ES2945607T3 - Láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación - Google Patents
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Abstract
Realizaciones de la presente solicitud se refieren a láminas poliméricas estampadas y procesos para preparar las mismas para aplicaciones de secuenciación. En particular, se preparan láminas de polímero flexibles con micro y nanodiseño y se utilizan como superficie de plantilla en la reacción de secuenciación y se describen nuevos métodos sin pulido para formar tapones de hidrogel aislados en nanopocillos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación
Campo
En general, la presente solicitud se refiere a los campos de láminas de polímero y a procesos para preparar las mismas para aplicaciones de secuenciación de polinucleótidos.
Antecedentes
Se usan sustratos recubiertos con polímeros para la preparación y/o el análisis de moléculas biológicas. Los análisis moleculares, tales como determinados métodos de secuenciación de ácidos nucleicos, se basan en la unión de cadenas de ácidos nucleicos a una superficie recubierta con polímero de un sustrato. Las secuencias de las cadenas de ácido nucleico unidas pueden determinarse después mediante una serie de métodos diferentes que son bien conocidos en la técnica.
Se usan células de flujo en determinados procesos de secuenciación por síntesis. Típicamente, estas células de flujo incluyen una superficie activa dentro de una región intersticial inerte. La superficie de la célula de flujo normalmente se fabrica usando las siguientes etapas: (1) las depresiones se graban inicialmente en un sustrato uniforme; (2) las depresiones y las regiones intersticiales se funcionalizan con un silano y un polímero o hidrogel; (3) el exceso de polímero o hidrogel que cubre las regiones intersticiales se retira a través de un proceso de pulido; (4) el polímero o hidrogel en las depresiones después se injerta con ADN cebador monocatenario para proporcionar una superficie de célula de flujo para la aplicación de secuenciación corriente abajo. En este caso, parte del polímero o hidrogel se desperdicia en la etapa de pulido del flujo de trabajo de fabricación. Los documentos WO 2015/095291, WO 2013/184796, WO2014/133905, WO 2015/002813 y WO 2011/090949 describen procesos y métodos de preparación para aplicaciones de secuenciación.
Resumen
Se proporciona un proceso para preparar una lámina de polímero para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos según las reivindicaciones. Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a procesos para preparar una lámina de polímero para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprenden proporcionar un sustrato con una superficie; depositar una capa de una composición de polímero sobre la superficie del sustrato, en donde la composición de polímero incluye grupos funcionales para injertar oligonucleótidos; conformar la composición de polímero en una lámina de polímero sobre la superficie; y retirar el exceso de material de lámina de polímero de la superficie del sustrato. En algunas realizaciones, la conformación de la lámina de polímero comprende deshidratar la composición de polímero.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos preparadas mediante los procesos descritos en la presente memoria.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a procesos para preparar una lámina de polímero para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprenden proporcionar un sustrato con una superficie; depositar una capa de una composición de polímero sobre la superficie del sustrato, en donde la composición de polímero incluye grupos funcionales para injertar oligonucleótidos; conformar la composición de polímero en una lámina de polímero sobre la superficie; y retirar el exceso de material de lámina de polímero de la superficie del sustrato. En algunas realizaciones, la conformación de la lámina de polímero comprende deshidratar la composición de polímero.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a un proceso para preparar una superficie de sustrato para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprende proporcionar una lámina de polímero que tiene una primera pluralidad de grupos funcionales; poner en contacto la lámina de polímero con una superficie de un sustrato, en donde la superficie incluye una segunda pluralidad de grupos funcionales; unir covalentemente la primera pluralidad de grupos funcionales de la lámina de polímero a la segunda pluralidad de grupos funcionales de la superficie. En algunas realizaciones, la lámina de polímero tiene un patrón. En algunas de dichas realizaciones, la lámina de polímero incluye una pluralidad de canales, zanjas, postes, depresiones o combinaciones de los mismos que tienen un patrón a escala micro o nanométrica. Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a un proceso para preparar una superficie de sustrato que tiene un patrón para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprende: proporcionar un sustrato con una superficie que tiene un patrón, en donde la superficie incluye una pluralidad de depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica; depositar una composición de polímero sobre la superficie que tiene un patrón para conformar una primera capa de polímero, en donde la composición de polímero llena las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica; y separar la primera capa de polímero, en donde la composición de polímero se aísla en las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón. En algunas realizaciones, el proceso incluye, además, deshidratar la primera capa de polímero antes de separar la primera capa de polímero. En algunas
realizaciones, los procesos incluyen, además, laminar una segunda capa de polímero directamente encima de la superficie que tiene un patrón después de separar la primera capa de polímero. En algunas de dichas realizaciones, los procesos incluyen, además, separar la segunda capa de polímero de la superficie que tiene un patrón, en donde la composición de polímero se retira de las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón para conformar una pluralidad de postes de polímero que tienen un patrón en la segunda capa de polímero. En algunas realizaciones, la segunda capa de polímero es estirable.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos preparadas mediante los procesos descritos en la presente memoria.
También se proporciona un proceso de rollo a rollo automatizado para secuenciar aplicaciones según las reivindicaciones. Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a un proceso de rollo a rollo automatizado para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprende: enrollar un rollo de una lámina de polímero que tiene un patrón preparada mediante el proceso descrito en la presente memoria; preparar la lámina de polímero que tiene un patrón para la secuenciación mediante el tratamiento de la lámina de polímero con reactivos de secuenciación; secuenciar una muestra en la lámina de polímero que tiene un patrón tratada; y volver a enrollar la lámina de polímero estirable que tiene un patrón después de completar un ciclo de secuenciación. En algunas realizaciones, la lámina de polímero que tiene un patrón es estirable.
Algunas realizaciones adicionales descritas en la presente memoria se refieren a un proceso automatizado para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprende: proporcionar una banda que comprende la lámina de polímero que tiene un patrón preparada mediante el proceso descrito en la presente memoria; preparar la lámina de polímero que tiene un patrón para la secuenciación mediante el tratamiento de la lámina de polímero con reactivos de secuenciación de un dispositivo de suministro de fluidos; y secuenciar una muestra en la lámina de polímero que tiene un patrón tratada, en donde la banda hace pasar el dispositivo de suministro de fluido para cada ciclo de la aplicación de secuenciación.
Aunque la presente descripción ejemplifica métodos y composiciones en el contexto de aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, se entenderá que son posibles otros usos y aplicaciones. Las aplicaciones ilustrativas incluyen, aunque no de forma limitativa, ensayos de ácidos nucleicos no basados en secuenciación, tales como ensayos de hibridación o unión; ensayos de proteínas, tales como ensayos de unión o cinéticos; ensayos celulares; ensayos para otros componentes biológicos; ensayos de componentes no biológicos (biológicamente activos o biológicamente inertes); o similares. En consecuencia, cualquiera de una diversidad de analitos útiles en estos ensayos u otros ensayos conocidos en la técnica se puede unir a una lámina de polímero y/o a una superficie como se ejemplifica en la presente memoria para analitos utilizados en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Como aplicación adicional, los métodos de las composiciones expuestas en la presente memoria se pueden usar para la síntesis de diversos analitos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ácidos nucleicos, proteínas, moléculas biológicamente activas, moléculas biológicamente inertes y agentes terapéuticos candidatos o similares.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1A ilustra una vista en sección transversal de un proceso para preparar una lámina de polímero sin patrón.
La FIG. 1B es una vista superior de una lámina de hidrogel de PAZAM preparada mediante el proceso ilustrado en la FIG. 1A.
La FIG. 1C es una vista superior de las láminas de PAZAM preparadas mediante el proceso ilustrado en la FIG. 1A, donde las láminas están suspendidas en un bastidor de soporte de plástico para conformar una membrana de polímero independiente.
La FIG. 2 ilustra una vista en sección transversal de un proceso para preparar una lámina de polímero que tiene un patrón según una realización.
La FIG. 3A ilustra la deslaminación de una lámina de PAZAM conformada según el proceso ilustrado en la FIG. 2.
La FIG. 3B ilustra la suspensión de una lámina de PAZAM en cinta Kapton® de color amarillo.
La FIG. 3C ilustra la transferencia de una lámina de PAZAM sobre un sustrato portador funcionalizado, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio recubierto con norborneno.
Las FIG. 4A y 4B ilustran imágenes fluorescentes Typhoon de una célula de flujo.
La FIG. 5A ilustra una vista en sección transversal de una lámina de polímero de hidrogel que tiene un patrón con postes.
Las FIG. 5B y 5C son imágenes de Microscopio electrónico de barrido (MEB) de láminas de PAZAM que tienen un patrón con una pluralidad de postes a escala nanométrica.
La FIG. 6A es una imagen de Microscopio electrónico de barrido (MEB) de una lámina de polímero que contiene un único poste a escala nanométrica de polímero. El resto de los postes a escala nanométrica se aíslan en las nanodepresiones de la superficie de sustrato.
La FIG. 6B es una vista en sección transversal de una separación rápida de una lámina de hidrogel de una superficie de sustrato que tiene un patrón en donde queda parte del material de polímero dentro de las depresiones de una superficie, según algunas realizaciones de la presente solicitud.
La FIG. 6C es una vista en sección transversal de una separación controlada de una lámina de hidrogel de una superficie de sustrato que tiene un patrón en donde parte del material de polímero permanece unido a la lámina de hidrogel, según algunas realizaciones de la presente solicitud.
La FIG. 7A es una vista en sección transversal de un proceso de conformación de nanodepresiones rellenas de hidrogel sobre una superficie de sustrato según algunas realizaciones de la presente solicitud.
La FIG.7B es una vista en sección transversal de un proceso de formación de una lámina flexible que contiene hidrogel que tiene un patrón.
La FIG.8 es una vista esquemática de un proceso de secuenciación a escala de fábrica automatizado que usa láminas flexibles de rollo a rollo que tienen un patrón con polímeros o hidrogeles compatibles para la aplicación de secuenciación por síntesis (SBS, por sus siglas en inglés) preparadas mediante el proceso ilustrado en las FIG.7A y 7B.
La FIG. 9 ilustra la porción de un proceso de secuenciación de rollo a rollo automatizado representado en la FIG. 8 donde la lámina que tiene un patrón flexible se estira durante la formación de imágenes y se retrae después de la formación de imágenes.
Descripción detallada de las realizaciones
En la presente memoria se describen procesos para formar láminas de polímero. En algunas realizaciones, las láminas de polímero se pueden usar para reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, las láminas de polímero tienen superficies lisas, mientras que, en otras realizaciones, las láminas de polímero son láminas de polímero que tienen un patrón micro o nanométrico. Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a la formación directa de un patrón y a la liberación de una lámina de polímero flexible e independiente para su uso opcional como superficie molde en reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos u otras aplicaciones. Algunas otras realizaciones descritas en la presente memoria se refieren al método sin pulido para formar “ geles en depresiones” que se refieren al hidrogel que tiene un patrón aislado en nanodepresiones de la superficie de sustrato. Estos procesos se pueden usar en una diversidad de aplicaciones, incluyendo la secuenciación de ácidos nucleicos de próxima generación, el crecimiento, diferenciación y proliferación de células madre en superficies biocompatibles que tienen un patrón y estirables, y biorreacciones e integración con biosensores en electrónica flexible y/o estirable y superficies estirables para plasmónica.
