JP7437161B2 - フローセル - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２９日に出願された米国仮出願第６２／６９２，５１１号および２０１８年１０月９日に出願された米国仮出願第６２／７４３，３７３号の利益を主張し、その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
配列ＥＦＳ－ウェブを通じて提出された配列表は、その全体を参照して組み込まれている。ファイル名はILI172APCT＿IP－1806－PCT＿Sequence＿Listing＿ST25．txt、ファイルサイズは５５１バイト、ファイル作成日は２０１９年５月２０日である。
核酸を配列決定するためのいくつかの利用可能なプラットフォームは、合成による配列決定アプローチを利用する。このアプローチを用いて、発生期のストランドが合成され、そして成長するストランドへの各モノマー（単量体）（例えば、ヌクレオチド）の付加が、光学的および／または電子的に検出される。鋳型（テンプレート）ストランドは発生期ストランドの合成を方向づけるので、合成の間に成長ストランドに添加された一連のヌクレオチドモノマーから鋳型ＤＮＡの配列を推測することができる。いくつかの例において、ペアエンド（対末端）配列決定が使用され得、ここで、順方向ストランドが配列決定され、そして除去され、次いで、逆方向ストランドが構築され、そして配列決定される。
イントロダクション
本明細書に開示される第１の態様は、基材と、基材上の第１の領域に結合した第１のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、基材上の第２の領域に結合した第２のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第２のプライマーセットとを含むフローセルである。
第１の態様の一例では、第１の領域は、第１の官能基を有する材料を含み、第２の領域は、第１の官能基とは異なった第２の官能基を有する材料を含む。
第１の態様の一例では、フローセルは、第１のプライマーセットを第２のプライマーセットから分離するギャップをさらに含む。
第１の態様の一例では、基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、凹部のそれぞれは、第１の部分に位置する第１の領域と、第２の部分に位置する第２の領域とを含む。この例の１つのバージョンでは、フローセルは、第１の領域を第２の領域から分離するギャップをさらに含むことができる。この例の別のバージョンでは、第１の領域と第２の領域とが部分的に重なり合う。この例のさらに別のバージョンでは、第１および第２の部分は、異なる深さを有する。この実施例のさらなるバージョンでは、第１および第２の領域は、ブロック共ポリマー（ブロックコポリマー）の異なるブロックである。
第１の態様の一例では、基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、凹部のそれぞれは、第１の領域を含み、第２の領域は、間隙領域の少なくともいくつかの上に位置する。
第１の態様の一例では、第１の領域は、第１のポリマーを含み、第１のプライマーセットは、第１のポリマーにグラフト（移植）され、第２の領域は、第２のポリマーを含み、第２のプライマーセットは、第２のポリマーにグラフトされる。この実施形態の１つの態様では、フローセルは、第１のプライマーセット上および第１のポリマー上に保護塗装をさらに含む。この実施形態の別の態様では、第１のポリマーは、基材上の第１の層であり、第２のポリマーは、第１の層上の第２の層であり、フローセルは、第２の層上のパッシベーション（不動態化）樹脂と、パッシベーション樹脂、第２のポリマー、および第１のポリマーに画定された特徴（形状）とをさらに含み、第１および第２のプライマーセットのそれぞれは、特徴のそれぞれで露出される。
第１の態様の一例では、基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、凹部のそれぞれは、第１の領域が位置する第１の部分と、第２の部分とを含み、フローセルは、第２の部分に位置するビーズ（ビード）をさらに含み、第２の領域は、ビーズの表面にある。
第１の態様の一例では、切断可能な第１のプライマーは第１の切断部位を含み、切断可能な第２のプライマーは第２の切断部位を含み、第１および第２の切断部位は同一タイプである。この例の１つのバージョンでは、切断不可能な第１のプライマー、切断可能な第２のプライマー、切断可能な第１のプライマー、および切断可能な第２のプライマーのそれぞれは、それぞれのリンカーを含み、第１の切断可能なプライマーの第１の切断部位は、そのリンカーに沿って位置し、第２の切断可能なプライマーの第２の切断部位は、そのリンカーに沿って位置する。
第１の態様の一例では、切断可能な第１のプライマーは第１の切断部位を含み、切断可能な第２のプライマーは第２の切断部位を含み、第１および第２の切断部位は異なるタイプである。この例の１つのバージョンでは、切断不可能な第１のプライマー、切断可能な第２のプライマー、切断可能な第１のプライマー、および切断可能な第２のプライマーのそれぞれは、それぞれのリンカーを含み、第１の切断可能なプライマーの第１の切断部位は、そのリンカーに沿って位置し、第２の切断可能なプライマーの第２の切断部位は、そのリンカーに沿って位置する。
第１の態様の一例では、第１のプライマーセットは、第１の保持体構造に結合され、第１の領域は、第１の保持体構造に結合された第１の捕捉部位であり、第２のプライマーセットは、第１の保持体構造とは異なった第２の保持体構造に結合され、第２の領域は、第２の保持体構造に結合された第２の捕捉部位である。
本明細書に開示された第１の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第２の態様は、第１の基材と、第１の基材に結合した第１のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、第１の基材に対向する第２の基材と、第２の基材に結合した第２のプライマーセットとを含み、第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含むフローセルである。
第２の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、および／または本明細書で開示された例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第３の態様は、間隙領域によって分離された凹部を含む基材と、第１のポリマー層のいくつかの官能基がキャップされる、凹部のそれぞれの中の第１のポリマー層と、凹部のそれぞれの中の第１のポリマー層の他の官能基に結合された第１のプライマーセットと、間隙領域上の第２のポリマー層と、流体キャリアを含むプライミング流体と、第１のプライマーセットとは異なった第２のプライマーセットとを含む、フローセルを含むキットである。
第３の態様の例では、第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む。
第３の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第３の態様および／または第２の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、および／または本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第４の態様は、フローセルに鋳型流体を導入することを含む方法であって、フローセルは、間隙領域によって分離された凹部を含む基材と、凹部のそれぞれの中における第１のポリマー層であって、露出した官能基がキャップされている第１のポリマー層と、凹部のそれぞれの中の第１のポリマー層に結合し、切断可能な第１のプライマーセットおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、間隙領域上の第２のポリマー層とを含み、これにより、鋳型流体からの鋳型が増幅されて凹部の少なくともいくつかの中にクラスターを形成し、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含むプライミング流体をフローセルに導入し、これにより、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーが第２のポリマー層にグラフトされ、クラスターから切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーへのブリッジ増幅（bridgeamplification）を開始し、これにより、間隙領域の少なくともいくつかの上に第２のクラスターを形成する、方法である。
第４の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第４の態様および／または第３の態様および／または第２の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、および／または本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第５の態様は、間隙領域によって分離された凹部を含む基材と、凹部のそれぞれにある第１のポリマー層と、第１のポリマー層に取り付けられた第１のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、第１のポリマー層上および第１のプライマーセット上の任意の光学保護塗装層と、間隙領域上の第２のポリマー層と、第２のポリマー層に取り付けられた第２のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第２のプライマーセットと、を含むフローセルに鋳型流体を導入するステップであって、これにより、鋳型流体からの鋳型が増幅されて、凹部の少なくともいくつかおよび間隙領域の少なくともいくつかにクラスターを形成するステップと、切断可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを切断するステップとを含む、方法である。
第５の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第５の態様および／または第３の態様および／または第２の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、および／または本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第６の態様は、保持体と、保持体上のパターン化（パターニング／パターン形成）された樹脂であって、間隙領域によって分離された第１の凹部および第２の凹部を含み、第１の凹部は、第２の凹部よりも小さい開口部寸法を有する、パターン化された樹脂と、第１の凹部の少なくともいくつかに取り付けられた第１のプライマーセットと、第２の凹部の少なくともいくつかにそれぞれ配置された官能基を有するビーズとを含み、官能基を有するビーズは、コア構造の表面に取り付けられた第２のプライマーセットを含み、第２のプライマーセットは、第１のプライマーセットとは異なっている、フローセルである。
第６の態様では、官能基を有するビーズのコア構造は、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレン、およびアクリル酸塩からなる群から選択される。
第６の態様の一例では、パターン化された樹脂は、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
第６の態様の一例では、フローセルは、第１の凹部および第２の凹部にポリマーをさらに含み、第１のプライマーセットは、第１の凹部の少なくともいくつかのポリマーに結合される。この例の１つのバージョンでは、官能基を有するビーズは、第２の凹部の少なくともいくつかのポリマー上に配置される。この例の別のバージョンでは、第１のプライマーセットはまた、第２の凹部の少なくともいくつかのポリマーに結合され、官能基を有するビーズは、第２の凹部の少なくともいくつかの第１のプライマーセット上に配置される。
第６の態様の例では、第１のプライマーセットは、第１のプライマーおよびウラシル修飾された第２のプライマーを含み、第２のプライマーセットは、ウラシル修飾された第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む。
本明細書に開示された第６の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第７の態様は、保持体と、保持体上のパターン化された樹脂であって、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された樹脂と、凹部の少なくともいくつかに取り付けられた第１のプライマーセットと、第１のプライマーセットの少なくともいくつかのプライマーが露出されるように、凹部の少なくともいくつかに配置された官能化されたビーズとを含み、官能化されたビーズは、コア構造の表面に取り付けられた第２のプライマーセットを含み、第２のプライマーセットは、第１のプライマーセットとは異なっている、フローセルである。
第７の態様の一例では、凹部のそれぞれは、官能基を有するビーズの直径より大きいかまたは等しい第１の開口部寸法を有する第１の部分と、官能基を有するビーズの直径より小さい第２の開口部寸法を有する第２の部分とを含み、官能基を有するビーズは、凹部の少なくともいくつかのそれぞれの第１の部分に配置される。
第７の態様の一例では、官能基を有するビーズのコア構造は、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレン、およびアクリル酸塩からなる群から選択される。
第７の態様の一例では、パターン化された樹脂は、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
第７の態様の一例では、フローセルは、凹部においてポリマーをさらに含む。この局面の１つのバージョンにおいて、第１のプライマーセットは、官能基を有するビーズによって占有されていないポリマーの部分に結合される。このバージョンの一例では、第１のプライマーセットは、凹部においてポリマーに結合され、官能基を有するビーズは、第１のプライマーセットのいくつかの他のプライマー上に配置される。
本明細書に開示された第７の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第８の態様は、保持体上のパターン化された樹脂の凹部にポリマーを選択的に適用（塗布）することと、第１のプライマーセットを少なくともいくつかの凹部にポリマーにグラフトすることと、第１のプライマーセットをグラフトする前後に、ｉ）少なくともいくつかの凹部のそれぞれの一部に、またはｉｉ）少なくともいくつかの凹部よりも大きい開口部寸法を有する第２の凹部に官能基を有するビーズを堆積させることとを含み、官能基を有するビーズは、コア構造の表面に結合された第２のプライマーセットを含み、第１および第２のプライマーセットが異なっている、方法である。
第８の態様の実施形態では、官能基を有するビーズを堆積させる前に、該方法は、第２のプライマーセットをコア構造に結合させることによって官能基を有するビーズを形成することをさらに含む。
第８の態様の一例では、凹部の少なくともいくつかのそれぞれの部分は、官能基を有するビーズのそれぞれの直径より大きいかまたは等しい開口部寸法を有し、凹部の少なくともいくつかは、部分と相互接続された第２の部分を含み、第２の部分は、官能基を有するビーズのそれぞれの直径より小さい第２の開口部寸法を有し、官能基を有するビーズは、サイズ排除凹部の少なくともいくつかのそれぞれの部分に自己集合（セルフアセンブル）する。
第８の態様の一実施形態では、方法は、前記ポリマーを選択的に適用する前に、前記保持体上に樹脂を堆積させるステップと、ナノインプリントリソグラフィを用いて前記樹脂をパターン化するステップとによって、前記パターン化された樹脂を前記保持体上に形成するステップとをさらに含む。
第８の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第８の態様および／または第７の態様および／または第６の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、かつ／または本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第９の態様は、保持体と、保持体上のパターン化された樹脂であって、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された樹脂と、凹部におけるパターン化された樹脂上のブロック共ポリマーであって、ブロック共ポリマーの各ブロックが、他の各ブロックのブロック特異的官能基とは異なるブロック特異的官能基を有する、ブロック共ポリマーと、ブロックのうちの少なくとも１つのブロック特異的官能基に結合されたプライマーとを含む、フローセルである。
第９の態様の一例では、パターン化された樹脂は、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。この実施例の１つのバージョンでは、パターン化された樹脂はＰＯＳＳベースの樹脂であり、ＰＯＳＳベースの樹脂は架橋エポキシＰＯＳＳ樹脂である。本実施例の別のバージョンでは、ブロック共ポリマーは、ブロック特異的官能基としてアミノ基を有するアクリルアミドモノマーを含む第１のブロックと、ブロック特異的官能基としてアジド基を有するアジドアセトアミドペンチルアクリルアミドモノマーを含む第２のブロックとを含む。この他の例では、ブロック共ポリマーは、
であり、
式中、Ｒは水素またはポリマー開始種末端基であり、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。この実施別のバージョンの形態では、ブロック共ポリマーは、
であり、
式中、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。
第９の態様では、パターン化された樹脂は、非晶質フッ素ポリマーである。この実施形態の一態様では、ブロック共ポリマーは、ブロック特異的官能基としてトリフルオロメチル基を有するモノマーを含む第１のブロックと、ブロック特異的官能基としてプライマーグラフト官能基を有するモノマーを含む第２のブロックとを含む。
第９の態様の一例では、ブロック共ポリマーは、ブロック特異的官能基としてプライマーグラフト化官能基を有するモノマーを含む第１のブロックと、第１および第２のブロックの相分離を駆動するための相互作用パラメータを調整するためのモノマーを含む第２のブロックとを含む。この実施形態の一態様では、プライマーグラフト化官能基はアジド基であり、第２のブロックのモノマーのブロック特異的官能基は、アミノ基、アルコール基、アリール基、および荷電基からなる群から選択される。
第９の態様の一例では、ブロック共ポリマーは、第１のブロック、第２のブロック、および第３のブロックを含む三元共ポリマーであり、第１のブロックのブロック特異的官能基は、パターン化された樹脂に結合され、第２のブロックのブロック特異的官能基は、プライマーに結合され、第３のブロックのブロック特異的官能基は、前記プライマーとは別の他のプライマーまたは酵素に結合される。
第９の態様の一例では、ブロック共ポリマーは、第１のブロック、第２のブロック、および第３のブロックを含む三元共ポリマーであり、第１のブロックのブロック特異的官能基は、パターン化された樹脂に結合され、第２のブロックのブロック特異的官能基は、プライマーに結合され、第３のブロックのブロック特異的官能基は、ブロック共ポリマーの表面自由エネルギーに影響を及ぼすか、またはブロック共ポリマーの安定性に影響を及ぼす。
第９の態様の一例では、凹部は、ウェルおよびトレンチからなる群から選択される。
第９の態様では、パターン化された樹脂およびブロック共ポリマーは、それぞれ、約２５ｍＮ／ｍ～約５０ｍＮ／ｍの表面自由エネルギーを有する。
本明細書に開示された第９の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または形状で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第９の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、および／または本明細書で開示された例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第１０の態様は、保持体と、保持体上のパターン化された多面体オリゴマーシルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂と、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化されたＰＯＳＳベースの樹脂と、凹部におけるパターン化されたＰＯＳＳベースの樹脂上の分離されたブロック共ポリマーであって、分離されたブロック共ポリマーの一方のブロックが、パターン化されたＰＯＳＳベースの樹脂に結合された官能基を有し、分離されたブロック共ポリマーの他方のブロックが別の官能基を有する、ブロック共ポリマーと、当該別の官能基に結合されたプライマーと、を有するフローセルである。
第１０の態様では、分離されたブロック共ポリマーは、
（式中、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。）
（式中、Ｒは水素またはポリマー開始種末端基であり、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。）、
からなる群から選択される。
本明細書に開示された第１０の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１０の態様および／または第９の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、および／または本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示された第１１の態様は、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された樹脂を形成するために樹脂をパターン化することと、パターン化された樹脂上にブロック共ポリマーを含む溶液を導入することであって、ブロック共ポリマーの各ブロックがブロック共ポリマーの他の各ブロックのブロック特異的官能基とは異なったブロック特異的官能基を有し、溶液を溶媒蒸気焼鈍に曝し、それによってブロック共ポリマー相が凹部において分離し、自己集合し、ブロックの少なくとも１つのブロック特異的官能基にプライマーをグラフトする、方法である。
第１１の態様の実施形態では、樹脂をパターン化することは、ナノインプリントリソグラフィを含む。
第１１の態様の実施形態では、ブロック共ポリマーを含む溶液は、約０．０４～約０．３０の範囲のフロリ－ハギンズ相互作用パラメータを有する。
第１１の態様の例において、グラフト化の前に、該方法は、凹部における相分離および自己集合（自己組織化）ブロック共ポリマーを含むパターン化された樹脂を硬化工程に曝すことをさらに含む。
本明細書に開示された第１１の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１１の態様および／または第１０の態様および／または第９の態様および／または第１の態様の特徴の任意の組み合わせが、一緒に使用されてもよく、かつ／または本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせられてもよいことを理解されたい。
本明細書に開示される第１２の態様は、基材上に第１の官能化層を適用するステップと、第１の官能化層をパターン化し、それによってフォトレジストによって覆われた第１の官能化領域を形成するステップと、フォトレジストおよび基材の部分上に第２の官能化層を適用するステップと、フォトレジストおよびその上の第２の官能化層のいずれかをリフトオフするステップと、第２の官能化層の一部を除去し、それによって第１の官能化領域に近接する第２の官能化領域を形成するステップと、第１のプライマーセットを第１の官能化層または第１の官能化領域におよび第２のプライマーセットに第２の官能化層または第２の官能化領域に結合させるステップであって、第１のプライマーセットが第２のプライマーセットとは異なっているステップと、を含む方法である。
第１２の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、第１の官能化層が適用される前に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層に予めグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、第２の官能化層が適用される前に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層に予めグラフトすることを含む。
第１２の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層にグラフトすることを含む。
第１２の態様の一例では、方法は、第１の自己集合単層（単分子層）を第１の官能化領域上に、第２の自己集合単分子層を第２の官能化領域上にそれぞれ堆積させることをさらに含み、第１のプライマーセットの結合は、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の自己集合単層にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の自己集合単層にグラフトすることを含む。
第１２の態様の一例では、除去することは、第１の官能化領域上に第２のフォトレジストを適用し、第２の官能化領域になる第２の官能化層の第２の部分を適用することと、第２の官能化層の一部をエッチングすることとを含む。
第１２の態様の一例では、基材は、保持体上に樹脂を含み、樹脂は、間隙領域によって分離された凹部を含み、第１の官能化領域は、各凹部の第１の部分上にあり、第２の官能化層は、各凹部の第２の部分上および間隙領域上にあり、除去することは、間隙領域から第２の官能化層を研磨することを含む。
第１２の態様の一例では、基材は、保持体上の樹脂を含み、樹脂は、間隙領域によって分離されたマルチレベル凹部を含み、第１の官能化領域は、それぞれのマルチレベル凹部の第１のレベルにあり、第２の官能化層を適用する前に、フォトレジストおよび樹脂の一部分上に犠牲層を適用するステップと、樹脂の一部分から犠牲層を除去するステップと、多層の凹部から樹脂の領域を除去して、第１の官能化領域に近接する領域を生成するステップと、第２の官能化層が、フォトレジスト上の犠牲層上、領域上、および間隙領域上に適用されるステップと、をさらに含む。
本明細書に開示された第１２の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１２の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第１３の態様は、第１の基材部分が露出（露光）されるように基材上に第１のフォトレジストを適用するステップと、フォトレジストおよび第１の基材部分上に第１の官能化層を適用するステップと、フォトレジストおよびその上の第１の官能化層のいずれかをリフトオフするステップと、それによって第１の基材部分上に第１の官能化領域を形成するステップと、第１の官能化領域上および基材上に第２のフォトレジストを適用して第１の官能化領域に隣接する第２の基材部分を露出するステップと、第２のフォトレジストおよび第２の基材部分上に第２の官能化層を適用するステップと、第２のフォトレジストおよびその上の第２の官能化層のいずれかをリフトオフするステップと、それによって第１の官能化領域に隣接する第２の官能化領域を形成するステップと、第１のプライマーセットを第１の官能化層または第１の官能化領域におよび第２のプライマーセットを第２の官能化層または第２の官能化領域に結合させるステップであって、第１のプライマーセットが第２のプライマーセットとは異なっているステップと、を含む。
第１３の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、第１の官能化層が適用される前に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層に予めグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、第２の官能化層が適用される前に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層に予めグラフトすることを含む。
第１３の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層にグラフトすることを含む。
第１３の態様の一例では、方法は、第１の自己集合単層を第１の官能化領域上に、第２の自己集合単層を第２の官能化領域上にそれぞれ堆積させることをさらに含み、第１のプライマーセットの結合は、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の自己集合単層にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の自己集合単層にグラフトすることを含む。
本明細書に開示された第１３の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１３の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第１４の態様は、間隙領域によって分離されたトレンチおよびトレンチのそれぞれの第１の部分における犠牲材料領域を含む基板上に第１の官能化層を適用するステップと、第１の官能化層をパターン化して、各トレンチの第２の部分においてフォトレジストによって覆われた第１の官能化領域を形成するステップと、犠牲材料領域を除去して、各トレンチの第１の部分を露出させるステップと、第２の官能化層を、間隙領域上に、第１の部分上に、フォトレジスト上に、適用するステップと、フォトレジストおよびその上の任意の第２の官能化層をリフトオフするステップと、任意の第２の官能化層を間隙領域から除去し、これにより、第２の官能化領域を、各トレンチの第１の部分に残すステップと、少なくとも実質的にトレンチに垂直な空間的に分離されたストライプのパターンで第２のフォトレジストを適用するステップと、空間的に分離されたストライプ間に露出された第１の官能化領域および第２の官能化領域の部分を除去するステップと、第２のフォトレジストを除去するステップと、第１のプライマーセットを第１の官能化層または第１の官能化領域におよび第２のプライマーセットを第２の官能化層または第２の官能化領域に結合させるステップであって、第１のプライマーセットが第２のプライマーセットとは異なっているステップと、を含む。
第１４の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、第１の官能化層が適用される前に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層に予めグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、第２の官能化層が適用される前に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層に予めグラフトすることを含む。
第１４の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層にグラフトすることを含む。
第１４の態様の一例では、基材は、各トレンチの第２の部分に第２の犠牲材料領域を含み、基材、犠牲材料領域、および第２の犠牲材料領域は、異なるエッチング率（速度）を有し、第１の官能化層を適用する前に、該方法は、各トレンチの第２の部分から第２の犠牲材料領域を除去することをさらに含む。本実施例の１つのバージョンは、第２の犠牲材料領域を除去する前に、方法は、間隙領域によって分離されたトレンチを含む基材上に犠牲材料を適用することと、犠牲材料の領域が各トレンチの各サイドウォールに直接隣接して残るように犠牲材料の一部を除去することと、第２の犠牲材料を基材上および犠牲材料領域上に適用することと、第２の犠牲材料の領域が各犠牲材料領域に直接隣接して残るように第２の犠牲材料の一部を除去することと、第２の犠牲材料領域の間の任意の空間を充填するために材料を適用することとによって、犠牲材料領域および第２の犠牲材料領域を形成することをさらに含む。本バージョンの一実施例では、基材は多層基材であり、トレンチは多層基材の最表層に画定され、該材料および最表層は同じである。
本明細書に開示された第１４の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１４の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第１５の態様は、第１の間隙領域によって分離された凹部を含む基板に犠牲材料を適用することを含み、各凹部は、ステップ部分によって画定される深い部分および浅い部分を含み、犠牲層（犠牲材料の層）は、深い部分を部分的に充填し、犠牲層の一部分および基板の一部分を順次除去して、犠牲層の残りの部分と少なくとも実質的に同じ高さである第２の間隙領域を形成し、犠牲層の残りの部分に隣接する領域を形成するステップ部分を除去するステップと、第２の間隙領域、犠牲層の残りの部分、および領域上に第１の官能化層を適用するステップと、第１の官能化層にフォトレジストを適用するステップと、フォトレジストの一部分および下にある第１の官能化層の部分を除去して、犠牲層の残りの部分および第２の間隙領域が露出されるようにし、その上にフォトレジストの第２の部分を有する第１の官能化層をその領域に残すステップと、犠牲層の残りの部分を除去してから第１の官能化層の部分に隣接する第２の領域を形成するステップと、第２の官能化層をその領域に適用し、それによって第２の官能化領域を形成するステップと、フォトレジストの第２の部分をリフトオフし、それによって第１の官能化領域を形成するステップと、第１のプライマーセットを第１の官能化層または第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを第２の官能化層または第２の官能化領域に結合させ、第１のプライマーセットは第２のプライマーセットとは異なるステップと、を含む。
第１５の態様の一例では、第２の官能化層は、フォトレジストの第２の部分および第２の間隙領域にも適用され、第２の官能化層の第１の部分は、フォトレジストの第２の部分と共に除去され、方法は、第２の間隙領域から第２の官能化層を研磨することをさらに含む。
第１５の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、第１の官能化層が適用される前に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層に予めグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、第２の官能化層が適用される前に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層に予めグラフトすることを含む。
第１５の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、その適用後に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層にグラフトすることを含む。
本明細書に開示された第１５の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１５の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第１６の態様は、保持体と、保持体上の第１の官能化層と、第１の官能化層上の第２の官能化層と、第２の官能化層上のパッシベーション層とを含み、それによってパッシベーション層の間隙領域によって分離された特徴部分を形成し、第１および第２の官能化層のそれぞれの領域が各特徴部分で露出され、第１のプライマーセットを第１の官能化層または第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを第２の官能化層または第２の官能化領域に結合させ、第１のプライマーセットは第２のプライマーセットとは異なる、多層基材をインプリント（刻印）することを含む方法である。
第１６の態様の例において、第１のプライマーセットの結合は、第１の官能化層が多層基材に組み込まれる前に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを第１の官能化層に予めグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、第２の官能化層が多層基材に組み込まれる前に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを第２の官能化層に予めグラフトすることを含む。
第１６の態様の例では、第１のプライマーセットの結合は、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを各凹部の第１の官能化領域にグラフトすることを含み、第２のプライマーセットの結合は、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを各凹部の第２の官能化領域にグラフトすることを含む。
本明細書に開示された第１６の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または形状で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１６の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第１７の態様は、第１の樹脂をインプリントして、段差部分によって画定される深い部分と浅い部分とを含む凹部を形成するステップであって、第１の樹脂が第２の樹脂上に配置される犠牲層上に配置される犠牲層と、第１の樹脂の第１の部分および深い部分の下にある犠牲層の一部をエッチングし、それによって第２の樹脂の一部を露出させるステップと、段差部分をエッチングして、犠牲層の第２の部分を露出させるステップと、第１の官能化層を第２の樹脂の部分に適用して、第１の官能化領域を形成するステップと、犠牲層の第２の部分を除去し、これにより、第２の樹脂の第２の部分を露出させるステップと、第２の官能化層を第２の樹脂の第２の部分に適用して、第２の官能化領域を形成するステップと、第１のプライマーセットを第１の官能化層または第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを第２の官能化層または第２の官能化領域に結合させ、第１のプライマーセットは第２のプライマーセットとは異なるステップと、を含む方法である。
第１７の態様の一例では、第２の官能化層の適用中に、第２の官能化層は、凹部を取り囲む間隙領域上に堆積され、第１の官能化領域上に堆積されず、方法は、間隙領域から第２の官能化層を研磨することをさらに含む。
本明細書に開示された第１７の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１７の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本明細書に開示される第１８の態様は、第１のプライマーセットを第１の保持体構造に結合させるステップと、第２のプライマーセットを第２の保持体構造に結合させるステップであって、第２のプライマーセットおよび第２の保持体構造が、第１のプライマーセットおよび第１の保持体構造とは異なっているステップと、第１の保持体構造に選択的に結合する複数の第１の捕捉部位および第２の保持体構造に選択的に結合する複数の第２の捕捉部位を有する基材面に第１および第２の保持体構造をロードするステップとを含む方法である。
本明細書に開示された第１８の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１８の態様および／または第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書で開示される例の任意のものと組み合わせることができることを理解されたい。
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになり、図面において、同様の参照番号は、おそらく同一ではないが、同様の構成要素に対応する。簡潔にするために、先に説明した機能を有する符号または特徴は、それらが現れる他の図面と関連して説明されてもよいし、説明されなくてもよい。
図１Ａ～１Ｄは、基材上の第１および第２の領域に結合した第１および第２のプライマーセットの異なる例示的な模式図である。 図２は、基材面上の第１および第２の領域の例示的な概略断面図である。 図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ、凹部における第１および第２の領域の例示的な概略断面図および上面図である。 図４Ａ～４Ｃは、凹部における第１および第２の領域の異なる例示的な概略断面図である。 図５は、凹部における第１の領域および基材面上の第２の領域の例示的な概略断面図である。 図６Ａ～６Ｂは、凹部における第１の領域と基材面上の第２の領域の例示的な概略断面図および上面図である。 図７Ａ～図７Ｇは、例示的な凹部における第１の領域と基材面上の第２の領域の例とを含む例示的なフローセルの製造方法の一例を一緒に示す概略断面図である。 図８Ａ～８Ｆは、凹部における第１の領域および基材面上の第２の領域の例を含む別の例示的なフローセルを作製するための別の実施例を共に示す概略断面図である。 図９は、凹部における第１の領域と、凹部に配置されたビーズの一部としての第２の領域との例示的な概略断面図である。 図１０は、別個の基材に取り付けられた第１および第２のプライマーセットの例示的な概略断面図である。 図１１Ａ～１１Ｃは、保持体上のパターン化された樹脂の一実施例の形成を共に示す概略斜視図である。図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｄは、保持体上のパターン化された樹脂の別の実施例の形成を共に示す概略斜視図である。 図１２は、本明細書で開示される方法の一例を示すフロー図である。 図１３Ａ～１３Ｄは、図１１Ｃのパターン化された基材を使用して、本明細書に開示される方法の一例を共に描写する概略斜視図である。 図１４は、図１３Ｄの線４－４に沿った断面図である。 図１５Ａ～図１５Ｄは、図１１Ｃのパターン化された基材を用いて本明細書に開示された他の実施形態を共に示す概略斜視図である。 図１６は、図１５Ｄの６－６線に沿った断面図である。 図１７Ａ～図１７Ｄは、図１１Ｄのパターン化された基材を使用して本明細書に開示される方法の一例を共に示す概略斜視図である。 図１８は、図１７Ｄの線８－８に沿った断面図である。 図１９Ａ～図１９Ｄは、図１１Ｄのパターン化された基材を用いて本明細書に開示された他の実施例を共に示す概略斜視図である。 図２０は、図１９Ｄの１０－１０線に沿った断面図である。 図２１は、本明細書で開示される方法の別の例を示すフロー図である。 図２２Ａ～２２Ｅは、本明細書に開示される他の方法の一例を共に示す概略斜視図である。図２２Ｆは、図２２Ｅに示されるフローセルの例示的な凹部の拡大図であり、凹部は、１つのブロックにグラフトされたブロック共ポリマーおよびプライマーを含む。 図２３Ａおよび２３Ｂは、凹部および周囲の間隙領域の例の概略上面図であり、ブロック共ポリマーの異なる例は、自己集合され、凹部において相分離され、ここで、各々の図は、ブロックの異なる模様を示す。 図２４は、本明細書に開示されるフローセルの一例の概略斜視図を示す。 図２５Ａおよび２５Ｂは、トリブロック共ポリマーを含む、本明細書中に開示されるフローセルの異なる例を描写する概略断面図である。 図２６Ａ～２６Ｈは、図２に示される例示的な領域を形成するための例示的な方法を共に示す模式図である。 図２７Ａ～２７Ｆは、図２に示される例示的な領域を形成するための別の例示的な方法を共に示す模式図である。 図２８Ａ～２８Ｇは、図３Ａ、３Ｂに示される例示的な領域を形成するための例示的な方法を共に示す模式図である。 図２９Ａ～２９Ｈは、図３Ａ、３Ｂに示される例示的な領域を形成するための別の例示的な方法を共に示す模式図である。 図３０Ａ～３０Ｆは、図３Ａ、３Ｂに示される例示的な領域を形成するためのさらに例示的な方法を共に示す模式図である。 図３１Ａ～３１Ｉは、図３Ａ、３Ｂに示される例示的な領域を形成するための例示的な方法を共に示す模式図である。 図３２Ａ～３２Ｆは、図４Ｃに示される例示的な領域を形成するための例示的な方法を共に示す模式図である。 図３３Ａは、本明細書に開示される領域の別の例を形成するための例示的な方法の模式図である。図３３Ｂは、領域を示す、図３３Ａの凹部のうちの１つの上面図である。 図３４Ａ～３４Ｓは、トレンチにおける例示的な領域を形成するための例示的な方法を共に示す概略図である。 図３５は、官能化された保持体構造の例を概略的に示す。 図３６Ａおよび３６Ｂは、図３５の官能化保持体構造を使用して例示的領域を形成するための例示的方法を共に示す模式図である。 図３７Ａおよび３７Ｂは、図３５の官能化保持体構造を使用して例示的領域を形成するための例示的方法を共に示す模式図である。 図３８Ａおよび３８Ｂは、ブロック共ポリマーの別の例を含む例示的な方法を共に示す模式図である。 図３９Ａは、間隙領域によって分離された直径５０μｍの凹部を有するフローセル基板の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像であり、その上に予めグラフトされたポリマー層が堆積されている。図３９Ｂは、予備グラフトポリマー層上に堆積された防護層を有する図３９Ａのフローセル基材のＳＥＭ像である。図３９Ｃは、間隙領域から防護層を除去するためのエッチング後の図３９Ｂのフローセル基材のＳＥＭ像である。 図４０Ａおよび４０Ｂは、同時ペアエンド読み取り（図４０Ａ）および順次ペアエンド読み取り（図４０Ｂ）のためのデータ分析を示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図２に示される例示的な領域を形成するための別の例示的な方法を共に示す概略図である。 図４２Ａ～４２Ｈは、図２に示される例示的な領域を形成するためのさらに別の例示的な方法を共に示す概略図である。
本明細書中に開示されるフローセルの例は、核酸配列決定のために使用され得る。
フローセルのいくつかは、フローセル基材の別領域に結合した異なるプライマーセットを含む。これらの例では、切断（線状化）ケミストリーが異なる領域で直交するようにプライマーセットを制御することができる。直交切断ケミストリーは、異なるセットの異なるプライマーに結合した同一の切断部位を通して、または異なるセットの異なるプライマーに結合した異なる切断部位を通して実現することができる。これにより、基材の１つの領域にフォワード（順方向）ストランドのクラスターを生成することができ、基材の別の領域にリバース（逆方向）ストランドのクラスターを生成することができる。一例では、領域は互いに直接隣接している。別の例では、領域間の任意の空間は、クラスター化が２つの領域にまたがることができるほど十分に小さい。本明細書に開示されるフローセル構成のいくつかでは、フォワードおよびリバースストランドは、空間的に分離され、これは、それぞれの読み取りの同時の塩基呼び出しを可能にしながら、両方の読み取りから蛍光信号を分離する。したがって、本明細書に開示されるフローセルのいくつかの例は、同時のペアエンド読み取りが得られることを可能にする。
フローセルの他の例は、同時ペアエンド読み取りを得るために使用され得るか；または順次ペアエンド読み取りを得るために使用され得、ここで、フォワードストランドが配列決定され、そして除去され、次いで、リバースストランドが配列決定され、そして除去される。これらの他の例では、フローセル保持体上のパターン化された樹脂は、パターン化された樹脂の凹部において方向付けられた自己集合を受けるブロック共ポリマーでコーティングされる。パターン化された樹脂は、ブロック共ポリマーの配置のためのガイドとしての役割を果たす。制御された条件下で、ブロック共ポリマーは特異的ドメインに自己集合する。本明細書中に開示される例のいくつかにおいて、ドメインの官能性は、１つ以上のドメインがパターン化された樹脂と反応し得、そして１つ以上の他のドメインがプライマーをグラフトし得るように、直交するように制御される。いくつかの例では、ドメインの官能性を制御して、そのドメインの特性を変更することができる。これらの例示的なフローセルは、光学的または非光学的検出方法での使用に好適であり得る。
定義
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味をとることを理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を以下に示す。
単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。
用語含む（comprising）、含む（including）、からなる（containing）およびこれらの用語の様々な形状は、互いに同義であり、等しく広いことを意味する。
用語「上部」、「下部」、「下側」、「上側」などは、本明細書では、フローセルおよび／またはフローセルの様々な構成要素を説明するために使用される。これらの方向を示す用語は、具体的な配向性を意味するものではなく、構成要素間の相対的な配向性を示すために使用されることを理解されたい。方向を示す用語の使用は、本明細書に開示される実施例を任意の具体的な配向性に限定すると解釈されるべきではない。
「アクリルアミドモノマー」は、構造を有するモノマー、またはその構造を有するアクリルアミド基を含むモノマーである。アクリルアミド基を含むモノマーとしては、例えば、
が挙げられる。
他のアクリルアミドモノマーを使用してもよい。
アルデヒドは、本明細書中で使用される場合、カルボニル中心（すなわち、酸素に二重結合した炭素）を含み、炭素原子もまた水素に結合した構造－ＣＨＯおよびＲ基（例えば、アルキルまたは他の側鎖）を有する官能基を含む有機化合物である。アルデヒドの一般構造は、
である。
本明細書中で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和した（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐鎖状炭化水素鎖を指し、アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有し得る。例示的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。例として、「Ｃ１～４アルキル」という名称は、アルキル鎖中に１～４個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群より選択されることを示す。
本明細書中で使用される場合、「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を含む直鎖または分岐鎖状炭化水素鎖をいう。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有することができる。例示的なアルケニル基には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが含まれる。
本明細書中で使用される場合、「アルキン」または「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を含む直鎖または分枝鎖炭化水素鎖をいう。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有していてもよい。
本明細書中で使用される場合、「アリール」は、環骨格に炭素のみを含む芳香環または環系（すなわち、２つの隣り合う炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）をいう。アリールが環系である場合、系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有することができる。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが含まれる。
「アミノ」官能基は、－ＮＲａＲｂ基を指し、ここで、ＲａおよびＲｂは、本明細書中で定義されるように、水素

Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および５～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
本明細書中で使用される場合、用語「取り付けられた」は、２つのものが、直接的または間接的のいずれかで、互いに接合され、固定され、接着され、連結され、または結合される状態をいう。例えば、凹部に取り付けられたビーズは、凹部に物理的に閉じ込められてもよい。別の例では、核酸を、共有結合または非共有結合によって官能化ポリマーに結合させることができる。共有結合は、原子間で電子の一対を共有することを特徴とする。非共有結合は、一対の共有を伴わない物理的な結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を含むことができる。さらに別の例では、プライマーは、保持体構成を介して基材上の領域に結合させることができる。
「アジド（azide）」または「アジド（azido）」官能基は、－Ｎ３を指す。
官能基を有するビーズの「ビーズ」または「コア構造」という用語は、剛性または半剛性の材料から作られた小さな本体を指す。本体は、例えば、球形、楕円形、微小球形、または規則的または不規則な寸法を有するかどうかにかかわらず他の認識された粒子形状として特徴付けられる形状を有することができる。ビーズ／コア構造に役立つ例示的な材料には、ガラス；アクリル酸、ポリスチレンなどのプラスチック、またはスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、またはポリテトラフルオロエチレン（Teflon（登録商標）、Chemours製）；アガロースまたはセファロースなどの多糖または架橋多糖；ナイロン；ニトロセルロース；ケイ素および改質ケイ素を含む樹脂；シリカまたはシリカベースの材料；炭素繊維、金属；無機ガラス；光ファイバ束、または様々な他のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ビーズ／コア構造の例には、制御された気孔ガラスビーズ、常磁性ビーズ、トリアゾル、セファロースビーズ、ナノ結晶、および、例えば、Bangs Laboratories、Fishers Ind.のマイクロスフェアディテクションガイドに記載されているような検出当業者で公知の他のものが含まれる。ビーズはまた、プライマーに結合し得る官能基を有するポリマーで被覆され得る。
「ブロック共ポリマー」は、２つ以上のモノマーが一緒にクラスター化し、繰り返し単位のブロックを形成する場合に形成されるコポリマーである。各ブロックは、隣り合うブロックに存在しない少なくとも１つの特徴および／または少なくとも１つのブロック特異的官能基を有するべきである。本明細書に開示される実施例では、ブロック共ポリマーは、特定の焼鈍条件に曝されると、構成ポリマーブロックのミクロ相分離によって、ナノメートルスケールの寸法で規則正しいドメインに自己集合することができる。ブロック共ポリマーの具体例については、後述する。
「ブロック特異的官能基」は、パターン化された樹脂との反応、プライマーの結合、ミクロ相分離を駆動するための相互作用パラメータの調整、ブロック共ポリマーの特性の変更などのような、特定の機能性を有するブロックポリマーの特定のブロックにおける原子および／または結合の部分を指す。本明細書で開示されるいくつかの例では、それぞれのブロックは、様々なブロック特異的官能基を含む。以下、それぞれのブロック固有官能基の具体例についてさらに説明する。
本明細書で使用されるように、「結合領域」は、別の物質に結合されるべき保持体上の領域を指し、別の物質は、例として、スペーサー層、蓋、別の基材など、またはそれらの組み合わせ（例えば、スペーサー層および蓋）であってもよい。結合領域で形成される結合は、化学結合（上述のようである）または機械的結合（例えば、ファスナなどを使用する）であってもよい。
本明細書で使用される「捕捉部位」は、官能化された保持体組織の局在化を可能にする化学的性質で物理的に修飾および／または修飾されたフローセル表面の一部を指す。一例では、捕捉部位は、化学的捕捉剤を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格中に炭素原子のみを含む非芳香族環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つ以上の環が、縮合、架橋、またはスピロ連結様式で一緒に結合され得る。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族でないという条件で、任意の程度の飽和度を有し得る。したがって、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有してもよい。カルボシクロ環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが含まれる。
本明細書で使用される「カルボン酸」または「カルボキシル」という語は、本明細書で使用される場合、－ＣＯＯＨを指す。
「化学捕捉剤」は、標的分子（例えば、官能化保持体構造）に結合、保持、または結合することができる物質、分子、または部分である。１つの例示的な化学捕捉剤は、標的分子の標的核酸の少なくとも一部に相補的であるか、または標的分子に結合した捕捉核酸（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）を含む。さらに別の例示的な化学捕捉剤は、標的分子（または標的分子に結合した連結部分）に結合することができる受容体－配位子結合対（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合蛋白質、エピトープ、抗体など）の部材を含む。化学的捕集剤のもう一つの例は、標的分子と共に静電相互作用、水素結合、または同価結合を形成することができる化学試薬である（例えば、チオール‐ジスルフィド交換、クリック化学、ディール‐アルダー等）。
本明細書中で使用される場合、「シクロアルキレン」は、２つの結合点を介して分子の残りの部分に結合している完全に飽和したカルボシクリル環または環系を意味する。
本明細書中で使用される場合、「シクロアルケニル」または「シクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中の環は芳香族ではない。例としては、シクロヘキセニルまたはシクロヘキセンおよびノルボルネニルまたはノルボルネンが挙げられる。また、本明細書中で使用される場合、「ヘテロシクロアルケニル」または「ヘテロシクロアルケン」は、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系であって、環系中に環が芳香族ではないものを意味する。
本明細書で使用する「シクロアルキニル」または「シクロアルキン」とは、少なくとも１つの三重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中に環が芳香族ではない。例はシクロオクチンである。他の例はビシクロノインである。本明細書で使用する「ヘテロシクロアルキニル」または「ヘテロシクロアルキン」とは、少なくとも１つの三重結合を有し、環系中に環が芳香族ではない、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味する。
本明細書で使用される「堆積」という用語は、任意の適切な適用技術を指し、これは、手動であっても自動であってもよく、いくつかの例では、表面性状の改変をもたらす。一般に、蒸着は、蒸着技術、塗装技術、グラフト技術などを使用して行うことができる。いくつかの具体例は、化学蒸着（ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンクまたはディップ法、ドクターブレードコーティング、パドルディスペンシング、フロースルーコーティング、エアロゾルプリンティング、スクリーンプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、インクジェットプリンティングなどを含む。
本明細書で使用されるように、「凹部」という語は、基材またはパターン化された樹脂の間隙領域によって少なくとも部分的に取り囲まれた面開口を有する基材またはパターン化された樹脂における個別の凹状形状（特徴部）を指す。凹部は、例えば、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の個数の頂点を有する）等を含む様々な形状のいずれかを表面における開口部に有することができる。表面と直交する凹部の断面は、湾曲、正方形、多角形、双曲線、円錐状、角度等であってもよい。例として、凹部は、ウェルまたは２つの相互接続されたウェルとすることができる。また、凹部は、隆起部、階段形状等のような、より複雑なアーキテクチャを有してもよい。
用語「各々」は、アイテムのコレクションに関して使用される場合、コレクションにおける個々のアイテムを識別することを意図するが、必ずしもコレクションにおけるあらゆるイテムを指すわけではない。例外は、明示的な開示または文脈が明らかにそうでないことを指示する場合に発生する可能性がある。
用語「エポキシ」（グリシジルまたはオキシラン基とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、
または
を指す。
本明細書で使用される「フローセル」という語は、反応を行うことができるチャンバ（すなわち、流路）と、チャンバに試薬を送達するための入口と、チャンバから試薬を除去するための出口とを有する容器を意味することを意図している。いくつかの例では、チャンバは、チャンバ内で起こる反応の検出を可能にする。例えば、チャンバ／流路は、凹部におけるアレイ、光学的に標識された分子などの光学的検出を可能にする１つ以上の透明な表面を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、「流路」は、液状試料を選択的に受容し得る、２つの結合された構成要素の間に規定される領域であり得る。いくつかの例では、流路は、パターン化された樹脂と蓋との間に画定されてもよく、したがって、パターン化された樹脂に画定された１つまたは複数の凹部と連通してもよい。
「官能化保持体構造」とは、本明細書に開示されるプライマーセットの１つがその表面に結合している剛性または半剛性材料から作製された小型本体を指す。本体は、例えば、球形、楕円形、微小球形、または規則的または不規則な寸法を有するかどうかにかかわらず他の認識された粒子形状として特徴付けられる形状を有することができる。本体に役立つ例示的な材料には、ガラス；アクリル酸、ポリスチレンなどのプラスチック、またはスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、またはポリテトラフルオロエチレン（Teflon（登録商標）、Chemours製）；アガロースまたはセファロースなどの多糖または架橋多糖；ナイロン；ニトロセルロース；ケイ素および改質ケイ素を含む樹脂；シリカまたはシリカベースの材料、炭素繊維、金属；無機ガラス；光ファイバ束、または様々な他のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環骨格中に１つ以上のヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素（窒素、酸素およびイオウを含むが、これらに限定されない）を含有する芳香族環または環系（すなわち、２つ以上の隣り合う原子を共有する２つ以上の縮合環）をいう。ヘテロアリールが環系である場合、系中の全ての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、５～１８リング部材を有することができる。
本明細書中で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を含む非芳香族環または環系を意味する。複素環は、融合、架橋またはスピロ連結様式で一緒に結合され得る。複素環は、環系中の少なくとも１つの環が芳香族でないことを条件として、任意の程度の飽和度を有することができる。環系において、ヘテロ原子は、非芳香環または芳香環のいずれかで存在し得る。ヘテロシクリル基は、３～２０リング部材（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む、環骨格を構成する原子の数）を有し得る。いくつかの例では、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳである。
本明細書で使用される「ヒドラジン」または「ヒドラジニル」という語は、－ＮＨＮＨ２基を指す。
本明細書で使用する「ヒドラゾン」または「ヒドラゾニル」という語は、本明細書で使用する場合、

基を指し、
ＲａおよびＲｂが、本明細書で定義するように、水素、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および５～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
本明細書中で使用される「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は－ＯＨ基を意味する。
本明細書で使用される「間隙領域」という語は、例えば、基材、パターン化された樹脂、または凹部を分離する他の保持体の面積を指す。例えば、間隙領域は、アレイの１つの凹部をアレイの別の凹部から分離することができる。互いに分離された２つの凹部は、離散的であってもよく、すなわち、互いに物理的接触を欠いていてもよい。多くの例では、間隙領域は連続的であるが、凹部は、例えば、他の点では連続的な表面に画定された複数の凹部の場合のように、不連続である。他の例では、間隙領域および特徴部（フィーチャ）は、例えば、それぞれの間隙領域によって分離された複数のトレンチの場合のように、離散的である。間隙領域によって提供される分離は、部分的または完全な分離であり得る。間隙領域は、表面に画定された凹部の表面材料とは異なる表面材料を有することができる。例えば、凹部は、その中にポリマーおよび第１のプライマーセットを有することができ、間隙領域は、その上にポリマーおよび第２のプライマーセットを有することができる。別の例では、アレイの凹部は、その中にビーズを有することができ、間隙領域は、その上にビーズを有さない。
本明細書中で使用される「ニトリルオキシド」は、Ｒａが本明細書中で定義される「ＲａＣ≡Ｎ＋Ｏ－」基を意味する。ニトリルオキシドを調製する例には、クロラミド－Ｔでの処理による、またはイミドイルクロリド［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］に対する塩基の作用による、またはヒドロキシルアミンとアルデヒドとの間の反応からの、アルドキシムからのｉｎ ｓｉｔｕ生成が含まれる。
本明細書で使用される「ニトロン」は、
基であり、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が、本明細書で定義されるＲａおよびＲｂ基のいずれかであり得る。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は、窒素を含む複素環塩基、糖、および１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在する水酸基を欠く糖である。窒素含有複素環塩基（すなわち、核酸塩基）は、プリン塩基またはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにそれらの修飾誘導体またはアナログが含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体またはアナログが含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子はピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合している。核酸類似体は、改変されたリン酸骨格、糖、または核酸塩基のいずれかを有し得る。核酸アナログの例には、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのユニバーサル塩基またはリン酸－糖骨格アナログが含まれる。
「パターン化された樹脂」は、その中に規定された凹部を有することができる任意のポリマーを指す。樹脂をパターン化するための樹脂および技術の具体例は、以下でさらに説明される。本明細書で開示されるいくつかの例では、パターン化された樹脂は、その上に自己集合するためのブロック共ポリマーのためのガイド鋳型として機能することができる。ポリマーを「ガイド鋳型」にする特性の具体例は、以下でさらに説明される。
本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、一本鎖核酸配列（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）として定義される。本明細書中で増幅プライマーと呼ばれるいくつかのプライマーは、鋳型増幅およびクラスター生成のための起点として役立つ。本明細書中で配列決定プライマーと呼ばれる他のプライマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成の開始点として役立つ。プライマーの５’末端は、ポリマーの官能基またはビーズ面とのカップリング反応を可能にするように修飾することができる。プライマー長は、任意の数の塩基長であってよく、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。例えば、配列決定プライマーは、１０～６０塩基、または２０～４０塩基の範囲の短いストランドである。
本明細書で使用される「スペーサー層」は、２つの成分を互いに結合する材料を指す。いくつかの例では、スペーサー層は、結合を助ける放射線吸収材料であってもよく、または結合を助ける放射線吸収材料と接してもよい。
「溶媒焼鈍」または「溶媒蒸気焼鈍」は、ポリマーの上に飽和蒸気（すなわち、溶媒雰囲気）を生成するために、ポリマー（例えば、フィルムまたは層の形成で）を密閉されたエンクロージャ内の過剰の溶媒に曝すことを含む。ポリマーフィルムまたは層は、室温（例えば、約１８℃～約２５℃）または高温で保持され得、これは、ポリマーを膨潤させ、そしてその鎖易動度を増加させる。
用語「基材」は、フローセルの種々の成分（例えば、ポリマー、プライマーなど）が添加され得る構造をいう。基材は、ウェハ、パネル、矩形板、ダイス、または好適な形態であってもよい。基材は、一般に剛性であり、水溶液に不溶である。基材は、凹部を改質するために使用されるか、または凹部に存在する薬品に対して不活性であってもよい。例えば、基材は、ポリマーを形成するため、プライマーを結合させるためなどに使用される化学物質に対して不活性であり得る。基材は、単層であってもよいし、多積層構造（例えば、保持体上に保持体およびパターン化された樹脂を含む）であってもよい。好適な基材の例を以下にさらに説明する。
「チオール」官能基は、－ＳＨを指す。
ここで用いられているように、「テトラジン」および「テトラジニル」という用語は、４つの窒素原子を含む６員ヘテロアリール基を指す。テトラジンは、任意に置換されていてもよい。
本明細書で使用される「テトラゾール」は、４個の窒素原子を含む５員複素環基を指す。テトラゾールは、任意に置換されていてもよい。
同時ペアエンド読み出しシーケンスのためのフローセル
本明細書中に開示されるフローセルの例は、基材；基材上の第１の領域に結合した第１のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセット；および基材上の第２の領域に結合した第２のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第２のプライマーセットを含む。
適切な基材の例としては、エポキシシロキサン、ガラスおよび修正機能性ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレン他の材料の共重合物、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ChemoursからのTEFLON（登録商標）など）、環状オレフィン/シクロオレフィンポリマー（ゼオン社からのZEONOR（登録商標）など）、ポリイミド等を含む）、ナイロン、セラミック／セラミック酸化物、シリカ、溶融シリカ、またはシリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、シリコンと修飾シリコン（例えば、ホウ素をドープしたｐ＋シリコン）、窒化シリコン（Ｓｉ３Ｎ４）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）または他の酸化タンタル（ＴａＯｘ）、酸化ハフニウム（ＨａＯ２）、カーボン、金属、無機ガラスなどなどが挙げられる。基材はまた、マルチ積層構造であってもよい。多重積層構造のいくつかの例としては、ガラスまたはケイ素が挙げられ、その表面には、酸化タンタルまたは別のセラミックス酸化物の塗装層がある。マルチ積層構造の他の例は、パターン化された樹脂をその上に有する下にある保持体（例えば、ガラスまたはケイ素）を含む。多層基材の他の例としては、シリコン－オン－絶縁材（ＳＯＩ）基材が挙げられる。
一実施形態では、基材は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の径、または最大約１０フィート（～３メートル）までの最大寸法を有する長方形の板またはパネルを有することができる。一実施形態では、基材は、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の径を有するウェハである。別の実施形態では、基材は、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの幅を有するダイスである。例示的な寸法が提供されたが、適切な寸法を有する基材が使用されてもよいことを理解されたい。別の例として、３００ミリメートルの円形ウェハよりも大きい表面積を有する長方形の保持体であるパネルを使用することができる。
フローセルのいくつかの例において、第１のプライマーセットは、基材上の第１の領域に結合され、第２のプライマーセットは、基材上の第２の領域に結合される。図１Ａ～図１Ｄは、別領域１４、１６に結合したプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、１２Ｂ、１２Ｂ’、１２Ｃ、１２Ｃ’、および１２Ｄ、１２Ｄ’の異なる形状を示す。
第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄの各々は、切断不可能な第１のプライマー１８または１８’および切断可能な第２のプライマー２０または２０’を含み；第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’および１２Ｄ’の各々は、切断可能な第１のプライマー１９および切断不可能な第２のプライマー２１を含む。
切断不可能な第１のプライマー１８または１８’および切断可能な第２のプライマー２０または２０’は、例えば、切断不可能な第１のプライマー１８または１８’が順方向増幅プライマーであり、切断可能な第２のプライマー２０または２０’が逆方向増幅プライマーである場合、または切断可能な第２のプライマー２０または２０’が順方向増幅プライマーであり、切断不可能な第１のプライマー１８または１８’が逆方向増幅プライマーである場合、オリゴ一対である。第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄの各例において、切断可能な第２のプライマー２０または２０’は切断部位２２を含むが、切断不可能な第１のプライマー１８または１８’は切断部位２２を含まない。
切断可能な第１のプライマー１９または１９’および切断不可能な第２のプライマー２１または２１’もまたオリゴペアであり、例えば、切断可能な第１のプライマー１９または１９’は順方向増幅プライマーであり、切断不可能な第２のプライマー２１または２１’は逆方向増幅プライマーであるか、または切断不可能な第２のプライマー２１または２１’は順方向増幅プライマーであり、切断可能な第１のプライマー１９または１９’は逆方向増幅プライマーである。第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’および１２Ｄ’の各例において、切断可能な第１のプライマー１９または１９’は、切断部位２２’または２３を含み、一方、切断不可能な第２のプライマー２１または２１’は、切断部位２２’または２３を含まない。
第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄの切断不可能な第１のプライマー１８または１８’および第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’および１２Ｄ’の切断可能な第１のプライマー１９または１９’は、切断可能な第１のプライマー１９または１９’がヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列に結合したリンカー２４’に組み込まれた切断部位２２’または２３を含むことを除いて、同じヌクレオチド配列（例えば、両方とも順方向増幅プライマーである）を有することを理解されたい。同様に、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄの切断可能な第２のプライマー２０または２０’および第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’および１２Ｄ’の切断不可能な第２のプライマー２１または２１’は、切断可能な第２のプライマー２０または２０’がヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列に結合したリンカー２４に組み込まれた切断部位２２を含むことを除いて、同じヌクレオチド配列を有する（例えば、両方とも逆増幅プライマーである）。
第１のプライマー１８および１９または１８’および１９’が順方向増幅プライマーである場合、第２のプライマー２０および２１または２０’および２１’は逆方向プライマーであり、逆もまた同様であることが理解されるべきである。
切断不可能なプライマー１８、２１または１８’、２１’の例としては、Ｐ５およびＰ７プライマーが挙げられ、その例は、例えば、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＩＳＥＱＴＭ、ＧＥＮＯＭＥＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、および他の機器プラットフォームなどのシーケンシングのためにIlluminaInc.が販売する市販のフローセルの表面上で使用される。Ｐ５およびＰ７プライマーは、捕捉および／または増幅目的のための普遍的な配列を有する。一例において、Ｐ５およびＰ７プライマーは、以下を含む：

Ｐ５：５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ（配列番号１）
Ｐ７：５’→３’
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ（配列番号２）

Ｐ５およびＰ７プライマーは、切断部位２２、２２’、２３を含まないので、切断不可能プライマー１８、２１または１８’、２１’である。任意の適切な普遍的配列が、切断不可能なプライマー１８、２１または１８’、２１’として使用され得ることが理解されるべきである。
切断可能なプライマー１９、２０または１９’、２０’の例には、それぞれの核酸配列（例えば、図１Ａおよび図１Ｃ）に、または切断可能なプライマー１９、２０または１９’、２０’をそれぞれの領域１６、１４に結合させるリンカー２４’、２４に組み込まれたそれぞれの切断部位２２、２２’、２３を有するＰ５およびＰ７（または他の普遍的配列）プライマーが含まれる（図１Ｂおよび図１Ｄ）。適切な切断部位２２、２２’、２３の例には、酵素的に切断可能な核酸塩基または化学的に切断可能な核酸塩基、修飾された核酸塩基、またはリンカー（例えば、核酸塩基間）が含まれる。酵素的に切断可能な核酸塩基は、グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼとの反応によって切断されやすくてもよい。切断可能な核酸塩基の１つの具体例は、デオキシウラシル（ｄＵ）であり、これは、ＵＳＥＲ酵素によって標的化され得る。例えば、ウラシル塩基は、Ｐ５プライマー（Ｐ５Ｕ）またはＰ７プライマー（Ｐ７Ｕ）の３’末端から７番目の塩基の位置に組み込むことができる。他の非塩基性部位も使用することができる。化学的に切断可能な核酸塩基、修飾された核酸塩基、またはリンカーの例には、ビシナルジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光切断可能な基、アリルＴ（アリル官能性を有するチミンヌクレオチド類似体）、アリルエーテル、またはアジド官能性エーテルが含まれる。
それぞれのプライマーセット１２Ａおよび１２Ａ’または１２Ｂおよび１２Ｂ’または１２Ｃおよび１２Ｃ’または１２Ｄおよび１２Ｄ’は、基材上のそれぞれの領域１４または１６に結合される。いくつかの例では、領域１４、１６は、同じ表面化学を有し、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して、領域１４上にプライマー１８、２０または１８’、２０’の１つのセットを、そして領域１６上にプライマー１９、２１または１９’、２１’の別のセットをグラフトし得る。他の例では、領域１４または１６は、それぞれのプライマー１８、２０または１８’、２０’または１９、２１または１９’、２１’と選択的に反応することができる様々な表面化学物質（例えば、官能基）を含む。これらの他の例では、第１の領域１４は第１の官能基を有し、第２の領域１６は第１の官能基とは異なった第２の官能基を有する。
前述のように、図１Ａ～図１Ｄは、別領域１４、１６に結合したプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、１２Ｂ、１２Ｂ’、１２Ｃ、１２Ｃ’、および１２Ｄ、１２Ｄ’の異なる構成を示す。より具体的には、図１Ａ～図１Ｄは、使用され得るプライマー１８、２０および１９、２１または１８’、２０’および１９’、２１’の異なる形状を示す。
図１Ａに示される例において、プライマーセット１２Ａおよび１２Ａ’のプライマー１８、２０および１９、２１は、例えば、リンカー２４、２４’なしで、領域１４および１６に直接結合される。領域１４は、プライマー１８、２０の５’末端に末端基を固定化することができる表面官能基を有していてもよい。同様に、領域１６は、プライマー１９、２１の５’末端に末端基を固定化することができる表面官能基を有することができる。一例では、領域１４とプライマー１８、２０との間の固定化化学（固定化ケミストリー）、および領域１６とプライマー１９、２１との間の固定化化学は、プライマー１８、２０または１９、２１が所望の領域１４または１６に選択的に結合するように異なっていてもよい。別の例では、固定化化学は、領域１４、１６およびそれぞれのプライマー１８、２０または１９、２１について同じであってもよく、一度に１つのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’をグラフトするために、パターン化技術が使用されてもよい。さらに別の例では、領域１４、１６を形成するために適用される材料は、それに予めグラフトされたそれぞれのプライマー１８、２０または１９、２１を有してもよく、したがって、固定化化学は、同じであっても異なっていてもよい。
この例では、固定化は、それぞれのプライマー１８および２０または１９および２１の５’末端におけるそれぞれの領域１４または１６への一点共有結合によるものであってもよい。領域１４、１６では、当該技術分野で公知の任意の適切な共有結合手段を使用することができる。使用され得る末端プライマーの例としては、アルキン末端プライマー、テトラジン末端プライマー、アジド末端プライマー、アミノ末端プライマー、エポキシまたはグリシジル末端プライマー、チオホスフェート末端プライマー、チオール末端プライマー、アルデヒド末端プライマー、ヒドラジン末端プライマー、ホスホラミダイト末端プライマー、およびトリアゾリンジオン末端プライマーが挙げられる。いくつかの具体例では、スクシンイミジル（ＮＨＳ）酸エステル末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面でアミンと反応させてもよく、アルデヒド末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面でヒドラジンと反応させてもよく、またはアルキン末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面でアジドと反応させてもよく、またはアジド末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面でアルキンまたはＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）させてもよく、またはアミノ末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面で活性化カルボキシレート基またはＮＨＳエステルと反応させてもよく、またはチオール末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面でアルキル化反応物（例えば、ヨードアセトアミンまたはマレイミド）と反応させてもよく、ホスホラミダイト末端プライマーは、領域１４および／または１６の表面でチオエーテルと反応させてもよく、またはビオチン修飾プライマーは、領域１４および／または１６の表面でストレプトアビジンと反応させてもよい。
また、図１Ａに示される例において、切断可能なプライマー２０、１９の各々の切断部位２２、２２’は、プライマー２０、１９の配列に組み込まれる。この例では、同じタイプの切断部位２２、２２’が、それぞれのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’の切断可能なプライマー２０、１９において使用される。例えば、切断部位２２、２２’はウラシル塩基であり、切断可能なプライマー２０、１９はＰ５ＵおよびＰ７Ｕである。この例では、オリゴペア１８、２０の切断不可能プライマー１８はＰ７であってもよく、オリゴペア１９、２１の切断不可能プライマー２１はＰ５であってもよい。したがって、この例では、第１のプライマーセット１２ＡはＰ７、Ｐ５Ｕを含み、第２のプライマーセット１２Ａ’はＰ５、Ｐ７Ｕを含む。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’は、反対側の線形化化学を有し、これは、増幅、クラスター生成、および線形化の後、順方向鋳型ストランドが１つの領域１４または１６上に形成されること、および反転ストランドが他の領域１６または１４上に形成されることを可能にする。
図１Ｂに示される例において、プライマーセット１２Ｂおよび１２Ｂ’のプライマー１８’、２０’および１９’、２１’は、例えば、リンカー２４、２４’を介して領域１４および１６に結合される。領域１４は、プライマー１８’、２０’の５’末端にリンカー２４を固定することができる表面官能基を有することができる。同様に、領域１６は、プライマー１９’、２１’の５’末端にリンカー２４’を固定することができる表面官能基を有することができる。一例では、領域１４およびリンカー２４のための固定化化学、ならびに領域１６およびリンカー２４’のための固定化化学は、プライマー１８’、２０’または１９’、２１’が所望の領域１４または１６に選択的にグラフトされるように、異なっていてもよい。別の例において、固定化化学は、領域１４、１６およびリンカー２４、２４’について同じであり得、そして本明細書中に開示される任意の適切な技術が、一度に１つのプライマーセット１２Ｂ、１２Ｂ’をグラフトするために使用され得る。さらに別の例では、領域１４、１６を形成するために適用される材料は、予めグラフトされたそれぞれのプライマー１８’、２０’および１９’、２１’を有していてもよく、したがって、固定化化学は、同じであっても異なっていてもよい。好適なリンカー２４、２４’の例としては、核酸リンカー（例えば、１０ヌクレオチド以下）または非核酸リンカー（例えば、ポリエチレングリコール鎖、アルキル基もしくは炭素鎖、ビシナルジオールを有する脂肪族リンカー、ペプチドリンカーなど）が挙げられ得る。核酸リンカーの例は、ポリＴスペーサーであるが、他のヌクレオチドもまた使用され得る。一実施形態では、スペーサーは、６Ｔ～１０Ｔスペーサーである。以下は、非核酸リンカー（ここで、Ｂは核酸塩基であり、「オリゴ」はプライマーである）を含むヌクレオチドのいくつかの例である：

図１Ｂに示される例において、プライマー１８’、１９’は、同じ配列および同じまたは異なるリンカー２４、２４’を有する。プライマー１８’は切断不可能であるが、プライマー１９’はリンカー２４’に組み込まれた切断部位２２’を含む。また、この例では、プライマー２０’、２１’は、同じ配列（例えば、Ｐ７）および同じまたは異なるリンカー２４、２４’を有する。プライマー２１’は切断不可能であり、プライマー２０’はリンカー２４に組み込まれた切断部位２２を含む。切断可能なプライマー２０’、１９’の各々のリンカー２４、２４’において、同じタイプの切断部位２２、２２’が使用される。例えば、切断部位２２、２２’は、核酸リンカー２４、２４’に組み込まれるウラシル塩基であってもよい。プライマーセット１２Ｂ、１２Ｂ’は、反対側の線形化化学を有し、これは、増幅、クラスター生成、および線形化の後、順方向鋳型ストランドが１つの領域１４または１６上に形成されること、および逆方向ストランドが他の領域１６または１４上に形成されることを可能にする。
図１Ｃに示される例は、異なるタイプの切断部位２２、２３が、それぞれのプライマーセット１２Ｃ、１２Ｃ’の切断可能プライマー２０、１９において使用されることを除いて、図１Ａに示される例と同様である。例として、２つの異なる酵素的切断部位を使用してもよく、２つの異なる化学的切断部位を使用してもよく、または１つの酵素的切断部位および１つの化学的切断部位を使用してもよい。それぞれの切断可能なプライマー２０、１９において使用され得る異なる切断部位２２、２３の例としては、ビシナルジオール、ウラシル、アリルエーテル、ジスルフィド、制限酵素部位、および８－オキソグアニンの任意の組み合わせが挙げられる。
図１Ｄに示される例は、異なるタイプの切断部位２２、２３が、それぞれのプライマーセット１２Ｄ、１２Ｄ’の切断可能なプライマー２０’、１９’に結合したリンカー２４、２４’において使用されることを除いて、図１Ｂに示される例と同様である。切断可能なプライマー２０、１９に結合したリンカー２４、２４’のそれぞれにおいて使用され得る異なる切断部位２２、２３の例としては、ビシナルジオール、ウラシル、アリルエーテル、ジスルフィド、制限酵素部位、および８－オキソグアニンの任意の組み合わせが挙げられる。
図１Ａ～図１Ｄに示される実施例のいずれにおいても、プライマー１８、２０および１９、２１または１８’、２０’および１９’、２１’の領域１４、１６への取り付け部材は、プライマー１８、２０および１９、２１または１８’、２０’および１９’、２１’の鋳型特定部位を、その同族鋳型へのアニーリングのために自由に残し、そしてプライマー伸長のために３’水酸基を自由に残す。
領域１４、１６は、異なるプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’が結合している基材上の異なる領域を表す。領域１４、１６は、異なった官能基の材料を含むことができる。いくつかの例では、様々な官能基は、基材の表面に導入された基材または官能基の表面官能基であるか、または基材上に堆積される別の構成要素（例えば、ポリマー層、ビーズなど）の官能基であってもよい。
いくつかの例では、領域１４、１６は化学的に同じであり、本明細書に開示される任意の技術を使用して、それぞれのセット１２Ａおよび１２Ａ’、または１２Ｂおよび１２Ｂ’、または１２Ｃおよび１２Ｃ’、または１２Ｄおよび１２Ｄ’のプライマー１８、２０および１９、２１、または１８’、２０’および１９’、２１’をそれぞれの領域１４、１６に順次結合させてもよい。
領域１４、１６が化学的に同じである一例では、領域１４、１６の両方が同じポリマー層を含む。ポリマー層は、液体および気体に対して透過性である半剛性ポリマー材料であってもよい。ポリマー層の例は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭなどのアクリルアミドコポリマーを含む。ＰＡＺＡＭおよびアクリルアミドコポリマーのいくつかの他の形態は、以下の構造（Ｉ）で表される：
ここで、
ＲＡは、アジド、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいヒドラゾン、置換されていてもよいヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群より選択され、
ＲＢは、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
ＲＣ、ＲＤおよびＲＥは、それぞれ独立して、Ｈおよび置換されていてもよいアルキルからなる群から選択され、
－（ＣＨ２）ｐ－のそれぞれを任意に置換することができ、
ｐは、１～５０の範囲の整数であり、
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは１～１００，０００の範囲の整数である。
当業者は、構造（Ｉ）における繰り返し「ｎ」および「ｍ」特徴の配置が代表的であり、モノマーサブユニットが、ポリマー構造中に任意の順序で存在し得る（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、またはそれらの組み合わせ）ことを認識する。
ＰＡＺＡＭの分子量は、約１０ｋＤａ～約１５００ｋＤａの範囲であってもよく、または具体例では、約３１２ｋＤａであってもよい。
いくつかの例では、ＰＡＺＡＭは直鎖状ポリマーである。いくつかの他の例では、ＰＡＺＡＭは、軽度に架橋されたポリマーである。
他の例では、ポリマー２６は、構造（Ｉ）の変形であってもよい。一例では、アクリルアミド単位は、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド

で置き換えることができる。本実施例では、式（Ｉ）中のアクリルアミド単位を

で置き換えることができ、ここで、ＲＤ、ＲＥおよびＲＦがそれぞれＨであり、ＲＧおよびＲＨがそれぞれメチル基である（アクリルアミドの場合のようにＨの代わりに）。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。別の例では、アクリルアミド単位に加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドを使用することができる。この実施形態では、構造（Ｉ）は、繰り返される「ｎ」および「ｍ」の特徴に加えて、
を含むことができ、ここで、ＲＤ、ＲＥおよびＲＦがそれぞれＨであり、ＲＧおよびＲＨがそれぞれメチル基であることを含むことができる。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。
別の例のポリマーとして、構造（Ｉ）における繰り返し「ｎ」特徴は、構造（ＩＩ）：
を有する複素環式アジド基を含むモノマーで置き換えられてもよく、ここで、Ｒ１はＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルであり；Ｒ２はＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルであり；Ｌは、炭素、酸素、および窒素からなる群から選択される２～２０原子を有する直鎖状鎖、ならびに鎖中の炭素および任意の窒素原子上の１０個の任意の置換基を含むリンカーであり；Ｅは、炭素、酸素、および窒素からなる群から選択される１～４個の原子、ならびに鎖中の炭素および任意の窒素原子上の任意の置換基を含む直鎖状鎖であり；Ａは、Ｎに結合したＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルを有するＮ置換アミドであり；およびＺは、窒素を含む複素環である。Ｚの例には、単一の環状構造または融合構造として存在する５～１０環状メンバー（ringmember）が含まれる。
さらに別の例として、ポリマーは、構造（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：

