닉스 플루오로펠, 플루오로실란, 플라즈마 증착된 플루오로카본, 실리콘 중합체, 폴리다이메틸실록산 또는 실록산, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 과불화 중합체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 CYTOP-M, CYTOP-S 또는 CYTOP-A, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 CYTOP-S를 포함한다. 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 CYTOP-M을 포함한다. 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 CYTOP-S 및 CYTOP-A를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 소수성 코팅층은 표면과 직접 접촉한다. 다른 실시형태에서, 소수성 코팅층은 제1 접착 촉진 층을 통해 표면과 접촉한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 접착 촉진 층은 CYTOP-A, APTMS 또는 APTES, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 포토레지스트는 고체 지지체의 소수성 코팅층과 직접 접촉한다. 다른 실시형태에서, 포토레지스트는 제2 접착 촉진 층을 통해 고체 지지체의 소수성 코팅층과 접촉한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 접착 촉진 층은 불화 계면활성제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 불화 계면활성제는 Surflon S-651, Novec FC-4430, Novec FC-4432, Novec FC-4434, Novec FC-5210, Zonyl FSN-100, Zonyl FS-300, Zonyl FS-500, Capstone FS-10, Capstone FS-30, Capstone FS-60, Capstone FS-61, Capstone FS-63, Capstone FS-64 또는 Capstone FS-65, 또는 이들의 조합이다.
몇몇 실시형태에서, 포토레지스트는 Shipley S1800(상표명) 시리즈 포토레지스트이다. 몇몇 실시형태에서, 포토레지스트는 Shipley S1818(MICROPOSIT(상표명) S1818(상표명)) 및 Shipley S1805(MICROPOSIT(상표명) S1805(등록상표))로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 겔 재료는 PAZAM을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료는 핵산에 부착된 PAZAM을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 표면은 (a) 결합 재료 층 또는 (b) 실란층을 추가로 포함하고, 결합 재료 층 또는 실란층은 임의로 노르보르넨 유도체화 실란을 포함하고, 결합 재료 층 또는 실란층은 적어도 윤곽의 일부 및 소수성 개재성 영역의 일부를 커버한다.
이러한 패턴화된 표면을 제조하는 방법이 본 명세서에 또한 기재된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는", 및 다른 형태, 예컨대 "포함한다", "포함하고" 및 "포함된"의 사용은 제한이 아니다. 용어 "갖는", 및 다른 형태, 예컨대 "갖는다", "갖고" 및 "가졌다"의 사용은 제한이 아니다. 본 명세서에 사용된 바대로, 이행 구절이든 또는 청구항의 실체이든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방 말단 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 예를 들어 공정의 맥락에서 사용될 때 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"의 구절과 동의어로 해석되어야 하고, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계를 포함하지만, 추가적인 단계를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 화합물, 조성물, 또는 장치의 맥락에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물, 또는 장치가 적어도 언급된 특징부 또는 성분을 포함하지만, 또한 추가적인 특징부 또는 성분을 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 흔한 약어는 하기 정의되어 있다:
APTS: 아미노프로필 실란
APTES: (3-아미노프로필)트라이에톡시실란
APTMS: (3-아미노프로필)트라이메톡시실란
aq.: 수성
Azapa: N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아마이드
℃: 섭씨 온도
CA: 접촉 각
CVD: 화학 증기 증착
dATP: 데옥시아데노신 트라이포스페이트
dCTP: 데옥시사이티딘 트라이포스페이트
dGTP: 데옥시구아노신 트라이포스페이트
dTTP: 데옥시타이미딘 트라이포스페이트
g: 그램(들)
h 또는 hr: 시간(들)
IPA: 아이소프로필 알코올
m 또는 min: 분(들)
㎖: 밀리리터(들)
PAZAM: 임의의 아크릴아마이드 대 Azapa 비율의 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)
rt: 실온
SFA: 미국 특허 공보 제2011/0059865호에 정의된 바와 같은 실란 유리 아크릴아마이드
SBS: 합성에 의한 서열분석
SHP: 반소수성
ssDNA: 단일 가닥 DNA
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "부착된"은 서로에 접합된, 패스팅된, 부착된, 연결된 또는 결합된 2개의 것의 상태를 의미한다. 예를 들어, 분석물질, 예컨대 핵산은 공유 또는 비공유 결합에 의해 재료, 예컨대 겔 또는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자 사이에 한 쌍의 전자를 공유하는 것을 특징으로 한다. 비공유 결합은 한 쌍의 전자의 공유를 수반하지 않는 화학 결합이지만, 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "어레이"는 상이한 프로브가 상대 위치에 따라 서로로부터 구별될 수 있도록 하나 이상의 기판에 부착된 상이한 프로브의 집단(예를 들어, 프로브 분자)을 의미한다. 어레이는 기판에 상이한 어드레스 가능한 위치에서 각각 위치한 상이한 프로브를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이는 상이한 프로브를 각각 보유하는 별개의 기판을 포함할 수 있고, 상이한 프로브는 기판이 부착된 표면 상의 기판의 위치에 따라 또는 액체 중의 기판의 위치에 따라 확인될 수 있다. 별개의 기판이 표면 상에 위치한 예시적인 어레이는, 제한 없이, 예를 들어 미국 특허 제6,355,431호 B1, US 제2002/0102578호 및 PCT 공보 WO 제00/63437호에 기재된 웰 내의 비드를 포함하는 것을 포함한다. 예를 들어, 마이크로유체공학 장치, 예컨대 형광성 활성화 세포 분류기(FACS)를 사용하여 액체 어레이에서 비드를 구별하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 포맷은 예를 들어 미국 특허 제6,524,793호에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 어레이의 추가의 예는, 제한 없이, 미국 특허 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; WO 제93/17126호; WO 제95/11995호; WO 제95/35505호; EP 제742 287호; 및 EP 제799 897호에 기재된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자 사이의 한 쌍의 전자를 공유하는 것을 특징으로 하는 화학 결합을 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 공유 부착된 하이드로겔은 다른 수단, 예를 들어 접착 또는 정전기 상호작용을 통한 표면에 대하 부착과 비교하여 기판의 기능화된 표면에 의해 화학 결합을 형성하는 하이드로겔을 의미한다. 표면에 공유 부착된 중합체가 공유 부착 이외의 수단을 통해 또한 결합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 동사로서 사용될 때 용어 "코팅한다"는 표면 상의 층 또는 커버링의 제공을 의미하는 것으로 의도된다. 표면의 적어도 일부는 층 또는 커버가 제공될 수 있다. 몇몇 경우에, 전체 표면은 층 또는 커버가 제공될 수 있다. 대안적인 경우에, 표면의 오직 일부는 층 또는 커버링이 제공될 것이다. 표면과 재료 사이의 관계를 기술하기 위해 사용될 때 용어 "코팅한다"는 재료가 표면 상에 층 또는 커버로서 존재한다는 것을 의미하도록 의도된다. 재료는 표면을 실링할 수 있어서, 예를 들어 액체 또는 가스와 표면의 접촉을 방지한다. 그러나, 재료는 시일을 형성할 필요가 없다. 예를 들어, 재료는 액체, 가스, 또는 액체 또는 가스에 보유된 하나 이상의 성분에 다공성일 수 있다. 표면을 코팅할 수 있는 예시적인 재료는 겔, 중합체, 유기 중합체, 액체, 금속, 제2 표면, 플라스틱, 실리카 또는 가스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "분석물질"은 검출, 규명, 변형, 합성, 또는 기타가 되는 임의의 다양한 분석물질을 포함하도록 의도된다. 예시적인 분석물질은 핵산(예를 들어, DNA, RNA 또는 이의 유사체), 단백질, 다당류, 세포, 핵, 세포 소기관, 항체, 에피토프, 수용체, 리간드, 효소(예를 들어, 키나제, 포스파타제 또는 중합효소), 펩타이드, 소분자 약물 후보 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 어레이는 분석물질의 라이브러리로부터 다수의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종은 항체 라이브러리로부터의 상이한 항체, 핵산의 라이브러리로부터 상이한 서열을 갖는 핵산, 단백질의 라이브러리로부터의 상이한 구조 및/또는 기능을 갖는 단백질, 소분자의 조합 라이브러리로부터의 약물 후보 등일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "윤곽"은 표면의 형상의 국재화된 변형을 의미하도록 의도된다. 예시적인 윤곽은 웰, 피츠, 채널, 포스트, 필러 및 리지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 윤곽은 표면에서의 임의의 다양한 함몰부 또는 표면으로부터의 돌출부에서 발생할 수 있다. 윤곽의 전부 또는 일부는 어레이에서 특징부로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체의 특정한 면에서 생긴 윤곽의 일부는 그 특정한 면에서 특징부로서 작용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 윤곽은 표면 상의 규칙적인 또는 반복 패턴으로 제공된다.
