CN117460836A - 流通池和方法 - Google Patents

Abstract

一种流通池的示例包括基底；沿着该基底延伸的多个反应区；以及将该多个反应区中的一个反应区与该多个反应区中的相邻一个反应区分离的非反应区。该多个反应区中的每个反应区包括沿着该反应区定位的交替的第一区域和第二区域。该第一区域中的每个第一区域包括第一引物组，并且该第二区域中的每个第二区域包括不同于该第一引物组的第二引物组。相邻第一区域和第二区域彼此直接邻接，或者该第一区域定位在突出部上并且该第二区域定位在与该突出部相邻的凹入部中。

Description

流通池和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月31日提交的美国临时申请序列号63/195,123的权益，该申请的内容全文以引用方式并入本文。

序列表的参考

通过EFS-Web提交的序列表在此以引用的方式整体并入本文。文件名称是ILI213BPCT_IP-2091-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，文件的大小为3,002字节，并且文件的创建日期为2022年5月26日。

背景技术

一些可用的核酸测序平台利用边合成边测序方法。利用这种方法，合成新生链，并且以光学和/或电子方式检测生长链中每种单体(例如，核苷酸)的添加。因为模板链指导新生链的合成，人们可根据在合成期间添加到生长链的一系列核苷酸单体推断出模板DNA的序列。在一些示例中，可使用顺序配对末端测序，其中对正向链进行测序和移除，然后对反向链进行构建和测序。

发明内容

本文所公开的示例中的一些示例是在相邻反应区域处包括不同引物组的流通池。不同引物组彼此正交。正交引物组使得不同模板链能够在相应反应区域上扩增，而不使得来自相邻反应区域的模板链能够接种和扩增。因此，正交引物减少或消除指数或垫跳跃，该指数或垫跳跃是一个反应区域中一个文库模板的扩增子簇被来自另一反应区域的不同扩增子污染。正交引物还使得反应区域能够彼此紧密接近地布置，几乎没有空隙区分开反应区域。这增加了反应区域密度，以及因此簇密度；并且还减少了流通池表面上的非功能性空间。增加的反应区域密度增加了测序期间的信号强度。

附图说明

通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。

图1A是包括不同引物组的示例性活性区的示意图；

图1B至图1E是使得能够在相邻活性区上产生正向和反向链的引物组的示意图；

图2是流通池的顶视图；

图3A和图3C是流通池中的表面化学架构的不同示例的半示意性透视图，每个示例包括由非反应区分开的反应区；

图3B是沿着图3A的线3B-3B截取的反应区中的一个反应区的剖视图；

图4A和图4C是流通池中的表面化学架构的不同示例的半示意性透视图，每个示例包括交替的第一反应区域和第二反应区域的行和列；

图4B是沿着图4A的线4B-4B截取的交替的第一反应区域和第二反应区域的行中的一行的剖视图；

图5是流通池中的表面化学架构的另一个示例的半示意性透视图，该示例包括第一高度和第二高度的交替区，以及沿着这些区延伸的交替的第一反应区域和第二反应区域；

图6是流通池中的表面化学架构的另一个示例的半示意性透视图，该示例包括三个不同的反应区域；

图7A是流通池中表面化学架构的又一个示例的顶视图，该示例包括在指定位置处的捕获引物；

图7B、图7C和图7D是图7A中的架构的不同示例的剖视图；

图8A至图8C一起示意性地描绘了用于制备本文所公开的表面化学架构的一些示例的方法的示例；

图9A至图9D一起示意性地描绘了用于制备本文所公开的表面化学架构的一些示例的另一种方法的示例；

图10A至图10C一起示意性地描绘了用于制备本文所公开的表面化学架构的其他示例的又一种方法的示例；

图11A至图11D一起示意性地描绘了用于制备本文所公开的表面化学架构的一些示例的再一种方法的示例；

图12A至图12L一起示意性地描绘了用于制备本文所公开的表面化学架构的一些示例的再一种方法的示例；

图13A是通过图12A至图12L的方法形成的表面化学架构的顶视图；并且

图13B是在图12A至图12L的方法中使用的多深度基底的一部分的示意性透视图，示出了其中引入不同表面化学成分的表面的六边形几何形状。

具体实施方式

本文公开的流通池中的一些流通池包括在相邻反应区域处的正交引物组。正交引物组使得不同模板链能够在相应反应区域上扩增，而不使得来自相邻反应区域的模板链能够接种和扩增。因此，正交引物减少或消除了指数或垫跳跃。正交引物还增加了反应区域密度，以及因此测序期间的信号强度。

本文公开的其他流通池包括以行和偏移列布置在整个基底上的正交捕获引物。正交捕获引物使得不同模板链能够被接种在整个基底表面上的相应区域处，并且周围引物组使得接种的模板链能够被扩增。

定义

应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。

除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。

术语包含、包括、容纳和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。

术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述流通池和/或流通池的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。

术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。

“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包含丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰氨基戊基丙烯酰胺：/>和N-异丙基丙烯酰胺：/>可使用其它丙烯酰胺单体。

如本文所用，术语“活化”是指在基座载体的表面或多层结构的最外层生成反应性基团的过程。活化可以使用硅烷化或等离子体灰化来完成。虽然可以在本文所公开的每个方法中进行活化，但是附图并没有描绘反应性基团。然而，应当理解，存在硅烷化层或-OH基团(来自等离子体灰化)以将聚合物水凝胶共价附接到下面的载体或层。可用于硅烷化过程的合适的硅烷包括氨基硅烷，诸如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷(AHAMTES)、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AEAPTES)和N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPTMS)；炔基硅烷，诸如O-炔丙基)-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)氨基甲酸酯、环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)；或降冰片烯硅烷，诸如[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。

如本文所用，醛是包含具有结构-CHO的官能团和R基团诸如烷基或其他侧链的有机化合物，结构-CHO包括碳原子也与氢键合的羰基中心(即，与氧双键键合的碳)。醛的通式结构是：

如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-C4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。

如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。

如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。

“氨基”官能团是指-NR_aR_b基团，其中R_a和R_b各自独立地选自氢(例如)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所定义。

如本文所用，术语“附接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到聚合物水凝胶。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。

“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N₃。

如本文所用，“粘结区域”是指图案化结构的要粘结到另一种材料的区域，该另一种材料可以例如为间隔层、盖、另一个图案化结构等，或者它们的组合(例如，间隔层和盖，或者间隔层和另一个图案化结构)。形成于粘结区域处的粘结可为化学粘结(如上所述)或机械粘结(例如，使用紧固件等)。

如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。

如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。

如本文所用，“亚环烷基”是指完全饱和的碳环或环系，其通过两个连接点连接到分子的其余部分。

如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。同样如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。

如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。同样如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。

如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。

如本文所用，术语“凹入部”是指基座载体或多层叠堆的层中的离散凹形特征。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。

当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。

如本文所用，术语“环氧”(也称为缩水甘油基或环氧乙烷基团)是指

如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的流动通道、用于将试剂递送到流动通道的入口以及用于从流动通道中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，流通池适于检测在该流通池中发生的反应。例如，流通池可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。

如本文所用，“流动通道”或“通道”可为限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可以限定在两个图案化结构之间，并且因此可以与这些图案化结构中的每个图案化结构的表面化学成分流体连通。在一些示例中，流动通道可以限定在图案化结构与盖之间，因此可以与一个图案化结构的表面化学成分流体连通。

如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员。

如本文所用，“杂环”意指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。

如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH₂基团。

如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指基团，其中R_a和R_b各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环，如本文所定义。

如本文所用，“羟基”是指-OH基团。

如本文所用，术语“空隙区域”是指例如基座载体或多层叠堆的层中将凹入部(凹形区域)或突出部(凸形区域)隔开的区域。在本文所公开的示例中，一些凹入部和/或突出部彼此直接邻接，并且因此在两个邻接的凹入部和/或突出部之间不存在空隙区。在其他示例中，空隙区可以形成在彼此以对角线定位的凹入部和/或突出部之间，或者可以形成在四个邻接凹入部和/或突出部中的三者的相交处。空隙区具有与凹入部或突出部的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部和/或突出部可具有聚合物水凝胶和其上的引物组，而空隙区没有这种表面化学成分。

如本文所用，“负性光刻胶”是指其中暴露于特定波长的光的部分变得不溶于显影剂的光敏材料。在这些示例中，不溶性负性光刻胶在显影剂中的溶解度小于5％。对于负性光刻胶，曝光会改变化学结构，从而使材料的暴露部分在显影剂中变得更难溶解(相比于未暴露部分)。不溶性负性光致抗蚀剂虽然不可溶于显影剂中，但是可以至少99％可溶于和显影剂不同的去除剂中。去除剂可以是例如在剥离过程中使用的溶剂或溶剂混合物。

与不溶性负性光刻胶相比，负性光刻胶没有暴露于光的任何部分至少95％可溶于显影剂。在一些示例中，负性光刻胶没有暴露于光的部分至少98％(例如99％、99.5％、100％)可溶于显影剂。

如本文所用，“腈氧化物”是指“R_aC≡N⁺O^-”基团，其中R_a在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(Cl)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。

如本文所用，“硝酮”是指基团，其中R¹、R²和R³可以是本文所定义的R_a基团和R_b基团中的任一者，不同的是R³不是氢(H)。

如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)。

在一些示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料直接位于另一个部件或材料上。当一个直接在另一个上时，两个彼此接触。在图3A中，层44施加在基座载体42上方，使得其直接位于基座载体42上并与该基座载体接触。

在其它示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料间接位于另一个部件或材料上。所谓间接地，表示间隙或另外的部件或材料可位于两个部件或材料之间。在图3A中，聚合物水凝胶12A定位在基座载体42上方，使得两者间接接触。更具体地，聚合物水凝胶12A间接在基座载体42上，因为树脂层44位于两个部件12A和42之间。

“图案化树脂”是指可具有限定于其中的凹入部和/或突起部的任何聚合物。树脂以及用于使树脂图案化的技术的具体示例将在下文中进一步描述。

“图案化结构”是指包括图案样式的表面化学成分的单层基座载体，或具有包括图案样式的表面化学成分的层的多层叠堆，所述图案例如在凹入部中、在突出部上，或以其他方式定位在该载体或层表面上。表面化学成分可包括聚合物水凝胶和引物。在一些示例中，单层基座载体或多层叠堆的该层已暴露于图案化技术(例如，蚀刻、光刻等)，以便生成表面化学成分的图案。然而，术语“图案化结构”不旨在暗示必须使用此类图案化技术来生成该图案。例如，基座载体可以是其上具有聚合物水凝胶的图案的基本上平坦的表面。图案化结构可以经由本文所公开的任何方法来生成。

如本文所用，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA)。一些引物，本文称为捕获引物，用作文库模板的种子。本文称为扩增引物的一些其他引物用作模板扩增和簇生成的起点。在一些情况下，扩增引物也可以充当用于接种文库模板的捕获引物。本文称为测序引物的另外其他引物用作DNA合成的起点。引物的5'末端可被修饰以允许与聚合物的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包含多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。

如本文所用，“正性光刻胶”是指其中暴露于特定波长的光的部分变得可溶于显影剂的光敏材料。在这些示例中，正性光刻胶暴露于光的任何部分至少95％可溶于显影剂。在一些示例中，正性光刻胶暴露于光的部分至少98％(例如99％、99.5％、100％)可溶于显影剂。对于正性光刻胶，曝光会改变化学结构，从而使材料的暴露部分在显影剂中变得更易溶解(相比于未暴露部分)。

与可溶性正性光刻胶相比，正性光刻胶没有暴露于光的任何部分不可溶于(少于5％可溶于)显影剂。不溶性正性光致抗蚀剂虽然不可溶于显影剂中，但是可以至少99％可溶于和显影剂不同的去除剂中。在一些示例中，不溶性正性光刻胶至少98％(例如99％、99.5％、100％)可溶于去除剂。去除剂可以是在剥离过程中使用的溶剂或溶剂混合物。

如本文所用，“间隔层”是指将两个部件粘结在一起的材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料，或者可与有助于粘结的辐射吸收材料接触。

术语“基板”是指在其上引入表面化学成分的单层基座载体或多层结构。

术语“表面化学成分”是指聚合物水凝胶和附接到聚合物水凝胶的引物组。在本文所公开的示例中，表面化学成分可以以各种架构布置。表面化学成分构成基底的反应区域或区，并且基底的没有表面化学成分的区域或区可以被称为非反应区域或区。

术语“五氧化二钽”是指具有式Ta₂O₅的无机化合物。该化合物对约0.35μm(350nm)到至少1.8μm(1800nm)范围内的波长是透明的，透射率在约0.25(25％)至1(100％)范围内。“五氧化二钽基座载体”或“五氧化二钽层”可以包含Ta₂O₅，基本上由其组成，或由其组成。

“硫醇”官能团是指-SH。

如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。

如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。

引物

在本文所述的示例中的一些示例中，流通池包括附接到紧邻反应区域的不同引物组。在一个示例中，直接相邻的反应区域是在基底表面上彼此相邻并且彼此邻接的那些反应区域。在另一个示例中，直接相邻的反应区域是在基底表面上彼此相邻但不彼此邻接的那些反应区域，因为它们位于不同高度处。

附接到紧邻反应区域的不同引物组的示例示于图1中。反应区域10A、10B、10C中的每一者包括聚合物水凝胶12A、12B、12C，相应的引物组14A、14B、14C附接到该聚合物水凝胶。如下文将更详细描述，一个反应区域10A、10B、10C中的聚合物水凝胶12A、12B、12C可与另一反应区域10A、10B、10C中的聚合物水凝胶12A、12B、12C相同或不同。

每个引物组14A、14B、14C包括两个不同的引物16A、18A或16B、18B或16C、18C，诸如正向和反向扩增引物。第一组(例如，14A)的引物16、18使得能够一起扩增具有与该第一组14A中的两个不同引物16A、18A互补的末端衔接子的文库模板。第二组(例如，16B)的引物16B、18B使得能够一起扩增具有与第二组14B中的两个不同引物16B、18B互补的末端衔接子的不同文库模板，但不使得能够接种或扩增与第一引物组14A相关联的文库模板。在一些示例中，使用第三引物组14C。在这些示例中，第三组14C的引物16C、18C使得能够一起扩增具有与第三组14C中的两个不同引物16C、18C互补的末端衔接子的不同文库模板，但不使得能够接种或扩增与第一引物组14A或第二引物组14B相关联的文库模板。

例如，第一引物组12包括P5引物和P7引物；并且第二引物组14包括本文所述的PA引物、PB引物、PC引物和PD引物的任意组合。在其他示例中，P15和P7可用于第一引物组12。例如，第二引物组14可包括任何两种(或三种)PA、PB、PC和PD引物，或者一种PA引物和一种PB、PC或引物PD的任何组合，或者一种PB引物和一种PC或PD引物的任何组合，或者一种PC引物和一种PD引物的任何组合。

P5引物和P7引物的示例用在由Illumina Inc.销售的商用流通池的表面上，用于例如在HISEQ^TM、HISEQX^TM、MISEQ^TM、MISEQDX^TM、MINISEQ^TM、NEXTSEQ^TM、NEXTSEQDX^TM、NOVASEQ^TM、ISEQ^TM、GENOME ANALYZER^TM和其他仪器平台上进行测序。P5引物是：

P5:5'→3'

AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(SEQ.ID.NO.1)

P7引物可以是以下中的任一种：

P7#1:5’→3’

CAAGCAGAAGACGGCATACGAnAT(SEQ.ID.NO.2)

P7#2：5’→3’

CAAGCAGAAGACGGCATACnAGAT(SEQ.ID.NO.3)

其中“n”是这些序列中的每个序列中的8-氧代鸟嘌呤或尿嘧啶。

P15引物是：

P15:5'→3'

AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC(SEQ.ID.NO.4)

其中“n”是烯丙基-T。

上述其他引物(PA-PD)包括：

PA 5’→3’

GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG(SEQ.ID.NO.5)

cPA(PA’)5’→3’

CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC(SEQ.ID.NO.6)

PB 5’→3’

CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT(SEQ.ID.NO.7)

cPB(PB’)5’→3’

AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG(SEQ.ID.NO.8)

PC 5’→3’

ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT(SEQ.ID.NO.9)

cPC(PC’)5’→3’

AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT(SEQ.ID.NO.10)

PD 5’→3’

GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC(SEQ.ID.NO.11)

cPD(PD’)5’→3’

GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC(SEQ.ID.NO.12)

虽然PA-PD的示例性序列中未示出，但是应当理解，这些引物中的任一者可在链中的任何点处包括裂解位点，诸如尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等。

例如，第一引物组14A包括未封端的P5引物和P7引物(SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.3)；并且第二引物组14B包括3’封端的P5和P7引物。在该示例中，可以添加附接到第二引物组14B的引物16B、18B的暴露的3'端的封端基团(例如，3'磷酸根)。封端基团防止在第一引物组14A的扩增期间在这些引物16B、18B处的不期望的延伸。然后可移除封端基团，以便用新添加的文库模板和第二引物组14B进行一轮扩增。

在另外其他示例中，本文所述的一个引物组14A、14B、14C可与使得能够同时进行配对末端测序的另一个引物组一起使用。使得能够同时进行配对末端测序的引物组包括在聚合物水凝胶的不同区域上的引物子组。图1B至图1E描绘了附接到聚合物水凝胶区12A1、12A2的引物子组13A、15A、13B、15B、13C、15C和13D、15D的不同配置。

第一引物子组13A、13B、13C和13D中的每一者包括不可裂解的第一引物17或17’和可裂解的第二引物19或19’；第二引物子组15A、15B、15C和15D中的每一者包括可裂解的第一引物25或25’和不可裂解的第二引物27或27’。

不可裂解的第一引物17或17’和可裂解的第二引物19或19’是寡核苷酸对，例如，其中不可裂解的第一引物17或17’是正向扩增引物，而可裂解的第二引物19或19’是反向扩增引物，或者其中可裂解的第二引物19或19’是正向扩增引物，而不可裂解的第一引物17或17’是反向扩增引物。在第一引物子组13A、13B、13C和13D的每个示例中，可裂解的第二引物19或19’包括裂解位点29，而不可裂解的第一引物17或17’不包括裂解位点29。

可裂解的第一引物25或25'和不可裂解的第二引物27或27'也是寡核苷酸对，例如，其中可裂解的第一引物25或25'是正向扩增引物，而不可裂解的第二引物27或27'是反向扩增引物，或者其中不可裂解的第二引物27或27'是正向扩增引物，而可裂解的第一引物25或25'是反向扩增引物。在第二引物子组15A、15B、15C和15D的每个示例中，可裂解的第一引物25或25’包括裂解位点29’或31，而不可裂解的第二引物27或27’不包括裂解位点29’或31。

应当理解，第一引物子组13A、13B、13C和13D的不可裂解的第一引物17或17’和第二引物子组15A、15B、15C和15D的可裂解的第一引物25或25’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是正向扩增引物)，不同的是可裂解的第一引物25或25’包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头33’中的裂解位点29’或31。类似地，第一引物子组13A、13B、13C和13D的可裂解的第二引物19或19’和第二引物子组15A、15B、15C和15D的不可裂解的第二引物27或27’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是反向扩增引物)，不同的是可裂解的第二引物19或19’包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头33中的裂解位点29。

应当理解，当第一引物17和25或17’和25’是正向扩增引物时，第二引物19和27或19’和27’是反向引物，反之亦然。

不可裂解的引物17、27或17'、27'可以是具有用于捕获和/或扩增目的的通用序列的任何引物，诸如P5、P7和P15引物或者PA、PD、PC、PD引物的任何组合(例如，PA和PB、或PA和PD等)。应当理解，这些引物17、27或17'、27'不包括序列中所示的裂解位点(例如，尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤等)。在一些示例中，P5引物和P7引物是不可裂解的引物17、27或17’、27’，因为它们分别不包括尿嘧啶和8-氧代鸟嘌呤。应当理解，任何合适的通用序列均可以用作不可裂解的引物17、27或17’、27’。

可裂解引物19、25或19’、25’的示例包括P5和P7引物或其他通用序列引物(例如，PA、PB、PC、PD引物)，其中相应的裂解位点29、29’、31掺入相应的核酸序列中(例如，图1B和图1D)，或掺入将可裂解的引物19、25或19’、25’附接到相应的官能化层24、26或层垫24’、26’的接头33’、33中(图1C和图1E)。合适的裂解位点29、29’、31的示例包括酶促可裂解的核碱基或化学可裂解的核碱基、经修饰的核碱基，或者接头(例如，核碱基之间的接头)，如本文所述。

每个引物子组13A和15A、或13B和15B、或13C和15C、或13D和15D附接到聚合物水凝胶区12A1、12A2。聚合物水凝胶区12A1、12A2可包括可与相应引物17、19或17’、19’或25、27或25’、27’选择性反应的不同官能团。

虽然在图1B至图1E中未示出，但是应当理解，引物子组13A、13B、13C或13D、或15A、15B、15C或15D中的一者或两者还可包括用于捕获/接种文库模板的PX引物。作为一个示例，PX可包括在引物子组13A、13B、13C和13D中，但不包括在引物子组15A、15B、15C或15D中。作为另一个示例，PX可包括在引物子组13A、13B、13C和13D中，并且包括在引物子组15A、15B、15C或15D中。PX基序的密度应当相对低，以便使每个凹入部30内的多克隆性最小化(参见例如图3B)。

图1B至图1E描绘了附接到聚合物水凝胶区12A1、12A2的引物子组13A、15A、13B、15B、13C、15C和13D、15D的不同配置。更具体地，图1B至图1E描绘了可以使用的引物17、19或17’、19’和25、27或25’、27’的不同配置。

在图1B所示的示例中，引物子组13A和15A的引物17、19和25、27直接附接到聚合物水凝胶区12A1、12A2，例如，无需接头33、33'。聚合物水凝胶区12A1具有能够将末端基团固定在引物17、19的5'端处的表面官能团。类似地，聚合物水凝胶区12A2具有能够将末端基团固定在引物25、27的5'端处的表面官能团。聚合物水凝胶区12A1和引物17、19之间的固定化学物质与聚合物水凝胶区12A2和引物25、27之间的固定化学物质是不同的，使得引物17、19或25、27选择性地附接到期望的聚合物水凝胶区12A1、12A2。聚合物水凝胶区12A1、12A2可包括本文公开的任何示例性聚合物水凝胶12A、12B、12C。

同样在图1B所示的示例中，可裂解的引物19、25各自的裂解位点29、29’掺入引物的序列中。在该示例中，相同类型的裂解位点29、29’用于相应引物子组13A、15A的可裂解的引物19、25中。作为一个示例，裂解位点29、29’是尿嘧啶碱基，并且可裂解的引物19、25是P5U(参见SEQ.ID.NO.1)和P7U(参见SEQ.ID.NOS.2和3)。尿嘧啶碱基或其他裂解位点也可掺入PA、PB、PC和PD引物中的任一种以产生可裂解的引物19、25。在该示例中，寡核苷酸对17、19的不可裂解的引物17可以是P7(没有8-氧代鸟嘌呤)，并且寡核苷酸对25、27的不可裂解的引物27可以是P5(没有尿嘧啶)。因此，在该实施例中，第一引物子组13A包括P7(没有8-氧代鸟嘌呤)、P5U(SEQ.ID.NO.1)并且第二引物子组15A包括P5(没有尿嘧啶)、P7U(SEQ.ID.NO.2或NO.3)。引物子组13A、15A具有相反的直链化化学物质，其在扩增、簇生成和直链化之后，允许在一个聚合物水凝胶区12A1上形成正向模板链，并且在另一个聚合物水凝胶区12A2上形成反向链。

在图1C所示的示例中，引物子组13B和15B的引物17'、19'和25'、27'例如通过接头33、33'附接到聚合物水凝胶区12A1、12A2。聚合物水凝胶区12A1、12A2包括相应官能团，并且相应接头33、33'的末端能够共价附接到相应官能团。因此，聚合物水凝胶区12A1可具有能够将接头33'固定在引物17'、19'的5'端处的表面官能团。类似地，聚合物水凝胶区12A2可具有能够将接头33'固定在引物25'、27'的5'端处的表面官能团。聚合物水凝胶区12A1和接头33的固定化学物质与聚合物水凝胶区12A2和接头33'的固定化学物质可以是不同的，使得引物17'、19'或25'、27'选择性地接枝到期望的聚合物水凝胶区12A1、12A2。

合适接头33、33’的示例可以包括核酸接头(例如，10个核苷酸或更少)，或者非核酸接头，诸如聚乙二醇链、烷基基团或碳链、具有邻二醇的脂肪族接头、肽接头，等等。核酸接头的一个示例是聚T间隔区，但是也可以使用其他核苷酸。在一个示例中，间隔区是6T至10T间隔区。以下是核苷酸的一些示例，包括具有末端炔烃基团的非核酸接头(其中B是核碱基并且“寡核苷酸”是引物)：

/>

在图1C所示的示例中，引物17'、25'具有相同的序列(例如，没有尿嘧啶的P5)以及相同或不同的接头33、33'。引物17’是不可裂解的，而引物25’包括掺入接头33’中的裂解位点29’。同样在该示例中，引物19’、27’具有相同的序列(例如，没有8-氧代鸟嘌呤的P7)以及相同或不同的接头33、33’。引物27’是不可裂解的，而引物19’包括掺入接头33中的裂解位点29。相同类型的裂解位点29、29’用于可裂解的引物19’、25’各自的接头33、33’中。作为示例，裂解位点29、29’可以是掺入核酸接头33、33’中的尿嘧啶碱基。引物子组13B、15B具有相反的直链化化学物质，其在扩增、簇生成和直链化之后，允许在一个聚合物水凝胶区12A1上形成正向模板链，并且在另一个聚合物水凝胶区12A2上形成反向链。

图1D所示的示例类似于图1B所示的示例，不同的是不同类型的裂解位点29、31用于相应引物子组13C、15C的可裂解的引物19、25中。例如，可使用两种不同的酶可裂解位点，可使用两种不同的化学可裂解位点，或者可使用一种酶可裂解位点和一种化学可裂解位点。可以在相应可裂解的引物19、25中使用的不同裂解位点29、31的示例包括下列物质的任何组合：邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤。

图1E所示的示例类似于图1C所示的示例，不同的是不同类型的裂解位点29、31用于与相应引物子组13D、15D的可裂解的引物19’、25’附接的接头33、33’中。可以在与可裂解的引物19’、25’附接的相应接头33、33’中使用的不同裂解位点29、31的示例包括以下物质的任何组合：邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤。

在另外其他示例中，流通池包括以行和偏移列布置在整个基底上的不同捕获引物。捕获引物是正交的，因为它们使得不同的模板链(即，文库模板)能够被接种在整个基底表面上的相应区域处。在示例中，捕获引物是PX引物。本文所述的PX引物可用作接种文库模板分子的捕获引物，但不以另外的方式参与扩增，因为它们与所有其他引物正交。对于使用引物组14A、14B、14C的连续配对末端测序，可将不同的PX引物包括在不同引物组14A、14B、14C中以捕获不同的文库模板分子。

PX捕获引物可以是：

PX 5’→3’

AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG(SEQ.ID.NO.13)

cPX(PX’)5’→3’

CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT(SEQ.ID.NO.14)

本文所公开的这些引物中的每一者还可在引物序列的5'端处包含polyT序列。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。

引物16A、18A或16B、18B或16C、18C中的任一者(包括捕获引物)可以在5'端处以能够与聚合物水凝胶12A、12B、12C的官能团单点共价附接的官能团封端。可使用的封端引物的示例包括炔烃封端的引物、四嗪封端的引物、叠氮基封端的引物、氨基封端的引物、环氧基或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸基封端的引物、硫醇封端的引物、醛封端的引物、肼封端的引物、亚磷酰胺封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。在一个示例中，引物用己炔基终止。在一些具体示例中，琥珀酰亚胺(NHS)酯封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的胺发生反应，醛封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的肼发生反应，或者炔烃封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的叠氮化物发生反应，或者叠氮化物封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的炔烃或DBCO(二苯并环辛炔)发生反应，或者氨基封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的活化的羧酸基团或NHS酯发生反应，或者硫醇封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的烷基化反应物(例如，碘乙酰胺或马来酰亚胺)发生反应，或者亚磷酰胺封端的引物可与聚合物水凝胶12A、12B、12C的硫醚发生反应。虽然已经提供了若干示例，但是应当理解，可以使用能够附接到引物16A、18A或16B、18B或16C、18C和/或捕获引物并且能够附接到聚合物水凝胶12A、12B、12C的官能团的任何官能团。类似的官能团可以包括在引物17、17'、19、19'、25、25'、27、27’中的任一者的5'端处。

聚合物水凝胶

在本文所述的示例中的任一个示例中，引物组14A、14B、14C附接到聚合物水凝胶12A、12B、12C。引物组14A、14B、14C的附接使得引物16A、18A或16B、18B或16C、18C的模板特异性部分自由退火到其同源模板，并且3’羟基基团自由用于引物延伸。应当理解，在本文公开的示例中，可以使用引物子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D代替引物组14A、14B、14C中的一者。在这些情况下，特定反应区域10A、10B或10C将包括附接到聚合物水凝胶12A、12B或12C的引物17、19、25、27或17'、19'、25'、27'(以参考图1B、图1C、图1D或图1E所述的方式)。

在一些示例中，聚合物水凝胶12A、12B、12C在反应区域10A、10B、10C中的每一者中是相同的。在这些示例中，聚合物水凝胶12A、12B、12C在化学上是相同的，并且本文公开的任何技术可用于将相应组14A、14B、14C的引物16A、18A或16B、18B或16C、18C顺序地附接到相应反应区域10A、10B、10C。当引物子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D用于区域10A、10B、10C中的一者时，子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D的引物17、19或17’、19’和25、27或25’、27’使用本文公开的示例性技术顺序地附接。

在其他示例中，聚合物水凝胶12A、12B、12C在反应区域10A、10B、10C中的每一者中是不同的。例如，反应区域10A、10B、10C中的每一者中的聚合物水凝胶12A、12B、12C可以包括不同的官能团，这些官能团能够附接到相应引物16A、18A或16B、18B或16C、18C的末端官能团。当引物子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D用于区域10A、10B、10C中的一者时，聚合物水凝胶区12A1、12A2包括用于附接特定子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D的引物17、19或17’、19’和25、27或25’、27的相应官能团。在一些情况下，不同的官能团是已经引入到沉积在基底上的聚合物水凝胶中的官能团。

聚合物水凝胶12A、12B、12C可以是任何凝胶材料，当吸收液体时该凝胶材料可溶胀，并且当例如通过干燥去除液体时该凝胶材料可收缩。在一个示例中，聚合物水凝胶包括丙烯酰胺共聚物。丙烯酰胺共聚物的一些示例由以下结构(I)表示：

其中：

R^A选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；

R^B为H或任选地取代的烷基；

R^C、R^D和R^E各自独立地选自H和任选地取代的烷基；

-(CH₂)_p-中的每一者可任选地被取代；

p为在1至50范围内的整数；

n为在1至50,000范围内的整数；并且

m为在1至100,000范围内的整数。

由结构(I)表示的丙烯酰胺共聚物的一个具体示例是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。

本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。

丙烯酰胺共聚物的分子量可以在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可以为约312kDa。

在一些示例中，丙烯酰胺共聚物是线型聚合物。在一些其他的示例中，丙烯酰胺共聚物为轻度交联聚合物。

在其他示例中，凝胶材料可以是结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可以用N,N-二甲基丙烯酰胺

替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用/>替换，其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括/>其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。

作为聚合物水凝胶12A、12B、12C的另一个示例，结构(I)中反复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：

其中R¹为H或C1-C6烷基；R₂为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。

作为再一个示例，聚合物水凝胶12A、12B、12C可包括结构(III)和(IV)中的每一者的重复出现的单元：

其中R^1a、R^2a、R^1b和R^2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R^3a和R^3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L¹和L²独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。

