BR112019028058A2 - células de fluxo - Google Patents

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Jeffrey S. Fisher
Sang Park
Wayne N. George
Andrew A. Brown
Dajun Yuan
Brian D. Mather
Maria Candelaria Rogert Bacigalupo
Justin Fullerton
Ludovic Vincent
Lewis J. Kraft
Sahngki Hong
Boyan Boyanov
M. Shane Bowen
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Abstract

Um exemplo de uma célula de fluxo inclui um substrato; um primeiro conjunto de iniciadores anexado a uma primeira região no substrato, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; e um segundo conjunto de iniciadores ligado a uma segunda região no substrato, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.

Description

CÉLULAS DE FLUXO CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de Número de Série U.S. 62/692,511, depositado em 29 de junho de 2018 e do Pedido Provisório de Número de Série U.S. 62/743,373, depositado em 9 de outubro de 2018; o conteúdo de cada um dos quais é incorporado por referência aqui na sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTA DE SEQUÊNCIA
[0002] A Listagem de Sequências submetida através do EFS-Web é incorporada por referência na sua totalidade. O nome do arquivo é ILI172APCT IP-1806- PCT Sequence Listing ST25.txt, o tamanho do arquivo é 551 bytes e a data de criação do arquivo é 20 de maio de 2019.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Algumas plataformas disponíveis para sequenciamento de ácidos nucleicos utilizam uma abordagem de sequenciamento por síntese. Com esta abordagem, uma fita nascente é sintetizada e a adição de cada monômero (por exemplo, nucleotídeo) à fita em crescimento é detectada opticamente e/ou eletronicamente. Como uma cadeia modelo (template) direciona a síntese da cadeia nascente, pode-se inferir a sequência do DNA modelo a partir da série de monômeros de nucleotídeos que foram adicionados à cadeia crescente durante a síntese. Em alguns exemplos, o sequenciamento paired-end pode ser usado, onde as cadeias senso (forward) são sequenciadas e removidas, e as cadeias antisenso (reverse)são construídas e sequenciadas.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0004] Um primeiro aspecto aqui divulgado é uma célula de fluxo, compreendendo: um substrato; um primeiro conjunto de iniciadores anexados a uma primeira região no substrato, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; e um segundo conjunto de iniciadores anexados a uma segunda região no substrato, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
[0005] Em um exemplo do primeiro aspecto, a primeira região inclui um material tendo um primeiro grupo funcional; e a segunda região inclui um material tendo um segundo grupo funcional que é diferente do primeiro grupo funcional.
[0006] Em um exemplo do primeiro aspecto, a célula de fluxo compreende ainda uma lacuna que separa o primeiro conjunto de iniciadores do segundo conjunto de iniciadores.
[0007] Em um exemplo do primeiro aspecto, o substrato inclui depressões separadas por regiões intersticiais; e cada uma das depressões inclui: a primeira região localizada em uma primeira porção; e a segunda região localizada em uma segunda porção. Em uma versão deste exemplo, a célula de fluxo pode ainda compreender uma lacuna que separa a primeira região da segunda região. Em outra versão deste exemplo, a primeira região e a segunda região se sobrepõem parcialmente. Ainda em outra versão deste exemplo, a primeira e a segunda porções têm profundidades diferentes. Em uma versão adicional deste exemplo, a primeira e a segunda regiões são blocos diferentes de um copolímero de bloco.
[0008] Em um exemplo do primeiro aspecto, o substrato inclui depressões separadas por regiões intersticiais; cada uma das depressões inclui a primeira região; e a segunda região está localizada em pelo menos algumas das regiões intersticiais.
[0009] Em um exemplo do primeiro aspecto, a primeira região inclui um primeiro polímero e o primeiro conjunto de iniciadores é enxertado no primeiro polímero; e a segunda região inclui um segundo polímero e o segundo conjunto de iniciadores é enxertado no segundo polímero. Em uma versão deste exemplo, a célula de fluxo compreende ainda um revestimento protetor no primeiro conjunto de iniciadores e no primeiro polímero. Em outra versão deste exemplo, o primeiro polímero é uma primeira camada no substrato; o segundo polímero é uma segunda camada na primeira camada; a célula de fluxo compreende ainda: uma resina de passivação na segunda camada; e características definidas na resina de passivação, no segundo polímero e no primeiro polímero; e cada um dos primeiro e segundo conjuntos de iniciadores é exposto em cada um dos recursos.
[0010] Em um exemplo do primeiro aspecto, o substrato inclui depressões separadas por regiões intersticiais; cada uma das depressões inclui: uma primeira porção em que a primeira região está localizada; e uma segunda porção; e a célula de fluxo compreende ainda uma esfera localizada na segunda porção, em que a segunda região está em uma superfície da esfera.
[0011] Em um exemplo do primeiro aspecto, o primeiro iniciador clivável inclui um primeiro local de clivagem, o segundo iniciador clivável inclui um segundo local de clivagem, e o primeiro e o segundo locais de clivagem são de um tipo idêntico. Em uma versão deste exemplo, cada um do primeiro iniciador não clivável, o segundo iniciador clivável, o primeiro iniciador clivável e o segundo iniciador clivável incluem um respectivo ligante; o primeiro local de clivagem do primeiro iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante; e o segundo local de clivagem do segundo iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante.
[0012] Em um exemplo do primeiro aspecto, o primeiro iniciador clivável inclui um primeiro local de clivagem, o segundo iniciador clivável inclui um segundo local de clivagem, e o primeiro e o segundo locais de clivagem são de um tipo diferente. Numa versão deste exemplo, cada um do primeiro iniciador não clivável, o segundo iniciador clivável, o primeiro iniciador clivável e o segundo iniciador clivável incluem um respectivo ligante; o primeiro local de clivagem do primeiro iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante; e o segundo local de clivagem do segundo iniciador clivável está localizado ao longo do seu ligante.
[0013] Em um exemplo do primeiro aspecto, o primeiro conjunto de iniciadores é anexado a uma primeira estrutura de suporte; a primeira região é um primeiro site de captura anexado à primeira estrutura de suporte; o segundo conjunto de iniciadores é anexado a uma segunda estrutura de suporte que é diferente da primeira estrutura de suporte; e a segunda região é um segundo site de captura anexado à segunda estrutura de suporte.
[0014] Deve ser entendido que quaisquer características do primeiro aspecto divulgado neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis.
[0015] Um segundo aspecto divulgado neste documento é uma célula de fluxo compreendendo um primeiro substrato; um primeiro conjunto de iniciadores anexados ao primeiro substrato, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; um segundo substrato oposto ao primeiro substrato; e um segundo conjunto de iniciadores anexados ao segundo substrato, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
[0016] Deve ser entendido que quaisquer características do segundo aspecto podem ser combinadas de qualquer maneira desejável. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0017] Um terceiro aspecto divulgado neste documento é um kit que compreende uma célula de fluxo incluindo: um substrato incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma primeira camada de polímero em cada uma das depressões, em que alguns grupos funcionais da primeira camada de polímero são tapados; um primeiro conjunto de iniciadores ligado a outros grupos funcionais da primeira camada de polímero em cada uma das depressões; e uma segunda camada de polímero nas regiões intersticiais; e um fluido de preparação incluindo: um transportador de fluido; e um segundo conjunto de iniciadores diferente do primeiro conjunto de iniciadores.
[0018] Em um exemplo do terceiro aspecto, o primeiro conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; e o segundo conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
[0019] Deve ser entendido que quaisquer características do terceiro aspecto podem ser combinadas de qualquer maneira desejável. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do terceiro aspecto e/ou do segundo aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0020] Um quarto aspecto divulgado neste documento é um método que compreende a introdução de um fluido modelo (template) a uma célula de fluxo incluindo: um substrato incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma primeira camada de polímero em cada uma das depressões, em que os grupos funcionais expostos da primeira camada de polímero são tapados; um primeiro conjunto de iniciadores ligado à primeira camada de polímero em cada uma das depressões, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável; e uma segunda camada de polímero nas regiões intersticiais; em que um molde do fluido de modelo é amplificado para formar um cluster em pelo menos algumas das depressões; introduzir um fluido de iniciação, incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável, na célula de fluxo, em que o primeiro iniciador não clivável e o segundo iniciador clivável são enxertados na segunda camada de polímero; e iniciar a amplificação em ponte do cluster para o primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável, formando assim um segundo cluster em pelo menos algumas das regiões intersticiais.
[0021] Deve ser entendido que quaisquer características do quarto aspecto podem ser combinadas de qualquer maneira desejável. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do quarto aspecto e/ou do terceiro aspecto e/ou do segundo aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer dos exemplos aqui divulgados.
[0022] Um quinto aspecto aqui divulgado é um método, compreendendo: introduzir um fluido modelo a uma célula de fluxo, incluindo: um substrato incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma primeira camada de polímero em cada uma das depressões; um primeiro conjunto iniciadores ligado à primeira camada de polímero, o primeiro conjunto iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável; uma camada de revestimento protetora opcional na primeira camada de polímero e no primeiro conjunto iniciadores; uma segunda camada de polímero nas regiões intersticiais; e um segundo conjunto de iniciadores ligado à segunda camada de polímero, o segundo conjunto iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; em que um modelo do fluido de modelo é amplificado para formar um aglomerado em pelo menos algumas das depressões e em pelo menos algumas das regiões intersticiais; e clivar o primeiro iniciador clivável e o segundo iniciador clivável.
[0023] Deve ser entendido que quaisquer características do quinto aspecto podem ser combinadas de qualquer maneira desejável. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do quinto aspecto e/ou do terceiro aspecto e/ou do segundo aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto, e/ou pode ser combinada com qualquer dos exemplos aqui divulgados.
[0024] Um sexto aspecto aqui divulgado é uma célula de fluxo compreendendo um suporte; uma resina padronizada no suporte, a resina padronizada incluindo primeiras depressões e segundas depressões separadas por regiões intersticiais, as primeiras depressões tendo dimensões de abertura menores que as segundas depressões; um primeiro conjunto iniciadores ligado em pelo menos algumas das primeiras depressões; e uma esfera funcionalizada posicionada respectivamente em pelo menos algumas das segundas depressões, a esfera funcionalizada incluindo um segundo conjunto iniciadores anexado a uma superfície de uma estrutura de núcleo, em que o segundo conjunto iniciadores é diferente do primeiro conjunto iniciadores.
[0025] Em um exemplo do sexto aspecto, a estrutura do núcleo da esfera funcionalizada é selecionada do grupo que consiste em dióxido de silício, um material superparamagnético, poliestireno e um acrilato.
[0026] Em um exemplo do sexto aspecto, a resina padronizada é selecionada do grupo que consiste em uma resina à base de resina oligomérica poliédrica de silsesquioxano (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli (etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilatoy uma resina de metacrilato e suas combinações.
[0027] Em um exemplo do sexto aspecto, a célula de fluxo compreende ainda um polímero nas primeiras depressões e nas segundas depressões, e em que o primeiro conjunto de iniciadores está ligado ao polímero nas pelo menos algumas das primeiras depressões. Em uma versão deste exemplo, a esfera funcionalizada está posicionada no polímero nas pelo menos algumas das segundas depressões. Em outra versão deste exemplo, o primeiro conjunto de iniciadores também está ligado ao polímero nas pelo menos algumas das segundas depressões; e a esfera funcionalizada é posicionada no primeiro conjunto de iniciadores nas pelo menos algumas das segundas depressões.
[0028] Em um exemplo do sexto aspecto, o primeiro conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador e um segundo iniciador modificado por uracila; e o segundo conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador modificado por uracila e um segundo iniciador.
[0029] Deve ser entendido que quaisquer características do sexto aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis.
[0030] Um sétimo aspecto aqui divulgado é uma célula de fluxo compreendendo um suporte; uma resina padronizada no suporte, a resina padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; um primeiro conjunto de iniciadores ligado a pelo menos algumas das depressões; e uma esfera funcionalizada posicionada em pelo menos algumas das depressões, de modo que pelo menos alguns iniciadores do primeiro conjunto de iniciadores sejam expostos, a esfera funcionalizada incluindo um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma superfície de uma estrutura de núcleo, em que o segundo conjunto de iniciadores é diferente do primeiro conjunto de iniciadores.
[0031] Em um exemplo do sétimo aspecto, cada uma das depressões inclui uma primeira porção com uma primeira dimensão de abertura que é maior que ou igual a um diâmetro da esfera funcionalizada e uma segunda porção com uma segunda dimensão de abertura que é menor que o diâmetro da esfera funcionalizada; e a esfera funcionalizada é posicionada na primeira porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões.
[0032] Em um exemplo do sétimo aspecto, a estrutura central da esfera funcionalizada é selecionada do grupo que consiste em dióxido de silício, um material superparamagnético, poliestireno e um acrilato.
[0033] Em um exemplo do sétimo aspecto, a resina padronizada é selecionada do grupo que consiste em uma resina à base de resina oligomérica poliédrica de silsesquioxano (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli (etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato e suas combinações.
[0034] Em um exemplo do sétimo aspecto, a célula de fluxo compreende ainda um polímero nas depressões. Em uma versão deste aspecto, o primeiro conjunto de iniciadores é fixado a uma porção do polímero desocupada pela esfera funcionalizada. Em um exemplo desta versão, o primeiro conjunto de iniciadores é anexado ao polímero nas depressões; e a esfera funcionalizada é posicionada em alguns outros iniciadores do primeiro conjunto de iniciadores.
[0035] Deve ser entendido que quaisquer características do sétimo aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis.
[0036] Um oitavo aspecto aqui divulgado é um método que compreende aplicar seletivamente um polímero nas depressões de uma resina padronizada em um suporte; enxertar um primeiro conjunto de iniciadores no polímero em pelo menos algumas das depressões; e antes ou depois de enxertar o primeiro conjunto de iniciadores, depositar esferas funcionalizadas i) em uma porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões, ou ii) nas segundas depressões com dimensões de abertura maiores que as pelo menos algumas das depressões, as esferas funcionalizadas incluindo um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma superfície de uma estrutura de núcleo, em que o primeiro e o segundo conjuntos de iniciadores são diferentes.
[0037] Em um exemplo do oitavo aspecto, em que antes de depositar as esferas funcionalizadas, o método compreende ainda formar as esferas funcionalizadas anexando o segundo conjunto de iniciadores à estrutura do núcleo.
[0038] Em um exemplo do oitavo aspecto, a porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões tem uma dimensão de abertura que é maior que ou igual ao diâmetro de cada uma das esferas funcionalizadas; as pelo menos algumas das depressões incluem uma segunda porção interconectada com a porção, onde a segunda porção tem uma segunda dimensão de abertura que é menor que o diâmetro de cada uma das esferas funcionalizadas; e as esferas funcionalizadas se auto-montam na porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões por exclusão de tamanho.
[0039] Em um exemplo do oitavo aspecto, em que antes de aplicar seletivamente o polímero, o método compreende ainda formar a resina padronizada no suporte por: depositar uma resina no suporte; e padronizar a resina usando litografia por nanoimpressão (nanoimprint).
[0040] Deve ser entendido que quaisquer características do oitavo aspecto pode ser combinado de qualquer maneira desejável. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do oitavo aspecto e/ou do sétimo aspecto e/ou do sexto aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer dos exemplos aqui divulgados.
[0041] Um nono aspecto divulgado neste documento é uma célula de fluxo compreendendo um suporte; uma resina padronizada no suporte, a resina padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; um copolímero em bloco na resina padronizada nas depressões, cada bloco do copolímero em bloco tendo um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco do copolímero em bloco; e um iniciador ligado ao grupo funcional específico do bloco de pelo menos um dos blocos.
[0042] Em um exemplo do nono aspecto, a resina padronizada é selecionada do grupo que consiste em uma resina à base de resina oligomérica poliédrica de silsesquioxano (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli (etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilatoy, uma resina de metacrilato e suas combinações. Em uma versão deste exemplo, a resina padronizada é a resina baseada em POSS e em que a resina baseada em POSS é uma resina POSS de epóxi reticulada. Em outra versão deste exemplo, o copolímero em bloco inclui: um primeiro bloco incluindo um monômero de acrilamida tendo um grupo amino como seu grupo funcional específico do bloco; e um segundo bloco incluindo um monômero de azido acetamido pentil acrilamida tendo um grupo azido como seu grupo funcional específico do bloco. Em um exemplo desta outra versão, o copolímero de bloco é:
Os AX XY N3
NH NH, É ÚÓ P
OR NH O NH ] x
AA VOA MN VR
RI ANA vv An NS /m em que R é hidrogênio ou um grupo final de espécies iniciadoras de polímero, n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000. Ainda em outra versão deste exemplo, o copolímero em bloco é: x n m N3 em que n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000.
[0043] Em um exemplo do nono aspecto, a resina padronizada é um fluoropolímero amorfo. Em uma versão deste exemplo, o copolímero em bloco inclui: um primeiro bloco incluindo um monômero tendo um grupo trifluorometil como seu grupo funcional específico do bloco; e um segundo bloco incluindo um monômero que tem um grupo funcional de enxerto primário como seu grupo funcional específico do bloco.
[0044] Em um exemplo do nono aspecto, o copolímero em bloco inclui: um primeiro bloco incluindo um monômero com um grupo funcional de enxerto primário como seu grupo funcional específico do bloco; e um segundo bloco incluindo um monômero para ajustar um parâmetro de interação para conduzir a separação de fases do primeiro e do segundo blocos. Em uma versão deste exemplo, o grupo funcional de enxerto primário é um grupo azido; e o grupo funcional específico do bloco do monômero do segundo bloco é selecionado do grupo que consiste em um grupo amino, um grupo álcool, um grupo aril e um grupo carregado.
[0045] Em um exemplo do nono aspecto, o copolímero em bloco é um terpolímero incluindo um primeiro bloco, um segundo bloco e um terceiro bloco; o grupo funcional específico do bloco do primeiro bloco é anexado à resina padronizada; o grupo funcional específico do bloco do segundo bloco está ligado ao iniciador; e o grupo funcional específico do bloco do terceiro bloco é anexado a um outro iniciador diferente do iniciador ou a uma enzima.
[0046] Em um exemplo do nono aspecto, o copolímero em bloco é um terpolímero que inclui um primeiro bloco, um segundo bloco e um terceiro bloco; o grupo funcional específico do bloco do primeiro bloco é anexado à resina padronizada; o grupo funcional específico do bloco do segundo bloco está ligado ao iniciador; e o grupo funcional específico do bloco do terceiro bloco afeta uma energia livre de superfície do copolímero de bloco ou afeta a estabilidade do copolímero de bloco.
[0047] Em um exemplo do nono aspecto, em que as depressões são selecionadas do grupo que consiste em poços e valas.
[0048] Em um exemplo do nono aspecto, a resina padronizada e o copolímero em bloco têm uma energia livre de superfície dentro de um intervalo de cerca de 25 mN/m a cerca de 50 mN/m.
[0049] Deve ser entendido que quaisquer características do nono aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do nono aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0050] Um décimo aspecto aqui divulgado é uma célula de fluxo compreendendo um suporte; uma resina à base de silsesquioxano poliédrico padronizado (POSS) no suporte, a resina à base de POSS padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; copolímero de bloco segregado na resina à base de POSS padronizada nas depressões, em que um bloco do copolímero de bloco segregado tem um grupo funcional anexado à resina à base de POSS padronizada e um outro bloco do copolímero de bloco segregado tem um outro grupo funcional; e um iniciador ligado ao outro grupo funcional.
[0051] Em um exemplo do décimo aspecto, o copolímero de bloco segregado é selecionado do grupo que consiste em: x n m i) N3 em que n varia de 1 a 10.000, em varia de 1 a 10.000; e y N;
NH NH> Ó J ) O. NH O. NH
Y Y R-/ Tv À ATX R VA Zn À m ii) em que R é hidrogênio ou um grupo final de espécies iniciadoras de polímero, n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000.
[0052] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo aspecto e/ou do nono aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0053] Um décimo primeiro aspecto divulgado neste documento é um método que compreende padronizar uma resina para formar uma resina padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; introduzir uma solução incluindo um copolímero em bloco na resina padronizada, cada bloco do copolímero em bloco tendo um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco do copolímero em bloco; expor a solução ao anelamento de vapor de solvente, pelo qual a fase de copolímero em bloco se separa e se auto-monta nas depressões; e enxertar um iniciador no grupo funcional específico do bloco de pelo menos um dos blocos.
[0054] Em um exemplo do décimo primeiro aspecto, o padrão da resina envolve litografia por nanoimpressão.
[0055] Em um exemplo do décimo primeiro aspecto, a solução incluindo o copolímero em bloco tem um parâmetro de interação Flory-Huggins variando de cerca de 0,04 a cerca de 0,30.
[0056] Em um exemplo do décimo primeiro aspecto, em que antes do enxerto, o método compreende ainda expor a resina padronizada, incluindo o copolímero em bloco separado por fase e auto-montado nas depressões, a um processo de cura.
[0057] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo primeiro aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo primeiro aspecto e/ou do décimo aspecto e/ou do nono aspecto e/ou do primeiro aspecto pode ser usada em conjunto e/ou pode ser combinada com qualquer dos exemplos aqui divulgados.
[0058] Um décimo segundo aspecto aqui divulgado é um método que compreende aplicar uma primeira camada funcionalizada em um substrato; padronizar a primeira camada funcionalizada, formando, assim, uma primeira região funcionalizada coberta por um fotorresistente; aplicar uma segunda camada funcionalizada no fotorresistente e nas porções do substrato; levantar o fotorresistente e qualquer uma da segunda camada funcionalizada sobre o mesmo; remover uma porção da segunda camada funcionalizada, formando, assimy uma segunda região funcionalizada adjacente à primeira região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
[0059] Em um exemplo do décimo segundo aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve pré- enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada antes da primeira camada funcionalizada ser aplicada; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve pré-enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada antes da segunda camada funcionalizada ser aplicada.
[0060] Em um exemplo do décimo segundo aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada após a sua aplicação; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada após a sua aplicação.
[0061] Em um exemplo do décimo segundo aspecto, o método compreende ainda: depositar, respectivamente, uma primeira monocamada auto-montada na primeira região funcionalizada e uma segunda monocamada auto-montada na segunda região funcionalizada; em que a ligação do primeiro conjunto de iniciadores inclui enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira monocamada auto-montada; e em que a fixação do segundo conjunto de iniciadores inclui enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda monocamada auto-montada.
[0062] Em um exemplo do décimo segundo aspecto, em que a remoção envolve: aplicar um segundo fotorresistente na primeira região funcionalizada e uma segunda porção da segunda camada funcionalizada que deve se tornar a segunda região funcionalizada; e gravar a porção da segunda camada funcionalizada.
[0063] Em um exemplo do décimo segundo aspecto, o substrato inclui uma resina em um suporte; a resina inclui depressões separadas por regiões intersticiais; a primeira região funcionalizada está em uma primeira porção de cada depressão; a segunda camada funcionalizada está em uma segunda porção de cada depressão e nas regiões intersticiais; e a remoção envolve o polimento da segunda camada funcionalizada das regiões intersticiais.
[0064] Em um exemplo do décimo segundo aspecto, o substrato inclui uma resina em um suporte; a resina inclui depressões de vários níveis separadas por regiões intersticiais; a primeira região funcionalizada está no primeiro nível de cada depressão multinível; e antes da aplicar a segunda camada funcionalizada, o método compreende ainda: aplicar uma camada sacrificial no fotorresistente e nas porções da resina; remover a camada sacrificial das porções da resina; e remover uma região da resina da depressão multicamada para criar uma área que é adjacente à primeira região funcionalizada; e a segunda camada funcionalizada é aplicada na camada sacrifical no fotorresistente, na área e nas regiões intersticiais.
[0065] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo segundo aspecto divulgado neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo segundo aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0066] Um décimo terceiro aspecto divulgado neste documento é um método que compreende aplicar um primeiro fotorresistente em um substrato, de modo que uma primeira porção de substrato seja exposta; aplicar uma primeira camada funcionalizada no fotorresistente e na primeira porção de substrato; levantar o fotorresistente e qualquer uma da primeira camada funcionalizada sobre o mesmo, formando, assim, uma primeira região funcionalizada na primeira porção de substrato; aplicar um segundo fotorresistente na primeira região funcionalizada e no substrato, de modo que uma segunda porção de substrato adjacente à primeira região funcionalizada seja exposta; aplicar uma segunda camada funcionalizada no segundo fotorresistente e na segunda porção de substrato; levantar o segundo fotorresistente e qualquer uma da segunda camada funcionalizada sobre o mesmo, formando, assim, uma segunda região funcionalizada adjacente à primeira região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
[0067] Em um exemplo do décimo terceiro aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve pré- enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada antes da primeira camada funcionalizada ser aplicada; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve pré-enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada antes da segunda camada funcionalizada ser aplicada.
[0068] Em um exemplo do décimo terceiro aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada após a sua aplicação; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada após a sua aplicação.
[0069] Em um exemplo do décimo terceiro aspecto, o método compreende ainda depositar, respectivamente, uma primeira monocamada auto-montada na primeira região funcionalizada e uma segunda monocamada auto-montada na segunda região funcionalizada; em que a fixação do primeiro conjunto de iniciadores inclui enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira monocamada auto-montada; e em que a ligação do segundo conjunto de iniciadores inclui enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda monocamada auto-montada.
[0070] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo terceiro aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo terceiro aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0071] Um décimo quarto aspecto divulgado neste documento é um método que compreende aplicar uma primeira camada funcionalizada em um substrato incluindo valas separadas por regiões intersticiais e uma região de material sacrificial em uma primeira porção de cada uma das valas; padronizar a primeira camada funcionalizada, formando, assim, uma primeira região funcionalizada coberta por um fotorresistente em uma segunda porção de cada uma das valas; remover a região do material sacrificial para expor a primeira porção de cada uma das valas; aplicar uma segunda camada funcionalizada nas regiões intersticiais, na primeira porção e no fotorresistente; levantar o fotorresistente e qualquer uma da segunda camada funcionalizada sobre o mesmo; remover qualquer uma da segunda camada funcionalizada das regiões intersticiais, em que uma segunda região funcionalizada permanece na primeira porção de cada uma das valas; aplicar um segundo fotorresistente em um padrão de faixas espacialmente separadas que são pelo menos substancialmente perpendiculares às valas; remover porções das primeiras regiões funcionalizadas e das segundas regiões funcionalizadas que são expostas entre as faixas espacialmente separadas; remover o segundo fotorresistente; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou às primeiras regiões funcionalizadas e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou às segundas regiões funcionalizadas, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
[0072] Em um exemplo do décimo quarto aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve pré- enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada antes da primeira camada funcionalizada ser aplicada; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve pré-enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada antes da segunda camada funcionalizada ser aplicada.
[0073] Em um exemplo do décimo quarto aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada após a sua aplicação; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada após a sua aplicação.
[0074] Em um exemplo do décimo quarto aspecto, o substrato inclui uma segunda região de material sacrificial na segunda porção de cada uma das valas; o substrato, a região do material sacrificial e a segunda região do material sacrificial têm diferentes taxas de gravação e antes de aplicar a primeira camada funcionalizada, o método compreende ainda remover a segunda região do material sacrificial da segunda porção de cada uma das valas. Em uma versão deste exemplo, em que antes da remoção da segunda região do material sacrificial, o método compreende ainda formar a região do material sacrificial e a segunda região do material sacrificial, por: aplicar um material sacrificial no substrato, incluindo as valas separadas pelas regiões intersticiais; remover uma porção do material sacrificial, de modo que uma região do material sacrificial permaneça diretamente adjacente a cada parede lateral de cada uma das valas; aplicar um segundo material sacrificial no substrato e nas regiões do material sacrificial; remover uma porção do segundo material sacrificial, de modo que uma região do segundo material sacrificial permaneça diretamente adjacente a cada uma das regiões do material sacrificial; e aplicar um material para preencher quaisquer espaços entre as segundas regiões do material sacrificial. Em um exemplo desta versão, o substrato é um substrato de várias camadas; as valas são definidas em uma camada mais externa do substrato multicamada; e o material e a camada mais externa são os mesmos.