재료가 "내에" 윤곽 "내에" 있을 때, 이것은 윤곽의 공간에 위치한다. 예를 들어, 웰에 대해, 재료는 웰 내부에 있고, 필러 또는 포스트에 대해, 재료는 표면의 면 위로 연장하는 윤곽을 커버한다.
몇몇 실시형태에서, 제2 층이 제1 층을 "커버한다"고 말해지는 경우, 제2 층은 제1 층의 상부 위의 얇은 필름의 형태이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "상이한"이, 핵산과 관련하여 사용될 때, 핵산이 서로와 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 2개 이상의 핵산은 이의 전체 길이를 따라 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 핵산은 이의 길이의 실질적인 부분을 따라 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 핵산은, 2개 이상의 분자 상에 동일한 보편적 서열 부분을 또한 가지면서, 2개 이상의 분자에 대해 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열 부분을 가질 수 있다. 상기 용어는 아미노산 서열 차이에 기초하여 서로로부터 상이한 것으로 구별 가능한 단백질에 유사하게 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "각각"은, 항목의 수집과 관련하여 사용될 때, 수집에서 개별 항목을 확인하도록 의도되지만, 수집에서 모든 항목을 반드시 의미하지는 않는다. 명쾌한 개시내용 또는 문맥이 명확히 달리 나타내지 않는 경우, 예외가 발생할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "특징부"는 특정한 분석물질에 부착하도록 구성된 어레이에서의 위치를 의미한다. 예를 들어, 특징부는 표면 상의 윤곽의 전부 또는 일부일 수 있다. 특징부는 오직 단일 분석물질을 함유할 수 있거나, 이것은 몇몇 분석물질의 집단을 함유할 수 있고, 임의로 몇몇 분석물질은 동일한 종일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 특징부는 분석물질을 부착시키기 전에 고체 지지체에 존재한다. 다른 실시형태에서, 특징부는 고체 지지체에 대한 분석물질의 부착에 의해 생성된다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "흐름 셀"은 반응이 수행될 수 있는 챔버, 시약을 챔버에 전달하기 위한 입구 및 챔버로부터 시약을 제거하기 위한 출구를 갖는 용기를 의미하도록 의도된다. 몇몇 실시형태에서, 챔버는 챔버에서(예를 들어, 챔버와 유체 접촉하는 표면 상에) 발생하는 반응의 검출을 위해 구성된다. 예를 들어, 챔버는 챔버에서의 어레이의 광학 검출을 허용하는 하나 이상의 투명한 표면, 광학적으로 표지된 분자 등을 포함할 수 있다. 예시적인 흐름 셀은 핵산 서열분석 장치에서 사용된 것, 예컨대 Illumina, Inc.(캘리포니아주 샌 디에고)에 의해 상업화된 게놈 Analyzer(등록상표), MiSeq(등록상표), NextSeq(등록상표) 또는 HiSeq(등록상표) 플랫폼; 또는 Life Technologies(캘리포니아주 칼스바드)에 의해 상업화된 SOLiD(상표명) 또는 Ion Torrent(상표명) 서열분석 플랫폼에 대한 흐름 셀을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이의 제조 및 사용을 위한 예시적인 흐름 셀 및 방법은 또한 예를 들어 WO 제2014/142841호 A1; 미국 특허 출원 공보 제2010/0111768호 A1 및 미국 특허 제8,951,781호(각각 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "겔 재료"는 액체 및 가스에 투과성인 반경질 재료를 의미하도록 의도된다. 통상적으로, 겔 재료는 액체가 흡수될 때 팽윤될 수 있고, 액체가 예를 들어 건조에 의해 제거될 때 접촉할 수 있다. 예시적인 겔은 콜로이드 구조, 예컨대 아가로스; 중합체 메쉬 구조, 예컨대 젤라틴; 또는 가교 결합된 중합체 구조를 갖는 것, 예컨대 폴리아크릴아마이드, 실란 유리 아크릴아마이드(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2011/0059865호 A1 참조), PAZAM(예를 들어, 미국 특허 제9,012,022호(본 명세서에 참고로 포함됨) 참조), 및 미국 특허 공보 제2015/0005447호 및 미국 출원 제14/927,252호(이들 모두 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특히 유용한 겔 재료는 이것이 있는 웰 또는 다른 윤곽의 형상에 정합할 것이다. 몇몇 유용한 겔 재료는 (a) 이것이 있는 웰 또는 다른 윤곽의 형상에 정합하면서, (b) 이것이 있는 웰 또는 윤곽의 용적을 실질적으로 초과하지 않는 용적을 가질 수 있다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 겔 재료는 중합체 하이드로겔이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "개재성 영역"은 기판 또는 표면의 다른 영역을 분리시키는 기판에서의 또는 표면 상의 영역을 의미한다. 예를 들어, 개재성 영역은 표면 상의 또 다른 윤곽 또는 특징부로부터 하나의 윤곽 또는 특징부를 분리할 수 있다. 서로 분리된 2개의 영역은 서로와의 접촉이 결여되어 별개일 수 있다. 많은 실시형태에서, 개재성 영역은 연속인 반면, 윤곽 또는 특징부는, 예를 들어, 달리 연속 표면에서의 웰의 어레이에 대한 경우처럼, 별개이다. 개재성 영역에 의해 제공된 분리는 부분 또는 완전 분리일 수 있다. 개재성 영역은 통상적으로 표면 상의 윤곽 또는 특징부의 표면 재료로부터 다른 표면 재료를 가질 것이다. 예를 들어, 어레이의 윤곽은 개재성 영역에 존재하는 양 또는 농도를 초과하는 겔 재료 또는 분석물질의 양 또는 농도를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 겔 재료 또는 분석물질은 개재성 영역에 존재하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 당해 분야에서 이의 사용과 일치하고, 천연 발생 종 또는 이의 기능성 유사체를 포함하도록 의도된다. 핵산의 특히 유용한 기능성 유사체는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화할 수 있거나, 특정한 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 포스포다이에스터 결합을 함유하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 당해 분야에 공지된 임의의 다양한 것을 포함하는 교대하는 골격 연결을 가질 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견) 또는 리보스 당(예를 들어, 리보핵산(RNA)에서 발견)을 갖는다. 핵산은 당해 분야에 공지된 이 당 모이어티의 임의의 다양한 유사체를 갖는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 핵산은 네이티브 또는 비네이티브 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 네이티브 데옥시리보핵산은 아데닌, 타이민, 사이토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있고, 리보핵산은 유라실, 아데닌, 사이토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 유용한 비네이티브 염기는 당해 분야에 공지되어 있다. 용어 "프로브" 또는 "표적"은, 핵산과 관련하여 사용될 때, 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물의 맥락에서 핵산에 대한 의미론적 식별자로서 의도되고, 달리 명확하게 표시된 것 뒤로 핵산의 구조 또는 기능을 반드시 제한하지는 않는다. 용어 "프로브" 및 "표적"은 다른 분석물질, 예컨대 단백질, 소분자, 세포 등에 유사하게 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "불화"는 적어도 하나의 불소 원자를 함유하는 분자를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "과불화"는 2개 이상의 불소 원자를 함유하는 분자를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 과불화 분자는 sp3 혼성화된 탄소 상의 수소 원자가 불소 원자에 의해 대체된 탄화수소 함유 분자이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 소정의 과불화 중합체는 퍼플루오로알킬기 또는 퍼플루오로알킬렌 모이어티를 함유한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "포토레지스트" 및 이의 유도체는 표면 상에 패턴화된 코팅을 형성하기 위해 포토리쏘그래피, 포토에칭 또는 사진제판과 같은 공정에서 사용된 광 민감성 재료를 의미한다. 포토레지스트 재료는 광의 소정의 파장에 노출될 때 현상제 용액과 관련하여 용해도를 변경시킨다. 포토레지스트 층은 포지티브(노출된 영역은 가용성이 됨) 또는 네가티브(노출된 영역은 불용성이 됨) 포토레지스트 재료로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "피치"는, 표면 상의 윤곽 또는 특징부와 관련하여 사용될 때, 인접한 특징부에 대한 중앙-대-중앙 스페이싱을 의미하도록 의도된다. 특징부의 패턴은 평균 피치의 면에서 규명될 수 있다. 