在又一个示例中，使用硝基氧介导的聚合形成丙烯酰胺共聚物，并且因此至少一些共聚物链具有烷氧基胺端基。在共聚物链中，术语“烷氧基胺端基”是指休眠种-ONR₁R₂，其中R₁和R₂中的每一者可以相同或不同，并且可独立地为直链或支链烷基或环结构，并且其中氧原子附接到共聚物链的其余部分。在一些示例中，还可以将烷氧基胺引入到一些重复出现的丙烯酰胺单体中，例如在结构(I)的位置R^A处。因此，在一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基；并且在另一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基和至少一些侧链中的烷氧基胺基团。

应当理解，其他分子可用于形成聚合物水凝胶12A、12B、12C，只要它们被官能化以将寡核苷酸引物组14A、14B、14C或子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D中的一者接枝到其上。合适的聚合物水凝胶12A、12B、12C材料的一些示例包括官能化硅烷，诸如降冰片烯硅烷、叠氮硅烷、炔官能化硅烷、胺官能化硅烷、马来酰亚胺硅烷，或者具有可以附接相应引物组14A、14B、14C或子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D的官能团的任何其他硅烷。合适的聚合物水凝胶12A、12B、12C材料的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物水凝胶12A、12B、12C材料的另外其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可以用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括树枝状聚合物(例如，多臂聚合物或星型聚合物)、星形或星型嵌段聚合物，等等。例如，可以将单体(例如，丙烯酰胺、包含催化剂的丙烯酰胺等)无规地或以嵌段掺入树枝状聚合物的支链(臂)中。

聚合物水凝胶12A、12B、12C可使用任何合适的共聚过程来形成，诸如硝基氧介导的聚合(NMP)、可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合等。聚合物水凝胶12A、12B、12C也可以使用本文公开方法中的任一种方法沉积。

聚合物水凝胶12A、12B、12C与下面的基底的附接可以通过共价键合进行。在一些情况下，可以首先例如通过硅烷化或等离子体灰化来活化下面的基底。共价连接有助于将引物组14A、14B、14C和/或子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D在流通池的整个寿命内在各种使用期间维持在期望区域中。

基底

流通池的基底可以是在其上形成反应区域10A、10B、10C的单层基座载体或多层结构。

合适的单层基座载体的示例包括环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的/>)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅、基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si₃N₄)、氧化硅(SiO₂)、五氧化二钽(Ta₂O₅)或其他钽氧化物(TaO_x)、氧化铪(HfO₂)、碳、金属、无机玻璃等。

多层结构的示例包括基座载体和其上的至少一个其他层。多层结构的一些示例包括玻璃或硅作为基座载体，该基座载体表面上具有(钽氧化物(例如，五氧化二钽或另一种钽氧化物(TaO_x)的)涂层或另一种陶瓷氧化物。多层结构的其他示例包括基座载体(例如，玻璃、硅、五氧化二钽，或任何其他基座载体材料)和作为涂层的图案化树脂。应当理解，可以选择性地沉积或者沉积并图案化以形成凹入部、不同高度的区等的任何材料可以用作图案化树脂。

在一个示例中，图案化树脂是可经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷选择性地施加到基座载体的无机氧化物。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta₂O₅)、氧化铝(例如Al₂O₃)、氧化硅(例如SiO₂)、氧化铪(例如HfO₂)等。

在另一个示例中，图案化树脂是可施加到基座载体并且然后进行图案化的聚合物树脂。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷的树脂(例如，来自Hybrid Plastics的)、非基于多面体低聚倍半硅氧烷的环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的/>)以及它们的组合。

如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”是指作为二氧化硅(SiO₂)和有机硅(R₂SiO)之间的杂交中间体(例如RSiO_1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO_3/2]_n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不同的笼或芯结构作为单体单元。

在示例中，基底可使用具有在约2mm至约300mm范围内的直径的圆形晶片，或者为最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板制造。在示例中，基底使用直径范围为约200mm到约300mm的圆形晶片制造。在另一个示例中，可以使用为矩形支持物的面板，其具有比300mm圆形晶片更大的表面积。晶片、面板和其他大基底材料可以被裂解成单独的流通池基底。在另一个示例中，基底是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的晶粒。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底材料来制造基底。

流通池结构

流通池20的顶视图在图2中示出。流通池20可包括两个粘结在一起的图案化结构，或者粘结到盖的一个图案化结构。流通池20的图案化结构的不同示例在图3A至图7D中示出。流动通道21位于两个图案化结构之间或者在一个图案化结构与盖之间。图2所示的示例包括八个流动通道21。虽然示出了八个流动通道21，但是应当理解，流通池20中可包括任何数量的流动通道21(例如，单个流动通道21、四个流动通道21，等等)。每个流动通道21可以与另一个流动通道21分离，使得引入流动通道21中的流体不会流到相邻的流动通道21中。引入流动通道21中的流体的一些示例可引入反应组分(例如，DNA样品、聚合酶、测序引物、标记的核苷酸等)、洗涤溶液、解封闭剂等。

流动通道21至少部分地由图案化结构限定。图案化结构可包括基底，诸如单层基座载体或多层结构。图2描绘了流通池20的顶视图，并且因此描绘了一个图案化结构的基底的顶部(例如，当流通池20包括盖时)或第二图案化结构的基底的底部(例如，当流通池20包括表面化学成分彼此面对的两个图案化结构时)。

在示例中，流动通道21具有矩形或基本上矩形的配置。可选择流动通道21的长度和宽度，使得基底的一部分包围流动通道21，并且可用于附接到盖(未示出)或另一个图案化结构。

当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道21的壁的单独材料时，流动通道21的深度可以小到单层厚。对于其他示例，流动通道21的深度可为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度可在约10μm至约30μm的范围内。在又一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，流动通道21的深度可大于、小于上文指定的值，或者介于这些值之间。

图3A至图7D描绘了图案化结构的不同示例，并且因此描绘了流通池20的流动通道21内的架构的不同示例。这些图的描述涉及引物组14A、14B、14C，但应当理解这些图中描述的引物组14A、14B、14C中的任一者可被本文所述的引物子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D中的任一者替代。

流通池20的图案化结构23A、23B的两个示例分别示于图3A和图3C中。流通池20的图案化结构23A、23B的这些示例包括基底22；沿着基底22延伸的多个反应区24、24'、24”；以及将多个反应区中的一个反应区(例如，24)与多个反应区中的相邻一个反应区(例如，24')分开的非反应区26、26'；其中：多个反应区24、24'、24”中的每一者包括沿着反应区24、24'、24”定位的交替的第一(反应)区域10A和第二(反应)区域10B；第一区域10A中的每一者包括第一引物组14A，并且第二区域10B中的每一者包括不同于第一引物组14A的第二引物组14B；并且i)相邻第一区域10A和第二区域10B彼此直接邻接(参见图3C)或者ii)第一区域10A定位在突出部28上并且第二区域10B定位在与突出部28相邻的凹入部30中(图3A和图3B)。

在图3A中，基底22是多层结构，包括单层基座载体42和定位在单层基座载体42上的另一层44。对于图3A中所示的图案化结构23A，基底22可替代地为单层基座载体42。在图3C中，基底22是单层基座载体42。对于图3C中所示的图案化结构23B，基底22可替代地为多层结构。

在图3A和图3C中，图案化结构23A、23B包括沿着基底22延伸的多个反应区24、24'、24”。在一个示例中，反应区24、24'、24”部分地沿着基底22的长度延伸，并且沿着流动通道21的整个长度延伸。每个反应区24、24'、24”包括交替的第一(反应)区域10A和第二(反应)区域10B。交替区域10A、10B的图案沿着反应区24、24'、24”中的每一者的长度延伸。

在图3A和图3B所示的示例中，基底22包括沿着反应区24、24’、24”交替的突出部28和凹入部30。在该示例中，突出部28和凹入部30形成在层44中。这些特征28、30在图3B的剖视图中示出。如图3A和图3B所描绘的，相应活性区域10A定位在突出部28中的每个突出部上，并且相应活性区域10B定位在凹入部30中的每个凹入部中。

突出部28从基底22的底部延伸第一高度H₁，并且凹入部30从基底22的底部延伸第二高度H₂，其中第一高度H₁大于第二高度H₂。突出部28中的每个突出部的表面可以与非反应区26、26'的表面共面。在该示例中，非反应区26、26'的表面也是基底22的表面。凹入部30中的每个凹入部的表面定位在从突出部/非反应区/基底表面(例如，层44的表面)测量的深度处。该深度至少为150nm。该深度特别适用于500碱基对(bp)长的文库模板(例如，假设0.35nm/bp)。深度不应超过约10:1的高度(深度)与宽度比。在一些示例中，深度可以在约150nm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大。

基底22的x-y平面中的突出部28和凹入部30的形状可以是正方形或矩形。突出部28和凹入部30可以具有相同的形状，以及因此相同的x-y尺寸。长度和宽度中的每一者可为约150nm或更大。在示例中，长度和宽度可各自在约150nm至约100μm的范围内，例如约0.5μm、约2μm、约10μm或更大。可以选择长度和宽度，使得它们不超过约10:1的长度与宽度比。突出部28和凹入部30中的每一者的宽度等于反应区24、24'、24”的宽度。

每个突出部28和凹入部30的大小可以分别由其表面和开口面积来表征。突出部28的表面积和凹入部30的开口面积可以在约1×10^-3μm²至约100μm²的范围内，例如，约1×10^-2μm²、约0.1μm²、约1μm²、至少约10μm²，或更大，或更小。

凹入部30还可以由其体积来表征。例如，体积可以在约1×10^-3μm³至约100μm³的范围内，例如，为约1×10^-2μm³、约0.1μm³、约1μm³、约10μm³，或更大，或更小。

如图3A所示，反应区24、24'或24”中的每一者内的交替的突出部28和凹入部30彼此直接邻接。因此，一个突出部28的边缘也是一个凹入部30的边缘。在该示例中，基底22在反应区24、24’或24”中的一者内的交替突出部28和凹入部30之间的仅有的暴露部分是突出部28和凹入部30的侧壁32(沿着z轴延伸)，该侧壁不具有施加到其上的聚合物水凝胶12A、12B或引物组14A、14B。该侧壁32限定活性区域10A、10B之间的空隙区。

在图3A和图3B所示的示例中，在交替的突出部28和凹入部30之间在基底22的x-y平面中缺少空隙区减小了活性区域10A、10B跨基底22的平均节距。在该示例中，平均节距是从一个活性区域10A的中心到相邻活性区域10B的中心的间距(中心到中心间距)。平均节距可在约50nm至约100μm的范围内。在示例中，平均节距可在约50nm至约2μm范围内。在另一个示例中，平均节距可为例如约0.4μm。

在该示例中，活性区域10A、10B彼此相邻，但并不直接彼此邻接，因为一者(10A)定位在突出部28上，而另一者(10B)定位在凹入部30内。

定位在每个突出部28上的活性区域10A包括聚合物水凝胶12A和引物组14A。因此，每个活性区域10A的x-y尺寸等于其上施加有活性区域10A的突出部28的x-y尺寸。定位在凹入部30中的每个凹入部内的活性区域10B包括聚合物水凝胶12B和引物组14B。因此，每个活性区域10B的x-y尺寸等于其中施加活性区域10B的凹入部30的x-y尺寸。

如本文所述，聚合物水凝胶12A、12B可以相同或不同，并且引物组14A、14B不同。在一个示例中，第一区域10A和第二区域10B中的每一者包括相同的聚合物水凝胶12A＝12B，相应的第一引物组14A和第二引物组14B附接到该聚合物水凝胶。在另一个示例中，第一区域10A包括第一引物组14A附接到其的第一聚合物水凝胶12A；第二区域10B包括第二引物组14B附接到其的第二聚合物水凝胶12B；并且第一聚合物水凝胶12A和第二聚合物水凝胶12B包括分别附接第一引物组14A和第二引物组14B的正交官能团。

现在参考图3C所示的示例，基底22是平面的，并且因此不包括突出部28或凹入部30。因此，相应反应区24、24’或24”内的交替活性区域10A、10B定位在基底表面上。

在图3C所示的示例中，活性区域10A、10B彼此直接邻接。因此，基底表面在交替的活性区域10A、10B之间不暴露，并且因此在相邻的活性区域10A、10B之间不存在空隙区。在交替的活性区域10A、10B之间的基底22的x-y平面中缺少空隙区减小了活性区域10A、10B跨基底22的平均节距。在该示例中，平均节距是在任一个反应区24、24’、24”中从一个活性区域10A的中心到相邻活性区域10B的中心的间距(中心到中心间距)。平均节距可在约50nm至约100μm的范围内。在示例中，平均节距可在约50nm至约2μm范围内。在示例中，平均节距可以是例如约0.4μm。

在该示例中，基底22的x-y平面中的活性区域10A、10B的形状可为正方形或矩形。活性区域10A、10B可具有相同形状，以及因此相同x-y尺寸。长度和宽度可各自在约150nm至约100μm的范围内，例如约0.5μm、约1μm、约10μm或更大。可以选择长度和宽度，使得它们不超过约10:1的长度与宽度比。活性区域10A、10B中的每一者的宽度等于反应区24、24’、24”的宽度。

在图3C所示的示例中，活性区域10A包括聚合物水凝胶12A和引物组14A，并且活性区域10B包括聚合物水凝胶12B和引物组14B。如本文所述，聚合物水凝胶12A、12B可以相同或不同，并且引物组14A、14B不同。在一个示例中，第一区域10A和第二区域10B中的每一者包括相同的聚合物水凝胶12A＝12B，相应的第一引物组14A和第二引物组14B附接到该聚合物水凝胶。在另一个示例中，第一区域10A包括第一引物组14A附接到其的第一聚合物水凝胶12A；第二区域10B包括第二引物组14B附接到其的第二聚合物水凝胶12B；并且第一聚合物水凝胶12A和第二聚合物水凝胶12B包括分别附接第一引物组14A和第二引物组14B的正交官能团。

在图3A和图3C所示的两个示例中，反应区24、24’、24”由相应的非反应区26、26'分开。非反应区26、26'是基底22的不含表面化学成分(例如，聚合物水凝胶12A、12B和引物组14A、14B)的区，该表面化学成分位于活性区域10A、10B中。非反应区26、26'沿着基底22在与反应区24、24’、24”相同的方向上延伸。在图3A和图3C所示的示例中，非反应区26、26'沿着基底22的长度延伸。如上所述，一个非反应区(例如，26)将一个反应区(例如，24)与紧邻的反应区(例如，24')分开。每个非反应区26、26'的宽度可足够大以减少或消除一个反应区(例如，24')中的活性区域10A、10B与紧邻反应区(例如，24及24')中的活性区域10A、10B之间的垫跳跃。在示例中，非反应区26、26'的宽度可以是150nm或更大。在示例中，宽度可各自在约150nm至约100μm的范围内，例如约0.5μm、约2μm、约10μm或更大。在示例中，非反应区26、26'的宽度可以是约0.3μm。

其他非反应区26、26'也可位于基底22的最外表面处(例如，位于周边处的一个或多个区处)。这些区26、26'可用于结合到另一图案化结构23A或23B的非反应区26、26'或结合到盖。

在图3A和图3C所示的示例中，反应区24、24’、24”的数量和每个反应区24、24’、24”内的活性区域10A、10B的数量将取决于反应区和非反应区定位在其中的通道21的长度和宽度、每个非反应区26、26'的宽度以及活性区域10A、10B的x和y尺寸。在基底22的x-y平面中的活性区域10A、10B之间缺少空隙区将增加限定区域中的活性区域10A、10B的密度(数量)。在示例中，活性区域10A、10B可以以大约360万个/mm²的密度存在。

流通池20的图案化结构23C、23D的两个附加示例在图4A和图4B中分别示出。流通池20的图案化结构23C、23D的这些示例包括基底22；以及交替的第一区域10A和第二区域10B的行34、34’、34”和列36、36’、36”；其中：第一区域10A中的每一者包括第一引物组14A，并且第二区域10B中的每一者包括不同于第一引物组14A的第二引物组14B；并且i)相邻第一区域10A和第二区域10B彼此直接邻接(图4C)或者ii)第一区域10A定位在突出部28上并且第二区域10B定位在与突出部28相邻的凹入部30中(图4A和图4B)。

在图4A中，基底22是多层结构，包括单层基座载体42和定位在单层基座载体42上的另一层44。对于图4A中所示的图案化结构23C，基底22可替代地为单层基座载体42。在图4C中，基底22是单层基座载体42。对于图4C中所示的图案化结构23B，基底22可替代地为多层结构。