[0075] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo quarto aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo quarto aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0076] Um décimo quinto aspecto divulgado neste documento é um método que compreende aplicar de um material sacrificial a um substrato incluindo depressões separadas pelas primeiras regiões intersticiais, em que cada depressão inclui uma porção profunda e uma porção rasa definida por uma porção de etapa e em que a camada sacrificial parcialmente preenche a porção profunda; remover sequencialmente uma porção da camada sacrificial e uma porção do substrato para formar segundas regiões intersticiais que estão pelo menos substancialmente niveladas com uma porção restante da camada sacrificial e remover a porção da etapa para formar uma área próxima à porção restante da camada sacrificial; aplicar uma primeira camada funcionalizada nas segundas regiões intersticiais, a porção restante da camada sacrificial e a área; aplicar um fotorresistente na primeira camada funcionalizada; remover uma porção do fotorresistente e uma porção subjacente da primeira camada funcionalizada, de modo que a porção restante da camada sacrificial e as segundas regiões intersticiais sejam expostas, e uma porção da primeira camada funcionalizada com uma segunda porção do fotorresistente nela permaneça na área; remover a porção restante da camada sacrificial para uma segunda área próxima à porção da primeira região funcionalizada; aplicar uma segunda camada funcionalizada à área, formando assim uma segunda região funcionalizada; levantar a segunda porção do fotorresistente, formando assim uma primeira região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
[0077] Em um exemplo do décimo quinto aspecto, a segunda camada funcionalizada também é aplicada à segunda porção do fotorresistente e segunda região intersticial; uma primeira porção da segunda camada funcionalizada é removida com a segunda porção do fotorresistente; e o método compreendendo ainda o polimento da segunda camada funcionalizada das segundas regiões intersticiais.
[0078] Em um exemplo do décimo quinto aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve pré- enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada antes primeira camada funcionalizada ser aplicada; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve pré-enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada antes da segunda camada funcionalizada ser aplicada.
[0079] Em um exemplo do décimo quinto aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada após a sua aplicação; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada após a sua aplicação.
[0080] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo quinto aspecto divulgado neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo quinto aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0081] Um décimo sexto aspecto divulgado neste documento é um método que compreende imprimir um substrato de várias camadas, incluindo: um suporte; uma primeira camada funcionalizada no suporte; uma segunda camada funcionalizada na primeira camada funcionalizada; e uma camada de passivação na segunda camada funcionalizada; formando, desse modo, recursos separados por regiões intersticiais da camada de passivação, em que uma região de cada uma das primeira e segunda camadas funcionalizadas é exposta em cada recurso; anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
[0082] Em um exemplo do décimo sexto aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve pré- enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira camada funcionalizada antes que a primeira camada funcionalizada seja incorporada no substrato de múltiplas camadas; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve pré-enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada antes que a segunda camada funcionalizada seja incorporada ao substrato de múltiplas camadas.
[0083] Em um exemplo do décimo sexto aspecto, a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira região funcionalizada em cada depressão; e a ligação do segundo conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda região funcionalizada em cada depressão.
[0084] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo sexto aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo sexto aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0085] Um décimo sétimo aspecto divulgado neste documento é um método que compreende imprimir uma primeira resina para formar uma depressão, incluindo uma porção profunda e uma porção rasa definida por uma porção de etapa, em que a primeira resina é posicionada em uma camada sacrificial que é posicionada em uma segunda resina; gravar uma primeira porção da primeira resina e uma porção da camada sacrificial subjacente à porção profunda, expondo, assim, uma porção da segunda resina; gravar a parte da etapa, expondo, assim, uma segunda porção da camada sacrificial; aplicar uma primeira camada funcionalizada à porção da segunda resina para formar uma primeira região funcionalizada; remover a segunda porção da camada sacrificial, expondo assim uma segunda porção da segunda resina; aplicar uma segunda camada funcionalizada à segunda porção da segunda resina para formar uma segunda região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
[0086] Em um exemplo do décimo sétimo aspecto, durante a aplicação da segunda camada funcionalizada, a segunda camada funcionalizada é depositada nas regiões intersticiais ao redor da depressão e não é depositada na primeira região funcionalizada; e o método compreende ainda o polimento da segunda camada funcionalizada das regiões intersticiais.
[0087] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo sétimo aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo sétimo aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0088] Um décimo oitavo aspecto divulgado neste documento é um método que compreende anexar um primeiro conjunto de iniciadores a uma primeira estrutura de suporte; anexar um segundo conjunto de iniciadores a uma segunda estrutura de suporte, em que o segundo conjunto de iniciadores e a segunda estrutura de suporte são diferentes do que o primeiro conjunto de iniciadores e a primeira estrutura de suporte; e carregar a primeira e a segunda estruturas de suporte em uma superfície de substrato tendo uma pluralidade de primeiros locais de captura para fixar seletivamente às primeiras estruturas de suporte e uma pluralidade de segundos locais de captura para fixar seletivamente às segundas estruturas de suporte.
[0089] Deve ser entendido que quaisquer características do décimo oitavo aspecto divulgadas neste documento podem ser combinadas de qualquer maneira e/ou configuração desejáveis. Além disso, deve ser entendido que qualquer combinação de características do décimo oitavo aspecto e/ou do primeiro aspecto e/ou do segundo aspecto pode ser combinada com qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0090] Características de exemplos da presente divulgação se tornarão aparentes por referência à seguinte descrição detalhada e desenhos, nos quais números de referência semelhantes correspondem a componentes semelhantes, embora talvez não idênticos. Por uma questão de brevidade, os números ou características de referência com uma função descrita anteriormente podem ou não ser descritos em conexão com outros desenhos nos quais eles aparecem.
[0091] Figs. 1A a 1D são vistas esquemáticas de diferentes exemplos de primeiro e segundo conjuntos de iniciadores ligados à primeira e à segunda região em um substrato;
[0092] A Fig. 2 é uma vista esquemática em seção transversal de um exemplo da primeira e segunda regiões em uma superfície de substrato;
[0093] Figs. 3A e 3B são, respectivamente, uma vista esquemática em seção transversal e uma vista superior de um exemplo da primeira e segunda regiões em uma depressão;
[0094] Figs. 4A a 4C são vistas esquemáticas em seção transversal de diferentes exemplos da primeira e segunda regiões na depressão;
[0095] Fig. 5 é uma vista esquemática em seção transversal de um exemplo da primeira região na depressão e da segunda região em uma superfície de substrato;
[0096] Figs. 6A e 6B são, respectivamente, uma vista esquemática em seção transversal e uma vista superior de um exemplo da primeira região na depressão e da segunda região em uma superfície de substrato;
[0097] Figs. 7A a 7G são vistas esquemáticas em seção transversal que, juntas, representam um exemplo de um método para fazer um exemplo de célula de fluxo incluindo um exemplo da primeira região na depressão e da segunda região na superfície do substrato;
[0098] Figs. 8A a 8F são vistas esquemáticas em seção transversal que, juntas, representam outro exemplo de método para fazer outro exemplo de célula de fluxo, incluindo um exemplo da primeira região na depressão e da segunda região na superfície do substrato;
[0099] Fig. 9 é uma vista esquemática em seção transversal de um exemplo da primeira região na depressão e da segunda região como parte de uma esfera que está posicionado na depressão;
[0100] Fig. 10 é uma vista esquemática em seção transversal de um exemplo de primeiro e segundo conjuntos de iniciadores ligados a substratos separados;
[0101] Figs. 11A a 11C são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam a formação de um exemplo de uma resina padronizada em um suporte;
[0102] Figs. 11A, 11B e 11D são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam a formação de outro exemplo de uma resina padronizada em um suporte;
[0103] A Fig. 12 é um fluxograma que ilustra um exemplo de um método divulgado neste documento;
[0104] Figs. 13A a 13D são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam um exemplo do método aqui divulgado usando o substrato padronizado da Fig. 11C;
[0105] A Fig. 14 é uma vista em seção transversal feito ao longo da linha 4-4 da Fig. 13D;
[0106] Figs. 15A a 15D são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam outro exemplo do método aqui divulgado usando o substrato padronizado da Fig. 11C;
[0107] A Fig. 16 é uma vista em seção transversal feito ao longo da linha 6-6 da Fig. 15D;
[0108] Figs. 17A a 17D são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam um exemplo do método aqui divulgado usando o substrato padronizado da Fig. 11D;
[0109] A Fig. 18 é uma vista em seção transversal feito ao longo da linha 8-8 da Fig. 17D;
[0110] Figs. 19A a 19D são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam outro exemplo do método aqui divulgado usando o substrato padronizado da Fig. 11D;
[0111] A Fig. 20 é uma vista em seção transversal feito ao longo da linha 10-10 da Fig. 19D;
[0112] A Fig. 21 é um fluxograma que ilustra outro exemplo de um método divulgado neste documento;
[0113] Figs. 22A a 22E são vistas esquemáticas em perspectiva que juntas representam um exemplo do outro método aqui divulgado;
[0114] A Fig. 22F é uma vista ampliada de uma depressão de um exemplo de uma célula de fluxo mostrada em 22E, em que a depressão inclui um copolímero em bloco e um iniciador enxertado em um bloco;
[0115] Figs. 23A e 23B são vistas esquemáticas de cima de exemplos de depressões e regiões intersticiais circundantes, onde diferentes exemplos de copolímeros de blocos são auto-montados e fase separados nas depressões, onde cada figura mostra um padrão diferente dos blocos;
[0116] A Fig. 24 representa uma vista esquemática em perspectiva de um exemplo de uma célula de fluxo aqui divulgada;
[0117] Figs. 25A e 25B são vistas esquemáticas em seção transversal representando diferentes exemplos das células de fluxo aqui divulgadas que incluem copolímeros tribloco;
[0118] Figs. 26A a 26H são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas na Fig. 2;
[0119] Figs. 27A a 27F são vistas esquemáticas que juntas ilustram outro método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas na Fig. 2;
[0120] Figs. 28A a 27G são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas nas Figs. 3A e 3B;
[0121] Figs. 29A a 29H são vistas esquemáticas que juntas ilustram outro método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas nas Figs. 3A e 3B;
[0122] Figs. 30A a 30F são vistas esquemáticas que juntas ilustram ainda um exemplo de método para formar as regiões de exemplo mostradas nas Figs. 3A e 3B;
[0123] Figs. 31A a 311 são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas nas Figs. 3A e 3B;
[0124] Figs. 32A a 32F são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas na Fig. 4C;
[0125] A Fig. 33A é uma vista esquemática de um método de exemplo para formar outro exemplo das regiões aqui divulgadas;
[0126] A Fig. 33B é uma vista superior de uma das depressões da Fig. 33A, ilustrando as regiões;
[0127] Figs. 34A a 34S são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo em valas; e
[0128] Fig. 35 ilustra esquematicamente um exemplo de estruturas de suporte funcionalizadas;
[0129] Figs. 36A e 36B são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo usando as estruturas de suporte funcionalizadas da Fig. 35;
[0130] Figs. 37A e 37B são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo para formar as regiões de exemplo usando as estruturas de suporte funcionalizadas da Fig. 35;
[0131] Figs. 38A e 38B são vistas esquemáticas que juntas ilustram um método de exemplo envolvendo outro exemplo de um copolímero em bloco;
[0132] Fig. 39º é uma imagem de microscopia eletrônica de varredura (SEM) de um substrato de célula de fluxo com depressões de diâmetro de 50 um separadas por regiões intersticiais, com uma camada de polímero pré- enxertada depositada nela;
[0133] Fig. 39B é uma imagem em SEM do substrato da célula de fluxo da Fig. 39A com uma camada de proteção depositada na camada polimérica pré-enxertada;
[0134] Fig. 39C é uma imagem em SEM do substrato da célula de fluxo da Fig. 39B após a gravação para remover a camada de proteção das regiões intersticiais;
[0135] Figs. 40A e 40B representam a análise de dados para uma leitura pareada das extremidades (paired end read) simultânea (Fig. 40A) e uma leitura pareada das extremidades sequencial (Fig. 40B);
[0136] Figs. 41A a 41G são vistas esquemáticas que juntas ilustram outro método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas na Fig. 2; e
[0137] Figs. 42A a 42H são vistas esquemáticas que juntas ilustram ainda outro método de exemplo para formar as regiões de exemplo mostradas na Fig. 2.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0138] Exemplos das células de fluxo aqui divulgadas podem ser usadas para sequenciamento de ácido nucleico.
[0139] Algumas das células de fluxo incluem diferentes conjuntos de iniciadores ligados a diferentes regiões do substrato da célula de fluxo. Nestes exemplos, os conjuntos de iniciadores podem ser controlados de modo que a química da clivagem (linearização) seja ortogonal nas diferentes regiões. A química de clivagem ortogonal pode ser realizada através de locais de clivagem idênticos que estão ligados a diferentes iniciadores nos diferentes conjuntos, ou através de diferentes locais de clivagem que estão ligados a diferentes iniciadores nos diferentes conjuntos. Isso permite que um grupo de cadeias senso seja gerado em uma região do substrato e um grupo de cadeias antisenso seja gerado em outra região do substrato. Em um exemplo, as regiões estão diretamente adjacentes uma à outra. Em outro exemplo, qualquer espaço entre as regiões é pequeno o suficiente para que o agrupamento possa abranger as duas regiões. Com algumas das configurações de célula de fluxo aqui divulgadas, as cadeias senso e antisenso são espacialmente separadas, o que separa os sinais de fluorescência de ambas as leituras enquanto permite a chamada de base simultânea de cada leitura. Como tal, alguns exemplos das células de fluxo aqui divulgadas permitem que leituras paired-end sejam obtidas.
[0140] Outros exemplos de células de fluxo podem ser usados para obter leituras paired-end simultâneas; ou podem ser usados para obter leituras paired-end sequenciais, onde as cadeias senso são sequenciadas e removidos e, então, as cadeias antisenso são sequenciadas e removidas. Nestes outros exemplos, uma resina padronizada em um suporte de célula de fluxo é revestida com um copolímero em bloco que sofre auto-montagem direcionada em depressões da resina padronizada. A resina padronizada serve como um guia para o arranjo do copolímero em bloco. Sob condições controladas,
o copolímero em bloco se auto-monta em domínios específicos. Em alguns dos exemplos aqui divulgados, a funcionalidade dos domínios é controlada para ser ortogonal, de modo que um ou mais domínios possam reagir com a resina padronizada e um ou mais outros domínios possam enxertar iniciador(es). Em alguns exemplos, a funcionalidade de um domínio pode ser controlada para alterar uma característica desse domínio. Estes exemplos de células de fluxo podem ser adequados para uso com métodos de detecção ópticos ou não ópticos. Definições
[0141] Deve ser entendido que os termos aqui utilizados terão seu significado comum no estado da técnica relevante, a menos que especificado de outra forma. Vários termos usados aqui e seus significados são apresentados abaixo.
[0142] As formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0143] Os termos compreendendo, incluindo, contendo e várias formas desses termos são sinônimos entre si e devem ser igualmente amplos.
[0144] Os termos superior, inferior, em baixo, em cima, ligado etc. são usados aqui para descrever a célula de fluxo e/ou os vários componentes da célula de fluxo. Deve ser entendido que esses termos direcionais não significam uma orientação específica, mas são usados para designar uma orientação relativa entre os componentes. O uso de termos direcionais não deve ser interpretado para limitar os exemplos aqui divulgados a qualquer orientação (ões)
específica(s).
[0145] Um "monômero de acrilamida" é um monômero com o Ah, R : : a estrutura ou um monômero incluindo um grupo acrilamida com essa estrutura. Exemplos do monômero incluindo um grupo acrilamida incluem azido acetamido pentil acrilamida:
ON Í
NH ? 4 e N-isopropilacrilamida: O CH; HE A, 3 H . Outros monômeros de acrilamida podem ser usados.
[0146] Um aldeído, como usado aqui, é um composto orgânico contendo um grupo funcional com a estrutura -CHO, que inclui um centro de carbonila (isto é, um carbono com dupla ligação ao oxigênio) com o átomo de carbono também ligado ao hidrogênio e um Grupo R, tal como um alquil ou outra cadeia lateral. A estrutura geral de um aldeído é:
O Ê RH,
[0147] Como aqui utilizado, "alquil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que é totalmente saturada (isto é, não contém ligações duplas ou triplas). O grupo alquil pode ter 1 a 20 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquil incluem metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, butil terciário, pentil, hexil e semelhantes. Como um exemplo, a designação “alquil C1-4” indica que existem de um a quatro átomos de carbono na cadeia alquil, ou seja, a cadeia alquil é selecionada do grupo que consiste em metil, etil, propil, isopropil, n-butil, isobutil, sec-butil e t-butil.
[0148] Como aqui utilizado, "alquenil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações duplas. O grupo alquenil pode ter 2 a átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenil incluem etenil, propenil, butenil, pentenil, hexenil e similares.
[0149] Como aqui utilizado, "alquino" ou "alquinil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações triplas. O grupo alquinil pode ter 2 a 20 átomos de carbono.
[0150] Como usado neste documento, "aril" refere-se a um anel ou sistema de anéis aromáticos (isto é, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos de carbono adjacentes) contendo apenas carbono na cadeia principal do anel. Quando o aril é um sistema de anéis, todos os anéis no sistema são aromáticos. O grupo aril pode ter 6 a 18 átomos de carbono. Exemplos de grupos aril incluem fenil, naftil, azulenil e antracenil.
[0151] Um grupo funcional "amino" refere-se a um grupo -NRkR6r, em que R, e R, são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio (por exemplo, NH), alquil Cl-6, alquenil C2-6, alquinil C2-6, carbociclil C3-7 , aril C6-10, heteroaril com 5-10 membros e heterociclil com 5-10 membros, como aqui definido.
[0152] Como usado aqui, o termo "anexado" refere-se ao estado de duas coisas sendo unidas, presas, aderidas, conectadas ou ligadas entre si, direta ou indiretamente. Por exemplo, uma esfera que é anexada a uma depressão pode estar fisicamente aprisionada na depressão. Para outro exemplo, um ácido nucleico pode ser anexado a um polímero funcionalizado por uma ligação covalente ou não covalente. Uma ligação covalente é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre átomos. Uma ligação não covalente é uma ligação física que não envolve o compartilhamento de pares de elétrons e pode incluir, por exemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de van der Waals, interações hidrofílicas e interações hidrofóbicas. Para ainda outro exemplo, um iniciador pode ser anexado a uma região no substrato através de uma estrutura de suporte.
[0153] Um grupo funcional "azida" ou "azido" refere- se a -N;:.
[0154] Os termos "esfera" ou "estrutura do núcleo" de uma esfera funcionalizada se referem à um corpo pequeno feito de um material rígido ou semi-rígido. O corpo pode ter uma forma caracterizada, por exemplo, como uma esfera, oval, microesfera ou outra forma de partícula reconhecida, possuindo dimensões regulares ou irregulares. Exemplos de materiais que são úteis para esferas/estruturas de núcleo incluem, sem limitação, vidro; plástico como acrílico,
poliestireno ou um copolímero de estireno e outro material, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretano ou politetrafluoretileno (TEFLONO, da Chemours); polissacarídeos ou polissacarídeos reticulados, como agarose ou Sepharose; nylon; nitrocelulose; resina; sílica ou materiais à base de sílica, incluindo silício e silício modificado; fibra de carbono, metal; vidro inorgânico; pacote de fibra óptica ou uma variedade de outros polímeros. Exemplos de esferas/estruturas de núcleo incluem esferas de vidro de poro controlado, esferas paramagnéticas, thoria sol, esferas de Sepharose, nanocristais e outros conhecidos no estado da técnica como descrito, por exemplo, no Microsphere Detection Guide da Bangs Laboratories, Fishers Ind. Esferas também podem ser revestidas com um polímero que possui um grupo funcional que pode ser anexado a um iniciador.
[0155] Um "copolímero em bloco" é um copolímero formado quando dois ou mais monômeros se agrupam e formam blocos de unidades repetidas. Cada bloco deve ter pelo menos uma característica e/ou pelo menos um grupo funcional específico do bloco que não esteja(m) presente em blocos adjacentes. Nos exemplos aqui divulgados, os copolímeros em bloco são capazes, quando expostos a condições particulares de anelamento, de se auto-montar em domínios ordenados em dimensões em escala nanométrica por separação em microfase dos blocos de polímero constituintes. Exemplos específicos de copolímeros em bloco serão descritos mais adiante.
[0156] Um "grupo funcional específico de bloco" refere-se a uma fração de átomos e/ou ligações dentro de um bloco específico do polímero em bloco que tem uma funcionalidade específica, como reagir com uma resina padronizada, anexar um iniciador, ajustar um parâmetro de interação para conduzir a separação por microfase, alterando uma característica do copolímero em bloco, etc. Em alguns exemplos divulgados neste documento, cada bloco inclui um grupo funcional específico de bloco diferente. Exemplos específicos de cada grupo funcional específico de bloco serão descritos mais adiante.
[0157] Como aqui utilizado, uma "região de ligação" refere-se a uma área em um suporte que deve ser ligado a outro material, que pode ser, como exemplos, uma camada espaçadora, uma tampa, outro substrato, etc. ou combinações dos mesmos (por exemplo, uma camada espaçadora e uma tampa). A ligação que é formada na região de ligação pode ser uma ligação química (como descrito acima) ou uma ligação mecânica (por exemplo, usando um prendedor, etc.).
[0158] Um "local de captura", como aqui utilizado, refere-se à porção de uma superfície de célula de fluxo tendo sido fisicamente modificada e/ou modificada com uma propriedade química que permite a localização de uma estrutura de suporte funcionalizada. Em um exemplo, o local de captura pode incluir um agente de captura química.
[0159] Como aqui utilizado, "carbociclil" significa um anel ou sistema de anéis cíclicos não aromáticos contendo apenas átomos de carbono na cadeia principal do sistema de anéis. Quando o carbociclil é um sistema de anéis, dois ou mais anéis podem ser unidos de maneira fundida, em ponte ou conectado em espiral. Os carbociclis podem ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel em um sistema de anéis não seja aromático. Assim, os carbociclis incluem cicloalquis, cicloalquenis e cicloalquinis. O grupo carbociclil pode ter 3 a 20 átomos de carbono. Exemplos de anéis carbociclil incluem ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclohexil, ciclohexenil, 2,3-di-hidro-indeno, biciclo[2.2.2] octanil, adamantila e espiro[4.4] nonanil.
[0160] Como usado aqui, o termo "ácido carboxílico" ou "carboxil", conforme usado aqui, refere-se a -COOH.
[0161] Um "agente de captura química" é um material, molécula ou porção que é capaz de anexar, reter ou se ligar a uma molécula alvo (por exemplo, uma estrutura de suporte funcionalizada). Um exemplo de agente de captura química inclui um ácido nucleico de captura (por exemplo, um oligonucleotídeo de captura) que é complementar a pelo menos uma porção de um ácido nucleico alvo de ou anexado à molécula alvo. Ainda outro exemplo de agente de captura química inclui um membro de um par de ligação receptor-ligante (por exemplo, avidina, estreptavidina, biotina, lectina, carboidrato, proteína de ligação de ácido nucleico, epítopo, anticorpo, etc.) que é capaz de se ligar à molécula alvo (ou a uma porção de ligação anexada à molécula alvo). Ainda outro exemplo do agente de captura química é um reagente químico capaz de formar uma interação eletrostática, uma ligação de hidrogênio ou uma ligação covalente (por exemplo, troca de tiol-dissulfeto, química de cliques, Diels-Alder, etc.) com a molécula alvo.
[0162] Como usado neste documento, "cicloalquileno" significa um anel ou sistema de anéis de carbociclil totalmente saturado que é anexado ao restante da molécula por meio de dois pontos de fixação.
[0163] Como aqui utilizado, "cicloalquenil" ou "cicloalqueno" significa um anel ou sistema de anéis de carbociclil tendo pelo menos uma ligação dupla, em que nenhum anel no sistema de anéis é aromático. Exemplos incluem ciclohexenil ou ciclohexeno e norbornenil ou norborneno. Também como aqui utilizado, "heterocicloalquenil" ou "heterocicloalqueno" significa um anel ou sistema de anéis de carbociclil com pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel, tendo pelo menos uma ligação dupla, em que nenhum anel no sistema de anéis é aromático.
[0164] Como usado neste documento, "cicloalquinil" ou "cicloalquino" significa um anel ou sistema de anéis carbociclil tendo pelo menos uma ligação tripla, em que nenhum anel no sistema de anéis é aromático. Um exemplo é o ciclooctino. Outro exemplo é o biciclononina. Também como aqui utilizado, "heterocicloalquinil" ou "heterocicloalquino" significa um anel ou sistema de anéis de carbociclil com pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel, tendo pelo menos uma ligação tripla, em que nenhum anel no sistema de anéis é aromático.
[0165] O termo "depósito", como aqui utilizado, refere-se a qualquer técnica de aplicação adequada, que pode ser manual ou automatizada e, em alguns casos, resulta em modificação das propriedades da superfície. Geralmente, o depósito pode ser realizado utilizando técnicas de deposição a vapor, técnicas de revestimento, técnicas de enxerto ou similares. Alguns exemplos específicos incluem deposição química a vapor (CVD), revestimento por spray (por exemplo, revestimento por spray ultrasônico), revestimento por centrifugação (spin coating), dunk ou dip coating, doctor blade coating, puddlie dispensing, flow through coating , aerosol printing, screen printing, impressão por microcontato (microcontact printing), jato de impressão por tinta (inkjet printing) ou similares.
[0166] Como aqui utilizado, o termo "depressão" refere-se a uma característica côncava discreta em um substrato ou em uma resina padronizada com uma abertura de superfície que é pelo menos parcialmente circundada por região (ões) intersticiais do substrato ou da resina padronizada. As depressões podem ter uma variedade de formas nas suas aberturas em uma superfície, incluindo, por exemplo, redondo, elíptico, quadrado, poligonal, em forma de estrela (com qualquer número de vértices) etc. A seção transversal de uma depressão tomada ortogonalmente com a superfície pode ser curva, quadrada, poligonal, hiperbólica, cônica, angular etc. Como exemplos, a depressão pode ser um poço ou dois poços interconectados. A depressão também pode ter arquiteturas mais complexas, como cristas, elementos em degrau, etc.
[0167] O termo "cada", quando usado em referência a uma coleção de itens, destina-se a identificar um item individual na coleção, mas não se refere necessariamente a todos os itens da coleção. Exceções podem ocorrer se a divulgação explícita ou o contexto determinar claramente o contrário.
[0168] O termo "epóxi" (também chamado como um grupo glicidil ou oxirano), conforme aqui utilizado, refere-se a o o Pu O,
[0169] Como aqui utilizado, o termo "célula de fluxo" pretende significar um vaso tendo uma câmara (isto é, canal de fluxo) onde uma reação pode ser realizada, uma entrada para fornecimento de reagente(s) à câmara e uma saída para remoção do reagente(s) da câmara. Em alguns exemplos, a câmara permite a detecção da reação que ocorre na câmara. Por exemplo, a câmara/canal de fluxo pode incluir uma ou mais superfícies transparentes, permitindo a detecção óptica de matrizes, moléculas marcadas opticamente, ou similares, na depressão.