패턴은 평균 피치 주위의 변동 계수가 작도록 순서화될 수 있거나, 패턴은 랜덤일 수 있고, 이 경우에 변동 계수는 비교적 클 수 있다. 어느 한 경우에, 평균 피치는 예를 들어 적어도 약 10㎚, 0.1㎛, 0.2㎛, 0.3㎛, 0.4㎛, 0.5㎛, 1㎛, 5㎛, 10㎛, 100㎛ 또는 이것 초과, 또는 임의의 2개의 이전의 값(예를 들어, 10 내지 100㎚, 10 내지 200㎚, 200 내지 400㎚, 300 내지 500㎚)에 의해 한정된 범위일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 평균 피치는 예를 들어 기껏해야 약 100㎛, 10㎛, 5㎛, 1㎛, 0.5㎛, 0.1㎛ 또는 이것 미만, 또는 임의의 2개의 이전의 값에 의해 한정된 범위일 수 있다. 물론, 특징부의 특정한 패턴에 대한 평균 피치는 상기 범위로부터 선택된 하부 값의 하나와 상부 값의 하나 사이일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "반복 패턴"은, 특징부와 관련하여 사용될 때, 물체의 하나의 영역에서의 특징부 또는 윤곽의 하위집단의 상대 위치가 물체의 적어도 하나의 다른 영역에서의 특징부 또는 윤곽의 하위집단의 상대 위치와 동일하다는 것을 의미하도록 의도된다. 일반적으로, x 및 y 치수에서 반복이 발생한다. 하나의 영역은 통상적으로 패턴에서 그 다른 영역과 인접하다. 반복 패턴의 하나의 영역에서의 특징부에 대한 상대 위치는 일반적으로 반복 패턴의 또 다른 영역에서의 윤곽의 상대 위치로부터 예측 가능하다. 측정에 사용된 하위집단은 일반적으로 적어도 2개의 특징부를 포함할 것이지만, 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 10개 또는 이것 초과의 특징부를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 측정에 사용된 하위집단은 2개 초과, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 10개의 특징부를 포함할 수 있다. 예시적인 반복 패턴은 정사각형 격자, 직사각형 격자, 사방정계 격자, 육각형 격자 및 비스듬한 격자를 포함한다. 반복 패턴은 하위패턴의 다수의 반복을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "분리시킨다"는, 2개의 윤곽 상의(또는 2개의 별개의 특징부에서) 겔 재료와 관련하여 사용될 때, 다른 윤곽에서(또는 다른 특징부에서) 겔 재료로부터 윤곽의 하나에서(또는 특징부의 하나에서) 겔 재료를 분리시키거나 격리시키는 것을 의미한다. 따라서, 제1 윤곽에서의(또는 제1 특징부에서의) 겔 재료는 다른 웰에서(또는 다른 특징부에서) 겔 재료와 직접 접촉하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 용어 "분리시킨다"는 2개의 웰에서의 겔 재료와 관련하여 사용되고, 다른 웰에서 겔 재료로부터 웰의 하나에서 겔 재료를 분리하거나 격리시키는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 웰에서(또는 2개의 특징부에서) 겔 재료는 예를 들어 2개의 웰(또는 특징부)을 접촉시키는 용액을 통해 간접 접촉한다. 대안적으로, 2개의 웰에서(또는 2개의 특징부에서) 겔 재료는 심지어 간접 접촉이 아니다. 표면 상의 개재성 영역은 겔 재료가 없음으로써 2개의 웰에서(또는 2개의 특징부에서) 겔 재료를 분리시킬 수 있다. 특정한 실시형태에서, 겔 재료는 특징부에서, 예컨대 웰에서 존재하지만, 특징부 사이의 개재성 영역에 존재하지 않는 표면 상에 불연속일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "표면"은 고체 지지체 또는 겔 재료의 외부 부분 또는 외부 층을 의미하도록 의도된다. 표면은 또 다른 재료, 예컨대 가스, 액체, 겔, 중합체, 유기 중합체, 유사한 또는 상이한 재료의 제2 표면, 금속, 또는 코트와 접촉할 수 있다. 표면, 또는 이의 영역은 실질적으로 평평하거나 평면일 수 있다. 표면은 표면 윤곽 예컨대 웰, 피치, 채널, 리지, 융기된 영역, 페그(peg), 포스트 등을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "고체 지지체"는 수성 액체 중에 불용성인 경질 기판을 의미한다. 기판은 비다공성 또는 다공성일 수 있다. 기판은 임의로 (예를 들어, 다공성으로 인해) 액체를 흡수할 수 있지만, 기판이 액체를 흡수할 때 실질적으로 팽윤하지 않고 액체가 건조에 의해 제거될 때 실질적으로 접촉하지 않도록 통상적으로 충분히 경질일 것이다. 비다공성 고체 지지체는 일반적으로 액체 또는 가스에 불투과성이다. 예시적인 고체 지지체는 유리 및 변형된 또는 작용기화 유리, 플라스틱(예를 들어, 아크릴릭, 폴리스타이렌 및 스타이렌의 공중합체 및 다른 재료, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리뷰틸렌, 폴리우레판, 테플론(상표명), 사이클릭 올레핀, 폴리이미드 등), 나일론, 세라믹, 수지, Zeonor, 실리카 또는 실리카계 재료, 예를 들어 실리콘 및 변형된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 광학 섬유 다발 및 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에 특히 유용한 고체 지지체는 흐름 셀의 성분이거나 흐름 셀 장치 내에 위치한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "웰"은 표면의 개재성 영역(들)에 의해 완전히 둘러싸인 표면 개구를 갖는 고체 지지체에서의 별개의 윤곽을 의미한다. 웰은 원형, 타원형, 정사가형, 다각형, (임의의 수의 교차점을 갖는) 별 형상 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 표면에서 이의 개구에서 임의의 다양한 형상을 가질 수 있다. 표면에 의해 직각으로 취해진 웰의 단면은 곡선화, 정사각형, 다각형, 쌍곡선, 원뿔, 각모양 등일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 웰은 마이크로웰 또는 나노웰이다.
본 명세서에 기재되고 청구항에 기재된 실시형태는 상기 정의의 관점에서 이해될 수 있다.
도 1은 기판의 패턴화된 표면의 소수성 개재성 영역을 생성하기 위해 사용될 수 있는 플루오로중합체의 3개의 유형을 도시한다. CYTOP-A, CYTOP-M 및 CYTOP-S는 각각 하기 골격 구조 및 중합체 사슬의 양 말단에서 상이한 작용기를 갖는 상업적으로 구입 가능한 비결정질 과불화 중합체이다:
Figure 112018126871974-pct00001
. CYTOP-A는 -C(O)OH 말단 작용기를 갖는다. CYTOP-M은 -C(O)NH-Si(OR)n 작용기를 갖는다. CYTOP-S는 -CF3 작용기를 갖는다. 도 1은 또한 표면과 CYTOP 중합체의 각각의 유형 사이의 가능한 상호작용의 유형을 보여준다. 이것은 CYTOP-S가 -CF3 작용기의 불활성(inertness)으로 인해 금속 표면, 실란 마감 표면 또는 Si/SiN 표면과 화학 상호작용을 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
도 2a는 유리 기판(10)의 패턴화된 표면의 다이어그램식 단면 부분 도면이다. 도시된 바대로, 유리 기판(10)은 상부 표면(15) 및 하부 표면(20)을 갖는다 상부 표면(15)은 상부 표면(15)에서 형성된 복수의 웰(25a-25d)을 갖는다. 각각의 웰(25a-25d)은 웰의 내벽에 걸친 중합체 재료 또는 겔(30a-30d)을 갖는다. 일련의 소수성 개재성 영역(35a-35e)은 각각의 웰(25a-25d) 사이에 위치한 상부 표면(15) 상에 도시된다. 도시된 바대로, 중합체 재료 또는 겔(30a-30d)은 웰(25a-25d)의 바닥에 증착되고, DNA 클러스터(40a-40d)는 겔 재료(30a-30d)에 공유 부착된다.
도 2b는 본 명세서에 기재된 표면의 더 자세한 다이어그램식 예이다. 예시된 바대로, 표면은 유리 슬라이드의 상부에 재료의 3개의 층을 포함한다. 하부 CYTOP 층은 하부 유리 표면과 직접 접촉한다. 노르보르넨 유도체화 실란층은 CYTOP 재료의 상부에 증착된다. PAZAM을 포함하는 상부 층은 노르보르넨 층의 상부에 있다. 형광단 TET(상표명)가 부착된 일련의 그래프팅된 P5/P7 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 재료의 PAZAM 층에 결합된다. P5 및 P7 프라이머의 서열은 US 특허 제8,969,258호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
도 2c는 3개의 그래프팅된 유리 표면의 형광 영상이다. 화학 불활성 시험은 CYTOP-S 및 CYTOP-M에서 수행되었다. 왼쪽 표면은 대조군으로서 사용되고, 임의의 CYTOP 중합체에 의해 코팅되지 않는다. 중간 표면은 CYTOP-M에 의해 코팅되고, 오른쪽 표면은 CYTOP-S에 의해 코팅된다. 이후, 각각의 표면은 노르보르넨 유도체화 실란에 의해 처리된 후, PAZAM 커플링되고, P5 및 P7 올리고뉴클레오타이드는 PAZAM에 그래프팅된다. PAZAM 부착된 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재는 형광 표지된 TET 올리고뉴클레오타이드(P5 및 P7에 상보성)의 혼성화 및 타이푼 형광 영상장치에서의 검출에 의해 평가되었다. CYTOP-S 처리된 표면에서의 TET 올리고 강도의 결여는 올리고뉴클레오타이드 그래프팅된 PAZAM이 CYTOP-S 처리된 표면에서 부동화되지 않는다는 것을 나타낸다.