在图4A和图4C两者中，图案化结构23C、23D包括交替的第一区域10A和第二区域10B的行34、34’、34”和列36、36’、36”。在一个示例中，行34、34’、34”部分地沿着基底22的宽度并且沿着流动通道21的整个宽度延伸；并且列36、36’、36”部分地沿着基底22的长度并且沿着流动通道21的整个长度延伸。每行34、34’、34”和每列36、36’、36”包括交替的第一(反应)区域10A和第二(反应)区域10B。

在图4A所示的示例中，基底22(例如层44)包括沿着行34、34’、34”并且沿着列36、36’、36”交替的突出部28和凹入部30。一行34”中的特征28、30在图4B的剖视图中示出。如图4A和图4B所描绘的，相应活性区域10A定位在突出部28中的每个突出部上，并且相应活性区域10B定位在凹入部30中的每个凹入部中。

突出部28从基底22的底部延伸第一高度H₁，并且凹入部30从基底22的底部延伸第二高度H₂，其中第一高度H₁大于第二高度H₂。突出部28中的每个突出部的表面可以与基底22的表面共面。凹入部30中的每个凹入部的表面定位在从基底表面(例如，从层44的表面)测量的深度处。深度可以在约150nm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大。

在图4A的示例中，基底22的x-y平面中的突出部28和凹入部30的形状可以是圆形、菱形或旋转正方形。突出部28和凹入部30可以具有相同的形状，以及因此相同的x-y尺寸。(圆形的)直径，或(菱形或旋转正方形的)长度和宽度中的每一者可在约150nm至约100μm的范围内，例如约0.5μm、约1μm、约10μm或更大。可以选择长度和宽度，使得它们不超过约10:1的长度与宽度比。突出部28和凹入部30中的每一者的宽度等于反应区24、24'、24”的宽度。

每个突出部28和凹入部30的大小可以分别由其表面和开口面积来表征，如参考图3A所述。凹入部30还可以由其体积来表征，如参考图3A所述。

如图4A所示，行34、34’、34”中的每一者内的交替的突出部28和凹入部30彼此直接邻接，并且列36、36’、36”中的每一者内的交替的突出部28和凹入部30彼此直接邻接。因此，突出部28和凹入部30中的一些共享侧壁32。当突出部28和凹入部30是圆形时，侧壁32沿着相应圆形的圆周。当突出部28和凹入部30是菱形或旋转正方形时，侧壁32沿着相应的菱形或旋转正方形的拐角。突出部28和凹入部30的侧壁32(沿着z轴延伸)不具有施加到其上的聚合物水凝胶12A、12B或引物组14A、14B，并且因此限定活性区域10A、10B之间的空隙区。

因为交替的突出部28和凹入部30彼此邻接，所以在邻接部分之间没有直接的空隙区。直接在突出部28和凹入部30的邻接部分之间在基底22的x-y平面中缺少空隙区减小了活性区域10A、10B跨基底22的平均节距。在该示例中，平均节距是在同一行34、34’、34”或列36、36’、36”中从一个活性区域10A的中心到相邻活性区域10B的中心的间距(中心到中心间距)。平均节距可在约50nm至约100μm的范围内。在示例中，平均节距可以在约50nm至约2μm的范围内。在示例中，平均节距可以是例如约0.4μm。

在该示例中，活性区域10A、10B彼此相邻，但并不直接彼此邻接，因为一者(10A)定位在突出部28上，而另一者(10B)定位在凹入部30内。

定位在每个突出部28上的活性区域10A包括聚合物水凝胶12A和引物组14A。因此，每个活性区域10A的x-y尺寸等于其上施加有活性区域10A的突出部28的x-y尺寸。定位在凹入部30中的每个凹入部内的活性区域10B包括聚合物水凝胶12B和引物组14B。因此，每个活性区域10B的x-y尺寸等于其中施加活性区域10B的凹入部30的x-y尺寸。

如本文所述，聚合物水凝胶12A、12B可以相同或不同，并且引物组14A、14B不同。在一个示例中，第一区域10A和第二区域10B中的每一者包括相同的聚合物水凝胶12A＝12B，相应的第一引物组14A和第二引物组14B附接到该聚合物水凝胶。在另一个示例中，第一区域10A包括第一引物组14A附接到其的第一聚合物水凝胶12A；第二区域10B包括第二引物组14B附接到其的第二聚合物水凝胶12B；并且第一聚合物水凝胶12A和第二聚合物水凝胶12B包括分别附接第一引物组14A和第二引物组14B的正交官能团。

现在参考图4C所示的示例，基底22是平面的，并且因此不包括突出部28或凹入部30。因此，行34、34’、34”或列36、36’、36”内的交替活性区域10A、10B定位在基底表面上。

在图4C所示的示例中，活性区域10A、10B彼此直接邻接。因此，基底表面在交替的活性区域10A、10B之间不直接暴露，并且因此在相邻的活性区域10A、10B之间不存在空隙区。在交替的活性区域10A、10B之间的基底22的x-y平面中缺少空隙区减小了活性区域10A、10B跨基底22的平均节距。在该示例中，平均节距是在任一行34、34’、34”或列36、36’、36”中从一个活性区域10A的中心到相邻活性区域10B的中心的间距(中心到中心间距)。平均节距可在约50nm至约100μm的范围内。在示例中，平均节距可在约50nm至约2μm范围内。在示例中，平均节距可以是例如约0.4μm。

在该示例中，基底22的x-y平面中的活性区域10A、10B的形状可以是圆形、菱形或旋转正方形。活性区域10A、10B可具有相同形状，以及因此相同x-y尺寸。(圆形的)直径，或(菱形或旋转正方形的)长度和宽度中的每一者可在约150nm至约100μm的范围内，例如约0.5μm、约1μm、约10μm或更大。

在图4C所示的示例中，活性区域10A包括聚合物水凝胶12A和引物组14A，并且活性区域10B包括聚合物水凝胶12B和引物组14B。如本文所述，聚合物水凝胶12A、12B可以相同或不同，并且引物组14A、14B不同。在一个示例中，第一区域10A和第二区域10B中的每一者包括相同的聚合物水凝胶12A＝12B，相应的第一引物组14A和第二引物组14B附接到该聚合物水凝胶。在另一个示例中，第一区域10A包括第一引物组14A附接到其的第一聚合物水凝胶12A；第二区域10B包括第二引物组14B附接到其的第二聚合物水凝胶12B；并且第一聚合物水凝胶12A和第二聚合物水凝胶12B包括分别附接第一引物组14A和第二引物组14B的正交官能团。

在图4A和图4C所示的两个示例中，非反应区26位于四个活性区域10A、10B的相交处。这四个活性区域10A、10B以类似正方形的配置定位，使得每个活性区域10A与两个不同的活性区域10B相邻，并且每个活性区域10B与两个不同的活性区域10A相邻。非反应区26将活性区域10A、10B分开，这些活性区域以类似正方形的配置彼此对角。

其他非反应区26也可位于基底22的最外表面处(例如，沿着周边)。这些区26可用于结合到另一图案化结构23C或23D的非反应区26或结合到盖。

在图4A和图4C所示的示例中，行34、34’、34”、列36、36’、36”的数量以及每行34、34’、34”和列36、36’、36”内的活性区域10A、10B的数量将取决于活性区域10A、10B定位在其中的通道21的长度和宽度以及活性区域10A、10B的x和y尺寸。直接在基底22的x-y平面中的活性区域10A、10B之间缺少空隙区将增加限定区域中的活性区域10A、10B的密度(数量)。在示例中，活性区域10A、10B可以以大约630万个/mm²的密度存在。

流通池20的图案化结构23E的再一个示例在图5中示出。流通池20的图案化结构23E的该示例包括具有交替的第一高度H₃的区38、38’、38”和第二高度H₄的区40、40’的基底22；以及沿着第一高度H₃的区38、38’、38”延伸并且沿着第二高度H₄的区40、40'延伸的交替第一区域10A和第二区域10B；其中第一区域10A中的每一者包括第一引物组14A，并且第二区域10B中的每一者包括不同于第一引物组14A的第二引物组14B。

在图5中，基底22是多层结构。如图所描绘的，基底22包括基座载体42和定位在基座载体42上的另一层44。在图案化结构23E的该示例中，基底22可替代地为单层基座载体。

在该示例中，基底22，特别是层44，被图案化为具有交替的第一高度H₃的区38、38’、38”和第二高度H₄的区40、40'。层44可以是本文所述的图案化树脂的任何示例，并且可以使用本文所述的任何技术以变化的高度H₃、H₄图案化。在一个示例中，层44被图案化，使得区38、38’、38”和区40、40'部分地沿着基底22的长度延伸，并且沿着流动通道21的整个长度延伸。

第一高度H₃和第二高度H₄从基底22的底部测量，并且第一高度H₃大于第二高度H₄。在一些示例中，区38、38’、38”中的每一者具有相同的高度H₃，并且区40、40'中的每一者具有相同的高度H₄。在其他示例中，区38、38’、38”中的每一者具有不同的高度H₃，并且区40、40’中的每一者具有不同的高度H₄，只要区38、38’、38”中的每一者的高度大于区40、40’中的每一者的高度。在任何示例中，第一高度H₃与第二高度H₄之间的差为至少150nm。

区38、38’、38”中的每一者的表面可以与基底表面共面。区40、40’中的每一者的表面被定位在从基底/区38、38’、38”表面测量的深度处。深度可以在至少150nm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大。

如图5所示，相邻区(例如38和40、40和38'、38'和40'、以及40'和38”)共享侧壁32。在该示例中，相邻区(例如，38和40、40和38'、38'和40'、以及40'和38”)之间的基底22的唯一暴露部分是沿着z轴延伸的侧壁32。相应侧壁32不具有施加到其上的聚合物水凝胶12A、12B或引物组14A、14B，并且因此侧壁32限定定位在区38、38’、38”上的活性区域10A、10B以及定位在区40、40’上的那些活性区域之间的空隙区。

区38、38’、38”和区40、40’中的每一者包括交替的第一(反应)区域10A和第二(反应)区域10B。在图5所示的示例中，区域10A、10B沿着区38、38’、38”中的每一者的交替图案是10A、10B、10A、10B等，并且区域10A、10B沿着区40、40'中的每一者的交替图案是相反的，例如10B、10A、10B等。因此，区域10A、10B的交替图案沿着区38、38’、38”，40、40'中的每一者的长度(例如，在图5中的y方向上)并且还在垂直于该长度的方向上(例如，在图5中的x方向上)跨过区38”、40'、38'、40、38被观察到。

在该示例中，区38、38’、38”，40、40'中的每一者中的活性区域10A、10B(例如，在图5中的y方向上)彼此紧邻且彼此直接邻接。因此，在作为特定区38、38’、38”，40、40'的一部分的活性区域10A、10B之间不存在空隙区。相比之下，由于相邻区之间的高度H₃、H₄的变化，相邻区域(例如，38和40、40和38'、38'和40'、以及40'和38”)中的活性区域10A、10B彼此相邻但不直接彼此邻接。如本文所提到的，侧壁32用作活性区域10A、10B之间跨过区38”、40'、38'、40、38的空隙区。

在该示例中，基底22的x-y平面中的活性区域10A、10B的形状可为正方形或矩形。活性区域10A、10B可具有相同形状，以及因此相同x-y尺寸。长度和宽度可各自在约150nm至约100μm的范围内，例如约0.5μm、约1μm、约10μm或更大。在区38、38’、38”中的每个活性区域10A、10B的宽度等于相应区38、38’、38”的宽度；并且在区40、40'中的每个活性区域10A、10B的宽度等于相应区40、40'的宽度。

在图5所示的示例中，活性区域10A包括聚合物水凝胶12A和引物组14A，并且活性区域10B包括聚合物水凝胶12B和引物组14B。如本文所述，聚合物水凝胶12A、12B可以相同或不同，并且引物组14A、14B不同。在一个示例中，第一区域10A和第二区域10B中的每一者包括相同的聚合物水凝胶12A＝12B，相应的第一引物组14A和第二引物组14B附接到该聚合物水凝胶。在另一个示例中，第一区域10A包括第一引物组14A附接到其的第一聚合物水凝胶12A；第二区域10B包括第二引物组14B附接到其的第二聚合物水凝胶12B；并且第一聚合物水凝胶12A和第二聚合物水凝胶12B包括分别附接第一引物组14A和第二引物组14B的正交官能团。

图5中所示的图案化结构23E还可以包括位于基底22的周边的至少一部分处的非反应区26，其中非反应区26是基底22(例如，层44)的暴露部分。在图5所示的示例中，非反应区26位于基底22的相对边缘处并且沿着长度延伸。这些非反应区26可用于结合到另一图案化结构23E或盖，例如以便产生流动通道21(图5中未示出)。

在图3A至图5中所示的示例中的任一者中，活性区域10A、10B的定位可颠倒。例如，在图3A或图4A中，活性区域10A可以形成在凹入部30中，并且活性区域10B可以形成在突出部28上。

流通池20的图案化结构23F的再一个示例在图6中示出。流通池20的图案化结构23F的该示例包括基底22；多个第一区域10A，每个第一区域10A包括第一引物组14A并且与每个其他第一区域10A隔离；多个第二区域10B，每个第二区域10B包括第二引物组14B，并且通过至少一个相邻的第一区域10A和至少一个相邻的第三区域10C与每个其他第二区域10B隔离；以及多个第三区域10C，每个第三区域10C包括第三引物组14C，并且通过至少一个相邻的第一区域10A和至少一个相邻的第二区域10B与每个其他第三区域10C隔离。

在图6中，基底22是单层基座载体。在图案化结构23F的该示例中，基底22可替代地为多层结构。

在该示例中，基底22是平面的，并且因此不包括不同高度H₃、H₄的突出部28或凹入部30或区38、40等。因此，活性区域10A、10B、10C定位在基底表面上。

在该示例中，基底22的x-y平面中的活性区域10A、10B、10C的形状可为圆形。活性区域10A、10B可具有相同形状，以及因此相同x-y尺寸。直径可以在约150nm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大。

活性区域10A、10B、10C可以跨基底22以若干行46、46’、46”布置。在图6所示的示例中，每隔一行46'与其紧邻的行46、46”稍微偏移，因此稍微偏移的行46'中的活性区域10A、10B、10C位于紧邻的行46、46”中的两个活性区域10A、10B、10C之间。从一行46、46’、46”到下一行46、46’、46”的偏移定位允许活性区域10A与活性区域10B和/或10C接触但不与其他活性区域10A接触，允许活性区域10B中的每一者与区域10A和/或10C接触但不与其他活性区域10B接触，并且允许活性区域10C中的每一者与区域10A和/或10B接触但不与其他活性区域10C接触。

给定行46、46’、46”内的活性区域10A、10B、10C彼此相邻并且因此彼此直接邻接(例如，在x方向上)，使得给定行46、46’、46”内的活性区域10A、10B、10C之间不存在空隙区。偏移行46'中的每个活性区域10A、10B、10C可以在对角线处直接邻接紧邻行46、46”中的一个或两个活性区域10A、10B、10C。在图6所示的示例中，偏移行46’中的每个活性区域10A、10B、10C相对于行46中的活性区域10A、10B、10C中的两者且相对于行46”中的活性区域10A、10B、10C中的两者成45°对角线。作为一个示例，偏移行46'中的活性区域10C和行46中的两个对角活性区域10A、10B以类似三角形的配置定位，使得活性区域10A、10B彼此相邻(在行46中)并且各自相对于活性区域10C(在行46'中)成对角线。作为另一个示例，偏移行46'中的活性区域10A和行46”中的两个对角活性区域10B、10C以类似三角形的配置定位，使得活性区域10B、10C彼此相邻(在行46”中)并且各自相对于活性区域10A(在行46'中)成对角线。

从一行46、46’、46”到下一行46、46’、46”的偏移定位在每个类似三角形的配置的相交处产生非反应区26。其他非反应区26也可位于基底22的最外表面处(例如，在周边处)。这些区26可用于结合到另一图案化结构23F的非反应区26或结合到盖。