のそれぞれの繰り返し単位を含んでもよく、
ここで、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、それぞれ独立して、水素、任意に置換されたアルキルまたは任意に置換されたフェニルから選択され、各Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたフェニル、または任意に置換されたＣ７～Ｃ１４アラルキルから選択され、各Ｌ１およびＬ２は、独立して、任意に置換されたアルキレンリンカーまたは任意に置換されたヘテロアルキレンリンカーから選択される。
第１および第２のプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’と相互作用するように官能化されている限り、他の分子を使用してポリマー層を形成してもよいことを理解されたい。好適なポリマー層の他の例には、アガロースなどのコロイド構造；またはゼラチンなどのポリマーメッシュ構造；またはポリアクリルアミドポリマーおよびコポリマーなどの架橋高分子構造、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、またはＳＦＡのアジドール化版が含まれる。好適なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドおよびビニル基を含むアクリル酸またはアクリル酸から、または［２＋２］光環状付加反応を形成するモノマーから合成することができる。好適なポリマー層のさらに他の例には、アクリルアミドとアクリル酸塩との混合共ポリマーが含まれる。星形ポリマー、星形または星形ブロックポリマー、デンドリマーなどの分枝ポリマーも使用することができる。
他の例では、領域１４、１６は化学的に異なる。例えば、領域１４は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄのプライマー１８、２０または１８’、２０’を固定することができる表面官能基を有することができ、領域１６は、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’のプライマー１９、２１または１９’、２１’を固定することができる様々な表面官能基を有することができる。
領域１４、１６が化学的に異なっている１つの実施形態では、ブロック共ポリマーが使用される。この実施例では、ブロック共ポリマーは、２つの異なったブロックを含み、一方は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄのプライマー１８、２０または１８’、２０’に結合することができるプライマーグラフト官能基を有し、他方は、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’のプライマー１９、２１または１９’、２１’に結合することができるプライマーグラフト官能基を有する。プライマーグラフト化官能基の例は、アジド／アジド、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、アルデヒド、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、チオール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
化学的に別領域１４、１６の他の例には、金およびＰＡＺＡＭ、金およびアルミニウム、２つの異なる表面官能基を有するシラン（例えば、アジドおよびアミン）、金上のチオール自己集合単層、ならびにアルミニウムまたは酸化ハフニウム、ＳｉＯ２およびＴａ２Ｏ５、エポキシおよびＴａ２Ｏ５上のホスホネート自己集合単層、アジド基を含む第１のポリマー、ならびにアミン基、ＳｉＯ２および銅、またはエポキシおよび銅を含む第２のポリマーが含まれる。いくつかの例が提供されたが、化学的に別領域１４、１６の他の組み合わせが使用されてもよいことが理解されるべきである。
領域１４、１６はまた、異なる物理的構成を有してもよい。図２～図６Ｂは、これらの構造の異なる例を示す。これらの例では、基材２６は、ガラス、シリコンなどのような単一の層／材料として示されている。しかしながら、これらの例示的な構成のいずれかと共に多層基材を使用できることを理解されたい。例えば、これらの例のいずれかは、保持体上に形成された保持体およびパターン化された樹脂を含むことができる。
図２は、領域１４、１６が基材２６の表面Ｓの様々な領域に配置されている例を示している。
図２に図示例を作製するための１つの例示的な方法が、図２６Ａ～図２６Ｈに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、この説明を通して言及されているが、明確にするために示されているのではない。
図２６Ａに示されるように、第１の官能化層６０が基材２６上に適用される。第１の官能化層６０は、ポリマー（ＰＡＺＡＭ）、シラン、金属（金、アルミなど）、または第１のプライマーの組１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄに結合することができる官能基を有する任意の他の物質であってもよい。第１の官能化層６０は、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して堆積されてもよい。
使用される第１の官能化層６０に応じて、基材２６は、シラン化またはプラズマアッシングを使用して活性化されて、第１の官能化層６０と反応することができる表面基を生成することができる。シラン化およびプラズマアッシングの例は、図１３Ａを参照してより詳細に説明される。次いで、第１の官能化層６０は、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して堆積されてもよい。使用される材料に応じて、第１の官能化層６０を硬化させることもできる。
図２６Ｂおよび図２６Ｃでは、次に、第１の官能化層６０をパターン化して、フォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化領域（領域１４）を形成する。一例では、フォトレジスト６２はネガ型フォトレジストである（露出領域は不溶性になる）。適切なネガ型フォトレジストの例には、エポキシ系ＳＵ－８フォトレジスト（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能）が含まれる。フォトレジスト６２は、第１の官能化層６０に適用され、特定の波長の光に選択的に露光されて不溶性部分（６２で示す）を形成し、現像液溶液に曝して可溶性部分を除去する。別の例では、フォトレジスト６２はポジ型フォトレジストである（露光領域は可溶性になる）。適切なポジ型フォトレジストの例としては、ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴ（登録商標）Ｓ１８００シリーズまたはＡＺ（登録商標）１５００シリーズが挙げられ、これらは両方ともＭｉｃｒｏＣｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能である。フォトレジスト６２を基材２６に適用し、ある波長の光に選択的に露光して可溶性領域を形成し、現像液溶液に曝して可溶性部分を除去し、不溶性領域（６２で示す）を残す。他の例では、フォトレジスト６２は、該領域（例えば、６２）を形成するためにパターン化されたナノインプリントリソグラフィ樹脂で置き換えることができる。
図２６Ｃに示すように、次に、第１の官能化層６０の露出部分（例えば、フォトレジスト６２によって覆われていない部分）を、例えば、エッチングまたは別の適切な技法によって除去することができる。
図２６Ｄに示すように、次いで、任意の好適な蒸着技術を用いて、フォトレジスト６２上及び基材２６の一部（例えば、露出表面Ｓ）上に、第２の官能化層６４を適用する。使用する材料に応じて、第２の官能化層６４も硬化させることができる。
次に、図２６Ｅに示すように、フォトレジスト６２をリフトオフして、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去することができる。
図２６Ｆおよび図２６Ｇでは、第２の官能化層６４の一部が除去される。この部分を除去するために、第２のフォトレジスト６２’を適用し、露光し、現像して、不溶性領域（６２’で示す）が第１の官能化領域１４と、ｉ）第１の官能化領域１４に隣接し、ｉｉ）第２の官能化領域１６になる第２の官能化層６４の望ましい部分とを覆うようにする。フォトレジスト６２’が形成されると、第２の官能化層６４の露出部分（例えば、フォトレジスト６２’によって覆われていない部分）を、例えば、エッチングまたは他の適切な技術によって除去することができる。
次に、図２６Ｈに示すように、フォトレジスト６２’をリフトオフして、第１および第２の官能化領域１４、１６を露出させる。
いくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図２６Ａ～図２６Ｈには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図２６Ａ～図２６Ｈには示さず）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２６Ａで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２６Ｈで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２６Ｄで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２６Ｈで）グラフトされ得る。
この方法の間にグラフト化が行われる場合、グラフト化は、フロースルー析出（例えば、一時的に結合された蓋を使用して）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシングによって、またはプライマー１８、２０もしくは１８’、２０’を領域１４に結合させるか、またはプライマー１９、２１もしくは１９’、２１’を領域１６に結合させる別の好適な方法によって達成され得る。これらの例示的な技術の各々は、プライマー溶液または混合物を利用し得、これは、プライマー１８、２０または１８’、２０’、１９、２１または１９’、２１’水、緩衝液、および触媒を含み得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、基材２６に対する親和性を有さない。
図２６Ａ～図２６Ｈには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。例えば、領域１４は金であり、第１のＳＡＭは、プライマー１８、２０または１８’、２０’に結合することができる金およびアジド基に結合することができるチオール基を含む。別の例では、領域１６は、酸化ハフニウムまたは酸化アルミニウムであり、第２のＳＡＭは、酸化ハフニウムまたは酸化アルミニウムに結合することができるホスホネート基と、プライマー１９、２１または１９’、２１’に結合することができるアミン基とを含む。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図２に図示例を作製するための別の例示的な方法が、図２７Ａ～図２７Ｆに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、本明細書を通して言及されているが、明確にするために示されているのではない。
図２７Ａに示すように、第１の基材部６６が露出したままになるように、第１のフォトレジスト６２が基材２６上に適用される。この例では、フォトレジスト６２は、ポジ型フォトレジスト（露光領域が可溶性になる）またはネガ型フォトレジスト（露光領域が不溶性になる）とすることができる。フォトレジスト６２はまた、領域（例えば、６２）を形成するためにパターン化されるナノインプリントリソグラフィ樹脂で置き換えられてもよい。
図２７Ｂに示されるように、第１の官能化層６０は、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して、フォトレジスト６２上および第１の基材部６６上に堆積されてもよい。場合によっては、第１の官能化層６０を硬化させることもできる。
次に、図２７Ｃに示すように、フォトレジスト６２をリフトオフして、その上の第１の官能化層６０のいずれかを除去することができる。これにより、基材面Ｓに形成された範囲１４が残る。
第２のフォトレジスト６２’を適用し、露光し、現像して、不溶分領域（６２’で示す）が、第１の官能化領域１４に近接する第２の基材部６８を除いて、第１の官能化領域１４および基材２６を覆うようにする。
図２７Ｅに示すように、次に、任意の適当な堆積技術を用いて、場合によっては硬化させて、フォトレジスト６２’上及び第２の基材部６８上に、第２の官能化層６４を適用する。
次に、図２７Ｆに示すように、フォトレジスト６２’をリフトオフして、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去することができる。これにより、第１および第２の官能化領域１４、１６が露出される。
いくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図２７Ａ～図２７Ｆには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図２７Ａ～図２７Ｆには示されていない）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２７Ｂまたは２７Ｃで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２７Ｆで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２７Ｅで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２７Ｆで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、基材２６に対する親和性を有さない。
図２７Ａ～図２７Ｆには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図２に示される例を作製するためのさらに別の例示的な方法が、図４１Ａ～図４１Ｇに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、この説明を通して言及されているが、明確にするために示されているのではない。
基材２６は、本明細書に開示される基材の任意の例であってもよい。図示されていないが、基材は、保持体上のパターン化されていない樹脂（例えば、ガラス保持体上のナノインプリントリソグラフィ樹脂、または本明細書で説明される樹脂５４および保持体５２の任意の他の例、「ビーズベースフローセル」の部を参照されたい）を含む多層基材であってもよいことを理解されたい。
図４１Aに示すように、本実施例では、基材２６上に犠牲金属層９８を適用する。例えば、多層基材のナノインプリントリソグラフィ樹脂／レジストは、酸素プラズマに曝され、次いで、犠牲金属層９８は、任意の好適な金属析出技術を用いて堆積されてもよい。例えば、犠牲金属層９８は、スパッタ法を用いて堆積される。犠牲金属層９８の例は、アルミまたは銅を含み、層９８は、約１０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の厚さを有することができる。
図４１Ｂに示されるように、レジストが犠牲金属層９８に適用され、その中にマルチレベル（複数の高さ）またはマルチ深さ（複数の深さ）を有する凹部を画定するようにパターン化される。パターン化された樹脂は符号５４’で示されている。この実施形態では、樹脂は、任意のナノインプリントリソグラフィ樹脂とすることができる。一例では、樹脂は、スピンコーティングされ、軟ベークされ、次いでスタンプされ、硬化されて（例えば、紫外線硬化を使用して）、深い部分７０と、部分的にパターン化された樹脂５４’の段差部分７４によって画定される浅い部分７２とを含むマルチレベルまたはマルチ深さの凹部を画定する。
次いで、ウェットエッチングまたはドライエッチングを使用して、深い部分７０の下にある基材２６の一部分１００（例えば、多層基材のパターン化されていない樹脂またはガラスの一部分）および浅い部分７２の下にある犠牲金属層９８の一部分１０２を露出させることができる。露出した部分を図４１Ｃに示す。ウェットエッチングの一例では、銅犠牲金属層９８を除去するために、ＦｅＣｌ３を使用することができる。ウェットエッチングの別の実施形態では、アルミニウム犠牲金属層９８を除去するためにＫＯＨを使用することができる。ドライエッチングの一例では、まず、パターン化された樹脂５４’の残留分を除去するために酸素プラズマが使用され、次に、アルミニウム犠牲金属層９８をエッチングするために、Ｃｌ２プラズマとＢＣｌ３プラズマの組合せが使用される。酸素プラズマを再び使用して、露出部分１００および１０２を洗浄することができる。この例では、深さＤ１（例えば、浅い部分７２の深さ）およびＤ２（例えば、深い部分７０の底部から段差部分７４の頂部まで）、ならびに犠牲金属層９８の厚さＤ３は、部分１００および１０２を露出させるために、エッチング中に材料５４’および９８のそれぞれの所望の厚さが除去されるように、同一または類似（例えば、互いの１ｎｍ以内）であってもよい。
図４１Ｄに示されるように、第１の官能化層６０は、残りのパターン化された樹脂５４’、基材２６の露出部分１００、および犠牲金属層９８の露出部分１０２上に堆積されてもよい。第１の官能化層６０は、任意の実施例であってもよく、本明細書に記載される任意の技術を使用して堆積されてもよい。場合によっては、第１の官能化層６０も硬化される。
図４１Ｅでは、基材２６の別の部分１０４を露出させるために、ウェットエッチングを使用して、第１の官能化層６０の一部および犠牲金属層９８の別の部分を選択的に除去する。ウェットエッチングは、本明細書に記載されるように実行されてもよい。使用されるエッチャントは、犠牲金属層９８をエッチングすることができ、したがって、第１の官能化層６０を持ち上げることができる。
図４１Ｆに示されるように、次に、第２の官能化層６４が、露出部分１０４上および第１の官能化層６０上に適用される。第２の官能化層６４には、任意の適切な堆積技術を使用することができる。本明細書に開示される例示的な方法のいずれにおいても、堆積が高イオン強度下（例えば、１０×ＰＢＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの存在下）で行われる場合、第２の官能化層６４は、第１の官能化層６０上に析出しないか、または第１の官能化層６０に結合しない。したがって、第２の官能化層６４は、第１の官能化層６０に混入せず、領域１６を残す。
次に、図４１Ｇに示すように、残りのパターン化された樹脂５４をリフトオフして、その上の第１の官能化層６０のいずれかを除去することができる。このリフトオフプロセスは、超音波処理を用いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、またはアセトン中で、またはＮＭＰ（Ｎ－メチル－２－ピロリドン）ベースのストリッパを用いて行うことができる。次いで、残りの犠牲金属層９８を露出させ、本明細書に記載のようにウェットエッチングを使用して除去することができる。部分的には、犠牲金属層９８が領域１４、１６の下方に存在しないので、領域１４、１６は、ウェットエッチング後に基材面上にそのまま残る。
いくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図４１Ａ～図４１Ｇには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図４１Ａ～図４１Ｇには示さず）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後に（例えば、図４１Ｄで）グラフトされ得る。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図４１Ｇで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図４１Ｆで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図４１Ｇで）グラフトされ得る。
この方法の間にグラフト化が行われる場合、グラフト化は、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用して）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシングによって、またはプライマー１８、２０もしくは１８’、２０’を領域１４に結合させるか、またはプライマー１９、２１もしくは１９’、２１’を領域１６に結合させる別の好適な方法によって達成され得る。これらの例示的な技術の各々は、プライマー溶液または混合物を利用し得、これは、プライマー１８、２０または１８’、２０’、１９、２１または１９’、２１’水、緩衝液、および触媒を含み得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、基材２６に対する親和性を有さない。
図２に図示例を作製するためのさらに別の例示的な方法が、図４２Ａ～図４２Ｈに示される。ここでも、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、本明細書全体を通して言及されているが、明確にするために示されていない。
基材２６は、本明細書に開示される基材の任意の例であってもよい。図４１Ａ～図４１Ｇで説明した実施形態と同様に、基材は、保持体上にパターン化されていない樹脂を含む多層基材であってもよい。
図４２Ａに示すように、本実施例では、基材２６上に犠牲金属層９８を適用する。犠牲金属層９８は、例示的な物質のいずれであってもよく、図４１Ａに関して説明された例のいずれかによって堆積されてもよい。
図４２Ｂに示されるように、レジストが犠牲金属層９８に適用され、その中にマルチレベルまたはマルチ深さの凹部を画定するようにパターン化される。パターン化された樹脂は符号５４’で示されている。この実施形態では、樹脂は、任意のナノインプリントリソグラフィ樹脂とすることができる。一例では、樹脂は、スピンコーティングされ、軟ベークされ、次いでスタンプされ、硬化されて（例えば、紫外線硬化を使用して）、深い部分７０と、部分的にパターン化された樹脂５４’の段差部分７４によって画定される浅い部分７２とを含むマルチレベルまたはマルチ深さの凹部を画定する。
次いで、ウェットエッチングまたはドライエッチングを使用して、深い部分７０の下にある基材２６の一部分１００（例えば、多層基材のパターン化されていない樹脂の一部分）および浅い部分７２の下にある犠牲金属層９８の一部分１０２を露出させることができる。露出部分１００および１０２は、図４２Ｃに示される。ウェットエッチングまたはドライエッチングは、図４１Ｃを参照して説明したように実行することができる。
図４２Ｄに示すように、第１の官能化層６０は、残りのパターン化された樹脂５４’、基材２６の露出部分１００、および犠牲金属層９８の露出部分１０２上に堆積させることができる。第１の官能化層６０は、任意の実施例であってもよく、本明細書に記載される任意の技術を使用して堆積されてもよい。場合によっては、第１の官能化層６０を硬化させることもできる。
図４２Ｅおよび図４２Ｆでは、次に、第１の官能化層６０をパターン化して、フォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化領域（領域１４）を形成する。この例では、フォトレジスト６２はネガ型フォトレジストである。フォトレジスト６２は、第１の官能化層６０に適用され、特定の波長の光に選択的に露光されて不溶性部分を形成し、現像液溶液に露出されて可溶性部分を除去することができる。残りのフォトレジスト６２は、深い部分７０における部分１００上にある第１の官能化層６０の部分上に配置される。
図４２Ｆに示すように、次に、第１の官能化層６０の露出部分（例えば、フォトレジスト６２によって覆われていない部分）を、例えば、エッチングまたは別の適切な技法によって除去することができる。このエッチングプロセス（例えば、酸素プラズマ）はまた、パターン化された樹脂５４’の一部およびフォトレジスト６２の一部を除去する。別のエッチング工程では、浅い部分７２（図４２Ｂ参照）の下にあった犠牲金属層９８が除去される。この例では、図４１Ｃを参照して説明したようなウェットエッチングまたはドライエッチングを使用することができる。この工程は、基材２６の他の一部１０４を露出させる。
図４２Ｇに示すように、次に、任意の適当な堆積技術を用いて、樹脂５４’、フォトレジスト６２、及び基材２６の露出部分１０４の露出部分に第２の官能化層６４を適用する。一実施例では、第２の官能化層６４は、フォトレジスト６２上に堆積されてもよいが、フォトレジスト６２が持ち上げられると、フォトレジスト６２とともに除去されてもよい。
図４２Ｈに示されるように、残りのパターン化された樹脂５４’およびフォトレジスト６２は、次いで、リフトオフされ得、それは、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去する。このリフトオフプロセスは、超音波処理を用いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、またはアセトン中で、またはメチルピロリドン（Ｎ－メチル－２－ピロリドン）ベースのストリッパを用いて行うことができる。次いで、残りの犠牲金属層９８を露出させ、本明細書に記載のようにウェットエッチングを使用して除去することができる。部分的には、犠牲金属層９８が領域１４、１６の下方に存在しないので、領域１４、１６は、ウェットエッチング後に基材面上にそのまま残る。
いくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図４２Ａ～図４２Ｈには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図４２Ａ～図４２Ｈには示さず）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後に（例えば、図４２Ｄで）グラフトされ得る。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図４２Ｈで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図４２Ｇで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図４２Ｈで）グラフトされ得る。
この方法の間にグラフト化が行われる場合、グラフト化は、フロースルー析出（例えば、一時的に結合された蓋を使用して）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシングによって、またはプライマー１８、２０もしくは１８’、２０’を領域１４に結合させるか、またはプライマー１９、２１もしくは１９’、２１’を領域１６に結合させる別の好適な方法によって達成され得る。これらの例示的な技術の各々は、プライマー溶液または混合物を利用し得、これは、プライマー１８、２０または１８’、２０’、１９、２１または１９’、２１’水、緩衝液、および触媒を含み得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、基材２６に対する親和性を有さない。
図２に示す例示的な領域１４、１６は、マイクロコンタクトプリンティングまたはインクジェットプリンティングなどの直接印刷技術を使用して形成することもできる。これらの方法は、約１μｍ～約５０μｍなどのミクロンスケールで領域を生成することが望ましい場合に特に好適であり得る。
図２に示される実施例では、基材表面Ｓを横切って複数セットの分離された領域１４、１６をアレイ状に形成し得ることが理解される。分離されたセットにおける領域１４、１６が隣り合っていれば、多種多様なレイアウトを用いることができる。
図３Ａ～図６Ｂは、領域１４、１６の少なくとも一方が基材２６に画定された凹部２８に位置する様々な例を示す。凹部２８は、単層基材（例えば、基材２６）で形成されてもよいし、多層基材の最表層で形成されてもよい。
凹部２８は、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス加工技術、成形技術、マイクロエッチング技術などの任意の適切な技術を使用して形成することができる。
図３Ａ～図６Ｂの各々には単一の凹部２８が示されているが、フローセルは、間隙領域３０によって分離された複数の凹部２８を含むことができ、凹部２８の各々は、第１の部分に位置する第１の領域１４と、第２の部分に位置する第２の領域１６とを含むことを理解されたい。なおさらに、本明細書に開示される例のいくつかは、異なるサイズを有する凹部２８Ａおよび２８Ｂ（例えば、図１１Ｃを参照のこと）、または相互接続されるが異なるサイズを有する２つの部分３４、３４’を含む凹部２８Ｃ（例えば、図１１Ｄを参照のこと）を含む。凹部２８に関する以下の説明は、本明細書に開示される凹部２８、２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃの任意の例に適用可能であることを理解されたい。
規則的パターン、繰り返しのパターン、および非規則的パターンを含む、凹部２８の多くの異なるレイアウトを想定することができる。例えば、凹部２８は、密にパッキングし、濃度を向上させるために、六角形の格子状に配置されている。他のレイアウトは、例えば、直線（すなわち、矩形）レイアウト（図２４参照）、三角形レイアウトなどを含むことができる。いくつかの例では、レイアウトまたはパターンは、行および列にある凹部２８のｘ－ｙフォーマットとすることができる。いくつかの他の例では、レイアウトまたはパターンは、凹部２８および／または間隙領域３０の繰り返し配列であってもよい。さらに他の例では、レイアウトまたはパターンは、凹部２８および／または間隙領域３０のランダムな配列であってもよい。パターンは、ストライプ、スワール、線、三角形、長方形、円、弧、チェック、プライド、対角線、矢印、正方形、および／またはクロスハッチを含むことができる。
レイアウトまたはパターンは、定義された領域における凹部２８の密度（すなわち、凹部２８の数）に関して特徴付けられてもよい。例えば、凹部２８は、約２００万／ｍｍ２の密度で存在してもよい。密度は、例えば、少なくとも約１００／ｍｍ２、少なくとも約１，０００／ｍｍ２、少なくとも約１０万／ｍｍ２、少なくとも約１００万／ｍｍ２、少なくとも約２００万／ｍｍ２、少なくとも約５００万／ｍｍ２、少なくとも約１０００万／ｍｍ２、少なくとも約５０００万／ｍｍ２、またはそれ以上の密度を含む様々な密度に調整することができる。代替的に又は追加的に、密度は、約５０００万／ｍｍ２以下、約１０００万／ｍｍ２以下、約５００万／ｍｍ２以下、約２００万／ｍｍ２以下、約１００万／ｍｍ２以下、約１０万／ｍｍ２以下、約１０００／ｍｍ２以下、約１００／ｍｍ２以下に調整することができる。さらに、凹部２８の密度は、上記の範囲から選択された、下側の値の１つと上側の値の１つとの間とすることができることを理解されたい。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満だけ分離された凹部２８を有することを特徴とすることができ、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍ（１０００ｎｍ）だけ分離された凹部２８を有することを特徴とすることができ、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離された凹部２８を有することを特徴とすることができる。例示的な密度が提供されたが、任意の好適な密度を有する基材が使用されてもよいことを理解されたい。
凹部２８のレイアウトまたはパターンは、平均ピッチ、すなわち、凹部２８の中心から隣接する凹部２８の中心までの間隔（中心間間隔）、または１つの凹部２８の縁から隣接する凹部２８の縁までの間隔（縁から縁までの間隔）に関して特徴付けられてもよいし、代替的に特徴付けられてもよい。パターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように規則的であってもよく、またはパターンは、変動係数が比較的大きくなり得る非規則的であってもよい。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、少なくとも約１０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。あるいは、またはさらに、平均ピッチは、例えば、多くとも約１００μｍ、約１０μｍ、約５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ、またはそれ以下であり得る。凹部２８の特定のパターンの平均ピッチは、下側の値のうちの１つと、上記の範囲から選択された上側の値のうちの１つとの間とすることができる。一例では、凹部２８は、約１．５μｍのピッチ（中心間間隔）を有する。例示的な平均ピッチ値が提供されたが、他の平均ピッチ値が使用されてもよいことが理解されるべきである。
図３Ａ～図６Ｂに図示例では、凹部２８はウェルである。ウェルは、マイクロウェルまたはナノウェルであってもよい。各ウェルのサイズは、その体積、ウェル開口面積、深さ、および／または直径によって特徴付けることができる。
各ウェルは、液体を閉じ込めることができる任意の体積を有することができる。最小限または最大限の体積は、例えば、処理量（例えば、多重性）、分解能、分析物組成物、またはフローセルの下流での使用に予想される分析物反応性に適応するように選択することができる。例えば、体積は、少なくとも約１×１０－３μｍ３、少なくとも約１×１０－２μｍ３、少なくとも約０．１μｍ３、少なくとも約１μｍ３、少なくとも約１０μｍ３、少なくとも約１００μｍ３、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、体積は、多くとも約１×１０４μｍ３、多くとも約１×１０３μｍ３、多くとも約１００μｍ３、多くとも約１０μｍ３、多くとも約１μｍ３、多くとも約０．１μｍ３、またはそれ以下であり得る。領域１４、１６は、ウェルの体積の全部または一部を満たすことができることを理解されたい。例えば、個々のウェル中のポリマー層の体積は、上記で特定した値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。
表面上の各ウェル開口部によって占められる面積は、ウェル体積について上述したものと同様の基準に基づいて選択することができる。例えば、表面上の各ウェル開口部の表面積は、少なくとも約１×１０－３μｍ２、少なくとも約１×１０－２μｍ２、少なくとも約０．１μｍ２、少なくとも約１μｍ２、少なくとも約１０μｍ２、少なくとも約１００μｍ２、またはそれ以上とすることができる。代替的に又は追加的に、面積は、最大約１×１０３μｍ２、最大約１００μｍ２、最大約１０μｍ２、最大約１μｍ２、最大約０．１μｍ２、約１×１０－２μｍ２、又はそれ未満であってもよい。各ウェル開口部によって占められる面積は、上記で特定された値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。
各ウェル（または任意の他の種類の凹部２８）の深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、深さは、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．１μｍ、またはそれ以下であり得る。各ウェル（または他の凹部２８）の深さは、上記で特定された値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。
いくつかの例では、各ウェル（または他の凹部２８）の直径は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、直径は、多くとも約１×１０３μｍ、多くとも約１００μｍ、多くとも約１０μｍ、多くとも約１μｍ、多くとも約０．５μｍ、多くとも約０．１μｍ、またはそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。各ウェル（または他の凹部２８）の直径は、上記で特定された値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。
凹部２８がトレンチである場合（例えば、図３４Ｈを参照）、トレンチおよび間隙領域の両方は、直線構成を有することができる。各トレンチの深さは、少なくとも約０．０２μｍ（２０ｎｍ）、少なくとも約０．１μｍ（１００ｎｍ）、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、深さは、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．１μｍ、またはそれ以下であり得る。各トレンチの深さは、上記で指定された値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。
いくつかの例では、各トレンチの幅は、少なくとも約０．０２μｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、幅は、多くとも約１×１０３μｍ、多くとも約１００μｍ、多くとも約１０μｍ、多くとも約１μｍ、多くとも約０．５μｍ、多くとも約０．１μｍ、またはそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。各トレンチの幅は、上記で指定された値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。
図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ、領域１４、１６が凹部２８の異なる領域に位置する例の断面図および上面図を示す。この例では、領域１４、１６は、凹部２８において互いに直接隣接している。
図３Ａおよび図３Ｂに図示例を作製するための１つの例示的な方法が、図２８Ａから図２８Ｇに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、本明細書を通して言及されているが、明確にするために示されていない。さらに、図３Ａおよび図３Ｂは、単一層基材２６に画定された凹部２８を示し、一方、例示的な方法は、多層基材の保持体５２上のパターン化された樹脂５４’に画定された凹部２８を示す。この方法は、単層基材で使用されてもよいことを理解されたい。
この実施形態では、多層基材は、保持体５２上に（パターン化された）樹脂５４’を含む。樹脂５４（例えば、「ビーズベースフローセル」の部を参照）、保持体５２、および本明細書に記載の樹脂５４をパターン化するための方法の任意の例を使用することができる。
図２８Ａに示すように、パターン化された樹脂５４’に形成された凹部２８は、隣接する凹部２８を互いに分離する間隙領域３０に隣接している。図２８Ｂに示されるように、第１の官能化層６０は、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して、パターン化された樹脂５４’上に適用される（例えば、堆積されるか、または堆積され、硬化される）。
図２８Ｃおよび図２８Ｄでは、次に、第１の官能化層６０をパターン化して、フォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化領域（領域１４）を形成する。この例では、フォトレジスト６２は、ネガ型フォトレジスト（露光領域が不溶性になる）またはポジ型フォトレジスト（露光領域が可溶性になる）とすることができる。フォトレジスト６２は、第１の官能化層６０に適用され、ある波長の光に選択的に露光されて不溶性または可溶性部分を形成し、現像液溶液に露出されて可溶性部分を除去する。他の例では、フォトレジスト６２は、ナノインプリントリソグラフィ樹脂で置き換えることができる。図２８Ｃに示すように、この例では、フォトレジスト６２は、凹部２８の第１の部分７６上にある第１の官能化層６０の部分（例えば、領域１４になる層６０の部分）を覆い、凹部２８の第２の部分７８上にある第１の官能化層６０の第２の部分を覆わない。
図２８Ｄに示すように、次に、第１の官能化層６０の露出部分（例えば、フォトレジスト６２によって覆われていない部分）を、例えば、エッチングまたは別の適切な技法によって除去することができる。これにより、凹部２８の第２の部分７８および間隙領域３０が露出する。
図２８Ｅに示すように、第２の官能化層６４は、次に、任意の好適な結合技術を用いて（物質に応じて硬化を伴って、または伴わずに）、フォトレジスト６２上に、および凹部２８の第２の部分７８上および間隙領域３０上を含む、基材２６の部分（例えば、露出表面Ｓ）上に適用される。
次に、図２８Ｆに示すように、フォトレジスト６２をリフトオフして、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去することができる。
図２８Ｇでは、第２の官能化層６４の一部が除去される。特に、第２の官能化層６４は、間隙領域３０から除去される。この例では、除去することは、第２の官能化層６４（および存在し得る第１の官能化層６０のいずれか）を間隙領域３０から研磨することを含む。
研磨工程は、緩やかな化学スラリー液（例えば、研磨剤、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、および／または分散剤を含む）を用いて実施することができ、これは、下にある基材２６またはパターン化された樹脂５４’にこれらの領域で有害な影響を及ぼすことなく、間隙領域３０から第２の官能化層６４（および存在し得る第１の官能化層６０のいずれか）を除去することができる。あるいは、研磨粒子を含まない溶液で研磨を行ってもよい。
化学スラリー液は、間隙領域３０の表面を研磨するために化学機械研磨系で使用することができる。研磨ヘッド／パッドまたは他の研磨ツールは、凹部２８における領域１４、１６を少なくとも実質的に無傷のままにしながら、間隙領域３０から第２の官能化層６４（および存在し得る第１の官能化層６０のいずれか）を研磨することができる。一例として、研磨ヘッドは、Strasbaugh ViPRRII研磨ヘッドであってもよい。