En algunos casos, la lámina de polímero se suspende libremente y tiene la consistencia y flexibilidad del material de envoltura de plástico conocido utilizado para el almacenamiento de alimentos y otros artículos domésticos, sin embargo, también proporciona la reactividad química presente en un recubrimiento de hidrogel típico para la secuenciación de nucleótidos. Por ejemplo, en una célula de flujo convencional para secuenciación, generalmente hay presentes grupos funcionales activos en el recubrimiento que pueden participar en el injerto de cebador. Esto puede observarse en los sistemas de secuenciación por síntesis de ILLUMINA® (San Diego, CA). Como resultado, esta lámina de polímero flexible podría aplicarse a una diversidad de arquitecturas de secuenciación, incluyendo células de flujo, a través de procesos de laminación o impresión por transferencia.
Algunas realizaciones adicionales descritas en la presente memoria se refieren al uso de láminas de polímero flexibles para la secuenciación a escala de fábrica, por ejemplo, en un formato de rollo a rollo análogo a una imprenta donde las láminas de polímero flexibles se enrollan repetidamente de un lado a otro a través del sistema durante cada ciclo de secuenciación. De manera similar, las láminas de polímero flexibles se pueden conformar en bandas que hacen pasar repetidamente la superficie a través de un sistema para ciclos respectivos de secuenciación. Este enfoque podría permitir que se realicen reacciones de secuenciación de bajo coste y alto rendimiento.
Opcionalmente, las láminas de polímero pueden ser estirables. En dichas realizaciones, las láminas de polímero estirables contienen matrices de hidrogel de alta densidad que después podrían estirarse o deformarse a través de un cabezal de lectura de baja apertura numérica (AN) para la secuenciación usando dispositivos de formación de imágenes ópticas de bajo coste. Este enfoque combina los volúmenes más bajos de entrada y de reactivo proporcionados por los tamaños de célula de flujo más pequeños con la óptica de bajo coste. Más específicamente,
la superficie puede estar en un estado relativamente contraído durante las etapas de procesamiento de fluidos para permitir que un gran número de características de la matriz entren en contacto con un volumen relativamente bajo de reactivos. Después de la etapa química, la superficie se puede estirar para aumentar el espaciado de la matriz, permitiendo de este modo la detección óptica y la delineación de características adyacentes usando un objetivo de baja apertura numérica que típicamente no sería capaz de resolver estas características en un estado contraído. Además, estirar la superficie para aumentar el espaciado de las características reduce la interferencia entre las características de la matriz durante las etapas de detección, permitiendo la formación de imágenes robusta usando ópticas de bajo coste.
En algunas otras realizaciones de los polímeros estirables, estas láminas de polímero estirables se pueden recubrir o pueden obtener un patrón con metales o dieléctricos. Mediante tensión térmica, mecánica, química u óptica, estas láminas de polímero con memoria de forma con estructuras metálicas que tienen un patrón en el polímero pueden ajustarse para contraerse, formando de este modo superficies metálicas o dieléctricas con un espaciado reducido al estado sin tensión. Además, el proceso de contracción inducirá una mayor rugosidad de la superficie o “ arrugas” en las estructuras metálicas. Véase, Fu y col., “Tunable Nanowrinkles on Shape Memory Polymer Sheets” , Adv. Mater.
2009, 21, 1-5. Las aplicaciones potenciales para estos materiales de polímero contraídos con metales que tienen un patrón y dieléctricos se encuentran en plasmónica, SERS, potenciación de la fluorescencia, electrónica, entre otras aplicaciones. Los náilones y las poliolefinas son ejemplos de polímeros termorretráctiles que se pueden recubrir con polímeros para secuenciar u obtener patrones con metales/dieléctricos y contraerse para su uso en plasmónica, electrónica y para la formación de uniones comunicantes metálicas o semiconductoras. Otras familias de polímeros candidatos que se podrían usar para estas aplicaciones incluyen poliolefinas, polivinilos, policarbonatos, poliuretanos, siliconas, películas de poliimida Kapton®, entre otros.
La siguiente descripción detallada se refiere a determinadas realizaciones específicas de la presente solicitud. En esta descripción, se hace referencia a los dibujos en donde partes o etapas similares pueden designarse con números iguales para mayor claridad. La referencia en la presente memoria descriptiva a “ una sola realización” , “ una realización” o “ en algunas realizaciones” significa que una característica, estructura o característica particular descrita en relación con la realización puede incluirse en al menos una realización de la invención. Las apariciones de las expresiones “ una sola realización” , “ una realización” o “ en algunas realizaciones” en diversos lugares de la memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización, ni son realizaciones separadas o alternativas mutuamente excluyentes de otras realizaciones. Además, se describen diversas características que pueden presentar algunas realizaciones y otras no. De manera similar, se describen diversos requisitos que pueden ser requisitos para algunas realizaciones, pero no para otras realizaciones.
Los encabezados de secciones que se utilizan en la presente memoria tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.
Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. Todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad a menos que se indique lo contrario. Como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ uno” , “ una” , “ el” y “ la” incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. El uso de “ o” significa “y/o” a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término “ incluyendo” , así como otras formas, tales como “ incluyen” , “ incluye” e “ incluido” , no es limitativo. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, ya sea en una expresión de transición o en el cuerpo de la reivindicación, las expresiones “ comprende(n)” y “ que comprende(n)” se han de interpretar como que tienen un significado abierto. Es decir, las expresiones se han de interpretar como sinónimos de las expresiones “ que tiene(n) al menos” o “ que incluye(n) al menos” . Cuando se utiliza en el contexto de un proceso, la expresión “ que comprende(n)” significa que el proceso incluye al menos las etapas citadas, pero puede incluir etapas adicionales. Cuando se utiliza en el contexto de un compuesto, composición o dispositivo, la expresión “ que comprende(n)” significa que el compuesto, la composición o el dispositivo incluye al menos las características o componentes citados, pero también puede incluir características o componentes adicionales.
Como se utilizan en la presente memoria, las abreviaturas orgánicas comunes se definen de la siguiente manera:
dATP Trifosfato de desoxiadenosina
dCTP Trifosfato de desoxicitidina
dGTP Trifosfato de desoxiguanosina
dTTP Trifosfato de desoxitimidina
ADNmc ADN monocatenario
AN Apertura numérica
SBS Secuenciación por síntesis
PAZAM Relación de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) de cualquier acrilamida con respecto a Azapa (N-(5-(2-azidoacetamido)pentil)acrilamida)
°C Temperatura en grados centígrados
μm micrómetro
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ matriz” se refiere a una población de características diferentes que se producen en uno o más sustratos, de manera que las características diferentes puedan diferenciarse espacialmente entre sí. En algunas realizaciones, las características son depresiones, postes, zanjas, crestas u otros contornos sobre la superficie de un sustrato. Alternativamente o de forma adicional, cada una de las características puede comprender una o más moléculas de sonda y, opcionalmente, puede haber presentes sondas diferentes en cada una de las características. Una característica también se puede definir como una ubicación donde reside un gel u otro material en mayor cantidad que una región intersticial sobre la misma superficie. Una matriz puede incluir moléculas de sonda diferentes que están ubicadas cada una en una ubicación direccionable diferente en un sustrato. Alternativamente o de forma adicional, una matriz puede incluir sustratos separados, cada uno con una molécula de sonda diferente, en donde las diferentes moléculas de sonda pueden identificarse según las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que se unen los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido. Las matrices ilustrativas en las que se ubican sustratos separados en una superficie incluyen, sin limitación, aquellas que incluyen perlas en depresiones como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.355.431 B1, US 2002/0102578 y la publicación PCT n.° WO 00/63437. Los formatos ilustrativos que se pueden usar en la presente solicitud para distinguir perlas en una matriz líquida, por ejemplo, usando un dispositivo de microfluidos, tal como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.524.793. Otros ejemplos de matrices que se pueden usar en la solicitud incluyen, sin limitación, los descritos en las patentes estadounidenses n.° 5.429.807; 5.436.327; 5.561.071; 5.583.211; 5.658.734; 5.837.858; 5.874.219; 5.919.523; 6.136.269; 6.287.768; 6.287.776; 6.288.220; 6.297.006; 6.291.193; 6.346.413; 6.416.949; 6.482.591; 6.514.751 y 6.610.482; y el documento WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742287; y EP 799897.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ unido covalentemente” o “ enlazado covalentemente” se refiere a la conformación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, una “ lámina de polímero unida covalentemente” , cuando se utiliza en referencia a una superficie de sustrato, se refiere a una lámina de polímero que forma enlaces químicos con una superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con la unión a la superficie a través de otros medios, por ejemplo, adhesión o interacción electrostática. Se apreciará que los polímeros que se unen covalentemente a una superficie también se pueden unir a través de otros medios, además de la unión covalente.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ proceso de rollo a rollo” se refiere a la manipulación de un sustrato alargado a medida que se transfiere de un carrete a otro. Un proceso de rollo a rollo ilustrativo es la secuenciación continua de una superficie de sustrato que tiene un patrón a medida que la superficie pasa por un dispositivo de secuenciación mientras se desenrolla de un rollo y se enrolla en otro rollo.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ espaciado” se refiere al espacio de centro a centro entre dos características de una matriz. Un patrón de características se puede caracterizar en términos del espaciado promedio. Por ejemplo, el patrón puede ser regular, de manera que el coeficiente de variación alrededor del espaciado promedio sea pequeño, o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquiera de los casos, el espaciado promedio puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 10 nm, aproximadamente 0,1 μm, aproximadamente 0,5 μm, aproximadamente 1 μm, aproximadamente 5 μm, aproximadamente 10 μm, aproximadamente 100 μm o más, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. Alternativamente o de forma adicional, el espaciado promedio puede ser, por ejemplo, de como máximo aproximadamente 100 μm, aproximadamente 10 μm, aproximadamente 5 μm, aproximadamente 1 μm, aproximadamente 0,5 μm, aproximadamente 0,1 μm o menos, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ interferencia” se refiere a la señal aparente de una característica observada debido a la señal producida por otra característica. La interferencia es generalmente no deseable y generalmente se considera una forma de fondo.
Como se utiliza en la presente memoria, “ de Ca a Cb” o “ Ca-b” en los que “ a” y “ b” son números enteros se refieren al número de átomos de carbono en el grupo especificado. Es decir, el grupo puede contener de “ a” a “ b” , inclusive, átomos de carbono. Por lo tanto, por ejemplo, un grupo “ alquilo de C1 a C4” o “ alquilo C1-4” se refiere a todos los
grupos alquilo que tienen de 1 a 4 carbonos, es decir, CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)- y (CH3)3C-.