[0170] Como usado neste documento, um "canal de fluxo" pode ser uma área definida entre dois componentes ligados, que pode receber seletivamente uma amostra líquida. Em alguns exemplos, o canal de fluxo pode ser definido entre uma resina padronizada e uma tampa e, portanto, pode estar em comunicação fluida com uma ou mais depressões definidas na resina padronizada.
[0171] Uma "estrutura de suporte funcionalizada" refere-se a um pequeno corpo feito de um material rígido ou semi-rígido que possui um dos conjuntos de iniciadores aqui divulgados anexados à sua superfície. O corpo pode ter uma forma caracterizada, por exemplo, como uma esfera, oval, microesfera ou outra forma de partícula reconhecida, possuindo dimensões regulares ou irregulares. Exemplos de materiais que são úteis para o corpo incluem, sem limitação, vidro; plástico como acrílico, poliestireno ou um copolímero de estireno e outro material, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretano ou politetrafluoretileno (TEFLONGO, da Chemours); polissacarídeos ou polissacarídeos reticulados, tal como agarose ou Sepharose; nylon; nitrocelulose; resina; sílica ou materiais à base de sílica, incluindo silício e silício modificado; fibra de carbono, metal; vidro inorgânico; pacote de fibra óptica ou uma variedade de outros polímeros.
[0172] Como usado aqui, "heteroaril" refere-se a um anel ou sistema de anéis aromático (ou seja, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos adjacentes) que contêm um ou mais heteroátomos, ou seja, um elemento que não seja carbono, incluindo mas não se limitando a,, nitrogênio, oxigênio e enxofre, na cadeia principal do anel. Quando o heteroaril é um sistema de anéis, todos os anéis no sistema são aromáticos. O grupo heteroaril pode ter 5-18 membros no anel.
[0173] Como aqui utilizado, "heterociclil" significa um anel ou sistema de anéis cíclicos não aromáticos contendo pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel. Os heterociclis podem ser unidos de maneira fundida, em ponte ou conectada em espiral. Os heterociclis podem ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel no sistema de anéis não seja aromático. No sistema de anéis, o(s heteroátomo (s) podem estar presentes em um anel não aromático ou aromático. O grupo heterociclil pode ter de 3 a 20 membros no anel (isto é, o número de átomos que compõem acadeia principal do anel, incluindo átomos de carbono e heteroátomos). Em alguns exemplos, o(s) heteroátomo(s) são
O, Nou S.
[0174] O termo "hidrazina" ou "hidrazinil", conforme aqui utilizado, refere-se a um grupo -NHNH,;.
[0175] Conforme usado neste documento, o termo "hidrazona" ou "hidrazonil'", conforme aqui utilizado, x “E
À refere-se a um grupo R; Rb no qual R, e R, são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquil Cl1-6, alquenil C2-6, alquinil C2-6, carbociclil C3- 7, aril C6-10, heteroaril com 5-10 membros e heterociclil com 5-10 membros , conforme aqui definido.
[0176] Como usado aqui, "hidróxi" ou "hidroxil" refere-se a um grupo -OH.
[0177] Como aqui utilizado, o termo "região intersticial" refere-se a uma área, por exemplo, de um substrato, resina padronizada ou outro suporte que separa depressões. Por exemplo, uma região intersticial pode separar uma depressão de uma matriz de outra depressão da matriz. As duas depressões que são separadas uma da outra podem ser discretas, ou seja, falta de contato físico umas com a outra. Em muitos exemplos, a região intersticial é contínua, enquanto as depressões são discretas, por exemplo, como é o caso de uma pluralidade de depressões definidas em uma outra forma superfície contínua. Em outros exemplos, as regiões intersticiais e as características são discretas por exemplo, como é o caso de uma pluralidade de valas separadas pelas respectivas regiões intersticiais. A separação fornecida por uma região intersticial pode ser separação parcial ou total. As regiões intersticiais podem ter um material de superfície que difere do material de superfície das depressões definidas na superfície. Por exemplo, as depressões podem ter um polímero e um primeiro conjunto de iniciadores nele, e as regiões intersticiais podem ter um polímero e um segundo conjunto de iniciadores nele. Por outro exemplo, as depressões de uma matriz podem ter esferas enquanto as regiões intersticiais não têm esferas nelas.
[0178] "Óxido de nitrila, como aqui utilizado, significa um grupo "R.C=N*O0" no qual R. é aqui definido. Exemplos de preparação de óxido de nitrila incluem geração in situ a partir de aldoximas por tratamento com cloramida- T ou por ação da base em cloretos de imidoílo [RC(Cl)=NOH] ou pela reação entre hidroxilamina e um aldeído.
[0179] "Nitrona", como usado aqui, significa um R3 | Na R no 1 grupo R2 no qual Ri, Rz e R; podem ser qualquer um dos grupos R. e R, aqui definidos.
[0180] Como aqui utilizado, um "nucleotídeo" inclui uma base heterocíclica contendo nitrogênio, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. Os nucleotídeos são unidades monoméricas de uma sequência de ácido nucleico. No RNA, o açúcar é uma ribose e, no DNA, o açúcar é uma desoxirribose, isto é, um açúcar faltando um grupo hidroxila que está presente na posição 2' da ribose. A base heterocíclica contendo nitrogênio (isto é, nucleobase) pode ser uma base de purina ou uma base de pirimidina. As bases de purina incluem adenina (A) e guanina (G) e seus derivados ou análogos modificados. As bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U) e derivados ou análogos modificados dos mesmos. O átomo C-1 de desoxirribose está ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um análogo de ácido nucleico pode ter qualquer da cadeia principal de fosfato, açúcar ou nucleobase alterados. Exemplos de análogos de ácidos nucleicos incluem, por exemplo, bases universais ou análogos da cadeia principal de açúcar fosfato-açúcar, tais como ácido nucleico peptídico (PNA) .
[0181] Uma "resina padronizada" refere-se a qualquer polímero que pode ter depressões definidas nela. Exemplos específicos de resinas e técnicas para padronizar as resinas serão descritos mais adiante. Em alguns exemplos aqui divulgados, a resina padronizada pode servir como um modelo de orientação (guiding template) para um copolímero em bloco se auto-montar nela. Exemplos específicos de características que tornam um polímero um "modelo de orientação" serão descritos mais adiante.
[0182] Como usado aqui, o "iniciador" é definido como uma sequência de ácido nucleico de fita simples (por exemplo, DNA de fita simples ou RNA de fita simples). Alguns iniciadores, aqui referidos como iniciadores de amplificação, servem como ponto de partida para amplificação de modelos e geração de agrupamentos. Outros iniciadores, aqui referidos como iniciadores de sequenciamento, servem como ponto de partida para a síntese de DNA ou RNA. O terminal 5' do iniciador pode ser modificado para permitir uma reação de acoplamento com um grupo funcional de um polímero ou com uma superfície da esfera. O tamanho do iniciador pode ter qualquer número de bases e pode incluir uma variedade de nucleotídeos não naturais. Em um exemplo, o iniciador de sequenciamento é uma cadeia curta, variando de 10 a 60 bases ou de 20 a 40 bases.
[0183] Uma "camada espaçadora", conforme aqui utilizado, refere-se a um material que liga dois componentes. Em alguns exemplos, a camada espaçadora pode ser um material absorvedor de radiação que auxilia na ligação ou pode ser colocado em contato com um material absorvedor de radiação que auxilia na ligação.
[0184] "Anelamento de solvente" ou "anelamento de vapor de solvente" envolve a exposição de um polímero (por exemplo, na forma de um filme ou camada) a um excesso de solvente em um compartimento vedado para gerar um vapor saturado (por exemplo, uma atmosfera de solvente) acima do polímero. O filme ou camada de polímero pode ser mantido à temperatura ambiente (por exemplo, de cerca de 18ºC a cerca de 25ºC) ou a uma temperatura elevada, o que faz com que o polímero inche e aumente a sua mobilidade em cadeia.
[0185] O termo "substrato" refere-se a uma estrutura sobre a qual vários componentes da célula de fluxo (por exemplo, um polímero, iniciador (es), etc.) podem ser adicionados. O substrato pode ser uma pastilha, um painel, uma folha retangular, uma matriz ou qualquer outra configuração adequada. O substrato é geralmente rígido e é insolúvel em um líquido aquoso. O substrato pode ser inerte a uma química que é usada para modificar as depressões ou que está presente nas depressões. Por exemplo, um substrato pode ser inerte à química usada para formar o polímero, anexar o(s) iniciador(es), etc. O substrato pode ser uma estrutura de camada única ou uma estrutura de várias camadas (por exemplo, incluindo um suporte e uma resina padronizada no suporte). Exemplos de substratos adequados serão descritos mais adiante.
[0186] Um grupo funcional "tiol" refere-se a -SH.
[0187] Como usado aqui, os termos "tetrazina" e "tetrazinil" referem-se ao grupo heteroaril de seis membros que compreende quatro átomos de nitrogênio. A tetrazina pode ser opcionalmente substituída.
[0188] "Tetrazol”, como usado aqui, refere-se ao grupo heterocíclico de cinco membros, incluindo quatro átomos de nitrogênio. O tetrazol pode ser opcionalmente substituído.
Células de Fluxo para Sequenciamento de Leitura Paired-End Simultânea
[0189] Um exemplo da célula de fluxo aqui divulgada inclui um substrato; um primeiro conjunto de iniciadores anexado a uma primeira região no substrato, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; e um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma segunda região no substrato, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
[0190] Exemplos de substratos adequados incluem epóxi siloxano, vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoretileno (como TEFLONGO da Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de ciclo- olefina (COP) (como ZEONORO da Zeon), poliimidas etc.), nylon, cerâmica/óxidos cerâmico, sílica, sílica fundida ou materiais à base de sílica, silicato de alumínio, silício e silício modificado (por exemplo, silício p+ dopado com boro), nitreto de silício (Si3N'4), óxido de silício (SiO;), pentóxido de tântalo (TaszOs) ou outro(s) óxido(s) de tântalo (TaOx) óxido de háfnio (HaO;), carbono, metais, vidros inorgânicos, ou semelhante. O substrato também pode ser uma estrutura de várias camadas. Alguns exemplos da estrutura de múltiplas camadas incluem vidro ou silício, com uma camada de revestimento de óxido de tântalo ou outro óxido cerâmico na superfície. Outros exemplos da estrutura de múltiplas camadas incluem um suporte subjacente (por exemplo, vidro ou silício) tendo uma resina padronizada no mesmo. Ainda outros exemplos do substrato de múltiplas camadas podem incluir um substrato de silício sobre isolador (SOI).
[0191] Em um exemplo, o substrato pode ter um diâmetro variando de cerca de 2 mm a cerca de 300 mm, ou uma folha ou painel retangular tendo sua maior dimensão até cerca de 10 pés (-3 metros). Em um exemplo, o substrato é uma pastilha tendo um diâmetro variando de cerca de 200 mm a cerca de 300 mm. Em outro exemplo, o substrato é uma matriz tendo uma largura variando de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. Embora dimensões do exemplo tenham sido fornecidas, deve ser entendido que um substrato com quaisquer dimensões adequadas pode ser usado. Para outro exemplo, um painel pode ser usado que é um suporte retangular, que tem uma área de superfície maior que uma pastilha redonda de 300 mm.
[0192] Em alguns exemplos da célula de fluxo, um primeiro conjunto de iniciadores é anexado a uma primeira região no substrato e um segundo conjunto de iniciadores é anexado a uma segunda região no substrato. As Fig. 1A a Fig. 1D representam diferentes configurações dos conjuntos de iniciadores 12A, 12A', 12B, 12B', 12C, 12C', e 12D, 12D' anexados às diferentes regiões 14, 16.
[0193] Cada um dos primeiros conjuntos de iniciadores 12A, 12B, 12C e 12D inclui um primeiro iniciador não clivável 18 ou 18' e um segundo iniciador clivável 20 ou 20'; e cada um dos segundos conjuntos de iniciadores 12A', 12B', 12C' e 12D' inclui um primeiro iniciador clivável 19 e um segundo iniciador não clivável 21.
[0194] O primeiro iniciador não clivável 18 ou 18' e o segundo iniciador clivável 20 ou 20' são pares de oligo, por exemplo, onde o primeiro iniciador não clivável 18 ou 18' é um iniciador senso de amplificação e o segundo iniciador clivável 20 ou 20' é um iniciador antisenso de amplificação ou onde o segundo iniciador clivável 20 ou 20' é o iniciador senso de amplificação e o primeiro iniciador não clivável 18 ou 18' é o iniciador antisenso de amplificação. Em cada exemplo do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C e 12D, o segundo iniciador clivável ou 20' inclui um local de clivagem 22, enquanto o primeiro iniciador não clivável 18 ou 18' não inclui um local de clivagem 22.
[0195] O primeiro iniciador clivável 19 ou 19' e o segundo iniciador não clivável 21 ou 21' também são pares de oligo, por exemplo, onde o primeiro iniciador clivável 19 ou 19' é um iniciador senso de amplificação e um segundo iniciador não clivável 21 ou 21' é um iniciador antisenso de amplificação ou onde o segundo iniciador não clivável 21 ou 21' é o iniciador senso de amplificação e o primeiro iniciador clivável 19 ou 19' é o iniciador antisenso de amplificação. Em cada exemplo do segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C'e 12D', o primeiro iniciador clivável 19 ou 19' inclui um local de clivagem 22' ou 23, enquanto o segundo iniciador não clivável 21 ou 21' não inclui um local de clivagem 22'ou 23.
[0196] Deve ser entendido que o primeiro iniciador não clivável 18 ou 18' do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D e o primeiro iniciador clivável 19 ou 19' do segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B' , 12C' e 12D' tem a mesma sequência de nucleotídeos (por exemplo, ambos são iniciadores senso de amplificação), exceto que o primeiro iniciador clivável 19 ou 19' inclui o local de clivagem 22' ou 23 integrado na sequência nucleotídica ou em um ligante 24' anexado à sequência nucleotídica. Da mesma forma, o segundo iniciador clivável 20 ou 20' do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D e o segundo iniciador não clivável 21 ou 21' do segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C' e 12D' tem a mesma sequência nucleotídica (por exemplo, ambos são iniciadores antisenso de amplificação),
exceto que o segundo iniciador clivável 20 ou 20' inclui o local de clivagem 22 integrado na sequência nucleotídica ou em um ligante 24 anexado à sequência nucleotídica.
[0197] Deve ser entendido que quando os primeiros iniciadores 18 e 19 ou 18' e 19' são iniciadores senso de amplificação, os segundos iniciadores 20 e 21 ou 20' e 21' são iniciadores antisenso e vice-versa.
[0198] Exemplos de iniciadores não cliváveis 18, 21 ou 18', 21' incluem iniciadores P5 e P7, exemplos dos quais são usados na superfície de células de fluxo comerciais vendidas pela Illumina Inc. para sequenciamento, por exemplo, no HISEQ'" , HISEQX'"", MISEQT”, MISEQDX"", MINISEQ", NEXTSEQ”", NEXTSEQDX*", NOVASEQ!", ISEQT”, GENOME ANALYZER*" e outras plataformas de instrumentos. Os iniciadores P5 e P7 têm uma sequência universal para fins de captura e/ou amplificação. Em um exemplo, os iniciadores P5 e P7 incluem o seguinte: P5: 57 — 3" AATGATACGGCGACCACCGA (SEQ. ID. NO. 1) P7: 57 — 3" CAAGCAGAAGACGGCATACGA (SEQ. ID. NO. 2)
[0199] Os iniciadores P5 e P7 são iniciadores não cliváveis 18, 21 ou 18', 21' porque não incluem um local de clivagem 22, 22', 23. Deve ser entendido que qualquer sequência universal adequada pode ser usada como os iniciadores não cliváveis 18, 21 ou 18 ', 21º.
[0200] Exemplos de iniciadores cliváveis 19, 20 ou 19', 20' incluem os iniciadores P5 e P7 (ou outra sequência universal) com os respectivos locais de clivagem 22, 22', 23 incorporados nas respectivas sequências de ácidos nucleicos (por exemplo, Fig. 1A e Fig. 1C) ou em um ligante 24', 24 que anexa os iniciadores cliváveis 19, 20 ou 19', 20' às respectivas regiões 16, 14 (Fig. 1B e Fig. 1D). Exemplos de locais de clivagem adequados 22, 22', 23 incluem nucleobases enzimaticamente cliváveis ou nucleobases quimicamente cliváveis, nucleobases modificadas ou ligantes (por exemplo, entre nucleobases). A nucleobase enzimaticamente clivável pode ser suscetível à clivagem por reação com uma glicosilase e uma endonuclease, ou com uma exonuclease. Um exemplo específico da nucleobase clivável é o desoxiuracil (dU), que pode ser direcionado pela enzima USER. Em um exemplo, a base de uracila pode ser incorporada na 7º posição de base a partir da extremidade 3' do iniciador P5 (PSU) ou do iniciador P7 (P7U). Outros locais não básicos também podem ser usados. Exemplos de nucleobases quimicamente cliváveis, nucleobases modificadas ou ligantes incluem um diol vicinal, um dissulfeto, um silano, um azobenzeno, um grupo fotoclivável, alilT (um análogo de nucleotídeo de timina tendo uma funcionalidade alil), éteres alil ou um éter funcional.
[0201] Cada conjunto de iniciadores 12A e 12A' ou 12B e 12B' ou 12C e 12C' ou 12D e 12D' é anexado a uma região respectiva 14 ou 16 no substrato. Em alguns exemplos, as regiões 14, 16 têm a mesma química de superfície e qualquer uma das técnicas aqui apresentadas pode ser usada para enxertar um conjunto de iniciadores 18, 20 ou 18', 20' na região 14, e outro conjunto de iniciadores 19, 21 ou 19', 21' na região 16. Em outros exemplos, as regiões 14 ou 16 incluem diferentes químicas de superfície (por exemplo, grupos funcionais) que podem reagir seletivamente com os respectivos iniciadores 18, 20 ou 18', 20' ou 19, 21 ou 19', 21'. Nestes outros exemplos, a primeira região 14 tem um primeiro grupo funcional e a segunda região 16 tem um segundo grupo funcional que é diferente do primeiro grupo funcional.
[0202] Como mencionado, as figuras 1A a 1D representam diferentes configurações dos conjuntos de iniciadores 12A, 12A', 12B, 12B', 12C, 12C', e 12D, 12D' anexados às diferentes regiões 14, 16. Mais especificamente, as Fig. 1A a Fig. 1D representam diferentes configurações dos iniciadores 18, 20 e 19, 21 ou 18', 20' e 19', 21' que podem ser utilizados.
[0203] No exemplo mostrado na Fig. 1A, os iniciadores 18, 20 e 19, 21 dos conjuntos de iniciadores 12A e 12A' estão diretamente anexados às regiões 14 e 16, por exemplo, sem um ligante 24, 24'. A região 14 pode ter grupos funcionais de superfície que podem imobilizar os grupos terminais na extremidade 5' dos iniciadores 18, 20. Da mesma forma, a região 16 pode ter grupos funcionais de superfície que podem imobilizar os grupos terminais na extremidade 5' dos iniciadores 19, 21. Em um exemplo, a química de imobilização entre a região 14 e os iniciadores 18, 20 e a química de imobilização entre a região 16 e os iniciadores 19, 21 podem ser diferentes, de modo que os iniciadores 18, 20 ou 19, 21 seletivamente anexam à região desejável 14 ou 16. Em outro exemplo, a química da imobilização pode ser a mesma para as regiões 14, 16 e os respectivos iniciadores 18, 20 ou 19, 21, e uma técnica de padronização pode ser usada para enxertar um conjunto de iniciadores 12A, 12A' de cada vez. Ainda em outro exemplo, os materiais aplicados para formar as regiões 14, 16 podem ter os respectivos iniciadores 18, ou 19, 21 pré-enxertados neles e, portanto, as químicas de imobilização podem ser iguais ou diferentes.
[0204] Neste exemplo, a imobilização pode ser por ligação covalente de ponto único à região respectiva 14 ou 16 na extremidade 5' dos respectivos iniciadores 18 e 20 ou 19 e 21. Qualquer meio de ligação covalente adequado conhecido no estado da técnica pode ser usado nas regiões 14, 16. Exemplos de iniciadores terminados que podem ser utilizados incluem um iniciador terminado em alquino, um iniciador terminado em tetrazina, um iniciador terminado em azido, um iniciador terminado em amino, um iniciador terminado em epóxi ou glicidil, um iniciador terminado em tiofosfato, um iniciador terminado em tiol, um iniciador terminado em aldeído, um iniciador terminado em hidrazina, um iniciador terminado em fosforamidita e um iniciador terminado em triazolinediona. Em alguns exemplos específicos, um iniciador terminado com éster succinimidil (NHS) pode ser reagido com uma amina em uma superfície da região 14 e/ou 16, um iniciador terminado em aldeído pode ser reagido com uma hidrazina em uma superfície da região 14 e/ou 16, ou um iniciador terminado em alquino pode ser reagido com uma azida em uma superfície da região 14 e/ou 16, ou um iniciador terminado em azida pode ser reagido com um alquino ou DBCO (dibenzociclooctino) em uma superfície da região 14 e/ou 16, ou um iniciador terminado em amino pode ser reagido com um grupo carboxilato ativado ou éster NHS em uma superfície da região 14 e/ou 16, ou um iniciador terminado em tiol pode ser reagido com um reagente alquilante (por exemplo, iodoacetamina ou maleimida) em uma superfície da região 14 e/ou 16, um iniciador terminado com fosforamidita pode ser reagida com um tioéter em uma superfície da região 14 e/ou 16, ou um iniciador modificado com biotina pode ser reagido com estreptavidina em uma superfície da região 14 e/ou 16.
[0205] Também no exemplo mostrado na Fig. 1A, o local de clivagem 22, 22' de cada um dos iniciadores cliváveis 20 19 é incorporado na sequência do iniciador 20, 19. Neste exemplo, o mesmo tipo de local de clivagem 22, 22' é utilizado nos iniciadores cliváveis 20, 19 dos respectivos conjuntos de iniciadores 12A, 12A'. Como um exemplo, os locais de clivagem 22, 22' são bases de uracila e os iniciadores cliváveis 20, 19 são PSU e P7U. Neste exemplo, o iniciador não clivável 18 do par de oligo 18, 20 pode ser P7 e o iniciador não clivável 21 do par de oligo 19, 21 pode ser P5. Assim, neste exemplo, o primeiro conjunto de iniciadores 12A inclui P7, PSU e o segundo conjunto de iniciadores 12A' inclui P5, P7U. Os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' têm químicas de linearização opostas, que, após amplificação, geração de agrupamento e linearização, permitem que as cadeias modelo senso sejam formadas em uma região 14 ou 16 e as cadeias antisenso sejam formadas na outra região 16 ou 14.
[0206] No exemplo mostrado na Fig. 1B, os iniciadores 18', 20' e 19', 21' dos conjuntos de iniciadores 12B e 12B' são anexados às regiões 14 e 16, por exemplo, através dos ligantes 24, 24'. A região 14 pode ter grupos funcionais de superfície que podem imobilizar o ligante 24 na extremidade 5' dos iniciadores 18', 20'. Da mesma forma, a região 16 pode ter grupos funcionais de superfície que podem imobilizar o ligante 24' na extremidade 5' dos iniciadores 19', 21'. Em um exemplo, a química de imobilização para a região 14 e os ligantes 24 e a química de imobilização para a região 16 e os ligantes 24' podem ser diferentes, de modo que os iniciadores 18', 20' ou 19', 21' enxertam seletivamente na região desejável 14 ou 16. Em outro exemplo, a química de imobilização pode ser a mesma para as regiões 14, l16 e os ligantes 24, 24', e qualquer técnica adequada aqui divulgada pode ser usada para enxertar um conjunto de iniciadores 12B, 12B' de cada vez.
Em ainda outro exemplo, os materiais aplicados para formar as regiões 14, 16 podem ter os respectivos iniciadores 18', 20' e 19', 21' pré-enxertados neles, e, portanto, as químicas de imobilização podem ser iguais ou diferentes.
Exemplos de ligantes adequados 24, 24' podem incluir ligantes de ácidos nucleicos (por exemplo, 10 nucleotídeos ou menos) ou ligantes de ácidos não nucleicos, tal como uma cadeia de polietileno glicol, um grupo alquil ou uma cadeia de carbono, um ligante alifático com dióis vicinais, um ligante de peptídeo, etc.
Um exemplo de um ligante de ácido nucleico é um espaçador poliT, embora outros nucleotídeos também possam ser utilizados.
Em um exemplo, o espaçador é um espaçador 6T a 10T.
A seguir estão alguns exemplos de nucleotídeos, incluindo ligantes de ácidos não nucleicos (em que B é a nucleobase e "oligo" é o iniciador):
o o ZARA a A a A a TREO
Ú UV
À 5'Hexinil-HEG-oligo P ligo o R q Vy 5'Hexinil-HEG-HEG-oligo Cy 9 oligo 8 8 3 3 g AMA ÇO DO, x, 70-D-0, nO O, AO -0, n 0-P=0 FONTE TSE SE» 8 Md
PJ
W Ss 5'Hexinil-espaçador C3-espaçador C3-espaçador C3-espaçador C3- oligo hão
[0207] No exemplo mostrado na Fig. 1B, os iniciadores 18', 19' têm a mesma sequência e o mesmo ou diferente ligante 24, 24'. O iniciador 18' é não clivável, enquanto o iniciador 19' inclui o local de clivagem 22' incorporado no ligante 24', Também neste exemplo, os iniciadores 20', 21' têm a mesma sequência (por exemplo, P7) e o mesmo ou diferente ligante 24, 24'. O iniciador 21' é não clivável, e o iniciador 20' inclui o local de clivagem 22 incorporado no ligante 24. O mesmo tipo de local de clivagem 22, 22' é usado no ligante 24, 24' de cada um dos iniciadores cliváveis 20', 19'. Como um exemplo, os locais de clivagem 22, 22' podem ser bases de uracila que são incorporadas nos ligantes de ácido nucleico 24, 24'. Os conjuntos de iniciadores 12B, 12B' têm químicas de linearização opostas, que, após amplificação, geração de agrupamentos e linearização,
permitem que as cadeias modelo senso sejam formadas em uma região 14 ou 16 e as cadeias antisenso sejam formadas na outra região 16 ou 14.
[0208] O exemplo mostrado na Fig. 1C é semelhante ao exemplo mostrado na Fig. 1A, exceto que diferentes tipos de locais de clivagem 22, 23 são utilizados nos iniciadores cliváveis 20, 19 dos respectivos conjuntos de iniciadores 12C, 12C'. Como exemplos, dois locais de clivagem enzimática diferentes podem ser utilizados, dois locais de clivagem química diferentes podem ser usados, ou um local de clivagem enzimática e um local de clivagem química podem ser utilizados. Exemplos de diferentes locais de clivagem 22, 23 que podem ser usados nos respectivos iniciadores cliváveis 20, 19 incluem qualquer combinação de um diol vicinal, uma uracila, um éter alílico, um dissulfeto, um sítio de enzima de restrição e 8-oxoguanina.