洗浄および乾燥工程は、研磨後に実行されてもよい。洗浄工程は、水浴および音波処理を利用してもよい。恒温水槽は、約２２℃～約３０℃の範囲の比較的低い温度に維持することができる。乾燥工程は、スピン乾燥、または別の適切な技術による乾燥を含み得る。
いくつかの例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図２８Ａ～図２８Ｇには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされてもよく、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図２８Ａ～図２８Ｇには示さず）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２８Ｂで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２８Ｇで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２８Ｅで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２８Ｇで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、パターン化された樹脂５４’に対する親和性を有さない。
図２８Ａ～図２８Ｇには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図３Ａおよび図３Ｂに図示例を作製するための別の例示的な方法が、図２９Ａから図２９Ｈに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、本明細書を通して言及されているが、明確にするために示されていない。さらに、図３Ａおよび図３Ｂは、単一層基材２６に画定された凹部２８を示し、一方、例示的な方法は、多層基材の保持体５２上のパターン化された樹脂５４’に画定された凹部２８’を示す。この方法は、単層基材で使用されてもよいことを理解されたい。
この実施形態では、多層基材は、保持体５２上に（パターン化された）樹脂５４’を含む。図２９Ａに示すように、パターン化された樹脂５４’に形成された凹部２８’は、隣接する凹部２８’を互いに分離する間隙領域３０に隣接している。凹部２８’は、深い部分７０と、パターン化された樹脂５４’の段差部分７４によって部分的に画定される浅い部分７２とを含む、マルチレベルまたはマルチ深さの凹部である。
この実施形態では、犠牲層が凹部２８’における深部７０を少なくとも部分的に充填するように、犠牲層がパターン化された樹脂５４’上に適用される。例示的な犠牲層７６は、該方法で使用される樹脂５４’およびフォトレジスト６２とは異なったエッチング率を有する任意の物質である。適切な犠牲層材料７６の例には、シリコン、アルミニウム、ネガティブまたは正フォトレジスト、銅などが含まれる。これらの材料は、本明細書中に開示される任意の適切な技術を使用して堆積され得る。図示されていないが、深部７０の少なくとも一部に堆積されることに加えて、犠牲層は、間隙領域３０および段差部分７４上に堆積されてもよく、または凹部２８’を完全に充填してもよいことを理解されたい。
次に、犠牲層の一部と樹脂５４’の一部とが連続的に除去される。犠牲層は、最初にエッチバックされ、間隙領域３０および段差部分７４から除去され、深い部分７０における犠牲層の残りの部分（図２９Ｂに符号８０で示す）は、段差部分７４と実質的に同じ高さになる。図２９Ｂに示すように、樹脂５４’のいくつかの部分が除去される。例えば、樹脂５４’の一部を除去して、犠牲層８０の残りの部分と実質的に同じ高さの新しい（第２の）間隙領域３０’を形成し、樹脂５４’を除去して段差部分７４を除去する。段差部分７４を取り除くと、犠牲層８０の残りの部分の隣に凹部２８’の領域／部分７６が形成される。
図２９Ｃに示されるように、第１の官能化層６０は、犠牲層８０の残りの部分、面積／部分７６、および（第２の）格子間面積３０’上に適用される。次に、図２９Ｄに示すように、フォトレジスト６２を第１の官能化層６０上に適用する。
次いで、フォトレジスト６２の一部および下にある第１の官能化層６０を除去して、犠牲層８０の残りの部分および間隙領域３０’を露出させることができる。これを図２９Ｅに示す。この除去プロセスは、フォトレジスト６２の部分および下にある第１の官能化層６０を選択的に除去するが、犠牲層８０の残りの部分を除去しないエッチング液でエッチングすることによって達成することができる。本実施例では、ウェットエッチングは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＴＭＡＨ（テトラメチルアンモニウムヒドロキシド）などの基本現像液液を用いて行ってもよいし、酸素プラズマを用いてドライエッチングを行ってもよい。本実施例では、犠牲層８０の残りの部分が露出した時点でエッチングを停止する。これにより、第１の官能化層６０の第２の部分（例えば、領域１４）が残り、その上の領域／部分７６にフォトレジストの第２の部分６２’’を有する。
図２９Ｆに示すように、次に、犠牲層８０の残りの部分を除去して、第１の官能化層６０の第２の部分（例えば、領域１４）に隣接する第２の領域／部分７８を露出させる。この除去プロセスは、残りの犠牲層７６を選択的に除去するが、その上にフォトレジストの第２の部分６２’’を有する第１の官能化層６０の第２の部分（例えば、領域１４）を除去しないエッチング液でエッチングすることによって達成することができる。例として、アルミニウム犠牲層８０は、酸性または基本条件で除去することができ、銅犠牲層８０は、ＦｅＣｌ３を使用して除去することができ、フォトレジスト犠牲層８０は、アセトンなどの有機溶媒を使用して、または塩基性（ｐＨ）条件で除去することができ、シリコン犠牲層８０は、塩基性（ｐＨ）条件で除去することができる。
図２９Ｇに示すように、次いで、任意の適切な析出（および適用可能な場合には硬化）技術を使用して、第２の官能化層６４が面積／部分７８に適用される。これにより、第２の官能化領域１６が形成される。図２９Ｇに示されるように、第２の官能化層６４はまた、フォトレジストの第２の部分６２’’上および間隙領域３０上に適用され得る。
図２９Ｇに示されるように、フォトレジストの第２の部分６２’’は、次いで、リフトオフされ得、これはまた、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去する。これにより、第１の官能化領域１４が形成される。研磨は、間隙領域３０’から第２の官能化層６４を除去するために実行されてもよい。
図２９Ａ～２９Ｈに示す例はフォトレジスト６２を含むが、第２の官能化層６４が第１の官能化層６０に接着しない場合、フォトレジスト６２を省略することができることを理解されたい。さらに、犠牲層８０が、第１の官能化層６０が接着しない透明材料である場合、犠牲層８０は除去されず、領域１６が犠牲層８０上に形成されてもよい。
いくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図２９Ａ～図２９Ｈには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図２９Ａ～図２９Ｈには示さず）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後に（例えば、図２９Ｃで）グラフトされ得る。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２９Ｈで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図２９Ｇで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図２９Ｈで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、パターン化された樹脂５４’に対する親和性を有さない。
図２９Ａ～図２９Ｈには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図３Ａおよび図３Ｂに図示例を作製するためのさらに別の例示的な方法が、図３０Ａ～図３０Ｆに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、本明細書を通して言及されているが、明確にするために示されていない。さらに、図３Ａおよび図３Ｂは、単一層基材２６に画定された凹部２８’を示し、一方、例示的な方法は、多層基材の保持体５２上のパターン化された樹脂５４’に画定された凹部２８’を示す。この方法は、単層基材で使用されてもよいことを理解されたい。
図３０Ａに示すように、この実施形態では、多層基材は、保持体５２上のパターン化されていない樹脂５４と、樹脂５４上の犠牲層８０とを含む。樹脂５４、保持体５２、および犠牲層８０の任意の例を使用することができる。
図３０Ｂに示されるように、追加の樹脂が犠牲層８０に適用され、その中に凹部２８’を画定するようにパターン化される。追加の樹脂は、樹脂５４と同じであっても異なっていてもよい。凹部２８’は、深い部分７０と、部分的にパターン化された樹脂５４’の段差部分７４によって画定される浅い部分７２とを含む、マルチレベルまたはマルチ深さの凹部である。
図３０Ｃに示すように、（深い部分７０に隣接した）パターン化された樹脂５４’の第１の部分と、深い部分７０の下にある犠牲層８０の部分とがエッチングされる。これにより、樹脂５４の一部８２が露出する。一例では、パターン化された樹脂５４’は、犠牲層８０の下にある部分を露出させるために異方性酸素プラズマを使用してエッチングされてもよく、次いで、犠牲層８０の部分は、例えば、ＢＣ１３およびＣｌ２プラズマを使用して除去されてもよい。
図３０Ｄに示すように、パターン化された樹脂５４’の段差部分７４は、例えば、酸素プラズマを用いてエッチング除去される。これにより、段差部分７４の下にある犠牲層８０が露出する。使用されるエッチャントは、樹脂５４’をエッチングすることができるが、犠牲層８０をエッチングすることはできない。したがって、犠牲層８０はエッチストップとして作用し、したがって、犠牲層８０の部分１０２’が露出される。
樹脂５４’がエッチングされると、最初の間隙領域３０が短くなり得ることが理解されるべきである。このようにして、間隙領域３０’が形成される。
また、図３０Ｄに示されるように、第１の官能化層６０は、堆積（および場合によっては硬化）されてもよい。第１の官能化層６０は、犠牲層８０の露出部分１０２’に接着しなくてもよいが、樹脂５４の部分８２と、凹部２８’を囲む間隙領域３０’とに接着する。
次いで、犠牲層８０の露出部分１０２’を（例えば、材料に応じて塩基性溶液またはＦｅＣｌ３を使用して）エッチング除去することができ、第２の官能化層６４を堆積（および材料に応じて硬化）することができる。図３０Ｅに示されるように、第２の官能化層６４は、樹脂５４の新たに露出された部分（部分１０２’が除去された部分）に適用される。一実施形態では、第１の官能化層６０は、第２の官能化層６４に対する親和性を有さず、したがって、第２の官能化層６４は、第１の官能化層６０上に堆積しない。この方法の例では、図３０Ｆに示すように、第１の官能化層６０を間隙領域３０’から除去するために研磨を行うことができる。
図３０Ａ～図３０Ｆの方法のいくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図３０Ａ～図３０Ｆには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図３０Ａ～図３０には示されていない）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後に（例えば、図３０Ａまたは３０Ｄで）グラフトされ得る。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３０Ｆで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図３０Ｅで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３０Ｆで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、パターン化された樹脂５４’に対する親和性を有さない。
図３０Ａ～図３０Ｆには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図３Ａおよび図３Ｂに図示例を作製するためのさらに別の例示的な方法が、図３１Ａ～図３１Ｉに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、この説明を通して言及されているが、明確にするために示されていない。さらに、図３Ａおよび図３Ｂは、単一層基材２６に画定された凹部２８’を示し、一方、例示的な方法は、多層基材の保持体５２上のパターン化された樹脂５４’に画定された凹部２８’を示す。この方法は、単層基材で使用されてもよいことを理解されたい。
図３１Ａに示すように、多層基材は、保持体５２上に（パターン化された）樹脂５４’を含む。パターン化された樹脂５４’に形成された凹部２８’は、隣接する凹部２８’を互いに分離する間隙領域３０に隣接している。凹部２８’は、深い部分７０と、パターン化された樹脂５４’の段差部分７４によって部分的に画定される浅い部分７２とを含む、マルチレベルまたはマルチ深さの凹部である。
図３１Ｂに示されるように、第１の官能化層６０は、パターン化された樹脂５４’上に適用される。第１の官能化層６０は、本明細書に開示される例のいずれかであってもよく、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して堆積されてもよい。
図３１Ｃおよび図３１Ｄでは、次に、第１の官能化層６０をパターン化して、フォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化領域（領域１４）を形成する。この例では、フォトレジスト６２はネガ型フォトレジストである（露光された領域は不溶性になる）。図３１Ｃに示すように、フォトレジスト６２は、第１の官能化層６０に適用され、ある波長の光に選択的に露光されて不溶性部分を形成し（図３１Ｄに６２で示す）、現像液溶液に露出されて可溶性部分を除去する。図３１Ｄに示すように、次に、第１の官能化層６０の露出部分（例えば、フォトレジスト６２によって覆われていない部分）を、例えば、エッチングまたは別の適切な技法によって除去することができる。第１の官能化層６０の残りの部分（例えば、領域１４）は、各マルチレベル凹部の第１のレベル（高さ）にある。この実施形態では、第１のレベルは、保持体５２上の深部７０にある。
この例では、フォトレジスト６２及び樹脂５４’の部分（例えば、間隙領域３０、段差部分７４の表面）上に犠牲層８４が適用される。犠牲層８４を図３１Ｅに示す。樹脂５４’に対してエッチング差を有する任意の材料を犠牲層８４として使用することができる。一例では、アルミニウムを犠牲層８４として使用することができる。
図３１Ｆに示すように、犠牲層８４は樹脂５４’の部分から除去される。犠牲層８４を最初にエッチバックして、間隙領域３０および段差部分７４から除去し、犠牲層の残りの部分（図３１Ｆに符号８４’で示す）が深い部分７０のフォトレジスト６２上に残るようにすることができる。
次いで、樹脂５４’の領域（具体的には段差領域７４）を多層の凹部２８’から除去して、第１の官能化領域１４に近接する領域／部分７８（例えば、フォトレジスト６２の下にある第１の官能化層６０の部分および犠牲層８４’の残りの部分）を形成する。このプロセスはまた、間隙領域３０の一部を除去し、新たな間隙領域３０’をもたらすことができる。この除去工程は、樹脂５４’を選択的に除去するが、犠牲層８４’の残りの部分を除去しない、酸素プラズマのようなエッチャントでエッチングすることによって達成される。
図３１Ｈに示すように、次いで、任意の適切な堆積技術を使用して、犠牲層８４の残りの部分上、面積／部分７８上、および間隙面積３０’上に、第２の官能化層６４が適用される。
図３１Ｉに示されるように、フォトレジスト６２は、次いで、リフトオフされ得、これはまた、犠牲層８４’の残りの部分およびその上の第２の官能化層６４のいずれかを除去する。間隙領域３０’上の第２の官能化層６４のいずれも、研磨によって除去することもできる。
図３１Ａ～図３１Ｉの方法のいくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図３１Ａ～図３１Ｉには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図３１Ａ～図３１Ｉには示されていない）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後に（例えば、図３１Ｂで）グラフトされ得る。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３１Ｉで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図３１Ｈで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３１Ｉで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、パターン化された樹脂５４’に対する親和性を有さない。
図３１Ａ～図３１Ｉには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図３１Ａ～図３１Ｉに示される例における処理の全体を通して、マルチレベル凹部２８’は、図３Ａに示されるように、単一レベル凹部２８になる。
図４Ａ～４Ｃは、凹部２８の異なる部分に位置する領域１４、１６の異なる例を示す。
図４Ａでは、領域１４、１６の間に間隙３６がある。このように、フローセルのこの例は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（領域１４で、図４Ａには示されていない）と第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’（領域１６で、図４Ｂには示されていない）とを分離するギャップ３６を含む。一例では、ギャップ３６は、領域１４、１６が形成されるそれぞれのポリマー部間の空間である。図３１Ａ～図３１Ｉに示す方法のいずれも、ギャップ３６を形成するように変更することができる。ギャップ３６は、ゼロより大きい任意の測定可能な長さを有することができる。一例では、ギャップ３６は１ｎｍより大きい。一例では、ギャップは、約１ｎｍ～約１０ｎｍの範囲である。
図４Ｂでは、領域１４、１６は部分的に重なり合っている。重複領域３８は、プライマー１８、２０または１８’、２０’およびプライマー１９、２１または１９’、２１’の両方がグラフトされる領域である。一例では、この重複領域３８は、プライマー１８、２０または１８’、２０’がグラフトされたとき、およびプライマー１９、２１または１９’、２１’がグラフトされたときに、ポリマー層３２の同じ部分を露出させることによって、パターン化およびグラフトプロセスの間に形成され得る。別の例において、この重複領域３８は、別々にグラフトされたプライマー１８、２０または１８’、２０’およびプライマー１９、２１または１９’、２１’が、プロセスの間またはプロセスの後に物理的に重複または相互拡散する場合に形成され得る。
図４Ｃでは、それぞれの領域１４、１６が生成される凹部２８’の第１および第２の部分は、異なる深さを有する。凹部２８’の一方の部分が凹部２８’の他方の部分よりも深い限り、本明細書に記載の凹部深さのいずれかを使用することができる。凹部２８’が、例えば、ナノインプリンティング、エッチングなどによって形成されるとき、異なる深さが生成されてもよい。
図４Ｃに図示例を作製するための１つの例示的な方法が、図３２Ａ～図３２Ｆに示される。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、この説明を通して言及されているが、明確にするために示されていない。さらに、図４Ｃは、単一層基材２６に画定された凹部２８’を示し、一方、例示的な方法は、多層基材の保持体５２上のパターン化された樹脂５４’に画定された凹部２８’を示す。この方法は、単層基材で使用されてもよいことを理解されたい。
図３２Ａに示すように、多層基材は、保持体５２上に（パターン化された）樹脂５４’を含む。パターン化された樹脂５４’に形成された凹部２８’は、隣接する凹部２８’を互いに分離する間隙領域３０に隣接している。凹部２８’は、深い部分７０と、パターン化された樹脂５４’の段差部分７４によって部分的に画定される浅い部分７２とを含む、マルチレベルまたはマルチ深さの凹部である。
図３２Ｂに示されるように、第１の官能化層６０は、パターン化された樹脂５４’上に適用される。第１の官能化層６０は、本明細書に開示される例のいずれかであってもよく、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して堆積されてもよく、適切であれば、硬化されてもよい。
図３２Ｃおよび図３２Ｄでは、次に、第１の官能化層６０をパターン化して、フォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化領域（領域１４）を形成する。この例では、フォトレジスト６２は、ネガ型フォトレジストまたはポジ型フォトレジストである。図３２Ｃに示されるように、フォトレジスト６２は、第１の官能化層６０に適用され、不溶性領域または可溶性領域（使用されるレジストに依存する）を形成するために特定の波長の光に選択的に露光され、可溶性部分を除去するために現像液溶液に露光される。図３２Ｄに示すように、次に、第１の官能化層６０の露出部分（例えば、フォトレジスト６２によって覆われていない部分）を、例えば、エッチングまたは別の適切な技法によって除去することができる。ここで、第１官能化膜６０及び樹脂５４’はエッチング差を有することができる。第１の官能化層６０の残りの部分（例えば、領域１４）は、各マルチレベル凹部の第１のレベルにある。この実施形態では、第１の高さは、樹脂５４’上の深部７０にある。
図３２Ｅに示すように、次に、任意の好適な蒸着技術を用いて、樹脂５４’の露出部分（例えば、間隙領域３０及び段差領域７４）に第２の官能化層６４を適用する。材料に応じて、第２の官能化層６４も硬化させることができる。一実施形態では、フォトレジスト６２は、第２の官能化層６４に対する親和性を有さず、したがって、第２の官能化層６４は、フォトレジスト６２上に堆積しない。別の例では、第２の官能化層６４は、フォトレジスト６２上に堆積されてもよいが、フォトレジスト６２がリフトオフされることによって除去されてもよい。
図３２Ｆに示されるように、フォトレジスト６２はその後解放され、場合によっては、第２の官能化層６４のいずれかをも取り除くことができる。間隙領域３０上の第２の官能化層６４のいずれも、研磨によって除去することもできる。
図３２Ａ～図３２Ｆの方法のいくつかの例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図３２Ａ～図３２Ｆには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図３２Ａ～図３２Ｆには示さず）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図３２Ｂで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３２Ｆで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図３２Ｅで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３２Ｆで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、パターン化された樹脂５４’に対する親和性を有さない。
図３２Ａ～図３２Ｆには示されていないが、この例示的な方法は、第１の自己集合単層（ＳＡＭ）を第１の官能化領域１４上に堆積させるステップと、第２の自己集合単層（ＳＡＭ）を第２の官能化領域１６上に堆積させるステップとをさらに含むことができる。自己集合単層を使用する例では、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ＳＡＭＳが形成された後にグラフトされる。
図５、図６Ａおよび図６Ｂは、基材２６が間隙領域３０によって分離された凹部２８を含み、凹部の各々が第１の領域１４を含み、第２の領域１６が間隙領域３０の少なくともいくつかの上に位置する様々な例を示す。このように、これらの例では、領域１４の一方は凹部２８に位置し、領域１６の他方は凹部２８に隣接する基材面Ｓ上に位置する。図５に示す実施形態では、基材面Ｓ上の領域１６は、凹部２８の隣にある。図６Ａおよび６Ｂに示される例では、基材面Ｓ上の領域１６が凹部２８を取り囲んでいる。次に、図７Ａ～図７Ｇおよび図８Ａ～図８Ｆに関連して、基材面Ｓの少なくとも一部上の凹部２８の領域１４、１６のうちの一方および領域１６、１４のうちの他方を作製するための例示的な方法を説明する。
図６Ａおよび６Ｂに示される例を作製するための１つの例示的な方法を図７Ａ～７Ｇに示す。図７Ａに示すように、該方法は、間隙領域３０によって分離された複数の凹部２８を有する基材２６を利用する。この例示的な方法では、図３Ａおよび図３Ｂに関連して説明したように、ポリマー層３２が基材２６上に堆積され、間隙領域３０から研磨される。これにより、ポリマー層３２は、間隙領域３０上ではなく、凹部２８に残る。領域１４が凹部２８にあることが望ましい場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、本明細書に開示される例のいずれかを使用してグラフトされてもよい。領域１６が凹部２８にあることが望ましい場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、本明細書に開示される例のいずれかを用いてグラフトされてもよい。図７Ｂに示される例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、ポリマー層３２にグラフトされる。プライマー１８、２０または１８’、２０’は、図７Ｂに示すように、凹部２８のポリマー層３２にグラフトし、間隙領域３０にグラフトしないことを理解されたい。
本方法のいくつかの例では、基材２６（凹部２８に形成された領域１４または１６を有する）は、キャッピング剤に曝される。キャッピング剤は、ポリマー層３２の未反応官能基（例えば、プライマー１８、２０または１８’、２０’’と反応していない官能基）と反応して、後続の処理中にこれらの官能基を非機能性にすることができる化学種を含む。このプロセスは、その後に堆積されるポリマー層３２’が領域１４に接着する能力を低下させる可能性がある。換言すれば、ポリマー層３２とその後に堆積されるポリマー層３２’との間の相互作用は、ポリマー層３２に接着するポリマー層３２’がほとんどまたは全くないように低減される。これは、次に、続いて堆積されるプライマー（例えば、１９、２１または１９’、２１’）が、面積１４を覆う面積にグラフトする能力を低下させる。
ポリマー層３２がアジド官能基を含む実施例では、キャッピング剤中の化学種は、ホスフィンなどの還元剤であってもよい。ホスフィンの例は、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンである。ポリマー層３２の未反応アジドは、ホスフィンによって還元され、追加のプライマーグラフト化のために機能しなくなる。
図７Ｃに示すように、この方法は、次に、第２のポリマー層３２’を堆積させることを含む。ポリマー層３２’は、ポリマー層３２に使用されるものと同じポリマーであってもよく、またはポリマー層３２に使用されるものとは異なるタイプのポリマーであってもよい。一例では、第１のポリマー３２および第２のポリマー３２’のそれぞれは、ＰＡＺＡＭなどのアクリルアミドコポリマーである。ポリマー層３２’は、間隙領域３０を単独で被覆してもよく、または間隙領域３０に加えて領域１４の少なくともいくつかを被覆してもよい。ポリマー層３２’が領域１４を少なくとも部分的に被覆するかどうかは、ポリマー層３２に使用されるキャッピング剤に依存する。
この実施形態では、切断不可能な第１の鋳型鎖４０および切断可能な第２の鋳型鎖４２を含む鋳型ポリヌクレオチドストランドを、それぞれプライマー１８または１８’および２０、２０’を用いて領域１４に形成することができる。鋳型ポリヌクレオチド鎖生成の最初に、ライブラリー鋳型は、任意の核酸試料（例えば、ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料）から調製され得る。核酸試料は、一本鎖、同様の大きさ（例えば、＜１０００ｂｐ）のＤＮＡまたはＲＮＡ断片に断片化され得る。調製中、これらのフラグメントの末端にアダプターを付加することができる。減少したサイクル増幅によって、異なるモチーフ（例えば、配列決定結合部位、指数、および領域１４におけるプライマー１８または１８’および２０、２０’に相補的である領域）が、アダプターに導入され得る。最終ライブラリー鋳型は、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片および両端のアダプターを含む。いくつかの例において、単一の核酸試料由来のフラグメントは、それに付加された同じアダプターを有する。
複数のライブラリー鋳型を基材２６に導入することができる。これは、フローセルに鋳型流体を導入することを含み得る。鋳型流体は、液体キャリアおよび複数のライブラリー鋳型を含み得る。基材２６は凹部２８に領域１４の配列を含むので、多数のライブラリー鋳型が、例えば、その中に固定化された２つのタイプのプライマー１８、１８’または２０、２０’のうちの１つにハイブリダイズされる。
次に、クラスター生成を実行することができる。クラスター生成の間、鋳型流体からの鋳型は、少なくともいくつかの凹部２８にクラスターを形成するために増幅される。クラスター生成の一例において、ライブラリー鋳型は、ハイブリダイズしたプライマー１８、１８’または２０、２０’から、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼを用いて３’伸長によりコピーされる。元のライブラリー鋳型は変性され、領域１４に固定化されたコピーを残す。等温ブリッジ増幅を用いて、固定化されたコピーを増幅することができる。例えば、コピーされた鋳型は、隣り合う相補的プライマー２０、２０’または１８、１８’にハイブリダイズするためにループし、ポリメラーゼは、コピーされた鋳型をコピーして二本鎖橋梁を形成し、これらは変性されて２本の一本鎖ストランドを形成する。これらの２つのストランドは、隣り合う相補的プライマー２０、２０’または１８、１８’上でループし、かつハイブリダイズし、再度伸長されて、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性および増幅のサイクルによって各鋳型コピーについて繰り返し、密なクローンクラスターを作製する。二本ストランド橋梁の各々のクラスターは変性され、図７Ｄに示されるように、切断不可能な第１のプライマー１８、１８’に結合した切断不可能な第１の鋳型ストランド４０、および切断可能な第２のプライマー２０、２０’に結合した切断可能な第２の鋳型ストランド４２を生じる。プライマーの切断性が、それに結合した鋳型鎖の切断性を駆動することが理解されるべきである。切断可能な第２のプライマー２０、２０’に結合した第２の鋳型鎖４２は切断部位２２を含むので、切断可能な第２の鋳型鎖４２は切断可能である。このクラスター化の例は、ブリッジ増幅であり、実行され得る増幅の一例である。排除増幅（Ｅｘａｍｐ）ワークフロー（Illumina Inc.）のような他の増幅技術が使用されてもよいことが理解されるべきである。
第２のポリマー層３２’にはプライマー１８、１８’または２０、２０’がグラフトされていないので、増幅プロセスは個々の凹部２８を越えて延在しないことを理解されたい。
次に、プライミング流体を基材２６に導入することができる。プライミング流体は、液体キャリアと、凹部２８に導入された第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとは異なる第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’とを含む。プライミング流体中の液体キャリアは、クリックケミストリーを支持することができる任意の液体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水－クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、炭酸塩ベースの緩衝液などであってもよい。この例では、プライミング流体中のプライマーセットは、プライマー１９または１９’および２１または２１’を含む。プライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’（プライマー１９または１９’および２１または２１’を含む）を最初にグラフトして凹部２８に領域１６を形成する場合、プライミング流体はプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８または１８’および２０または２０’を含む）を含むことができることを理解されたい。
プライミング流体中のプライマー１９または１９’および２１または２１’は、間隙領域３０の上にある第２のポリマー層３２’にグラフトしてもよい。第２のポリマー層３２’はポリマー層３２に接着しないので、部分１４で増幅が行われ、下にあるポリマー層３２の官能基が非機能性にされているので、プライマー１９または１９’および２１または２１’は露出したポリマー層３２にグラフトしないかもしれない。
図７Ｅに示されるように、グラフト化プライマー１９または１９’および２１または２１’は、領域１６を形成する間隙領域３０を覆う第２のポリマー層３２’に結合する。
次いで、さらなる増幅が行われ得る。例えば、ブリッジ部増幅は、間隙領域の少なくともいくつかの上に第２のクラスターを形成するために、クラスターからグラフトプライマー１９または１９’および２１または２１’に開始され得る。このラウンドの増幅の間、切断不可能な第１の鋳型鎖４０は、隣接する相補的プライマー２１、２１’の上をループし、これにハイブリダイズし、一方、切断可能な第２の鋳型鎖４２は、隣接する相補的プライマー１９、１９’の上をループし、これにハイブリダイズする。それぞれのストランド４０、４２は、２つの新たな二本鎖ループを形成するように延長される。このプロセスは、等温変性および増幅のサイクルによって各鋳型コピーについて繰り返され、凹部２８から間隙領域３０へと成長する密なクローンクラスターを作製する。二本鎖橋梁のそれぞれのさらなるクラスターが変性され、その結果、図７Ｆに示されるように、切断不可能な第２のプライマー２１、２１’に結合した切断不可能な第２の鋳型鎖４４、および切断可能な第１のプライマー１９、１９’に結合した切断可能な第１の鋳型鎖４６が生じる。切断可能な第１のプライマー１９、１９’に結合した切断可能な第１の鋳型鎖４６は、切断部位２２’または２３を含むので、切断可能な第１の鋳型鎖４６は切断可能である。
切断不可能な第１の鋳型ストランド４０が順方向ストランドである場合、切断不可能な第２の鋳型ストランド４４は逆方向ストランドであり、切断不可能な第１の鋳型ストランド４０が逆方向ストランドである場合、切断不可能な第２の鋳型ストランド４４は順方向ストランドであることを理解されたい。同様に、切断可能な第１の鋳型ストランド４６が順方向ストランドである場合、切断可能な第２の鋳型ストランド４２は逆方向ストランドであり、切断可能な第１の鋳型ストランド４６が逆方向ストランドである場合、切断可能な第２の鋳型ストランド４２は順方向ストランドである。
次いで、切断可能な第１および第２の鋳型鎖４６、４２は、切断部位２２、２２’または２２、２３に依存して、薬剤または酵素的切断剤を導入することによって除去され得る。図７Ｇに示すように、切断後、切断不可能な第１の鋳型鎖４０は、凹部２８の領域１４に残り、切断不可能な第２の鋳型鎖４４は、間隙領域３０の領域１６に残る。切断が行われた後の一実施形態では、領域１４は順方向ストランドを含み、領域１６は逆方向ストランドを含む。
図５、６Ａおよび６Ｂに示される例を作製するための別の例示的な方法が、図８Ａ～８Ｇに示される。図８Ａに示すように、該方法は、間隙領域３０によって分離された複数の凹部２８を有する基材２６を利用する。この実施例では、ポリマー層３２は、凹部２８および間隙領域３０上に存在するように、基材２６上に堆積される。領域１４が凹部２８にあることが望ましい場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、本明細書に開示される例のいずれかを使用してグラフトされてもよい。領域１６が凹部２８にあることが望ましい場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、本明細書に開示される例のいずれかを用いてグラフトされてもよい。図８Ｂに示される例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、ポリマー層３２にグラフトされる。プライマー１８、２０または１８’、２０’は、図８Ｂに示されるように、基材２６全体にわたってポリマー層３２にグラフトすることが理解されるべきである。
本実施例の方法では、図８Ｃに示すように、プライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄがグラフトされたポリマー層３２上に保護塗装４８を堆積させる。保護塗装４８は、リフトオフレジストであってもよい。この種の保護塗装４８は、スピンオンされ、硬化され、その後、処理中の所望の時点で除去されてもよい。保護塗装４８は、水溶性塗装であってもよい。
次いで、エッチングを行って、プライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’を含む領域１６を生成することが望ましい間隙領域３０を露出させることができる。例えば、凹部２８に隣接する基材面Ｓの孤立した部分をエッチングにより露出させて、図５に示す例を形成してもよい。別の例として、凹部２８全体を囲む基材面Ｓの一部をエッチングにより露出させて、図６Ａおよび６Ｂにしめされる実施例を形成してもよい。図８Ｄは、間隙領域３０を露出させるためにエッチングが行われた後の基材２６の一例を示す。ここで、プラズマエッチングは、大気または酸素ガスを用いて行ってもよい。
次いで、この例示的な方法は、基材表面Ｓの露出部分をシラン化することを含むことができ、シラン化は、密着性促進剤を基材表面Ｓに導入して、第２のポリマー層３２’がそれに接着するのを助ける。
次に、第２のポリマー層３２’が堆積される。図８Ｅに示されるように、第２のポリマー層３２’は、基材面Ｓの露出部分（例えば、間隙領域３０）および保護塗装４８上に堆積されてもよい。この例示的な方法では、ポリマー層３２’は、ポリマー層３２で使用されるものと同じポリマーであってもよく、またはポリマー層３２で使用されるものとは異なるタイプのポリマーであってもよい。
図８Ｆに示されるように、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’のプライマー１９、１９’および２１、２１’は、次いで、ポリマー層３２’にグラフトされて、領域１６を生成し得る。グラフトは、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて行うことができる。別の例では、ポリマー層３２’は、プライマー１９、１９’および２１、２１’で予めグラフトされてもよい。
図示されていないが、この例示的な方法は、保護塗装４８を除去することを含むことができることを理解されたい。例えば、リフトオフ法を用いて、保護塗装４８と、その上の任意のポリマー層３２’およびプライマー１９、１９’および２１、２１’とを除去することができる。保護塗装４８が水溶性である場合、取り除くことは、塗装４８を水に再溶解することを含み得、これはまた、任意の上にあるポリマー層３２’およびプライマー１９、１９’および２１、２１’を取り除く。保護塗装を取り除くと、領域１４のプライマー１８、１８’および２０、２０’のすべてが露出し、領域１６のプライマー１９、１９’および２１、２１’のすべてが露出する。
図８Ａ～図８Ｆには示されていないが、複数のライブラリー鋳型を基材２６に導入することができることを理解されたい。基材２６は凹部２８に領域１４の配列を含むので、多数のライブラリー鋳型が、例えば、その中に固定化された２つのタイプのプライマー１８、１８’または２０、２０’のうちの１つにハイブリダイズされる。この例では、基材２６はまた、少なくともいくつかの間隙領域３０上に領域１６の配列を含むので、多数のライブラリー鋳型が、例えば、その中に固定化された２つの型のプライマー１９、１９’または２１、２１’のうちの１つにハイブリダイズされる。次いで、本明細書に記載されるように、クラスター生成を実行することができる。切断可能な鋳型の切断はまた、切断可能な第１のプライマー１９、１９’および切断可能な第２のプライマー２０、２０’を切断することによって行われ得る。
図９は、凹部２８の異なる部分に位置する領域１４、１６の別例を示す。この例では、領域１４または１６の一方は、凹部２８に配置されたビーズ５０の一部である。ビーズ５０は、コア構造４９と、コア構造４９の表面にある領域１６とを含む。この例では、領域１６は、コア構造４９の表面に本質的に存在する官能基、または任意の好適な官能化技術（例えば、化学反応、コア構造４９と反応性基含有ポリマーとの塗装など）によってコア構造４９の表面に組み込まれた官能基を含むことができる。
図９には単一の凹部２８が示されているが、いくつかの例では、基材２６は、間隙領域３０によって分離された複数の凹部２８を含み、凹部のそれぞれは、第１の領域１４が位置する第１の部分と、第２の部分とを含み、フローセルは、第２の部分に位置するビーズ５０をさらに含み、第２の領域１６は、ビーズの表面にあることを理解されたい。この例のいくつかの変形例が、「ビーズベースフローセル」のセクションの図１１Ａ～図２０を参照して本明細書でさらに説明される。