El término “ halógeno” o “ halo” , como se utiliza en la presente memoria, significa uno cualquiera de los átomos radioestables de la columna 7 de la Tabla periódica de los elementos, p. ej., flúor, cloro, bromo o yodo, prefiriéndose el flúor y el cloro.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que está completamente saturada (es decir, no contiene enlaces dobles ni triples). El grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que aparezca en la presente memoria, un intervalo numérico tal como “ de 1 a 20” se refiere a cada número entero en el intervalo dado; p. ej., “ de 1 a 20 átomos de carbono” significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e inclusive 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término “ alquilo” donde no se designa un intervalo numérico). El grupo alquilo también puede ser un alquilo de tamaño medio que tenga de 1 a 9 átomos de carbono. El grupo alquilo podría ser un alquilo inferior que tenga de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede designarse como “ alquilo C1-4” o designaciones similares. A manera de ejemplo únicamente, “ alquilo C1-4” indica que hay de uno a cuatro átomos de carbono en la cadena alquilo, es decir, la cadena alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y t-butilo. Los grupos alquilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alqueno” o “ alquenilo” se refiere a una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene uno o más dobles enlaces. El grupo alquenilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término “ alquenilo” donde no se designa ningún intervalo numérico. El grupo alquenilo también puede ser un alquenilo de tamaño medio que tenga de 2 a 9 átomos de carbono. El grupo alquenilo podría ser un alquenilo inferior que tenga de 2 a 4 átomos de carbono. El grupo alquenilo puede designarse como “ alquenilo C2-4” o designaciones similares. A manera de ejemplo únicamente, “ alquenilo C2-4” indica que hay de dos a cuatro átomos de carbono en la cadena de alquenilo, es decir, la cadena de alquenilo se selecciona del grupo que consiste en etenilo, propen-1-ilo, propen-2-ilo, propen-3-ilo, buten-1-ilo, buten-2-ilo, buten-3-ilo, buten-4-ilo, 1-metil-propen-1-ilo, 2-metil-propen-1-ilo, 1 -etil-eten-1 -ilo, 2-metil-propen-3-ilo, buta-1,3-dienilo, buta-1,2-dienilo y buta-1,2-dien-4-ilo. Los grupos alquenilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo y hexenilo, y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquinilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que contiene uno o más enlaces triples. El grupo alquinilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término “ alquinilo” donde no se designa ningún intervalo numérico. El grupo alquinilo también puede ser un alquinilo de tamaño medio que tenga de 2 a 9 átomos de carbono. El grupo alquinilo podría ser un alquinilo inferior que tenga de 2 a 4 átomos de carbono. El grupo alquinilo puede designarse como “ alquinilo C2-4” o designaciones similares. A manera de ejemplo únicamente, “ alquinilo C2-4” indica que hay de dos a cuatro átomos de carbono en la cadena de alquinilo, es decir, la cadena de alquinilo se selecciona del grupo que consiste en etinilo, propin-1-ilo, propin-2-ilo, butin-1-ilo, butin-3-ilo, butin-4-ilo y 2-butinilo. Los grupos alquinilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo, y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, “ cicloalquilo” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo completamente saturado. Los ejemplos incluyen ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, etc.
Como se utiliza en la presente memoria, “ cicloalquileno” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo completamente saturado que está unido al resto de la molécula a través de dos puntos de unión.
Como se utiliza en la presente memoria, “ cicloalquenilo” o “ cicloalqueno” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo que tiene/n al menos un enlace doble, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático. Un ejemplo es cicloocteno. Otro ejemplo es norborneno o norbornenilo.
Como se utiliza en la presente memoria, “ heterocicloalquenilo” o “ heterocicloalqueno” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo con al menos un heteroátomo en la cadena principal del anillo, que tiene al menos un enlace doble, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático.
Como se utiliza en la presente memoria, “ cicloalquinilo” o “ cicloalquino” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo que tiene al menos un enlace triple, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático. Un ejemplo es ciclooctino. Otro ejemplo es biciclononina.
Como se utiliza en la presente memoria, “ heterocicloalquinilo” o “ heterocicloalquino” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo con al menos un heteroátomo en la cadena principal del anillo, que tiene al menos un enlace triple, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático.
Un grupo “ amino” se refiere a un grupo “ -NRARB” en el que RA y RB se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 5-10 miembros, como se define en la presente memoria. Un ejemplo no limitativo incluye amino libre (es decir, -NH2).
Un grupo “ C-amido” se refiere a un grupo “ -C(=O)NRARB” en el que RA y RB se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 5-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Un grupo “ N-amido” se refiere a un grupo “ -N(RA)C(=O)RB” en el que RA y RB se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 5-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ ácido carboxílico” o “ carboxilo” como se utiliza en la presente memoria se refiere a -C(O)OH.
El término “ hidrazina” o “ hidrazinilo” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo -NHNH2.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ hidrazona” o “ hidrazonilo” como se utiliza en la presente memoria se refiere a un
grupo en el que Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 5-10 miembros, como se define en la presente memoria. Un ejemplo no limitativo incluye amino libre (es decir, -NH2).
El término “ epoxi” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a
La expresión “ glicidil éter” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a
Como se utilizan en la presente memoria, el término “ tetrazina” o “tetrazinilo” se refiere a un grupo heteroarilo de seis miembros que comprende cuatro átomos de nitrógeno. La tetrazina puede estar opcionalmente sustituida.
Como se utilizan en la presente memoria, los términos “tetrazol” y “ tetrazolilo” se refieren a un grupo heterocíclico de cinco miembros que comprende cuatro átomos de nitrógeno. El tetrazol puede estar opcionalmente sustituido.
Un “ óxido de nitrilo” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo “ RCeN+O'” en el que R se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 5-10 miembros, como se define en la presente memoria. Los ejemplos no limitativos de preparación de óxido de nitrilo incluyen la generación in situ a partir de aldoximas mediante el tratamiento con cloramida-T o a través de la acción de una base sobre cloruros de imidαlo [RC(Cl)=NOH].
Una “ nitrona” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo “ RARBC=NRc+O-” en el que RA, RB y Rc se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7 , arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 5-10 miembros, como se define en la presente memoria.
Como se utiliza en la presente memoria, un grupo sustituido deriva del grupo original no sustituido en el que ha habido un intercambio de uno o más átomos de hidrógeno por otro átomo o grupo. A menos que se indique lo contrario, cuando se considera que un grupo está “ sustituido” , se entiende que el grupo está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo C 1-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo C1-C6, heteroalquilo C1-C6, carbociclilo C3-C7 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), carbociclil-C3-C7-alquilo-C1-C6 (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6,
haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heterociclil-alquilo-Ci-C6 de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), arilo (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), aril-alquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), heteroarilo de 5-10 miembros alquilo (C1-C6) (opcionalmente sustituido con halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 y haloalcoxi C1-C6), halo, ciano, hidroxi, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6-alquilo (C1-C6) (es decir, éter), ariloxi, sulfhidrilo (mercapto), halo-alquilo (C1-C6) (p. ej., -C F 3), halo-alcoxi (C1-C6) (p. ej., -OCF3), alquiltio C1-C6, ariltio, amino, amino-alquilo (C1-C6), nitro, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acilo, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinilo, sulfonilo y oxo (=O). Siempre que un grupo se describa como “ opcionalmente sustituido” , ese grupo puede estar sustituido con los sustituyentes anteriores.
Como se utiliza en la presente memoria, un “ nucleótido” incluye una base heterocíclica que contiene nitrógeno, un azúcar y uno o más grupos fosfato. Son unidades monoméricas de una secuencia de ácido nucleico. En el ARN, el azúcar es una ribosa, y en el ADN una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la posición 2' en la ribosa. La base heterocíclica que contiene nitrógeno puede ser una base de purina o pirimidina. Las bases de purina incluyen adenina (A) y guanina (G), y derivados modificados o análogos de las mismas. Las bases de pirimidina incluyen citosina (C), timina (T) y uracilo (U) y derivados modificados o análogos de los mismos. El átomo C-1 de la desoxirribosa se une al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina.
Como se utiliza en la presente memoria, un “ nucleósido” es estructuralmente similar a un nucleótido, pero carece de restos fosfato en la posición 5'. El término “ nucleósido” se utiliza en la presente memoria en su sentido ordinario como lo entienden los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa de ninguna manera, un ribonucleósido que comprende un resto ribosa y un desoxirribonucleósido que comprende un resto desoxirribosa. Un resto pentosa modificado es un resto pentosa en el que un átomo de oxígeno se ha reemplazado por un carbono y/o un carbono se ha reemplazado por un átomo de oxígeno o de azufre. Un “ nucleósido” es un monómero que puede tener una base sustituida y/o un resto azúcar. De forma adicional, se puede incorporar un nucleósido en polímeros y oligómeros de ADN y/o a Rn más grandes.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ polinucleótido” se refiere a ácidos nucleicos en general, incluyendo ADN (p. ej., ADNc de ADN genómico), ARN (p. ej., ARNm), oligonucleótidos sintéticos y análogos de ácidos nucleicos sintéticos. Los polinucleótidos pueden incluir bases naturales o no naturales, o combinaciones de las mismas y uniones de cadena principal naturales o no naturales, p. ej., fosforotioatos, PNA o 2'-O-metil-ARN, o combinaciones de los mismos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ cebador” se define como una molécula de ADN monocatenario (ADNmc) con un grupo OH 3' libre y una modificación en el extremo 5' para permitir las reacciones de acoplamiento. La longitud del cebador puede ser cualquier cantidad de bases largas y puede incluir una diversidad de nucleótidos no naturales. En algunas realizaciones, los “ cebadores de SBS” se utilizan como parte de una reacción de secuenciación por síntesis (SBS) en un sistema tal como los sistemas HiSeq®, MiSeq® o NextSeq® de Illumina (San Diego, CA). En estas reacciones, típicamente se une un conjunto de cebadores de amplificación a una superficie de vidrio. Un conjunto de moléculas de ADN diana que se ha de secuenciar se hibrida con los cebadores unidos y después se amplifica mediante un proceso de amplificación en puente. Las reacciones de secuenciación se realizan, y en las realizaciones de la invención, los cebadores de amplificación (y los amplicones que incluyen cebadores extendidos durante las etapas de amplificación para incluir copias del ADN diana) se desligan después de la superficie de vidrio, de manera que la superficie es reutilizable en futuras reacciones de secuenciación. Por lo tanto, pueden repetirse una o más de las etapas de fijación de cebadores de amplificación a la superficie de vidrio, hibridación de moléculas de ADN diana a los cebadores, amplificación en puente, secuenciación del ADN diana y retirada de los cebadores de amplificación y los amplicones. Se puede realizar una o más repeticiones. En algunas realizaciones, los cebadores de SBS pueden ser los cebadores P5 o P7 en una realización, como se detalla a continuación. Los cebadores P5 y P7 se utilizan sobre la superficie de células de flujo comerciales comercializadas por Illumina Inc. para la secuenciación en las plataformas HiSeq®, MiSeq®, NextSeq® y Genome Analyzer®. Las secuencias de los cebadores se describen en la publicación de patente estadounidense n.° 2011/0059865 A1.
Las secuencias de cebadores P5 y P7 comprenden lo siguiente:
Conjunto final emparejado:
P5: extremo emparejado 5 '^ 3'AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC
P7: extremo emparejado 5 '^ 3'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT
Conjunto de lectura única:
P5: lectura única: 5 '^ 3'AATGATACGGCGACCACCGA
P7: lectura única 5 '^ 3'CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Opcionalmente, uno o ambos de los cebadores P5 y P7 pueden incluir una cola de poli T. La cola de poli T generalmente está ubicada en el extremo 5' de las secuencias anteriores, pero en algunos casos puede estar ubicada en el extremo 3'. La secuencia poli T puede incluir cualquier cantidad de nucleótidos T, por ejemplo, de 2 a 20.
Procesos para la preparación de láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a procesos para preparar una lámina de polímero para aplicaciones de secuenciación, incluyen proporcionar un sustrato con una superficie; depositar una capa de una composición de polímero sobre la superficie del sustrato, en donde la composición de polímero comprende grupos funcionales para injertar oligonucleótidos; conformar la composición de polímero en una lámina de polímero sobre la superficie; y retirar la lámina de polímero de la superficie del sustrato.