도 3은 화학 처리 전 및 후의 대조군 표면과 비교하여 CYTOP-M 및 CYTOP-S 처리된 유리 표면의 접촉 각을 예시한다. CYTOP 처리된 유리 표면은 CYTOP-M에 대해 약 120° 및 CYTOP-S에 대해 약 123°의 접촉 각을 보여주었다. 노르보르넨 실란층의 증착 후, 접촉 각은 CYTOP-M에 대해 116° 및 CYTOP-S에 대해 120°로 감소하였다. PAZAM 커플링 및 올리고 그래프팅 이후에, 접촉 각은 CYTOP-M 표면에 대해 51°로 실질적으로 감소하여서, 표면 및 표면들에 결합된 DNA 클러스터 및 친수성 PAZAM 중합체가 친수성이 된다는 것을 나타낸다. 반대로, CYTOP-S 표면은 접촉 각의 오직 약간의 감소로 이의 소수성을 보유하였다. 이의 화학 불활성 및 소수성 특징으로 인해, CYTOP-S는 (예를 들어, 분석물질 보유 특징 사이에 개재성 영역을 형성하기 위해) 표면 패터닝에 대해 우수한 후보인 것으로 확인되었다.
통상적인 작업흐름은 소수성 코팅으로서 CYTOP-S를 사용하여 패턴화된 표면을 제조하기 위해 도 4에 예시되어 있다. 처음에, 표면을 CYTOP-S에 의해 처리하였다. CYTOP-S가 유리 또는 실리콘 표면에 커플링하도록 임의의 반응성 작용기가 결여되므로, 접착 촉진 층은 표면에 대한 CYTOP-S의 코팅을 촉진하도록 사용될 수 있다. 이 예에서, CYTOP-A의 얇은 층을 처음에 유리 표면에 코팅하였다. 이후, CYTOP-S를 표면에서 편평하게 코팅하였다. 후속하는 경화 후, 2개의 CYTOP 층에서의 과불화 중합체는 더 얽혀서 더 강한 접착을 형성하였다. 유리 또는 실리콘 표면에 대한 접착 촉진 층으로서 사용될 수 있는 재료의 비제한적인 예는 또한 아미노계 실란 커플링제, 예컨대 APTMS, APTES 등을 포함한다.
이 표준 작업흐름에서, 포토리쏘그래피에 표준 포토레지스트를 증착시키기 위해 CYTOP-S 표면을 산소 플라즈마에 의해 처리하였다. 플라즈마 처리는 CYTOP-S가 더 친수성이게 하여서, 포토레지스트는 이의 상부에서 코팅될 수 있다. 이 표면 개질에 의해, 표준 포토레지스트는 표면으로부터 탈습윤되는 경향이 있다. 공정 동안, CYTOP-S 표면은 산소 플라즈마 처리 후 이의 소수성 및 화학 불활성을 소실한다. CYTOP-S 표면의 소수성이 CYTOP-S 용액을 사용하여 180℃에서 고온 리플로우 단계를 통해 회수되지만, 표면의 화학 불활성은 회수되지 않고, 개재성 CYTOP-S 표면에 대한 PAZAM의 비특이적 결합이 관찰되었다.
리플로우 공정
본 명세서에 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 방법은 패터닝 동안 표면에 대한 손상을 회복하도록 리플로우 공정을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CYTOP-S 표면이 패터닝 공정 동안 손상되면(예컨대, 불활성 또는 소수성 특성의 소실), CYTOP-S 표면 특성은 CYTOP-S 함유 용매를 사용하여 리플로우 공정에 의해 복원될 수 있다. 용매 리플로우는 도 9a에 예시된 것처럼 액상 공정 또는 도 9b에 예시된 것처럼 기상 공정으로서 수행될 수 있다. 액상 리플로우의 비제한적인 예는 고온(예를 들어, 180℃)에서 직접적으로 표면 상의 CYTOP-S 용매의 증착 또는 표면 상의 스핀 코팅, 이어서 더 낮은 온도(예를 들어, 50℃)에서의 경화를 포함한다. 기상 리플로우에서, 기판을 이것 내에 약간의 양의 CYTOP-S 함유 용매, 예컨대 2㎖의 과불화 플루오로카본 용매, 예컨대 CT-SOLV100E를 갖는 진공 밀봉 데시케이터에 배치한다. 리플로우 공정에서 사용될 수 있는 용매는 CT-SOLV180, 또는 CT-SOLV100E를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 선택의 다른 용매는 Fluorinert(등록상표) FC-40, Fluorinert(등록상표) FC-770(이들은 각각 과불화 중합체를 용해시킬 수 있음)을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 패턴화된 CYTOP-S 표면은 표면 특성 손상을 복원하도록 하이드로겔 코팅 후 리플로우 공정으로 처리될 수 있다. 리플로우 공정은 서열분석에 대한 하이드로겔 품질에 영향을 미치지 않는다. 도 10a는 O2 플라즈마 처리 후 PAZAM 코팅된 CYTOP-S 나노웰(700㎚ 내지 1.1㎛)의 광학 현미경관찰 영상이다. 도 110b는 액상 용매 리플로우 후 도 10a에서의 PAZAM 코팅된 CYTOP-S 나노웰의 광학 현미경관찰 영상이다. 도 10c는 형광성 다이에 의한 수성 액적의 습윤/탈습윤 후 도 10b의 PAZAM 코팅된 CYTOP-S 나노웰의 형광 영상이어서, PAZAM이 여전히 접근 가능하다는 것을 나타낸다.
고체 지지체
본 개시내용의 장치 또는 방법에서 유용한 고체 지지체는 일반적으로 평평한 표면(예를 들어, 칩 또는 슬라이드)일 수 있거나, 곡선 표면(예를 들어, 원통형 또는 드럼)을 가질 수 있다. 이것은 또한 2차원 또는 3차원일 수 있다. 유용한 재료는 유리, 석영, 플라스틱(예컨대, 폴리스타이렌(저 가교결합된 및 고 가교결합된 폴리스타이렌), 폴리카보네이트, 폴리프로필렌 또는 폴리(메틸메타크릴레이트)), 아크릴릭 공중합체, 폴리아마이드, 실리콘, 금속(예를 들어, 알칸티올레이트 유도체화 금), 셀룰로스, 나일론, 라텍스, 덱스트란, 겔 매트릭스(예를 들어, 실리카 겔), 폴리아크롤레인 또는 복합체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체는 유리를 포함한다.
특징부
어레이의 특징부는 임의의 다양한 형상을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 용어 "특징부"는 또한, 모든 윤곽이 어레이에서 특징부로서 작용할 때, 패턴화된 표면 상의 "윤곽"을 의미한다. 예를 들어, 예컨대 어레이의 표면에서 2차원 면에서 관찰될 때, 특징부는 원형, 환형, 타원형, 직사각형, 정사각형, 대칭, 비대칭, 삼각형, 다각형 등으로 보일 수 있다. 특징부는 예를 들어 정사각형 격자, 직사각형 격자, 사방정계 격자, 육각형 격자 또는 비스듬한 격자를 포함하는 규칙적인 반복 패턴으로 배열될 수 있다. 패턴은 패킹의 원하는 수준에서 달성되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 원형 특징부는 육각형 배열로 최적으로 패킹된다. 물론, 다른 패킹 배열은 또한 원형 특징부에 사용될 수 있고, 그 반대도 그렇다.
어레이 상의 특징부의 크기(또는 본 명세서에서 방법 또는 시스템에서 사용된 다른 물체)는 특정한 분야에 맞도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 어레이의 특징부는 단일 핵산 분자를 오직 수용하는 크기를 가질 수 있다. 이의 크기 범위에서 복수의 특징부를 갖는 표면은 단일 분자 해상에서 검출을 위한 분자의 어레이를 작제하는 데 유용하다. 이의 크기 범위에서의 특징부는 핵산 분자의 콜로니를 각각 함유하는 특징부를 갖는 어레이에 사용하기에 또한 유용하다. 따라서, 어레이의 특징부는 각각 약 1㎟ 이하, 약 500㎛2 이하, 약 100㎛2 이하, 약 10㎛2 이하, 약 1㎛2 이하, 약 500㎚2 이하 또는 약 100㎚2 이하, 약 10㎚2 이하, 약 5㎚2 이하 또는 약 1㎚2 이하인 면적을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이의 특징부는 약 1㎟ 이상, 약 500㎛2 이상, 약 100㎛2 이상, 약 10㎛2 이상, 약 1㎛2 이상, 약 500㎚2 이상, 약 100㎚2 이상, 약 10㎚2 이상, 약 5㎚2 이상 또는 약 1㎚2 이상일 것이다. 실제로, 특징부는 상기 예시된 것으로부터 선택된 상한과 하한 사이의 범위인 크기를 가질 수 있다. 표면의 특징부에 대한 몇몇 크기 범위가 핵산의 규모로 핵산과 관련하여 예시되어 있지만, 이 크기 범위에서의 특징부가 핵산을 포함하지 않는 분야에 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 특징부의 크기가 핵산 분야에 사용된 스케일에 반드시 구속될 필요는 없다는 것으로 추가로 이해될 것이다.