在图6所示的示例中，活性区域10A包括聚合物水凝胶12A和引物组14A，活性区域10B包括聚合物水凝胶12B和引物组14B，并且活性区域10C包括聚合物水凝胶12C和引物组14C。如本文所述，聚合物水凝胶12A、12B、12C可以相同或不同，并且引物组14A、14B、14C不同。在示例中，第一引物组14A包括P5和P7引物；第二引物组14B包括PX、PA、PB、PC和/或PD引物的任何组合；并且第三引物组14C包括不同于第二引物组14B的PX、PA、PB、PC和/或PD的任何组合。引物组14A、14B、14C中的任一者也可用引物子组13A、15A或13B、15B等替换。在一个示例中，第一区域10A、第二区域10B和第三区域10C中的每一者包括与相应的第一引物组14A、第二引物组14B和第三引物组14C附接到其的相同的聚合物水凝胶12A＝12B＝12C。在另一个示例中，第一区域10A包括第一引物组14A附接到其的第一聚合物水凝胶12A；第二区域10B包括第二引物组14B附接到其的第二聚合物水凝胶12B；第三区域10C包括第三引物组14B附接到其的第三聚合物水凝胶12C；并且第一聚合物水凝胶12A、第二聚合物水凝胶12B和第三聚合物水凝胶12C包括分别附接第一引物组14A、第二引物组14B和第三引物组14C的正交官能团。

流通池20的图案化结构23G的再一个示例在图7A中示出。

流通池20的图案化结构23G的该示例包括基底22；以行50、50’、50”和偏移列52、52’、52”、52”’、52””跨过基底22布置多个捕获引物48；定位在基底22上并且包围多个捕获引物48中的每一者的连续聚合物水凝胶12；以及附接到连续聚合物水凝胶12的引物组14。

本文所述的PX引物是合适的捕获引物48。本文所述的引物组或子组中的任一者可附接到包围捕获引物48的聚合物水凝胶12。每个捕获引物48与一个文库模板杂交，该文库模板跨引物组14扩增。当不同的扩增子簇物理碰撞时，扩增停止，从而产生不同的活性区域10A、10B、10C。

图案化结构23G的不同配置在图7B至图7D中示出。在图7B至图7D中，基底22是单层基座载体。在图案化结构23G的任何示例中，基底22可替代地为多层结构。

在图7B中，基底22是平面的，并且多个捕获引物48和连续聚合物水凝胶12附接到基底表面。

在图7C中，基底22包括以行50、50’、50”和偏移列52、52’、52”、52”’、52””跨过基底22布置的突出部28；并且多个捕获引物48中的一个捕获引物定位在突出部28中的每个突出部上。

在图7D中，基底22包括以行50、50’、50”和偏移列52、52’、52”、52”’、52””跨过基底22布置的凹入部30；并且多个捕获引物48中的一个捕获引物定位在凹入部30中的每个凹入部中。

在图3A、图4A、图4C、图5和图6所示的示例中，应当理解，形成在基底表面上的活性区域10A、10B、10C可以替代地形成在凹入部(例如，30)中。在这些示例中，活性区域10A可以以与包含活性区域10B的凹入部30的深度不同并且与包含活性区域10C(如果包括的话)的凹入部30的深度不同的深度定位在凹入部30中。不同凹入部之间的深度差为至少150nm。当各种活性区域10A、10B、10C形成在具有不同深度的凹入部中时(与一些形成在基底表面上相反)，基底的表面可以通过抛光清除任何聚合物水凝胶12A、12B、12C和引物14A、14B等，同时凹入部中的表面化学成分保持完整。

制作流通池架构的方法

图3A和图4A中所示的图案化结构23A、23C的架构可以通过图8A至图8C中所示的方法制备。利用该示例性方法，图案化结构23A、23C包括多层基底22。该方法通常包括将第一聚合物水凝胶12A沉积在多层基底(基底22的一个示例)上，该多层基底包括含有附接到第一聚合物水凝胶12A的表面基团的基座载体42；定位在基座载体42上的层44，该层44包括不能附接到第一聚合物水凝胶12A的材料；以及在层44中限定的多个凹入部30，使得基座载体42的一部分60在多个凹入部30的每一个处暴露，由此第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到基座载体42的在多个凹入部30的每个凹入部处暴露的部分60；用附接第二聚合物水凝胶12B的表面基团活化层44；沉积第二聚合物水凝胶12B，使得其选择性地附接到层44；将第一引物组14A接枝到第一聚合物水凝胶12A；以及将第二引物组14B接枝到第二聚合物水凝胶14B上，第二引物组14B不同于第一引物组14A。

虽然第一聚合物水凝胶12A和引物组14A在图3A和图4A中显示在突出部28上，但它们在图8C中显示在凹入部30中。类似地，虽然第二聚合物水凝胶12B和引物组14B在图3A和图4A中显示在凹入部30中，但它们在图8C中显示在突出部28上。应当理解，可以执行图8A至图8C所示的方法，使得反应区域10A形成在凹入部30中并且反应区域10B形成在突出部28上，或者使得反应区域10B形成在凹入部30中并且反应区域10A形成在突出部28上。

如图8A所示，基底22包括基座载体42和定位在其上的图案化层44。在一个示例中，基座载体42是树脂材料。

层44形成在基座载体42上。层44可以是能够被选择性地沉积或者沉积并且图案化以形成凹入部30和突出部28的任何材料。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷的树脂、非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的)以及它们的组合。

凹入部30和突出部28的布置可以如图3A中所示。因此，在一个示例中，层44被图案化以包括沿着层44延伸的多条第一线(类似于区24、24’、24”)，第一线中的每条线包括由层44的非图案化区(在图8A中示为突出部28)分开的多个凹入部30中的一些凹入部；以及将多条第一线中的一条第一线与多条第一线中的相邻一条第一线分开的第二线(类似于区26、26’)，该第二线包括层44的连续非图案化区，该连续非图案化区延伸多条第一线中的每条第一线的长度。凹入部30和突出部28的布置可以另选地如图4A所示。因此，在一个示例中，层44被图案化以包括层44的交替的凹入部30和非图案化区(在图8A中示为突出部28)的行(类似于行34、34’、34”)和列(类似于列36、36’、36”)。

层44覆盖基座载体42(如图3A和图4A所示)，除了在凹入部30处之外，在该凹入部中，活化的基座载体42的一部分60被暴露(如图8A所示)。

在一个示例中，基座载体42的暴露部分60可经由等离子体灰化来活化以引入可附接到第一聚合水凝胶12A的表面基团。层44可以在等离子体蚀刻过程期间被掩蔽，使得它不受影响。在另一个示例中，在层44形成于其上之前，可将基座载体42暴露于活化(例如，经由等离子体灰化或硅烷化)。在任一情况下，基座载体42的暴露部分60经官能化以选择性地附接到聚合物水凝胶12A，并且定位在基座载体42上的层44不能附接到第一聚合物水凝胶12A。

如图8B所示，使用任何合适的沉积技术将第一聚合物水凝胶12A沉积在多层基底22上。在该示例中，第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到载体42的暴露部分60，而不附接到层44的暴露部分。

然后清洁层44(例如，用NaOH)并用附接第二聚合物水凝胶12B的表面基团活化该层。用于活化层44的过程可取决于希望第二聚合物水凝胶12B附接的位置。

在图3A所示的示例中，非反应区26、26'不具有施加到其上的聚合物水凝胶12A、12B。因此，不希望活化层44的形成非反应区26、26'的连续非图案化区。层44的最终形成非反应区26、26'的连续非图案化区(称为第二线)可在层44的活化期间被掩蔽(例如，使用光致抗蚀剂)，使得这些线不能附接到第二聚合物水凝胶12B。在图3A中，在突出部28上形成沿着层44的(第一)线与凹入部28交替的活性区域，并且此期望活化突出部28。突出部28可通过硅烷化活化。一旦突出部28被活化，掩蔽层可从层44的连续非图案化区移除。突出部28含有附接到聚合物水凝胶(如图3A中所示的12A或如图8C中所示的12B)的表面基团。相比之下，层44的形成非反应区26、26'的连续非图案化区不具有附接聚合物水凝胶(如图3A所示的12A或如图8C所示的12B)的表面基团。

在图4A所示的示例中，在活性区域(例如，10A)形成在突出部28上之前，凹入部30被层44的非图案化区包围。这些非图案化区中的一些非图案化区在图8B中以附图标记62示出。在该示例中，活化层44涉及选择性硅烷化(层44的)非图案化区以产生层44的交替凹入部30(其中具有聚合物水凝胶12A(图8B)或12B(图4A))和活化区域62的行和列，其中凹入部30和活化区域62是圆形的并且具有相同直径。该活化过程形成用于将在突出部28上形成的活性区域的图案。

然后可将另一种聚合物水凝胶施加到例如活化的突出部28上。在图8C中，另一种聚合物水凝胶是第二聚合物水凝胶12B。在一个示例中，第二聚合物水凝胶12B附接到突出部28上的活化部分62。第二聚合物水凝胶12B可以使用任何合适的沉积技术来施加，并且当在高离子强度下(例如，在10x PBS、NaCl、KCl等存在下)进行该沉积时，第二聚合物水凝胶12B不会沉积在第一聚合物水凝胶12A(即，凹入部30中的聚合物水凝胶)上，也不会附着到该第一聚合物水凝胶。

该方法还包括将相应的引物组14A、14B附接到聚合物水凝胶12A、12B上。在一些示例中，引物组14A、14B可预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。

在其他示例中，引物组14A、14B不预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B。在这些示例中，引物组14A可在施加聚合物水凝胶12A之后接枝(例如，在图8B中)。在这些示例中，引物组14B可以预接枝到第二聚合物水凝胶12B。另选地，在这些示例中，引物组14B可以不预接枝到第二聚合物水凝胶12B。相反，引物组14B可以在施加第二聚合物水凝胶12B之后接枝(例如，在图8C中)，只要满足以下条件：i)第二聚合物水凝胶12B具有用于附接引物组14B的(与第一聚合物水凝胶12A相比)不同的官能团，或者ii)第一聚合物水凝胶12A的未反应官能团已淬灭，例如，使用Staudinger反应还原为胺或者与被动分子(诸如己炔酸)进行加成点击反应来淬灭。

当在该方法期间进行接枝时，可以使用任何合适的接枝技术来实现接枝。作为示例，接枝可以通过以下方式来实现：流通式沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配，或通过另一种合适的方法。这些示例性技术中的每种示例性技术可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包含引物组14A或14B、水、缓冲液和催化剂。利用接枝方法中的任一种接枝方法，引物组14A或14B附接到聚合物水凝胶12A或12B的反应性基团连接，并且对其他层不具有亲和力。

图3A和图4A中所示的图案化结构23A、23C的架构也可以通过图9A至图9D中所示的方法制备。在该示例性方法中，图案化结构23A、23C包括单层基座载体42。该方法通常包括在基底22中限定的每个凹入部30的侧壁32上沉积掩模材料64；在基底22上沉积第一聚合物水凝胶12A，由此第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到基底22的在多个凹入部30中的每一个处和在分离多个凹入部30的区域62'处暴露的部分60；在基底22上沉积光致抗蚀剂66；蚀刻以从区62’中去除光致抗蚀剂66的第一部分和第一聚合物水凝胶12A的第一部分，由此光致抗蚀剂66的第二部分66’和第一聚合物水凝胶12A的第二部分保留在多个凹入部30的每个凹入部中；用附接第二聚合物水凝胶12B的表面基团活化区62’；沉积第二聚合物水凝胶12B以使得其选择性地附接到区62’；去除掩模材料64和光致抗蚀剂66的第二部分；将第一引物组14A接枝到第一聚合物水凝胶12A；以及将第二引物组14B接枝到第二聚合物水凝胶12B上，第二引物组14B不同于第一引物组114A。

虽然第一聚合物水凝胶12A和引物组14A在图3A和图4A中显示在突出部28上，但它们在图9D中显示在凹入部30中。类似地，虽然第二聚合物水凝胶12B和引物组14B在图3A和图4A中显示在凹入部30中，但它们在图9D中显示在突出部28上。应当理解，可以执行图9A至图9D所示的方法，使得反应区域10A形成在凹入部30中并且反应区域10B形成在突出部28上，或者使得反应区域10B形成在凹入部30中并且反应区域10A形成在突出部28上。

在图9A所示的示例中，将凹入部30限定在单层基座载体42中。在该示例中，可使用多层基底。如果使用多层基底，则将在最外(顶)层中形成凹入部30，使得将不暴露任何下面的层。因此，无论使用单层基座载体42还是多层基底，凹入部30中的暴露部分60和区域62'具有相同的表面基团。

凹入部30可使用任何合适的技术在单层基座载体42中形成，诸如光刻法、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、激光辅助直接压印(LADI)压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。所使用的技术部分地取决于所使用的材料的类型。作为示例，凹入部30可以被微蚀刻到玻璃单层基底中或者被纳米压印到纳米压印光刻树脂中。当使用多层基底时，可使用任何合适的技术(诸如纳米压印光刻(NIL)或光刻等)在最外(顶)层中形成凹入部30。所使用的技术将部分地取决于所使用的材料的类型，并且将被执行使得任何下面的层不在凹入部30的底部处暴露。

凹入部30和突出部28的布置可以如图3A中所示。因此，在一个示例中，单层基座载体42被图案化以包括沿着单层基座载体42延伸的多条第一线(类似于区24、24’、24”)，第一线中的每条线包括由单层基座载体42的非图案化区(在图9A中示为突出部28)分开的多个凹入部30中的一些凹入部；以及将多条第一线中的一条第一线与多条第一线中的相邻一条第一线分开的第二线(类似于区26、26’)，该第二线包括单层基座载体42的连续非图案化区，该连续非图案化区延伸多条第一线中的每条第一线的长度。凹入部30和突出部28的布置可以另选地如图4A所示。因此，在一个示例中，单层基座载体42被图案化以包括单层基座载体42的交替的凹入部30和非图案化区(在图9A中示为突出部28)的行(类似于行34、34’、34”)和列(类似于列36、36’、36”)。

该示例性方法继续在每个凹入部30的侧壁32上施加掩模材料64。这在图9B中描绘。用于掩模材料64的合适材料的示例包括半金属诸如硅，或金属诸如铝、铜、钛、金、银等，或者负性或正性光致抗蚀剂。在一些示例中，半金属或金属可至少基本上是纯的(<99％纯)。在其他示例中，可使用所列元件的分子或化合物，因为它们在特定方法中提供期望的蚀刻停止层或其他功能。例如，任何列出的半金属的氧化物(例如，二氧化硅)或金属的氧化物(例如，氧化铝)可以单独使用或与列出的半金属或金属组合使用。

可使用与剥离技术或蚀刻技术组合的光刻过程将掩模材料64施加到侧壁32。在其他示例中，选择性沉积技术(诸如化学气相沉积(CVD))及其变型(例如，低压CVD或LPCVD)、原子层沉积(ALD)和成角度沉积可用于将掩模材料64沉积在期望区域中。另选地，可跨基底22施加掩模材料64，并且然后从部分60和区62选择性地移除(例如，经由掩蔽及蚀刻)以在侧壁32上限定图案。

然后可经由等离子体灰化活化单层基座载体42。等离子体灰化引入表面基团，用于将聚合物水凝胶12A或12B附接到单层基座载体42的暴露部分60和区62'。

如图9B所示，使用任何合适的沉积技术将第一聚合物水凝胶12A沉积在单层基座载体42上。在该示例中，第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到单层基座载体42的暴露部分60和区62'，而不附接到掩模材料64。

还如图9B所示，将光致抗蚀剂66施加到掩模64和第一聚合物水凝胶12A上的单层基座载体42上。在该示例中，整个光致抗蚀剂66可被显影以形成不溶性部分，使得该光致抗蚀剂可暴露于蚀刻过程。

在一个示例中，光致抗蚀剂66是负性光致抗蚀剂(暴露区域不溶于显影剂)。合适的负性光刻胶的示例包括系列光刻胶(购自Futurrex)。其它合适的负性光刻胶包括SU-8系列和/>系列(两者均购自Kayaku Advanced Materials,Inc.)，或UVN^TM系列(购自DuPont)。当使用负性光致抗蚀剂时，将其选择性地暴露于特定波长的光以使其不溶。在这些示例中，不使用显影剂溶液，因为没有可溶部分。在另一个示例中，光致抗蚀剂66是正性光致抗蚀剂(暴露区域在显影剂中变得可溶)。合适的正性光致抗蚀剂的示例包括S1800系列或/>1500系列，两者均得自Kayaku Advanced Materials,Inc.。合适的正性光致抗蚀剂的另一个示例为SPR^TM-220(来自杜邦公司)。当使用正性光致抗蚀剂时，它不暴露于某些波长的光以形成可溶区域，因为期望整个光致抗蚀剂66是不溶的。