Se pueden usar diversas composiciones de polímeros en los procesos descritos en la presente memoria. Las composiciones de polímero pueden incluir un polímero con uno o más grupos funcionales que sean capaces de reaccionar con biomoléculas de interés, por ejemplo, para cebadores de injerto. En algunas realizaciones, los grupos funcionales del polímero también son capaces de reaccionar con la superficie de sustrato para formar un enlace covalente entre el polímero y la superficie de sustrato. En estos casos, la superficie de sustrato usualmente se trata con silano funcional o derivados de silano, que proporcionan sitios reactivos sobre la superficie para la reacción con la composición de polímero. En algunas de dichas realizaciones, los grupos funcionales de la composición de polímero pueden incluir o pueden seleccionarse de cicloalquenos C8-14, heterocicloalquenos de 8 a 14 miembros, cicloalquinos C8-14, heterocicloalquinos de 8 a 14 miembros, alquinilo, vinilo, halo, azido, amino, amido, epoxi, glicidilo, carboxilo, hidrazonilo, hidrazinilo, hidroxi, tetrazolilo, tetrazinilo, óxido de nitrilo, nitreno, nitrona, oxo-amino o tiol, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de los polímeros que se pueden usar en la presente solicitud se describen en la presente memoria, incluyendo los descritos en la patente estadounidense n.° 9.012.022.
En algunos casos, la composición de polímero se puede reemplazar parcial o completamente por una composición de monómero, una composición de prepolímero o una composición de precursor de polímero, en donde la reacción de polimerización se realiza in situ durante la conformación de la lámina de polímero.
Hidrogeles
En algunas realizaciones, la composición de polímero descrita en la presente memoria comprende un hidrogel. Los hidrogeles ilustrativos no limitativos que se pueden usar en la presente solicitud incluyen poliacrilamida, ácidos polimetacrílicos, hidrogeles de homopolímeros, hidrogeles de copolímeros, hidrogeles de multipolímeros, etc. Otros ejemplos no limitativos de hidrogeles que se pueden usar en la presente solicitud se describen en la presente memoria. El documento WO 00/31148 describe hidrogeles de poliacrilamida y matrices a base de hidrogel de poliacrilamida en las que se forma un denominado prepolímero de poliacrilamida, preferiblemente a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un derivado de ácido acrílico que contiene un grupo vinilo. Después se puede realizar la reticulación del prepolímero. Los hidrogeles producidos de este modo tienen un soporte sólido, preferiblemente sobre vidrio. También se puede realizar la funcionalización del hidrogel en soporte sólido.
El documento WO 01/01143 describe una tecnología similar a la del documento WO 00/31148 pero que difiere en que el hidrogel tiene una funcionalidad capaz de participar en una reacción de fotocicloadición [2+2] con una biomolécula para formar matrices inmovilizadas de dichas biomoléculas. Dichos hidrogeles funcionalizados se pueden usar en un método de composición de la presente descripción. La dimetilmaleimida (DMI) es una funcionalidad particularmente preferida. El uso de reacciones de fotocicloadición [2+2], en el contexto de la tecnología de micromatriz basada en poliacrilamida, también se describe en los documentos WO02/12566 y WO03/014392.
La patente estadounidense n.° 6.465.178 describe el uso de composiciones de reactivos para proporcionar portaobjetos activados para su uso en la preparación de micromatrices de ácidos nucleicos; las composiciones de reactivos incluyen copolímeros de acrilamida. Las composiciones y métodos expuestos en el mismo se pueden aplicar en el contexto de los métodos y composiciones expuestos en la presente memoria.
El documento WO 00/53812 describe la preparación de matrices de ADN de hidrogel a base de poliacrilamida y el uso de estas matrices en la amplificación de réplicas que se pueden usar en un método o una composición expuestos en la presente memoria.
Una vez que se han formado los hidrogeles, después se les pueden unir biomoléculas para producir matrices moleculares, si se desea. La unión puede efectuarse de diferentes maneras. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.372.813 enseña la inmovilización de polinucleótidos que llevan grupos dimetilmaleimida en los hidrogeles producidos que llevan grupos dimetilmaleimida realizando una etapa de fotocicloadición [2+2] entre dos grupos dimetilmaleimida, uno unido al polinucleótido que se ha de inmovilizar y otro colgando del hidrogel.
Cuando la matriz molecular se forma después de la generación del hidrogel, se pueden emplear dos estrategias para lograr este fin. En primer lugar, el hidrogel puede modificarse químicamente después de su producción. Una alternativa más común es efectuar la polimerización con un comonómero que tenga una funcionalidad cebada o preactivada para reaccionar con las moléculas que se han de disponer en forma de matriz.
Pueden emplearse alternativas a la formación inicial de hidrogeles seguida de la disposición en forma de matriz posterior de moléculas en los mismos, por ejemplo, donde la matriz se forma al mismo tiempo que se produce el hidrogel. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mediante copolimerización directa de polinucleótidos derivados de acrilamida. Un ejemplo de este enfoque se describe en el documento WO01/62982 en el que se mezclan polinucleótidos derivados de acrilamida con soluciones de acrilamida y la polimerización se efectúa directamente.
Mosaic Technologies (Boston, Mass., EE.UU.) produjo ACRYDITE™ (una fosforamidita de acrilamida) que puede hacerse reaccionar con polinucleótidos antes de la copolimerización del monómero resultante con acrilamida.
Efimov y col. (Nucleic Acids Research, 1999, 27 (22), 4416-4426) describen un ejemplo adicional de una formación simultánea de hidrogel/matriz que puede usarse, en el que se producen la copolimerización de acrilamida, derivados de ácido acrílico reactivo y polinucleótidos modificados que tienen grupos acrilamida en el extremo 5' o 3'.
PAZAM
En algunas realizaciones, la composición de polímero comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-coacrilamida) (PAZAM). En algunas realizaciones, PAZAM también se representa por la Fórmula (A) o (B):
en donde n es un número entero en el intervalo de 1-20.000, y m es un número entero en el intervalo de 1-100.000.
Se puede preparar PAZAM por polimerización de acrilamida y Azapa (N-(5-(2-azidoacetamido)pentil)acrilamida) en cualquier relación. En algunas realizaciones, PAZAM es un polímero lineal. En algunas otras realizaciones, PAZAM es un polímero ligeramente reticulado. En algunas realizaciones, PAZAM se aplica como una solución acuosa. En algunas otras realizaciones, PAZAM se aplica como una solución acuosa con uno o más aditivos disolventes, tales como etanol. El método para la preparación de diferentes polímeros de PAZAM se analiza en detalle en la patente estadounidense n.° 9.012.022. En algunas realizaciones, se puede mezclar PAZAM con uno o más polímeros o hidrogeles en la preparación de la composición de polímero descrita en la presente memoria.
En algunas realizaciones, la superficie del sustrato se trata con un silano o derivado de silano antes de depositar la composición de polímero (o precursores del polímero). En una realización, la superficie del sustrato se trata con fluorosilano. En otra realización, la superficie se trata con un norbornenosilano, por ejemplo, [(5-biciclo[2.2.1]hept-2-enil)etil]trimetoxisilano. Otros derivados de silano adecuados que se pueden usar en la presente solicitud se describen en la publicación estadounidense n.° 2015/0005447 A1.
En algunas realizaciones, la conformación de la lámina de polímero comprende deshidratar la composición de polímero. Un fin de la etapa de deshidratación es retirar cualquier disolvente en la composición de polímero. En algunas realizaciones, la etapa de deshidratación se realiza a una temperatura elevada, por ejemplo, por encima de aproximadamente 30 °C, o a una temperatura que sea compatible con los restos funcionales en el polímero o hidrogel. En algunas de dichas realizaciones, la deshidratación se produce a aproximadamente 60 °C. En algunos casos, la temperatura de deshidratación se controla para mantener las propiedades químicas y físicas deseadas de las láminas de polímero, por ejemplo, por debajo de aproximadamente 100 °C. Por ejemplo, la temperatura de deshidratación usualmente está por debajo de aproximadamente 90 °C cuando se usa PAZAM. La etapa de deshidratación se puede realizar en diversos dispositivos conocidos por un experto habitual en la técnica, por ejemplo, una placa caliente o un horno de vacío. En algunas realizaciones, puede ser necesaria una etapa separada de incubación de la composición de polímero sobre la superficie si la lámina de polímero conformada se une químicamente o se une a la superficie.
En algunas realizaciones, la superficie del sustrato incluye patrones a escala micro o nanométrica, tales como canales, trincheras, postes, depresiones o combinaciones de los mismos. En algunas de dichas realizaciones, se transfiere una impresión de los patrones a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón a la lámina de polímero para formar una lámina de polímero que tiene un patrón. Los patrones a microescala incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen características con dimensiones (p. ej., diámetro promedio o sección transversal promedio) en el intervalo de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 999 micrómetros. Los patrones a nanoescala incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen características con dimensiones (p. ej., diámetro promedio o sección transversal promedio) en el intervalo de aproximadamente 1 nanómetro a aproximadamente 999 nanómetros.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación preparadas mediante los procesos descritos en la presente memoria y sustratos que comprenden láminas de polímero preparadas mediante los procesos descritos en la presente memoria para aplicaciones de secuenciación.
La FIG. 1A ilustra la vista en sección transversal de un proceso para preparar una lámina de polímero sin patrón según algunas realizaciones de la presente solicitud. Primero, se proporciona un sustrato 100 que contiene una placa 101 de vidrio subyacente y una superficie 102 de capa de fluorosilano. Después, una capa de hidrogel 103 hidratado se deposita encima de la capa 102 de fluorosilano. Después de la deshidratación del hidrogel a 60 °C, el hidrogel forma una lámina 104 de polímero, que posteriormente se retira mediante fuerza física, tal como una cinta.
La FIG. 1B es una vista superior de una lámina de PAZAM preparada mediante el proceso ilustrado en la FIG. 1A. La FIG. 1C es una vista superior de las láminas PAZAM preparadas mediante el proceso ilustrado en la FIG. 1A, donde las láminas están suspendidas en un armazón o estructura de soporte, por ejemplo, un bastidor de soporte de plástico.
La FIG. 2 ilustra una vista en sección transversal de un proceso para preparar una lámina de polímero que tiene un patrón según algunas realizaciones de la presente solicitud. En este ejemplo específico, se usa PAZAM como el hidrogel de elección, ya que admite la secuenciación por síntesis (SBS). Sin embargo, este proceso también se puede extender a una diversidad de otros hidrogeles y polímeros. Primero, se proporciona un sustrato 200 que contiene una placa 201 de vidrio que tiene un patrón subyacente con patrones 202 y una capa de fluorosilano (no se muestra). Después, se deposita una capa de hidrogel 203 de PAZAM hidratado encima de la placa 201 de vidrio que tiene un patrón. Después de la deshidratación del hidrogel, el hidrogel forma una lámina 204 de polímero, que contiene patrones 205, que se transfieren de patrones 202 de la placa 201 de vidrio. La lámina 204 de polímero posteriormente se retira mediante fuerza física.
La lámina de polímero sin patrón de la FIG. 1A y la lámina de polímero que tiene un patrón de la FIG. 2 pueden aumentar en escala en tamaño al de un portaobjetos de microscopio. Los métodos para aumentar la robustez estructural de estas láminas de polímero incluyen aumentar la longitud de la cadena de polímero de hidrogel para lograr un mayor entrelazamiento físico, añadir reticulantes de alquino al hidrogel (por ejemplo, reticulantes de alquino al hidrogel de PAZAM) o cambiar el peso molecular del hidrogel, entre otros.