어레이는 또한 피치와 관련하여 규명될 수 있다. 예를 들어, 특징부의 크기 및/또는 특징부의 피치는 어레이가 원하는 밀도를 가질 수 있도록 변할 수 있다. 예를 들어, 평균 특징부 피치는 기껏해야 100㎛, 50㎛, 10㎛, 5㎛, 1㎛, 0.5㎛, 0.4㎛, 0.3㎛, 0.2㎛, 0.1㎛ 또는 이것 미만일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 평균 특징부 피치는 적어도 0.1㎛, 0.2㎛, 0.3㎛, 0.4㎛, 0.5㎛, 1㎛, 5㎛, 10㎛, 50㎛, 100㎛ 또는 이것 초과일 수 있다. 유사하게, 최대 특징부 피치는 기껏해야 100㎛, 50㎛, 10㎛, 5㎛, 1㎛, 0.5㎛, 0.4㎛, 0.3㎛, 0.2㎛, 0.1㎛ 또는 이것 미만일 수 있고/있거나, 최소 특징부 피치는 적어도 0.1㎛, 0.2㎛, 0.3㎛, 0.4㎛, 0.5㎛, 1㎛, 5㎛, 10㎛, 50㎛, 100㎛ 또는 이것 초과일 수 있다. 상기 범위는 특징부 사이의 평균, 최대 또는 최소 피치에 적용될 수 있다.
어레이에서의 특징부의 밀도는 단위 면적당 존재하는 특징부의 수의 면에서 또한 이해될 수 있다. 예를 들어, 어레이에 대한 특징부의 평균 밀도는 적어도 약 1 x 103 특징부/㎟, 1 x 104 특징부/㎟, 1 x 105 특징부/㎟, 1 x 106 특징부/㎟, 1 x 107 특징부/㎟, 1 x 108 특징부/㎟ 또는 1 x 109 특징부/㎟ 또는 이것 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이에 대한 특징부의 평균 밀도는 기껏해야 약 1 x 109 특징부/㎟, 1 x 108 특징부/㎟, 1 x 107 특징부/㎟, 1 x 106 특징부/㎟, 1 x 105 특징부/㎟, 1 x 104 특징부/㎟ 또는 1 x 103 특징부/㎟ 또는 이것 미만일 수 있다.
특징부의 규칙적인 패턴을 갖는 어레이는 특징부의 상대 위치와 관련하여 순서화되지만, 각각의 특징부의 하나 이상의 다른 특징과 관련하여 랜덤일 수 있다. 예를 들어, 핵산 어레이의 경우에, 핵산 특징부는 이의 상대 위치와 관련하여 순서화되지만, 임의의 특정한 특징부에 존재하는 핵산 종에 대해 서열의 그 자체의 지식과 관련하여 랜덤이다. 더 구체적인 예로서, 주형 핵산에 의해 특징부의 반복 패턴을 시딩하고, (예를 들어, 클러스터 증폭 또는 브릿지 증폭을 통해) 특징부에서 주형의 카피를 형성하기 위해 각각의 특징부에서 주형을 증폭시킴으로써 형성된 핵산 어레이는 특징부를 형성하는 윤곽의 위치에 의해 결정된 바대로 핵산 특징부의 규칙적인 패턴을 가질 것이지만, 어레이에 걸쳐 핵산의 서열의 분포와 관련하여 랜덤일 것이다. 따라서, 일반적으로 어레이에서의 핵산 재료의 존재의 검출은 특징부의 반복 패턴을 생성시킬 수 있는 한편, 서열 특이적 검출은 어레이에 걸쳐 신호의 비반복 분포를 생성시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 단일 반복 패턴에 의해 윤곽을 형성한다. 몇몇 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 다수의 반복 패턴에 의해 윤곽을 형성하여서, 적어도 특징의 제1 반복 패턴 및 특징의 제2 반복 패턴을 갖는 어레이를 제공한다. 몇몇 이러한 실시형태에서, 제1 및 제2 패턴은 외부 표면을 따라 인터리빙된 패턴을 형성하고, 제1 반복 패턴의 특징은 제1 융기부에서 발생하고, 제2 반복 패턴의 특징은 제2 융기부에서 발생하고, 특징은 분석물질의 부착 점을 포함하고, 이로써 제1 반복 패턴의 특징은 제2 반복 패턴의 특징에 부착된 분석물질에 대해 상이한 융기부에서 분석물질을 부착시키도록 구성된다. 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에서 제조되거나 사용될 수 있는 다수의 반복 패턴을 갖는 윤곽을 갖는 기판의 예는 발명의 명칭이 "Multi-Plane Microarrays"인 2017년 3월 28일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2017/024578호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
분석 분야
몇몇 실시형태는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 패턴화된 표면을 갖는 기판을 사용하여 분석물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 분석물질은 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 항체, 항체에 대한 에피토프, 효소, 세포, 핵, 세포 소기관 또는 소분자 약물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 분석물질은 폴리뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열의 검출 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합할 수 있는 겔 재료에 의해 코팅된 마이크로스케일 및/또는 나노스케일 윤곽을 포함하는 패턴화된 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계(표면은 임의의 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조됨); 및 복수의 제1 올리고뉴클레오타이드 및 복수의 제2 올리고뉴클레오타이드를 겔 재료에 공유 부착하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 중합체 코팅에 부착된 복수의 제1 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키고자 하는 주형과 접촉시키는 단계(각각의 주형은 3' 말단에서 제1 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있는 서열 및 5' 말단에서 보체가 제2 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있는 서열을 포함함)를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 주형을 증폭시켜서, 폴리뉴클레오타이드의 클러스터링된 어레이를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
핵산을 사용하는 몇몇 실시형태는 기판 상에 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 많은 상이한 DNA 증폭 기법은 본 명세서에 기재된 기판과 관련하여 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 기법은 중합효소 사슬 반응(polymerase chain reaction: PCR), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA), 다중 변위 증폭(multiple displacement amplification: MDA) 또는 랜덤 프라임 증폭(random prime amplification: RPA)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 실시형태에서, 증폭에 사용된 하나 이상의 프라이머는 (예를 들어, 겔 또는 중합체 코팅을 통해) 기판에 부착될 수 있다. PCR 실시형태에서, 증폭에 사용된 프라이머 중 하나 또는 둘 다는 기판에 부착될 수 있다. 이중 가닥 앰플리콘이 카피되는 주형 서열을 플랭킹하는 2개의 부착된 프라이머 사이에 브릿지 유사 구조를 형성하므로, 부착된 프라이머의 2개의 종을 사용하는 포맷은 대개 브릿지 증폭이라 불린다. 브릿지 증폭에 사용될 수 있는 예시적인 시약 및 조건은 예를 들어 미국 특허 제5,641,658호; 미국 특허 공보 제2002/0055100호; 미국 특허 제7,115,400호; 미국 특허 공보 제2004/0096853호; 미국 특허 공보 제2004/0002090호; 미국 특허 공보 제2007/0128624호; 및 미국 특허 공보 제2008/0009420호(이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
PCR 증폭은 기판에 부착된 하나의 증폭 프라이머 및 용액 중의 제2 프라이머에 의해 또한 수행될 수 있다. 하나의 부착된 프라이머 및 가용성 프라이머의 조합을 사용하는 예시적인 포맷은 예를 들어 문헌[Dressman et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 100:8817-8822 (2003)], WO 제05/010145호, 또는 미국 특허 공보 제2005/0130173호 또는 제2005/0064460호(이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 에멀션 PCR이다. 에멀션 PCR은 포맷을 예시하고, 본 명세서에 기재된 방법의 목적을 위해, 에멀션의 사용은 임의이고, 실제로 몇몇 실시형태에 대해 에멀션이 사용되지 않는 것으로 이해될 것이다. 더구나, 프라이머는 ePCR 참고문헌에 기재된 바대로 기판 또는 고체 지지체에 직접적으로 부착될 필요가 없고, 대신에 본 명세서에 기재된 바대로 겔 또는 중합체 코팅에 부착될 수 있다.
RCA 기법은 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위해 변형될 수 있다. RCA 반응에서 사용될 수 있는 예시적인 성분 및 RCA가 앰플리콘을 생성하는 원리는 예를 들어 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)] 및 US 2007/0099208 A1(이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. RCA에 사용된 프라이머는 용액 중이거나 겔 또는 중합체 코팅에 부착될 수 있다.