[0209] O exemplo mostrado na Fig. 1D é semelhante ao exemplo mostrado na Fig. 1B, exceto que diferentes tipos de locais de clivagem 22, 23 são usados nos ligantes 24, 24' anexados aos iniciadores cliváveis 20', 19' dos respectivos conjuntos de iniciadores 12D, 12D'. Exemplos de diferentes locais de clivagem 22, 23 que podem ser utilizados nos respectivos ligantes 24, 24' anexados aos iniciadores cliváveis 20, 19 incluem qualquer combinação de um diol vicinal, uma uracila, um éter alílico, um dissulfeto, um sítio de enzima de restrição e uma 8-oxoguanina.
[0210] Em qualquer um dos exemplos mostrados nas Fig. 1A a Fig. 1D, a ligação dos iniciadores 18, 20 e 19, 21 ou 18', 20' e 19', 21' às regiões 14, 16 deixa uma porção modelo-específica dos iniciadores 18, 20 e 19, 21 ou 18', 20' e 19', 21' livre para anelar com seu modelo cognato e o grupo hidroxila 3' livre para extensão do iniciador.
[0211] As regiões 14, 16 representam áreas diferentes no substrato que possuem conjuntos de iniciadores diferentes 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' anexados a eles. As regiões 14, 16 podem incluir materiais com diferentes grupos funcionais. Em alguns casos, os diferentes grupos funcionais são grupos funcionais de superfície do substrato ou grupos funcionais que foram introduzidos em uma superfície do substrato ou podem ser grupos funcionais de outro componente (por exemplo, uma camada de polímero, uma esfera, etc.) que é depositado no substrato.
[0212] Em alguns exemplos, as regiões 14, 16 são quimicamente iguais, e qualquer técnica aqui divulgada pode ser usada para anexar sequencialmente os iniciadores 18, 20 e 19, 21 ou 18', 20' e 19', 21' dos respectivos conjuntos 12A e 12A', ou 12B e 12B', ou 12C e 12C', ou 12D e 12D' para as respectivas regiões 14, 16.
[0213] Em um exemplo onde as regiões 14, 16 são quimicamente iguais, ambas as regiões 14, 16 incluem a mesma camada de polímero. A camada polimérica pode ser um material polimérico semi-rígido que é permeável a líquidos e gases. Um exemplo da camada de polímero inclui um copolímero de acrilamida, tal como poli (N-(5- azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida, PAZAM. PAZAM e algumas outras formas do copolímero de acrilamida são representadas pela seguinte estrutura (1):
o
FOR - NH o MH NH o
E E R n R m RD qB RD go em que: Rº é selecionado do grupo que consiste em azido, amino opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, hidrazona opcionalmente substituída, hidrazina opcionalmente substituída, carboxil, hidróxi, tetrazol opcionalmente substituído, tetrazina opcionalmente substituída, óxido de nitrila, nitrona e tiol; RP é H ou alquil opcionalmente substituído; Rº, Rh e RE são cada independentemente selecionados do grupo consistindo de H e alquil opcionalmente substituído; cada um dos -(CH;),- pode ser opcionalmente substituído; p é um número inteiro no intervalo de 1 a 50; né um número inteiro no intervalo de 1 a 50.000; e m é um número inteiro no intervalo de 1 a 100.000.
[0214] Um técnico versado no assunto reconhecerá que o arranjo dos recursos "n" e "m" recorrentes na estrutura (1) são representativos e as subunidades monoméricas podem estar presentes em qualquer ordem na estrutura do polímero (por exemplo, aleatória, bloco, padronizada ou uma combinação dos mesmos).
[0215] O peso molecular do PAZAM pode variar de cerca de 10 kDa a cerca de 1500 kDa, ou pode ser, em um exemplo específico, cerca de 312 kDa.
[0216] Em alguns exemplos, PAZAM é um polímero linear. Em alguns outros exemplos, PAZAM é um polímero levemente reticulado.
[0217] Em outros exemplos, o polímero 26 pode ser uma variação da estrutura (1). Em um exemplo, a unidade de acrilamida pode ser substituída por N, N-dimetilacrilamida Os No
AA ( ). Neste exemplo, a unidade de acrilamida na
RH O.
ÁD RF estrutura (I) pode ser substituída por , onde Rº, RF e Rº são cada H, e Rº e Rº são cada um grupo metil (em vez de H, como é o caso com a acrilamida). Neste exemplo, q pode ser um número inteiro no intervalo de 1 a 100.000. Em outro exemplo, a N,N-dimetilacrilamida pode ser usada em adição à unidade de acrilamida. Neste exemplo, a estrutura o
RD RF (1) pode incluir em adição aos elementos recorrentes "n" e "m", onde Rº, RE e RF são cada H, e RE e Rº são cada um grupo metil. Neste exemplo, q pode ser um número inteiro no intervalo de 1 a 100.000.
[0218] Como outro exemplo de polímero, o elemento "n" recorrente na estrutura (1) pode ser substituído por um monômero, incluindo um grupo azido heterocíclico tendo estrutura (II): R2 9 NS AX “Ex. L Z N3 R1 em que R' é H ou alquil C1-C4; R7 é H ou alquil C1-C4; L é um ligante incluindo uma cadeia linear com 2 a 20 átomos selecionados do grupo consistindo de carbono, oxigênio e nitrogênio e 10 substituintes opcionais no carbono e quaisquer átomos de nitrogênio na cadeia; E é uma cadeia linear incluindo 1 a 4 átomos selecionados do grupo consistindo de carbono, oxigênio e nitrogênio e substituintes opcionais no carbono e quaisquer átomos de nitrogênio na cadeia; A é uma amida N substituída com um H ou alquil C1-C4 ligado ao N; e Z é um heterociclo contendo nitrogênio. Exemplos de Z incluem 5 a 10 membros de anel presentes como uma única estrutura cíclica ou uma estrutura fundida.
[0219] Como ainda outro exemplo, o polímero pode incluir uma unidade recorrente de cada uma das estruturas (III) e (IV): N3 NH É >
Ç T Ox N-R&8 O, NR? DS q R2a R2p e em que cada um de R!º, Rº%, RU e R%*» é selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil opcionalmente substituído ou fenil opcionalmente substituído; cada Rº*º e R?* é selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil opcionalmente substituído, fenil opcionalmente substituído ou aralquil C7T-C1l4 opcionalmente substituído; e cada L' e Lº é selecionado independentemente a partir de um ligante de alquileno opcionalmente substituído ou um ligante de heteroalquileno opcionalmente substituído.
[0220] Deve ser entendido que outras moléculas podem ser usadas para formar a camada de polímero, desde que sejam funcionalizadas para interagir com o primeiro e o segundo conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D'. Outros exemplos de camadas poliméricas adequadas incluem aqueles que possuem uma estrutura coloidal, como a agarose; ou uma estrutura de malha de polímero, como gelatina; ou uma estrutura polimérica reticulada, como polímeros e copolímeros de poliacrilamida, acrilamida livre de silano (SFA), ou uma versão azidolizada de SFA. Exemplos de polímeros de poliacrilamida adequados podem ser sintetizados a partir de acrilamida e um ácido acrílico ou um ácido acrílico contendo um grupo vinil, ou a partir de monômeros que formam reações de fotocicloadição [2+2]. Ainda outros exemplos de camadas “poliméricas adequadas incluem copolímeros misturados de acrilamidas e acrilatos. Polímeros ramificados, tais como polímeros em estrela (star polymers), polímero estrelado (star-shaped) ou de bloco em estrela (star-block), dendrímeros e similares também podem ser utilizados.
[0221] Em outros exemplos, as regiões 14, 16 são quimicamente diferentes. Por exemplo, a região 14 pode ter grupos funcionais de superfície que podem imobilizar os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' dos primeiros conjuntos de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D e a região 16 pode ter diferentes grupos funcionais de superfície que podem imobilize os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' dos segundos conjuntos de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D'.
[0222] Em um exemplo onde as regiões 14, 16 são quimicamente diferentes, um copolímero em bloco é utilizado.
Neste exemplo, o copolímero em bloco inclui dois blocos diferentes, um com grupos funcionais de enxerto de iniciador que podem ser anexados aos iniciadores 18, 20 ou 18', 20' dos primeiros conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D e outro com grupos funcionais de enxerto de iniciador que podem ser anexados aos iniciadores 19, 21 ou 19', 21' dos segundos conjuntos de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D'. Exemplos de grupo funcional de enxerto primário são selecionados a partir do grupo consistindo de azida/azido, amino opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, aldeído, hidrazona opcionalmente substituída, hidrazina opcionalmente substituída, carboxil, hidróxi, tetrazol opcionalmente substituído, tetrazina opcionalmente substituída, óxido de nitrila, nitrona, tiol e combinações dos mesmos.
[0223] Outros exemplos de regiões quimicamente diferentes 14, 16 incluem ouro e PAZAM, ouro e alumínio, silanos tendo dois grupos funcionais de superfície diferentes (por exemplo, azidas e aminas), uma monocamada tiol auto-montada em ouro e uma monocamada fosfonato auto- montado em óxido de alumínio ou háfnio, SiO; e Tas;Os, epóxi e Taz;O0s, um primeiro polímero incluindo grupos azida e um segundo polímero incluindo grupos amina, SiO; e cobre, ou epóxi e cobre. Embora vários exemplos tenham sido fornecidos, deve-se entender que outras combinações de regiões quimicamente diferentes 14, 16 podem ser usadas.
[0224] As regiões 14, 16 também podem ter configurações físicas diferentes. As figuras 2 a 6B ilustram exemplos diferentes dessas configurações. Nestes exemplos, o substrato 26 é mostrado como uma única camada/material,
tal como vidro, silício, etc. Deve ser entendido, no entanto, que um substrato de várias camadas pode ser usado com qualquer uma dessas configurações de exemplo. Por exemplo, qualquer um desses exemplos pode incluir um suporte e uma resina padronizada formada no suporte.
[0225] A Fig. 2 ilustra um exemplo onde as regiões 14, 16 estão localizadas em diferentes áreas de uma superfície S do substrato 26.
[0226] Um exemplo de método para fazer o exemplo mostrado na Fig. 2 é mostrado nas Fig. 26A a Fig. 26H. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A'ou 12B, 12B' ou 12C, 12C'ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo desta descrição, eles não são mostrados para fins de clareza.
[0227] Como mostrado na Fig. 26A, uma primeira camada funcionalizada 60 é aplicada em um substrato 26. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser um polímero (PAZAM), um silano, um metal (ouro, alumínio, etc.) ou qualquer outro material que possui um grupo funcional que pode anexar ao primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas.
[0228] Dependendo da primeira camada funcionalizada 60 que é usada, o substrato 26 pode ser ativado usando silanização ou incineração de plasma para gerar grupos de superfície que podem reagir com a primeira camada funcionalizada 60. Exemplos de silanização e cinza de plasma são descritos em mais detalhes em referência à Fig. 13A. A primeira camada funcionalizada 60 pode então ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas. Dependendo do material utilizado, a primeira camada funcionalizada 60 também pode ser curada.
[0229] Na Fig. 26B e Fig. 26C, a primeira camada funcionalizada 60 é então padronizada para formar uma primeira região funcionalizada (região 14) coberta por um fotorresistente 62. Em um exemplo, o fotorresistente 62 é um fotorresistente negativo (região exposta torna-se insolúvel). Um exemplo de fotorresistente negativo adequado inclui o fotorresistente SU-8 à base de epóxi (disponível na MicroChemicals). O fotorresistente 62 é aplicado à primeira camada funcionalizada 60, é seletivamente exposto a certos comprimentos de onda da luz para formar a região insolúvel (mostrado em 62) e é exposto a uma solução reveladora para remover as porções solúveis. Em outro exemplo, o fotorresistente 62 é um fotorresistente positivo (a região exposta se torna solúvel). Exemplos de fotorresistentes positivos adequados incluem as MICROPOSITO série S1800 ou série AZO 1500, ambas das quais estão disponíveis na MicroChemicals. O fotorresistente 62 é aplicado ao substrato 26, é seletivamente exposto a certos comprimentos de onda da luz para formar a região solúvel e é exposto a uma solução reveladora para remover as porções solúveis, deixando a região insolúvel (mostrado em 62). Em outros exemplos, o fotorresistente 62 pode ser substituído por uma resina litográfica por nanoimpressão que é padronizada para formar a região (por exemplo, 62).
[0230] Como mostrado na Fig. 26C, as porções expostas da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, aquelas não cobertas pelo fotorresistente 62) podem então ser removidas, por exemplo, por gravação ou outra técnica adequada.
[0231] Como mostrado na Fig. 26D, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, usando qualquer técnica de deposição adequada, no fotorresistente 62 e em porções (por exemplo, a superfície exposta S) do substrato 26. Dependendo do material utilizado, a segunda camada funcionalizada 64 também pode ser curada.
[0232] Como mostrado na Fig. 26E, o fotorresistente 62 pode então ser retirado, o que também remove qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nela.
[0233] Na Fig. 26F e Fig. 26G, uma porção da segunda camada funcionalizada 64 é removida. Para remover a(s porção(ões), um segundo fotorresistente 62' é aplicado, exposto e desenvolvido de modo que a região insolúvel (mostrada em 62') cubra a primeira região funcionalizada 14 e uma porção desejável da segunda camada funcionalizada 64 que é i) adjacente à primeira região funcionalizada 14 e ii) para se tornar a segunda região funcionalizada 16. Uma vez que o fotorresistente 62' é formado, as porções expostas da segunda camada funcionalizada 64 (por exemplo, aquelas não cobertas “pelo fotorresistente 62") podem então ser removidas, por exemplo, por gravação ou outra técnica adequada.
[0234] Como mostrado na Fig. 26H, o fotorresistente 62' pode então ser retirado, o que expõe a primeira e a segunda regiões funcionalizadas 14, 16.
[0235] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 26A a Fig. 26H) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados à primeira região funcionalizada
14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 26A a Fig. 26H) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0236] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20º não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 26A). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 26H), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0237] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 1', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 26D) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 26H), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0238] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado por deposição flow through (por exemplo, usando uma tampa temporariamente ligada), dunk coating, revestimento por spray, puddle dispensing ou por outro método adequado que anexará o(s) iniciador(es) 18, 20 ou 18', 20' à região 14 ou que anexará o(s) iniciador (es) 19, 21 ou 19', 21' à região 16. Cada uma desses técnicas de exemplo pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador(es) 18, 20 ou 18', 20', 19, 21 ou 19', 21' água, um tampão e um catalisador. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para o substrato 26.
[0239] Embora não mostrado nas Fig. 26A a Fig. 26H, este método de exemplo pode incluir ainda o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. Em um exemplo, a região 14 é ouro, e o primeiro SAM inclui grupos tiol que podem se anexar aos grupos ouro e azida que podem se anexar aos iniciadores 18, 20 ou 18', 20'. Em outro exemplo, a região 16 é óxido de háfnio ou óxido de alumínio, e o segundo SAM inclui grupos fosfonato que podem anexar a óxido de háfnio ou óxido de alumínio e grupos amina que podem se anexar aos iniciadores 19, 21 ou 19', 21'. No exemplo, usando as monocamadas auto-montadas, o conjunto de iniciadores 12A, 12A'ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0240] Outro método de exemplo para fazer o exemplo mostrado na Fig. 2 é mostrado nas Fig. 27A a Fig. 27F. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza.
[0241] Como mostrado na Fig. 27A, um primeiro fotorresistente 62 é aplicado no substrato 26, de modo que uma primeira porção de substrato 66 permaneça exposta. Neste exemplo, o fotorresistente 62 pode ser um fotorresistente positivo (a região exposta se torna solúvel) ou um fotorresistente “negativo (a região exposta se torna insolúvel). O fotorresistente 62 também pode ser substituído por uma resina litográfica por nanoimpressão que é padronizada para formar uma região (por exemplo, 62).
[0242] Como mostrado na Fig. 27B, a primeira camada funcionalizada 60 pode ser depositada no fotorresistente 62 e na primeira porção de substrato 66 usando qualquer uma das técnicas aqui descritas. Em alguns casos, a primeira camada funcionalizada 60 também pode ser curada.
[0243] Como mostrado na Fig. 27C, o fotorresistente 62 pode então ser retirado, o que também remove qualquer uma da primeira camada funcionalizada 60 nele. Isso deixa a região 14 formada na superfície do substrato S.
[0244] Um segundo fotorresistente 62' é aplicado, exposto e desenvolvido de modo que a região insolúvel (mostrada em 62') cubra a primeira região funcionalizada 14 e o substrato 26, exceto em uma segunda porção de substrato 68 que é adjacente à primeira região funcionalizada 14.
[0245] Como mostrado na Fig. 27E, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, usando qualquer técnica de deposição adequada e, em alguns casos curando, no fotorresistente 62' e na segunda porção de substrato 68.
[0246] Como mostrado na Fig. 27F, o fotorresistente
62' pode então ser retirado, o que remove qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nele. Isso expõe a primeira e a segunda regiões funcionalizadas 14, 16.
[0247] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 27A a Fig. 27F) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados à primeira funcionalizada região
14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19 ', 21' (não mostrados nas Fig. 27A a Fig. 27F) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0248] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20º não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 27B ou 27C). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 27F), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0249] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 27E) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 27F), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0250] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para o substrato 26.
[0251] Embora não mostrado nas Fig. 27A a Fig. 27F, este método de exemplo pode incluir ainda o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. No exemplo utilizando as monocamadas auto-montadas, os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C'ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0252] Ainda outro método de exemplo para fazer o exemplo mostrado na Fig. 2 é mostrado nas Fig. 41A a Fig. 41G. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza.
[0253] O substrato 26 pode ser quaisquer exemplos do substrato aqui divulgado. Embora não mostrado, deve ser entendido que o substrato também pode ser um substrato de várias camadas incluindo uma resina não padronizada em um suporte (por exemplo, uma resina litográfica por nanoimpressão em um suporte de vidro ou qualquer outro exemplo da resina 54 e suporte 52 aqui descrito, consulte a seção “Célula de Fluxo Baseada em Esferas”).
[0254] Como mostrado na Fig. 41A, neste exemplo, uma camada de metal de sacrifício 98 é aplicada ao substrato 26. Em um exemplo, a resina litográfica por nanoimpressão/ resistência do substrato de múltiplas camadas pode ser exposta ao plasma de oxigênio, e então a camada de metal de sacrifício 98 pode ser depositada usando qualquer técnica de deposição de metal adequada. Em um exemplo, a camada de metal de sacrifício 98 é depositada usando pulverização. Exemplos da camada de metal sacrificial 98 incluem alumínio ou cobre, e a camada 98 pode ter uma espessura que varia de cerca de nm a cerca de 100 nm.
[0255] Como mostrado na Fig. 41B, uma resistência é aplicada à camada de metal sacrificial 98 e é padronizada para definir uma depressão em vários níveis ou em várias profundidades nela. A resina padronizada é mostrada no número de referência 54'. Neste exemplo, a resina pode ser qualquer resina litográfica por nanoimpressão. Em um exemplo, a resina é revestida por centrifugação e submetida a softbake e, em seguida, estampada e curada (por exemplo, usando cura por ultravioleta) para definir uma depressão em vários níveis ou em várias profundidades que inclui uma porção profunda 70 e a porção rasa 72 que é definida , em parte, por uma porção em degrau 74 da resina padronizada 54'.
[0256] A gravação úmida ou seca pode então ser usada para expor uma porção 100 do substrato 26 (por exemplo, uma porção da resina não padronizada ou vidro do substrato multicamada) subjacente à porção profunda 70 e uma porção 102 da camada de metal sacrificial 98 subjacente à porção rasa 72. As porções expostas são mostradas na Fig. 41C. Em um exemplo de gravação úmida, FeCl; pode ser usado para remover uma camada de metal de sacrifício de cobre 98. Em outro exemplo de gravação úmida, KOH pode ser usado para remover uma camada de metal de sacrifício de alumínio 98. Em um exemplo de gravação a seco, o plasma de oxigênio pode primeiro ser usado para remover resíduo da resina padronizada 54' e, em seguida, uma combinação de plasmas de Cl; e BCl; pode ser usada para gravar uma camada de metal de sacrifício de alumínio 98. O plasma de oxigênio pode ser novamente utilizado para limpar as porções expostas 100 e 102. Neste exemplo, as profundidades Dl (por exemplo, da parte rasa 72) e D2 (por exemplo, a partir da parte inferior da porção profunda 70 até a parte superior da porção em degrau 74) e a espessura D3 da camada de metal de sacrifício 98 podem ser iguais ou semelhantes (por exemplo, dentro um nm de cada um), de modo que a espessura desejada de cada um dos materiais 54' e 98 seja removida durante a gravação, a fim de expor as porções 100 e 102.
[0257] Como mostrado na Fig. 41D, a primeira camada funcionalizada 60 pode ser depositada na resina padronizada remanescente 54', na porção exposta 100 do substrato 26 e na porção exposta 102 da camada de metal de sacrifício 98. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser qualquer um dos exemplos e pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas. Em alguns casos, a primeira camada funcionalizada 60 também é curada.
[0258] Na Fig. 41E, a gravação úmida é usada para remover "seletivamente uma porção da primeira camada funcionalizada 60 e outra porção da camada de metal de sacrifício 98, a fim de expor outra porção 104 do substrato
26. A gravação úmida pode ser realizada como aqui descrito. O agente de gravação (etchant)usado pode gravar a camada de metal de sacrifício 98, retirando assim a primeira camada funcional 60.
[0259] Como mostrado na Fig. 41F, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, na porção exposta 104 e na primeira camada funcionalizada 60. Qualquer técnica de deposição adequada pode ser usada para a segunda camada funcionalizada 64. Em qualquer um dos métodos de exemplo aqui divulgados, quando a deposição é realizada sob alta força iônica (por exemplo, na presença de 10x PBS, NaCl, KCl, etc.), a segunda camada funcionalizada 64 não se deposita ou adere à primeira camada funcionalizada 60. Assim sendo, a segunda camada funcionalizada 64 não contamina a primeira camada funcionalizada 60, deixando a região 16.
[0260] Como mostrado na Fig. 41G, a resina padronizada remanescente 54 pode então ser removida, o que remove qualquer uma da primeira camada funcionalizada 60 nela. Este processo de remoção pode ser realizado em dimetilsulfóxido (DMSO) usando sonicação, ou em acetona, ou com um removedor à base de NMP (N-metil-2-pirrolidona). A camada de metal de sacrifício remanescente 98 é então exposta, e pode ser removida usando gravação úmida como aqui descrito. As regiões 14, 16 permanecem intactas na superfície do substrato após a gravação úmida, em parte porque a camada de metal de sacrifício 98 não está presente nas regiões 14,
16.
[0261] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 41A a Fig. 41G) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados à primeira funcionalizada região
14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 41A a Fig. 41G) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0262] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20º não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 41D) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 41G), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0263] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 41F) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19 ', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 41G), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0264] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado por deposição flow through (por exemplo, usando uma tampa temporariamente ligada), dunk coating, revestimento por spray, puddle dispensing, ou por outro método adequado que anexará o(s) iniciador(es) 18, 20 ou 18', 20' à região 14 ou que anexará o(s) iniciador (es) 19, 21 ou 19', 21' à região 16. Cada uma dessas técnicas de exemplo pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador(es) 18, 20 ou 18', 20', 19, 21 ou 19', 21' água, um tampão e um catalisador. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para o substrato 26.
[0265] Ainda outro método de exemplo para fazer o exemplo mostrado na Fig. 2 é mostrado nas Fig. 42A a Fig. 42H. Novamente, enquanto o conjunto de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza.
[0266] O substrato 26 pode ser quaisquer exemplos do substrato aqui divulgado. Semelhante ao exemplo descrito nas Fig. 41A a Fig. 41G, o substrato também pode ser um substrato de múltiplas camadas incluindo uma resina não padronizada em um suporte.
[0267] Como mostrado na Fig. 42A, neste exemplo, a camada de metal de sacrifício 98 é aplicada no substrato 26. A camada de metal de sacrifício 98 pode ser qualquer um dos materiais de exemplo e pode ser depositada por qualquer um dos exemplos descritos em referência à Fig. 41A.
[0268] Como mostrado na Fig. 42B, uma resistência é aplicada à camada de metal de sacrifício 98 e é padronizada para definir uma depressão em vários níveis ou em várias profundidades nela. A resina padronizada é mostrada no número de referência 54'. Neste exemplo, a resina pode ser qualquer resina litográfica por nanoimpressão. Em um exemplo, a resina é revestida por centrifugação e submetida a softbake e, então, estampada e curada (por exemplo, usando cura por ultravioleta) para definir depressão em vários níveis ou em várias profundidades que inclui uma porção profunda 70 e a porção rasa 72 que é definida, em parte, por uma porção em degrau 74 da resina padronizada 54 '.
[0269] Gravação a seco ou a úmida pode então ser usado para expor uma porção 100 do substrato 26 (por exemplo, uma porção da resina não padronizada do substrato de várias camadas) subjacente à porção profunda 70 e uma porção 102 da camada de metal de sacrifício 98 subjacente à porção rasa
72. As porções expostas 100 e 102 são mostradas na Fig. 42C. A gravação úmida ou a seco pode ser realizada como descrito em referência à Fig. 41C.
[0270] Como mostrado na Fig. 42D, a primeira camada funcionalizada 60 pode ser depositada na resina padronizada remanescente 54', na porção exposta 100 do substrato 26 e na porção exposta 102 da camada de metal de sacrifício 98. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser qualquer um dos exemplos e pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas. Em alguns casos, a primeira camada funcionalizada 60 também pode ser curada.
[0271] Nas Fig. 42E e Fig. 42F, a primeira camada funcionalizada 60 é então padronizada para formar uma primeira região funcionalizada (região 14) coberta por um fotorresistente 62. Neste exemplo, o fotorresistente 62 é um fotorresistente negativo. O fotorresistente 62 pode ser aplicado à primeira camada funcionalizada 60, exposta seletivamente a certos comprimentos de onda da luz para formar uma região insolúvel e exposta a uma solução reveladora para remover as porções solúveis. o fotorresistente remanescente 62 é posicionado na porção da primeira camada funcionalizada 60 que está na porção 100 na porção profunda 70.
[0272] Como mostrado na Fig. 42F, as porções expostas da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, aquelas não cobertas pelo fotorresistente 62) podem então ser removidas, por exemplo, por gravação ou outra técnica adequada. Esse processo de gravação (por exemplo, plasma de oxigênio) também remove parte da resina padronizada 54' e parte do fotorresistente 62. Em um processo de gravação separado, a camada de metal de sacrifício 98 que estava subjacente à parte rasa 72 (ver Fig. 42B) é removida. Neste exemplo, a gravação úmida ou a seco, como descrito em referência à Fig. 41C, pode ser usada. Este processo expõe a outra porção 104 do substrato 26.
[0273] Como mostrado na Fig. 42G, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, utilizando qualquer técnica de deposição adequada, nas porções expostas da resina 54', no fotorresistente 62, e na porção exposta 104 do substrato 26. Em um exemplo, a segunda camada funcionalizada 64 pode ser depositada no fotorresistente 62, mas pode ser removida com o fotorresistente 62 quando a mesma é removida.
[0274] Como mostrado na Fig. 42H, a resina padronizada remanescente 54' e o fotorresistente 62 podem então ser retirados, o que remove qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nele. Este processo de remoção pode ser realizado em dimetilsulfóxido (DMSO) usando sonicação, ou em acetona, ou com um removedor à base de NMP (N-metil- 2-pirrolidona). A camada de metal de sacrifício remanescente 98 é então exposta e pode ser removida usando gravação úmida como aqui descrito. As regiões 14, 16 permanecem intactas na superfície do substrato após a gravação úmida, em parte porque a camada de metal de sacrifício 98 não está presente nas regiões 14, 16.