図１０は、領域１４、１６のさらに別の構成例を示す。この実施形態では、領域１４、１６は、別個の基材２６、２６’上に配置されている。このように、このフローセルの例示は、第１の基材２６、第１の基材２６に付属する第１のプライマーセット１２Ａ、第１のプライマーセットは切断不可能な第１のプライマーセット１８、１８’および切断可能な第２のプライマー２０、２０’を含み、第１の基材２６に対向する第２の基材２６であって、第２のプライマーセット１２Ａ’が第２の基材２６’に結合され、第２のプライマーセット１２Ａ’が切断可能な第１のプライマー１９、１９’および切断不可能な第２のプライマー２１、２１’を含む。このフローセルを作製するための一方法の例として、基材２６、２６’の各々は、ポリマー層（例えば、３２、図１０には示さず）でコーティングされ得、第１のプライマーセット１２Ａ（または１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄ）は、基材２６の一方にグラフトされ得、そして第２のプライマーセット１２Ａ’（または１２Ｂ’、１２Ｃ’、または１２Ｄ’）は、基材２６’の他方にグラフトされ得る。
それぞれの基材面Ｓ上に示されているが、領域１４、１６は、代替的に、それぞれの基材２６、２６’の凹部２８に配置されてもよいことを理解されたい。この例では、ポリマー層は、凹部２８および間隙領域３０上に堆積され、次いで、研磨によって間隙領域３０から除去されてもよい。第１のプライマーセット１２Ａ（または１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄ）は、一方の基材２６の凹部２８にグラフトされてもよく、第２のプライマーセット１２Ａ’ （または１２Ｂ’、１２Ｃ’、または１２Ｄ’）は、他方の基材２６’の凹部にグラフトされてもよい。
この実施形態では、基材２６、２６’は、鋳型のシーディングおよびクラスター化が成功裏に実行されるように、極めて接近した範囲にあることが望ましい場合がある。例えば、「近接」とは、２つの基材２６、２６’間の間隔が約１００μｍ以下であることを意味する。別の実施形態では、２つの基材２６、２６’間の間隔は、約１０μｍ～約９０μｍの範囲である。
別個の基材２６、２６’上に配置される代わりに、第１および第２の領域１４、１６ならびにプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’は、基材面Ｓ上でマクロ分離されてもよく、または互いにマクロ分離された別個の凹部２８に存在してもよい。マクロ分離とは、領域１４、１６が少なくとも５μｍだけ互いに分離されていることを意味する。一例では、領域１４、１６は、約５μｍ～約１００μｍの範囲の距離だけ互いに分離されている。
図３３Ａは、領域１４、１６のさらに別の例示的な構成を示す。この実施形態では、第１および第２の官能化層６０、６４は、多層基材の樹脂部に一体化される。図３３Ａに示すように、この多層基材は、保持体５２と、保持体５２上の第１の官能化層６０と、第１の官能化層６０上の第２の官能化層６４と、第２の官能化層６４上のパッシベーション層８６とを含む。
この実施形態では、第１および第２の官能化層６０、６４は、それぞれのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’に結合することができる面官能基を有するか、または導入することができる任意のナノインプリントリソグラフィ樹脂とすることができる。一実施形態では、層６０はエポキシ基で官能化されてもよく、層６４はアミン基で官能化されてもよい。
層６０、６４の樹脂は、それぞれのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’が、図３３Ａに示される多層基材が形成される前に、層６０、６４に予めグラフトされる場合、同じであり得る。この方法のこれらの例では、第１の官能化層６０が多層基材に組み込まれる前に、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（例えば、切断不可能な第１のプライマー１８、１８’および切断不可能な第２のプライマー２０、２０’）を第１の官能化層６０に予めグラフトすることができ、第２の官能化層６４が多層基材に組み込まれる前に、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’（例えば、切断可能な第１のプライマー１９、１９’および切断不可能な第２のプライマー２１、２１’）を第２の官能化層６６に予めグラフトすることができる。
層（予めグラフトされているか否かにかかわらず）は、本明細書に開示される例のいずれかを使用して、保持体５２上に堆積されてもよい。
プライマーがインプリント後にグラフトされる場合、層６０、６４は、少なくとも、それぞれのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’に結合し得る異なった表面官能基を有することが理解されるべきである。本明細書中に開示される樹脂のいずれかが使用され得る。
パッシベーション層８６は、インプリントすることができる任意の疎水性層とすることができる。例として、パッシベーション層８６は、フッ素化ポリマー、過フッ素化ポリマー、シリコンポリマー、およびそれらの混合物からなる群から選択される。例として、パッシベーション層８６は、非晶質フッ素ポリマー（ＡＧＣ ＣｈｅｍｉｃａｌｓからのＣＹＴＯＰ（登録商標）におけるものを含む商業的に入手可能な例であり、以下の末端官能基のうちの１つを有する：Ａ型：－ＣＯＯＨ、Ｍ型：－ＣＯＮＨ－Ｓｉ（ＯＲ）ｎまたはＳ型：－ＣＦ３）、ポリテトラフルオロエチレン（その商業的に入手可能な例はＣｈｅｍｏｕｒｓからのテフロン（登録商標）である）、パリレン、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー（その商業的に入手可能な例はＣｙｔｏｎｉｘからのＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（登録商標））。パッシベーション層８６は、本明細書に開示される例のいずれかを使用して保持体５２上に堆積されてもよい。
図３３Ａに示されるように、該方法のこの例は、多層基材をインプリントすることを含み、それによって、パッシベーション層８６の間隙領域３０によって分離された特徴部（例えば、凹部２８）を形成し、第１および第２の官能化層のそれぞれの領域１４、１６が、各特徴部／凹部２８において露出される。単一の特徴／凹部２８の露光領域１４、１６およびパッシベーション層８６の周囲の間隙領域３０が、図３３Ｂの上面図から示されている。各領域１４、１６について、特徴部／凹部２８は、傾斜した底部または段差領域、または層６０の一部および層６４の一部の両方を特徴部／凹部２８の上部から露出させる幾何学的形状の他の変形を有する。
多層基材をインプリントするために、ナノインプリントリソグラフィ金型または加工（ワーキング）スタンプ５６が樹脂５４の層に押し付けられて、層６０、６４、６８に特徴部のインプリントを生成する。言い換えれば、層６０、６４、６８の各々は、加工スタンプ５６の張出し部によって、へこんだり、穿孔されたりする。次に、層６０、６４、６８は、加工スタンプ５６を所定の位置にして硬化される。硬化は、可視光照射または紫外（ＵＶ）照射などの化学線、またはフォトレジストを使用する場合には約２４０ｎｍ～３８０ｎｍの範囲の波長の照射に露光することによって、または熱硬化性レジストを使用する場合には熱に露出することによって達成することができる。硬化は、重合および／または架橋結合を促進し得る。一例として、硬化は、ソフトベーク（例えば、溶媒を除去するための）およびハードベークを含む複数の段階を含むことができる。ソフトベークは、約５０℃～約１５０℃の範囲のより低い温度で行うことができる。ハードベークの持続時間は、約１００℃～約３００℃の範囲の温度で約５秒～約１０分間続くことができる。ソフトベーキングおよび／またはハードベーキングに使用することができるデバイスの例には、ホットプレート、オーブンなどが含まれる。
硬化後、加工スタンプ５６は解放される。これにより、層６０、６４、６８に地形的特徴、すなわち凹部２８が形成される。
上述のように、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図３３Ａまたは図３３Ｂには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされてもよく、したがって、第１の官能化領域１４に結合され、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図３３Ａまたは図３３Ｂには示されていない）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされてもよく、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’および／またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は、それぞれ、第１の官能化層６０および第２の官能化層６４に予めグラフトされていない。これらの実施例では、領域１４、１６は異なった官能基を有し、プライマー１８、２０または１８’、２０’およびプライマー１９、２１または１９’、２１’はインプリント後にグラフトされてもよい。
グラフトがインプリント後に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意のグラフト技術を使用して達成され得る。いずれのグラフト法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、パッシベーション層８６に対する親和性を有さない。
上述のように、凹部２８のいくつかの例は、トレンチの形成であってもよい。図３４Ｓは、領域１４、１６がトレンチ２８’’に形成される領域１４、１６のさらに別の例示的な構成を（上面図から）示す。
図３４Ａに示すように、多層基材は、保持体５２上に（パターン化された）樹脂５４’を含む。パターン化された樹脂５４’に画定されたトレンチ２８’’（例えば、ＮＩＬ樹脂、ＳｉＯ２など）は、隣接するトレンチ２８’’を互いに分離する間隙領域３０に隣接する（例えば、多数のトレンチ２８’’の上面図を示す図３４Ｈを参照）。
図３４Ｂに示されるように、犠牲層８４が樹脂５４’（例えば、間隙領域３０およびトレンチ２８’’）上に適用される。樹脂５４’および使用される第２の犠牲層８８に対してエッチング差を有する任意の物質を犠牲層８４として使用することができる。一例では、犠牲層８４は、シリコン、アルミニウム、またはクロムである。
図３４Ｃに示すように、犠牲層８４は樹脂５４’の部分から除去される。この実施形態では、犠牲層８４は、犠牲材料８４’’の領域が各トレンチ２８’’の各サイドウォール９０に直接的に隣接して残るようにエッチングされ、エッチング後、間隙領域３０および各トレンチ２８’’の底部が露出される。
図３４Ｄに示されるように、第２の犠牲層８８は、犠牲材料８４’’の領域上、および樹脂５４’の任意の露出領域（例えば、間隙領域３０およびトレンチ２８’’の底部）上に適用される。樹脂５４’および使用される第２の犠牲層８４に対してエッチング差を有する任意の物質を第２の犠牲層８８として使用することができる。例えば、層８４がシリコンである場合、層８８はアルミニウムまたはクロムであってもよい。
犠牲層８４、８８は、本明細書に記載の堆積技術のいずれかを使用して適用することができる。
図３４Ｅに示されるように、第２の犠牲層８８は、犠牲材料８４’’の領域および樹脂５４’’の部分から除去される。この例では、第２の犠牲層８８は、第２の犠牲材料８８’’の領域が犠牲材料領域８４’’のそれぞれのすぐ隣に残るようにエッチングされてもよく、この例では、エッチング後、間隙領域３０および各トレンチ２８’’の別の（より小さい）底部が露出される。
図３４Ｆ（上面図を示す）に示すように、材料９２が堆積されて、第２の犠牲材料領域８４’’間の任意の空間を充填し、換言すれば、追加の材料９２は、各トレンチ２８’’の底部を覆い、第２の犠牲材料８８’の領域を完全に分離する。追加の材料９２は、樹脂５４’と同じ材料とすることができる。例えば、二酸化ケイ素が樹脂５４’として使用される場合、追加の材料９２は二酸化ケイ素であってもよい。追加の材料９２は、そのトレンチ２８’’よりも小さい、新しいトランシェ２８’’（領域１４、１６が定義される）を定義するのに役立つ。この領域は、）。
この方法の例では、図３４Ｇに示すように、間隙領域３０’から追加の材料９２を除去するために研磨を行うことができる。
図３４Ｈは、２つの犠牲材料／層８４’’、８８’’で充填されたトレンチ２８’’’の上面図を示し、示されるように、犠牲材料／層８４’’、８８’’の各々は、各トレンチ２８’’’の長手に延在する。
図３４Ｉは、２つの犠牲材料／層８４’’、８８’’で充填されたトレンチ２８’’’の１つの断面図を示す。
図３４Ｊに示すように、犠牲材料領域８４’’は、トレンチ２８’’’の各々の一部から除去され、これは、第１の官能化領域１４が形成される領域／部分７６を露出させ、犠牲材料領域８４’’はエッチングされてもよく、このエッチングプロセスは、異なったエッチング率のために、樹脂５４’または第２の犠牲材料領域８８’に影響を及ぼさない。
図３４Ｋでは、第１の官能化層６０が、間隙領域３０、面積７６、および第２の犠牲材料面積８８’上に適用される。第１の官能化層６０は、本明細書に開示される例のいずれかであってもよく、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して堆積されてもよい。
図３４ＫＬおよび図３４Ｍでは、次に、第１の官能化層６０をパターン化して、面積／部分７６にフォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化面積（面積１４）を形成する。フォトレジスト６２およびその下の第１の官能化層６０は、間隙領域３０および第２の犠牲材料領域８８’をエッチストップとして使用して、研磨またはエッチング除去することができる。これにより、トレンチ２８’’’の領域／部分７６に、フォトレジスト６２によって覆われた第１の官能化領域１４が形成される。
図３４Ｎに示すように、第２の犠牲材料領域８８’は、各トレンチ２８’’’の一部から除去される。これにより、第２の官能化領域１６が形成される領域／部分７８が露出する。第２の犠牲材料領域８８’はエッチングされてもよく、このエッチングプロセスは、異なったエッチング率のために樹脂５４’またはフォトレジスト６２に影響を及ぼさない。第１の官能化層６０の露出部分は、このエッチングプロセス中に除去することができる。
図３４Ｏでは、第２の官能化層６４が、間隙領域３０、面積７８、フォトレジスト６２、および面積１４の任意の露出部分上に適用される。第２の官能化層６４は、本明細書に開示される例のいずれかであってもよく、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して堆積されてもよい。
次に、図３４Ｐにおいて、フォトレジスト６２をリフトオフして、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去することができる。本明細書に開示される実施例のいずれにおいても、超音波処理は、フォトレジスト剥離またはリフトオフプロセスの効率を改善するために行われてもよい。
図３４Ｑでは、間隙領域３０を研磨して、その上の第２の官能化層６４のいずれかを除去することができる。図３４Ｑに示すように、領域１４、１６は、トレンチ２８’’’のそれぞれの領域に形成されるが、領域１４、１６は、（図３４Ｒに示すように）トレンチ２８’’’の長手に延在することを理解されたい。領域１４、１６のこの構成は、本明細書中に開示されるプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’を使用して、同時対合末端読み取り配列決定のために使用され得る。
図３４Ｒでは、第２のフォトレジスト６２’を適用（および露光および現像）して、トレンチ２８’’’に少なくとも実質的に垂直な空間的に分離されたストライプのパターンを形成する。このパターンは、図３４Ｒに示されるように、空間的に分離されたストライプの間に露出される第１の官能化領域１４および第２の官能化領域１４の部分を残す。空間的に分離されたストライプの間に露出された第１の官能化領域１４および第２の官能化領域１６の部分が除去され（例えば、エッチングによって）、次いで、空間的に分離されたストライプ（第２のフォトレジスト６２’）が除去される（例えば、エッチングによって）。図３４Ｓに示されるように、空間的に分離されたストライプ（第２のフォトレジスト６２’）の下にある領域１４、１６は、空間的に分離されたストライプ（第２のフォトレジスト６２’）の除去後も無傷のままである。本実施例では、それぞれの領域１４、１６は、トレンチ２８’’’に沿って分離された対である。
いくつかの実施例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’（図３４Ａ～図３４Ｓには示されていない）は、第１の官能化層６０に予めグラフトされ得、したがって、第１の官能化領域１４に結合される。同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’（図３４Ａ～図３４Ｓには示されていない）は、第２の官能化層６４に予めグラフトされ得、したがって、第２の官能化領域１６に結合される。これらの実施例では、追加のプライマーグラフトは行われない。
他の実施例では、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０に予めグラフトされていない。これらの実施例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、第１の官能化層６０が適用された後に（例えば、図３４Ｋで）グラフトされ得る。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、領域１６の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３４Ｓで）グラフトされ得る。
同様に、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４に予めグラフトされていなくてもよい。これらの実施例において、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、第２の官能化層６４が適用された後にグラフトされ得る（例えば、図３４Ｏで）。領域１４、１６が異なった官能基を有する場合、プライマー１９、２１または１９’、２１’は、領域１４の表層官能基にグラフトされないので、該方法の最後に（例えば、図３４Ｓで）グラフトされ得る。
グラフトがこの方法の間に行われる場合、グラフトは、本明細書中に開示される任意の例を使用して行われ得る。いずれのグラフト化方法においても、プライマー１８、２０または１８’、２０’は領域１４の反応性基と反応し、またはプライマー１９、２１または１９’、２１’は領域１６の反応性基と反応し、樹脂５４’に対する親和性を有さない。
フローセルのさらに別の実施例では、領域１４、１６は、図３５に示されるように、それぞれの官能化保持体構造９３、９４上に形成されてもよい。官能化保持体構造９３、９４は、本明細書に開示されるそれぞれのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’を結合させることができる面官能基を有する。本明細書に開示されるコア構造４９の任意の例が、官能化保持体構造９３、９４のために使用されてもよい。種々のプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’を結合させることができる、本明細書中に開示される任意の表層官能基もまた、使用され得る。官能化保持体構成９３、９４は、例えば、官能基を有するビーズ５０を形成するために本明細書に開示される一方法（複数可）を使用して形成されてもよい（「ビーズベースフローセル」の部を参照されたい）。
いくつかの実施例では、官能化保持体構造９３、９４はまた、様々な形状を有してもよい。いくつかの例では、それぞれの形状は、基材（本明細書に記載されるような単層または多層基材であってもよい）の表面Ｓ上または表面Ｓに画定された捕捉部位９５、９６（図３６Ａ、図３６Ｂ、図３７Ａ、および図３７Ｂに示される）の形状にそれぞれ対応する。例えば、官能化保持体構造９３、９４は、それぞれ、ウェル捕捉部位９５、９６（後述）と同じ形を有することができる。種々の形状は、官能化された保持体構造９３が相補的な形状のウェル捕捉部位９５に物理的に捕捉されるようになり、官能化された保持体構造９４が相補的な形状のウェル捕捉部位９６に物理的に捕捉されるようになるのを助ける。
いくつかの実施例では、官能化保持体構造９３、９４は、異なった捕捉ケミストリーを有することもできる。捕捉ケミストリーは、基材表面Ｓ上の望ましい位置に取り付けることを可能にする構造９３，９４を可能にするケミストリーであり、いくつかの実施例では、官能化された保持体構造９３，９４の捕捉ケミストリーが、それぞれの官能化された保持体構造９３，９４を受け取ることを可能にする捕捉サイト９５，９６の捕捉ケミストリーとそれぞれ対応する。例えば、官能化保持体構造９３および捕捉部位９５は、それぞれ、１つの型の受容体－配位子結合対のメンバーを含み得、一方、官能化保持体構造９４および捕捉部位９６は、それぞれ、異なった型の受容体－配位子結合対のメンバーを含み得る。種々の化学的性質は、官能化保持体構造９３、９４（およびそれぞれの領域１４、１６）が基材面Ｓ上の所望の領域で捕捉されることに耐えるのを助けることができる。
捕捉部位９５、９６は、それぞれの官能化保持体９３、９４を基材２６（または多層基材の樹脂５４’）上に固定化することが物理的および／または化学的に可能である。捕捉部位９５、９６は、隣接領域１４、１６を有することが望ましい任意の適切な位置に配置することができる。基材２６を横切る捕捉部位９５、９６の位置は、均一であってもよく（図３６Ａおよび３６Ｂを参照のこと）、または不均一であってもよい。捕捉部位９５、９６は、捕捉部位９５、９６（例えば、斑点、ウェル、張出し部など）の構成、および捕捉部位９５、９６によって捕捉される官能化保持体９３、９４の種類に少なくとも部分的に依存し得る、任意の好適な形、幾何学的形状および寸法を有し得る。
いくつかの実施例では、捕捉部位９５、９６は、基材面Ｓの一部に適用される様々な化学捕捉剤である。本明細書に開示される化学捕捉剤の任意の例を使用することができる。一例では、それぞれの化学捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、または別の適切な技法を使用して、所望の位置に堆積させることができる。
他の実施例では、捕捉部位９５、９６は、基材２６（または樹脂５４’）の表面Ｓに画定されるそれぞれのウェルを含む。ウェルは、使用される基材（例えば、単層または多層）に応じて、エッチングまたはインプリントを使用して形成することができる。ウェルは、凹部２８について本明細書に記載したものなど、任意の適切な形状および幾何学的形状を有することができる。
いくつかの実施例では、ウェルは、追加の化学捕捉剤を添加されない。これらの実施例では、開口部寸法は、それぞれの官能化保持体９３、９４が（例えば、形に基づいて）対応するウェルに自己集合することを可能にする。他の例では、ウェルは、それに添加されるそれぞれの化学捕捉剤を有する。
捕捉部位９５、９６の他の例には、ウェルおよびその表面に化学捕捉剤を有する捕捉ビーズが含まれる。捕捉ビーズは、ウェルに適合するようにサイズ決定され得る。いくつかの例では、捕捉ビーズは、隣り合う間隙領域３０、３０’と同一平面上にあるか、またはわずかに上に延在してもよく、その結果、そこに最終的に結合する官能化保持体構造９３、９４は、ウェルに閉じ込められない。例えば、捕捉ビーズは、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレン、およびアクリル酸塩からなる群から選択される。本明細書中に開示される化学捕捉剤の任意の例は、捕捉ビーズの表面上で使用され得、そして捕捉ビーズがウェルに導入される前に捕捉ビーズ上にコーティングされ得る。これらの捕捉部位９５、９６のウェルおよびビーズの構成は、官能化保持体９３、９４（結合された場合）が、互いに近接する領域１４、１６を形成するようなものであり得る。
捕捉部位９５、９６のウェルの深さは、化学捕捉剤がそこに導入されるべきかどうか、および捕捉ビーズがそこに導入されるべきかどうかに依存して変化し得る。深さは、少なくともこれらの材料を収容するように選択することができる（すなわち、材料はウェルに収容される）。一例では、ウェルの深さは、約１ｎｍ～約５ミクロンの範囲である。
別の例として、捕捉部位９５、９６は、基材２６（または樹脂５４’）に規定される張出し部を含む。張出し部は、隣り合う面から外側（上方）に延びる三次元構造である。張出し部は、エッチング、フォトリソグラフィー、インプリントなどによって生成することができる。
張出し部捕捉部位９５、９６には任意の適当な三次元形状を使用することができるが、少なくとも実質的に扁平状な上面を有する形状が望ましい場合がある。例示的な張出し部形状は、球、円柱、立方体、多角形プリズム（例えば、直角プリズム、六角形プリズムなど）などを含む。
それぞれの張出し部捕捉部位９５、９６の上面には、様々な化学捕捉剤を適用することができる。本明細書に開示される化学捕捉剤の任意の例が使用されてもよく、任意の結合技術が、化学捕捉剤を張出し部の上面に適用するために使用されてもよい。
捕捉部位９５、９６は、捕捉剤、ウェルなどの両方であると記載されているが、捕捉部位９５、９６のタイプの任意の組み合わせが、フローセル上で一緒に使用され得る（例えば、捕捉剤およびウェル）ことが理解されるべきである。
図３６Ａでは、表面Ｓ上の捕捉部位９５、９６は異なる形状を有する。それぞれ対応する形状を有する官能化保持体構造９３、９４がフローセルにロードされると（図３６Ｂ）、官能化保持体構造９３、９４は、物理的な排除および／または捕捉ケミストリーのいずれかによって自己集合し、その結果、官能化保持体構造９３が捕捉部位９５に結合し、官能化保持体構造９４が捕捉部位９６に結合する。
図３７Ａでは、表面Ｓ上の捕捉部位９５、９６も異なる形状を有するが、図３６Ａに図示例とは異なるように配置される。それぞれ対応する形状を有する官能化保持体構造９３、９４がフローセルにロードされると（図３７Ｂ）、官能化保持体構造９３、９４は、物理的な排除および／または捕捉ケミストリーのいずれかによって自己集合し、その結果、官能化保持体構造９３が捕捉部位９５に結合し、官能化保持体構造９４が捕捉部位９６に結合する。
図３６Ｂおよび図３７Ｂに示される両方の構成は、基材面Ｓを横切る独立した位置に領域１４、１６の配列をもたらす。
図２～図１０、図３３Ａ、図３４Ｓ、図３６Ｂ、および図３７Ｂは、基材２６（または樹脂５４’）に接合された蓋を有さないフローセルの領域１４、１６の様々な構成を示す。図示されていないが、フローセルは、間隙領域３０、３０’の少なくとも一部に結合された蓋を有することができることを理解されたい。いくつかの例において、蓋は、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’のグラフト化の前または後に結合され得る。蓋がプライマーグラフトの前に結合される場合、フロースルー処理がグラフトのために使用され得ることが理解されるべきである。フロースルー処理において、プライマー溶液または混合物は、それぞれのインプットポート（図示せず）を通ってフローチャネル（蓋と間隙領域３０、３０’との間に規定される）に導入され得、プライマー１８、１８’、２０、２０’、１９、１９’、２１、２１’がそれぞれの領域１４、１６に結合するのに十分な時間（すなわち、インキュベーション期間）、フローチャネルに維持され得、次いで、それぞれのアウトプットポート（図示せず）から除去され得る。プライマー１８、１８’、２０、２０’、１９、１９’、２１、２１’の結合後、追加の流体は、今や官能化された凹部および流路を洗浄するために、流路を通って導かれてもよい。
蓋は、単一の流路または複数の流体的に分離された流路を画定するように、間隙領域３０上に配置されてもよい。
蓋は、基材２６に向けられる励起光に対して透明な任意の物質であってもよい。例として、蓋は、ガラス（例えば、ホウケイ酸塩、溶融シリカなど）、プラスチックなどであってもよい。好適な瑚珪酸ガラスの商業的に入手可能な例は、ショットノースアメリカ社から入手可能なＤ２６３（登録商標）である。好適なプラスチック材料、すなわちシクロオレフィンポリマーの市販の例は、ゼオンケミカルズ（Zeon Chemicals）Ｌ．Ｐ．から入手可能なゼオノア（登録商標）製品である。
いくつかの例では、蓋は、蓋が接合される間隙領域３０の一部の形に対応するサイドウォールと一体的に形成されてもよい。例えば、凹部は、実質的に平坦な（例えば、上部）部分および実質的に平坦な部分から延びるサイドウォールを形成するために、透明なブロックにエッチングされてもよい。エッチングされた塊が間隙領域３０に取り付けられると、凹部は流路となる。他の例では、サイドウォール（複数可）および蓋は、互いに結合される別個の構成要素であってもよい。例えば、蓋は、少なくとも実質的に平坦な外装と、流路の一部（例えば、天板部）を画定する少なくとも実質的に平坦な内面とを有する実質的に矩形の塊であってもよい（間隙領域３０の一部に接合されると）。ブロックは、間隙領域３０の一部に接合され、流路のサイドウォールを形成するサイドウォール上に取り付けられてもよい（例えば、接合されてもよい）。この実施形態では、サイドウォールは、スペーサー層（後述）について本明細書に記載される材料のいずれかを含むことができる。
蓋は、レーザー接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、プラズマ活性化接合、ガラスフリット接合、または当技術分野で知られている他の方法など、任意の好適な技法を使用して接合することができる。例えば、蓋を間隙領域３０の一部に結合するために、スペーサー層が使用されてもよい。スペーサー層は、間隙領域３０の少なくとも一部と蓋とを一緒に封止する任意の物質であってもよい。
一例では、スペーサー層は、蓋および／または基材２６（または、例えば、基材２６のパターン化された樹脂）によって透過される波長の放射を吸収する放射吸収材であってもよい。次に、吸収エネルギーは、スペーサー層と蓋との間、およびスペーサー層と基材２６との間の結合を形成する。この放射線吸収物質の例は、デュポン（米国）からの黒色ＫＡＰＴＯＮ（登録商標）（カーボンブラックを含むポリイミド）であり、これは約１０６４ｎｍで吸収する。ポリイミドは、天然のポリイミド物質によって著しく吸収されるもの（例えば、４８０ｎｍ）に波長を変えなければならないことを除いて、カーボンブラックを加えることなく使用することができることを理解されたい。別の例として、ポリイミドＣＥＮ ＪＰは、５３２ｎｍの光で照射された場合に結合され得る。スペーサー層が放射線吸収材である場合、スペーサー層は、スペーサー層が所望の接合領域に接触するように、蓋と間隙領域３０の一部との間のインタフェースに配置されてもよい。適当な波長のレーザーエネルギがインタフェースに印加される（すなわち、放射線吸収物質が照射される）間に、圧力が適用されてもよい（例えば、約１００ｐｓｉの圧）。レーザーエネルギは、好適な結合を達成するために、上から及び下からの両方からインタフェースに印加されてもよい。
別の実施例では、スペーサー層は、それに接する放射線吸収材を含むことができる。放射線吸収材は、スペーサー層と蓋との間のインタフェース、並びにスペーサー層と間隙領域３０の一部との間のインタフェースに適用することができる。例えば、スペーサー層は、ポリイミドであってもよく、別個の放射線吸収物質は、カーボンブラックであってもよい。この実施例では、別個の放射線吸収材は、スペーサー層と蓋との間、およびスペーサー層と間隙領域３０の一部との間に結合を形成するレーザーエネルギを吸収する。この実施形態では、適当な波長のレーザーエネルギがインタフェースに印加されている間（すなわち、放射線吸収物質が照射されている間）、それぞれのインタフェースで圧迫を加えることができる。
同時ペアエンドシーケンシング方法
本明細書中に記載されるプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’を含むフローセルの任意の例は、同時ペアエンド配列決定において使用され得、ここで、順方向および逆方向ストランド（例えば、ストランド４０および４４）は、同時に読み出される。
切断不可能な第１の鋳型鎖４０のクラスターが領域１４に生成され、切断不可能な第２の鋳型鎖４４のクラスターが領域１６に生成されると（図７Ｃ～図７Ｇを参照して説明される）、遊離末端は、望ましくないプライミングを防ぐためにブロックされ得る。残存する任意のプライマーの遊離末端もまた、ブロックされ得ることが理解されるべきである。
これらの方法では、未切断の第１の鋳型鎖４０および未切断の第２の鋳型鎖４４にそれぞれハイブリダイズすることができる配列決定プライマーを含む組み込み混合物を添加することができる。それぞれの鋳型鎖４０、４４に沿った配列決定プライマーの伸長をモニターして、鋳型鎖４０、４４中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学的処理は、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）またはライゲーション（例えば、リガーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリメラーゼベースのプロセスにおいて、蛍光標識されたヌクレオチドは、それぞれの配列決定プライマーに付加されたヌクレオチドの順序およびタイプの検出が鋳型の配列を決定するために使用され得るように、鋳型依存的な様式でそれぞれの配列決定プライマーに付加される。例えば、合成サイクルによって第１の配列決定を開始するために、１つ以上の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどが、フローセルに／を通って送達され得、ここで、配列決定プライマー伸長は、標識されたヌクレオチドが、それぞれの鋳型４０、４４に相補的である発生期ストランドに組み込まれることを引き起こす。取り込み有害事象は、それぞれの鋳型４０、４４で生成された蛍光シグナルの実質的な物理的重複なしに、画像化有害事象を通してタンデムに検出することができる。これにより、それぞれの鋳型４０、４４で同時に塩基を呼び出すことができる。画像化事象の間、イルミネーションシステム（図示せず）は、フローセルに励起光を提供し得、画像は、捕捉および分析され得る。例として、照度は、レーザー、発光ダイオード、平面導波路などを用いて達成されてもよい。
いくつかの実施例において、蛍光標識されたヌクレオチドは、ヌクレオチドがそれぞれの鋳型４０、４４に付加されると、さらなるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性をさらに含み得る。例えば、可逆的停止部分を有するヌクレオチドアナログは、鋳型４０、４４に付加され得、その結果、その部分を除去するために脱ブロッキング剤が送達されるまで、その後の伸長が起こり得ない。したがって、可逆的終結を使用する例では、脱ブロッキング試薬をフローセルなどに送達することができる（検知が起こった後）。
洗浄は、様々な流体送達工程の間に行うことができる。次いで、配列決定サイクルをｎ時間繰り返して、鋳型をｎヌクレオチド伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。
ペアエンド配列決定は、ユーザがフラグメントの両端を配列決定し、高品質で整列可能な配列データを生成することを可能にする。ペア末端配列決定は、ゲノム再配列および反復配列エレメント、ならびに遺伝子融合および新規転写物の検出を容易にする。１つの例示的なペアエンド配列決定方法が詳細に記載されているが、本明細書中に記載されるフローセルは、遺伝子型決定のために、または他の化学的および／または生物学的適用において、他の配列決定プロトコルとともに利用され得ることが理解されるべきである。別例では、本明細書に開示されるフローセルは、オンセルライブラリ生成のために使用されてもよい。
キット
本明細書中に記載されるフローセルの任意の例は、キットの一部であり得る。
キットのいくつかの例には、フローセル、鋳型混合／流体、および組み込み混合物が含まれる。フローセルのこれらの例は、それに結合するプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’の両方を有する。鋳型混合物／流体は、配列決定される鋳型を含み、組み込み混合物は、切断不可能な第１の鋳型鎖４０および切断不可能な第２の鋳型鎖４４（鋳型を使用して形成される）にそれぞれハイブリダイズすることができる配列決定プライマーを含む。
キットの他の例には、本明細書に記載のフローセルおよびプライミング流体が含まれる。フローセルのこれらの例は、それに結合する１つのプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄを有しており、プライミング流体を使用して、他方のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、または１２Ｄ’を導入することができる。このキットの一実施例では、フローセルは、間隙領域３０によって分離された凹部２８を含む基材２６と、各凹部内のいくつかの官能基がキャップされている第１のポリマー層３２と、凹部２８の各々内の第１のポリマー層３２の他の官能基に結合された第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄと、間隙領域３０上の第２のポリマー層３２’とを含み、プライミング流体は、流体キャリアと、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄとは異なった第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、または１２Ｄ’とを含む。この例示的なキットはまた、鋳型混合物および組み込み混合物を含み得る。
ビーズベースのフローセル
図９は、領域１４または１６の一方がビーズ５０の一部であるフローセルの１つの構成を示す。このセクションは、このフローセル構成のための様々な例および方法を説明する。
本明細書に開示されるこのフローセル１０Ａ（図１３Ｄおよび１４）、１０Ｂ（図１５Ｄおよび１６）、１０Ｃ（図１７Ｄおよび１８）、１０Ｄ（図１９Ｄおよび２０）の例は、保持体５２上の保持体５２およびパターン化された樹脂５４’、５４’’を含み、パターン化された樹脂は、間隙領域３０によって分離された凹部２８Ａ、２８Ｂまたは２８Ｃを含む。凹部２８Ａ、２８Ｂ、または２８Ｃを形成するために樹脂５４をパターン化する方法の一例を、図１１Ａから１１Ｄまでにともに示す。より具体的には、図１１Ａ～１１Ｃは、凹部２８Ａ、２８Ｂ、の形成を示し、図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｄは、凹部２８Ｃの形成を示す。
図１１Ａは、保持体５２を示し、図１１Ｂは、保持体５２上に堆積された樹脂５４を示す。本明細書に記載される基材１２の任意の実施例が、保持体５２のために使用されてもよい。
好適な樹脂５４のいくつかの例は、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの例が提供されたが、硬化され得る任意の樹脂が使用され得ると考えられる。
本明細書で使用する「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」（ＰＯＳＳ）および「ＰＯＳＳベースの樹脂」という用語は、シリカ（ＳｉＯ２）とシリコン（Ｒ２ＳｉＯ）との間の混成中間体（ＲＳｉＯ１．５）である成分組成を指す。ＰＯＳＳの例は、Kehagias et al.,Microelectronic Engineering 86 （2009）, pp．776－778に記載されているものであることができ、その全体が参照により組み込まれる。化合物は、化学式［ＲＳｉＯ３／２］ｎを有する有機ケイ素化合物であり、ここで、Ｒ基は、同一であっても異なっていてもよい。この配合物は、モノマー単位として、１つ以上の異なったケージまたはコア構造を含んでいてもよい。場合によっては、構造は、以下の多八面体のケージまたはコア構造を含む。場合によっては、多面体構造は、以下のようなＴ８構造であってもよく、
によって表される。このモノマー単位は、典型的には、８アームの官能基Ｒ１～Ｒ８を有する。
モノマー単位は、以下のような、１０個のケイ素原子および１０個のＲ基（例えば、Ｔ１０と称される）を有するケージ構造を有し得るか、または１２個のケイ素原子および１２個のＲ基（例えば、Ｔ１２と称される）を有するケージ構造
を有し得る。ＰＯＳＳベースの物質は、Ｔ６、Ｔ１４またはＴ１６ケージ構造を含むことができる。平均ケージ含有量は、合成中に調整することができ、および／または精製的な方法によって制御することができ、本明細書に開示される実施例では、モノマー単位のケージサイズの分布を使用することができる。例として、ケージ構造のいずれかは、使用される合計ＰＯＳＳモノマー単位の約３０％～約１００％の範囲の量で存在し得る。ＰＯＳＳベースの材料は、開いたケージ構造および部分的に開いたケージ構造とともに、ケージ構造の混合物であってもよい。したがって、ＰＯＳＳベースの樹脂前駆体または樹脂は、シルセスキオキサン構成の混合物であってもよいエポキシＰＯＳＳ材料を含んでもよい。例えば、本明細書中に記載される任意のＰＯＳＳ材料は、別個のＰＯＳＳケージと、非別個のシルセスキオキサン構造および／または不完全に縮合した別個の構造（例えば、ポリマー、ラダーなど）との混合物であり得る。したがって、部分的に縮合した材料は、本明細書に記載されるように、いくつかのケイ素頂点にエポキシＲ基を含むが、いくつかのケイ素原子は、Ｒ基で置換されず、代わりにＯＨ基で置換され得る。いくつかの例では、ＰＯＳＳ材料は、以下のような様々な形状の混合物を含む：
（ａ）