MDA 기법은 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위해 변형될 수 있다. MDA에 대한 몇몇 기본 원칙 및 유용한 조건은 예를 들어 문헌[Dean et al., Proc Natl . Acad. Sci . USA 99:5261-66 (2002); Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl . Acids Res. 20:1691-96 (1992)]; US 제5,455,166호; US 제5,130,238호; 및 US 제6,214,587호(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. MDA에 사용된 프라이머는 용액 중이거나 겔 또는 중합체 코팅에 부착될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 상기 예시된 증폭 기법의 조합을 이용할 수 있다. 예를 들어, RCA 및 MDA는 조합으로 사용될 수 있고, RCA는 용액 중의 연쇄체 앰플리콘(예를 들어, 액상 프라이머를 사용)을 생성하기 위해 사용된다. 이후, 앰플리콘은 (예를 들어, 겔 또는 중합체 코팅을 통해) 기판에 부착된 프라이머를 사용하여 주형으로서 사용될 수 있다. 이 예에서, 조합된 RCA 및 MDA 단계 후 생성된 앰플리콘은 기판에 부착될 것이다.
핵산 어레이를 함유하는 본 개시내용의 기판은 임의의 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 핵산에 대한 특히 바람직한 사용은 상보성 서열을 갖는 표적 핵산을 혼성화하는 포획 프로브로서 작용하는 것이다. 표적 핵산은 포획 프로브에 일단 혼성화되면 예를 들어 포획 프로브에 동원된 라벨을 통해 검출될 수 있다. 포획 프로브에 대한 혼성화를 통해 표적 핵산의 검출을 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허 공보 제2005/0053980호 A1; 제2009/0186349호 A1 또는 제2005/0181440 A1호(이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 라벨은 라벨을 보유하는 표적 프로브에 대한 포획 프로브의 혼성화 덕분에 포획 프로브에 동원될 수 있다. 또 다른 예에서, 포획 프로브가 (예를 들어, 리가제 활성을 통한) 표지된 올리고뉴클레오타이드에 대한 결찰에 의해 또는 (예를 들어, 중합효소 활성을 통한) 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 연장될 수 있도록, 라벨은 표적 프로브를 포획 프로브에 혼성화함으로써 포획 프로브에 동원될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 기판은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 폴리뉴클레오타이드 중합효소를 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 중합체 또는 겔 코팅 중 임의의 하나를 통해) 기판의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드 클러스터와 접촉시키는 단계; (b) 하나 이상의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 중합효소에 의해 사용될 때 검출 가증한 신호가 생성되도록 기판의 표면에 뉴클레오타이드를 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 부착된 폴리뉴클레오타이드(또는 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 생성된 하나 이상의 클러스터)에서 신호를 검출하는 단계; 및 (d) 단계 (b) 및 (c)를 반복하여서, 기판 부착되 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
핵산 서열분석은 당해 분야에 공지된 다양한 공정에 의해 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 방법에서, 합성에 의한 서열분석(sequencing-by-synthesis: SBS)은 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 중합체 코팅 중 임의의 하나를 통해) 기판의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 이용된다. 이러한 공정에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 중합효소와 연관된 주형 폴리뉴클레오타이드에 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 중합효소는 폴리뉴클레오타이드 주형에 상보성인 새로 합성된 핵산 가닥에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 도입한다. 합성은 주형 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 주형 폴리뉴클레오타이드의 일 말단에서 공유 결합된 보편적 또는 비가변적 핵산의 일부에 상보성인 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 개시된다. 뉴클레오타이드가 주형 폴리뉴클레오타이드에 대해 포함되면서, 어떤 뉴클레오타이드가 서열분석 공정의 각각의 단계 동안 도입되는지의 결정을 허용하는 검출 가능한 신호가 생성된다. 이러한 방식으로, 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부에 상보성인 핵산의 서열은 생성될 수 있어서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 허용한다.
흐름 셀은 본 개시내용의 방법에 의해 제조되고, 합성에 의한 서열분석(SBS) 또는 사이클에서 시약의 반복된 전달을 수반하는 다른 검출 기법으로 처리되는 어레이를 하우징하기 위한 편리한 포맷을 제공한다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 개시시키기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 핵산 어레이를 수용하는 흐름 셀로/통해 흐를 수 있다. 프라이머 연장이 표지된 뉴클레오타이드가 도입되게 하는 어레이의 이 부위가 검출될 수 있다. 임의로, 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되면, 뉴클레오타이드는 추가의 프라이머 연장을 종료시키는 가역적 종료 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 탈차단제가 모이어티를 제거하도록 전달될 때 후속하는 연장이 발생하지 않을 수 있도록 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체는 프라이머에 첨가될 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 실시형태에 대해, 탈차단 시약은 (검출이 발생하기 전에 또는 후에) 흐름 셀로 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에 세척이 수행될 수 있다. 이후, 사이클은 n회 반복되어서 n 뉴클레오타이드만큼 프라이머를 연장시켜서, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 어레이와 사용하기 위해 쉽게 채택될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유동성 시스템 및 검출 플랫폼은 예를 들어 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], WO 제04/018497호; US 제7,057,026호; WO 제91/06678호; WO 제07/123744호; US 제7,329,492호; US 제7,211,414호; US 제7,315,019호; US 제7,405,281호 및 US 제2008/0108082호(이들은 각각 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
흐름 셀을 사용하는 상기 기재된 방법의 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드의 오직 단일 유형은 단일 흐름 단계 동안 흐름 셀에 존재한다. 이러한 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 흐름 셀을 사용하는 상기 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드의 복수의 상이한 유형은 단일 흐름 단계 동안 흐름 셀에 존재한다. 이러한 방법에서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
흐름 셀에 존재하는 기판의 표면 상의 중합체 코팅에 부착된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대한 각각의 흐름 단계 동안 도입된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 결정은 폴리뉴클레오타이드 주형에서 또는 그 근처에서 신호를 검출함으로써 달성된다. 상기 기재된 방법의 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 신호는 광학 신호를 포함한다. 다른 실시형태에서, 검출 가능한 신호는 비광학 신호를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 비광학 신호는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 주형에서 또는 그 근처에서 pH의 변화를 포함한다.
본 개시내용의 분야 및 기판의 사용은 핵산과 관련하여 본 명세서에 예시되어 있다. 그러나, 다른 분석물질이 본 명세서에 기재된 기판에 부착되고 분석될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 하나 이상의 분석물질은 본 개시내용의 기판에 또는 이것 상에 존재할 수 있다. 본 개시내용의 기판은 분석물질의 검출을 위해, 또는 분석물질에 의해 합성 반응을 수행하기에 특히 유용하다. 따라서, 검출, 규명, 변형, 합성 등이 되는 임의의 다양한 분석물질은 본 명세서에 기재된 기판에 또는 이것 상에 존재할 수 있다. 예시적인 분석물질은 핵산(예를 들어, DNA, RNA 또는 이의 유사체), 단백질, 다당류, 세포, 항체, 에피토프, 수용체, 리간드, 효소(예를 들어, 키나제, 포스파타제 또는 중합효소), 소분자 약물 후보 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 기판은 분석물질의 라이브러리로부터 다수의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종은 항체 라이브러리로부터의 상이한 항체, 핵산의 라이브러리로부터의 상이한 서열을 갖는 핵산, 단백질의 라이브러리로부터의 상이한 구조 및/또는 기능을 갖는 단백질, 소분자의 조합 라이브러리로부터의 약물 후보 등일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 분석물질은 기판 상의 특징부에 분포할 수 있어서, 이것은 개별적으로 분해 가능하다. 예를 들어, 각각의 분석물질의 단일 분자는 각각의 특징부에 존재할 수 있다. 대안적으로, 분석물질은 콜로니 또는 집단으로서 존재할 수 있어서, 개별 분자는 반드시 분해되지는 않는다. 콜로니 또는 집단은 (비록 다수의 카피이지만) 오직 분석물질의 단일 종과 관련하여 균일할 수 있다. 핵산을 예로 취해서, 기판 상의 각각의 특징부는 핵산의 콜로니 또는 집단을 포함할 수 있고, 콜로니 또는 집단에서의 모든 핵산은 동일한 뉴클레오타이드 서열(단일 가닥 또는 이중 가닥)을 가질 수 있다. 이러한 콜로니는 본 명세서에 이전에 기재된 바대로 클러스터 증폭 또는 브릿지 증폭에 의해 생성될 수 있다. 표적 서열의 다수의 반복부는 단일 핵산 분자, 예컨대 롤링 서클 증폭 절차를 이용하여 생성된 연속체에 존재할 수 있다. 따라서, 기판 상의 특징부는 분석물질의 단일 종의 복수의 카피를 함유할 수 있다. 대안적으로, 특징부에 있는 분석물질의 콜로니 또는 집단은 2개 이상의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기판 상의 하나 이상의 웰은 2개 이상의 상이한 핵산 종(즉, 상이한 서열을 갖는 핵산 분자)을 갖는 혼합 콜로니를 각각 함유할 수 있다. 혼합된 콜로니에서의 2개 이상의 핵산 종은 무시할만한 양으로 존재할 수 있어서, 예를 들어 하나 초과의 핵산이 혼합된 콜로니로 검출되게 한다.