[0275] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 42A a Fig. 42H) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados à primeira funcionalizada região
14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 42A a Fig. 42H) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0276] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após o a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 42D). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 42H), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0277] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 42G). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19 ', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 42H), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0278] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado por deposição flow through (por exemplo, usando uma tampa temporariamente ligada), dunk coating , revestimento por spray, puddle dispensing, ou por outro método adequado que anexe o(s) iniciador(es) 18, 20 ou 18', 20' à região 14 ou que anexará o(s) iniciador(es) 19, 21 ou 19', 21' à região 16. Cada uma dessas técnicas de exemplo pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador(es) 18, 20 ou 18', 20', 19, 21 ou 19', 21' água, um tampão e um catalisador. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para o substrato 26.
[0279] As regiões de exemplo 14, 16 mostradas na Fig. 2 também podem ser formadas usando técnicas de impressão por microcontato (micro-contact printing) ou impressão direta (direct printing), tal como impressão a jato de tinta. Esses métodos podem ser particularmente adequados quando é desejável gerar regiões em uma escala de mícron, tal como cerca de 1 um a cerca de 50 um.
[0280] No exemplo mostrado na Fig. 2, deve ser entendido que múltiplos conjuntos de regiões isoladas 14, 16 podem ser formados em uma matriz através da superfície do substrato S. Muitos layouts diferentes podem ser usados para a matriz, desde que como as regiões 14, 16 dentro de um conjunto isolado sejam adjacentes umas às outras.
[0281] As Fig. 3A a Fig. 6B ilustram diferentes exemplos onde pelo menos uma das regiões 14, 16 está localizada em uma depressão 28 definida no substrato 26. As depressões 28 podem ser formadas em um único substrato em camadas (por exemplo, substrato 26) ou podem ser formadas em uma camada mais externa de um substrato de várias camadas.
[0282] As depressões 28 podem ser formadas usando qualquer técnica adequada, tal como fotolitografia, litografia por nanoimpressão (NIL), técnicas de estampagem, técnicas de estampagem em relevo, técnicas de moldagem, técnicas de microgravação, etc.
[0283] Enquanto uma única depressão 28 é mostrada em cada uma das Fig. 3A a Fig. 6B, deve ser entendido que uma célula de fluxo pode incluir uma pluralidade de depressões 28 que são separadas por regiões intersticiais 30, onde cada uma das depressões 28 inclui a primeira região 14 localizada em uma primeira porção e a segunda região 16 localizada em uma segunda porção. Além disso, alguns dos exemplos aqui divulgados incluem depressões 28A e 28B com tamanhos diferentes (ver, por exemplo, Fig. 11C) ou depressões 28C que incluem duas porções 34, 34' que estão interconectadas,
mas que têm tamanhos diferentes (ver, por exemplo, Fig. 11D). Deve ser entendido que a discussão a seguir relacionada às depressões 28 pode ser aplicável a qualquer exemplo das depressões 28, 28A, 28B, 28C divulgadas aqui.
[0284] Muitos layouts diferentes das depressões 28 podem ser considerados, incluindo padrões regulares, repetitivos e não regulares. Em um exemplo, as depressões 28 são dispostas em uma grade hexagonal para fechar o empacotamento e melhorar a densidade. Outros layouts podem incluir, por exemplo, layouts retilíneos (isto é, retangulares) (ver Fig. 24), layouts triangulares e assim por diante. Em alguns exemplos, o layout ou padrão pode ser um formato x-y de depressões 28 que estão em linhas e colunas. Em alguns outros exemplos, o layout ou padrão pode ser um arranjo repetitivo das depressões 28 e/ou regiões intersticiais 30. Em outros exemplos, o layout ou padrão pode ser um arranjo aleatório das depressões 28 e/ou regiões intersticiais 30. O padrão pode incluir faixas, redemoinhos, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, marcas (checks), xadrez (plaids), diagonais, setas, quadrados e/ou hachuras cruzadas.
[0285] O layout ou padrão pode ser caracterizado em relação à densidade das depressões 28 (isto é, número de depressões 28) em uma área definida. Por exemplo, as depressões 28 podem estar presentes a uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm?º. A densidade pode ser ajustada para diferentes densidades, incluindo, por exemplo, uma densidade de pelo menos cerca de 100 por mm?, pelo menos cerca de 1.000 por mm?, pelo menos cerca de 0,1 milhão por mmº, pelo menos cerca de 1 milhão por mmº, pelo menos cerca de 2 milhões por mm?, pelo menos cerca de 5 milhões por mmº, pelo menos cerca de 10 milhões por mmº, pelo menos cerca de 50 milhões por “mm? ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a densidade pode ser ajustada para ser não mais que cerca de 50 milhões por mmº, não mais que cerca de milhões por mm?º, não mais que cerca de 5 milhões por mmº, não mais que cerca de 2 milhões por mm?º?, não mais que cerca de 1 milhão por mm?, não mais que cerca de 0,1 milhão por mmº, não mais que cerca de 1.000 por mmº, não mais que cerca de 100 por mm ou menos. Deve ser ainda entendido que a densidade das depressões 28 pode estar entre um dos valores mais baixos e um dos valores mais altos selecionados nas faixas acima. Como exemplos, uma matriz de alta densidade pode ser caracterizada como tendo depressões 28 separadas por menos que cerca de de 100 nm, uma matriz de média densidade pode ser caracterizada como tendo depressões 28 separadas por cerca de 400 nm a cerca de 1 um (1000 nm) e uma matriz de baixa densidade pode ser caracterizada como tendo depressões 28 separadas por mais que cerca de 1 um. Embora exemplos de densidades tenham sido fornecidos, deve ser entendido que substratos com quaisquer densidades adequadas podem ser utilizados.
[0286] O layout ou padrão das depressões 28 pode também ou alternativamente ser caracterizado em termos do pitch médio, isto é, o espaçamento do centro da depressão 28 para o centro de uma depressão adjacente 28 (espaçamento centro a centro) ou da borda de uma depressão 28 até a borda de uma depressão adjacente 28 (espaçamento borda a borda).
O padrão pode ser regular, de modo que o coeficiente de variação em torno do pitch médio é pequeno, ou o padrão pode ser não regular, nesse caso o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em qualquer um dos casos, o pitch médio pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 10 nm, cerca de 0,1 um, cerca de 0,5 um, cerca de 1 um, cerca de 5 um, cerca de 10 um, cerca de 100 um ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o pitch médio pode ser, por exemplo, no máximo cerca de 100 um, cerca de 10 um, cerca de 5 um, cerca de 1 um, cerca de 0,5 um, cerca de 0,1 um ou menos. O pitch médio para um padrão particular de depressões 28 pode estar entre um dos valores mais baixos e um dos valores mais altos selecionados nas faixas acima. Em um exemplo, as depressões 28 têm um pitch (espaçamento de centro a centro) de cerca de 1,5 um. Embora exemplos de valores do pitch médio tenham sido fornecidos, deve ser entendido que outros valores de pitch médio podem ser utilizados.
[0287] No exemplo mostrado nas Fig. 3A a Fig. 6B, as depressões 28 são poços. Os poços podem ser micropoços ou nanopoços. O tamanho de cada poço pode ser caracterizado por seu volume, área de abertura do poço, profundidade e/ou diâmetro.
[0288] Cada poço pode ter qualquer volume que é capaz de confinar um líquido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, para acomodar a taxa de transferência (por exemplo, multiplexidade), resolução, composição do analito ou reatividade do analito esperada para usos a jusante da célula de fluxo. Por exemplo, o volume pode ser pelo menos cerca de 1 x 103 um?, pelo menos cerca de 1 x 10º um?º, pelo menos cerca de 0,1 um?º, pelo menos cerca de 1 umôà, pelo menos cerca de 10 um?, pelo menos cerca de 100 umº, ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o volume pode ser no máximo cerca de 1 x 10º um?à, no máximo cerca de 1 x 103 umi, no máximo cerca de 100 umôà, no máximo cerca de umià, no máximo cerca de 1 um?º?, no máximo cerca de 0,1 um? ou menos. Deve ser entendido que a(s) região(ões) 14, 16 pode (m) preencher todo ou parte do volume de um poço. O volume, por exemplo, da camada de polímero em um poço individual pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.
[0289] A área ocupada por cada abertura do poço em uma superfície pode ser selecionada com base em critérios semelhantes aos estabelecidos acima para o volume do poço. Por exemplo, a área para cada abertura do poço em uma superfície pode ser pelo menos cerca de 1 x 103? um?, pelo menos cerca de 1 x 10º um?º, pelo menos cerca de 0,1 um?º, pelo menos cerca de 1 um?, pelo menos cerca de 10 um?, pelo menos cerca de 100 um? ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a área pode ser no máximo cerca de 1 x 10º um?,y no máximo cerca de 100 um?, no máximo cerca de 10 umº, no máximo cerca de 1 um?, no máximo cerca de 0,1 um?, cerca de 1 x 10º um? ou menos. A área ocupada por cada abertura de poço pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.
[0290] A profundidade de cada poço (ou qualquer outro tipo de depressão 28) pode ser pelo menos cerca de 0,1 um, pelo menos cerca de 1 um, pelo menos cerca de 10 um, pelo menos cerca de 100 um ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a profundidade pode ser no máximo cerca de
1 x 10º? um, no máximo cerca de 100 um, no máximo cerca de 10 um, no máximo cerca de 1 um, no máximo cerca de 0,1 um ou menos. A profundidade de cada poço (ou outra depressão 28) pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.
[0291] Em alguns casos, o diâmetro de cada poço (ou outra depressão 28) pode ser pelo menos cerca de 50 nm, pelo menos cerca de 0,1 um, pelo menos cerca de 0,5 um, pelo menos cerca de 1 um, pelo menos cerca de 10 um, pelo menos cerca de 100 um ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o diâmetro pode ser no máximo cerca de 1 x 10º um, no máximo cerca de 100 um, no máximo cerca de 10 um, no máximo cerca de 1 um, no máximo cerca de 0,5 um, no máximo cerca de 0,1 um ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). O diâmetro de cada poço (ou outra depressão 28) pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.
[0292] Quando a depressão 28 é uma vala (ver, por exemplo, Fig. 34H), ambas as valas e as regiões intersticiais podem ter uma configuração retilínea. A profundidade de cada vala pode ser de pelo menos cerca de 0,02 um (20 nm), pelo menos cerca de 0,1 um (100 nm), pelo menos cerca de 1 um, pelo menos cerca de 10 um, pelo menos cerca de 100 um ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a profundidade pode ser no máximo cerca de 1 x 10º um, no máximo cerca de 100 um, no máximo cerca de 10 um, no máximo cerca de 1 um, no máximo cerca de 0,1 um ou menos. A profundidade de cada vala pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.
[0293] Em alguns casos, a largura de cada vala pode ser de pelo menos cerca de 0,02 um, pelo menos cerca de 0,1 um, pelo menos cerca de 0,5 um, pelo menos cerca de 1 um, pelo menos cerca de 10 um, pelo menos cerca de 100 um, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, a largura pode ser no máximo cerca de 1 x 10º um, no máximo cerca de 100 um, no máximo cerca de 10 um, no máximo cerca de 1 um, no máximo cerca de 0,5 um, no máximo cerca de 0,1 um ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). A largura de cada vala pode ser maior que, menor que ou entre os valores especificados acima.
[0294] A Fig. 3A e a Fig. 3B representam, respectivamente, uma vista em seção transversal e uma vista superior de um exemplo em que as regiões 14, 16 estão localizadas em diferentes áreas da depressão 28. Neste exemplo, as regiões 14, 16 são diretamente adjacentes um ao outro dentro da depressão 28.
[0295] Um método de exemplo para fazer o exemplo mostrado na Fig. 3A e na Fig. 3B é mostrado na Fig. 28A a Fig. 28G. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo desse relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza. Além disso, a Fig. 3A e a Fig. 3B representam a depressão 28 definida em um substrato de camada única 26, enquanto o exemplo descreve a depressão 28 definida em uma resina padronizada 54' em um suporte 52 de um substrato de múltiplas camadas. Deve ser entendido que este método pode ser utilizado com um substrato de camada única.
[0296] Neste exemplo, o substrato de múltiplas camadas inclui uma resina (padronizada) 54' em um suporte
52. Qualquer exemplo da resina 54 (por exemplo, consulte a seção "Célula de fluxo baseada em esferas"), o suporte 52 e os métodos para padronizar a resina 54 aqui descritos podem ser utilizados.
[0297] Como mostrado na Fig. 28A, a depressão 28 definida na resina padronizada 54' é adjacente às regiões intersticiais 30, que separam as depressões adjacentes 28 uma da outra. Como mostrado na Fig. 28B, uma primeira camada funcionalizada 60 é aplicada (por exemplo, depositada ou depositada e curada) na resina padronizada 54' usando qualquer uma das técnicas descritas aqui.
[0298] Na Fig. 28C e Fig. 28D, a primeira camada funcionalizada 60 é então padronizada para formar uma primeira região funcionalizada (região 14) coberta por um fotorresistente 62. Neste exemplo, o fotorresistente 62 pode ser um fotorresistente negativo (região exposta se torna insolúvel) ou um fotorresistente positivo (região exposta se torna solúvel). O fotorresistente 62 é aplicado à primeira camada funcionalizada 60, é seletivamente exposto a certos comprimentos de onda da luz para formar a região insolúvel ou solúvel e é exposto a uma solução reveladora para remover as porções solúveis. Em outros exemplos, o fotorresistente 62 pode ser substituído por uma resina litográfica por nanoimpressão. Como mostrado na Fig. 28C, neste exemplo, o fotorresistente 62 cobre uma porção da primeira camada funcionalizada 60 que está em uma primeira porção 76 da depressão 28 (por exemplo, a porção da camada 60 que é para tornar a região 14) e não cobre uma segunda porção da primeira camada funcionalizada 60 que está em uma segunda porção 78 da depressão 28.
[0299] Como mostrado na Fig. 28D, as porções expostas da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, aquelas não cobertas pelo fotorresistente 62) podem então ser removidas, por exemplo, por gravação ou outra técnica adequada. Isso expõe a segunda porção 78 da depressão 28 e as regiões intersticiais 30.
[0300] Como mostrado na Fig. 28E, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, usando qualquer técnica de deposição adequada (com ou sem cura dependendo do material), no fotorresistente 62 e em porções (por exemplo, a superfície exposta S) do substrato 26, incluindo na segunda porção 78 da depressão 28 e nas regiões intersticiais 30.
[0301] Como mostrado na Fig. 28F, o fotorresistente 62 pode então ser retirado, o que também remove qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nela.
[0302] Na Fig. 28G, uma porção da segunda camada funcionalizada 64 é removida. Em particular, a segunda camada funcionalizada 64 é removida das regiões intersticiais 30. Neste exemplo, a remoção envolve o polimento da segunda camada funcionalizada 64 (e de qualquer uma da primeira camada funcionalizada 60 que pode estar presente) das regiões intersticiais 30.
[0303] O processo de polimento pode ser realizado com uma pasta química suave (incluindo, por exemplo, um abrasivo, um tampão, um agente quelante, um surfactante e/ou um dispersante) que pode remover a segunda camada funcionalizada 64 (e qualquer uma das primeiras camadas funcionalizadas 60 que pode estar presente) das regiões intersticiais 30 sem afetar prejudicialmente o substrato subjacente 26 ou a resina padronizada 54' nessas regiões. Alternativamente, o polimento pode ser realizado com uma solução que não inclui as partículas abrasivas.
[0304] A pasta química pode ser utilizada em um sistema de polimento químico mecânico para polir a superfície das regiões intersticiais 30. A(s) cabeça(s) / almofada(s de polimento ou outra(s) ferramenta(s) de polimento é/são capaz(es) de polir a segunda camada funcionalizada 64 (e qualquer uma das primeiras camadas funcionalizadas 60 que pode estar presente) das regiões intersticiais 30, enquanto deixa as regiões 14, 16 na(s) depressão(s) 28 pelo menos substancialmente intactas. Como exemplo, a cabeça de polimento pode ser uma cabeça de polimento Strasbaugh ViPRR II.
[0305] Os processos de limpeza e secagem podem ser realizados após o polimento. O processo de limpeza pode utilizar banho-maria e sonicação. O banho-maria pode ser mantido a uma temperatura relativamente baixa variando de cerca de 22º C a cerca de 30º C. O processo de secagem pode envolver secagem por centrifugação ou secagem através de outra técnica adequada.
[0306] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 28A a Fig. 28G) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, são anexados à primeira funcionalizada região 14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 28A a Fig. 28G) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, são anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0307] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após o a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 28B) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 28G), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0308] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 28E) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 28G), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0309] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para a resina padronizada 54'.
[0310] Embora não mostrado nas Fig. 28A a Fig. 28G, este exemplo de método pode ainda incluir o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. No exemplo utilizando as monocamadas auto-montadas, os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0311] Outro exemplo de método para fazer o exemplo mostrado na Fig. 3A e na Fig. 3B é mostrado na Fig. 29A a Fig. 29H. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza. Além disso, a Fig. 3A e a Fig. 3B representam a depressão 28 definida em um substrato de camada única 26, enquanto o exemplo de método descreve a depressão 28' definida em uma resina padronizada 54' em um suporte 52 de um substrato de múltiplas camadas. Deve ser entendido que este método pode ser utilizado com um substrato de camada única.
[0312] Neste exemplo, o substrato de múltipla camada inclui a resina (padronizada) 54' no suporte 52. Como mostrado na Fig. 29A, a depressão 28' definida na resina padronizada 54' é adjacente às regiões intersticiais 30, que separam depressões adjacentes 28' uma da outra. A depressão 28' é uma depressão em múltiplos níveis ou em múltiplas profundidades que inclui uma porção profunda 70 e uma porção rasa 72 que é definida, em parte, por uma porção em degrau 74 da resina padronizada 54'.
[0313] Neste exemplo, uma camada de sacrifício é aplicada sobre a resina padronizada 54' para que a camada de sacrifício preencha pelo menos parcialmente a porção profunda 70 na depressão 28'. Um exemplo de camada de sacrifício 76 é qualquer material que tenha uma taxa de gravação que é diferente da resina 54' e um fotorresistente 62 usado no método. Exemplos de materiais de camada de sacrifício adequados 76 incluem silicone, alumínio, fotorresistentes negativos ou positivos, cobre, etc. Esses materiais podem ser depositados usando qualquer técnica adequada aqui divulgada. Embora não mostrado, deve ser entendido que, além de ser depositada em pelo menos parte da porção profunda 70, a camada de sacrifício também pode ser depositada nas regiões intersticiais 30 e na porção em degrau 74, ou para preencher completamente a depressão 28'.
[0314] Uma porção da camada de sacrifício e uma porção da resina 54' são então removidas sequencialmente. A camada de sacrifício pode primeiro ser gravada de volta para que seja removida das regiões intersticiais 30 e da porção em degrau 74 e para que a porção remanescente da camada de sacrifício (mostrada no número de referência 80 na Fig. 29B) na porção profunda 70 esteja substancialmente nivelada com a porção em degrau 74. Como mostrado na Fig. 29B, várias porções da resina 54' são removidas. Por exemplo, porções da resina 54' são removidas para formar novas (referidas como segunda) regiões intersticiais 30' que são substancialmente niveladas com a porção remanescente da camada de sacrifício 80 e a resina 54' é removida para se livrar da porção em degrau 74. A remoção da porção em degrau 74 forma uma área/porção 76 da depressão 28' próxima à porção remanescente da camada de sacrifício 80.
[0315] Como mostrado na Fig. 29C, a primeira camada funcionalizada 60 é aplicada na porção remanescente da camada de sacrifício 80, na área/porção 76 e na (segunda) regiões intersticiais 30'. Como mostrado na Fig. 29D, um fotorresistente 62 é então aplicado na primeira camada funcionalizada 60.
[0316] Porções do fotorresistente 62 e a primeira camada funcionalizada subjacente 60 podem então ser removidas para expor a porção remanescente da camada de sacrifício 80 e as regiões intersticiais 30'. Isso é mostrado na figura 29E. Este processo de remoção pode ser realizado gravando com um agente de gravação que remove seletivamente a porção do fotorresistente 62 e a primeira camada funcionalizada subjacente 60, mas não remove a porção remanescente da camada de sacrifício 80. Neste exemplo, a gravação úmida pode ser realizada com uma solução revelador de pH básico, tal como NaOH, KOH ou TMAH (hidróxido de tetrametilamônio), ou a gravação a seco pode ser realizada com plasma de oxigênio. Neste exemplo, a gravação é interrompida quando a porção restante da camada sacrificial 80 é exposta. Isso deixa uma segunda porção (por exemplo região 14) da primeira camada funcionalizada 60 tendo uma segunda porção 62'' do fotorresistente nela na área/porção
76.
[0317] Como mostrado na Fig. 29F, a porção restante da camada sacrificial 80 é então removida para expor uma segunda área/porção 78 próxima da segunda porção (por exemplo, região 14) da primeira camada funcionalizada 60. Esse processo de remoção pode ser realizado gravando com um agente de gravação que remove seletivamente a camada de sacrifício restante 76, mas não remove a segunda porção (por exemplo, região 14) da primeira camada funcionalizada 60 tendo uma segunda porção 62'' do fotorresistente nela. Como exemplos, uma camada de sacrifício de alumínio 80 pode ser removida em condições ácidas ou básicas, uma camada de sacrifício de cobre 80 pode ser removida usando FeClº, uma camada de sacrifício fotorresistente 80 pode ser removida usando solventes orgânicos, como acetona, ou em condições básicas (pH) ; e uma camada de sacrifício de silício 80 pode ser removida em condições básicas (pH).
[0318] Como mostrado na Fig. 29G, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada à área/porção 78, usando qualquer técnica de deposição adequada (e se aplicável, cura). Isso forma a segunda região funcionalizada 16. Como mostrado na Fig. 29G, a segunda camada funcionalizada 64 também pode ser aplicada na segunda porção 62'' do fotorresistente e nas regiões intersticiais 30.
[0319] Como mostrado na Fig. 29G, a segunda porção 62'' do fotorresistente pode então ser removida, o que também remove qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nela. Isso forma a primeira região funcionalizada 14. O polimento também pode ser realizado para remover a segunda camada funcionalizada 64 das regiões intersticiais 30'.
[0320] Enquanto o exemplo mostrado nas Fig. 29A a 29H inclui o fotorresistente 62, deve ser entendido que se a segunda camada funcionalizada 64 não aderir à primeira camada funcionalizada 60, então o fotorresistente 62 pode ser omitido. Além disso, se a camada de sacrifício 80 é um material transparente que a primeira camada funcionalizada
60 não adere, então a camada de sacrifício 80 pode não ser removida e a região 16 pode ser formada na camada de sacrifício 80.
[0321] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 29A a Fig. 29H) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, são anexados à primeira funcionalizada região 14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 29A a Fig. 29H) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0322] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20º não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após o a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 29C). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 29H), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0323] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 29G). Se as regiões 14, 16 tiverem grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 29H), porque eles não serão enxertados nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0324] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para a resina padronizada 54'.
[0325] Embora não mostrado nas Fig. 29A a Fig. 29H, este exemplo de método pode incluir ainda o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. No exemplo utilizando as monocamadas auto-montadas, os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0326] Ainda um outro exemplo de método para fazer o exemplo mostrado na Fig. 3A e na Fig. 3B é mostrado nas Fig. 30A a Fig. 30F. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza. Além disso, a Fig. 3A e a Fig. 3B representam a depressão 28' definida em um substrato de camada única 26, enquanto o exemplo do método representa a depressão 28' definida em uma resina padronizada 54' em um suporte 52 de um substrato de várias camadas. Deve ser entendido que este método pode ser utilizado com um substrato de camada única.
[0327] Como mostrado na Fig. 30A, neste exemplo, o substrato de múltiplas camadas inclui uma resina não padronizada 54 no suporte 52 e a camada de sacrifício 80 na resina 54. Quaisquer exemplos da resina 54, suporte 52 e a camada de sacrifício 80 pode ser usada.
[0328] Como mostrado na Fig. 30B, resina adicional é aplicada à camada de sacrifício 80 e é padronizada para definir a depressão 28' nela. A resina adicional pode ser igual ou diferente da resina 54. A depressão 28' é uma depressão de múltiplos níveis ou de múltiplas profundidades que inclui a porção profunda 70 e a porção rasa 72 que é definida, em parte, por uma porção em degrau 74 da resina padronizada 54'.
[0329] Como mostrado na Fig. 30C, uma primeira porção da resina padronizada 54' (adjacente à porção profunda 70) e uma porção da camada de sacrifício 80 subjacente à porção profunda 70 são gravadas. Isso expõe uma porção 82 da resina
54. Em um exemplo, a resina padronizada 54' pode ser gravada usando um plasma de oxigênio anisotrópico para expor a porção subjacente da camada de sacrifício 80 e, então, a porção da camada de sacrifício 80 pode ser removida, por exemplo, usando um plasma de BCl; e Cl;.
[0330] Como mostrado na Fig. 30D, a porção em degrau 74 da resina padronizada 54' é de certa forma gravada, por exemplo, usando plasma de oxigênio. Isso expõe a camada de sacrifício 80 que está por trás da porção em degrau 74. O agente de gravação usado pode gravar a resina 54', mas não a camada de sacrifício 80. Como tal, a camada de sacrifício 80 atua como uma parada de gravação e, portanto, a porção
102' da camada de sacrifício 80 é exposta.
[0331] Deve ser entendido que quando a resina 54' é gravada, as regiões intersticiais iniciais 30 podem ser encurtadas. Como tal, as regiões intersticiais 30' são formadas.
[0332] Também como mostrado na Fig. 30D, a primeira camada funcionalizada 60 pode ser depositada (e curada em alguns casos). A primeira camada funcionalizada 60 pode não aderir à porção exposta 102' da camada de sacrifício 80, mas irá aderir à porção 82 da resina 54 e às regiões intersticiais 30' em torno da depressão 28'.
[0333] A porção exposta 102' da camada de sacrifício 80 pode então ser gravada (por exemplo, usando uma solução básica ou FeCl; dependendo do material), e a segunda camada funcionalizada 64 pode ser depositada (e curada dependendo do material). Como mostrado na Fig. 30E, a segunda camada funcionalizada 64 é aplicada à porção recém-exposta da resina 54 (onde a porção 102' foi removida). Em um exemplo, a primeira camada funcionalizada 60 não tem afinidade para a segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, a segunda camada funcionalizada 64 não se deposita na primeira camada funcionalizada 60. Neste exemplo do método, como mostrado na Fig. 30F, o polimento pode ser realizado para remover a primeira camada funcionalizada 60 das regiões intersticiais 30'.
[0334] Em alguns exemplos do(s) método(s) das Fig. 30A a Fig. 30F, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 30A a Fig. 30F) podem ser pré-enxertados para a primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados à primeira região funcionalizada 14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados na Fig. 30A-Fig. 30) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto de iniciador adicional não é realizado.
[0335] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20º não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após o a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 30A ou 30D). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 30F), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0336] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 30E) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 30F), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0337] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21'
reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para a resina padronizada 54'.
[0338] Embora não mostrado nas Fig. 30A a Fig. 30F, este exemplo de método pode incluir ainda o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. No exemplo, utilizando as monocamadas auto-montadas, os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0339] Ainda um outro exemplo de método para fazer o exemplo mostrado na Fig. 3A e na Fig. 3B é mostrado na Fig. 31A a Fig. 311. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza. Além disso, a Fig. 3A e a Fig. 3B representam a depressão 28' definida em um substrato de camada única 26, enquanto o exemplo do método representa a depressão 28' definida em uma resina padronizada 54' em um suporte 52 de um substrato de múltiplas camadas. Deve ser entendido que este método pode ser utilizado com um substrato de camada única.