（ｂ）


および／または（ｃ）。

本明細書に開示される実施例のいくつかでは、Ｒ１～Ｒ８またはＲ１０またはＲ１２の少なくとも１つは、エポキシを含み、したがって、ＰＯＳＳは、エポキシＰＯＳＳと呼ばれる。いくつかの例では、８、１０、または１２個のアーム、またはＲ基などのアームの大部分は、エポキシ基を含む。他の例では、Ｒ１～Ｒ８またはＲ１０またはＲ１２は同じであり、したがって、Ｒ１～Ｒ８またはＲ１０またはＲ１２の各々はエポキシ基を含む。さらに他の例では、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１０、またはＲ１２は同じではなく、したがって、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１０、またはＲ１２のうちの少なくとも１つはエポキシを含み、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１０、またはＲ１２のうちの少なくとも１つは非エポキシ官能基である。非エポキシ官能基は、（ａ）エポキシ基に対して直角に反応性である（すなわち、エポキシ基とは異なった条件下で反応する）、樹脂を増幅プライマー、ポリマー、または重合剤に結合させるためのハンドルとして働く反応性基、または（ｂ）樹脂の機械的または機能的特性、例えば、表面エネルギー調節を調節する基であってもよい。いくつかの例では、非エポキシ官能基は、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アミノ、水酸基、アルキニル、ケトン、アルデヒド、エステル基、アルキル、アリール、アルコキシ、およびハロアルキルからなる群から選択される。いくつかの態様では、非エポキシ官能基は、樹脂の表面エネルギーを増大させるように選択される。これらの他の実施例では、エポキシ基対非エポキシ基の比率は、７：１～１：７、または９：１～１：９、または１１：１～１：１１の範囲である。実施例のいずれにおいても、二置換または一置換（末端）エポキシ基は、紫外（ＵＶ）光および酸を用いた開始時にモノマー単位が重合して架橋マトリックスになることを可能にする。いくつかの態様では、エポキシＰＯＳＳは末端エポキシ基を含む。このタイプのＰＯＳＳの例は、以下の構造：
を有するグリシジルＰＯＳＳである。
エポキシＰＯＳＳはまた、１つ以上の官能基Ｒ１～Ｒ８またはＲ１０またはＲ１２として、樹脂またはコアまたはケージ構造に組み込まれた、制御されたラジカル重合（ＣＲＰ）剤および／または別の目的の官能基を含む、改質エポキシＰＯＳＳであってもよい。
本明細書に開示されるＰＯＳＳベースの樹脂の他の例では、Ｒ１～Ｒ８またはＲ１０またはＲ１２のそれぞれは、アクリル酸塩、メタクリレート、エチレングリコール、または短ポリエチレングリコール鎖（最大５０繰り返し単位）などの任意の非エポキシ基を含む。ラジカル重合することができる任意の非エポキシＰＯＳＳ一量体を使用することができる。一例は、以下の構造：
を有するメタクリルＰＯＳＳケージ混合物である。
別の例は、以下の構造：
を有するＰＥＧ－ＰＯＳＳケージ混合物である。
ＰＥＧ－ＰＯＳＳの例では、Ｒグループの末端メチル基（ＣＨ３）をＸに置き換えてもよいが、ここでＸはアクリル基、メタクリル基、または別の適当な末端基である。
他の樹脂５４を使用することもできる。例としては、（非ＰＯＳＳ）エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（開環エポキシであってもよい）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせが挙げられる。例として、エポキシおよびアクリレートモノマーを含む樹脂が使用され得るか、またはエポキシおよびエチレンモノマーを含む樹脂が使用され得る。
好適な樹脂５４の別の例は、非晶質フッ素ポリマーである。商業的に入手可能な非晶質（非結晶）フッ素ポリマーの例は、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標）である。
図１１Ｂに示すように、樹脂５４は保持体５２上に堆積される。例えば、樹脂５４の堆積は、化学蒸着、ディップ法、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシング、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾルプリンティング、スクリーンプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、またはインクジェットプリンティングを含む。
次いで、堆積された樹脂５４は、本明細書に記載されたパターン化技術のいずれかを用いてパターン化される。図１１Ｂに示す実施形態では、ナノインプリントリソグラフィを使用して樹脂５４をパターン化する。樹脂５４を堆積させた後、ソフトベークして余分な溶剤を除去することができる。ナノインプリントリソグラフィ金型または加工スタンプ５６を樹脂５４の層に押し付けて、樹脂５４上にインプリントを生成する。言い換えれば、樹脂５４は、加工スタンプ５６の張出し部によって、へこんだり、穿孔されたりする。次いで、樹脂５４は、加工スタンプ５６を所定の位置にして硬化させることができる。硬化は、可視光照射または紫外（ＵＶ）照射などの化学線、またはフォトレジストを使用する場合には約２４０ｎｍ～３８０ｎｍの範囲の波長の照射に曝すことによって、または熱硬化性レジストを使用する場合には熱に曝すことによって達成することができる。硬化は、重合および／または架橋を促進し得る。一例として、硬化は、ソフトベーク（例えば、溶媒を除去するための）およびハードベーキングを含む複数の段階を含むことができる。ソフトベーキングは、約５０℃～約１５０℃の範囲のより低い温度で行うことができる。ハードベーキングの持続時間は、約１００℃～約３００℃の範囲の温度で約５秒～約１０分間続くことができる。ソフトベーキングおよび／またはハードベーキングに使用することができるデバイスの例には、ホットプレート、オーブンなどが含まれる。
硬化後、加工スタンプ５６は解放される。これにより、樹脂５４に地形的特徴、すなわち凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃが形成される。図１１Ｃに示すように、凹部２８Ａおよび２８Ｂが形成された樹脂５４は、パターン化された樹脂５４’と呼ばれる。図１１Ｄに示すように、凹部２８Ｃが形成された樹脂５４は、パターン化された樹脂５４’’と呼ばれ、パターン化された樹脂５４’、５４’’は、硬化を完了し、インプリントされたトポグラフィを固定するために、さらにハードベーキングに供される。いくつかの例では、ハードベーキングは、約６０℃～約３００℃の範囲の温度で行うことができる。
図１１Ｃに示される凹部２８Ａおよび２８Ｂは、異なるサイズを有する。この例では、「異なったサイズ」は、凹部２８Ｂのいくつかが他の凹部２８Ａのいくつかよりも小さい開口部寸法を有することを意味し、この例では、「開口部寸法」は、パターン化された樹脂５４’上の各凹部開口部によって占められる面積および／またはパターン化された樹脂５４’上の各凹部開口部の径を指す。図１１Ｃに示される例では、各凹部２８Ｂの開口部の面積および直径は、各凹部２８Ａの開口部の面積および直径よりも小さい。より大きな凹部２８Ａの開口部の面積および直径は、そこに導入されるビーズ５０の粒径（例えば、直径）に依存する。より小さい凹部２８Ｂの開口部の面積及び径は、ビーズ５０の粒径よりも小さい。これらの開口寸法は、ビーズ５０が、サイズ排除によって凹部２８Ｂではなく、凹部２８Ａ内に自己集合することを可能にする。
図１１Ｄに示される凹部２８Ｃは、相互接続されるが異なるサイズを有する２つの部分３４、３４’を含む。この例では、「異なったサイズ」とは、凹部２８Ｃの各々の部分３４’が部分３４よりも小さい開口部寸法を有することを意味し、また、この例では、「開口部寸法」は、パターン化された樹脂５４上の各部分開口部によって占められる面積、および／またはパターン化された樹脂５４’’上の各部分開口部の径を指す。図１１Ｄに示す実施形態では、各部分３４’の開口部の面積および直径は、各部分３４の開口部の面積および直径よりも小さい。より大きい部分３４の開口部の面積および直径は、そこに導入されるビーズ５０の粒径（例えば、直径）に依存する。小さな部分３４’の開口部の面積及び径は、ビーズ５０の粒径よりも小さい。これらの開口部の寸法は、ビーズ５０が、サイズ排除によって部分３４’ではなく部分３４に自己集合することを可能にする。
表面上のそれぞれの凹部開口部または部分開口部の表面積の例は、少なくとも約１×１０－３μｍ２、少なくとも約１×１０－２μｍ２、少なくとも約０．１μｍ２、少なくとも約１μｍ２、少なくとも約１０μｍ２、少なくとも約１００μｍ２、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、面積は、最大で約１×１０３μｍ２、最大で約１００μｍ２、最大で約１０μｍ２、最大で約１μｍ２、最大で約０．１μｍ２、最大で約１×１０－２μｍ２、またはそれ以下であってもよい。いくつかの例では、各凹部２８Ａ、２８Ｂまたは部分３４、３４’の直径は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、直径は、多くとも約１×１０３μｍ、多くとも約１００μｍ、多くとも約１０μｍ、多くとも約１μｍ、多くとも約０．５μｍ、多くとも約０．１μｍ、またはそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。それぞれの凹部開口部または部分開口部の面積および径は、上記で特定した値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。凹部２８Ａの開口部の面積および直径が凹部２８Ｂの開口部の面積および直径よりも大きい限り、または凹部２８Ｃの部分３４の開口部の面積および直径が凹部２８Ｃの部分３４’の開口部の面積および直径よりも大きい限り、任意の望ましい面積および直径を使用することができる。
規則的なパターン、反復パターン、および非規則的なパターンを含む、凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃの多くの異なるレイアウトを想定することができる。例えば、凹部２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃは、密接にパッキングし、密度を改善するために、六角形の格子状に配置されている。他のレイアウトとしては、例えば、凹部２８Ａまたは部分３４が機能化ビーズ５０（例えば、図１３Ｃ、１４などに示されるように、その上に形成された領域１６を有するコア構造４９）を受容することができる限り、例えば、直線（すなわち、矩形）レイアウト、三角形レイアウトなどが挙げられ得る。いくつかの例では、レイアウトまたはパターンは、行および列にある凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃのｘ－ｙフォーマットとすることができる。いくつかの他の例では、レイアウトまたはパターンは、凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃおよび／または間隙領域３０の繰り返し配列であってもよい。さらに他の例では、レイアウトまたはパターンは、凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃおよび／または間隙領域３０のランダムな配列であってもよい。パターンは、ストライプ、スワール、線、三角形、長方形、円、弧、小切手、プライド、対角線、矢印、正方形、および／またはクロスハッチを含むことができる。
凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃのレイアウトまたはパターンは、本明細書に記載されるように、密度および／または平均ピッチに関して特徴付けられ得ることが理解されるべきである。
さらに、凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃは、任意の適切な深さを有してもよい。
図１１Ｃに示されるパターン化された樹脂５４’または図１１Ｄに示されるパターン化された樹脂５４’’を使用するフローセルの例を作製するための方法１００の例は、図１２に示される。図１２Ｃに示されるように、方法１００は、保持体５２（参照番号１０２）上のパターン化された樹脂５４’または５４’’の凹部２８Ａ、２８Ｂまたは２８Ｃにポリマー３２を選択的に適用すること；第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄを、凹部２８Ａ、２８Ｂまたは２８Ｃ（参照番号１０４）の少なくともいくつかでポリマー３２にグラフトすること；および第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄをグラフトする前または後に、ｉ）凹部２８Ｃの少なくともいくつかのそれぞれの一部、またはｉｉ）少なくともいくつかの凹部２８Ｂより大きい開口寸法を有する第２の凹部２８Ａにおいて、官能基を有するビーズ５０を堆積することを含み、
官能基を有するビーズ５０はコア構造４９の表面に取り付けられた第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’を含み、第１および第２のプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’は異なる。凹部２８Ａ、２８Ｂを含むこの方法１００の異なる例を、図１３Ａ～１３Ｄおよび１４ならびに図１５Ａ～１５Ｄ、１６を参照してさらに説明する。凹部２８Ｃを含むこの方法１００の異なる例を、図１７Ａ～図１７Ｄおよび図１８ならびに図１９Ａ～１９Ｄ、２０を参照してさらに説明する。
図１３Ａは、より大きな凹部２８Ａおよびより小さな凹部２８Ｂを含む、パターン化された樹脂５４’を示す。凹部１６Ａおよび１６Ｂの深さは、明確化のために省略されている。
図１３Ｂは、凹部２８Ａおよび２８Ｂの各々へのポリマー３２の選択的適用を示す。ポリマー３２の選択的適用は、間隙領域３０および凹部２８Ａ、２８Ｂ内の露出表面の活性化、活性化された間隙領域３０上および凹部２８Ａ、２８Ｂ内にポリマー３２を堆積させること、および間隙領域３０からポリマー３２を除去することを含む、複数のプロセスを含み得る。
いくつかの例では、活性化は、パターン化された樹脂５４’の間隙領域３０と、凹部２８Ａ、２８Ｂ内に露出された保持体５２の領域とを含む表面をシラン化することを含む。シラン化は、任意のシランまたはシラン誘導体を使用して達成することができる。シランまたはシラン誘導体の選択は、シランまたはシラン誘導体とポリマー３２との間に共有結合を形成することが望ましい場合があるので、形成されるポリマー３２に部分的に依存し得る。シランまたはシラン誘導体を結合させるために使用される方法は、使用されるシランまたはシラン誘導体に依存して変化し得る。いくつかの例を本明細書に記載する。
好適なシラン化方法の例には、蒸着（例えば、ＹＥＳ法）、スピンコーティング、または他の堆積方法が含まれる。
ＹＥＳＣＶＤオーブンを使用する実施例では、パターン化された樹脂５４’をその上に有する保持体５２は、ＣＶＤオーブン内に配置される。チャンバを排気し、次いでシラン化サイクルを開始することができる。サイクルの間、シランまたはシラン誘導体の容器は、適切な温度（例えば、ノルボルネンシランについて約１２０℃）に維持されてもよく、シランまたはシラン誘導体蒸気ラインは、適切な温度（例えば、ノルボルネンシランについて約１２５℃）に維持されてもよく、真空ラインは、適切な温度（例えば、約１４５℃）に維持されてもよい。
別の例では、シランまたはシラン誘導体（例えば、液状ノルボルネンシラン）は、ガラス瓶の内部に堆積され、パターン化された樹脂５４’を有する保持体５２を有するガラスバキュームデシケータの内部に配置されてもよい。次いで、デシケータを約１５ｍＴｏｒｒ～約３０ｍＴｏｒｒの範囲の圧力まで排気し、約６０℃～約１２５℃の範囲の温度でオーブン内に配置することができる。シラン化を進行させ、次いで乾燥器を炉から取り出し、冷却し、大気中で排気する。
蒸着、ＹＥＳ法および／または真空デシケータは、多種のシランまたはシラン誘導体、例えばシクロアルケン不飽和部分を含むシランまたはシラン誘導体、例えばノルボルネン、ノルボルネン誘導体（例えば、炭素原子の１つの代わりに酸素または窒素を含む（ヘテロ）ノルボルネン）、トランスシクロオクテン、トランスシクロオクテン誘導体、トランスシクロペンテン、トトランスシクロヘプテン、トランス－シクロノネン、ビシクロ［３．３．１］ノン－１－エン、ビシクロ［４．３．１］ｄｅｃ－１（９）－エン、ビシクロ［４．２．１］ノン－１（８）－エン、およびビシクロ［４．２．１］ノン－１－エンなどと共に使用することができる。これらのシクロアルケンのいずれも、例えば、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルなどのＲ基で置換することができる。ノルボルネン誘導体の一例としては、［（５－ビシクロ［２．２．１］ヘプト－２－エニル）エチル］トリメトキシシランが挙げられる。他の例として、シランまたはシラン誘導体が、シクロオクチン、シクロオクチン誘導体、またはビシクロノニン（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン４－インまたはその誘導体、ビシクロ［６．１．０］ノン２－イン、またはビシクロ［６．１．０］ノン３－イン）などのシクロアルキン不飽和部分を含む場合、これらの方法を使用することができる。これらのシクロアルキンは、本明細書中に記載されるＲ基のいずれかで置換され得る。
シラン又はシラン誘導体の結合は、間隙領域３０及び凹部２８Ａ、２８Ｂの両方に活性化表面を形成する。
次いで、ポリマー層３２は、本明細書に記載されるように適用されてもよい。例として、ポリマー（例えば、ＰＡＺＡＭ）は、スピンコーティング、またはディッピングもしくはディップコーティング、または陽圧もしくは陰圧下での官能化分子のフロー、または別の好適な技術を使用して堆積されてもよい。ポリマー層３２を形成するために堆積されたポリマーは、混合物中に存在してもよい。例えば、混合物は、水中またはエチルアルコールと水の混合物中のＰＡＺＡＭを含む。
コーティングされた後、ポリマーを含む混合物はまた、硬化工程にさらされて、パターン化された樹脂５４’の活性化された間隙領域３０を横切って、そして凹部２８Ａ、２８Ｂ中にポリマー層３２を形成し得る。一例では、硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。別の例では、時間は、１０秒～少なくとも２４時間の範囲であってもよい。さらに別の例では、時間は、約５分～約２時間の範囲であってもよい。
活性化された（この例ではシラン化された）表面へのポリマー層３２の結合は、共有結合を介してもよい。共有結合は、種々の使用の間に最終的に形成されるフローセルの寿命を通して、凹部２８Ｂ中に少なくとも第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄを維持するのに有用である。以下は、活性化された（例えば、シラン化された）表面とポリマー層３２との間で起こり得る反応のいくつかの例である。
シランまたはシラン誘導体が不飽和部分としてノルボルネンまたはノルボルネン誘導体を含む場合、ノルボルネンまたはノルボルネン誘導体は、ｉ）ＰＡＺＡＭのアジド（azide）／アジド（azido）基との１，３－双極性環化付加反応を受けることができ、ｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したテトラジン基とのカップリング反応を受けることができ、ＰＡＺＡＭに結合したヒドラゾン基との環化付加反応を受けることができ、ＰＡＺＡＭに結合したテトラゾール基とのフォトクリック反応を受けることができ、またはＰＡＺＡＭに結合したニトリルオキシド基との環化付加を受けることができる。
シランまたはシラン誘導体が不飽和部分としてシクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体を含む場合、シクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体は、ｉ）ＰＡＺＡＭのアジド（azide）／アジド（azido）との歪み促進アジド－アルキン１，３－環化付加（ＳＰＡＡＣ）反応を受けるか、またはｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したニトリルオキシド基との歪み促進アルキン－ニトリルオキシド環化付加反応を受けることができる。
シランまたはシラン誘導体が、不飽和部分としてビシクロノニンを含む場合、ビシクロノニンは、二環系における歪みのために、ＰＡＺＡＭに結合したアジドまたはニトリルオキシドによる同様のＳＰＡＡＣアルキン環化付加を受けることができる。
他の例では、シラン化ではなくプラズマアッシングを使用して、間隙領域３０および凹部２８Ａ、２８Ｂ内の保持体５２の露出表面を活性化することができる。プラズマアッシング後、ポリマーを含有する混合物は、プラズマアッシングされた表面上に直接スピンコーティング（または他の方法で堆積）され、次いで硬化されてポリマー層３２を形成することができる。本実施例では、プラズマアッシングにより、表面活性化剤（例えば、ヒドロキシル（Ｃ－ＯＨまたはＳｉ－ＯＨ）および／またはカルボキシル基）が生成され、それらは、凹部２８Ａ、２８Ｂにおける、間隙領域３０および保持体５２の露出表面にポリマーを接着させることができる。これらの例では、ポリマー２６は、プラズマアッシングによって生成された表面基と反応するように選択される。
活性化がシラン化またはプラズマアッシングを介して行われるかどうかにかかわらず、活性化された間隙領域３０からポリマー層３２を除去するために、研磨を行うことができる。研磨は、本明細書に記載されるように実行されてもよい。いくつかの例では、研磨はまた、間隙領域３０に隣接するシランまたはシラン誘導体を除去しても、しなくてもよい。これらのシラン化された部分が完全に除去されると、下にあるパターン化された樹脂５４’が露出されることが理解されるべきである。
図１３Ｃに示すように、方法１００のこの例では、官能基を有するビーズ５０が凹部２８Ａ内に堆積される。それぞれの官能基を有するビーズ５０は、コア構造４９と、コア構造４９の表面に結合した第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’とを含む。第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’は、本明細書中に記載されるように、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとは異なる。プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’の任意の例が使用され得る。
コア構造４９は、ビーズ／コア構造について本明細書で言及される例のいずれかであってもよい。例えば、官能基を有するビーズ５０のコア構造４９は、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレン、およびアクリル酸塩からなる群から選択される。コア構造４９は、第２のプライマー組１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’への共有結合のために、その表面上に反応性基を有することができる。このような反応性基の例としては、カルボン酸、第一級脂肪族アミン、芳香族アミン、芳香族クロロメチル（例えば、ベンジルクロライドビニル）、アミド、ヒドラジド、アルデヒド、水酸基、チオール、およびエポキシが挙げられる。これらの反応性基は、コア構造４９の表面に本質的に存在してもよく、または任意の好適な官能化技術（例えば、化学反応、コア構造４９と反応性基含有ポリマーとのコーティングなど）によってコア構造４９の表面に組み込まれてもよい。固有の反応性基またはその付加された反応性基または塗装を有するコア構造４９は、領域１６を画定する。
ビーズ５０を利用する本明細書中に開示される実施例において、１つのプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄまたは１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’は、播種後に生じる任意の伸長を阻害する３’末端のリン酸ブロック基で官能化され得る。最初の伸長が起こると（他のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’または１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ’で）、リン酸ブロックプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄまたは１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’に播種された任意のストランドと共にリン酸基が除去され、２つのプライマーグループ１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄおよび１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’の間の増幅が進行する。この方法は、１つのプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄまたは１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’のみが最初に伸長可能であるので、ポリクローン性率を減少させるのに役立つ。
図１３Ａから１３Ｄまでには示されていないが、官能化されたビーズ５０を堆積する前に、方法１００は、第２プライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’をコア構造４９に結合することにより官能化されたビーズ５０を形成することを含んでいる。官能化は、アジド（例えば、スクシンイミジル（ＮＨＳ）酸エステル）末端プライマーをコア構造４９の表面上のヒドラジンと反応させること、またはアルキン末端プライマーをコア構造の表面上のアジドと反応させること、またはアミノ末端プライマーをコア構造４９の表面上の活性化カルボキシレート基もしくはＮＨＳ酸エステルに反応させること、またはチオール末端プライマーをアルキル化反応物（例えば、ヨードアセトアミンもしくはマレイミド）、チオエーテルを有するホスホラミダイト末端プライマー、またはコア構造４９の表面上のストレプトアビジンを有するビオチン修飾プライマーと反応させることを含む、任意の好適な技術を使用して行うことができる。いくつかの核酸プライマー１９、１９’、２１、２１’は、カオトロピック剤（ＫＩ、ＮＩ、またはＮａＳＣＮ）の存在下でシリカビーズ上に捕捉され得る。具体的には、例えば、ジベンゾシクロオクチン（アルキンを含むＤＢＣＯ）末端プライマーを銅フリークリックグラフトに用いることができる。
官能化されたビーズ５０は、任意の好適な技術を用いて、パターン化された樹脂５４’上に堆積されてもよい。一例として、官能基を有するビーズ５０は、液状キャリア（例えば、水）中で混合され得、これは、パターン化された樹脂５４’の表面上にロードされ得る。別の実施形態では、官能化されたビーズ５０は、パターン化された樹脂５４’をその上に有する保持体５２も含む振とう機内で、５０μｍ～１５０μｍのスチールビーズと共にビーズ５０を振とうすることによって、凹部２８Ａ内に強制的に埋め込まれてもよい。官能基を有するビーズ５０のサイズ、並びに凹部２８Ａ及び２８Ｂのサイズのために、サイズ排除は、官能基を有するビーズ５０がより小さい凹部２８Ｂに入ることを妨げ、１つの官能基を有するビーズ５０が１つの凹部２８Ａに自己集合することを可能にする。官能化されたビーズ５０は、それぞれの凹部２８Ａに物理的に閉じ込められてもよい。あるいは、官能基を有するビーズ５０は、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンリンカーを介して、それぞれの凹部２８Ａに化学的に結合されてもよい。
図１３Ｄに示されるように、凹部２８Ｂは、次いで、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄで官能化され得る。プライマー１８、１８’および２０、２０’は、本明細書中に開示される例のいずれかであり得、そしてポリマー層３２の反応性基に結合し得る官能基を含む。凹部２８Ａ内のポリマー層３２は官能基を有するビーズ５０で覆われているので、凹部２８Ａ内のポリマー層３２は露出されず、したがって、その反応性基は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとの反応に利用できない。
プライマー１８、１８’および２０、２０’は、本明細書中に示される例のいずれかであり得、そして互いに異なり、そしてプライマー１９、１９’および２１、２１’とは異なる。例えば、プライマー２１、１９がＰ５およびＰ７Ｕプライマーを含む場合、プライマー２０、１８はＰ５ＵおよびＰ７プライマーを含み得る。この例では、第１のプライマーセット１２Ａは、切断不可能な第１のプライマー１８（例えば、Ｐ７）および切断可能な（例えば、ウラシル修飾された）第２のプライマー（例えば、Ｐ５Ｕ）を含み、第２のプライマーセット１２Ａ’は、切断可能な（例えば、ウラシル修飾された）第１のプライマー１９（例えば、Ｐ７Ｕ）および切断不可能な第２のプライマー２１（例えば、Ｐ５）を含む。本明細書中で議論されるように、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’の化学は、直交し、これは、両方のプライマー集団（セット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’）にわたる増幅、および生成された鋳型ストランドのいくつか（例えば、４２、４６）を切断し、同じ（順方向または逆方向）鋳型ストランド４０または４４を特定の領域１４または１６に残すことを可能にする。これにより、判別可能なリード１信号とリード２信号とを同時に得ることができる。
プライマー１８、１８’および２０、２０’を凹部２８Ｂ内のポリマー層３２にグラフトするために、グラフト化処理を実施することができる。一例では、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用する）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシング、または、凹部２８Ｂにおけるポリマー層３２にプライマー１８，１８，２０’および２０’を結合する別の適当な方法によってグラフト化が達成されるであろう。これらの例示的な技術のそれぞれは、プライマー溶液または混合物を利用してもよく、プライマー、水、緩衝液、および触媒を含んでもよい。
官能化されたビーズ５０は、この実施形態では、凹部２８Ａに導入される前に官能化され、したがって、ダンクケミストリーと反応しないので、ダンクコーティングを使用することができる。ダンクコーティングは、図１３Ｃに示されるように、保持体５２（その上にパターン化された樹脂５４’および凹部２８Ａ内の官能化されたビーズ５０を有する）を一連の温調槽に浸漬することを含み得る。浴槽はまた、流量制御されてもよく、および／または窒素ブランケットで覆われてもよい。槽は、プライマー溶液または混合物を含んでもよい。種々の槽を通して、プライマー１８、１８’および２０、２０’は、ポリマー層３２の反応性基に結合する。例えば、保持体５２は、プライマー１８、１８’および２０、２０’を結合させるために反応が起こるプライマー溶液またはプライマー混合物を含む第１の槽に導入され、次いで、洗浄のために追加の槽に移動される。槽から槽への移動は、ロボットアームを伴ってもよいし、手動で行ってもよい。また、乾式系をダンクコーティングに使用することもできる。
スプレーコーティングは、図１３Ｃに示されるように、プライマー溶液または混合物を保持体５２上に直接的に噴霧することによって達成され得る（その上にパターン化された樹脂５４’および凹部２８Ａ内に官能化されたビーズ５０を有する）。スプレーコーティングされたウェハは、約０℃～約７０℃の範囲の温度で、約４分～約６０分の範囲の時間インキュベートされ得る。インキュベーション後、プライマー溶液または混合物を希釈し、例えばスピンコーターを用いて除去することができる。
パドルディスペンシングは、プールおよびスピンオフ法に従って行うことができ、従って、スピンコーターを用いて行うことができる。プライマー溶液または混合物は、図１３Ｃに示されるように（パターン化された樹脂５４’および凹部２８Ａ内の官能化されたビーズ５０と共に）、保持体５２に適用され得る（手動でまたは自動化された工程を介して）。適用されたプライマー溶液または混合物は、官能基を有するビーズ５０および間隙領域３０を含む表面全体に適用または広げることができる。プライマーコーティングされた基材は、約０℃～約８０℃の範囲で約２分～約６０分間インキュベートすることができる。インキュベーション後、プライマー溶液または混合物を希釈し、例えばスピンコーターを用いて除去することができる。
いずれのグラフト化方法でも、プライマー１８、１８’および２０、２０’は、凹部２８Ｂ内の露出したポリマー層３２の反応性基と反応し、官能基を有するビーズ５０またはパターン化された樹脂５４’の間隙領域３０に対する親和性を有さない。したがって、プライマー１８、１８’および２０、２０’は、凹部２８Ｂ内のポリマー層３２に選択的にグラフトする。
図１４は、図１３Ｄに描かれたフローセル１０Ａの部分の断面図である。フローセル１０Ａは、保持体５２と、保持体５２上のパターン化された樹脂５４’であって、間隙領域３０によって分離された第１の凹部２８Ｂおよび第２の凹部２８Ａを含むパターン化された樹脂５４’と、第２の凹部２８Ａよりも小さな開口部寸法を有する第１の凹部２８Ｂと、第１の凹部２８Ｂの少なくともいくつかにそれぞれ取り付けられた第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）と、第２の凹部２８Ａの少なくともいくつかにそれぞれ配置された官能基を有するビーズ５０とを含み、官能基を有するビーズ５０は、コア構造４９の表面に取り付けられた第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、または１２Ｄ’（プライマー１９、１９’および２１、２１’を含む）を含み、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、または１２Ｄ’は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄとは異なっている。図１３Ｄおよび１４に示す例では、ポリマー層３２は、第１の凹部２８Ｂおよび第２の凹部２８Ａに存在し、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、または１２Ｄは、第１の凹部２８Ｂの少なくともいくつかのポリマー層３２に結合される。また、図１３Ｄおよび１４に示す例では、官能基を有するビーズ５０は、第２の凹部２８Ａの少なくともいくつかのポリマー層３２上に配置される。
図１５Ａ～図１５Ｄを参照すると、凹部２８Ａ、２８Ｂを含む方法１００の別の例が示されている。図１５Ａは、より大きな凹部２８Ａおよびより小さな凹部２８Ｂを含む、パターン化された樹脂５４’を描写する。凹部２８Ａおよび２８Ｂの深さは、明確にするために省略されている。
図１５Ｂは、凹部２８Ａおよび２８Ｂの各々におけるポリマー層３２を示す。ポリマー層３２は、本明細書に記載されるように選択的に適用されてもよく、これには、間隙領域３０および凹部２８Ａ、２８Ｂ内の露出表面を活性化すること、活性化した間隙領域３０上および凹部２８Ａ、２８Ｂ内にポリマー層３２を堆積させること、および間隙領域３０からポリマー層３２を除去することが含まれてもよい。
本実施例では、図１５Ｃに示されるように、プライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）は、次に、凹部２８Ａ、２８Ｂの各々のポリマー層３２にグラフトされる。官能化されたビーズ５０は導入されていないので、凹部２８Ａ、２８Ｂの各々のポリマー層３２は露出され、従って、その反応性基は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとの反応のために利用可能である。グラフトは、図１３Ｄを参照して記載される技術のいずれかを使用して達成され得る。ポリマー層３２は、凹部２８Ａ、２８Ｂの各々において露出されるので、プライマー１８、１８’および２０、２０’は、凹部２８Ａ、２８Ｂの各々にグラフトされ得る。
図１５Ｄに示されるように、官能基を有するビーズ５０は、次いで、凹部２８Ａ（ポリマー層３２およびプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄをその中に有する）に導入され得る。官能化されたビーズ５０は、任意の好適な技術を用いて、パターン化された樹脂５４’上に堆積されてもよい。官能基を有するビーズ５０のサイズ、並びに凹部２８Ａ及び２８Ｂのサイズのために、サイズ排除は、官能基を有するビーズ５０がより小さい凹部２８Ｂに入ることを妨げ、１つの官能基を有するビーズ５０が１つの凹部２８Ａに自己集合することを可能にする。この例では、官能基を有するビーズ５０は、それぞれの凹部２８Ａに物理的に閉じ込められてもよい。あるいは、この例では、官能基を有するビーズ５０は、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンリンカーを介して、それぞれの凹部２８Ａに化学的に結合されてもよい。
図１６は、図１５Ｄに示されるフローセル１０Ｂの部分の断面図である。フローセル１０Ｂは、保持体５２と、保持体５２上のパターン化された樹脂５４’であって、間隙領域３０によって分離された第１の凹部２８Ｂおよび第２の凹部２８Ａを含むパターン化された樹脂５４’と、第２の凹部２８Ａよりも小さな開口部寸法を有する第１の凹部２８Ｂと、第１の凹部２８Ｂの少なくともいくつかにそれぞれ結合された第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）と、第２の凹部２８Ａの少なくともいくつかにそれぞれ配置された官能化ビーズ５０とを含み、官能化ビーズ５０は、コア構造４９の表面に結合された第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’（プライマー１９、１９’および２１、２１’を含む）を含み、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとは異なっている。図１５Ｄおよび１６に示される例では、ポリマー層３２は、第１の凹部２８Ｂおよび第２の凹部２８Ａに存在し、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄは、第１の凹部２８Ｂおよび第２の凹部２８Ａにおいてポリマー層３２に結合される。次いで、この例では、官能基を有するビーズ５０は、第２の凹部２８Ａの少なくともいくつかにおける第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）上に配置される。
図１７Ａ～図１７Ｄを参照すると、凹部２８Ｃを含む方法１００の一例が示されている。
図１７Ａは、凹部２８Ｃを含むパターン化された樹脂５４’’を示す。凹部２８Ｃの各々は、より大きな部分３４とより小さな部分３４’とを含む。凹部２８Ｃの深さ（図１１Ｄに示す）は、明確にするために省略されている。
図１７Ｂは、凹部２８Ｃの各々におけるポリマー層３２を示す。図１７Ｂに示すように、各凹部２８Ｃの大きい方の部分３４と小さい方の部分３４’の両方には、適用されたポリマー層３２を有する。ポリマー層３２は、本明細書に記載されるように選択的に適用されてもよく、これは、一例では、間隙領域３０および凹部２８Ｃ内の露出表面を活性化すること、活性化間隙領域３０上および凹部２８Ｃ内にポリマー層３２を堆積させること、および間隙領域３０からポリマー層３２を除去することを含んでもよい。
図１７Ｃに示されるように、方法１００本実施例では、官能基を有するビーズ５０は、凹部２８Ｃのより大きな部分３４に堆積される。本明細書中に記載される官能基を有するビーズ５０のいずれかが、本実施例において使用され得る。
官能化されたビーズ５０（プライマー１９、１９’および２１、２１’を含む）は、本明細書中に記載されるような任意の好適な技術を使用して、パターン化された樹脂５４’’上に堆積され得る。官能基を有するビーズ５０のサイズおよび部分３４および３４’のサイズのために、サイズ排除は、官能基を有するビーズ５０がより小さな部分３４’に入ることを妨げ、そして１つの官能基を有するビーズ５０が各凹部２８Ｃの１つのより大きな部分３４に自己集合することを可能にする。本実施例では、官能基を有するビーズ５０は、それぞれのより大きな部分３４に物理的に捕捉されてもよく、または、例えばストレプトアビジン／ビオチンリンカーを介して、それぞれのより大きな部分３４に化学的に結合されてもよい。
図１７Ｄに示されるように、凹部２８Ｃのより小さい部分３４’は、次いで、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄで官能化され得る。官能基を有するビーズ５のプライマー１９、１９’および２１、２１’とは異なり、それらと直交するように選択される限り、本明細書に記載されるプライマー１８、１８’および２０、２０’の任意の例が使用され得る。本実施例では、凹部２８Ｃのより大きい部分３４のポリマー層３２は、官能基を有するビーズ５０で覆われており、したがって、凹部２８Ｃのより大きい部分３４のポリマー層３２は、露出されていない。したがって、ポリマー反応性基は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとの反応には利用できない。より小さな部分３４’のポリマー反応性基は露出したままであり、したがって第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとの反応に利用可能である。プライマー１８、１８’および２０、２０’の、より小さい部分３４’におけるポリマー層３２へのグラフト化は、図１３Ｄを参照して記載される技術のいずれかを使用して達成され得る。
図１８は、図１７Ｄに示されるフローセル１０Ｃの部分の断面図である。フローセル１０Ｃは、保持体５２と、保持体５２上のパターン化された樹脂５４’’であって、間隙領域３０によって分離された凹部２８Ｃを含むパターン化された樹脂５４’’と、凹部２８Ｃの少なくともいくつかに結合された第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）と、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄの少なくともいくつかのプライマー１８、１８’および２０、２０’が露出されるように、凹部２８Ｃの少なくともいくつかに配置された官能化されたビーズ５０と、を含み、官能化されたビーズ５０は、コア構造４９の表面に結合された第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’を含み、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとは異なっている。図１７Ｄおよび１８に示される例では、凹部２８Ｃの各々が、官能基を有するビーズ５０の直径より大きいかまたは等しい第１の開口部寸法を有する第１の部分３４と、官能基を有するビーズ５０の直径より小さい第２の開口部寸法を有する第２の部分３４’とを含み、官能基を有するビーズ５０は、凹部２８Ｃの少なくともいくつかの各々の第１の部分３４に配置される。また、図に図示例においても、同様である。１７Ｄおよび１８、ポリマー層３２は凹部２８Ｃに存在し、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄは、官能基を有するビーズ５０によって占有されていないポリマー層３２の部分（すなわち、凹部２８Ｃのより小さい部分３４’におけるポリマー層３２の部分）に結合される。
図１９Ａ～図１９Ｄを参照すると、凹部２８Ｃを含む方法１００の別の例が示されている。凹部２８Ｃの各々は、より大きな部分３４とより小さな部分３４’とを含む。凹部２８Ｃの深さ（図１１Ｄに示す）は、明確にするために省略されている。
図１９Ｂは、凹部２８Ｃの各々におけるポリマー層３２を示す。図１９Ｂに示すように、各凹部２８Ｃの大きい方の部分３４と小さい方の部分３４’の両方には、適用されたポリマー層３２を有する。ポリマー層３２は、本明細書に記載されるように選択的に適用されてもよく、この例では、間隙領域３０および凹部２８Ｃ内の露出表面を活性化すること、活性化した間隙領域３０上および凹部２８Ｃ内にポリマー層３２を堆積させること、および間隙領域３０からポリマー層３２を除去することを含んでもよい。
本実施例では、図１９Ｃに示されるように、プライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）は、次いで、凹部２８Ｃの各々においてポリマー層３２にグラフトされる。官能基を有するビーズ５０が導入されていないので、凹部２８Ｃの各部分３４、３４’のポリマー層３２が露出され、したがって、その反応性基が、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとの反応に利用可能である。グラフトは、図１３Ｄを参照して記載される技術のいずれかを使用して達成され得る。ポリマー層３２は、凹部２８Ｃの各部分３４、３４’において露出されるので、プライマー１８、１８’および２０、２０’は、各部分３４、３４’の各々にグラフトされ得る。
図１９Ｄに示されるように、官能基を有するビーズ５０は、次いで、（ポリマー層３２およびプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄをその中に有する）凹部２８Ｃのより大きな部分３４に導入され得る。官能化されたビーズ５０は、任意の好適な技術を用いて、パターン化された樹脂５４’’上に堆積されてもよい。官能化されたビーズ５０のサイズおよび部分３４および３４’のサイズのために、サイズ排除は、官能化されたビーズ５０がより小さい部分３４’に入ることを妨げ、そして１つの官能化されたビーズ５０が１つのより大きい部分３４に自己集合することを可能にする。この例では、官能基を有するビーズ５０は、それぞれのより大きな部分３４に物理的に捕捉されてもよく、または、例えばストレプトアビジン／ビオチンリンカーを介して、それぞれのより大きな部分３４に化学的に結合されてもよい。
図２０は、図１９Ｄに描かれたフローセル１０Ｄの部分の断面図である。フローセル１０Ｄは、保持体５２と、保持体５２上のパターン化された樹脂５４’’であって、間隙領域３０によって分離された凹部２８Ｃを含むパターン化された樹脂５４’’と、凹部２８Ｃの少なくともいくつかに結合された第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ（プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む）と、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄの少なくともいくつかのプライマー１８、１８’および２０、２０’が露出されるように凹部２８Ｃの少なくともいくつかに配置された官能化されたビーズ５０と、を含み、官能化されたビーズ５０は、コア構造４９の表面に結合された第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’を含み、第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’は、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄとは異なっている。図１９Ｄおよび２０に示される例では、凹部２８Ｃの各々は、官能基を有するビーズ５０の直径より大きいかまたは等しい第１の開口部寸法を有する第１の部分３４と、官能基を有するビーズ５０の直径より小さい第２の開口部寸法を有する第２の部分３４’とを含み、官能基を有するビーズ５０は、凹部２８Ｃの少なくともいくつかの各々の第１の部分３４に配置される。また、図１９Ｄおよび２０においても示されるように、ポリマー層３２は凹部２８Ｃに存在し、第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄは凹部２８Ｃのポリマー層３２に結合し、官能基を有するビーズ５０は第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄのプライマー１８、１８’および２０、２０’のいくつか（すなわち、凹部２８Ｃのより大きい部分３４のポリマー層３２に結合したプライマー１８、１８’および２０、２０’）に配置される。
例示的なフローセル１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄは、それに結合された蓋なしで示されている。図示されていないが、フローセル１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄは、記載されているように、間隙領域３０の少なくとも一部に結合された蓋を有してもよい。いくつかの例では、フローセル１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄが形成された後に蓋を接合することができる。
フローセル１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄは、しばしば合成による配列決定（ＳＢＳ）、環状アレイ配列決定、ライゲーションによる配列決定、パイロシークエンシングなどと呼ばれる技術を含む、種々の配列決定アプローチまたは技術において使用され得る。１つの特定の例において、フローセル１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄは、鋳型流体／混合物に曝露され得、そして増幅は、本明細書中に記載されるように実施されて、切断不可能な第１の鋳型鎖４０、切断可能な第１の鋳型鎖４６、切断不可能な第２の鋳型鎖４４、切断可能な第２の鋳型鎖４２を生成し得る。切断が行われ得、次いで、本明細書中に開示される同時対合末端配列決定方法が行われ得る。
フローセル１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄで使用される技術のいずれにおいても、プライマーセット１２Ａ、１２Ａ’または１２Ｂ、１２Ｂ’または１２Ｃ、１２Ｃ’または１２Ｄ、１２Ｄ’は、凹部２８Ａまたは２８Ｂまたは凹部２８Ｃの部分３４または３４’に存在し、間隙領域３０には存在しないので、増幅および配列決定は、凹部２８Ａおよび２８Ｂまたは２８Ｃに制限される。
ブロック共ポリマーベースのフローセル
本明細書に開示されるフローセルのいくつかの例は、パターン化された樹脂を含む多層基材と共に使用されるブロック共ポリマーを含む。これらの例は、図２１～図２５Ｂを参照して説明される。
これらの実施例では、パターン化された樹脂（例えば、５４’）は、ナノインプリントリソグラフィなどの「トップダウン」アプローチを使用して製造することができる。トップダウンアプローチは、高密度、低ピッチ、および小さなナノ特徴を有する凹部２８の配列を生成することができる。「ボトムアップ」アプローチであるブロック共ポリマーの有向自己集合と組み合わせると、さらに小さな特徴（サブリソグラフィサイズのドメインを有する）を凹部２８内に形成することができる。より高いクラスター密度を得ることができるので、小さな特徴部が望ましい場合がある。より高いクラスター密度は、所与のユニット領域からより多くの塩基を読み取ることができることを意味し、これは、パターン化されたフローセルからの遺伝的収率を増加させる。さらに、非グラフト化領域（例えば、間隙領域３０）は、小さな特徴を取り囲み、これは、ブロック共ポリマーにグラフト化されたプライマーへのより大きなアクセシビリティーを可能にする。そのようなものとして、プライマーの利用が増加し得る。
これらの実施例では、ブロック共ポリマーは、パターン化された樹脂の凹部２８内で自己集合され、凹部２８間の間隙領域３０には自己集合されない。したがって、間隙領域３０から材料を除去するための追加の処理は含まれない。
フローセルのこれらの実施例は、保持体５２と、保持体５２上のパターン化された樹脂であって、間隙領域３０によって分離された凹部２８を含むパターン化された樹脂と、凹部２８内のパターン化された樹脂上のブロック共ポリマーであって、ブロック共ポリマーの各ブロックが、ブロック共ポリマーの他の各ブロックのブロック特異的官能基とは異なったブロック特異的官能基を有するものと、ブロックの少なくとも１つのブロック特異的官能基に結合されたプライマーとを含む。いくつかの例では、プライマーは、ブロック共ポリマーの１つのブロックに結合した切断不可能なプライマー１８、１８’および２１、２１’を含み、フローセルは、１つのブロックに結合した順方向鋳型ストランド、次いで逆方向鋳型ストランドを連続的に配列決定することを含むペアエンド配列決定技術において使用され得る。他の実施例では、本明細書中に開示されるそれぞれのプライマーセット１２Ａ、１２Ａ’、または１２Ｂ、１２Ｂ’、または１２Ｃ、１２Ｃ’、または１２Ｄ、１２Ｄ’は、ブロック共ポリマーの異なるブロックに結合される。この例では、１つのブロックはプライマー１８、１８’および２０、２０’を含み、別のブロックはプライマー１９、１９’および２１、２１’を含む。フローセルの本実施例は、本明細書中に開示される同時ペアエンド配列決定技術において使用され得る。
フローセルの一部の例を図２２Ｅおよび２３に示し、本明細書でさらに説明される。
フローセルの一例を作製するための方法２００の一例を図２１に示す。図２１に示すように、該方法１００は、間隙領域３０によって分離された凹部２８を含むパターン化された樹脂を形成するために樹脂をパターン化すること（符号２０２）、パターン化された樹脂上にブロック共ポリマーを含む溶液を導入すること（ブロック共ポリマーの各ブロックはブロック共ポリマーの他の各ブロックのブロック特異的官能基とは異なったブロック特異的官能基を有する）（符号２０４）、溶液を溶媒蒸気焼鈍に曝し、それによってブロック共ポリマー相が分離し、凹部２８内で自己集合すること（符号２０６）、およびブロックの少なくとも１つのブロック特異的官能基にプライマーをグラフトすること（符号２０８）を含む。この方法２００は、図２２Ａ～２２Ｅを参照してさらに説明される。
図２２Ａは、保持体５２を示し、図２２Ｂは、保持体５２上に堆積された樹脂５４Ａを示す。本明細書に記載の保持体５２の任意の例を使用することができる。本ブロック共ポリマーでは、樹脂５４Ａは、その中に規定された凹部２８（図２２Ｃ）を有することができ、また、後に堆積されるブロック共ポリマー５８（図２２Ｃと図２２Ｄとの間の「ＢＣＰ」）のためのガイド鋳型として作用することができる。したがって、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィ、スタンピング技術、エンボス加工技術、モールディング技術、マイクロエッチング技術、プリント技術などを使用してパターン化することができる任意の樹脂５４Ａを使用することができる。さらに、樹脂５４Ａは、パターン化された後（すなわち、パターン化された樹脂５４Ａ’）、その上に堆積されるブロック共ポリマー５８と同じ範囲内にある表面エネルギーを有するべきである。例えば、樹脂５４Ａ／パターン化された樹脂５４Ａ’およびブロック共ポリマー５８は、それぞれ、約２５ｍＮ／ｍ～約５０ｍＭ／ｍの範囲内の表面エネルギーを有する。
パターン化され、誘導鋳型として作用することができる樹脂５４Ａのいくつかの例は、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの例が提供されたが、ラジカル硬化され得る任意の樹脂が使用され得ると考えられる。本明細書に開示される樹脂５４のいずれも、樹脂５４Ａに使用することができる。
図２２Ａと図２２Ｂとの間に示されるように、樹脂５４Ａは、保持体５２上に堆積される。該方法２００の一例では、樹脂４４の堆積は、化学蒸着、化学蒸着、ディップ法、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシング、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾルプリンティング、スクリーンプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、またはインクジェットプリンティングを含む。
次いで、堆積された樹脂５４は、本明細書に記載されたパターン化技術のいずれかを用いてパターン化される。図２２Ａと図２２Ｂとの間に示される実施例では、ナノインプリントリソグラフィを使用して樹脂５４をパターン化する。樹脂５４を堆積させた後、ソフトベークして余分な溶剤を除去することができる。ナノインプリントリソグラフィ金型または加工スタンプ５６を樹脂５４に押し付けて、樹脂５４上にインプリントを生成する。言い換えれば、樹脂５４は、加工スタンプ５６の張出し部によって、へこんだり、穿孔されたりする。次いで、樹脂５４は、加工スタンプ５６を所定の位置にして硬化させることができる。硬化は、可視光照射または紫外（ＵＶ）照射などの化学線、またはフォトレジストを使用する場合には約２４０ｎｍ～３８０ｎｍの範囲の波長の照射に露光することによって、または熱硬化性レジストを使用する場合には熱に露光することによって達成することができる。硬化は、重合および／または架橋を促進し得る。一例として、硬化は、ソフトベーク（例えば、溶媒を除去するための）およびハードベークを含む複数の段階を含むことができる。ソフトベークは、約５０℃～約１５０℃の範囲のより低い温度で行うことができる。ハードベークの持続時間は、約１００℃～約３００℃の範囲の温度で約５秒～約１０分間続くことができる。ソフトベーキングおよび／またはハードベーキングに使用することができるデバイスの例には、ホットプレート、オーブンなどが含まれる。
硬化後、加工スタンプ５６は解放される。これにより、樹脂５４に地形的特徴、すなわち凹部１６が形成される。図２２Ｃに示すように、凹部２８が形成された樹脂５４は、パターン化された樹脂５４’と呼ばれる。パターン化された樹脂５４’は、硬化を完了し、インプリントされたトポグラフィを固定するために、さらにハードベーキングに供されてもよい。いくつかの例では、ハードベーキングは、約６０℃～約３００℃の範囲の温度で行うことができる。
図２２Ｃに示すように、パターン化された樹脂５４’は、その中に画定された凹部２８と、隣り合う凹部２８を分離する間隙領域３０とを含む。本明細書に開示される例では、凹部２８は、ブロック共ポリマー（ＢＣＰ）５８およびプライマー１８、２１で官能化されるようになり（図２２Ｆ）、間隙領域２０の一部は、結合のために使用され得るが、ブロック共ポリマー５８またはプライマー１８、２１を有さない。
図２２Ｃに示されるように、パターン化された樹脂５４’は、次に、凹部２８内に相分離ブロック共ポリマー５８（ブロック５８Ａおよび５８Ｂを含む）を形成するためのプロセスにさらされてもよい。図２２Ｃと図２２Ｄとの間に示されるように、ブロック共ポリマー５８の溶液は、パターン化された樹脂５４’上に堆積され、ブロック共ポリマー５８の各ブロック５８Ａ、５８Ｂは、ブロック共ポリマー５８の他の各ブロック５８Ｂ、５８Ａのブロック特異的官能基とは異なったブロック特異的官能基を有する。ここで、ブロック共ポリマー５８の様々な例を説明する。
ブロック共ポリマー５８は、少なくとも２つの異なったモノマーから構成されるヘテロポリマーである。一実施形態では、ブロック共ポリマー５８は、ブロック特異的官能基としてプライマーグラフト化官能基を有するモノマーを含む第１のブロック５８Ａと、第１および第２のブロックの相分離を駆動するために相互作用パラメータを調整するモノマーを含む第２のブロック５８Ｂとを含む。この実施形態では、第２のブロック５８Ｂのモノマーはまた、パターン化された樹脂５４’と反応する（したがって、それに結合する）ことができるブロック特異的官能基を含むことができる。パターン化された樹脂５４’と反応する（したがって、それに結合する）ことができるブロック特異的官能基は、本明細書では樹脂結合官能基と呼ばれる。第１および第２の名称は、本ブロック共ポリマーにおいて特定の順序を示すものではなく、任意のブロックが、相互作用パラメータを調整するためのプライマーグラフト化官能基または官能基を含み得ることを理解されたい。例えば、第１のブロック５８Ａは、プライマー（例えば、１８、２１）をグラフトすることができ、第１および第２のブロックの相分離を駆動するために相互作用パラメータを調整することができるブロック特異的官能基を有するモノマーを含むことができ、第２のブロック５８Ｂは、樹脂結合官能基を有するモノマーを含むことができる。別の例では、第１のブロック５８Ａは、プライマー（例えば、１８、２１）をグラフトし、樹脂５４’に結合することができるブロック特異的官能基を有するモノマーを含むことができ、第２のブロック５８Ｂは、第１および第２のブロックの相分離を駆動するために相互作用パラメータを調整することができるモノマーを含むことができる。
本明細書中に開示されるブロック共ポリマー５８の任意の例において、プライマーグラフト化官能基は、アジド（azide）／アジド（azido）、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、アルデヒド、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、チオール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。多数のプライマーグラフト官能基が単一のブロックに含まれる場合、異なったプライマーが単一のブロックに結合され得る。異なるプライマーグラフト化官能基が異なるブロックに含まれる場合、異なるプライマーが異なるブロックに結合され得る。
プライマーグラフト官能基は、プライマーの５’末端に結合した官能基と反応することができる。例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン４－イン（ＢＣＮ）末端プライマーは、歪み促進触媒フリークリックケミストリーを介して、ブロック共ポリマー５８のアジドプライマーグラフト官能基によって捕捉され得る。別の例として、アルキン末端プライマーは、銅触媒クリックケミストリーを介して、ブロック共ポリマー５８のアジドプライマーグラフト官能基によって捕捉され得る。さらに別の例として、ノルボルネン末端プライマーは、ブロック共ポリマー５８のテトラジンプライマーグラフト化官能基との触媒フリー環歪み促進クリック反応を受けることができる。
例えば、プライマーグラフト化官能基は、アクリルアミドモノマーに結合したアジド基である。このモノマーの例は、アジドアセトアミドペンチルアクリルアミドである。別の実施例では、プライマーグラフト化官能基は、ベンゼン含有モノマーに結合したアジド基である。このモノマーの２つの例には、アジ化ベンジルまたはアジド官能化スチレン（例えば、