실시예
추가적인 실시형태는 어떤 식이든 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시에에 더 자세히 개시되어 있다.
실시예 1
도 5는 수행된 CYTOP-S를 사용하여 패턴화된 표면을 제조하기 위한 예시적인 공정의 작업흐름 다이어그램이다. 상기 기재된 바대로, CYTOP-S 표면의 산소 플라즈마 처리는 소수화도 및 CYTOP 층의 화학 불활성화 및 소수화도의 손실을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 소정의 포토레지스트, 예컨대 Shipley 18 시리즈 포토레지스트가 임의의 산소 플라즈마 처리를 요하지 않으면서 CYTOP-S 코팅된 표면에 직접적으로 스피닝될 수 있다는 것이 발견되었다.
표면 준비 : 처음에, 기판(유리 기판 또는 이산화규소 코팅된 Si 기판)을 아이소프로필 알코올(IPA), 탈이온수(DI) 중에 깨끗이 하고, 질소 가스에 의해 취입 건조시켰다. 이후, 기판을 APTMS에 의한 실란화를 위해 60℃에서 12시간 동안 진공 데시케이터에 배치하였다. 이후, 0.5% CYTOP-A 코팅 용액을 2000rpm에서 20초 동안 기판 표면 상에 스핀 코팅하였다. 코팅된 기판을 50℃에서 30분 동안 소프트 베이킹하였다. 후속하여, 5% CYTOP-S 코팅 용액을 1000rpm에서 30초 동안 CYTOP-A 층에 스핀 코팅하였다. CYTOP-A 및 CYTOP-S 용액을 준비하기 위해, 플루오로카본계 용매, 예컨대 AGC로부터의 CT-SOLV180을 사용하였다. 기판을 실온에서 30분 동안 건조시키고, 이후 50℃에서 30분 동안, 이어서 80℃에서 30분 동안 베이킹하고, 마지막으로 250℃에서 30분 동안 베이킹하였다. CYTOP-A/S 코팅은 완전하고, 기판은 포토리쏘그래피에 준비되었다.
포토리쏘그래피 : Shipley S1800 포토레지스트를 기판 표면의 CYTOP 층에 직접적으로 스핀 코팅하였다(예를 들어, 0.5㎛의 두께로 Shipley S1805를 코팅하기 위해 30초 동안 3000rpm). 기판을 60초 동안 115℃에서 소프트 베이킹하였다. G-라인 UV를 갖는 스텝퍼 또는 접촉 얼라이너(aligner)를 대략 120mJ/㎠의 노출 에너지로 포토리쏘그래피에 사용하였다. 기판을 60초 동안 마이크로포지트 MF-321 현상제에 넣고, 이후 탈이온수에 의해 세정한 후, 질소 가스 취입 건조시켜서 전개 공정을 수행하였다. 이후, Shipley S18 포토레지스트 패턴화된 기판을 30분 동안 120℃ 오븐에서 하드 베이킹하였다. 웰 영역에서 CYTOP를 에칭하여 밑의 SiO2 표면을 노출시키기 위해, 기판을 O2 플라즈마(평행 플레이트 플라즈마 에칭제, 100 sccm O2 유입, 150W, 180초 건조 에칭)에 의해 처리하였다. 기판의 생성된 표면은 하이드로겔 패터닝 단계에 준비된 CYTOP-S에 의해 커버된 개재성 영역에 의해 분리된 패턴화된, 노출된 SiO2 표면으로 이루어졌다.
하이드로겔 패터닝 : 실란 커플링제를 기판의 처리된 표면에 증착시켜서, 노출된 SiO2 표면 및 CYTOP-S에 의해 커버된 개재성 영역 둘 다를 커버하였다. 이후, 하이드로겔을 실란 커플링제 위로 스핀 코팅하여 공유 결합을 형성하여서 하이드로겔은 표면에 부동화되었다. 경화 후, 과량의 하이드로겔을 세정하였다. 하이드로겔 패턴화된 표면을 연마 없이 올리고 그래프팅에서 직접 사용할 수 있다.
도 6a 및 도 6b는 클러스터링 및 14회 사이클 서열분석 전 및 후의 28㎛ 피치를 갖는 14㎛ 마이크로웰을 함유하는 패턴화된 장치 표면의 형광성 영상이다. 장치 표면은 조합된 CYTOP-A 및 CYTOP-S 층에 대해 370㎚의 전체 두께를 갖는 Shipley S1805를 사용하여 도 5에 기재된 Shipley 포토레지스트 작업흐름에 따라 준비하였다. 도 6a는 TET 염료에 의해 표지된 올리고 프라이머에 의해 그래프팅된 PAZAM 패턴화된 표면의 영상을 예시한다. 도 6b는 SYTOX(등록상표) 인터칼레이팅 염료에 의해 표지된 마이크로웰에서의 DNA 클러스터의 성장을 예시한다. 마이크로웰 사이의 소수성 CYTOP-S 개재성 영역에서 프라이머 또는 DNA 클러스터의 비특이적 결합의 징후가 없다는 것이 이 영상으로부터 명확하다.
도 5에 기재된 동일한 Shipley 18 포토레지스트 작업흐름을 이용하여 제작된 1.8㎛ 피치를 갖는 700㎚ 마이크로웰을 함유하는 장치에서 공정을 반복하였다. 도 6c는 SYTOX(등록상표) 인터칼레이팅 염료에 의해 가시화된 700㎚ 마이크로웰에서 패턴화된 DNA 클러스터의 형광성 영상이다. 다시, 영상은 매우 깨끗한 CYTOP-S 개재성 영역을 보여주었다.
실시예 2
이 예에서, 포토리쏘그래피 전에 표면의 산소 플라즈마 처리의 필요 없이 표준 포토레지스트르 사용하여 패턴화된 표면을 생성하기 위한 2개의 공정(직접적인 패터닝 공정 및 리프트-오프 공정)을 수행하였다.
도 7은 패턴화된 표면을 생성하기 위한 직접적인 패터닝 작업흐름을 예시한다.
표면 준비 : 처음에, CYTOP-A 및 CYTOP-S를 실시예 1에 기재된 바와 동일한 절차에 따라 고체 지지체의 표면에 코팅하였다. 이후, 플루오로계면활성제 Suflon-S651을 아이소프로판올(IPA)과 혼합하여 1% 용액을 형성하고, 5초 동안 500rpm에서 및 이후 50초 동안 4000rpm에서 CYTOP-S 표면 위에 스핀 코팅하였다. 이 단계는 CYTOP 층과 이것 위에 증착된 포토레지스트 층 사이에 표면 에너지의 불일치를 감소시킨다. 후속하여, MICROCHEM으로부터의 LOR 레지스트를 임의의 산소 플라즈마 처리를 요하지 않으면서 처리된 표면 위로 직접 스피닝하였다. 이 접근법은 공정 작업흐름을 확장하여서 Shipley 18 포토레지스트 뒤로 제작 설비에서 사용되는 많은 다양한 포토레지스트의 사용을 허용한다. 이 작업흐름에서 후속하는 단계는 소정의 포토레지스트 생성물에 적절한 바대로 포토레지스트 코팅, 소프트 베이킹, UV 정렬/노출 및 형상을 포함한다. 웰 영역에서 CYTOP 중합체를 에칭하여 밑의 SiO2 area 영역을 노출시키기 위해, 기판을 O2 플라즈마(평행 플레이트 플라즈마 에칭제, 100 sccm O2 유입, 150W, 180초 건조 에칭)에 의해 처리하였다. 기판의 생성된 표면은 하이드로겔 패터닝 단계에 준비된 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 패턴화된 노출된 SiO2 표면을 포함하였다.
직접 패터닝: 처음에, 기판 표면에 남은 포토레지스트를 10분 동안 아세톤 중에 기판을 음파처리, 이후 IPA 세정, 물 세정 및 이후 공기 취입 건조에 의해 제거하였다. 대안적으로, 포토레지스트 LOR을 MICROCHEM Remover PG에 의해 스트리핑할 수 있고, 이후 Suflon-S651을 아세톤에 의해 스트리핑할 수 있다. 포토레지스트 및 플루오로계면활성제의 제거는 개재성 영역으로서 밑의 CYTOP-S 코팅을 노출시켰다. 후속하여, 기판을 노르보르넨 실란화를 위해 60℃에서 12시간 동안 진공 데시케이터에 배치하였다. 실란화를 완료한 후, 기판을 이후 PAZAM에 의해 코팅하고, 1시간 동안 60℃ 오븐에서 항온처리하였다. 과량의 하이드로겔을 DI 물에 의해 세정하였다. 이후, 기판을 45℃에서 30분 동안 DI 물 중에 음파처리하여 공유 결합 없이 표면에 헐겁게 남은 과량의 하이드로겔을 제거하였다. 생성된 기판은 하이드로겔이 없는 깨끗한 CYTOP 개재성 영역 및 웰 영역에서 코팅된 하이드로겔을 가질 것이다. 기판은 하기의 프라이머 그래프팅 및 DNA 시딩 및 서열분석에 준비된다.