[0340] Como mostrado na Fig. 31A, o substrato de múltiplas camadas inclui a resina (padronizada) 54' no suporte 52. A depressão 28' definida na resina padronizada 54' é adjacente às regiões intersticiais 30, que separam depressões adjacentes 28' um do outro. A depressão 28' é uma depressão em múltiplos níveis ou múltiplas profundidades que inclui uma porção profunda 70 e uma porção rasa 72 que é definida, em parte, por uma porção em degrau 74 da resina padronizada 54'.
[0341] Como mostrado na Fig. 31B, uma primeira camada funcionalizada 60 é aplicada na resina padronizada 54'. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser qualquer um dos exemplos aqui divulgados e pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas.
[0342] Na Fig. 31C e Fig. 31D, a primeira camada funcionalizada 60 é então padronizada para formar uma primeira região funcionalizada (região 14) coberta por um fotorresistente 62. Neste exemplo, o fotorresistente 62 é um fotorresistente negativo (região exposta torna-se insolúvel). Como mostrado na Fig. 31C, o fotorresistente 62 é aplicado à primeira camada funcionalizada 60, é seletivamente exposto a certos comprimentos de onda da luz para formar a região insolúvel (mostrado em 62 na Fig. 31D) e é exposto a uma solução reveladora para remover as porções solúveis. Como mostrado na Fig. 31D, as porções expostas da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, aquelas não cobertas pelo fotorresistente 62) podem então ser removidas, por exemplo, por gravação ou outra técnica adequada. A porção restante da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, a região 14) está no primeiro nível de cada depressão de múltiplos níveis. Neste exemplo, o primeiro nível está na porção profunda 70 no suporte 52.
[0343] Neste exemplo, uma camada de sacrifício 84 é aplicada no fotorresistente 62 e nas porções da resina 54' (por exemplo, regiões intersticiais 30, superfície da porção em degrau 74). A camada de sacrifício 84 é mostrada na Fig.
31E. Qualquer material pode ser usado, como a camada de sacrifício 84 que tem um diferencial de gravação em relação à resina 54'. Em um exemplo, o alumínio pode ser usado como a camada de sacrifício 84.
[0344] Como mostrado na Fig. 31F, a camada de sacrifício 84 é removida das porções da resina 54'. A camada de sacrifício 84 pode primeiro ser gravada de volta para que seja removida das regiões intersticiais 30 e da porção em degrau 74 e para que a porção restante da camada de sacrifício (mostrada no número de referência 84' na Fig. 31F) permaneça no fotorresistente 62 na porção profunda 70.
[0345] Uma região da resina 54' (especificamente a porção em degrau 74) é então removida da depressão de múltiplas camadas 28' para criar uma área/porção 78 que é adjacente à primeira região funcionalizada 14 (por exemplo, a porção da primeira camada funcionalizada 60 que está subjacente ao fotorresistente 62 e a porção restante da camada de sacrifício 84'. Esse processo também pode remover porções das regiões intersticiais 30, resultando em novas regiões intersticiais 30'. Esse processo de remoção pode ser realizado gravando com um agente de gravação, tal como plasma de oxigênio, que remove seletivamente a resina 54', mas não remove a porção restante da camada de sacrifício 84'.
[0346] Como mostrado na Fig. 31H, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, usando qualquer técnica de deposição adequada, na porção restante da camada de sacrifício 84, na área/porção 78 e nas regiões intersticiais 30'.
[0347] Como mostrado na Fig. 311, o fotorresistente
62 pode então ser retirado, o que também remove a porção restante da camada de sacrifício 84' e qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nela. Qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nas regiões intersticiais 30' também pode ser removida por polimento.
[0348] Em alguns exemplos do(s) método(s) da Fig. 31A a Fig. 311, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 31A a 311) podem ser pré-enxertados para a primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, está anexada à primeira região funcionalizada 14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 31A a Fig. 311) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexadas à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto de iniciador adicional não é realizado.
[0349] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 31B). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 311), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0350] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 31H)
Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19 ', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 311), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0351] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para a resina padronizada 54'.
[0352] Embora não mostrado nas Fig. 31A a Fig. 311, este exemplo de método pode ainda incluir o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. No exemplo utilizando as monocamadas auto-montadas, os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0353] Durante todo o processamento nos exemplos mostrados nas Fig. 31A a Fig. 311, a depressão em múltiplos níveis 28' se torna uma depressão em nível único 28, como mostrado na Fig. 3A.
[0354] Figs. 4A a 4C ilustram diferentes exemplos das regiões 14, 16 que estão localizadas em diferentes partes da depressão 28.
[0355] Na Fig. 4A, existe um espaço 36 entre as regiões 14, 16. Assim, este exemplo da célula de fluxo inclui um espaço 36 que separa o primeiro conjunto de iniciadores
12A, 12B, 12C, 12D (na região 14, não mostrado na Fig. 4A) e o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' (na região 16, não mostrada na Fig. 4B). Em um exemplo, o espaço 36 é um espaço entre as respectivas seções de polímero onde as regiões 14, 16 são formadas. Qualquer um dos métodos mostrados nas Fig. 31A a 311 pode ser modificado para formar o espaço 36. O espaço 36 pode ter qualquer comprimento mensurável maior que zero. Em um exemplo, o espaço 36 é maior que 1 nm. Em um exemplo, o espaço varia de cerca de l nm a cerca de 10 nm.
[0356] Na Fig. 4B, as regiões 14, 16 se sobrepõem parcialmente. A região de sobreposição 38 é uma área onde ambos os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' e os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' são enxertados. Em um exemplo, esta região de sobreposição 38 pode ser formada durante o processo de padronização e enxerto, por ter a mesma porção da camada de polímero 32 exposta quando os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' são enxertados e quando os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' são enxertados. Em outro exemplo, esta região de sobreposição 38 pode ser formada quando os iniciadores enxertados separadamente 18, 20 ou 18', 20' e os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' se sobrepõem fisicamente ou se interdifundem durante ou após o processo.
[0357] Nas Figs. 4C, a primeira e a segunda porções da depressão 28', onde as respectivas regiões 14, 16 são geradas têm profundidades diferentes. Qualquer uma das profundidades da depressão aqui descritas pode ser usada, desde que uma porção da depressão 28' seja mais profunda que a outra porção da depressão 28'. As diferentes profundidades podem ser geradas quando a depressão 28' é formada, por exemplo, por nanoimpressão, gravação, etc.
[0358] Um exemplo de método para fazer o exemplo mostrado na Fig. 4C é mostrado nas Fig. 32A a Fig. 32F. Embora os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' sejam mencionados ao longo deste relatório descritivo, eles não são mostrados para fins de clareza. Além disso, a Fig. 4C representa a depressão 28 definida em um substrato de camada única 26, enquanto o exemplo do método representa a depressão 28' definida em uma resina padronizada 54' em um suporte 52 de um substrato de múltiplas camadas. Deve ser entendido que este método pode ser utilizado com um substrato de camada única.
[0359] Como mostrado na Fig. 32A, o substrato de múltiplas camadas inclui a resina (padronizada) 54' no suporte 52. A depressão 28' definida na resina padronizada 54' é adjacente às regiões intersticiais 30, que separam depressões adjacentes 28' um do outro. A depressão 28' é uma depressão de múltiplos níveis ou em múltiplas profundidades que inclui uma porção profunda 70 e uma porção rasa 72 que é definida, em parte, por uma porção em degrau 74 da resina padronizada 54'.
[0360] Como mostrado na Fig. 32B, uma primeira camada funcionalizada 60 é aplicada sobre a resina padronizada 54'. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser qualquer um dos exemplos aqui divulgados e pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas e, se adequado, também pode ser curada.
[0361] Na Fig. 32C e Fig. 32D, a primeira camada funcionalizada 60 é então padronizada para formar uma primeira região funcionalizada (região 14) coberta por um fotorresistente 62. Neste exemplo, o fotorresistente 62 é um fotorresistente negativo ou fotorresistente positivo. Como mostrado na Fig. 32C, o fotorresistente 62 é aplicado à primeira camada funcionalizada 60, é seletivamente exposto a certos comprimentos de onda da luz para formar a região insolúvel ou a região solúvel (dependendo da resistência usada) e é exposto a uma solução reveladora para remover as porções solúveis. Como mostrado na Fig. 32D, as porções expostas da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, aquelas não cobertas pelo fotorresistente 62) podem então ser removidas, por exemplo, por gravação ou outra técnica adequada. Neste exemplo, a primeira camada funcionalizada 60 e a resina 54' podem ter um diferencial de gravação. A porção restante da primeira camada funcionalizada 60 (por exemplo, região 14) está no primeiro nível de cada depressão de múltiplos níveis. Neste exemplo, o primeiro nível está na porção profunda 70 na resina 54'.
[0362] Como mostrado na Fig. 32E, a segunda camada funcionalizada 64 é então aplicada, utilizando qualquer técnica de deposição adequada, nas porções expostas da resina 54' (por exemplo, nas regiões intersticiais 30 e na região em degrau 74). Dependendo do material, a segunda camada funcionalizada 64 também pode ser curada. Em um exemplo, o fotorresistente 62 não tem afinidade para a segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, a segunda camada funcionalizada 64 não se deposita no fotorresistente 62. Em outro exemplo, a segunda camada funcionalizada 64 pode ser depositada no fotorresistente 62, mas pode ser removida com o fotorresistente 62 que é retirado.
[0363] Como mostrado na Fig. 32F, o fotorresistente 62 pode então ser retirado, o que, em alguns casos, também remove qualquer uma das segundas camadas funcionalizada 64 nele. Qualquer uma das segundas camadas funcionalizadas 64 nas regiões intersticiais 30 também pode ser removida por polimento.
[0364] Em alguns exemplos do(s) método(s) das Fig. 32A a Fig. 32F, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 32A a Fig. 32F) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, está anexada à primeira região funcionalizada 14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 32A a Fig. 32F) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, o enxerto de iniciador adicional não é realizado.
[0365] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 32B). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 32F), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 16.
[0366] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 32E). Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 32F), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície da região 14.
[0367] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º reagem com grupos reativos da região 16 e não possuem afinidade para a resina padronizada 54'.
[0368] Embora não mostrado nas Fig. 32A a Fig. 32F, este exemplo de método pode ainda incluir o depósito de uma primeira monocamada auto-montada (SAM) na primeira região funcionalizada 14 e o depósito de uma segunda monocamada auto-montada (SAM) na segunda região funcionalizada 16. No exemplo utilizando as monocamadas auto-montadas, os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' são enxertados após as SAMS serem formadas.
[0369] Figs. 5, 6A e 6B ilustram exemplos diferentes onde o substrato 26 inclui depressões 28 separadas por regiões intersticiais 30; cada uma das depressões inclui a primeira região 14; e a segunda região 16 está localizada em pelo menos algumas das regiões intersticiais 30. Como tal, nesses exemplos, uma das regiões 14 está localizada na depressão 28 e a outra das regiões 16 está localizada na superfície do substrato S adjacente à depressão 28. No exemplo mostrado na Fig. 5, a região 16 na superfície do substrato S está próxima da depressão 28. No exemplo mostrado nas Figs. 6A e 6B, a região 16 na superfície do substrato S circunda a depressão 28. Exemplos de métodos para fazer uma das regiões 14, 16 na depressão 28 e a outra das regiões 16, 14 em pelo menos uma porção da superfície do substrato S serão agora descritos em referência às Fig. 7A a Fig. /1G e Fig. 8A a Fig. 8F.
[0370] Um método de exemplo para fazer o exemplo mostrado nas Figs. 6A e 6B é mostrado nas Figs. 7A a 7G. Como mostrado na Fig. 7A, o método utiliza o substrato 26 com uma pluralidade de depressões 28 separadas por regiões intersticiais 30. Neste exemplo de método, a camada de polímero 32 é depositada no substrato 26 e polida a partir das regiões intersticiais 30, como descrito em referência às Figs. 3A e 3B. Isso deixa a camada de polímero 32 na depressão 28 e não nas regiões intersticiais 30. Se é desejável que as regiões 14 estejam nas depressões 28, então os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados usando qualquer dos exemplos aqui divulgados. Se é desejável que as regiões 16 estejam nas depressões 28, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados usando qualquer um dos exemplos aqui divulgados. No exemplo mostrado na Fig. 7B, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' são enxertados na camada de polímero 32. Deve ser entendido que os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' serão enxertados na camada de polímero 32 na depressão 28 e não enxertará nas regiões intersticiais 30, como mostrado na Fig. 7B.
[0371] Em alguns exemplos deste método, o substrato 26 (que tem a região 14 ou 16 formada na depressão 28) é exposto a um agente de capeamento (capping agent). O agente de capeamento inclui uma espécie química que pode reagir com quaisquer grupos funcionais que não reagiram da camada de polímero 32 (por exemplo, quaisquer grupos funcionais que não reagiram com um iniciador 18, 20 ou 18', 20''), a fim de tornar esses funcionais grupos não funcionais durante o processamento subsequente. Este processo pode reduzir a capacidade da camada de polímero depositada 32' aderir subsequentemente à região 14. Em outras palavras, a interação entre a camada de polímero 32 e a camada de polímero depositada subsequentemente 32' é reduzida de modo que pouca ou nenhuma camada de polímero 32' possa aderir à camada de polímero 32. Isso, por sua vez, reduz a capacidade de iniciadores depositados subsequentemente (por exemplo, 19 21 ou 19', 21') enxertar na área que cobre a região 14.
[0372] Em um exemplo onde a camada de polímero 32 inclui grupos funcionais de azida, as espécies químicas no agente de capeamento podem ser um agente redutor, como uma fosfina. Um exemplo de fosfina é tris (hidróxipropil)fosfina. As azidas não reagidas da camada de polímero 32 serão reduzidas pela fosfina, o que as torna não funcionais para enxerto de iniciador adicional.
[0373] Como mostrado na Fig. 7C, o método então inclui depositar a segunda camada de polímero 32'. A camada de polímero 32' pode ser o mesmo polímero que é usado na camada de polímero 32 ou pode ser um tipo de polímero diferente daquele usado na camada de polímero 32. Em um exemplo, cada um do primeiro polímero 32 e o segundo polímero 32' é um copolímero de acrilamida, como PAZAM. A camada de polímero 32' pode revestir apenas as regiões intersticiais ou pode revestir pelo menos algumas das regiões 14, além das regiões intersticiais 30. Se a camada de polímero 32' reveste pelo menos parcialmente as regiões 14 dependerá do agente de capeamento usado na camada de polímero 32.
[0374] Neste exemplo, as cadeias polinucleotídicas modelo, incluindo uma primeira fita modelo não clivável 40 e uma segunda fita modelo clivável 42, podem ser formadas na região 14 usando, respectivamente, os iniciadores 18 ou l18'e 20, 20'. No início da formação da fita polinucleotídica modelo, os modelos de biblioteca podem ser preparados a partir de qualquer amostra de ácido nucleico (por exemplo, uma amostra de DNA ou uma amostra de RNA). A amostra de ácido nucleico pode ser fragmentada em fragmentos de DNA ou RNA de cadeia única, de tamanho semelhante (por exemplo, <1000 pb). Durante a preparação, os adaptadores podem ser adicionados às extremidades desses fragmentos. Através de amplificação de ciclo reduzido, diferentes motivos (motifs) podem ser introduzidos nos adaptadores, tal como locais de ligação de sequenciamento, índices e regiões que são complementares aos iniciadores 18 ou 18' e 20, 20' nas regiões 14. Os modelos finais da biblioteca incluem o fragmento de DNA ou RNA e adaptadores em ambas extremidades. Em alguns exemplos, os fragmentos de uma única amostra de ácido nucleico têm os mesmos adaptadores adicionados a eles.
[0375] Uma pluralidade de modelos de biblioteca pode ser introduzida no substrato 26. Isso pode envolver a introdução de um fluido modelo na célula de fluxo. O fluido modelo pode incluir um veículo líquido e a pluralidade de modelos de biblioteca. Como o substrato 26 inclui uma matriz de regiões 14 nas depressões 28, múltiplos modelos de biblioteca são hibridizados, por exemplo, a um dos dois tipos de iniciadores 18, 18' ou 20, 20' nele imobilizados.
[0376] A geração de cluster pode então ser executada. Durante a geração de cluster, um modelo do fluido modelo é amplificado para formar um cluster em pelo menos algumas das depressões 28. Em um exemplo de geração de cluster, os modelos da biblioteca são copiados a partir dos iniciadores hibridizados 18, 18' ou 20, 20' pela extensão de 3' usando uma DNA polimerase de alta fidelidade. Os modelos originais da biblioteca são desnaturados, deixando as cópias imobilizadas nas regiões 14. A amplificação isotérmica em ponte pode ser usada para amplificar as cópias imobilizadas. Por exemplo, os modelos copiados fazem uma alça (loop) para hibridizar a um iniciador adjacente complementar 20, 20' ou 18, 18' e uma polimerase copia os modelos copiados para formar pontes de fita dupla, que são desnaturadas para formar duas fitas de fita única. Essas duas fitas fazem uma alça e hibridizam a iniciadores complementares adjacentes 20, 20' ou 18, 18' e são estendidos novamente para formar duas novas alças de fita dupla. O processo é repetido em cada cópia de modelo por ciclos de desnaturação e amplificação isotérmica para criar aglomerados clonais densos. Cada aglomerado de pontes de fita dupla é desnaturado, resultando em primeiras fitas modelo não cliváveis 40 anexadas aos primeiros iniciadores não cliváveis 18, 18' e segundas fitas modelo cliváveis 42 anexadas aos segundos iniciadores cliváveis 20, 20', como mostrado na Fig. 7D. Deve ser entendido que a clivabilidade dos iniciadores conduz a clivabilidade das fitas molde anexadas a eles. Como as segundas fitas modelo 42 anexadas nos segundos iniciadores cliváveis 20, 20' incluem o local de clivagem 22, as segundas fitas modelo cliváveis 42 são cliváveis. Este exemplo de agrupamento é a amplificação em ponte e é um exemplo da amplificação que pode ser realizada. Deve ser entendido que outras técnicas de amplificação podem ser usadas, tal como o fluxo de trabalho de amplificação de exclusão (Examp) (ITllumina Inc.).
[0377] Deve ser entendido que, como a segunda camada de polímero 32' não possui os iniciadores 18, 18' ou 20, 20' enxertados nela, o processo de amplificação não se estende além das depressões individuais 28.
[0378] Um fluido de iniciação pode então ser introduzido no substrato 26. O fluido de iniciação inclui um veículo líquido e um segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' que é diferente do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D que tinha sido introduzido nas depressões 28. O veículo líquido no fluido de iniciação pode ser qualquer líquido que pode suportar química de clique, tal como tampão fosfato salina (PBS), salina citrato de sódio (SSC), um tampão à base de carbonato , etc. Neste exemplo, o conjunto de iniciadores no fluido de iniciação inclui os iniciadores 19 ou 19' e 21 ou 21'. Deve ser entendido que, se o conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' (incluindo os iniciadores 19 ou 19' e 21 ou 21') é enxertado primeiro para formar a região 16 nas depressões 28, então o fluido de iniciação pode incluir o conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18 ou 18' e 20 ou 20').
[0379] Os iniciadores 19 ou 19' e 21 ou 21' no fluido de iniciação podem enxertar na segunda camada de polímero 32' que cobre as regiões intersticiais 30. Como a segunda camada de polímero 32' pode não aderir à camada de polímero 32, porque a amplificação foi realizada na região 14 e porque os grupos funcionais da camada de polímero subjacente 32 haviam se tornado não funcionais, os iniciadores 19 ou 19' e 21 ou 21' não podem enxertar na camada de polímero exposta
32.
[0380] Como mostrado na Fig. 7E, os iniciadores enxertados 19 ou 19' e 21 ou 21' se anexam à segunda camada de polímero 32' que cobre as regiões intersticiais 30, que formam a região 16.
[0381] Amplificação adicional pode então ser realizada. Por exemplo, a amplificação em ponte pode ser iniciada a partir do cluster para os iniciadores enxertados 19 ou 19' e 21 ou 21' a fim de formar um segundo cluster em pelo menos algumas das regiões intersticiais. Durante esta rodada de amplificação, as primeiras fitas modelo não cliváveis 40 fazem alças e hibridizam com iniciadores complementares adjacentes 21, 21' enquanto as segundas fitas modelo cliváveis 42 fazem alças e hibridizam a iniciadores complementares adjacentes 19, 19'. As respectivas fitas 40, 42 são estendidas para formar duas novas alças de fita dupla. O processo é repetido em cada cópia do modelo por ciclos de desnaturação e amplificação isotérmica para criar clusters clonais densos que crescem para fora das depressões 28 para as regiões intersticiais 30. Cada cluster adicional de pontes de fita dupla é desnaturado, resultando em segundas fitas modelo não cliváveis 44 anexadas aos segundos iniciadores não cliváveis 21, 21' e primeiras fitas modelo cliváveis 46 anexadas aos primeiros iniciadores cliváveis 19, 19', como mostrado na Fig. 7F. Como as primeiras fitas modelo cliváveis 46 anexadas aos primeiros iniciadores cliváveis 19, 19' incluem o local de clivagem 22' ou 23, as primeiras fita modelo cliváveis 46 são cliváveis.
[0382] Deve ser entendido que quando as primeiras fitas modelo não cliváveis 40 são fitas senso, as segundas fitas modelo não cliváveis 44 são fitas antisenso, e quando as primeiras fitas modelo não cliváveis 40 são fitas antisenso, as segundas fitas modelo não cliváveis 44 são cadeias senso. Da mesma forma, quando as primeiras fitas modelo cliváveis 46 são fitas senso, as segundas fitas modelo cliváveis 42 são fitas antisenso, e quando as primeiras fitas modelo cliváveis 46 são fitas antisenso, as segundas fitas modelo cliváveis 42 são fitas senso.
[0383] As primeiras e segundas fitas modelo cliváveis 46, 42 podem então ser removidas através da introdução de um agente químico ou de um agente de clivagem enzimática, dependendo dos locais de clivagem 22, 22' ou 22,
23. Como mostrado na Fig. 7G, após a clivagem, as primeiras fitas modelo não cliváveis 40 permanecem na região 14 na depressão 28 e as segundas fitas modelo não cliváveis 44 permanecem na região 16 nas regiões intersticiais 30. Em um exemplo depois que a clivagem é realizada, a região 14 inclui fitas senso e a região 16 inclui fitas antisenso.
[0384] Outro exemplo de método para fazer os exemplos mostrados nas Figs. 5, 6A e 6B é mostrado nas Figs. 8A a 8G. Como mostrado na Fig. 8A, o método utiliza o substrato 26 tendo uma pluralidade de depressões 28 separadas por regiões intersticiais 30. Neste exemplo de método, a camada de polímero 32 é depositada no substrato 26 de modo que a mesma esteja presente nas depressões 28 e nas regiões intersticiais
30. Se for desejável que as regiões 14 estejam nas depressões 28, então os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados usando qualquer um dos exemplos aqui divulgados. Se for desejável que as regiões 16 estejam nas depressões 28, então os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados usando qualquer um dos exemplos aqui divulgados. No exemplo mostrado na Fig. 8B, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' são enxertados na camada de polímero 32. Deve ser entendido que os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' serão enxertados na camada de polímero 32 ao longo de todo o substrato 26, como mostrado na Fig. 8B.
[0385] Neste exemplo de método, como mostrado na Fig. 8C, um revestimento protetor 48 é então depositado na camada de polímero 32 tendo o conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D nele enxertado. O revestimento protetor 48 pode ser uma resistência de remoção. Este tipo de revestimento protetor 48 pode ser centrifugado, curado e subsequentemente removido em um momento desejável no processo. O revestimento protetor 48 também pode ser um revestimento solúvel em água.
[0386] A gravação pode então ser realizada para expor aquelas regiões intersticiais 30 onde é desejável gerar a região 16 incluindo o conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D'. Por exemplo, uma seção isolada da superfície do substrato S próxima de cada depressão 28 pode ser exposta por gravação para formar o exemplo mostrado na Fig. 5. Para outro exemplo, uma seção da superfície do substrato S que circunda toda a depressão 28 pode ser exposta via gravação para formar o exemplo mostrado nas Figs. 6A e 6B. A Fig. 8D ilustra um exemplo do substrato 26 depois que a gravação é realizada para expor as regiões intersticiais 30. Neste exemplo, a gravação por plasma pode ser realizada com ar ou gás oxigênio.
[0387] Este método de exemplo pode então envolver a silanização das porções expostas da superfície do substrato S. A silanização introduz um promotor de adesão à superfície do substrato S para ajudar a segunda camada de polímero 32'a aderir a ele.
[0388] A segunda camada de polímero 32' é então depositada. Como mostrado na Fig. 8E, a segunda camada de polímero 32' pode ser depositada nas porções expostas da superfície do substrato S (por exemplo, nas regiões intersticiais 30) e no revestimento protetor 48. Neste exemplo de método, a camada de polímero 32' pode ser o mesmo polímero que é usado na camada de polímero 32, ou pode ser um tipo de polímero diferente daquele usado na camada de polímero 32.
[0389] Como mostrado na Fig. 8F, os iniciadores 19, 19' e 21, 21' do segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' podem então ser enxertados na camada de polímero
32' para gerar as regiões 16. O enxerto pode ser realizado usando qualquer um dos métodos aqui descritos. Em outro exemplo, a camada de polímero 32' pode ser pré-enxertada com os iniciadores 19, 19' e 21, 21º.
[0390] Embora não mostrado, deve ser entendido que este exemplo de método pode incluir remover o revestimento protetor 48. Como um exemplo, um método de remoção pode ser usado para remover o revestimento protetor 48 e qualquer camada de polímero 32' e iniciadores 19, 19' e 21, 21' nele. Se o revestimento protetor 48 é solúvel em água, a remoção pode envolver a dissolução do revestimento 48 em água, o que também removerá qualquer camada de polímero subjacente 32' e os iniciadores 19, 19' e 21, 21 '. A remoção do revestimento protetor expõe todos os iniciadores 18, 18' e 20, 20' nas regiões 14 e todos os iniciadores 19, 19'e 21, 21' nas regiões 16.
[0391] Embora não mostrado nas Fig. 8A a Fig. 8F, deve ser entendido que uma pluralidade de modelos da biblioteca pode então ser introduzida no substrato 26. Como o substrato 26 inclui uma matriz de regiões 14 nas depressões 28, múltiplos modelos da biblioteca são hibridados, por exemplo, a um dos dois tipos de iniciadores 18, 18' ou 20, 20' nele imobilizados. Neste exemplo, porque o substrato 26 também inclui uma matriz de regiões 16 em pelo menos algumas das regiões intersticiais 30, múltiplos modelos da biblioteca são hibridizados, por exemplo, com um dos dois tipos de iniciadores 19, 19'ou 21, 21' imobilizado nele. A geração de cluster pode então ser realizada como descrito aqui. A clivagem dos modelos cliváveis também pode ser realizada pela clivagem do primeiro iniciador clivável 19, 19' e do segundo iniciador clivável 20, 20'.
[0392] A Fig. 9 ilustra ainda outro exemplo das regiões 14, 16 que estão localizadas em diferentes partes da depressão 28. Neste exemplo, uma das regiões 14 ou 16 faz parte de uma esfera 50 que está posicionado na depressão 28. A esfera 50 inclui uma estrutura de núcleo 49 e a região 16 na superfície da estrutura de núcleo 49. Neste exemplo, a região 16 pode incluir grupo(s) funcional (ais) inerentemente presentes na superfície da estrutura de núcleo 49, ou grupo(s) funcional(ais) incorporado(s) na superfície da estrutura do núcleo 49 através de qualquer técnica de funcionalização adequada (por exemplo, reação química, revestimento da estrutura do núcleo 49 com um polímero contendo grupo reativo, etc.).