Procesos para la preparación de la superficie de sustrato para aplicaciones de secuenciación
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren procesos para preparar una superficie de sustrato para aplicaciones de secuenciación, que comprenden proporcionar una lámina de polímero que tiene una primera pluralidad de grupos funcionales; poner en contacto la lámina de polímero con una superficie de un sustrato, en donde la superficie incluye una segunda pluralidad de grupos funcionales; unir covalentemente la primera pluralidad de grupos funcionales de la lámina de polímero a la segunda pluralidad de grupos funcionales de la superficie. En algunas realizaciones, puede ser necesario incubar la composición de polímero sobre la superficie cuando se forma un enlace covalente con la superficie.
En algunas realizaciones, los procesos incluyen, además, injertar oligonucleótidos sobre la superficie de sustrato haciendo reaccionar oligonucleótidos funcionalizados con la primera pluralidad de grupos funcionales de la lámina de polímero.
En algunas realizaciones, la lámina de polímero tiene un patrón. En algunas de dichas realizaciones, la lámina de polímero incluye una pluralidad de canales, zanjas, postes, depresiones o combinaciones de los mismos que tienen un patrón a escala micro o nanométrica.
En algunas realizaciones, la lámina de polímero incluye un hidrogel. En alguna de dichas realizaciones, el hidrogel se deshidrata antes de unirse covalentemente a la superficie de sustrato. En dicha realización, el hidrogel deshidratado se rehidrata antes de reaccionar con los oligonucleótidos funcionalizados.
En algunas realizaciones, la primera pluralidad de grupos funcionales de la lámina de polímero incluyen o se seleccionan de cicloalquenos C8-14, heterocicloalquenos de 8 a 14 miembros, cicloalquinos C8-14, heterocicloalquinos de 8 a 14 miembros, alquinilo, vinilo, halo, azido, amino, amido, epoxi, glicidilo, carboxilo, hidrazonilo, hidrazinilo,
hidroxi, tetrazolilo, tetrazinilo, óxido de nitrilo, nitreno, nitrona, oxo-amino o tiol, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones adicionales, la primera pluralidad de grupos funcionales se selecciona de azido, alquinilo, amino, carboxilo, epoxi, glicidilo, halo o tetrazinilo, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En una realización, la primera pluralidad de grupos funcionales comprende azido.
En algunas realizaciones, la lámina de polímero comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM). En algunas realizaciones, se puede mezclar PAZAM con uno o más polímeros o hidrogeles en la preparación de la composición de polímero descrita en la presente memoria.
En algunas realizaciones, la segunda pluralidad de grupos funcionales de la superficie de sustrato incluye o se selecciona de vinilo, acrilαlo, alquenilo, alquinilo, cicloalquenos C8-14, heterocicloalquenos de 8 a 14 miembros, cicloalquinos C8-14, heterocicloalquinos de 8 a 14 miembros, nitreno, aldehído, hidrazinilo, glicidil éter, epoxi, amino, carbeno, isocianato o maleimida, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones adicionales, la segunda pluralidad de grupos funcionales se selecciona de alquinilo, acrilαlo, cicloalquenos C8-14, alquinilo, glicidil éter, epoxi o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En una realización, la segunda pluralidad de grupos funcionales comprende norborneno opcionalmente sustituido.
Las FIG. 3A-3C ilustrar una lámina de polímero conformada mediante el proceso ilustrado en la FIG. 2 y la transferencia de la lámina de polímero sobre un sustrato portador funcionalizado. La FIG. 3A ilustra una lámina de PAZAM deslaminada formada según el proceso ilustrado en la FIG. 2. La FIG. 3B ilustra la suspensión de la lámina de PAZAM en cinta Kapton® de color amarillo. La FIG. 3C ilustra la transferencia de la lámina PAZAM sobre un sustrato portador funcionalizado, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio recubierto con norborneno. El sustrato portador funcionalizado puede ser cualquier sustrato con grupos funcionales superficiales que puedan reaccionar con los grupos funcionales en la lámina de polímero. En este caso, los grupos norborneno en el portaobjetos de vidrio pueden reaccionar con los grupos azido de PAZAM para formar enlaces covalentes entre la lámina de PAZAM y el sustrato. También se pueden usar otros sustratos portadores en el proceso de impresión por transferencia, por ejemplo, vidrio silanizado, plástico, metales, óxidos metálicos, etc. En la FIG. 3C, el portaobjetos de vidrio recubierto con norbornenosilano contiene cinco puntos de agua o solución tampón. El agua/tampón del sustrato portador se utiliza para rehidratar el hidrogel con el fin de realizar las reacciones superficiales posteriores, por ejemplo, el injerto de cebador.
Las FIG. 4A-4B ilustran imágenes fluorescentes de una célula de flujo tomadas con un generador de imágenes “ Typhoon” de GE Healthcare Lifesciences. La FIG. 4A muestra una imagen de Typhoon de una célula de flujo preparada mediante la transferencia de una lámina de PAZAM sin patrón sobre un portaobjetos de vidrio recubierto con norborneno y el posterior injerto de cebador e hibridación con tinte fluorescente de TET. La FIG. 4B muestra una imagen de Typhoon de una célula de flujo preparada mediante la transferencia de una lámina de PAZAM que tiene un patrón sobre un portaobjetos de vidrio recubierto con norborneno y el posterior injerto de cebador e hibridación con tinte fluorescente de TET. Las FIG.4A y 4B demuestran que la superficie es claramente funcional después del proceso de transferencia y la región de la matriz muestra una mayor intensidad de TET.
La FIG. 5A ilustra una vista en sección transversal de una lámina de polímero de hidrogel que tiene un patrón con postes, preparada según el proceso ilustrado en la FIG. 2. Las FIG. 5B y 5C son imágenes de MEB de una lámina de PAZAM que tiene un patrón nanométrico formada usando el proceso ilustrado en la FIG.2. La FIG.5B muestra postes de hidrogel de PAZAM que tienen un patrón de aproximadamente 400 nm de diámetro en una lámina de hidrogel suspendida a un espaciado de aproximadamente 700 nm. La FIG. 5C es una imagen ampliada de la FIG. 5B.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a procesos para preparar una superficie de sustrato que tiene un patrón para aplicaciones de secuenciación. En algunas realizaciones, el proceso puede incluir proporcionar un sustrato con una superficie que tiene un patrón, en donde la superficie incluye una pluralidad de depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica. Después, la composición de polímero se puede depositar sobre la superficie que tiene un patrón para formar una primera capa de polímero, en donde la composición de polímero llena las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica. Después, la primera capa de polímero de la superficie se separa de la superficie. Esto permite la retención de la composición de polímero aislada dentro de las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón. En algunas realizaciones, el proceso comprende, además, deshidratar la primera capa de polímero antes de separar la primera capa de polímero. En algunas realizaciones, puede ser necesario una etapa separada de incubación de la composición de polímero cuando se forma un enlace covalente entre la composición de polímero y la superficie de las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica.
En algunos casos, la composición de polímero se puede reemplazar parcial o completamente por una composición de monómero, una composición de prepolímero o una composición de precursor de polímero, en donde la reacción de polimerización se realiza in situ durante la conformación de la lámina de polímero.
En algunas realizaciones, la composición de polímero incluye una primera pluralidad de grupos funcionales seleccionados de cicloalquenos C8-14, heterocicloalquenos de 8 a 14 miembros, cicloalquinos C8-14, heterocicloalquinos de 8 a 14 miembros, alquinilo, vinilo, halo, azido, amino, amido, epoxi, glicidilo, carboxilo, hidrazonilo, hidrazinilo,
hidroxi, tetrazolilo, tetrazinilo, óxido de nitrilo, nitreno, nitrona, oxo-amino o tiol, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones adicionales, la primera pluralidad de grupos funcionales se selecciona de azido, alquinilo, amino, carboxilo, epoxi, glicidilo, halo o tetrazinilo, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En una realización, la primera pluralidad de grupos funcionales comprende azido.
En algunas realizaciones, la composición de polímero comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-coacrilamida) (PAZAM). En algunas realizaciones, se puede mezclar PAZAM con uno o más polímeros o hidrogeles en la preparación de la composición de polímero descrita en la presente memoria.
En algunas realizaciones, los procesos incluyen, además, injertar oligonucleótidos sobre la superficie de sustrato haciendo reaccionar oligonucleótidos funcionalizados con la primera pluralidad de grupos funcionales de la lámina de polímero.
En algunas realizaciones, la composición de polímero incluye un hidrogel. En alguna de dichas realizaciones, la composición de polímero se rehidrata antes de reaccionar con los oligonucleótidos.
La FIG. 6A es una imagen de MEB de una lámina de polímero que contiene un único poste a escala nanométrica de polímero. El resto de los postes a escala nanométrica se aíslan en las nanodepresiones de la superficie de sustrato.
La FIG. 6B es una vista en sección transversal de una separación rápida de una lámina de hidrogel de una superficie de sustrato que tiene un patrón según algunas realizaciones de la presente solicitud. En una realización específica, un sustrato 600B que contiene una placa de vidrio 601 subyacente y una superficie con nanodepresiones que tienen un patrón se deposita con una capa de composición de hidrogel. Después de deshidratar la composición de hidrogel, la lámina 603 de hidrogel formada se separa rápidamente de la superficie de la placa 601 de vidrio, dando como resultado el aislamiento de la composición 604 de hidrogel que tiene un patrón en las nanodepresiones del sustrato.
La FIG. 6C es una vista en sección transversal de una separación controlada de una lámina de hidrogel de una superficie de sustrato que tiene un patrón según algunas realizaciones de la presente solicitud. Similar a la realización mostrada en la FIG. 6B , un sustrato 600C que contiene una placa de vidrio 601 subyacente y una superficie con nanodepresiones que tienen un patrón se deposita con una capa de composición de hidrogel. Después de deshidratar la composición de hidrogel, la lámina 605 de hidrogel formada se separa de la superficie de la placa 601 de vidrio con fuerza controlada, dando como resultado la retención de las estructuras 604 que tienen un patrón transferidas desde la superficie 602 del sustrato a la lámina 605 de hidrogel.
En algunas realizaciones, los procesos incluyen, además, laminar una segunda capa de polímero directamente encima de la superficie que tiene un patrón después de separar la primera capa de polímero.
En algunas realizaciones, la segunda capa de polímero incluye una segunda pluralidad de grupos funcionales seleccionados de vinilo, acriloílo, alquenilo, alquinilo, cicloalquenos C8-14, heterocicloalquenos de 8 a 14 miembros, cicloalquinos C8-14, heterocicloalquinos de 8 a 14 miembros, nitreno, aldehído, hidrazinilo, glicidil éter, epoxi, amino, carbeno, isocianato o maleimida, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones adicionales, la segunda pluralidad de grupos funcionales se selecciona de alquinilo, acrilαlo, cicloalquenos C8-14, alquinilo, glicidil éter, epoxi o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos. En una realización, la segunda pluralidad de grupos funcionales comprende norborneno opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, la segunda capa de polímero se trata primero con un silano funcional o un derivado de silano antes de la laminación. El silano funcional o los derivados de silano proporcionan sitios reactivos en la superficie de la segunda lámina de polímero para la reacción con la composición de polímero aislada sobre la superficie que tiene un patrón del sustrato. En una realización, la superficie se trata con un norbornenosilano, por ejemplo, [(5-biciclo[2.2.1]hept-2-enil)etil]trimetoxisilano. Otros derivados de silano adecuados que se pueden usar en la presente solicitud se describen en la publicación estadounidense n.° 2015/0005447 A1.