然后可使用定时干蚀刻工艺从单层基座载体42的区62'去除光致抗蚀剂66和第一聚合物水凝胶12A的部分。如图9C所示，停止定时干蚀刻，使得聚合物水凝胶12A的一部分和光致抗蚀剂66的一部分66'保留在凹入部30中。在一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用CF₄)，其中以约17nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂66。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括100％ O₂等离子体蚀刻，其中以约98nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂66。

如所提及的，在蚀刻光致抗蚀剂66期间，也可移除区62'上的聚合物水凝胶12A。可发生燃烧反应，其中聚合物水凝胶12A被转化为二氧化碳和水，并且从蚀刻室中排出。

然后可用附接第二聚合物水凝胶12B的表面基团活化单层基座载体42的区62'。用于活化单层基座载体42的过程可取决于希望第二聚合物水凝胶12B附接的位置。

在图3A所示的示例中，非反应区26、26'不具有施加到其上的聚合物水凝胶12A、12B。因此，不希望活化单层基座载体42的形成非反应区26、26'的连续非图案化区。单层基座载体42的最终形成非反应区26、26'的连续非图案化区(称为第二线)可在单层基座载体42的活化期间被掩蔽(例如，用掩模材料64)，使得这些线不能附接到第二聚合物水凝胶12B。因此，掩模材料64也沉积在第二线上，使得第二线在活化期间被覆盖。在图3A中，在突出部28上形成沿着单层基座载体42的(第一)线与凹入部28交替的活性区域，并且此期望活化突出部28。可通过等离子体灰化或硅烷化活化突出部28。在活化后，突出部28含有附接到聚合物水凝胶(如图3A中所示的12A或如图9C中所示的12B)的表面基团。相比之下，形成非反应区26、26'的单层基座载体42的连续非图案化区涂覆有掩模材料64。

在图4A所示的示例中，在活性区域(例如，10A)形成在突出部28上之前，凹入部30被单层基座载体42的非图案化区包围。在该示例中，活化单层基座载体42涉及选择性硅烷化(单层基座载体42的)非图案化区62’以产生单层基座载体42的交替凹入部30(其中具有聚合物水凝胶12A(图9C)或12B(图4A))和活化区域62的行和列，其中凹入部30和活化区域62’是圆形的并且具有相同直径。该活化过程形成用于将在突出部28上形成的活性区域的图案。

然后可将另一种聚合物水凝胶施加到例如活化的突出部28(区62')上。在图9C中，另一种聚合物水凝胶是第二聚合物水凝胶12B。在一个示例中，第二聚合物水凝胶12B附接到突出部28上的活化部分62'，并且还施加在掩模材料64和光致抗蚀剂66的部分66'上。第二聚合物水凝胶12B可以使用任何合适的沉积技术来施加。

然后可以执行光致抗蚀剂部分66'和掩模材料64的移除。

光致抗蚀剂部分66’可以用正性或负性光刻胶去除剂剥离，其中正性或负性光刻胶去除剂诸如：使用超声处理的二甲基亚砜(DMSO)；或丙酮；或基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂。正性光致抗蚀剂部分66'也可以用丙二醇单甲醚乙酸酯去除。该剥离过程去除i)至少99％的不溶性光致抗蚀剂部分66’，和ii)其上的第二聚合物水凝胶12B。该剥离过程使凹入部30中的聚合物水凝胶12A暴露。

也可以将掩模材料64暴露于剥离过程。可以使用任何合适的湿法剥离过程，诸如浸泡、超声处理或旋转和分配剥离液。该剥离过程移除i)掩模材料64和ii)其上的第二聚合物水凝胶12B。当该方法用于形成图3A中所示的示例时，掩模材料64移除暴露非反应区26、26'。

该方法还包括将相应的引物组14A、14B附接到聚合物水凝胶12A、12B上。在一些示例中，引物组14A、14B可预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。

在其他示例中，引物组14A、14B不预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B。在这些示例中，引物组14A可在施加聚合物水凝胶12A之后接枝(例如，在图9B中)。在这些示例中，引物组14B可以预接枝到第二聚合物水凝胶12B。另选地，在这些示例中，引物组14B可以不预接枝到第二聚合物水凝胶12B。相反，引物组14B可在施加第二聚合物水凝胶12B之后(例如，在图9C中)并且在执行剥离过程之前接枝。当在该方法期间进行接枝时，可以使用任何合适的接枝技术来实现接枝。

图3C和图4C中所示的图案化结构23B、23D的架构可以通过图10A至图10C中所示的方法制备。该方法通常包括在多层叠堆上沉积第一聚合物水凝胶12A，该多层叠堆包括基底22和在基底22上图案化以限定交替的第一区域68和第二区域70的掩模材料64，第一区域68暴露基底22的包括附接到第一聚合物水凝胶12A的表面基团的部分，并且第二区域70被掩模材料64覆盖，由此第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到基底22的在第一区域68处暴露的部分；剥离掩模材料64以暴露第二区域70；用附接第二聚合物水凝胶12B的表面基团活化第二区域70；沉积第二聚合物水凝胶12B，使得其选择性地附接到第二区域70；将第一引物组14A接枝到第一聚合物水凝胶12A；以及将第二引物组14B接枝到第二聚合物水凝胶12B上，第二引物组14B不同于第一引物组14A。

在该示例性方法中，将掩模材料64施加到基底22(其可为单层基座载体42或包括基座载体42和其上的层44两者的多层结构)。

掩模材料64的布置取决于用于待形成的活性区域10A、10B的期望架构。

为了产生图3C所示的图案化结构，沿着沿基底22延伸的多条第一线(对应于图3C中的区24、24’、24”)限定第一区域68和第二区域70；并且该方法还包括沿着将多条第一线中的一条第一线与多条第一线中的相邻的一条第一线分开的第二线(对应于图3C中的区26、26')施加第二掩模材料(未示出)，该第二线限定基底22的连续非图案化区，该连续非图案化区延伸多条第一线中的每条第一线的长度。因此，掩模材料64沿着多条第一线沉积在区域70上而不是区域68上，并且第二掩模材料沿着第二线沉积。

在该示例中，掩模材料64和第二掩模材料为可在不同条件下剥离的不同材料。因此，掩模材料64的移除将不会移除第二掩模材料。因此，第二掩模材料在第二区域70的活化期间保持在适当位置，并且可以在单独的剥离过程中剥离。

在该示例中，在掩模材料64覆盖部分70并且第二掩模材料覆盖线(对应于图3C中的区26、26')的情况下，可经由等离子体灰化活化基底22的暴露部分68(其为图10A中的层44)以引入可附接到第一聚合物水凝胶12A的表面基团。使用任何合适的沉积技术将第一聚合物水凝胶12A沉积在活化的暴露部分68上。在该示例中，第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到活性暴露部分68，并且还沉积在掩模材料64和第二掩模材料上。

为了产生图4C所示的图案化结构，形成第一区域68和第二区域70，使得它们以行(对应于图4C中的行34、34’、34”)和列(对应于图4C中的列36、36’、36”)延伸跨过基底22。因此，掩模材料64以圆形图案沉积在区域70上，而不是沉积在区域68上。为了形成区域68的圆形图案，这些区域68可以被活化。该活化过程被选择性地执行，使得基底22的外周边(例如，图4C中的区26)以及四个第一区域68和第二区域70的相交处的区不被活化。第一区域68的活化涉及选择性地灰化第一区域68，使得活化的第一区域68为圆形且具有与第二区域70(由掩模材料64覆盖)相同的直径。选择性等离子体灰化将表面基团引入到可附接到第一聚合物水凝胶12A的区域68。在该示例中，基底22的外周边(例如，图4C中的区26)和四个第一区域68和第二区域70的相交处的区未被活化，并且因此不能附接到第一聚合物水凝胶12A。使用任何合适的沉积技术将第一聚合物水凝胶12A沉积在活化的暴露部分68上。在该示例中，第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到活性暴露部分68，并且还沉积在掩模材料64上。

沉积的聚合物水凝胶12A示于图10B中。

在该示例性方法中，掩模材料64被剥离以暴露第二区域70。当沿着第二线(对应于图3C中的区26、26')使用第二掩模材料时，第二掩模材料在剥离掩模材料64期间保持在适当位置。硅的合适的剥离条件的示例包括碱性(pH)条件，对于铝包括酸性或碱性条件，对于金包括碘和碘化物混合物，对于银包括碘和碘化物混合物，对于钛包括H₂O₂，或对于铜包括碘和碘化物混合物。掩模材料64的移除还移除定位在其上的第一聚合物水凝胶12A。

暴露的第二区域70然后可以被活化。当第二掩模材料仍然在第二线(对应于图3C中的区26、26')上处于适当位置时，可使用等离子体灰化或硅烷化来活化第二区域70。当移除掩模材料64并且因此暴露第二区域70、基底22的外周边(例如，图4C中的区26)以及四个第一区域68与第二区域70的相交处的区时，可使用选择性等离子体灰化或选择性硅烷化来活化第二区域70而不活化基底22的外周边(例如，图4C中的区26)以及四个第一区域68与第二区域70的相交处的区。

然后可将另一种聚合物水凝胶施加到例如活化区域70上。在图10C中，另一种聚合物水凝胶是第二聚合物水凝胶12B。第二聚合物水凝胶12B选择性地附接到活化部分70。第二聚合物水凝胶12B可以使用任何合适的沉积技术来施加，并且当在高离子强度下(例如，在10x PBS、NaCl、KCl等存在下)进行该沉积时，第二聚合物水凝胶12B不会沉积在附接在区68处的第一聚合物水凝胶12A上，也不会附着到该第一聚合物水凝胶。

当使用第二掩模材料时(例如，为了形成图3C所示的架构)，第二聚合物水凝胶12B也可施加在第二掩模材料上。然而，可使用用于材料的任何合适的湿式剥离过程来移除第二掩模材料，并且这将移除掩模材料和第二聚合物水凝胶12B两者。

当该方法用于形成图4C中的架构时，第二聚合物水凝胶12B可沉积在基底22的外周边上(例如，图4C中的区26)，并且沉积在四个第一区域68(聚合物水凝胶12A附接到其上)和第二区域70(聚合物水凝胶12B附接到其上)的相交处的区上。因为这些基底区没有被活化，所以聚合物水凝胶12B没有共价附接，并且可以通过超声处理、洗涤、擦拭等容易地移除。

该方法还包括将相应的引物组14A、14B附接到聚合物水凝胶12A、12B上。在一些示例中，引物组14A、14B可预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。

在其他示例中，引物组14A、14B不预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B。在这些示例中，引物组14A可在施加聚合物水凝胶12A之后接枝(例如，在图10B中)。在这些示例中，引物组14B可以预接枝到第二聚合物水凝胶12B。另选地，在这些示例中，引物组14B可以不预接枝到第二聚合物水凝胶12B。相反，引物组14B可在施加第二聚合物水凝胶12B之后(例如，在图10C中)接枝。当在该方法期间进行接枝时，可以使用任何合适的接枝技术来实现接枝。

图5所示的图案化结构23E的架构可通过参考图10A至图10C所示和所述的方法制备，不同之处在于基底22包括交替的第一高度的区(例如，图5所示的38、38’、38”)和第二高度的区(例如，图5所示的40、40')；并且交替的第一区域68和第二区域70(图10A)延伸跨过第一高度的区(例如，图5所示的38、38’、38”)和第二高度的区(例如，图5所示的40、40')中的每一者。在一个示例中，如果使用第二掩模材料，那么其可施加于基底22的周边处(因为不存在其他非反应区26、26')。在另一个示例中，如果不使用第二掩模材料，则可使用选择性等离子体灰化或选择性硅烷化来活化第二区域70而不活化基底22的外周边。

图6中所示的图案化结构23F的架构可以通过图11A至图11D中所示的方法制备。该方法通常包括在多层叠堆上沉积第一聚合物水凝胶12A，该多层叠堆包括基底22和第一掩模材料64以及在基底22上图案化的不同的第二掩模材料64以限定多个第一区域68，每个第一区域68暴露基底22的一部分并且与每个其他第一区域68隔离；多个第二区域70，每个第二区域70被第一掩模材料64覆盖并且与每个其他第二区域70隔离；以及多个第三区域72，每个第三区域72被不同的第二掩模材料64’覆盖并且与每个其他第三区域72隔离，由此第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到基底22的在多个第一区域68中的每个第一区域处暴露的部分；剥离第一掩模材料64以暴露多个第二区域70；用附接第二聚合物水凝胶12B的表面基团活化多个第二区域70；沉积第二聚合物水凝胶12B，使得其选择性地附接到多个第二区域70；剥离不同的第二掩模材料64'以暴露多个第三区域72；用附接第三聚合物水凝胶12C的表面基团活化多个第三区域72；沉积第三聚合物水凝胶12C，使得其选择性地附接到多个第三区域72；将第一引物组14A接枝到第一聚合物水凝胶12A；将第二引物组14B接枝到第二聚合物水凝胶12B，第二引物组12B不同于第一引物组12A；以及将第三引物组14C接枝到第三聚合物水凝胶12C，第三引物组14C不同于第一引物组14A和第二引物组14B。

在该示例性方法中，将掩模材料64、64’施加到基底22(其可为单层基座载体42或包括基座载体42和其上的层44两者的多层结构)。

掩模材料64、64’的布置取决于用于待形成的活性区域10A、10B、10C的期望架构。

在该示例中，基底22的x-y平面中的掩模材料64、64’的形状可为圆形。在该示例中，掩模材料64、64’为可在不同条件下剥离的不同材料。因此，掩模材料64的移除将不会移除掩模材料64’。因此，掩模材料64’在第二区域70的活化期间保持在适当位置，并且可以在单独的剥离过程中剥离。

在该示例中，在掩模材料64覆盖部分70并且掩模材料64’覆盖部分72的情况下，可经由等离子体灰化活化基底22的暴露部分68(其为图11A中的层44)以引入可附接到第一聚合物水凝胶12A的表面基团。在该示例中，基底22的外周边(例如，图6中的区26)和三个第一区域68、70、72的相交处的区未被活化，并且因此不能附接到第一聚合物水凝胶12A。使用任何合适的沉积技术将第一聚合物水凝胶12A沉积在活化的暴露部分68上。在该示例中，第一聚合物水凝胶12A选择性地附接到活性暴露部分68，并且还沉积在掩模材料64、64’上，如图11B所示。

在该示例性方法中，掩模材料64被剥离以暴露第二区域70。硅的合适的剥离条件的示例包括碱性(pH)条件，对于铝包括酸性或碱性条件，对于金包括碘和碘化物混合物，对于银包括碘和碘化物混合物，对于钛包括H₂O₂，或对于铜包括碘和碘化物混合物。掩模材料64的移除还移除定位在其上的第一聚合物水凝胶12A。

暴露的第二区域70然后可以被活化，如图11C所示。选择性等离子体灰化或选择性硅烷化可用于活化第二区域70而不活化基底22的外周边(例如，图6中的区26)以及第一区域68、第二区域70和第三区域72的相交处的区。

然后可将第二聚合物水凝胶12B施加到例如活化区域70上。这在图11C中示出。第二聚合物水凝胶12B选择性地附接到活化部分70。第二聚合物水凝胶12B可以使用任何合适的沉积技术来施加，并且当在高离子强度下(例如，在10x PBS、NaCl、KCl等存在下)进行该沉积时，第二聚合物水凝胶12B不会沉积在附接在区68处的第一聚合物水凝胶12A上，也不会附着到该第一聚合物水凝胶。

第二聚合物水凝胶12B可沉积在基底22的外周边(例如，图6中的区26)上，并且沉积在第一区域68(聚合物水凝胶12A附接到其上)、第二区域70(聚合物水凝胶12B附接到其上)和第三区域72的相交处的区上。因为这些基底区没有被活化，所以聚合物水凝胶12B没有共价附接，并且可以通过超声处理、洗涤、擦拭等容易地移除。