[0393] Embora uma única depressão 28 seja mostrada na Fig. 9, deve ser entendido que em alguns exemplos, o substrato 26 inclui uma pluralidade de depressões 28 separadas por regiões intersticiais 30; e cada uma das depressões inclui uma primeira porção onde a primeira região 14 está localizada, e uma segunda porção; e a célula de fluxo compreende ainda uma esfera 50 localizado na segunda porção, em que a segunda região 16 está em uma superfície da esfera. Várias variações deste exemplo são ainda descritas aqui em referência às Figs. 11A a 20 na seção "Célula de Fluxo Baseada em Esfera".
[0394] A Fig. 10 representa ainda outro exemplo de configuração para as regiões 14, 16. Neste exemplo, as regiões 14, 16 estão posicionadas em substratos separados
26, 26'. Como tal, este exemplo da célula de fluxo inclui um primeiro substrato 26, um primeiro conjunto de iniciadores 12A anexado ao primeiro substrato 26, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável 18, 18' e um segundo iniciador clivável 20, 20', um segundo substrato 26' oposto ao primeiro substrato 26, e um segundo conjunto de iniciadores 12A' anexado ao segundo substrato 26', o segundo conjunto de iniciadores 12A' incluindo um primeiro iniciador clivável 19, 19' e um segundo iniciador não clivável iniciador 21, 21'. Como um exemplo do método para fazer essa célula de fluxo, cada um dos substratos 26 26' pode ser revestido com a camada de polímero (por exemplo, 32, não mostrado na Fig. 10), o primeiro conjunto de iniciadores 12A (ou 12B, 12C , ou 12D) pode ser enxertado em um dos substratos 26 e o segundo conjunto de iniciadores 12A' (ou 12B', 12C' ou 12D') pode ser enxertado no outro substrato 26 '.
[0395] Embora mostradas nas respectivas superfícies de substrato S, deve-se entender que as regiões 14, 16 podem alternativamente ser posicionadas nas depressões 28 dos respectivos substratos 26, 26'. Neste exemplo, a camada de polímero pode ser depositada nas depressões 28 e nas regiões intersticiais 30 e, então pode ser removida das regiões intersticiais 30 por meio de polimento. O primeiro conjunto de iniciadores 12A (ou 12B, 12C ou 12D) pode ser enxertado nas depressões 28 de um substrato 26, e o segundo conjunto de iniciadores 12A' (ou 12B', 12C' ou 12D') pode ser enxertado nas depressões do outro substrato 26'.
[0396] Neste exemplo, pode ser desejável para os substratos 26, 26' estarem dentro de uma proximidade próxima, de modo que a semeadura e o agrupamento do modelo possam ser executados com sucesso. Em um exemplo, "proximidade próxima" significa que a distância entre os dois substratos 26, 26' é cerca de 100 um ou menos. Em outro exemplo, a distância entre os dois substratos 26, 26' varia de cerca de 10 um a cerca de 90 um.
[0397] Em vez de serem posicionadas em substratos separados 26, 26', as primeiras e segundas regiões 14, l6 e os conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' podem ser macro-separados na superfície do substrato S ou podem estar presentes em depressões separadas 28 que são macro-separadas uma da outra. Por macro- separada, entende-se que as regiões 14, 16 são separadas umas das outras por pelo menos 5 um. Em um exemplo, as regiões 14, 16 são separadas uma da outra por uma distância que varia de cerca de 5 um à cerca de 100 um.
[0398] A Fig. 33A representa ainda outro exemplo de configuração para as regiões 14, 16. Neste exemplo, as primeiras e as segundas camadas funcionalizadas 60, 64 são integradas na porção de resina do substrato de múltiplas camadas. Como mostrado na Fig. 33A, este exemplo do substrato de múltiplas camadas inclui um suporte 52; a primeira camada funcionalizada 60 no suporte 52; a segunda camada funcionalizada 64 na primeira camada funcionalizada 60; e uma camada de passivação 86 na segunda camada funcionalizada
64.
[0399] Neste exemplo, as primeiras e as segundas camadas funcionalizadas 60, 64 podem ser qualquer resina litográfica por nanoimpressão tendo ou capaz de ter introduzido na mesma grupos funcionais de superfície que podem se anexar aos respectivos conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D'. Em um exemplo, a camada 60 pode ser funcionalizada com grupos epóxi e a camada 64 pode ser funcionalizada com grupos amina.
[0400] As resinas das camadas 60, 64 podem ser as mesmas se os respectivos conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' forem pré-enxertados nas camadas 60,64 antes do substrato de múltiplas camadas mostrado na Fig. 33A ser formado. Nestes exemplos deste método, o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (por exemplo, um primeiro iniciador não clivável 18, 18' e um segundo iniciador clivável 20, 20') pode ser pré- enxertado na primeira camada funcionalizada 60 antes da primeira camada funcionalizada 60 ser incorporada no substrato de múltiplas camada; e o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' (por exemplo, um primeiro iniciador clivável 19, 19' e um segundo iniciador não clivável 21, 21') pode ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 66 antes da segunda camada funcionalizada 64 ser incorporada no substrato de múltiplas camadas.
[0401] As camadas (se pré-enxertadas ou não) podem ser depositadas no suporte 52 usando qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0402] Quando os iniciadores são enxertados após a impressão, deve ser entendido que as camadas 60, 64 têm pelo menos diferentes grupos funcionais de superfície que podem anexar aos respectivos conjuntos de iniciadores 12A, 12A',
ou 12B, 12B' ou 12C, 12C', ou 12D, 12D'. Qualquer uma das resinas aqui divulgadas pode ser usada.
[0403] A camada de passivação 86 pode ser qualquer camada hidrofóbica que pode ser impressa. Como exemplos, a camada de passivação 86 é selecionada do grupo consistindo de um polímero fluorado, um polímero perfluorado, um polímero de silício e uma mistura dos mesmos. Como exemplos, a camada de passivação 86 pode incluir um fluoropolímero amorfo (exemplos comercialmente disponíveis o qual inclui aqueles da série CYTOPO da AGC Chemicals, que possuem um dos seguintes grupos funcionais terminais: Tipo A: -COOH, tipo M: -CONH-Si(OR)n ou S tipo: -CF3), um politetrafluoretileno (um exemplo disponível comercialmente que é TEFLONO da Chemours), parileno, um hidrocarboneto fluorado, um copolímero fluoroacrílico (um exemplo disponível comercialmente que inclui FLUOROPELO da Cytonix). A camada de passivação 86 pode ser depositada no suporte 52 usando qualquer um dos exemplos aqui divulgados.
[0404] Como mostrado na Fig. 33A, este exemplo do método inclui imprimir o substrato de múltiplas camadas, formando assim característica (por exemplo, depressões 28) separadas por regiões intersticiais 30 da camada de passivação 86, em que uma região 14, 16, respectivamente, de cada uma das primeiras e segundas camadas funcionalizadas é exposta em cada característica/depressão 28. As regiões expostas 14, 16 de uma única característica/depressão 28 e as regiões intersticiais circundantes 30 da camada de passivação 86 são mostradas a partir de uma vista superior em Fig. 33B. Para cada região 14, 16, a característica/depressão 28 tem um fundo inclinado ou uma região em degrau ou alguma outra variação na geometria que expõe ambas uma parte da camada 60 e uma parte da camada 64 da parte superior da característica/depressão 28.
[0405] Para imprimir o substrato de múltiplas camadas, um molde litográfico por nanoimpressão ou carimbo de trabalho (working stamp) 56 é pressionado contra a camada de resina 54 para criar uma impressão das características nas camadas 60, 64, 68. Em outras palavras, cada uma das as camadas 60, 64, 68 são recuadas ou perfuradas pelas protusões do carimbo de trabalho 56. As camadas 60, 64, 68 podem então ser curadas com o carimbo de trabalho 56 no lugar. A cura pode ser realizada por exposição à radiação actínica, tal como radiação de luz visível ou radiação ultravioleta (UV), ou radiação de comprimento de onda variando entre cerca de 240 nm e 380 nm quando um fotorresistente é usado; ou pela exposição ao calor quando uma resistência curável térmica é usada. A cura pode promover polimerização e/ou reticulação. Como um exemplo, a cura pode incluir múltiplos estágios, incluindo um softbake (por exemplo, para remover solvente (s)) e un hardbake. O softbake pode ocorrer a uma temperatura mais baixa, variando de cerca de 50ºC a cerca de 150ºC. A duração do hardbake pode durar de cerca de 5 segundos à cerca de 10 minutos a uma temperatura variando de cerca de 100ºC a cerca de 300ºC. Exemplos de dispositivos que podem ser usados para softbaking e/ou hardbaking incluem uma placa de placa aquecedora, forno, etc.
[0406] Após a cura, o carimbo de trabalho 56 é liberado. Isso cria características topográficas, isto é, as depressões 28, nas camadas 60, 64, 68.
[0407] Como mencionado, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados na Fig. 33A ou Fig. 33B) podem ser pré- enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados à primeira região funcionalizada 14; e os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados na Fig. 33A ou Fig. 33B) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados à segunda região funcionalizada 16. Nestes exemplos, enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0408] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' e/ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' não são pré- enxertados, respectivamente, para a primeira camada funcionalizada 60 e a segunda funcionalizada camada 64. Nestes exemplos, as regiões 14, 16 têm diferentes grupos funcionais, e os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' e os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após impressão.
[0409] Quando o enxerto é realizado após a impressão, o enxerto pode ser realizado usando qualquer técnica de enxerto aqui divulgada. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16, e não possuem afinidade para a camada de passivação 86.
[0410] Como mencionado, alguns exemplos da depressão 28 podem estar na forma de valas. A Fig. 34S representa (de uma vista superior) ainda outro exemplo de configuração para as regiões 14, 16, onde elas são formadas nas valas 28''.
[0411] Como mostrado na Fig. 34A, o substrato de múltiplas camadas inclui a resina (padronizada) 54' no suporte 52. As valas 28'' definidas na resina padronizada 54' (por exemplo, uma resina NIL, SiO;, etc.) são adjacentes às regiões intersticiais 30, que separam as valas adjacentes 28'' umas das outras (ver, por exemplo, a Fig. 34H, que ilustra uma vista superior de múltiplas valas 28'').
[0412] Como mostrado na Fig. 34B, uma camada de sacrifício 84 é aplicada na resina 54' (por exemplo, regiões intersticiais 30 e na vala 28''). Qualquer material pode ser usado como a camada de sacrifício 84 que tem um diferencial de gravação em relação à resina 54' e em relação a uma segunda camada de sacrifício 88 que é usada. Em um exemplo, a camada de sacrifício 84 é silício, alumínio ou crómio.
[0413] Como mostrado na Fig. 34C, a camada de sacrifício 84 é removida das porções da resina 54'. Neste exemplo, a camada de sacrifício 84 pode ser gravada de modo que uma região do material de sacrifício 84'' permaneça diretamente adjacente a cada parede lateral 90 de cada uma das valas 28''. Após a gravação, as regiões intersticiais 30 e uma porção inferior de cada vala 28'' são expostas.
[0414] Como mostrado na Fig. 34D, uma segunda camada de sacrifício 88 é aplicada nas regiões do material de sacrifício 84'' e em quaisquer áreas expostas da resina 54' (por exemplo, regiões intersticiais 30 e na porção inferior da vala 28''). Qualquer material pode ser usado como a segunda camada de sacrifício 88 que tem um diferencial de gravação em relação à resina 54' e em relação a uma segunda camada de sacrifício 84 que é usada. Por exemplo, se a camada 84 é silício, então a camada 88 pode ser alumínio ou crómio.
[0415] As camadas de sacrifício 84, 88 podem ser aplicadas usando qualquer uma das técnicas de deposição aqui descritas.
[0416] Como mostrado na Fig. 34E, a segunda camada de sacrifício 88 é removida das regiões do material de sacrifício 84'' e das porções da resina 54'. Neste exemplo, a segunda camada de sacrifício 88 pode ser gravada de tal modo que uma região do segundo material de sacrifício 88'' permaneça diretamente adjacente a cada uma das regiões do material de sacrifício 84''. Neste exemplo, após gravação, as regiões intersticiais 30 e outra porção inferior (menor de cada vala 28'' são expostas.
[0417] Como mostrado na Fig. 34F (representando uma vista superior), um material 92 é depositado para preencher quaisquer espaços entre as segundas regiões do material de sacrifício 84''. Em outras palavras, o material adicional 92 cobre a porção inferior de cada vala 28'' e separa completamente as regiões do segundo material sacrificial 88'. O material adicional 92 pode ser o mesmo material, como a resina 54'. Por exemplo, se o dióxido de silício for usado como resina 54', então o material adicional 92 pode ser dióxido de silício. O material adicional 92 ajuda a definir novas valas 28''' (nas quais as regiões 14,16 serão definidas), que são menores que as valas 28''.
[0418] Neste exemplo do método, como mostrado na Fig. 34G, o polimento pode ser realizado para remover o material adicional 92 das regiões intersticiais 30'.
[0419] A Fig. 34H representa uma vista superior das valas 28''' preenchidas com os dois materiais/camadas de sacrifício 84'', 88'. Como mostrado, cada um dos materiais/camadas de sacrifício 84'', 88' estende o comprimento de cada vala 28'''.
[0420] A Fig. 341 representa uma vista em seção transversal de uma das valas 28''' preenchidas com os dois materiais/camadas de sacrifício 84'', 88'.
[0421] Como mostrado na Fig. 34I, a região do material de sacrifício 84'' é removida de uma porção de cada uma das valas 28'''. Isso expõe uma área/porção 76 onde a primeira região funcionalizada 14 deve ser formada. A região do material de sacrifício 84'' pode ser gravada e esse processo de gravação não afeta a resina 54' ou a segunda região do material de sacrifício 88' devido às diferentes taxas de gravação.
[0422] Na Fig. 34K, uma primeira camada funcionalizada 60 é aplicada nas regiões intersticiais 30, na área 76 e na segunda região do material de sacrifício 88'. A primeira camada funcionalizada 60 pode ser qualquer um dos exemplos aqui divulgados e pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas aqui descritas.
[0423] Na Fig. 34KL e Fig. 34M, a primeira camada funcionalizada 60 é então padronizada para formar uma primeira região funcionalizada (região 14) coberta por um fotorresistente 62 na área/porção 76. O fotorresistente 62 e a primeira camada funcionalizada subjacente 60 pode ser polida ou gravada, usando as regiões intersticiais 30 e a segunda região de material de sacrifício 88' como uma parada de gravação. Isso forma a primeira região funcionalizada 14 coberta pelo fotorresistente 62 na área/porção 76 da vala 28!"
[0424] Como mostrado na Fig. 34N, a segunda região do material de sacrifício 88' é removida de uma porção de cada uma das valas 28'''. Isso expõe uma área/porção 78 onde a segunda região funcionalizada 16 deve ser formada. A segunda região de material de sacrifício 88' pode ser gravada e esse processo de gravação não afeta a resina 54' ou o fotorresistente 62 devido às diferentes taxas de gravação. A porção exposta da primeira camada funcionalizada 60 pode ser removida durante este processo de gravação.
[0425] Na Fig. 340, uma segunda camada funcionalizada 64 é aplicada nas regiões intersticiais 30, na área 78, no fotorresistente 62 e em qualquer porção exposta da região 14. A segunda camada funcionalizada 64 pode ser qualquer um dos exemplos divulgados aqui e pode ser depositada usando qualquer uma das técnicas descritas aqui.
[0426] Na Fig. 34P, o fotorresistente 62 pode então ser retirado, o que remove qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nele. Em qualquer um dos exemplos aqui divulgados, a sonicação pode ser realizada para melhorar a eficiência do processo de remoção ou retirada do fotorresistente.
[0427] Na Fig. 340, as regiões intersticiais 30 podem ser polidas para remover qualquer uma da segunda camada funcionalizada 64 nelas. Como mostrado na Fig. 34Q0, as regiões 14, 16 são formadas nas respectivas regiões da vala 28 '''. Deve ser entendido que as regiões 14, 16 estendem o comprimento das valas 28''' (como mostrado na Fig. 34R). Esta configuração das regiões 14, 16 pode ser usada para sequenciamento de leitura paired-end final simultâneo usando os conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' divulgados aqui.
[0428] Na Fig. 34R, um segundo fotorresistente 62' é aplicado (e exposto e desenvolvido) para formar um padrão de faixas espacialmente separadas que são pelo menos substancialmente perpendiculares às valas 28'''. Este padrão deixa porções das primeiras regiões funcionalizadas 14 e das segundas regiões funcionalizadas 14 que são expostas entre as faixas espacialmente separadas, como mostrado na Fig. 34R. As porções das primeiras regiões funcionalizadas 14 e das segundas regiões funcionalizadas 16 que são expostas entre as faixas separadas espacialmente são removidas (por exemplo, por gravação) e, então, as faixas separadas espacialmente (segundo fotorresistente 62') são removidas (por exemplo, via gravação). As regiões 14, 16 subjacentes às faixas espacialmente separadas (segundo fotorresistente 62') permanecem intactas após a remoção das faixas espacialmente separadas (segundo fotorresistente 62'), como mostrado na Fig. 34S. Neste exemplo, as respectivas regiões 14, 16 são pares isolados ao longo das valas 28'''.
[0429] Em alguns exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' (não mostrados nas Fig. 34A a Fig. 34S) podem ser pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60 e, portanto, estão anexados às primeiras regiões funcionalizadas 14. Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' (não mostrados nas Fig. 34A a Fig. 34S) podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64 e, portanto, estão anexados às segundas regiões funcionalizadas
16. Nestes exemplos, o enxerto adicional de iniciador não é realizado.
[0430] Em outros exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' não são pré-enxertados na primeira camada funcionalizada 60. Nestes exemplos, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados após a primeira camada funcionalizada 60 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 34K) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 34S), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície das regiões
16.
[0431] Da mesma forma, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21º não podem ser pré-enxertados na segunda camada funcionalizada 64. Nestes exemplos, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados após a segunda camada funcionalizada 64 ser aplicada (por exemplo, na Fig. 340) Se as regiões 14, 16 têm grupos funcionais diferentes, os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no final do método (por exemplo, na Fig. 34S), porque eles não enxertarão nos grupos funcionais de superfície das regiões
14.
[0432] Quando o enxerto é realizado durante o método, o enxerto pode ser realizado usando qualquer exemplo aqui divulgado. Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20' reagem com grupos reativos da região 14 ou os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' reagem com grupos reativos da região 16, e não possuem afinidade para a resina 54'.
[0433] Em ainda outro exemplo da célula de fluxo, as regiões 14, 16 podem ser formadas nas respectivas estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94, como mostrado na Fig. 35. As estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94 têm grupos funcionais de superfície que podem anexar os respectivos conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' divulgados aqui. Qualquer exemplo da estrutura de núcleo 49 divulgada neste documento pode ser usado para as estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94. Qualquer um dos grupos funcionais de superfície aqui divulgados que são capazes de anexar os diferentes conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D', também podem ser usados. A estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 pode ser formada, por exemplo, usando o(s) método(s) aqui divulgado(s) para formar a esfera funcionalizada 50 (consulte a seção "Célula de Fluxo Baseada em Esfera").
[0434] Em alguns exemplos, as estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94 também podem ter formas diferentes. Em alguns exemplos, as respectivas formas correspondem, respectivamente, às formas dos locais de captura 95, 96 (mostrados na Fig. 36A, Fig. 36B, Fig. 37A e Fig. 37B) sobre ou definidas em uma superfície S do substrato (que pode ser um substrato de camada única ou múltiplas camadas, como descrito aqui). Por exemplo, as estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94 podem ter, respectivamente, a mesma forma assim como os locais de captura 95, 96 (descritos abaixo). As diferentes formas ajudarão na estrutura de suporte funcionalizada 93 tornando-se fisicamente presa no local de captura de poço em forma complementar 95 e na estrutura de suporte funcionalizada 94 tornando-se fisicamente presa no local de captura de poço em forma complementar 96.
[0435] Em alguns exemplos, as estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94 também podem ter química de captura diferente. A química de captura é a química que permite que as estruturas 93, 94 se anexem a um local desejável na superfície do substrato S. Em alguns exemplos, a química de captura das estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94 corresponde respectivamente à química de captura dos locais de captura 95, 96 que deve receber a respectiva estrutura de suporte funcionalizada 93, 94. Por exemplo, a estrutura de suporte funcionalizada 93 e o local de captura 95 podem cada um incluir um membro de um tipo de par de ligação receptor- ligante, enquanto a estrutura de suporte funcionalizada 94 e o local de captura 96 pode cada um incluir um membro de um tipo diferente de par de ligação receptor-ligante. As diferentes químicas podem ajudar a suportar que as estruturas de suporte funcionalizadas 93, 94 (e as respectivas regiões 14, 16) sejam capturadas em regiões desejáveis na superfície do substrato S.
[0436] Os locais de captura 95, 96 são fisicamente e/ou quimicamente capazes de imobilizar a respectiva estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 no substrato 26 (ou resina 54' de um substrato de múltiplas camadas). Os locais de captura 95, 96 podem ser posicionados em qualquer local adequado, onde é desejável ter regiões adjacentes 14,
16. A posição dos locais de captura 95, 96 através do substrato 26 pode ser uniforme (ver Fig. 36A e 36B) ou pode ser não uniforme. Os locais de captura 95, 96 podem ter qualquer forma, geometria e dimensões adequadas, que podem depender, pelo menos em parte, da configuração dos locais de captura 95, 96 (por exemplo, um remendo, um poço, uma saliência, etc.) e o tipo de estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 que deve ser capturada pelos locais de captura 95, 96.
[0437] Em alguns exemplos, os locais de captura 95, 96 são diferentes agentes de captura química que são aplicados em uma porção da superfície do substrato S. Quaisquer exemplos do agente de captura química aqui divulgados podem ser usados. Em um exemplo, os respectivos agentes de captura química podem ser depositados nos locais desejáveis usando a impressão em microcontato, ou outra técnica adequada.
[0438] Em outros exemplos, os locais de captura 95, 96 incluem os respectivos poços que são definidos na superfície S do substrato 26 (ou resina 54'). Os poços podem ser formados usando gravação ou impressão, dependendo do substrato (por exemplo, camada única ou múltipla) que é usado. Os poços podem ter qualquer forma e geometria adequadas, tal como aquelas aqui estabelecidas para as depressões 28.
[0439] Em alguns exemplos, os poços não têm um agente de captura químico adicional adicionado a eles. Nestes exemplos, as dimensões de abertura permitem que a respectiva estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 se auto-monte nos poços correspondentes (por exemplo, com base na forma). Em outros exemplos, os poços têm respectivos agentes de captura química adicionados a eles.
[0440] Outros exemplos dos locais de captura 95, 96 incluem o poço e uma esfera de captura tendo um agente de captura químico em uma superfície do mesmo. A esfera de captura pode ser dimensionada para caber nos poços. Em alguns exemplos, as esferas de captura podem ser co-planares ou estender ligeiramente acima das regiões intersticiais adjacentes 30, 30', de modo que a estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 que finalmente anexa a ela não esteja confinada no poço. Em um exemplo, a esfera de captura é selecionada do grupo que consiste em dióxido de silício, um material superparamagnético, poliestireno e um acrilato. Quaisquer exemplos do agente de captura química divulgados neste documento podem ser utilizados na superfície da esfera de captura, e podem ser revestidos na esfera de captura antes de serem introduzidas no poço. A configuração dos poços e esferas desses locais de captura 95, 96 pode ser tal que a estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 (quando anexada) forme regiões 14, 16 que são adjacentes uma à outra.
[0441] A profundidade dos poços dos locais de captura 95, 96 pode variar dependendo se o agente de captura química deve ser introduzido no mesmo e se a esfera de captura deve ser introduzida no mesmo. A profundidade pode ser selecionada pelo menos para acomodar esses materiais (isto é, o material está contido dentro dos poços). Em um exemplo, a profundidade do poço varia de cerca de 1 nm a cerca de 5 mícrons.
[0442] Como outro exemplo, os locais de captura 95, 96 incluem protusões que são definidas no substrato 26 (ou na resina 54'). As protusões são estruturas tridimensionais que se estendem para fora (para cima) a partir de uma superfície adjacente. As protusões podem ser geradas por gravação, fotolitografia, impressão, etc.
[0443] Embora qualquer geometria tridimensional adequada possa ser usada para os locais de captura de protrusão 95, 96, uma geometria com uma superfície superior pelo menos substancialmente plana pode ser desejável. Exemplos de geometrias de protrusão incluem uma esfera, um cilindro, um cubo, prismas poligonais (por exemplo, prismas retangulares, prismas hexagonais, etc.) ou similares.
[0444] Diferentes agentes de captura química podem ser aplicados na superfície superior dos respectivos locais de captura de protrusão 95, 96. Quaisquer exemplos do agente de captura química divulgados neste documento podem ser usados, e qualquer técnica de deposição pode ser usada para aplicar o agente de captura química na superfície superior das protusões.
[0445] Deve ser entendido que, embora os locais de captura 95, 96 tenham sido descritos como ambos sendo agentes de captura, poços etc., qualquer combinação dos tipos de locais de captura 95, 96 pode ser usada em conjunto (por exemplo, agente de captura e poço) na célula de fluxo.
[0446] Na Fig. 36A, os locais de captura 95, 96, na superfície S têm formas diferentes. Quando a estrutura de suporte funcionalizada 93, 94, tendo respectivamente formas correspondente são carregadas na célula de fluxo (Fig. 36B),
a estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 se auto-monta, por exclusão física e/ou pela química de captura, de modo que o as estruturas de suporte funcionalizadas 93 anexem aos locais de captura 95 e a estrutura de suporte funcionalizada 94 anexe aos locais de captura 96.
[0447] Na Fig. 37A, os locais de captura 95, 96, na superfície S também têm formas diferentes, mas estão arranjados diferentemente do exemplo mostrado na Fig. 36A. Quando a estrutura de suporte funcionalizada 93, 94, tendo as respectivas formas correspondentes são carregadas na célula de fluxo (Fig. 37B), a estrutura de suporte funcionalizada 93, 94 se auto-monta, por exclusão física e/ou pela química de captura, de modo que o as estruturas de suporte funcionalizadas 93 anexem aos locais de captura 95 e a estrutura de suporte funcionalizada 94 anexe aos locais de captura 96.
[0448] Ambas as configurações mostradas nas figuras 36B e 37B resultam em uma matriz de regiões 14, 16 em posições isoladas na superfície do substrato S.
[0449] As Fig. 2 a Fig. 10, Fig. 33A, Fig. 34S, Fig. 36B e Fig. 37B ilustram configurações diferentes para as regiões 14, 16 da célula de fluxo sem uma tampa ligada ao substrato 26 (ou a resina 54'). Embora não mostrado, deve ser entendido que as células de fluxo podem ter a tampa ligada a pelo menos uma porção da região intersticial 30, 30'. Em alguns exemplos, a tampa pode ser ligada antes ou após o enxerto dos conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D'. Quando a tampa é ligada antes do enxerto do iniciador, deve ser entendido que um processo de fluxo contínuo pode ser usado para enxertar. No processo de fluxo contínuo, a solução ou mistura de iniciador pode ser introduzida em um(s) canal(ais) de fluxo (definido entre a tampa e a região intersticial 30, 30') através das respectivas porta(s) de entrada (não mostrada (s)), pode ser mantido no(s) canal(ais) de fluxo por um tempo suficiente (isto é, um período de incubação) para que o(s) iniciador(es) 18, 18', 20, 20', 19, 19', 21, 21º sejam anexados às respectivas regiões 14 , 16 e, então, podem ser removidos das respectivas porta(s) de saída (não mostradas). Após a ligação do iniciador 18, 18', 20, 20', 19, 19', 21, 21', o(s) fluido(s) adicional (ais) pode(m) ser direcionado(s) através do(s) canal(ais) de fluxo para lavar as depressões agora funcionalizadas e o(s) canal(ais) de fluxo.