도 8a는 패턴화된 표면을 생성하기 위한 리프트-오프 패터닝 작업흐름을 예시한다. 기판 제작 공정은 도 7에 예시된 작업흐름에서 상기 기재된 것과 동일하다. CYTOP 및 Surflon 코팅 및 포토리쏘그래피 후, 패턴화된 표면을 에칭하여 웰에서 밑의 SiO2 표면을 노출시켰다. 이후, 표면에 남은 포토레지스트 층을 갖는 패턴화된 기판을 노르보르넨 실란화를 위해 60℃에서 12시간 동안 진공 데시케이터에 직접 넣었다. 이후, 기판을 PAZAM에 의해 코팅하고, 1시간 동안 60℃ 오븐에서 항온처리하였다. 과량의 하이드로겔을 DI 물에 의해 세정하였다. 이후, 기판을 45℃에서 30분 동안 DI 물 중에 음파처리하여 공유 결합 없이 표면에 헐겁게 남은 하이드로겔을 제거하였다. 후속하여, 기판을 45℃에서 30분 동안 아세톤 중에 음파처리하여서 개재성 영역에서 포토레지스트 층을 제거하였다. 포토레지스트 층의 상부에 증착된 하이드로겔을 또한 동시에 제거하였다. 개재성 영역에서의 깨끗한 CYTOP 표면을 노출시켰다. 생성된 기판 표면은 하이드로겔이 없는 깨끗한 CYTOP 개재성 영역 및 웰 영역에 부동화된 하이드로겔을 갖는다. 이후, 기판은 하기의 프라이머 그래프팅 및 DNA 시딩 및 서열분석에 준비된다.
도 8b는 도 8a에 예시된 리프트-오프 작업흐름을 이용하여 14㎛ 마이크로웰 구조에서 패턴화된 PAZAM 및 DNA 클러스터의 형광성 영상을 예시한다. DNA 클러스터를 SYTOX(등록상표) 인터칼레이터 염료에 의해 염색하였다. 영상은 하이드로겔 패터닝 결과가 도 7에서 지시하는 패터닝 작업흐름에 의해 달성된 것과 필적하다는 것을 제안한다.
또한, CYTOP-S 표면은 직접적인 및 리프트-오프 공정 둘 다에서 하이드로겔 패터닝 후 표면 소수화도를 재개하고, 리프트-오프 방법은 직접적인 패터닝 방법과 비교하여 더 양호한 표면 소수화도를 보유한다.
실시예 3
CYTOP A 표면 및 다양한 웰 패턴을 갖는 패턴화된 흐름 셀을 본 명세서에 기재된 바대로 준비하였다. ExAmp 증폭 방법 및 2 x 150 사이클 실행을 이용하여 DNA 서열의 증폭을 수행하였다. 항온처리는 탈차단을 위해 1분 및 15초 동안 실행되고, 반응은 65㎕ 용적에서 실행되었다. 하기 결과가 얻어지고, 결과는 도 13a 내지 도 13c에 도시되어 있다.
Figure 112018126871974-pct00002
결과는 CYTOP 패터닝이 Illumina SBS 화학물질과 알맞고, 표면이 2 x 150bp 서열분석 실행을 완료하기 위해 수천 개의 흐름 교환을 허용하기에 튼튼하다는 것을 입증한다.

Claims (58)

  1. 고체 지지체를 포함하는 겔 코팅된 윤곽(contour)을 갖는 패턴화된 표면으로서,
    연속 소수성 코팅층을 포함하는 표면;
    상기 고체 지지체의 상기 소수성 코팅층 상의 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 포함하는 포토레지스트 층; 및
    상기 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽 내의 올리고뉴클레오타이드에 공유로 결합할 수 있는 겔 재료의 층을 포함하는, 패턴화된 표면.
  2. 제1항에 있어서, 상기 윤곽은 소수성 개재성 영역(hydrophobic interstitial region)에 의해 분리되고,
    상기 패턴화된 표면은 (a) 결합 재료층 또는 (b) 실란층을 더 포함하되, 상기 결합 재료층 또는 실란층은 적어도 상기 윤곽의 일부 및 상기 소수성 개재성 영역의 일부를 커버하고,
    상기 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽의 적어도 일부는 소수성 코팅이 없는, 패턴화된 표면.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합 재료층 또는 실란층은 노르보르넨 유도체화 실란을 포함하는, 패턴화된 표면.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 코팅층은 불화 중합체, 과불화 중합체 또는 실리콘 중합체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 패턴화된 표면.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소수성 코팅층은 CYTOP-M, CYTOP-S 또는 CYTOP-A, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 패턴화된 표면.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 코팅층은 상기 표면과 직접 접촉하거나, 또는 상기 소수성 코팅층은 제1 접착 촉진층을 통해 상기 표면과 접촉하고, 선택적으로 상기 제1 접착 촉진층은 CYTOP-A, (3-아미노프로필)트라이메톡시실란(APTMS) 또는 (3-아미노프로필)트라이에틸옥시실란(APTES), 또는 이들의 조합을 포함하는, 패턴화된 표면.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포토레지스트는 상기 고체 지지체의 소수성 코팅층과 직접 접촉하거나, 또는 상기 포토레지스트는 제2 접착 촉진층을 통해 상기 고체 지지체의 소수성 코팅층과 접촉하고, 선택적으로 상기 제2 접착 촉진층은 불화 계면활성제를 포함하는, 패턴화된 표면.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포토레지스트는 Shipley S1800(상표명) 시리즈 포토레지스트이고, 선택적으로 상기 포토레지스트는 Shipley S1818(MICROPOSIT(상표명) S1818(상표명)) 및 Shipley S1805(MICROPOSIT(상표명) S1805(등록상표))로부터 선택되는, 패턴화된 표면.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겔 재료는 PAZAM을 포함하는, 패턴화된 표면.
  10. 제9항에 있어서, 상기 겔 재료는 핵산에 부착된 PAZAM을 포함하는, 패턴화된 표면.
  11. 겔 코팅된 윤곽을 갖는 패턴화된 표면을 제조하는 방법으로서,
    연속 소수성 코팅층을 포함하는 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;
    상기 고체 지지체의 소수성 코팅층 상에 포토레지스트 층을 배치하는 단계;
    상기 포토레지스트 층을 패턴화하여 소수성 개재성 영역에 의해 분리된 상기 표면 상에 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽을 형성하는 단계; 및
    상기 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽 내에 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합할 수 있는 겔 재료의 층을 증착시키는 단계를 포함하는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 포토레지스트를 제거하는 단계; 및
    상기 겔 재료를 증착시키기 전에 (a) 결합 재료층 또는 (b) 실란층을 상기 표면에 도포하여 적어도 상기 윤곽의 일부 및 상기 소수성 개재성 영역의 일부를 커버하는 단계를 포함하는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 겔 재료는 상기 결합 재료층 또는 실란층에 공유 부착되는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 상기 소수성 코팅층의 일부를 에칭함으로써 형성된, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 마이크로-스케일 또는 나노-스케일 윤곽은 상기 소수성 코팅층을 포함하는 소수성 개재성 영역에 의해 서로 분리되는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 결합 재료층 또는 실란층은 노르보르넨 유도체화 실란을 포함하고, 상기 겔 재료는 PAZAM을 포함하는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 겔 재료를 경화시키는 단계를 더 포함하는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 소수성 개재성 영역은 상기 포토레지스트의 제거 후 상기 겔 재료를 실질적으로 포함하지 않는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 방법은 상기 포토레지스트를 배치하기 전에 상기 표면의 플라즈마 디스큠 처리(plasma descum treatment)를 요하지 않는, 패턴화된 표면을 제조하는 방법.
  20. 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법으로서,
    올리고뉴클레오타이드에 공유 부착할 수 있는 겔 재료에 의해 코팅된 마이크로스케일 또는 나노스케일 윤곽을 포함하는 패턴화된 표면을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 패턴화된 표면은 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 및
    복수의 제1 올리고뉴클레오타이드 및 복수의 제2 올리고뉴클레오타이드를 겔 재료에 공유 부착하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 겔 재료에 부착된 복수의 제1 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키고자 하는 주형과 접촉시키는 단계로서, 각각의 주형은 3' 말단에서 제1 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 있는 서열 및 5' 말단에서 보체가 제2 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 있는 서열을 포함하는, 상기 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 상기 주형을 증폭시켜서, 폴리뉴클레오타이드의 클러스터링된 어레이를 생성하는 단계를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법.
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