在该示例性方法中，掩模材料64’被剥离以暴露第三区域72。可以使用任何合适的剥离条件，这取决于掩模材料64'。掩模材料64’的移除还移除定位在其上的第二合物水凝胶12B。

暴露的第三区域72然后可以被活化，如图11D所示。选择性等离子体灰化或选择性硅烷化可用于活化第三区域72而不活化基底22的外周边(例如，图6中的区26)以及第一区域68、第二区域70和第三区域72的相交处的区。

然后可将第三聚合物水凝胶12C施加到例如活化区域72上。这在图11D中示出。第三聚合物水凝胶12C选择性地附接到活化部分72。第三聚合物水凝胶12C可以使用任何合适的沉积技术来施加，并且当在高离子强度下(例如，在10x PBS、NaCl、KCl等存在下)进行该沉积时，第三聚合物水凝胶12C不会沉积在附接在区68处的第一聚合物水凝胶12A或部分72处的第二聚合物水凝胶上，也不会附着到该第一聚合物水凝胶和第二聚合物水凝胶。

第三聚合物水凝胶12C可沉积在基底22的外周边(例如，图6中的区26)上，并且沉积在第一区域68(聚合物水凝胶12A附接到其上)、第二区域70(聚合物水凝胶12B附接到其上)和第三区域72的相交处的区上。因为这些基底区没有被活化，所以聚合物水凝胶12C没有共价附接，并且可以通过超声处理、洗涤、擦拭等容易地移除。

该方法还包括将相应的引物组14A、14B、14C附接到聚合物水凝胶12A、12B、12C上。在一些示例中，引物组14A、14B、14C可预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B、12C。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。

在其他示例中，引物组14A、14B、14C不预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B、12C。在这些示例中，引物组14A可在施加聚合物水凝胶12A之后接枝(例如，在图11B中)。在这些示例中，引物组14B可预接枝到第二聚合物水凝胶12B，并且引物组14C可预接枝到第三聚合物水凝胶12C。另选地，在这些示例中，引物组14B可以不预接枝到第二聚合物水凝胶12B，并且引物组14C可以不预接枝到第三聚合物水凝胶12C。相反，引物组14B可在施用第二聚合物水凝胶12B之后接枝(例如，在图11C中)，并且引物组14C可在施用第三聚合物水凝胶12C之后接枝(例如，在图11D中)。当在该方法期间进行接枝时，可以使用任何合适的接枝技术来实现接枝。

也可以使用具有不同深度的凹入部30的多深度基底来制备图6所示的架构。活性区域10A可以形成在具有第一深度的凹入部30中，活性区域10B可以形成在具有第二深度(例如，第一深度-(减)150nm)的凹入部30中，并且活性区域10C可以形成在具有第三深度(例如，第二深度-150nm)的凹入部30中或基底表面上。在一个示例中，这些凹入部为六边形形状，并且因此活性区域10A、10B、10C也为六边形形状(参见例如描绘基底的一部分的俯视图的图13A和描绘基底的一部分的透视图的图13B)。该架构可以通过图12A至图12L所示的方法来形成。该方法使用树脂(例如，多层结构的层44、44')，其紫外光吸收率可以随厚度而变化。在这些示例中，较薄部分可以是UV透明的，而较厚部分可以是UV吸收剂。这允许树脂用作光致抗蚀剂材料的背面图案化的掩模。

在图12A至图12L的方法中，可以通过调节树脂层44'的厚度来改变该树脂层的UV吸收率。可以使用任何先前列出的树脂，只要当树脂暴露于预先确定的UV光剂量时，较厚部分吸收UV光并且较薄部分透射用于图案化的期望量的UV光。在一个示例中，当暴露于范围为约30mJ/cm²至约60mJ/cm²的剂量时，具有约500nm的较厚部分和约150nm的较薄部分的多面体低聚硅倍半氧烷基树脂将分别且有效地吸收和透射UV光。可以使用其他厚度，并且可以相应地调节UV剂量以实现在较厚区域中的期望吸收和在较薄区域中的透射。

虽然在图12A至图12L中未示出，但是树脂层44'可以由在此阐述的能够透射UV光的基座载体42的任何示例支撑。在该示例中，调整树脂层44'的厚部分和薄部分以实现期望的吸收和透射。

UV剂量、UV吸收常数和树脂层厚度之间的相关性可以表示为：

D₀＝D×exp(-kd)

其中D₀是图案化树脂层所需的UV剂量，D是必须施加到树脂层上的实际UV剂量，k是吸收常数，并且d是树脂层较薄部分的厚度。因此，实际UV剂量(D)可以表示为：

D＝D₀/exp(-kd)

在一个示例中，树脂膜44'是负性光致抗蚀剂NR9-1000P(来自Futurrex)，在0.9μm厚度处D₀＝19mJ/cm²，光致抗蚀剂的UV吸收常数(k)是3×10⁴cm^-1，光致抗蚀剂的较薄部分的厚度是150nm，并且D是约30mJ/cm²。

在图12A至图12C中，所示方法通常包括：将第一聚合物水凝胶12A沉积在树脂层44'上，该树脂层包括由空隙区74分隔的多个多深度凹入部30',每个多深度凹入部30'包括深部分76和与深部分76相邻的浅部分78(图12B)；在第一官能化层24上沉积并固化光致抗蚀剂66；以及定时干蚀刻以从浅部分78和空隙区74移除光致抗蚀剂66和第一聚合物水凝胶12A(图12C)。

图3A所示的多深度凹入部30’可以使用任何合适的技术蚀刻、压印或限定在树脂层44’中。在一个示例中，使用纳米压印光刻。在该示例中，当材料是软的时，将工作印模压入树脂层44’中，这在树脂层44’中产生具有工作印模特征的印记(负复制品)。然后可以在工作印模留在原位的情况下将树脂层44’固化。在使用可辐射固化的树脂材料时，可以通过暴露于光化辐射(诸如可见光辐射或紫外线(UV)辐射)来实现固化；或者在使用可热固化的树脂材料时，可以通过暴露于热量来实现固化。固化可促进聚合和/或交联。作为一个示例，固化可以包括多个阶段，包括软烘烤(例如，以驱除可以用于沉积树脂的任何液体载体)和硬烘烤。软烘烤可以在范围为约50℃至约150℃的较低温度下进行，持续大于0秒至约3分钟。硬烘烤的持续时间可在约100℃至约300℃的温度范围内持续约5秒至约10分钟。可用于软烘烤和/或硬烘烤的装置的示例包括热板、烘箱等。

固化后，释放工作印模。这在树脂层44’中产生了形貌特征。在该示例中，多深度凹入部30'的形貌特征包括浅部分78和深部分76。

虽然在图12A中示出了两个多深度凹入部30'，但应当理解，该方法可以被执行以产生多深度凹入部30'的阵列，该阵列包括跨过树脂层44'的表面由空隙区74分开的相应的深部分76和浅部分78。

如图12B所示，第一聚合物层12A沉积在树脂层44'上。第一聚合物层12A可以是本文所述的任何凝胶材料，并且可以使用任何合适的沉积技术来施加。可在沉积之后执行固化过程。第一聚合物层12A与树脂层44'共价附接。共价连接有助于在流通池20的整个寿命中在各种用途期间将引物组14A维持在期望的区域中。

为了实现图12C中的结构，在第一聚合物水凝胶12A上施加正性或负性光致抗蚀剂66。在该示例中，整个光致抗蚀剂66可被显影以形成不溶性部分，使得该光致抗蚀剂可暴露于定时干蚀刻。定时干蚀刻工艺用于从空隙区74和从多深度凹入部30'的浅部分78移除光致抗蚀剂66和第一聚合物水凝胶12A的部分。如图12C所示，停止定时干蚀刻，使得聚合物水凝胶12A的一部分和光致抗蚀剂66的一部分66'保留在凹入部30'的深部分76中。在一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用CF₄)，其中以约17nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂66。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括100％ O₂等离子体蚀刻，其中以约98nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂66。

如所提及的，在蚀刻光致抗蚀剂66期间，还可以移除空隙区74上和浅部分78中的聚合物水凝胶12A。可发生燃烧反应，其中聚合物水凝胶12A被转化为二氧化碳和水，并且从蚀刻室中排出。

然后可以剥离光致抗蚀剂66的部分66'。光致抗蚀剂部分66’可以用正性或负性光刻胶去除剂剥离，其中正性或负性光刻胶去除剂诸如：使用超声处理的二甲基亚砜(DMSO)；或丙酮；或基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂。正性光致抗蚀剂部分66'也可以用丙二醇单甲醚乙酸酯去除。该剥离过程移除i)至少99％的不溶性光致抗蚀剂部分66'，在多深度凹入部30'的深部分76中留下聚合物水凝胶12A(如图12D所示)。

然后将负性光致抗蚀剂80施加在树脂层44'上，包括在空隙区74上、在浅部分78中以及在第一聚合物水凝胶12A上、在深部分76中。然后将紫外光引导通过树脂层44'的背面以图案化负性光致抗蚀剂80并产生不溶性光致抗蚀剂80'和可溶性光致抗蚀剂80'。虽然未示出，但是所使用的任何基座载体都能够透射用于背面曝光的UV光。

树脂层44'的第一厚度t₁被选择为允许UV光的剂量透射穿过树脂层44'，并且第二厚度t₂和第三厚度t₃被选择为阻挡UV光的剂量透射穿过树脂层44'。因此，负性光致抗蚀剂80的覆盖厚度t₁的部分由于暴露于UV光而变得不可溶(80'),并且负性光致抗蚀剂80的覆盖厚度t₂、t₃的部分由于没有暴露于UV光而变得可溶(80”)。换句话说，当暴露于紫外光剂量时，不溶性负性光致抗蚀剂80'在深部分76中形成，而可溶性负性光致抗蚀剂80'在浅部分78中和空隙区74上形成。

然后使用本文所述的用于负性光致抗蚀剂的任何合适的显影剂移除可溶性负性光致抗蚀剂80”。可溶性负性光致抗蚀剂80”的移除暴露了浅部分78和空隙区74处的树脂层44’。这在图12F中示出。

如图12F所示，第二聚合物层12B沉积在树脂层44'上。第二聚合物层12B可以是本文所述的任何凝胶材料，并且可以使用任何合适的沉积技术来施加。可在沉积之后执行固化过程。第二聚合物层12B与树脂层44'共价附接。

图12G描绘了不溶性负性光致抗蚀剂80'的去除。不溶性负性光致抗蚀剂80'可经由剥离过程去除。剥离过程可以是本文所述的任何合适的剥离过程，并且可以涉及用于所使用的负性光致抗蚀剂80的类型的合适的去除剂。如图12G所示，去除过程去除i)至少99％的不溶性光致抗蚀剂80'和ii)施加到其上的第二聚合物水凝胶12B。该去除过程使定位在浅层部分78中和空隙区74上的第二聚合物水凝胶12B保持完整，并且还使第一聚合物水凝胶12A保持完整。聚合物水凝胶12A、12B的这些部分保持完整，部分是因为它们共价附接到树脂层44'。

为了实现图12H中的结构，将另一正性或负性光致抗蚀剂66施加到树脂层44'上，包括第一聚合物水凝胶12A和第二聚合物水凝胶12B上。在该示例中，整个光致抗蚀剂66可被显影以形成不溶性部分，使得该光致抗蚀剂可暴露于定时干蚀刻。定时干蚀刻工艺用于从空隙区74移除光致抗蚀剂66和第二聚合物水凝胶12B的部分。如图12H中所示，停止定时干蚀刻，使得聚合物水凝胶12B的一部分保留在浅部分78中，聚合物水凝胶12A的部分保留在深部分76中，并且光致抗蚀剂66的一部分66'保留在聚合物水凝胶12A、12B两者上。在一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用CF₄)，其中以约17nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂66。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括100％ O₂等离子体蚀刻，其中以约98nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂66。

如所提及的，在蚀刻光致抗蚀剂66期间，也可移除空隙区74上的第二聚合物水凝胶12B。可发生燃烧反应，其中聚合物水凝胶12B被转化为二氧化碳和水，并且从蚀刻室中排出。

然后可以剥离光致抗蚀剂66的部分66'。光致抗蚀剂部分66’可以用正性或负性光刻胶去除剂剥离，其中正性或负性光刻胶去除剂诸如：使用超声处理的二甲基亚砜(DMSO)；或丙酮；或基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂。正性光致抗蚀剂部分66'也可以用丙二醇单甲醚乙酸酯去除。该剥离过程移除i)至少99％的不溶性光致抗蚀剂部分66'，留下多深度凹入部30'的深部分76中的聚合物水凝胶12A和浅部分78中的聚合物水凝胶12B(如图12H所示)。

然后在树脂层44'上施加另一负性光致抗蚀剂80，包括在空隙区74上、在浅部分78中的第二聚合物水凝胶12B上和在深部分76中的第一聚合物水凝胶12A上。这在图12J中示出。然后将紫外光引导通过树脂层44'的背面以图案化负性光致抗蚀剂80并产生不溶性光致抗蚀剂80'和可溶性光致抗蚀剂80'。

应当理解，在该过程期间使用的UV光剂量比在参考图12E描述的过程期间用于图案化负性光致抗蚀剂80的UV光剂量更强。因此，在图12J中，树脂层44'的第一厚度t₁和第二厚度t₂均允许较高剂量的UV光透射穿过树脂层44'并且第三厚度t₃阻挡较高剂量的UV光透射穿过树脂层44'。因此，覆盖厚度t₁、t₂的负性光致抗蚀剂80的部分由于暴露于UV光而变得不可溶(80'),并且覆盖厚度t₃的负性光致抗蚀剂80的部分由于没有暴露于UV光而变得可溶(80”)。换句话说，当暴露于较高紫外光剂量时，在深部分76中和在浅部分78中形成不溶性负性光致抗蚀剂80’，并且在空隙区74上形成可溶性负性光致抗蚀剂80”(参见图12J)。

然后使用本文所述的用于负性光致抗蚀剂的任何合适的显影剂移除可溶性负性光致抗蚀剂80”。可溶性负性光致抗蚀剂80”的移除暴露了空隙区74处的树脂层44’。这在图12K中示出。

如图12K所示，第三聚合物层12C沉积在树脂层44'上。第三聚合物层12C可以是本文所述的任何凝胶材料，并且可以使用任何合适的沉积技术来施加。可在沉积之后执行固化过程。第三聚合物层12C共价附接到树脂层44'(例如，在空隙区74处)。

图12L描绘了不溶性负性光致抗蚀剂80'的去除。不溶性负性光致抗蚀剂80'可经由剥离过程去除。剥离过程可以是本文所述的任何合适的剥离过程，并且可以涉及用于所使用的负性光致抗蚀剂80的类型的合适的去除剂。如图12L所示，去除过程去除i)至少99％的不溶性光致抗蚀剂80'和ii)施加到其上的第三聚合物水凝胶12C。该移除过程使定位在浅部分78中的第二聚合物水凝胶12B保持完整，并且还使定位在深部分76中的第一聚合物水凝胶12A保持完整。

该方法还包括将相应的引物组14A、14B、14C附接到聚合物水凝胶12A、12B、12C上。在一些示例中，引物组14A、14B、14C可预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B、12C。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。

在其他示例中，引物组14A、14B、14C不预接枝到相应的聚合物水凝胶12A、12B、12C。在这些示例中，引物组14A可在施加聚合物水凝胶12A之后接枝(例如，在图12B中)。在这些示例中，引物组14B可预接枝到第二聚合物水凝胶12B，并且引物组14C可预接枝到第三聚合物水凝胶12C。另选地，在这些示例中，引物组14B可以不预接枝到第二聚合物水凝胶12B，并且引物组14C可以不预接枝到第三聚合物水凝胶12C。相反，引物组14B可在施用第二聚合物水凝胶12B之后接枝(例如，在图12F中)，并且引物组14C可在施用第三聚合物水凝胶12C之后接枝(例如，在图12K中)。当在该方法期间进行接枝时，可以使用任何合适的接枝技术来实现接枝。