）が含まれる。
本明細書に開示されるブロック共ポリマー５８のいずれの例においても、樹脂結合官能基は、アミノ基、アルコール基、アリール基、および荷電基からなる群から選択される。好適なアニオン性荷電基には、硫酸塩またはカルボン酸が含まれる。好適なカチオン性荷電基には、アンモニウム、グアニジニウム、またはイミダゾリウムが含まれる。他の例では、樹脂結合官能基は、トリフルオロメチル基（－ＣＦ３）であってもよい。本明細書に開示されるブロック共ポリマー１８のさらに別の実施形態では、樹脂結合官能基を含むモノマーは、ＳｉＯ（ＣＨ３）２などのシロキサンモノマーであってもよい。
例えば、樹脂結合官能基は、アクリルアミドモノマーに結合したアミノ基である。このモノマーの例は、


である。本実施例では、（窒素間の）エチル橋梁は、プロピル基橋梁またはモノマーの所望の機能を妨害しない任意の他の橋梁な長さで置き換えることができる。例えば、橋梁長は、１６個までの炭素原子であってもよい。別の実施例では、樹脂結合官能基は、スチレンモノマーの一アリール基である。（共有結合のための）他の樹脂結合基は、樹脂１４がどのように官能化されるかに依存する。例えば、樹脂がエポキシ基を含む場合、アミンまたはアルコールは、好適な樹脂結合官能基であり得る。
ブロック共ポリマー５８のいくつかの例には、プライマーグラフト化官能基および樹脂結合官能基が含まれる。これらの基は、グラフトされるプライマー（例えば１８、２１、１８、２０、１８’、２０’、または１９、２１、または２１’）に依存し、かつ、ブロック共ポリマー５８に接着されるパターン化された樹脂５４’に、それぞれまたは部分的に基づいてもよい。以下は、プライマーグラフト化官能基および樹脂結合官能基の両方を含むブロック共ポリマー５８のいくつかの例である。
パターン化された樹脂５４’がエポキシＰＯＳＳである実施例では、ブロック共ポリマー５８は、ブロック特異的官能基としてアミノ基を有するアクリルアミドモノマーを含む第１のブロック５８Ａと、ブロック特異的官能基としてアジド基を有するアジドアセトアミドペンチルアクリルアミドモノマーを含む第２のブロック５８Ｂとを含む。本実施例では、第１のブロック５８Ａは、樹脂結合官能基を含み、第２のブロック５８Ｂは、プライマーグラフト化官能基を含むが、第２のブロック５８Ｂは、樹脂結合官能基としても機能し得る。このブロック共ポリマー１８の具体例は、



であり、
式中、Ｒは水素またはポリマー開始種末端基であり、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。ポリマー開始種末端基の例には、可逆的付加開裂移動（ＲＡＦＴ）末端基、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）末端基、ニトロキシド媒介ラジカル重合（ＮＭＰ）末端基、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）末端基、またはフリーラジカル重合（ＦＲＰ）末端基が含まれる。別の例において、ｎおよびｍは、独立して、約１～約１，０００の範囲である。
パターン化された樹脂５４’がエポキシＰＯＳＳである別の実施例では、ブロック共ポリマー５８は、そのブロック特異的官能基としてアリール基を有するスチレンモノマーを含む第１のブロック５８Ａと、そのブロック特異的官能基としてアジドを有するアジド官能化スチレンを含む第２のブロック５８Ｂとを含む。本実施例では、第１のブロック５８Ａは、樹脂結合官能基を含み、第２のブロック５８Ｂは、プライマーグラフト化官能基を含むが、第２のブロック５８Ｂは、樹脂結合官能基としても機能し得る。このブロック共ポリマー５８の具体的な例は、


であり、
式中、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。別の実施例において、ｎおよびｍは、独立して、約１～約１，０００の範囲である。
パターン化された樹脂５４’がエポキシＰＯＳＳであるさらに別の実施例では、ブロック共ポリマー５８は、アジドをそのブロック特異的官能基として有するアジド官能化スチレンを含む第１のブロック５８Ａと、シロキサンをそのブロック特異的官能基として有するシロキサンモノマーを含む第２のブロック５８Ｂとを含む。本実施例では、第１のブロック５８Ａは、プライマーグラフト化官能基を含むが、第１のブロック５８Ａは、樹脂結合官能基として機能することもでき、第２のブロック５８Ｂは、樹脂結合官能基を含む。このブロック共ポリマー５８の具体的な例は、


であり、
式中、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。別の例において、ｎおよびｍは、独立して、約１～約１，０００の範囲である。
パターン化された樹脂５４’が非晶質フッ素ポリマー（例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標））である場合、ブロック共ポリマー５８は、そのブロック特異的官能基としてトリフルオロメチル基を有するモノマーを含む第１のブロック５８Ａと、そのブロック特異的官能基としてプライマーグラフト化および樹脂グラフト化官能基を有するモノマーを含む第２のブロック５８Ｂとを含む。このブロック共ポリマー５８の一例では、第２のブロック５８Ｂは、アジドアセトアミドペンチルアクリルアミドモノマーを含み、第１のブロック５８Ａ（この例では、表面エネルギー変更官能基であってもよい）は、フッ素化アクリル酸塩またはフッ素化アクリルアミドであってもよい。このブロック共ポリマー１８の具体例は、


ように構成され、
式中、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。別の実施例において、ｎおよびｍは、独立して、約１～約１，０００の範囲である。このブロック共ポリマー５８（非晶質フッ素ポリマーと共に使用するのに適している）の別の実施例では、第２のブロック５８Ｂは、アジド官能化スチレンを含み、第１のブロック５８Ａ（この例では、表面エネルギー変更官能基）は、アクリル酸トリフルオロエチルであってもよい。このブロック共ポリマー５８の具体的な構成は、


であり、
式中、ｎは１～１０，０００の範囲であり、ｍは１～１０，０００の範囲である。別の実施例において、ｎおよびｍは、独立して、約１～約１，０００の範囲である。
本明細書中に開示されるブロック共ポリマー５８はまた、ブロック５８Ａおよび／または５８Ｂのそれぞれの機能を妨害しない１つ以上の他のモノマー（例えば、プライマーグラフト、樹脂結合、相分離など）を含み得ることがさらに理解される。追加のブロックの追加のモノマー（および特に追加のモノマーのブロック特異的官能基）は、ブロック共ポリマー５８の表面自由エネルギーに影響を及ぼす／変更させる、ブロック共ポリマー５８の安定性に影響を及ぼす、別のプライマーを結合させる、および／または酵素を結合させるように選択することができる。表面自由エネルギーに影響を及ぼす／変更させることができるモノマーの例には、アクリル酸塩モノマー（例えば、アクリル酸トリフルオロエチルまたはトリフルオロエチルメタクリレート）またはトリフルオロエチルアクリルアミドのトリフルオロメチル基が含まれる。酵素を結合することができるモノマーの例には、以下のブロック特異的官能基：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－官能化酵素と反応することができるチオール、アミン、またはアルコールが含まれ得る。酵素または他の生体分子を結合させるために、他の官能基が使用され得ることが理解されるべきである。そのようなものとして、ブロック共ポリマー５８のいくつかの例は、三元共ポリマーであり、これは、図２４Ａおよび図２４Ｂに関してさらに詳細に議論される。
上述したように、方法２００では、ブロック共ポリマー５８の溶液が、（図２２Ｃと図２２Ｄとの間に示されるように）パターン化された樹脂５４’上に導入される。溶液は、トルエンなどの適当な溶媒中のブロック共ポリマー５８の希釈溶液（例えば、約０．０１重量％～約１０重量％の範囲）であってもよい。ブロック共ポリマー５８液は、スピンコーティングなどの任意の好適な技術を用いて堆積されてもよい。
ブロック共ポリマー５８が自己集合し、トポロジー的にパターン化された保持体（例えば、パターン化された樹脂５４’）上でミクロ相分離を受けるために、ブロック共ポリマーを含む溶液は、下にあるパターン化された樹脂５４’との高ハギンズ相互作用パラメータを有することである。例えば、ブロック共ポリマー５８の溶液は、約０．０４～約０．３０の範囲のフロリ－ハギンズ（Flory－Huggins）相互作用パラメータを有する。別の実施形態では、ブロック共ポリマー５８の溶液は、約０．２６のフロリ－ハギンズ相互作用パラメータを有する。
パターン化された樹脂５４’上の堆積されたままのブロック共ポリマー５８は、次いで、溶剤焼鈍にさらされる。溶剤焼鈍に使用される溶剤の気体、温度、及び時間は、使用されるブロック共ポリマー５８に依存し、特に、ブロック共ポリマー５８が凹部２８に自己集合し、ミクロ相がそれぞれのブロック５８Ａ及び５８Ｂに分離する状態に依存する。一例では、溶媒蒸気はトルエンであり、温度は室温（例えば、約１４℃～約２５℃）であり、時間は約３時間である。溶剤の選択、焼鈍時間、および焼鈍温度は、ブロック共ポリマーに依存することを理解されたい。いくつかの適当な溶媒は、トルエン、ヘプタン、高級アルカンおよびそれらの混合物であってもよい。この時期及び気温は、凹部２８内のモルフォロジーに影響を及ぼすので、制御することができる。例えば、焼鈍時間は、１分～１８０分、またはさらに長く、例えば、約３時間～約４８時間の範囲であってもよく、アニーリング温度は、１８℃～約２５０℃の範囲であってもよい。
溶媒焼鈍の結果として、ブロック共ポリマー５８は、凹部１６内に自己集合し（従って、間隙領域３０上には存在しない）、また、隔離されたドメイン、すなわちブロック５８Ａ、５８Ｂに相分離する。図２Ｄでは、分離されたブロック５８Ａ、５８Ｂは、円形または螺旋パターンを有するが、このパターンは、使用されるブロック共ポリマー５８に依存し得る。ブロック共ポリマー５８のパターンの他の例は、例えば、図２３Ａおよび２３Ｂに示されている。図２３Ａは、凹部２８および周囲の間隙領域３０の一部の上面図であり、凹部２８内のブロック共ポリマー５８は、フィンガープリントパターンを示すブロック５８Ａおよび５８Ｂに相分離する。図２３Ｂは、凹部２８および周囲の間隙部３０の一部の上面図であり、凹部２８内のブロック共ポリマー５８は、ラインパターンを示すブロック５８Ａおよび５８Ｂに相分離する。ブロック５８Ａ、５８Ｂは、サブリソグラフィサイズドメインを有する。
溶媒焼鈍の間、樹脂結合官能基を含むブロック５８Ａまたは５８Ｂは、パターン化された樹脂５４’と反応することができ、したがって、パターン化された樹脂５４’に結合することができる。
図示されていないが、メソッド２００のいくつかの実施例では、凹部２８内の相分離および自己集合ブロック共ポリマー５８Ａ、５８Ｂを含むパターン化された樹脂５４’は、追加の硬化処理にさらされる。硬化は、先に記載したように行うことができる。
図２２Ｄと２２Ｅとの間に示されるように、グラフト化処理は、プライマー（順次ペアエンド配列決定のための１８、２１または１８’、２１’）または（同時ペアエンド配列決定のための１８、２０または１８’、２０’および１９、２１または１９’、２１’）を、凹部２８におけるブロック５８Ａおよび／または５８（Ｂ）の任意のプライマーグラフト官能基にグラフトために実施される。
一実施例では、グラフト化は、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合した蓋を使用して）、ダンクコーティング，スプレーコーティング、パドルディスペンシングによって、またはプライマー（順次ペアエンド配列決定のための１８、２１もしくは１８’、２１’）、または（同時ペアエンド配列決定のための１８、２０もしくは１８’、２０’および１９、２１もしくは１９’、２１’、２１’）を、ブロック５８Ａおよび／または５８Ｂのプライマーグラフト化官能基に結合させる別の好適な方法によって達成され得る。同時ペアエンド配列決定の例において、プライマー１８、２０または１８’、２０’は、一方のブロック５８Ａにグラフトされ得、そしてプライマー１９、２１または１９’、２１’は、他方のブロック５８Ｂにグラフトされ得る。これらの例示的な技術の各々は、本明細書に記載されるように実施され得、プライマー溶液または混合物を利用し得、これは、プライマー、水、緩衝液、および触媒を含み得る。
プライマー（順次ペアエンド配列決定のための非切断性プライマー１８、２１または１８’、２１’）または（同時ペアエンド配列決定のための非切断性／切断性プライマー対１８、２０または１８’、２０’および１９、２１または１９’、２１’）は、プライマー－グラフト化官能基を含むブロック５８Ａおよび／または５８（Ｂ）に結合することが理解されるべきである。図２２Ｅおよび２２Ｆに示される例において、プライマー１８、２１は、ブロック５８Ａにではなく、ブロック５８Ｂに結合される。本実施例では、ブロック５８Ａは、第１および第２のブロック５８Ａ、５８Ｂの相分離を駆動するために相互作用パラメータに寄与している可能性があり、また、樹脂取り付け官能基を介してパターン化された樹脂５４’に取り付けることもできる。
ここで図２４を参照すると、２つのブロック５８Ａおよび５８Ｂに分離されたブロック共ポリマー５８相を有する別の実施例が示されている。本実施例は、２つの異なるプライマーセット（一方はプライマー１８、１８’および２０、２０’を含み、他方はプライマー１９、１９’および２１、２１’を含む）が、それぞれのブロック５８Ａ、５８Ｂに結合される。この実施例は、本明細書中に記載されるように、配列決定の間に、同時ペアエンド読み取りを可能にする。本実施例では、それぞれのブロック５８Ａ、５８Ｂの各々は、それぞれのプライマーセットを結合させることができるプライマーグラフト化官能基を含む。
上述のように、ブロック共ポリマー５８のいくつかは三元共ポリマーであり、ここで、各々のブロックは、異なったブロック特異的官能基を含む。一例では、ブロック共ポリマー５８は、第１のブロック、第２のブロック、および第３のブロックを含む三元共ポリマーであり、第１のブロックのブロック特異的官能基は、パターン化された樹脂に結合され（すなわち、樹脂結合官能基である）、第２のブロックのブロック特異的官能基は、プライマーに結合され（すなわち、プライマーグラフト官能基である）、第３のブロックのブロック特異的官能基は、ｉ）第２のブロックのブロック特異的官能基に結合されたプライマーとは異なり、またはｉｉ）酵素（例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）トランスポソーム）に結合される。相分離三元共ポリマーの例を図２５Ａに示す。この実施例では、分離された三元共ポリマーは、ブロック５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃを含み、５８Ａは、プライマーグラフト官能基を含み、５８Ｂは、樹脂結合官能基を含み、および／またはブロック共ポリマーの表面自由エネルギーに影響を及ぼし、および／またはブロック共ポリマーの安定性に影響を及ぼし、５８Ｃは、異なったプライマーグラフト官能基または酵素結合官能基を含む。示されるように、ブロック５８Ａは、プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄを結合し、そしてブロック５８Ｃは、プライマー１９、１９’および２１、２１’を含む第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’を結合する。この例では、ブロック５８Ａは領域１４として機能し、ブロック５８Ｃは領域１６として機能する。別の例では、領域１４、１６は、互いに直接隣接するブロック（例えば、５８Ａおよび５８Ｂまたは５８Ｂおよび５８Ｃ）であってもよい。
別の実施形態では、ブロック共ポリマー５８は、第１のブロック、第２のブロック、および第３のブロックを含む三元共ポリマーであり、第１のブロックのブロック特異的官能基は、パターン化された樹脂５４’（すなわち、樹脂結合官能基）に結合され、第２のブロックのブロック特異的官能基は、プライマー（すなわち、プライマーグラフト官能基）に結合され、第３のブロックのブロック特異的官能基は、ブロック共ポリマーの表面自由エネルギーに影響を及ぼすか、またはブロック共ポリマーの安定性に影響を及ぼす。相分離三元共ポリマーの例を図２５Ｂに示す。本実施例では、分離された三元共ポリマーは、ブロック５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃを含み、５８Ａは、樹脂結合官能基を含み、５８Ｂは、ブロック共ポリマーの表面自由エネルギーに影響を及ぼすか、またはブロック共ポリマーの安定性に影響を及ぼし、５８Ｃは、プライマーグラフト官能基を含む。この実施例では、切断不可能なプライマー１８、２１が結合しており、したがって、この実施例は、順次ペアエンド配列決定に特に適している可能性がある。
図３８Ａおよび図３８Ｂは、共に、ブロック共ポリマー５８’を含む別の例示的な方法を示す。この実施例では、ブロック共ポリマー５８’は層状ブロック共ポリマーである。層状ブロック共ポリマーは、種々のブロック５８Ａ’および５８Ｂ’が、下にある材料５４Ｂ、５４Ｃおよび保持体５２に並行になるように、一方が他方の上に積層されるように、自己集合する。ラメラブロック共ポリマーの例には、複素環式アジド単位を含むコポリマーが含まれる。材料５４Ｂ、５４Ｃは、本明細書に記載の樹脂５４Ａ、シラン、またはシラン化樹脂の様々な例であってもよく、ブロック共ポリマー５８’の自己集合を誘導するように選択されてもよい。制御された条件下で、ブロック共ポリマー５８’は、下にある材料５４Ｂ、５４Ｃ上に層状になっている特異的ドメイン／ブロック５８Ａ’および５８Ｂ’に自己集合する。図３８Ａおよび３８Ｂに図示される例では、アニーリングの結果として、ドメイン／ブロック５８Ａ’および５８Ｂ’は、ブロック５８’Ｂが１つの領域（上にある材料５４Ｂ）の表面で露出され、他のブロック５８Ａ’が別の領域（上にある材料５４Ｃ）の表面で露出されるように、自己集合する。ブロック５８Ｂ’は、プライマー１８、１８’および２０、２０’を含む第１のプライマーセット１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄを結合させることができるプライマー結合官能基を含むことができ、ブロック５８Ａ’は、プライマー１９、１９’および２１、２１’を含む第２のプライマーセット１２Ａ’、１２Ｂ’、１２Ｃ’、１２Ｄ’を結合させることができる様々なプライマー結合官能基を含むことができる。この例では、ブロック５８Ｂ’は領域１４として働き、ブロック５８Ａ’は領域１６として働く。
ブロック共ポリマー５８、５８’を含むフローセルは、しばしば合成による配列決定（ＳＢＳ）、環状アレイ配列決定、ライゲーションによる配列決定、パイロシークエンシングなどと呼ばれる技術を含む、種々の配列決定アプローチまたは技術において使用され得る。これらの例のいくつかでは、相分離ブロック５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃおよび結合プライマー（順次ペアエンド配列決定のための非開裂性プライマー１８、２１または１８’、２１’）または（同時ペアエンド配列決定のための非開裂性／開裂性プライマー対１８、２０または１８’、２０’および１９、２１または１９’、２１’）が凹部２８に存在し、間隙領域３０には存在しないので、増幅は凹部２８に限定される。
一例として、合成による配列決定（ＳＢＳ）反応は、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑＸ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑＤＸ（商標）、ＭｉＮＩＳｅｑ（商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑＤＸ（商標）または他のあらゆるIllumina Inc.（SanDIego, CA）からのシーケンサーシステム上ではしさせることができる。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば、配列決定鋳型）に沿った配列決定プライマーの伸長は、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定するためにモニターされる。基礎となる化学的処理は、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）またはライゲーション（例えば、リガーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリメラーゼベースのＳＢＳ処理において、蛍光標識されたヌクレオチドは、配列決定プライマーに付加されたヌクレオチドの順序および型の検出が鋳型の配列を決定するために使用され得るように、鋳型依存的な様式で配列決定プライマーに付加される（それによってプライマーを伸長する）。
例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、切断不可能プライマー１８、２１または１８’、２１’（順次ペアエンド配列決定のため）に結合したフォワードまたはリバースストランドのアレイ、または切断不可能／切断可能プライマー対１８、２０または１８’、２０’（同時ペアエンド配列決定のため）に結合したフォワードおよびリバースストランドの両方を収容する流路などに／を通って送達することができ、配列決定プライマー伸長が標識ヌクレオチドを組み込ませる場合、画像化事象を通して検出することができる。撮像イベントの間、イルミネーションシステム（図示せず）は、官能化された凹部に励起光を提供することができる。
これらの実施例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドが付加されるとさらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができ、脱ブロッキング剤を使用して配列決定を続けることができる。洗浄は、様々な流体送達工程の間に行うことができる。次いで、ＳＢＳサイクルをｎ回繰り返して、配列決定プライマーをｎヌクレオチドにより伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。
ＳＢＳが詳細に記載されているが、本明細書に記載されるフローセルは、遺伝子型決定のために、または他の化学的および／または生物学的適用において、他の配列決定プロトコルとともに利用され得ることが理解されるべきである。
本開示をさらに説明するために、本明細書に実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
実施例
実施例１
予めグラフトされたＰ７およびＰ５Ｕプライマーを有するＰＡＺＡＭを、高さ約４００ｎｍおよび直径約３５０ｎｍのピラー特徴部を有するフローセル基材上に堆積させた。堆積させたプレグラフトＰＡＺＡＭ層の一部のスキャニングエレクトロン組織写真（ＳＥＭ）画像を図３９Ａに示す。この第１のグラフトＰＡＺＡＭ層上にリフトオフレジストを堆積させて、本明細書に記載の保護層の一例を形成した。堆積した保護層の一部のＳＥＭ画像を図３９Ｂに示す。次いで、エッチングを行って、ピラー状特徴部の上部から保護層および第１のグラフトＰＡＺＡＭ層を除去した。エッチング後の基材の一部のＳＥＭ像を図３９Ｃに示す。ＰＡＺＡＭを、ピラー特徴部の上部および残りの保護層上に堆積させて、第２のＰＡＺＡＭ層を形成した。第２のＰＡＺＡＭ層をＰ５およびＰ７Ｕプライマーでグラフトした。
リフトオフプロセスを使用して、第１のグラフトＰＡＺＡＭ層から保護層および第２のグラフトＰＡＺＡＭ層のいずれかを除去した。
同じゲノム（ヒトゲノム由来）由来のライブラリーフラグメントをフローセルに導入した。ライブラリーフラグメントは、インデックス配列、すなわちリード１およびリード２と共に、Ｐ７プライマー配列のＰ５に相補的な部分を含んだ。ライブラリーフラグメントを播種し、ブリッジ増幅を用いてクラスター化を行った。次いで、同時ペアエンド配列決定を行った。
ピラー特徴部と隣接領域との間の境界領域において、全てのリードの約３４％が対になっていることが見出された。
リードを単一の位置から抽出し、ゲノムに整列させた。図４０Ａは、同時ペアエンドリードであるように帰属される２つのＲ１リード（Ｒ１およびＲ１’）を示す。
フローセルはまた、順次ペアエンド合成（順方向ストランド配列決定および除去、続いて逆方向ストランド配列決定）によって処理した。図４０Ｂは、図４０Ａからの結果を示し、順次ペアエンド合成からの第２のリード（Ｒ２）は、それが同時ペアエンドリードのペアに実際に一致することを示すためにフリップされている。Ｒ２のクリップされた部分は、品質低下に起因する可能性があり、一方、Ｒ１リードは、より高品質のクリップされていないリードである。これらの結果は、本明細書中に開示される方法が、同時に生成されたペア（図４０Ａ）を使用して、標準的なペアエンド配列決定（図４０Ｂ）に対する当量インフォメーションを生成し得ることを実証する。
さらに、ライブラリーフラグメントの挿入サイズの分布は、同時ペアエンド配列決定と順次（標準）ペアエンド配列決定のデータに基づいて大まかに当量であった。これらの結果は、同時に生成された一対を使用して、本明細書中に開示される方法が、標準的な一ペアエンド配列決定に対する当量のインフォメーションを生成し得ることをさらに実証する。
実施例２
ＰＡＺＡＭを平面フローセル基材上に堆積させ、Ｐ７およびＰ５Ｕプライマーでグラフトした。保護層（Ｓｈｉｐｌｅｙ１８１３フォトレジスト）を、この第１のグラフトＰＡＺＡＭ層の上に堆積させた。紫外線を、フォトマスクを通して使用して、保護層の規定された部分を露光し、次いで溶媒中で現像し、保護層の５０μｍの円形パッドを残した。大気プラズマを用いて、間隙領域の第１グラフトＰＡＺＡＭ層の露出部分をエッチング除去したが、保護パッドの下の部分は無傷のままであった。次いで、ＰＡＺＡＭの第２の層を、間隙領域上および残りの保護層上に堆積させた。次いで、この第２の堆積ＰＡＺＡＭを、Ｐ５およびＰ７Ｕプライマーでグラフトした。
リフトオフプロセスを使用して、第１のグラフトＰＡＺＡＭ層から保護層および第２のグラフトＰＡＺＡＭ層のいずれかを除去した。
同じゲノム（ヒトゲノム由来）由来のライブラリーフラグメントをフローセルに導入した。ライブラリーフラグメントは、インデックス配列、すなわちリード１およびリード２と共に、Ｐ７プライマー配列のＰ５に相補的な部分を含んだ。ライブラリーフラグメントを播種し、ブリッジ増幅を用いてクラスター化を行った。次いで、同時ペアエンド配列決定を行った。
第１のグラフトされたＰＡＺＡＭと第２のグラフトされたＰＡＺＡＭとの間の境界領域において、全てのリードの約２．２％が対になっていることが見出された。これは、２つのリードが互いに２μｍ以内であり、ゲノムにおいて互いに２ｋｂ以内であったことを意味した。
注記事項
前述の概念と、以下でより詳細に論じられる追加の概念とのすべての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しないという条件で）が、本明細書で開示される本発明の対象の一部であると考えられることを理解されたい。特に、本発明の最後に現れる特許請求の範囲に記載された対象の全ての組み合わせは、本明細書に開示された本発明の対象の一部であると考えられる。同様に当然のことながら、本明細書に明示的に用いられ、参照として組み込まれている任意の開示にも現れるであろう専門用語は、本明細書に開示された特定の概念と最も整合する意味を有するものとする。
本明細書全体を通して、「一実施例」、「別の例」、「１つの例」などへの言及は、実施例と関連して説明される特定の要素（例えば、特性、構成、および／または特性）が、本明細書で説明される少なくとも１つの例に含まれ、他の例に存在しても存在しなくてもよいことを意味する。さらに、任意の例について記載された要素は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、様々な例において任意の適切な方法で組み合わされてもよいことが理解されるべきである。
本明細書で提供される範囲は、記載された範囲、および記載された範囲内の任意の値またはサブ範囲を、そのような値またはサブ範囲が明示的に列挙されたかのように含むことを理解されたい。例えば、約４００ｎｍ～約１μｍ（１０００ｎｍ）の範囲は、約４００ｎｍ～約１μｍの明示的に列挙された限界を含むだけでなく、約７０８ｎｍ、約９４５．５ｎｍなどのような個々の値、および約４２５ｎｍ～約８２５ｎｍ、約５５０ｎｍ～約９４０ｎｍなどのようなサブ範囲を含むと解釈されるべきである。さらに、「約」および／または「実質的に」が値を記述するために利用される場合、それらは、記載された値からのわずかな変動（＋／－１０％まで）を包含することを意味する。
いくつかの実施例を詳細に説明したが、開示された実施例は変更されてもよいことを理解されたい。したがって、前述の説明は、非限定的であると考えられるべきである。