En algunas realizaciones, la primera pluralidad de grupos funcionales de la composición de polímero reacciona con la segunda pluralidad de grupos funcionales de la segunda capa de polímero para formar enlaces covalentes. En algunas de dichas realizaciones, la composición de polímero se rehidrata antes de reaccionar con la segunda pluralidad de grupos funcionales.
En algunas de dichas realizaciones, los procesos incluyen, además, separar la segunda capa de polímero de la superficie que tiene un patrón después de que se forman enlaces covalentes entre la segunda capa de polímero y la primera pluralidad de grupos funcionales de la composición de polímero, dando como resultado la retirada de la composición de polímero de la depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica de la superficie de sustrato para formar postes de polímero que tienen un patrón en la segunda capa de polímero. En algunas realizaciones, la composición de polímero se deshidrata antes de separarse de las depresiones que tienen un patrón de la superficie de sustrato con la segunda capa de polímero.
En algunas realizaciones, la segunda capa de polímero es flexible o estirable. En algunas de dichas realizaciones, la segunda capa de polímero comprende polidimetilsiloxano (PDMS), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliacrilatos, ácidos poliacrílicos, poliuretanos, poliéteres, policarbonatos, polivinilos, poliimidas Kapton® o combinaciones y copolímeros de los mismos.
En algunas realizaciones, los procesos incluyen, además, injertar oligonucleótidos en la segunda capa de polímero haciendo reaccionar oligonucleótidos funcionalizados con la primera pluralidad de grupos funcionales de la lámina de polímero.
La FIG. 7A es una vista en sección transversal de un proceso de conformación de nanodepresiones rellenas de hidrogel sobre una superficie de sustrato según algunas realizaciones de la presente solicitud. En una realización específica, un sustrato 700 que contiene una placa de vidrio 701 subyacente y una superficie con nanodepresiones que tienen un patrón se deposita con una capa de composición 703 de hidrogel. Después de deshidratar la composición de hidrogel, la lámina 704 de hidrogel formada se separa rápidamente de la superficie de la placa 701 de vidrio, dando como resultado el aislamiento de la composición 705 de hidrogel que tiene un patrón en las nanodepresiones del sustrato.
La FIG.7B es una vista en sección transversal de un proceso de formación de una lámina flexible que contiene hidrogel que tiene un patrón. Primero, un sustrato 700B que contiene una composición 705 de hidrogel que tiene un patrón aislada en las nanodepresiones que tienen un patrón de una placa de vidrio 701 formada según el proceso descrito en la FIG. 7A se lamina con una lámina flexible 706 que contiene determinados grupos funcionales que son capaces de reaccionar con la composición 705 de hidrogel. Después de rehidratar la composición 705 de hidrogel, se forman enlaces covalentes entre la composición 705 de hidrogel y la lámina flexible 706 a través de la reacción de los grupos funcionales en la composición de hidrogel y los grupos funcionales en la lámina flexible. Después de deshidratar la composición 705 de hidrogel, una lámina flexible 707 recién formada que contiene hidrogel 705 que tiene un patrón unido covalentemente se despega de la placa 701 de vidrio. En algunas realizaciones, la lámina flexible 705 está hecha de materiales de polímero tales como copolímero de olefina cíclica (COC) o plástico.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a una superficie de sustrato para aplicaciones de secuenciación preparadas mediante los procesos descritos en la presente memoria.
Procesos de rollo a rollo y banda
Algunas realizaciones adicionales descritas en la presente memoria se refieren a procesos de rollo a rollo automatizados, por ejemplo, para aplicaciones de secuenciación. Este proceso puede incluir enrollar un rollo de láminas de polímero con o sin patrón preparadas mediante el proceso descrito en la presente memoria. Las láminas de polímero se pueden preparar para reacciones de secuenciación mediante el tratamiento con reactivos de secuenciación y después secuenciando una muestra en la lámina de polímero tratada. Después del tratamiento, la lámina de polímero se puede volver a enrollar después de completar un ciclo de secuenciación.
En algunas realizaciones, las láminas de polímero que se utilizan en un proceso de rollo a rollo son estirables. En consecuencia, los procesos automatizados pueden incluir, además, estirar la lámina de polímero durante la formación de imágenes en el ciclo de secuenciación.
En algunas realizaciones, la lámina de polímero comprende polidimetilsiloxano (PDMS), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliacrilatos, ácidos poliacrílicos, poliuretanos, poliéteres, policarbonatos, polivinilos, poliimidas Kapton® o combinaciones y copolímeros de los mismos.
La FIG.8 es una vista esquemática de un proceso de secuenciación a escala de fábrica automatizado que usa láminas flexibles de rollo a rollo que tienen un patrón con polímeros o hidrogeles compatibles para aplicaciones de secuenciación por síntesis (SBS, por sus siglas en inglés) preparadas mediante el proceso ilustrado en las FIG.7A y 7B. En cada ciclo de secuenciación, el rollo se alimenta a través del sistema a través de los diversos baños de reactivos de SBS (p. ej., incorporación, aclarado, desbloqueo secuencialmente) y se toma una imagen mediante el cabezal de lectura en el otro lado del sistema y se vuelve a enrollar. Después, el rollo se alimenta a través del sistema en la dirección opuesta para comenzar el siguiente ciclo de secuenciación.
La FIG. 9 ilustra la porción de un proceso de secuenciación de rollo a rollo automatizado representado en la FIG. 8 donde la lámina que tiene un patrón flexible se estira durante la formación de imágenes y se retrae después de la formación de imágenes. El uso de estas láminas que tienen un patrón estirables abre la posibilidad de preparar matrices de SBS de ultra alta densidad y después obtener imágenes de ellas usando ópticas de apertura numérica (AN) baja y de bajo coste. La creación de patrones de matrices de alta densidad con un área de superficie pequeña da como resultado la necesidad de una entrada de ADN y volúmenes de reactivos más bajos. Mediante el estiramiento de esta matriz de láminas flexibles, se aumenta el espaciado de la matriz y se reduce la interferencia entre grupos adyacentes, lo que permite el uso de ópticas de AN baja y de bajo coste. Para reducir la distorsión de la imagen, estas superficies se pueden deformar para compensar la aberración. Esta superficie de SBS flexible y estirable también se
puede envolver alrededor de la propia lente de formación de imágenes. Después de la formación de imágenes, se permite que la lámina se retraiga y continúa al siguiente ciclo de química de SBS.
Algunas realizaciones adicionales descritas en la presente memoria se refieren a procesos impulsados por banda automatizados, por ejemplo, para aplicaciones de secuenciación. Este proceso puede incluir impulsar una banda de láminas de polímero con o sin patrón preparadas mediante el proceso descrito en la presente memoria. Las láminas de polímero se pueden preparar para reacciones de secuenciación mediante el tratamiento con reactivos de secuenciación y después secuenciando una muestra en la lámina de polímero tratada. La banda puede realizar múltiples pasadas a través de un sistema de detección y suministro de fluidos, de manera que cada pasada constituya un ciclo de secuenciación. Se exponen métodos para formar y usar bandas para la secuenciación de ácidos nucleicos y otras aplicaciones que pueden modificarse para nosotros en la presente memoria, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0178285 A1.
En cualquiera de las realizaciones descritas, la deshidratación de la composición de polímero puede provocar que el volumen de la composición de polímero disminuya más de 20 veces, más de 15 veces, más de 10 veces, más de 5 veces o más de 2 veces, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.
En cualquiera de las realizaciones descritas de las láminas de polímero flexibles o estirables, la lámina se puede estirar aproximadamente 20 veces, aproximadamente 17,5 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 12,5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 7,5 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 2 veces o aproximadamente 1,5 veces su dimensión o longitud original, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.
En cualquiera de las realizaciones descritas, los patrones a escala micro o nanométrica de la superficie de sustrato pueden incluir canales, zanjas, depresiones, postes o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, al menos una porción de los patrones a escala micro o nanométrica son depresiones. En algunas de dichas realizaciones, las depresiones tienen un diámetro promedio de menos de aproximadamente 500 nm. En algunos casos, las depresiones que tienen un diámetro promedio de menos de aproximadamente 500 nm se denominan “ nanodepresiones” . En algunas de dichas realizaciones, las depresiones tienen un diámetro promedio de aproximadamente 330 nm o menos incluyendo, por ejemplo, menos de aproximadamente 300 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 100 nm o aproximadamente 50 nm, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas de dichas realizaciones, las depresiones tienen una altura promedio de menos de aproximadamente 500 nm. En algunas realizaciones adicionales, las depresiones tienen una altura promedio de aproximadamente 300 nm o menos incluyendo, por ejemplo, menos de aproximadamente 300 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 100 nm o aproximadamente 50 nm, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. Alternativamente o de forma adicional a los límites superiores ilustrativos, el diámetro promedio y/o la altura promedio de las depresiones puede ser como máximo de aproximadamente 1 mm, aproximadamente 500 μm, aproximadamente 100 μm, aproximadamente 1 μm, aproximadamente 500 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 300 nm, aproximadamente 200 nm o aproximadamente 100 nm, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.
Sustratos
En algunas realizaciones, los sustratos utilizados en la presente solicitud incluyen sustratos a base de sílice, tales como vidrio, sílice fundida y otros materiales que contienen sílice. En algunas realizaciones, los sustratos a base de sílice también pueden ser silicio, dióxido de silicio, nitruro de silicio, hidruros de silicona. En algunas realizaciones, los sustratos utilizados en la presente solicitud incluyen materiales plásticos tales como polietileno, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, nailon, poliésteres, policarbonatos y poli(metacrilato de metilo). Son materiales plásticos preferidos los sustratos de poli(metacrilato de metilo), poliestireno y polímero de olefina cíclica. En algunas realizaciones, el sustrato es un material a base de sílice o un material plástico. En una realización, el sustrato tiene al menos una superficie que comprende vidrio.
También se puede utilizar acrilamida, enona o acrilato como material de sustrato. Otros materiales de sustrato pueden incluir, aunque no de forma limitativa, arseniuro de galio, fosfuro de indio, aluminio, cerámica, poliimida, cuarzo, resinas, polímeros y copolímeros. Las listas anteriores pretenden ser ilustrativas de la presente solicitud, aunque no de forma limitativa.
En algunas realizaciones, el sustrato y/o la superficie de sustrato pueden ser cuarzo. En algunas otras realizaciones, el sustrato y/o la superficie de sustrato pueden ser semiconductores, es decir, GaAs o ITO.
Los sustratos pueden comprender un único material o una pluralidad de materiales diferentes. Los sustratos pueden ser compuestos o laminados. El sustrato puede ser plano, redondo, texturizado y que tiene un patrón. Los patrones se pueden formar, por ejemplo, mediante almohadillas metálicas que forman características en superficies no metálicas, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 8.778.849. Otra superficie que tiene un patrón útil es una que tiene características bien formadas en una superficie, por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2014/0243224 A1, la publicación de solicitud de patente
estadounidense n.° 2011/0172118 A1 o la patente estadounidense n.° 7.622.294. Para las realizaciones que utilizan un sustrato que tiene un patrón, se puede unir selectivamente un gel a las características del patrón (p. ej., el gel se puede unir a almohadillas metálicas o el gel se puede unir al interior de las depresiones) o, alternativamente, el gel se puede unir uniformemente tanto en las características de patrón y las regiones intersticiales.