图7A至图7D所示的架构可通过在基底22上的期望区域处掺入捕获引物48(例如，使用结合对，诸如链霉抗生物素蛋白和生物素，或其他合适的附接机制)，并沉积聚合物水凝胶12以使其包围捕获引物48来制备。引物组14可以是预接枝的或在聚合物水凝胶12沉积后接枝的。

使用流通池的方法

本文公开的包括附接到聚合物12A、12B、12C的引物组14A、14B，以及在一些情况下14C的流通池20的一些示例可用于顺序成对的末端读取测序方法中。被引入到流通池20中的不同文库片段能够在活性区域10A、10B、10C中的每一者处接种和扩增。由于不同的引物组14A、14B、14C，任何给定文库片段跨相应活性区域10A、10B、10C的扩增不能在相邻但不同的活性区域10B、10C、10A上继续。在该方法中，将在特定活性区域10A、10B、10C上产生的相应正向链测序并去除，然后将相应反向链测序并去除。

当流通池20包括附接到活性区域10A、10B或10A的聚合物水凝胶区12A1、12A2的引物子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D(代替引物组14A、14B、4C中的一者)时，该子组可用于同时配对末端读取测序方法中。如本文所述，控制引物子组13A、15A或13B、15B或13C、15C或13D、15D，使得裂解(直链化)化学在不同的聚合物水凝胶区12A1、12A2上是正交的。这使得能够在活性区域10A的一个区12A1中生成正向链的簇，并且在活性区域10A的另一个区12A2中生成反向链的簇。在示例中，区12A1、12A2彼此直接相邻，并且与正交的活性区域10B、10C相邻。这使得能够在活性区域10A上获得同时的配对末端读取。

附加说明

还应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。此外，应当理解，本文所公开的示例中的任一个示例的任何特征可以任何期望的方式和/或配置组合在一起。

还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。

应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约0.35μm(350nm)到至少1.8μm(1800nm)的范围应被解释为不仅包括明确列举的约0.35μm(350nm)到至少1.8μm(1800nm)的限值，而且包括单个值，诸如约0.708μm(708nm)、约0.9μm(900nm)等，以及子范围，诸如约0.425μm(425nm)至约0.825μm(825nm)、约0.550μm(550nm)至约0.940μm(940nm)等。此外，当利用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与该值的微小变化(高达+/-10％)。

虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。

Claims (44)

1.一种流通池，所述流通池包括：

基底；

沿着所述基底延伸的多个反应区；以及

将所述多个反应区中的一个反应区与所述多个反应区中的相邻一个反应区分离的非反应区；

其中：

所述多个反应区中的每个反应区包括沿着所述反应区定位的交替的第一区域和第二区域；

所述第一区域中的每个第一区域包括第一引物组，并且所述第二区域中的每个第二区域包括不同于所述第一引物组的第二引物组；并且

i)相邻第一区域和第二区域彼此直接邻接或者ii)所述第一区域定位在突出部上并且所述第二区域定位在与所述突出部相邻的凹入部中。

2.根据权利要求1所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括P5和P7引物；并且

所述第二引物组包括PA、PB、PC和/或PD引物的任何组合。

3.根据权利要求1所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括未封端的P5和P7引物；并且

所述第二引物组包括3’封端的P5和P7引物。

4.根据权利要求1所述的流通池，其中所述非反应区是所述基底的暴露部分。

5.根据权利要求1所述的流通池，其中所述第一区域和所述第二区域中的每一者包括聚合物水凝胶，相应的第一引物组和第二引物组附接到所述聚合物水凝胶。

6.根据权利要求1所述的流通池，其中：

所述第一区域包括所述第一引物组附接到其的第一聚合物水凝胶；

所述第二区域包括所述第二引物组附接到其的第二聚合物水凝胶；并且

所述第一聚合物水凝胶和所述第二聚合物水凝胶包括分别附接所述第一引物组和所述第二引物组的正交官能团。

7.根据权利要求1所述的流通池，其中：

所述第一区域定位在所述突出部上，并且所述第二区域定位在与所述突出部相邻的所述凹入部中；并且

所述凹入部中的每个凹入部的侧壁限定相应的空隙区。

8.一种流通池，所述流通池包括：

基底；以及

交替的第一区域和第二区域的行和列；

其中：

所述第一区域中的每个第一区域包括第一引物组，并且所述第二区域中的每个第二区域包括不同于所述第一引物组的第二引物组；以及

i)相邻第一区域和第二区域彼此直接邻接或者ii)所述第一区域定位在突出部上并且所述第二区域定位在与所述突出部相邻的凹入部中。

9.根据权利要求8所述的流通池，其中所述第一区域和所述第二区域中的每一者的形状是圆形或菱形。

10.根据权利要求8所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括P5和P7引物；并且

所述第二引物组包括PA、PB、PC和/或PD引物的任何组合。

11.根据权利要求8所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括未封端的P5和P7引物；并且

所述第二引物组包括3’封端的P5和P7引物。

12.根据权利要求8所述的流通池，其中所述第一区域和所述第二区域中的每一者包括聚合物水凝胶，相应的第一引物组和第二引物组附接到所述聚合物水凝胶。

13.根据权利要求8所述的流通池，其中：

所述第一区域包括所述第一引物组附接到其的第一聚合物水凝胶；

所述第二区域包括所述第二引物组附接到其的第二聚合物水凝胶；并且

所述第一聚合物水凝胶和所述第二聚合物水凝胶包括分别附接所述第一引物组和所述第二引物组的正交官能团。

14.一种流通池，所述流通池包括：

具有交替的第一高度的区和第二高度的区的基底；以及

沿着所述第一高度的所述区延伸并且沿着所述第二高度的所述区延伸的交替的第一区域和第二区域；

其中所述第一区域中的每个第一区域包括第一引物组，并且所述第二区域中的每个第二区域包括不同于所述第一引物组的第二引物组。

15.根据权利要求14所述的流通池，其中所述第一高度和所述第二高度之间的差为至少150nm。

16.根据权利要求14所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括P5和P7引物；并且

所述第二引物组包括PA、PB、PC和/或PD引物的任何组合。

17.根据权利要求14所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括未封端的P5和P7引物；并且

所述第二引物组包括3’封端的P5和P7引物。

18.根据权利要求14所述的流通池，还包括位于所述基底的周边的至少一部分处的非反应区，其中所述非反应区是所述基底的暴露部分。

19.根据权利要求14所述的流通池，其中所述第一区域和所述第二区域中的每一者包括聚合物水凝胶，相应的第一引物组和第二引物组附接到所述聚合物水凝胶。

20.根据权利要求14所述的流通池，其中：

所述第一区域包括所述第一引物组附接到其的第一聚合物水凝胶；

所述第二区域包括所述第二引物组附接到其的第二聚合物水凝胶；并且

所述第一聚合物水凝胶和所述第二聚合物水凝胶包括分别附接所述第一引物组和所述第二引物组的正交官能团。

21.一种流通池，所述流通池包括：

基底；

多个第一区域，每个第一区域包括第一引物组并且与每个其他第一区域隔离；

多个第二区域，每个第二区域包括第二引物组，并且通过至少一个相邻的第一区域和至少一个相邻的第三区域与每个其他第二区域隔离；以及

多个所述第三区域，每个第三区域包括第三引物组，并且通过至少一个相邻的第一区域和至少一个相邻的第二区域与每个其他第三区域隔离。

22.根据权利要求21所述的流通池，其中所述第一区域、所述第二区域和所述第三区域中的每一者的形状为圆形或六边形。

23.根据权利要求21所述的流通池，其中：

所述第一引物组包括P5和P7引物；

所述第二引物组包括PA、PB、PC和/或PD引物的任何组合；并且

所述第三引物组包括不同于所述第二引物组的PA、PB、PC和/或PD引物的任何组合。

24.根据权利要求21所述的流通池，其中所述第一区域、所述第二区域和所述第三区域中的每一者包括聚合物水凝胶，相应的第一引物组和第二引物组附接到所述聚合物水凝胶。

25.根据权利要求21所述的流通池，其中：

所述第一区域包括所述第一引物组附接到其的第一聚合物水凝胶；

所述第二区域包括所述第二引物组附接到其的第二聚合物水凝胶；

所述第三区域包括所述第三引物组附接到其的第三聚合物水凝胶；并且

所述第一聚合物水凝胶、所述第二聚合物水凝胶和所述第三聚合物水凝胶包括分别附接所述第一引物组、所述第二引物组和所述第三引物组的正交官能团。

26.一种流通池，所述流通池包括：

基底；

多个正交捕获引物，所述多个正交捕获引物以行和偏移列布置在整个所述基底上；

连续聚合物水凝胶，所述连续聚合物水凝胶定位在所述基底上并包围所述多个捕获引物中的每个捕获引物；

引物组，所述引物组附接到所述连续聚合物水凝胶。

27.根据权利要求26所述的流通池，其中：

所述基底包括以所述行和偏移列布置在整个所述基底上的突出部；并且

所述多个正交捕获引物中的一个正交捕获引物定位在所述突出部中的每个突出部上。

28.根据权利要求26所述的流通池，其中：

所述基底包括以所述行和偏移列布置在整个所述基底上的凹入部；以及

所述多个正交捕获引物中的一个正交捕获引物定位在所述凹入部中的每个凹入部中。

29.根据权利要求26所述的流通池，其中所述引物组包括P5和P7引物。

30.一种方法，所述方法包括：

在多层基底上沉积第一聚合物水凝胶，所述多层基底包括：

基座载体，所述基座载体包括附接到所述第一聚合物水凝胶的表面基团；

定位在所述基座载体上的层，所述层包括不能附接到所述第一聚合物水凝胶的材料；以及

多个凹入部，所述多个凹入部限定在所述层中以使得所述基座载体的一部分在所述多个凹入部中的每个凹入部处暴露，由此所述第一聚合物水凝胶选择性地附接到所述基座载体的暴露在所述多个凹入部中的每个凹入部处的所述部分；

用附接第二聚合物水凝胶的表面基团活化所述层；

沉积所述第二聚合物水凝胶以使得其选择性地附接到所述层；

将第一引物组接枝到所述第一聚合物水凝胶；以及

将第二引物组接枝到所述第二聚合物水凝胶，所述第二引物组不同于所述第一引物组。

31.根据权利要求30所述的方法，其中：

所述层被图案化以包括：

沿着所述层延伸的多条第一线，所述第一线中的每条第一线包括由所述层的非图案化区分开的所述多个凹入部中的一些凹入部；以及

将所述多条第一线中的一条第一线与所述多条第一线中的相邻一条第一线分开的第二线，所述第二线包括所述层的连续非图案化区，所述连续非图案化区延伸所述多条第一线中的每条第一线的长度。

32.根据权利要求31所述的方法，还包括在所述层的活化期间掩蔽所述第二线，使得所述第二线不能附接到所述第二聚合物水凝胶。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述层被图案化以包括所述层的交替的凹入部和非图案化区的行和列。

34.根据权利要求33所述的方法，其中活化所述层涉及选择性地硅烷化所述非图案化区以产生所述层的交替凹入部和活化区域的行和列，其中所述凹入部和所述活化区域是圆形的并且具有相同的直径。

35.一种方法，所述方法包括：

在基底中限定的每个凹入部的侧壁上沉积掩模材料；

在所述基底上沉积第一聚合物水凝胶，由此所述第一聚合物水凝胶选择性地附接到所述基底的暴露在所述多个凹入部中的每个凹入部处以及分离所述多个凹入部的区处的部分；

在所述基底上沉积光致抗蚀剂；

蚀刻以从所述区移除所述光致抗蚀剂的第一部分和所述第一聚合物水凝胶的第一部分，由此所述光致抗蚀剂的第二部分和所述第一聚合物水凝胶的第二部分保留在所述多个凹入部中的每个凹入部中；

用附接第二聚合物水凝胶的表面基团活化所述区；

沉积所述第二聚合物水凝胶以使得其选择性地附接到所述区；

去除所述掩模材料和所述光致抗蚀剂的所述第二部分；

将第一引物组接枝到所述第一聚合物水凝胶；以及

将第二引物组接枝到所述第二聚合物水凝胶，所述第二引物组不同于所述第一引物组。

36.根据权利要求35所述的方法，其中：

所述基底被图案化以包括：

沿着所述基底延伸的多条第一线，所述第一线中的每条第一线包括由所述区分开的所述多个凹入部中的一些凹入部；以及

将所述多条第一线中的一条第一线与所述多条第一线中的相邻一条第一线分开的第二线，所述第二线包括所述基底的连续非图案化区，所述连续非图案化区延伸所述多条第一线中的每条第一线的长度。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述掩模材料也沉积在所述第二线上，使得所述第二线在活化期间被覆盖。

38.根据权利要求35所述的方法，其中所述基底被图案化以包括交替的凹入部和区的行和列。

39.根据权利要求38所述的方法，其中活化所述区涉及选择性地灰化所述区以产生交替凹入部和活化区域的行和列，其中所述凹入部和所述活化区域是圆形的并且具有相同的直径。

40.一种方法，所述方法包括：

在多层叠堆上沉积第一聚合物水凝胶，所述多层叠堆包括：

基底；以及

掩模材料，所述掩模材料在所述基底上图案化以限定交替的第一区域和第二区域，所述第一区域暴露所述基底的包括附接到所述第一聚合物水凝胶的表面基团的部分，并且所述第二区域被所述掩模材料覆盖，

由此所述第一聚合物水凝胶选择性地附接到所述基底的在所述第一区域处暴露的所述部分；

剥离所述掩模材料以暴露所述第二区域；

用附接第二聚合物水凝胶的表面基团活化所述第二区域；

沉积所述第二聚合物水凝胶以使得其选择性地附接到所述第二区域；

将第一引物组接枝到所述第一聚合物水凝胶；以及

将第二引物组接枝到所述第二聚合物水凝胶，所述第二引物组不同于所述第一引物组。

41.根据权利要求40所述的方法，其中：

所述基底包括交替的第一高度的区和第二高度的区；并且

所述交替的第一区域和第二区域延伸跨过所述第一高度的所述区和所述第二高度的所述区中的每一者。

42.根据权利要求40所述的方法，其中：

所述第一区域和所述第二区域沿着沿所述基底延伸的多条第一线限定；

所述方法还包括沿着将所述多条第一线中的一条第一线与所述多条第一线中的相邻一条第一线分开的第二线施加第二掩模材料，所述第二线限定所述基底的连续非图案化区，所述连续非图案化区延伸所述多条第一线中的每条第一线的长度；

所述第二掩模材料在所述第二区域的活化期间保持在适当位置；并且

所述方法还包括剥离所述第二掩模材料。

43.根据权利要求40所述的方法，其中：

所述第一区域和所述第二区域以行和列的形式延伸跨过所述基底；并且

所述第一区域的所述活化涉及选择性地灰化所述第一区域，使得所活化的第一区域是圆形的并且具有与所述第二区域相同的直径。

44.一种方法，所述方法包括：

在多层叠堆上沉积第一聚合物水凝胶，所述多层叠堆包括：

基底；以及

第一掩模材料和不同的第二掩模材料，它们在所述基底上图案化以限定：

多个第一区域，每个第一区域暴露所述基底的一部分并且与每个其他第一区域隔离；

多个第二区域，每个第二区域由所述第一掩模材料覆盖并且与每个其他第二区域隔离；以及

多个第三区域，每个第三区域由所述不同的第二掩模材料覆盖并且与每个其他第三区域隔离

由此所述第一聚合物水凝胶选择性地附接到所述基底的暴露在所述多个第一区域中的每个第一区域处的所述部分；

剥离所述第一掩模材料以暴露所述多个第二区域；

用附接第二聚合物水凝胶的表面基团活化所述多个第二区域；

沉积所述第二聚合物水凝胶以使得其选择性地附接到所述多个第二区域；

剥离所述不同的第二掩模材料以暴露所述多个第三区域；

用附接第三聚合物水凝胶的表面基团活化所述多个第三区域；

沉积所述第三聚合物水凝胶以使得其选择性地附接到所述多个第三区域；

将第一引物组接枝到所述第一聚合物水凝胶；

将第二引物组接枝到所述第二聚合物水凝胶，所述第二引物组不同于所述第一引物组；以及

将第三引物组接枝到所述第三聚合物水凝胶，所述第三引物组不同于所述第一引物组和所述第二引物组。