Claims (51)

  1. 基材と、
    該基材上の第１の領域に結合した第１のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、
    前記基材上の第２の領域に結合した第２のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第２のプライマーセットと、
    を含み、
    前記第１の領域は、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を有する材料を含み、
    前記第２の領域は、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を有する材料を含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、フローセル。
  2. 前記第１のプライマーセットを前記第２のプライマーセットから分離するギャップをさらに含む、請求項１に記載のフローセル。
  3. Ａ）前記基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、
    該凹部のそれぞれは、
    第１の部分に位置する前記第１の領域と、
    第２の部分に位置する前記第２の領域と、
    を含み、または、
    Ｂ）前記基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、
    前記凹部の各々は、
    第１の部分に位置する前記第１の領域と、
    第２の部分に位置する前記第２の領域と、
    を含み、
    ｉ）前記第１の領域を前記第２の領域から分離するギャップをさらに含み、もしくは
    ｉｉ）前記第１の領域と前記第２の領域とが部分的に重なり合い、もしくは
    ｉｉｉ）前記第１の部分と第２の部分とが異なる深さを有し、もしくは
    ｉｖ）前記第１の領域および前記第２の領域は、ブロック共ポリマーの異なるブロックである、または、
    Ｃ）前記基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、
    前記凹部の各々は、前記第１の領域を含み、
    前記第２の領域は、前記間隙領域の少なくともいくつかの上に位置する、請求項１に記載のフローセル。
  4. 前記第１の領域は第１のポリマーを含み、前記第１のプライマーセットは前記第１のポリマーにグラフトされ、
    前記第２の領域は第２のポリマーを含み、前記第２のプライマーセットは前記第２のポリマーにグラフトされる、請求項１に記載のフローセル。
  5. ｉ）前記フローセルが、前記第１のプライマーセット上および前記第１のポリマー上に保護塗装をさらに含み、または
    ｉｉ）
    前記第１のポリマーは、前記基材上の第１の層であり、
    前記第２のポリマーは、前記第１の層上の第２の層であり、
    前記第２の層上の不動態化樹脂と、該不動態化樹脂、前記第２のポリマーおよび前記第１のポリマーに画定された地形的特徴と、をさらに含み、
    前記第１のプライマーセットおよび第２のプライマーセットのそれぞれが、前記地形的特徴のそれぞれにおいて露出される、請求項４に記載のフローセル。
  6. 前記基材は、間隙領域によって分離された凹部を含み、
    該凹部の各々は、
    前記第１の領域が位置する第１の部分と、
    第２の部分と、
    を含み、
    該第２の部分に位置するビーズをさらに含み、
    前記第２の領域は、前記ビーズの表面にある、請求項１に記載のフローセル。
  7. ｉ）前記切断可能な第１のプライマーが第１の切断部位を含み、前記切断可能な第２のプライマーが第２の切断部位を含み、前記第１の切断部位および第２の切断部位が同一のタイプである、請求項１に記載のフローセル。
  8. 前記切断不可能な第１のプライマー、前記切断可能な第２のプライマー、前記切断可能な第１のプライマーおよび前記切断不可能な第２のプライマーのそれぞれは、前記基材のそれぞれの領域に対してプライマーを結合しているそれぞれのリンカーを含み、
    前記切断可能な第１のプライマーの前記第１の切断部位は、そのリンカーに組み込まれ、
    前記切断可能な第２のプライマーの前記第２の切断部位は、そのリンカーに組み込まれる、請求項７に記載のフローセル。
  9. 前記切断可能な第１のプライマーが第１の切断部位を含み、前記切断可能な第２のプライマーが第２の切断部位を含み、前記第１および第２の切断部位が異なるタイプである、請求項７に記載のフローセル。
  10. 前記切断不可能な第１のプライマー、前記切断可能な第２のプライマー、前記切断可能な第１のプライマー、および前記切断不可能な第２のプライマーのそれぞれは、前記基材のそれぞれの領域に対してプライマーを結合しているそれぞれのリンカーを含み、
    前記第１の切断可能なプライマーの前記第１の切断部位は、そのリンカーに組み込まれ、
    前記第２の切断可能なプライマーの前記第２の切断部位は、そのリンカーに組み込まれる、請求項９に記載のフローセル。
  11. 前記第１のプライマーセットは、第１の保持体構造により前記基材の前記第１の領域に結合され、
    前記第１の領域は、前記第１の保持体構造に結合した第１の捕捉部位を含み、
    前記第２のプライマーセットは、前記第１の保持体構造とは異なった第２の保持体構造に結合され、
    前記第２の領域は、前記第２の保持体構造により前記基材の前記第２の領域に結合された第２の捕捉部位を含む、請求項１に記載のフローセル。
  12. 第１の基材と
    該第１の基材に結合した第１のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、
    前記第１の基材に対向する第２の基材と、
    該第２の基材に結合した第２のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第２のプライマーセットと、
    を含み、
    前記第１の領域は、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を有する材料を含み、
    前記第２の領域は、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を有する材料を含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、フローセル。
  13. 間隙領域によって分離された凹部を含む基材と、
    前記凹部の各々の第１のポリマー層であって、いくつかの官能基がキャップされている、第１のポリマー層と、
    前記凹部の各々の第１のポリマー層の他の官能基に取り付けられた第１のプライマーセットと、
    前記間隙領域上の、前記第１のポリマー層とは異なる第２のポリマー層と、
    流体キャリアと、前記第１のプライマーセットとは異なる第２のプライマーセットと、を含むプライミング液と、
    を含むフローセル、を含み、
    前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、
    前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、
    キット。
  14. フローセルへの鋳型流体を導入することを含む方法であって、
    前記フローセルは、
    間隙領域によって分離された凹部を含む基材と、
    前記凹部の各々における第１のポリマー層であって、露出した官能基がキャップされている第１のポリマー層と、
    前記凹部の各々における前記第１のポリマー層に結合された第１のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、
    前記間隙領域上の、前記第１のポリマー層とは異なる第２のポリマー層と、
    を備え、
    これにより、前記鋳型流体からの鋳型が増幅されて、前記凹部の少なくともいくつかにクラスターを形成し、
    切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む、第２のプライマーセットを含むプライミング液を前記フローセルに導入し、これにより、前記切断不可能な第１のプライマーおよび前記切断可能な第２のプライマーを前記第２のポリマー層にグラフトし、
    前記クラスターから前記切断不可能な第１のプライマーおよび前記切断可能な第２のプライマーへのブリッジ増幅を開始し、これにより、前記間隙領域の少なくともいくつかに第２のクラスターを形成し、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  15. フローセルに鋳型流体を導入し、
    前記フローセルは、
    間隙領域によって分離された凹部を含む基材と、
    前記凹部の各々における第１のポリマー層と、
    前記第１のポリマー層結合された第１のプライマーセットであって、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、
    前記第１のポリマー層上および前記第１のプライマーセット上の任意の保護塗装層と、
    前記間隙領域上の、前記第１のポリマー層とは異なる第２のポリマー層と、
    前記第２のポリマー層に結合した第２のプライマーセットであって、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第２のプライマーセットと、
    を備え、
    これにより、前記鋳型流体からの鋳型が増幅されて、前記凹部の少なくともいくつかおよび前記間隙領域の少なくともいくつかにクラスターを形成し、
    前記切断可能な第１のプライマーおよび前記切断可能な第２のプライマーを切断し、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  16. 保持体と、
    該保持体上のパターン化された樹脂であって、間隙領域によって分離された第１の凹部および第２の凹部を含み、前記第１の凹部は前記第２の凹部よりも小さい開口部寸法を有する、パターン化された樹脂と、
    前記第１の凹部の少なくともいくつかに結合した第１のプライマーセットと、
    前記第２の凹部の少なくともいくつかにそれぞれ配置された官能基を有するビーズであって、コア構造の表面に結合した第２のプライマーセットを含み、該第２のプライマーセットは、前記第１のプライマーセットとは異なっている、官能基を有するビーズと、
    を備え、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットは、前記第１の凹部の少なくともいくつかにおいて、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を有する材料に結合しており、
    前記官能基を有するビーズのコア構造の表面は、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を有する材料を含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、フローセル。
  17. ａ）前記官能基を有するビーズの前記コア構造が、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレン、およびアクリル酸塩からなる群から選択され、または
    ｂ）前記パターン化された樹脂が、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載のフローセル。
  18. 前記フローセルが前記第１の凹部および前記第２の凹部にポリマーをさらに含み、前記第１のプライマーセットが、前記第１の凹部の少なくともいくつかにおいて前記ポリマーの前記第１の官能基に結合される、請求項１６に記載のフローセル。
  19. ｉ）前記官能基を有するビーズが、前記第２の凹部の少なくともいくつかにおいて前記ポリマー上に配置され、または
    ｉｉ）前記第１のプライマーセットは、第２の凹部の少なくともいくつかにおいても前記ポリマーに結合され、
    前記官能基を有するビーズは、前記第２の凹部の少なくともいくつかにおいて前記第１のプライマーセット上に配置され、または
    ｉｉｉ）前記第１のプライマーセットは、第１のプライマーおよびウラシル修飾された第２のプライマーを含み、
    前記第２のプライマーセットは、ウラシル修飾された第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、請求項１８に記載のフローセル。
  20. 保持体と、
    該保持体上のパターン化された樹脂であって、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された樹脂と、
    少なくともいくつかの前記凹部に結合した第１のプライマーセットと、
    前記第１のプライマーセットの少なくともいくつかのプライマーが露出するように前記凹部の少なくともいくつかに配置された、官能基を有するビーズであって、コア構造の表面に結合した第２のプライマーセットを含み、該第２のプライマーセットが前記第１のプライマーセットとは異なっている、官能基を有するビーズと、
    を含み、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットは、前記凹部の少なくともいくつかにおいて、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を有する材料に結合しており、
    前記官能基を有するビーズのコア構造の表面は、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を有する材料を含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、フローセル。
  21. ａ）前記凹部の各々は、官能基を有するビーズの直径より大きいかまたは等しい第１の開口部寸法を有する第１の部分と、前記官能基を有するビーズの直径より小さい第２の開口部寸法を有する第２の部分とを含み、
    前記官能基を有するビーズは、前記凹部の少なくともいくつかの各々の前記第１の部分に配置され、または
    ｂ）前記官能基を有するビーズの前記コア構造が、二酸化ケイ素、超常磁性物質、ポリスチレン、およびアクリル酸塩からなる群から選択され、または
    ｃ）前記パターン化された樹脂が、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、
    請求項２０に記載のフローセル。
  22. ｉ）前記凹部に、前記第１の官能基を定義するポリマーをさらに含み、または
    ｉｉ）前記凹部におけるポリマーをさらに含み、前記第１のプライマーセットが、前記官能基を有するビーズによって占有されていない前記ポリマーの一部分に結合され、または
    ｉｉｉ）前記凹部におけるポリマーをさらに含み、前記第１のプライマーセットは、前記官能基を有するビーズが占めていないポリマーの一部に結合し、かつ、前記第１のプライマーセットは、前記凹部における前記ポリマーに結合され、前記官能基を有するビーズは、前記第１のプライマーセットの他のいくつかのプライマー上に配置される、
    請求項２０に記載のフローセル。
  23. 保持体上のパターン化された樹脂の凹部にポリマーを選択的に適用し、
    第１のプライマーセットを少なくともいくつかの前記凹部において前記ポリマーにグラフトし、
    前記第１のプライマーセットをグラフトする前後に、
    ｉ）少なくともいくつかの前記凹部の各々の一部に、または
    ｉｉ）少なくともいくつかの前記凹部よりも大きい開口部寸法を有する第２の凹部に、官能基を有するビーズを堆積し、
    該官能基を有するビーズは、コア構造の表面に結合された第２のプライマーセットを含み、前記第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとは異なっており、
    前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記ポリマーは、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を提供し、
    前記官能基を有するビーズのコア構造の表面は、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を有する材料を含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  24. ｉ）前記官能基を有するビーズを堆積させる前に、前記第２のプライマーセットを前記コア構造の表面に結合させることによって、前記官能基を有するビーズを形成することをさらに含み、または
    ｉｉ）少なくともいくつかの前記凹部の各々の一部は、前記官能基を有するビーズの各々の径より大きいかまたは等しい開口部寸法を有し、
    前記凹部の少なくともいくつかは、前記一部と相互接続された第２の部分を含み、前記第２の部分は、前記官能基を有するビーズの各々の直径よりも小さい第２の開口部寸法を有し、
    前記官能基を有するビーズは、サイズ排除によって前記凹部の少なくともいくつかの各々の前記一部に自己集合し、または
    ｉｉｉ）前記ポリマーを選択的に適用する前に、
    前記保持体上に樹脂を堆積し、
    ナノインプリントリソグラフィを使用して前記樹脂をパターン化することにより、
    前記保持体上に前記パターン化された樹脂を形成することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 保持体と、
    該保持体上のパターン化された樹脂であって、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された樹脂と、
    前記凹部におけるパターン化された樹脂上のブロック共ポリマーであって、該ブロック共ポリマーの他の各ブロックのブロック特異的官能基とは異なるブロック特異的官能基を有するブロック共ポリマーの各ブロックと、
    プライマーが前記ブロック特異的官能基に結合するように、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、切断可能な第１のプライマーと切断不可能な第2のプライマーを含む第２のプライマーセットと、を含み、
    第１のブロック特異的官能基は、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができ、第２のブロック特異的官能基は、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができ、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、フローセル。
  26. 前記パターン化された樹脂が、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、エポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、アクリル酸塩樹脂、メタクリレート樹脂、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載のフローセル。
  27. 前記パターン化された樹脂がＰＯＳＳベースの樹脂であり、該ＰＯＳＳベースの樹脂が架橋エポキシＰＯＳＳ樹脂である、請求項２６に記載のフローセル。
  28. ｉ）前記ブロック共ポリマーが、
    そのブロック特異的官能基としてアミノ基を有するアクリルアミドモノマーを含む第１のブロックと、
    そのブロック特異的官能基としてアジド基を有するアジドアセトアミドペンチルアクリルアミドモノマーを含む第２のブロックと、
    を含み、または
    ｉｉ）前記ブロック共ポリマーが、
    であり、
    Ｒは水素またはポリマー開始種末端基であり、
    ｎは１～１０，０００の範囲であり、
    ｍは１～１０，０００の範囲であり、または
    ｉｉｉ）前記ブロック共ポリマーが、
    であり、
    ｎは１～１０，０００の範囲であり、
    ｍは１～１０，０００の範囲である、請求項２７に記載のフローセル。
  29. 前記パターン化された樹脂が
    ｉ）非晶質フッ素ポリマーであり、または
    ｉｉ）非晶質フッ素ポリマーであり、かつ、
    前記ブロック共ポリマーが
    そのブロック特異的官能基としてトリフルオロメチル基を有するモノマーを含む第１のブロックと、
    そのブロック特異的官能基としてプライマーグラフト官能基を有するモノマーを含む第２のブロックと、
    を含む、請求項２８に記載のフローセル。
  30. 前記ブロック共ポリマーが、
    そのブロック特異的官能基としてプライマーグラフト化官能基を有するモノマーを含む第１のブロックと、
    前記第１のブロックおよび第２のブロックの相分離を促進するための相互作用パラメータを調整するためのモノマーを含む第２のブロックと、
    を含む、請求項２８に記載のフローセル。
  31. （Ａ）前記プライマーグラフト官能基はアジド基であり、
    前記第２のブロックのモノマーの前記ブロック特異的官能基は、アミノ基、アルコール基、アリール基、および荷電基からなる群から選択される、または、
    （Ｂ）前記ブロック共ポリマーは、第１のブロック、第２のブロック、および第３のブロックを含む三元共ポリマーであり、
    前記第１のブロックの前記ブロック特異的官能基は、前記パターン化された樹脂に結合し、
    前記第２のブロックの前記ブロック特異的官能基は、前記プライマーに結合し、
    前記第３のブロックのブロック特異的官能基は、前記プライマーとは別のプライマーまたは酵素に結合する、または、
    （Ｃ）前記ブロック共ポリマーは、第１のブロック、第２のブロック、および第３のブロックを含む三元共ポリマーであり、
    前記第１のブロックの前記ブロック特異的官能基は、前記パターン化された樹脂に結合し
    前記第２のブロックの前記ブロック特異的官能基は、前記プライマーに結合し、
    前記第３のブロックの前記ブロック特異的官能基は、前記ブロック共ポリマーの表面自由エネルギーに影響を及ぼすか、または前記ブロック共ポリマーの安定性に影響を及ぼす、請求項３０に記載のフローセル。
  32. ｉ）前記凹部は、ウェルおよびトレンチからなる群から選択される、または、
    ｉｉ）前記パターン化された樹脂および前記ブロック共ポリマーは、それぞれ、約２５ｍＮ／ｍ～約５０ｍＮ／ｍの表面自由エネルギーを有する、請求項２５に記載のフローセル。
  33. 保持体と、
    該保持体上のパターン化された多面体オリゴマーシルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂であって、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化されたＰＯＳＳベースの樹脂と、
    前記凹部における前記パターン化されたＰＯＳＳベースの樹脂上の分離されたブロック共ポリマーであって、前記分離されたブロック共ポリマーの一方のブロックが前記パターン化されたＰＯＳＳベースの樹脂に結合した官能基を有し、前記分離されたブロック共ポリマーの他方のブロックが他の官能基を有する、分離されたブロック共ポリマーと、
    プライマーが官能基に結合するように、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含む第１のプライマーセットと、切断可能な第1のプライマーと切断不可能な第2のプライマーを含む第2のプライマーセットと、
    を含み、
    前記分離されたブロック共ポリマーの一方のブロックは、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を提供し、
    前記分離されたブロック共ポリマーの他方のブロックは、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を提供し、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、フローセル。
  34. 前記分離されたブロック共ポリマーが、
    ｉ）
    ｎは１～１０，０００の範囲であり、かつ
    ｍは１～１０，０００の範囲である、および
    ｉｉ）
    Ｒは水素またはポリマー開始種末端基であり、
    ｎは１～１０，０００の範囲であり、かつ
    ｍは１～１０，０００の範囲である、
    からなる群から選択される、請求項３３に記載のフローセル。
  35. 間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された樹脂を形成するための樹脂をパターン化し、
    ブロック共ポリマーの各ブロックが該ブロック共ポリマーの他の各ブロックのブロック特異的官能基とは異なるブロック特異的官能基を有する、パターン化された前記樹脂上にブロック共ポリマーを含む溶液を導入し、
    該溶液を溶媒蒸気焼鈍に曝し、これにより、前記ブロック共ポリマー相が分離し、前記凹部において自己集合し、
    プライマーが前記ブロック特異的官能基にグラフトされるように、ブロックに第１のプライマーセットをグラフトし、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、ブロックに第２のプライマーセットをグラフトし、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    第１のブロック特異的官能基は前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができ、第２のブロック特異的官能基は前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができ、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  36. ｉ）前記樹脂をパターン化することは、ナノインプリントリソグラフィを含み、または
    ｉｉ）前記ブロック共ポリマーを含む前記溶液が、約０．０４～約０．３０の範囲のフロリー－ハギンズ相互作用パラメータを有し、または
    ｉｉｉ）前記グラフトの前に、前記凹部において相分離および自己集合ブロック共ポリマーを含む前記パターン化された樹脂を、硬化プロセスに曝すことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 基材上への第１の官能化層を適用し、
    該第１の官能化層をパターン化し、これにより、フォトレジストによって覆われた第１の官能化領域を形成し、
    前記フォトレジストおよび前記基材の一部の上に第２の官能化層を適用し、ここで、前記第１の官能化層は前記第２の官能化層とは異なり、
    前記フォトレジストおよびその上の任意の前記第２の官能化層をリフトオフし、
    前記第２の官能化層の一部を除去し、これにより、前記第１の官能化領域に隣接する第２の官能化領域を形成し、
    第１のプライマーセットを前記第１の官能化層または前記第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを前記第２の官能化層または前記第２の官能化領域に結合させ、前記第１のプライマーセットは前記第２のプライマーセットとは異なり、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  38. ｉ）前記除去は、
    前記第１の官能化領域上に第２のフォトレジストを適用し、前記第２の官能化領域となる前記第２の官能化層の第２の部分を適用し、
    前記第２の官能化層の前記一部をエッチングする、
    ことを含む、または
    ｉｉ）
    ａ）前記基材は保持体上に樹脂を備え、
    該樹脂は、間隙領域によって分離された凹部を備え、
    前記第１の官能化領域は、各凹部の第１の部分上にあり、
    前記第２の官能化層は、各凹部の第２の部分の上および前記間隙領域の上にあり、
    前記除去は、前記第２の官能化層を前記間隙領域から研磨する、もしくは
    ｂ）前記基材は保持体上の樹脂を含み、
    前記樹脂は、間隙領域によって分離された多層の凹部を含み、
    前記第１の官能化領域は、各多層の凹部の第１のレベルにあり、前記第２の官能化層を適用する前に、
    前記方法は、さらに、
    前記フォトレジストおよび前記樹脂の一部の上に犠牲層を適用するステップと、
    前記樹脂の前記一部から前記犠牲層を除去するステップと、
    前記多層の凹部から前記樹脂の領域を除去して、前記第１の官能化領域に近接する領域を形成するステップと、
    を含み、
    前記第２の官能化層が、前記フォトレジスト上の前記犠牲層、前記領域上、および前記間隙領域上に適用される、
    請求項３７に記載の方法。
  39. 第１の基材部が露光されるように基材上に第１のフォトレジストを適用し、
    該フォトレジストおよび前記第１の基材部上に第１の官能化層を適用し、
    前記フォトレジストおよびその上の前記第１の官能化層のいずれかをリフトオフし、これにより、前記第１の基材部上に第１の官能化領域を形成し、
    該第１の官能化領域に隣接する第２の基材部が露光されるように、前記第１の官能化領域上および前記基材上に第２のフォトレジストを適用し、
    前記第２のフォトレジストおよび前記第２の基材部上に第２の官能化層を適用し、ここで、前記第１の官能化層は前記第２の官能化層とは異なり、
    前記第２のフォトレジストおよびその上の前記第２の官能化層のいずれかをリフトオフし、これにより、前記第１の官能化領域に隣接する第２の官能化領域を形成し、
    第１のプライマーセットを前記第１の官能化層または前記第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを前記第２の官能化層または前記第２の官能化領域に結合させ、前記第１のプライマーセットは前記第２のプライマーセットとは異なり、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  40. 前記第１の官能化領域上の第１の自己集合単層および前記第２の官能化領域上の第２の自己集合単層をそれぞれ堆積することをさらに含み、
    前記第１のプライマーセットの結合は、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを前記第１の自己集合単層にグラフトすることを含み、
    前記第２のプライマーセットの結合は、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを前記第２の自己集合単層にグラフトすることを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 間隙領域によって分離されたトレンチと、該トレンチの各々の第１の部分における犠牲材料領域とを含む基材上に第１の官能化層を適用し、
    前記第１の官能化層をパターン化し、これにより、前記トレンチの各々の第２の部分にフォトレジストによって覆われた第１の官能化領域を形成し、
    前記トレンチの各々の前記第１の部分を露出させるために前記犠牲材料領域を除去し、
    前記間隙領域上、前記第１の部分上、および前記フォトレジスト上に第２の官能化層を適用し、
    前記フォトレジストおよびその上の前記第２の官能化層のいずれかをリフトオフし、
    前記第２の官能化層のいずれかを前記間隙領域から除去し、これにより、第２の官能化領域が前記トレンチの各々の前記第１の部分に残り、
    前記トレンチに少なくとも実質的に垂直な空間的に分離されたストライプのパターンで第２のフォトレジストを適用し、
    前記空間的に分離されたストライプの間に露出された前記第１の官能化領域および前記第２の官能化領域の部分を除去し、
    前記第２のフォトレジストを除去し、
    第１のプライマーセットを前記第１の官能化層または前記第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを前記第２の官能化層または前記第２の官能化領域に結合させ、前記第１のプライマーセットは前記第２のプライマーセットとは異なり、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  42. 前記基材は、前記トレンチの各々の前記第２の部分に第２の犠牲材料領域を含み、
    前記基材、前記犠牲材料領域、および前記第２の犠牲材料領域は、異なったエッチング率を有し、
    前記第１の官能化層を適用する前に、前記トレンチの各々の第２の部分から前記第２の犠牲材料領域を除去することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記第２の犠牲材料領域を除去する前に、
    前記間隙領域によって分離された前記トレンチを含む前記基材上への前記犠牲材料を適用し、
    前記犠牲材料の一部を除去して、犠牲材料の領域が各トレンチの各サイドウォールに直接的に隣接して残るようにし、
    前記基材上および前記犠牲材料領域上に第２の犠牲材料を適用し、
    該第２の犠牲材料の領域が前記犠牲材料領域のそれぞれに直接隣接して残るように、前記第２の犠牲材料の一部を除去し、
    前記第２の犠牲材料領域間の任意の空間を充填するために材料を適用する、
    ことにより、前記犠牲材料領域および前記第２の犠牲材料領域を形成することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記基材は多層基材であり、
    前記トレンチは前記多層基材の最表層に画定され、前記材料および前記最表層は同じである、請求項４３に記載の方法。
  45. 第１の間隙領域によって分離された凹部を含む基材に犠牲材料を適用するステップであって、それぞれの凹部は、段差部分によって画定された深い部分と浅い部分とを含み、前記犠牲材料の層である犠牲層は、前記深い部分を部分的に充填する、ステップと、
    前記犠牲層の一部および前記基材の一部を連続的に除去して、前記犠牲層の残りの部分と少なくとも実質的に同じ高さである第２の間隙領域を形成し、段差部分を除去して、前記犠牲層の残りの部分に隣接する領域を形成する、ステップと、
    前記第２の間隙領域、前記犠牲層の残りの部分、および前記領域上に第１の官能化層を適用するステップと、
    該第１の官能化層上にフォトレジストを適用するステップと、
    前記犠牲層の残りの部分および前記第２の間隙領域が露出されるように、および前記フォトレジストの第２の部分をその上に有する前記第１の官能化層の一部がその領域に残るように、フォトレジストの一部および前記第１の官能化層の下にある部分を除去するステップと、
    前記犠牲層の残りの部分を除去して、前記第１の官能化領域の前記部分に隣接する第２の領域を形成するステップと、
    前記領域に第２の官能化層を適用し、これにより、第２の官能化領域を形成するステップであって、前記第１の官能化層は前記第２の官能化層とは異なるステップと、
    前記フォトレジストの前記第２の部分をリフトオフし、これにより、第１の官能化領域を形成し、
    第１のプライマーセットを前記第１の官能化層または前記第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを前記第２の官能化層または前記第２の官能化領域に結合させるステップであって、前記第１のプライマーセットは前記第２のプライマーセットとは異なるものである、ステップと、
    を含み、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  46. 前記第２の官能化層は、前記フォトレジストの前記第２の部分および前記第２の間隙領域にも適用され、
    前記第２の官能化層の第１の部分は、前記フォトレジストの前記第２の部分と共に除去され、
    前記第２の間隙領域から前記第２の官能化層を研磨することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 保持体と、
    該保持体の上の第１の官能化層と、
    該第１の官能化層の上の第２の官能化層であって、ここで、前記第１の官能化層は前記第２の官能化層とは異なる、第２の官能化層と、
    該第２の官能化層の上の不動態化層と、
    を備える多層基材をインプリントする方法であって、
    これにより、前記不動態化層の間隙領域によって分離された特徴を形成し、前記第１および第２の官能化層の領域のそれぞれが、各特徴において露出され、
    第１のプライマーセットを前記第１の官能化層または前記第１の官能化層の領域に結合させ、第２のプライマーセットを前記第２の官能化層または前記第２の官能化層の領域に結合させ、前記第１のプライマーセットは前記第２のプライマーセットとは異なるものであり、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  48. ｉ）前記第１のプライマーセットの結合は、前記第１の官能化層が前記多層基材に組み込まれる前に、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを前記第１の官能化層に予めグラフトすることを含み、
    前記第２のプライマーセットの結合は、前記第２の官能化層が前記多層基材に組み込まれる前に、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを前記第２の官能化層に予めグラフトすることを含む、または
    ｉｉ）前記第１のプライマーセットの結合は、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを各凹部の前記第１の官能化領域にグラフトすることを含み、
    前記第２のプライマーセットの結合は、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを各凹部の前記第２の官能化領域にグラフトすることを含む、請求項３９、４１、４３、４５、または４７に記載の方法。
  49. 第１の樹脂をインプリントして、深い部分と、段差部分によって画定される浅い部分とを含む凹部を形成し、前記第１の樹脂は、第２の樹脂上に配置される犠牲層の上に配置され、
    前記第１の樹脂の第１の部分と、前記深い部分の下にある犠牲層の一部とをエッチングし、これにより、前記第２の樹脂の一部を露出させ、
    前記段差部分をエッチングし、これにより、前記犠牲層の第２の部分を露出させ、
    前記第１の官能化層を前記第２の樹脂の一部に適用して第１の官能化領域を形成し、
    前記犠牲層の前記第２の部分を除去し、これにより、前記第２の樹脂の第２の部分を露出させ、
    第２の官能化層を前記第２の樹脂の前記第２の部分に適用して、第２の官能化領域を形成し、ここで、前記第１の官能化層は前記第２の官能化層とは異なり、
    第１のプライマーセットを前記第１の官能化層または前記第１の官能化領域に結合させ、第２のプライマーセットを前記第２の官能化層または前記第２の官能化領域に結合させ、前記第１のプライマーセット前記は第２のプライマーセットとは異なるものであり、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
  50. 前記第２の官能化層の適用中に、前記第２の官能化層は、前記凹部を囲む間隙領域上に堆積され、前記第１の官能化領域上に堆積されず、
    前記間隙領域から前記第２の官能化層を研磨することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 第１のプライマーセットを第１の保持体構造により基材の第１の領域に結合させ、
    第２のプライマーセットを第２の保持体構造により前記基材の第２の領域に結合させ、
    該第２のプライマーセットおよび前記第２の保持体構造は、前記第１のプライマーセットおよび前記第１の保持体構造とは異なり、前記第１のプライマーセットは、切断不可能な第１のプライマーおよび切断可能な第２のプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、切断可能な第１のプライマーおよび切断不可能な第２のプライマーを含み、
    前記第１の保持体構造に選択的に結合する複数の第１の捕捉部位および前記第２の保持体構造に選択的に結合する複数の第２の捕捉部位を有する基材面に前記第１および第２の保持体構造をロードすることを含み、
    前記第１の領域は、前記第１のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第１の官能基を有する材料を含み、
    前記第２の領域は、前記第１の官能基とは異なり、かつ、前記第２のプライマーセットのプライマーを固定化することができる第２の官能基を有する材料を含み、
    前記第１のプライマーセットおよび前記第２のプライマーセットのうち、一方が切断不可能な順方向増幅プライマーと切断可能な逆増幅プライマーのセットであり、他方が切断可能な順方向増幅プライマーと切断不可能な逆増幅プライマーのセットである、方法。
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