Las ventajas de usar sustratos a base de plásticos en la preparación y el uso de matrices moleculares incluyen el coste: la preparación de sustratos a base de plásticos apropiados, por ejemplo, mediante moldeo por inyección, es generalmente menos cara que la preparación, p. ej., mediante grabado y unión, de sustratos a base de sílice. Otra ventaja es la diversidad casi ilimitada de plásticos que permiten ajustar con precisión las propiedades ópticas del soporte para adecuarlo a la aplicación para la que está destinado o al que puede destinarse.
Cuando se utilizan metales como sustratos o como almohadillas sobre un sustrato, esto puede deberse a la aplicación deseada: la conductividad de los metales puede permitir la modulación del campo eléctrico en sensores a base de ADN. De esta forma, se puede potenciar la discriminación de los errores de apareamiento del ADN, se puede ver afectada la orientación de las moléculas de oligonucleótidos inmovilizadas o se puede acelerar la cinética de hibridación del ADN.
El sustrato puede ser a base de sílice. Además, la conformación y la forma del sustrato empleado pueden variar según la aplicación para la que se pone en práctica la presente solicitud. Generalmente, sin embargo, los portaobjetos de material de soporte, tal como sílice, p. ej., sílice fundida, son de particular utilidad en la preparación y posterior integración de moléculas. De uso particular en la práctica de la presente solicitud son portaobjetos de sílice fundida comercializada con el nombre comercial SPECTRASIL™. No obstante, será evidente para el experto en la materia que la presente solicitud es igualmente aplicable a otras presentaciones de sustrato (incluyendo los soportes a base de sílice), tales como perlas, varillas y similares.
En algunas realizaciones, la superficie de sustrato comprende tanto regiones recubiertas con moléculas funcionales como regiones inertes sin recubrimientos. En algunos casos, los recubrimientos de moléculas funcionalizadas incluyen láminas de hidrogel o polímero descritas en la presente memoria. Las regiones recubiertas con moléculas funcionales pueden comprender sitios reactivos y, por lo tanto, se pueden usar para unir moléculas a través de enlaces químicos u otras interacciones moleculares. En algunas realizaciones, las regiones recubiertas con moléculas funcionales (p. ej., características reactivas, almohadillas, perlas o depresiones) y las regiones inertes (denominadas regiones intersticiales) pueden alternarse para formar un patrón o una cuadrícula. Dichos patrones pueden ser de una o dos dimensiones. En algunas realizaciones, las regiones inertes pueden seleccionarse de regiones de vidrio, regiones de metal, regiones de máscara o regiones intersticiales. Alternativamente, estos materiales pueden formar regiones reactivas. La inercia o la reactividad dependerán de la química y los procesos utilizados en el sustrato. En una realización, la superficie comprende regiones de vidrio. En otra realización, la superficie comprende regiones metálicas. En otra realización más, la superficie comprende regiones de máscara. Los materiales de sustrato ilustrativos no limitativos que se pueden recubrir con un polímero de la presente descripción o que se pueden usar de cualquier otra manera en una composición o un método expuestos en la presente memoria se describen en los n.° de serie estadounidenses 13/492.661 y US 13/661.524.
En algunas realizaciones, un sustrato descrito en la presente memoria forma al menos parte de una célula de flujo o está ubicado en una célula de flujo. En algunas de dichas realizaciones, las células de flujo comprenden, además, polinucleótidos unidos a la superficie de sustrato a través del recubrimiento de moléculas funcionales, por ejemplo, un recubrimiento de polímero. En algunos casos, el recubrimiento de polímero es una lámina de polímero descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos están presentes en las células de flujo en grupos de polinucleótidos, en donde los polinucleótidos de los grupos de polinucleótidos se unen a una superficie de la célula de flujo a través del recubrimiento de polímero o la lámina de polímero descritos en la presente memoria. En dichas realizaciones, la superficie del cuerpo de la célula de flujo a la que se unen los polinucleótidos se considera el sustrato. En otras realizaciones, se inserta en el cuerpo de la célula de flujo un sustrato separado que tiene una superficie recubierta con polímero. En realizaciones preferidas, la célula de flujo es una cámara de flujo que está dividida en una pluralidad de carriles o una pluralidad de sectores, en donde uno o más de la pluralidad de carriles o la pluralidad de sectores comprende una superficie que está recubierta con una lámina de polímero unida covalentemente descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones de las células de flujo descritas en la presente memoria, los polinucleótidos unidos dentro de un único grupo de polinucleótidos tienen la misma secuencia de nucleótidos o una similar. En algunas realizaciones de las células de flujo descritas en la presente memoria, los polinucleótidos unidos de diferentes grupos de polinucleótidos tienen secuencias de nucleótidos diferentes o no similares. Las células de flujo y los sustratos ilustrativos para la fabricación de células de flujo que se pueden usar en el método o la composición expuestos en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, los disponibles en el mercado en Illumina, Inc. (San Diego, CA) o descritos en las publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses n.° 2010/0111768 A1 o 2012/0270305 A1.
En algunas realizaciones, los sustratos utilizados en la presente solicitud son sustratos a base de sílice. En general, la superficie de un sustrato a base de sílice puede modificarse químicamente de alguna manera para unir covalentemente un grupo químicamente reactivo capaz de reaccionar con las moléculas funcionalizadas, por ejemplo, hidrogel, polímero o un hidrogel parcialmente conformado (p. ej., un prepolímero (PRP)). El agente activador de
superficie es típicamente un compuesto de organosilano. En una realización, el agente activador de superficie es y -metacriloxipropiltrimetoxisilano, conocido como “ Bind Silane” o “ Crosslink Silane” y disponible en el mercado en Pharmacia, aunque también se conocen otros agentes activadores de superficie a base de silicio, tales como monoetoxidimetilsililbutanal, 3-mercaptopropil-trimetoxisilano y 3-aminopropiltrimetoxisilano (todos disponibles en Aldrich). De esta manera, los grupos funcionales colgantes, tales como los grupos amino, los grupos aldehidro o los grupos polimerizables (p. ej., olefinas), pueden unirse a la sílice.
En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el sustrato se puede seleccionar de un sustrato de vidrio, un sustrato de sílice, un sustrato de cuarzo, un sustrato de plástico, un sustrato metálico, un sustrato de óxido metálico o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el sustrato es un sustrato de vidrio. En una realización, el sustrato es parte de una célula de flujo o está alojado dentro de una célula de flujo.
Aplicaciones de análisis de ácidos nucleicos
Se pueden usar muchas técnicas diferentes de amplificación de ADN junto con las células de flujo descritas en la presente memoria. Las técnicas ilustrativas que se pueden usar incluyen, aunque no de forma limitativa, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación de círculo rodante (RCA), la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) o la amplificación primaria aleatoria (RPA). En realizaciones particulares, uno o más cebadores utilizados para la amplificación se pueden unir a un recubrimiento de polímero. En las realizaciones de PCR, uno o ambos cebadores utilizados para la amplificación se pueden unir a un recubrimiento de polímero. Los formatos que utilizan dos especies de cebadores unidos frecuentemente se denominan amplificación puente porque los amplicones bicatenarios forman una estructura similar a un puente entre los dos cebadores adjuntos que flanquean la secuencia molde que se ha copiado. Se describen ejemplos de reactivos y condiciones que se pueden usar para la amplificación en puente, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.641.658; la publicación de patente estadounidense n.° 2002/0055100; la patente estadounidense n.° 7.115.400; la publicación de patente estadounidense n.° 2004/0096853; la publicación de patente estadounidense n.° 2004/0002090; la publicación de patente estadounidense n.° 2007/0128624; y la publicación de patente estadounidense n.° 2008/0009420. La amplificación por PCR también se puede realizar con uno de los cebadores de amplificación unido a un recubrimiento de polímero y el segundo cebador en solución. Un formato ilustrativo que usa una combinación de un cebador adjunto y un cebador soluble es la PCR en emulsión como se describe, por ejemplo, en Dressman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), el documento WO 05/010145 o la publicación de patente estadounidense n.° 2005/0130173 o 2005/0064460. La PCR en emulsión es ilustrativa del formato y se entenderá que para los fines de los métodos expuestos en la presente memoria, el uso de una emulsión es opcional y, de hecho, para varias realizaciones no se utiliza una emulsión. Además, los cebadores no necesitan unirse directamente al sustrato o a los soportes sólidos como se establece en las referencias de ePCR y, en su lugar, se pueden unir a un recubrimiento de polímero como se expone en la presente memoria.
Las técnicas de RCA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Los componentes ilustrativos que se pueden usar en una reacción de RCA y los principios por los cuales RCA produce amplicones se describen, por ejemplo, en Lizardi y col., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y el documento US 2007/0099208 A1. Los imprimadores utilizados para RCA pueden estar en solución o adheridos a un recubrimiento de polímero.
Las técnicas de MDA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Algunos principios básicos y condiciones útiles para MDA se describen, por ejemplo, en Dean y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002); Lage y col., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker y col., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker y col., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992); US 5,455,166; US 5,130,238; y US 6,214,587. Los imprimadores utilizados para MDA pueden estar en solución o adheridos a un recubrimiento de polímero.
En realizaciones particulares, se puede usar una combinación de las técnicas de amplificación ejemplificadas anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar RCA y MDA en una combinación en donde se utiliza RCA para generar un amplicón concatemérico en solución (p. ej., usando cebadores en fase de solución). Después, el amplicón se puede usar como molde para MDA usando cebadores que se unen a un recubrimiento de polímero. En este ejemplo, los amplicones producidos después de las etapas combinadas de RCA y MDA se unirán al recubrimiento de polímero.
En algunas realizaciones, el hidrogel funcionalizado o el sustrato recubierto con lámina de polímero descritos en la presente memoria se pueden usar para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. En dichas realizaciones, el método puede incluir las etapas de (a) poner en contacto una polinucleótido polimerasa con grupos de polinucleótidos unidos a una superficie de un sustrato a través de uno cualquiera de los recubrimientos de polímero o hidrogel descritos en la presente memoria; (b) proporcionar nucleótidos a la superficie recubierta con polímero del sustrato de manera que se genere una señal detectable cuando la polinucleótido polimerasa utiliza uno o más nucleótidos; (c) detectar señales en uno o más grupos de polinucleótidos; y (d) repetir las etapas (b) y (c), determinando de este modo una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido presente en uno o más grupos de polinucleótidos.
La secuenciación de ácidos nucleicos puede usarse para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido mediante diversos procesos conocidos en la técnica. En un método preferido, se utiliza la secuenciación
por síntesis (SBS) para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido unido a una superficie de un sustrato a través de uno cualquiera de los recubrimientos poliméricos descritos en la presente memoria. En dicho proceso, se proporcionan uno o más nucleótidos a un polinucleótido molde que está asociado a una polinucleótido polimerasa. La polinucleótido polimerasa incorpora uno o más nucleótidos en una cadena de ácido nucleico recién sintetizada que es complementaria al molde de polinucleótido. La síntesis se inicia a partir de un cebador oligonucleotídico que es complementario a una porción del polinucleótido molde o a una porción de un ácido nucleico universal o no variable que está unido covalentemente a un extremo del polinucleótido molde. A medida que los nucleótidos se incorporan contra el polinucleótido molde, se genera una señal detectable que permite determinar qué nucleótido se ha incorporado durante cada etapa del proceso de secuenciación. De esta forma, se puede generar la secuencia de un ácido nucleico complementario a al menos una porción del polinucleótido molde, lo que permite la determinación de la secuencia de nucleótidos de al menos una porción del polinucleótido molde.
Las células de flujo proporcionan un formato conveniente para albergar una matriz que se produce mediante los métodos de la presente descripción y que se somete a secuenciación por síntesis (SBS) u otra técnica de detección que implica el suministro repetido de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una célula de flujo que aloja una matriz de ácidos nucleicos fabricada mediante métodos expuestos en la presente memoria. Pueden detectarse aquellos sitios de una serie en los que la extensión del cebador provoca que se incorpore un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, puede añadirse a un iniciador un análogo de nucleótido que tenga una fracción de terminador reversible, de modo que no se produzca una extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar la fracción. Por lo tanto, para realizaciones que usan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la célula de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre las diversas etapas de suministro. Después, el ciclo se puede repetir n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando de este modo una secuencia de longitud n. Se describen procedimientos de SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección ilustrativos que pueden adaptarse fácilmente para su uso con una matriz producida mediante los métodos de la presente descripción, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), los documentos WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082. En realizaciones particulares, se pueden realizar métodos similares a los ejemplificados anteriormente para una célula de flujo usando una lámina de polímero en lugar de una célula de flujo. Por ejemplo, la lámina de polímero se puede proporcionar en un formato de rollo a rollo o de cinta para permitir el suministro repetido de reactivos a la superficie de la lámina de polímero similar al suministro repetido de reactivos a una célula de flujo. Se entenderá que en algunas realizaciones una lámina de polímero de la presente divulgación puede estar presente en una célula de flujo para todo o parte de un proceso de secuenciación.
Otros procedimientos de secuenciación que utilizan reacciones cíclicas pueden emplear una lámina de polímero, un sustrato u otra composición expuesta en la presente memoria, tal como la pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en una cadena de ácido nucleico naciente (Ronaghi, y col., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi y col. Science 281(5375), 363 (1998); los documentos US 6.210.891; US 6.258.568, y US 6.274.320. En la pirosecuenciación, el PPi liberado se puede detectar convirtiéndolo inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se puede detectar mediante fotones producidos por luciferasa. Por lo tanto, la reacción de secuenciación se puede controlar a través de un sistema de detección de luminiscencia. Las fuentes de radiación de excitación utilizadas para los sistemas de detección a base de fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Los sistemas fluídicos, detectores y procedimientos útiles que se pueden usar para la aplicación de pirosecuenciación a matrices de la presente descripción se describen, por ejemplo, en los documentos WO 12/058096 A1, US 2005/0191698 A1, US 7.595.883 y US 7.244.559.
Las reacciones de secuenciación por ligadura también se pueden realizar de manera útil en una lámina de polímero, sustrato u otra composición expuesta en la presente memoria, incluyendo, por ejemplo, las descritas en Shendure y col. Science 309:1728-1732 (2005); los documentos US 5.599.675; y US 5.750.341. Algunas realizaciones pueden incluir procedimientos de secuenciación por hibridación como se describe, por ejemplo, en Bains y col., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac y col., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor y col., Science 251(4995), 767-773 (1995); y el documento WO 1989/10977. Tanto en los procedimientos de secuenciación por ligadura como de secuenciación por hibridación, los ácidos nucleicos que están presentes en los sitios de una matriz se someten a ciclos repetidos de suministro y detección de oligonucleótidos. Los sistemas fluídicos para los métodos de SBS expuestos en la presente memoria o en las referencias citadas en la presente memoria se pueden adaptar fácilmente para el suministro de reactivos para procedimientos de secuenciación por ligadura o secuenciación por hibridación. Típicamente, los oligonucleótidos están marcados con fluorescencia y pueden detectarse usando detectores de fluorescencia similares a los descritos con respecto a los procedimientos de SBS en la presente memoria o en las referencias citadas en la presente memoria.
Algunas realizaciones que emplean una composición expuesta en la presente memoria pueden utilizar métodos que impliquen el control en tiempo real de la actividad de polimerasa de ADN. Por ejemplo, las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
(FRET) entre una polimerasa portadora de fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato o con guías de ondas de modo cero (ZMW, por sus siglas en inglés). Las técnicas y los reactivos para la secuenciación basada en FRET se describen, por ejemplo, en Levene y col. Science 299, 6 8 2 - 6 8 6 (2003); Lundquist y col. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008).
Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles comercialmente en Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; o US 2010/0282617 A1, cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad. Los ácidos nucleicos se pueden unir a una lámina de polímero, sustrato u otra composición expuesta en la presente memoria para la detección en un sistema o método de este tipo.
Otra aplicación útil para una composición de la presente descripción es, por ejemplo, parte del análisis de expresión génica. La expresión génica se puede detectar o cuantificar usando técnicas de secuenciación de ARN, tales como las denominadas secuenciación de ARN digital. Las técnicas de secuenciación de ARN se pueden realizar usando metodologías de secuenciación conocidas en la técnica, tales como las expuestas anteriormente. La expresión génica también se puede detectar o cuantificar usando técnicas de hibridación realizadas por hibridación directa con una lámina de polímero, sustrato u otra composición expuesta en la presente memoria o usando un ensayo múltiple, cuyos productos se detectan en una lámina de polímero, sustrato u otra composición expuesta en la presente memoria. Una composición de la presente divulgación, por ejemplo, que se haya producido mediante un método expuesto en la presente memoria, también se puede usar para determinar genotipos para una muestra de ADN genómico de uno o más individuos. Se describen métodos ilustrativos para el análisis de genotipado y expresión a base de matriz que se pueden realizar en una matriz de la presente descripción en las patentes estadounidenses n.° 7.582.420; 6.890.741; 6.913.884 o 6.355.431 o las publicaciones de patentes estadounidenses n.° 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 o US 2005/0181440 A1.
En algunas realizaciones del método descrito anteriormente, que emplean una lámina de polímero, un sustrato u otra composición expuesta en la presente memoria, sólo un único tipo de nucleótido está presente en la célula de flujo durante una única etapa de flujo. En dichas realizaciones, el nucleótido se puede seleccionar del grupo que consiste en dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos. En otras realizaciones del método descrito anteriormente que emplean una célula de flujo, hay presente una pluralidad de tipos diferentes de nucleótidos en la célula de flujo durante una única etapa de flujo. En dichos métodos, los nucleótidos se pueden seleccionar de dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos.
La determinación del nucleótido o nucleótidos incorporados durante cada etapa de flujo para uno o más de los polinucleótidos unidos al recubrimiento de polímero sobre la superficie de sustrato presente en la célula de flujo se logra mediante la detección de una señal producida en o cerca del molde de polinucleótido. En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la señal detectable comprende una señal óptica. En otras realizaciones, la señal detectable comprende una señal no óptica. En dichas realizaciones, la señal no óptica comprende un cambio en el pH en o cerca de uno o más de los moldes de polinucleótidos.
En cualquiera de las realizaciones de los métodos de secuenciación descritos en la presente memoria, el recubrimiento de polímero puede incluir las láminas de hidrogel o polímero descritas en la presente memoria.
Claims (15)
- REIVINDICACIONESi. Un proceso para preparar una lámina de polímero para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprende:proporcionar un sustrato con una superficie;depositar una capa de una composición de polímero sobre la superficie del sustrato, en donde la composición de polímero comprende grupos funcionales para injertar oligonucleótidos; conformar la composición de polímero en una lámina de polímero sobre la superficie; y retirar dicha lámina de polímero de la superficie del sustrato y en donde la conformación de la lámina de polímero comprende deshidratar la composición de polímero, en donde la composición de polímero comprende un hidrogel y la superficie del sustrato comprende patrones a escala micro o nanométrica y en donde una impresión de los patrones a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón se transfiere a la lámina de polímero para conformar una lámina de polímero que tiene un patrón.
- 2. El proceso de la reivindicación 1, en donde la composición de polímero comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM).
- 3. El proceso de la reivindicación 1 o 2, en donde la superficie del sustrato se trata con un fluorosilano antes de depositar la composición de polímero.
- 4. Un proceso para preparar una superficie de sustrato que tiene un patrón para aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, que comprende:proporcionar un sustrato con una superficie que tiene un patrón, en donde dicha superficie comprende una pluralidad de depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica; y depositar una composición de polímero sobre la superficie que tiene un patrón para conformar una primera capa de polímero, en donde la composición de polímero llena las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica;separar la primera capa de polímero, en donde la composición de polímero se aísla en las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón, comprendiendo, además, el proceso deshidratar la primera capa de polímero antes de separar la primera capa de polímero, en donde la composición de polímero comprende un hidrogel.
- 5. El proceso de la reivindicación 4, en donde la composición de polímero comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM).
- 6. El proceso de la reivindicación 4 o 5, en donde la composición de polímero comprende una primera pluralidad de grupos funcionales seleccionados de azido, alquinilo, amino, carboxilo, epoxi, glicidilo, halo o tetrazinilo, o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos, preferiblemente azido.
- 7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende, además, laminar una segunda capa de polímero directamente encima de la superficie que tiene un patrón después de separar la primera capa de polímero.
- 8. El proceso de la reivindicación 7, en donde la segunda capa de polímero comprende una segunda pluralidad de grupos funcionales seleccionados de alquinilo, acrilαlo, cicloalquenos C8-14, alquinilo, glicidil éter, epoxi o variantes opcionalmente sustituidas y combinaciones de los mismos, preferiblemente norborneno opcionalmente sustituido.
- 9. El proceso de la reivindicación 7 u 8, que comprende, además, unir covalentemente la primera pluralidad de grupos funcionales de la composición de polímero a la segunda pluralidad de grupos funcionales de la segunda capa de polímero.
- 10. El proceso de la reivindicación 9, que comprende, además, separar la segunda capa de polímero de la superficie que tiene un patrón, en donde la composición de polímero se retira de las depresiones que tienen un patrón a escala micro o nanométrica de la superficie que tiene un patrón para conformar postes de polímero que tienen un patrón en la segunda capa de polímero.
- 11. El proceso de la reivindicación 10, en donde la composición de polímero se deshidrata antes de separar la segunda capa de polímero de la superficie que tiene un patrón.
- 12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la segunda capa de polímero es estirable.
- 13. El proceso de la reivindicación 12, en donde el segundo polímero comprende polidimetilsiloxano (PDMS), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliuretanos, poliéteres, policarbonatos, polivinilos, poliimidas o combinaciones y copolímeros de los mismos.
- 14. Un proceso de rollo a rollo automatizado para aplicaciones de secuenciación, que comprende:preparar una capa de polímero que tiene un patrón según el proceso de la reivindicación 12; enrollar un rollo de capa de polímero que tiene un patrón;preparar la capa de polímero que tiene un patrón para la secuenciación mediante el tratamiento de la lámina de polímero con reactivos de secuenciación;secuenciar una muestra en la lámina de polímero que tiene un patrón tratada; y volver a enrollar la lámina de polímero que tiene un patrón después de completar un ciclo de secuenciación.
- 15. El proceso de rollo a rollo automatizado de la reivindicación 14, que comprende, además, estirar la lámina de polímero que tiene un patrón durante la formación de imágenes en el ciclo de secuenciación.
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