[0450] A tampa pode ser posicionada na região intersticial 30, de modo a definir um único canal de fluxo ou múltiplos canais de fluxo fluidicamente separados.
[0451] A tampa pode ser qualquer material que seja transparente a uma luz de excitação direcionada para o substrato 26. Como exemplos, a tampa pode ser de vidro (por exemplo, borosilicato, sílica fundida, etc.), plástico ou semelhante. Um exemplo comercialmente disponível de um vidro de borossilicato adequado é o D 2636, disponível na Schott North America, Inc. Exemplos comercialmente disponíveis de materiais plásticos adequados, nomeadamente polímeros de ciclo-olefina, são os produtos ZEONORGO disponíveis na Zeon Chemicals L.P.
[0452] Em alguns exemplos, a tampa pode ser formada integralmente com parede(s) lateral(ais) que corresponde (m) ao formato da porção da região intersticial 30 à qual a mesma será ligada. Por exemplo, um recesso pode ser gravado em um bloco transparente para formar uma porção substancialmente plana (por exemplo, superior) e parede(s) lateral(ais) estendendo a partir da porção substancialmente plana. Quando o bloco gravado é montado na região intersticial 30, o recesso pode se tornar o canal de fluxo. Em outros exemplos, a(s) parede(s) lateral(ais) e a tampa podem ser componentes separados que são acoplados um ao outro. Por exemplo, a tampa pode ser um bloco substancialmente retangular tendo uma superfície externa pelo menos substancialmente plana e uma superfície interna pelo menos substancialmente plana que define uma porção (por exemplo, uma porção superior) do canal de fluxo (uma vez ligada à porção da região intersticial 30). O bloco pode ser montado (por exemplo, ligado a) na(s) parede(s) lateral(ais), as quais são ligadas à porção da região intersticial 30 e formam a(s) parede(s) lateral(ais) do canal de fluxo. Neste exemplo, a(s) parede(s) lateral (ais podem incluir qualquer um dos materiais aqui estabelecidos para a camada espaçadora (descrita abaixo).
[0453] A tampa pode ser ligada usando qualquer técnica adequada, tal como ligação a laser, ligação por difusão, ligação anódica, ligação eutética, ligação de ativação por plasma, ligação por frita de vidro (glass frit bonding) ou outros métodos conhecidos no estado da técnica. Em um exemplo, uma camada espaçadora pode ser usada para ligar a tampa à porção da região intersticial 30. A camada espaçadora pode ser qualquer material que irá selar pelo menos algumas das regiões intersticiais 30 e a tampa juntas.
[0454] Em um exemplo, a camada espaçadora pode ser um material absorvente de radiação que absorve radiação em um comprimento de onda que é transmitido pela tampa e/ou pelo substrato 26 (ou, por exemplo, uma resina padronizada do substrato 26). A energia absorvida, por sua vez, forma a ligação entre a camada espaçadora e a tampa e entre a camada espaçadora e o substrato 26. Um exemplo desse material de absorção de radiação é o KAPTONGO preto(poliimida contendo carbono negro) da DuPont (EUA), que absorve a cerca de 1064 nm. Deve ser entendido que a poliimida poderia ser usada sem a adição de carbono negro, exceto que o comprimento de onda teria que ser alterado para um que seja absorvido significativamente pelo material de poliimida natural (por exemplo, 480 nm). Como outro exemplo, a poliimida CEN JP pode ser ligada quando irradiada com luz a 532 nm. Quando a camada espaçadora é o material absorvedor de radiação, a camada espaçadora pode ser posicionada em uma interface entre a tampa e a porção da região intersticial 30, de modo que a camada espaçadora entre em contato com a região de ligação desejada. A compressão pode ser aplicada (por exemplo, aproximadamente 100 PSI de pressão) enquanto a energia do laser em um comprimento de onda adequado é aplicada à interface (isto é, o material absorvedor de radiação é irradiado). A energia do laser pode ser aplicada à interface tanto de cima como de baixo, a fim de obter uma ligação adequada.
[0455] Em outro exemplo, a camada espaçadora pode incluir um material absorvedor de radiação em contato com a mesma. O material absorvedor de radiação pode ser aplicado na interface entre a camada espaçadora e a tampa, bem como na interface entre a camada espaçadora e a porção da região intersticial 30. Como um exemplo, a camada espaçadora pode ser poliimida e o material absorvedor de radiação separado pode ser carbono negro. Neste exemplo, o material absorvedor de radiação separado absorve a energia do laser que forma as ligações entre a camada espaçadora e a tampa e entre a camada espaçadora e a porção da região intersticial 30. Neste exemplo, a compressão pode ser aplicada nas respectivas interfaces enquanto a energia do laser em um comprimento de onda adequado é aplicada às interfaces (ou seja, o material absorvedor de radiação é irradiado).
Método de Sequenciamento Paired-End Simultâneo
[0456] Quaisquer exemplos da célula de fluxo incluindo os conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' descritos neste documento podem ser utilizados no sequenciamento paired-end simultâneo, onde as fitas senso e antisenso (por exemplo, os fitas 40 e 44) são lidas simultaneamente.
[0457] Uma vez que os clusters das primeiras fitas modelo não cliváveis 40 são gerados nas regiões 14 e os clusters de segundas fitas modelo não cliváveis 44 são gerados na região 16 (descrito em referência às Fig. IC a Fig. 7G), as extremidades livres podem ser bloqueadas para evitar uma iniciação indesejável. Deve ser entendido que as extremidades livres de quaisquer iniciadores que permanecem também podem ser bloqueadas.
[0458] Nestes métodos, uma mistura de incorporação pode ser adicionada, que inclui iniciadores de sequenciamento que são capazes de hibridizar respectivamente com as primeiras fitas modelo não cliváveis 40 e as segundas fitas modelo não cliváveis 44. A extensão dos iniciadores de sequenciamento ao longo as respectivas fitas modelo 40, 44 é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos nas fitas modelo 40, 44. O processo químico subjacente pode ser polimerização (por exemplo, catalisada por uma enzima polimerase) ou ligação (por exemplo, catalisada por uma enzima ligase). Em um processo específico à base de polimerase, os nucleotídeos marcados fluorescentemente são adicionados aos respectivos iniciadores de sequenciamento de uma maneira dependente do modelo, de modo que a detecção da ordem e do tipo de nucleotídeos adicionados aos respectivos iniciadores de sequenciamento possa ser usada para determinar a sequência do modelo.
Por exemplo, para iniciar um primeiro sequenciamento por ciclo de síntese, um ou mais nucleotídeos marcados, DNA polimerase, etc., podem ser entregues na/através da célula de fluxo, onde a extensão do iniciador de sequenciamento faz com que um nucleotídeo marcado seja incorporado em uma fita nascente que é complementar ao respectivo modelo 40, 44. Os eventos de incorporação podem ser detectados em tandem por meio de um evento de geração de imagem sem sobreposição física substancial dos sinais fluorescentes gerados nos respectivos modelos 40, 44. Isso permite chamadas de base simultâneas nos respectivos modelos 40, 44. Durante um evento de geração de imagens, um sistema de iluminação (não mostrado) pode fornecer uma luz de excitação para a célula de fluxo e as imagens podem ser capturadas e analisadas. Como exemplos, a iluminação pode ser realizada com um laser, diodo emissor de luz, guia de ondas planar ou semelhante.
[0459] Em alguns exemplos, os nucleotídeos marcados fluorescentemente podem incluir ainda uma propriedade de terminação reversível que termina outra extensão do iniciador depois que um nucleotídeo foi adicionado aos respectivos modelos 40, 44. Por exemplo, um análogo de nucleotídeo tendo uma fração terminadora reversível pode ser adicionado aos modelos 40, 44, de modo que a extensão subsequente não possa ocorrer até que um agente de desbloqueio seja entregue para remover a fração. Assim, para exemplos que usam terminação reversível, um reagente de desbloqueio pode ser entregue à célula de fluxo, etc. (após a detecção ocorrer).
[0460] A(s) lavagem(ns) pode(m) ocorrer entre as várias etapas de entrega do fluido. O ciclo de sequenciamento pode então ser repetido n vezes para estender o modelo por n nucleotídeos, detectando assim uma sequência de comprimento n.
[0461] O sequenciamento paired-end permite usuários sequenciar ambas as extremidades de um fragmento e gerar dados de sequências alinhadas e de alta qualidade. O sequenciamento paired-end facilita a detecção de rearranjos genômicos e elementos de sequência repetitiva, bem como fusões de genes e novos transcritos. Embora um exemplo de método de sequenciação paired-end tenha sido descrito em detalhes, deve-se entender que as células de fluxo aqui descritas podem ser utilizadas com outro protocolo de sequenciamento, para genotipagem ou em outras aplicações químicas e/ou biológicas. Em ainda outro exemplo, as células de fluxo aqui divulgadas podem ser usadas para geração de biblioteca em células (on-cell library). Kits
[0462] Qualquer exemplo das células de fluxo aqui descritas pode ser parte de um kit.
[0463] Alguns exemplos do kit incluem a célula de fluxo, uma mistura/fluido de modelo e uma mistura de incorporação. Esses exemplos da célula de fluxo têm ambos os conjuntos de iniciadores 12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' anexados a eles. A mistura/fluido de modelo inclui o modelo a ser sequenciado e a mistura de incorporação inclui iniciadores de sequenciamento que são capazes de hibridizar respectivamente com as primeiras fitas modelo não cliváveis 40 e as segundas fitas modelo não cliváveis 44 (formadas usando o modelo).
[0464] Outros exemplos do kit incluem a célula de fluxo e o fluido de iniciação aqui descrito. Estes exemplos da célula de fluxo têm um conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C ou 12D anexado a ele, e o fluido de iniciação pode ser usado para introduzir o outro conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', ou 12D'. Em um exemplo do kit, a célula de fluxo inclui um substrato 26 incluindo depressões 28 separadas pelas regiões intersticiais 30, uma primeira camada de polímero 32 em cada uma das depressões, em que alguns grupos funcionais da primeira camada de polímero são capeados, um primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C ou 12D anexados a outros grupos funcionais da primeira camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28, e uma segunda camada de polímero 32' nas regiões intersticiais 30; e o fluido de iniciador inclui um transportador de fluido, e um segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', ou 12D' que é diferente do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, ou 12D. Este exemplo de kit também pode incluir a mistura de modelos e a mistura de incorporação. Célula de Fluxo Baseada em Esfera
[0465] A Fig. 9 representa uma configuração para a célula de fluxo, onde uma das regiões 14 ou 16 é parte de uma esfera 50. Esta seção descreve vários exemplos e métodos para essa configuração de célula de fluxo.
[0466] Exemplos desta célula de fluxo 10A (Fig. 13D e 14), 10B (Fig. 15D e 16), 10C (Fig. 17D e 18), 10D (Fig. 19D e 20) aqui divulgados incluem um suporte 52 e uma resina padronizada 54', 54''no suporte 52, a resina padronizada incluindo depressões 28A, 28B ou 28C separadas por regiões intersticiais 30. Figs. 11A a 11D juntas representam um exemplo de um método para padronizar uma resina 54 para formar as depressões 28A, 28B ou 28C. Mais especificamente, as Figs. 11A a 11C representam a formação das depressões 28A, 28B e Figs. 11A, 11B e 11D representam a formação das depressões 28C.
[0467] A Fig. 11A representa um suporte 52 e a Fig. 11B representa uma resina 54 depositada no suporte 52. Qualquer exemplo do substrato 12 aqui descrito pode ser usado para o suporte 52.
[0468] Alguns exemplos de resinas adequadas 54 são selecionados do grupo consistindo de uma resina à base de resina oligomérica poliédrica de silsesquioxano (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli(etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato e suas combinações. Embora vários exemplos tenham sido fornecidos, acredita-se que qualquer resina que possa ser curada pode ser usada.
[0469] Conforme usado aqui, os termos "oligomérico poliédrico de silsesquioxano" (POSS) e "resina à base de POSS" se referem a uma composição química que é um intermediário híbrido (RSiO1.s) entre o de sílica (SiO,) e silicone (R;SiO0). Um exemplo de POSS pode ser o descrito em Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 7176-778, que é incorporado por referência na sua totalidade. A composição é um composto de organosilício com a fórmula química [RSiO3z/2]n, onde os grupos R podem ser iguais ou diferentes. A composição pode compreender uma ou mais estruturas diferentes de gaiola ou núcleo como unidades monoméricas. Em alguns casos, a estrutura inclui a seguinte estrutura gaiola polioctaédrica ou do núcleo. Em alguns casos, a estrutura poliédrica pode ser uma estrutura Ts, tal R7 xX ATT Oi o Rea sl, o A À L “ O Ra; Sig FR ? o í é Sin g— si RÓ “R3 como: e representado por:
guto, Tg ; ” ; . Esta unidade monomérica normalmente possui oito braços dos grupos funcionais R; a Rg.
[0470] A unidade monomérica pode ter uma estrutura de gaiola com 10 átomos de silício e 10 grupos R, referidos E 1 como Tim, tal como: 10 , ou pode ter uma estrutura de gaiola com 12 átomos de silício e 12 grupos R, É — / | referidos como Ti2, tal como: Taz . O material baseado em POSS pode incluir estruturas de gaiola Tç, Ti ou T1i6. O conteúdo médio da gaiola pode ser ajustado durante a síntese e/ou controlado por métodos de purificação, e uma distribuição de tamanhos de gaiola da(s) unidade (s) monomérica(s) pode ser usada nos exemplos aqui divulgados. Como exemplos, qualquer uma das estruturas de gaiola pode estar presente em uma quantidade que varia de cerca de 30% a cerca de 100% do total de unidades monoméricas POSS utilizadas. O material à base de POSS pode ser uma mistura de estruturas de gaiola, juntamente com estruturas de gaiola abertas e parcialmente abertas. Assim, um precursor de resina à base de POSS ou resina pode incluir materiais POSS epóxi, que podem ser uma mistura de configurações de silsesquioxano. Por exemplo, qualquer material POSS aqui descrito pode ser uma mistura de gaiolas POSS discretas e estruturas de silsesquioxano não discretas e/ou estruturas discretas condensadas incompletamente, tal como polímeros, escada (ladders) e similares. Os materiais parcialmente condensados incluiriam, portanto, grupos R epóxi como aqui descrito em alguns vértices de silício, mas alguns átomos de silício não seriam substituídos pelos grupos R e poderiam ser substituídos, em vez disso, por grupos OH. Em alguns exemplos, os materiais POSS compreendem uma mistura de várias formas, tal como: Gaiolas Condensadas Pao çA / 7 / /RN R. Nao) / / (AN (| o /) 147 dal 8 fE[ CHI A | + re
T T T 8 10 12 (a)
Gaiolas Incompletamente Condensadas
R R si É conse AA 90 OH 0 [OH o ; RA SO Re > À RIO O o Sa ho São o So), dal o ro À o) 1 V | GS o Ss Vosso, MOR, 20h V 01 7R VW Fa R Podia So Sic0 SS HOns/ o (o) 8 o R % bi anS R x Conteúdo não gaiola Estrutura grande e mal definida
R R AO / 98 8 Rea o|
DO O 0 R o | 09 o A Fm OM SA ARM à,
ATO RR WON A & ro too] : 0 97 R da “Resinas T”/Polisilsesquioxanos n > y VV SiS Age o Se O o | o í. e/ou (c) B .
[0471] Em alguns dos exemplos aqui divulgados, pelo menos um de R; a Rg ou Rio ou Ri2 compreende um epóxi e, portanto, o POSS é referido como um POSS epóxi. Em alguns exemplos, a maioria dos braços, tal como os oito, dez ou doze braços, ou grupos R, compreende grupos epóxi. Em outros exemplos, R; a Rg ou Rio ou Ri7 são os mesmos e, portanto,
cada um de R; a Rg ou Rio ou Rir compreende um grupo epóxi.
Ainda em outros exemplos, Ri a Rg ou Rio ou Riº não são os mesmos e, portanto, pelo menos um de R;, a Rg ou Rio ou Ri compreende epóxi e pelo menos um outro de R; a Rg ou Ri OU Ri2 é um grupo funcional não-epóxi.
O grupo funcional não epóxi pode ser (a) um grupo reativo que é ortogonalmente reativo a um grupo epóxi (isto é, reage sob condições diferentes de um grupo epóxi), que serve como uma alça para acoplar a resina a um iniciador de amplificação, a polímero ou um agente de polimerização; ou (b) um grupo que ajusta as propriedades mecânicas ou funcionais da resina, por exemplo, ajustes de energia superficial.
Em alguns exemplos, o grupo funcional não-epóxi é selecionado do grupo que consiste em uma azida/azido, um tiol, um poli(etileno glicol), um norborneno, uma tetrazina, um amino, um hidroxil, um alquinil, uma cetona, um aldeído, um grupo éster, um alquil, um aril, um alcóxi e um haloalquil.
Em alguns aspectos, o grupo funcional não-epóxi é selecionado para aumentar a energia superficial da resina.
Nestes outros exemplos, a proporção de grupos epóxi para grupos não-epóxi varia de 7:1 a 1:7, ou 9:1 a 1:9, ou 11:1 a 1:11. Em qualquer um dos exemplos, o(s) grupo(s) epóxi (terminal) dissubstituído(s) ou monossubstituído(s) permite (m) a unidade monomérica polimerizar em uma matriz reticulada após o início usando luz ultravioleta (UV) e um ácido.
Em alguns aspectos, o POSS epóxi compreende grupos epóxi terminais.
Um exemplo desse tipo de POSS é o glicidil POSS tendo a estrutura:
o ] Lo > o Y o o dE Aa Po As si, dx 7 Y Pala ON o ST DAN a L o o
[0472] Um POSS epóxi também pode ser um POSS epóxi modificado, que inclui um agente de polimerização radicalar controlada (CRP) e/ou outro grupo funcional de interesse incorporado na resina ou na estrutura do núcleo ou da gaiola como um ou mais do grupo funcional R; a Rg ou Rio ou Ri2.
[0473] Em outros exemplos da resina baseada em POSS divulgada neste documento, cada um dos R; a Rg ou Ri6 ou Ri compreende qualquer grupo não-epóxi, tal como um acrilato, metacrilato, etileno glicol ou uma cadeia curta de polietileno glicol (até 50 unidades de repetição). Qualquer monômero POSS não-epóxi que possa ser radicalmente polimerizado pode ser usado. Um exemplo é uma mistura de gaiola de metacril POSS com a seguinte estrutura:
o "A 4 o o À O ano o ! x OSROSSA 3 61 | O o si si / À À O b o $ o Fo-si="9-/-* o.
SE VIA PY no e x. / A
[0474] Outro exemplo é uma mistura de gaiolas PEG- POSS tendo a seguinte estrutura:
R R -Si— O o 1
RS ONO Si so / a VRO SR ol V o” “of Si io nº o Si
R R = (CH,);O(CH,CH,O),.CH,CH,OCH;
[0475] No exemplo de PEG-POSS, o grupo metil final (CH3) do grupo R pode ser substituído por X, onde X é um grupo acril, um grupo metacril ou outro grupo final adequado.
[0476] Outras resinas 54 também podem ser utilizadas. Os exemplos incluem resinas epóxi (não-POSS), resinas de poli (etileno glicol), resinas de poliéter (que podem ser epóxis de anel aberto), resinas acrílicas, resinas de acrilato, resinas de metacrilato e combinações das mesmas. Como exemplos, uma resina que inclui monômeros de epóxi e acrilato pode ser usada, ou uma resina que inclui monômeros de epóxi e etileno pode ser usada.
[0477] Outro exemplo de uma resina adequada 54 é um fluoropolímero amorfo. Um exemplo de um fluoropolímero amorfo (não cristalino) comercialmente disponível é o CYTOPO da Bellex).
[0478] Como mostrado na Fig. 11B, a resina 54 é depositada no suporte 52. Em um exemplo, a deposição da resina 54 envolve a deposição química de vapor, dip coating, dunk coating, revestimento por centrifugação, revestimento por spray, puddle dispensing, revestimento por spray ultrassônico, doctor blade coating, aerosol printing , screen printing , impressão em microcontato ou impressão em jato de tinta.
[0479] A resina depositada 54 é então padronizada, utilizando qualquer uma das técnicas de padronização mencionadas neste documento. No exemplo mostrado na Fig. 11B, a litografia por nanoimpressão é usada para padronizar a resina 54. Após a resina 54 ser depositada, ela pode ser submetida a softbake para remover o excesso de solvente. Um molde litográfico por nanoimpressão ou carimbo de trabalho 56 é pressionado contra a camada de resina 54 para criar uma impressão na resina 54. Por outras palavras, a resina 54 é recuada ou perfurada pelas saliências do carimbo de trabalho
56. A resina 54 pode então ser curada com o carimbo de trabalho 56 no lugar. A cura pode ser realizada por exposição à radiação actínica, tal como radiação de luz visível ou radiação ultravioleta (UV), ou à radiação de comprimento de onda variando entre cerca de 240 nm e 380 nm quando um fotorresistente é usado; ou pela exposição ao calor quando uma resistência curável térmica é usada. A cura pode promover polimerização e/ou reticulação. Como um exemplo, a cura pode incluir múltiplos estágios, incluindo um softbake (por exemplo, para remover o(s) solvente(s)) e um hardbake. O softbake pode ocorrer a uma temperatura mais baixa, variando de cerca de 50ºC a cerca de 150ºC. A duração do hardbake pode durar de cerca de 5 segundos a cerca de 10 minutos a uma temperatura variando de cerca de 100ºC a cerca de 300ºC. Exemplos de dispositivos que podem ser usados para softbaking e/ou hardbaking incluem uma placa aquecedora, forno, etc.
[0480] Após a cura, o carimbo de trabalho 56 é liberado. Isso cria características topográficas, isto é, as depressões 28A e 28B ou 28C, na resina 54. Como mostrado na Fig. 11C, a resina 54 tendo as depressões 28A e 28B definidas nela é referida como a resina padronizada 54'. Como mostrado na Fig. 11D, a resina 54 tendo as depressões 28C definidas nela é referida como a resina padronizada 54''. A resina padronizada 54', 54'' pode estar sujeita a hard baking adicional para concluir a cura e travar na topografia impressa. Em alguns exemplos, o hard baking pode ser realizado a uma temperatura variando de cerca de 60ºC a cerca de 300ºC.
[0481] As depressões 28A e 28B mostradas na Fig. 11C têm tamanhos diferentes. Neste exemplo, "tamanhos diferentes" significa que algumas das depressões 28B têm dimensões de abertura menores que algumas outras depressões 28A. Neste exemplo, a "dimensão de abertura" refere-se à área ocupada por cada abertura de depressão na resina padronizada 54' e/ou o diâmetro de cada abertura de depressão na resina padronizada 54'. No exemplo mostrado na Fig. 11C, a área e o diâmetro da abertura de cada uma das depressões 28B é menor que a área e o diâmetro da abertura de cada uma das depressões 28A. A área e o diâmetro da abertura das depressões maiores 28A dependem do tamanho das partículas (por exemplo, diâmetro) das esferas 50 a serem introduzidas nela. A área e o diâmetro da abertura das depressões menores 28B são menores que o tamanho d partícula das esferas 50 Essas dimensões de abertura permitem que as esferas 50 se auto-montem nas depressões 28A e não nas depressões 28B por exclusão de tamanho.
[0482] As depressões 28C mostradas na Fig. 11D incluem duas porções 34, 34 'que estão interconectadas, mas que têm tamanhos diferentes. Neste exemplo, "tamanhos diferentes" significa que a porção 34' de cada uma das depressões 28C tem dimensões de abertura menores que a porção
34. Também neste exemplo, a "dimensão de abertura" refere- se à área ocupada por cada porção de abertura na resina padronizada 54'' e/ou o diâmetro de cada porção de abertura na resina padronizada 54''. No exemplo mostrado na Fig. 11D, a área e o diâmetro da abertura de cada uma das porções 34' é menor que a área e o diâmetro da abertura de cada uma das porções 34. A área e o diâmetro da abertura das porções maiores 34 dependem do tamanho das partículas (por exemplo, diâmetro) das beads 50 a serem introduzidas nas mesmas. A área e o diâmetro da abertura das porções menores 34' são menores que o tamanho de partícula das esferas 50. Essas dimensões de abertura permitem que as esferas 50 se auto- montem nas porções 34 e não nas porções 34' por exclusão de tamanho.
[0483] Exemplos da área para cada abertura da depressão ou abertura da porção em uma superfície podem ser pelo menos cerca de 1 x 10º? um?,y pelo menos cerca de 1 x 10º um”, pelo menos cerca de 0,1 um?, pelo menos cerca de 1 um , pelo menos cerca de 10 um?, pelo menos cerca de 100 um? ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, a área pode ser no máximo cerca de 1 x 10º um?, no máximo cerca de 100 umº?, no máximo cerca de 10 um?, no máximo cerca de 1 um?, no máximo cerca de 0,1 umº, no máximo cerca de 1 x 10º um?, ou menos. Em alguns casos, o diâmetro de cada depressão 28A, 28B ou porção 34, 34' pode ser pelo menos cerca de 50 nm, pelo menos cerca de 0,1 um, pelo menos cerca de 0,5 um, pelo menos cerca de 1 um, pelo menos cerca de 10 um, pelo menos cerca de 100 um ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o diâmetro pode ser no máximo cerca de 1 x 10º? um, no máximo cerca de 100 um, no máximo cerca de 10 um, no máximo cerca de 1 um, no máximo cerca de 0,5 um, no máximo cerca de 0,1 um ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). A área e o diâmetro de cada abertura da depressão ou abertura da porção podem ser maiores que, menores que ou entre os valores especificados acima. Quaisquer áreas e diâmetros desejáveis podem ser utilizados, desde que a área e o diâmetro das aberturas das depressões 28A sejam maiores que a área e o diâmetro das aberturas das depressões 28B, ou desde a área e o diâmetro das aberturas das porções 34 das depressões 28C sejam maiores que a área e o diâmetro das aberturas das porções 34' das depressões 28C.
[0484] Muitos layouts diferentes das depressões 28A e 28B ou 28C podem ser considerados, incluindo padrões regulares, repetitivos e não regulares. Em um exemplo, as depressões 28A e 28B ou 28C são dispostas em uma grade hexagonal para fechar o empacotamento e melhorar a densidade. Outros layouts podem incluir, por exemplo, layouts retilíneos (ou seja, retangulares), layouts triangulares e assim por diante, desde que a depressão 28A ou a porção 34 possa receber uma esfera funcionalizada 50 (por exemplo, estrutura de núcleos 49 com a região 16 formada nela , como mostrado, por exemplo, nas Fig. 13C, 14 etc.). Em alguns exemplos, o layout ou padrão pode ser um formato x-y das depressões 28A e 28B ou 28C que estão em linhas e colunas. Em alguns outros exemplos, o layout ou padrão pode ser um arranjo repetitivo das depressões 28A e 28B ou 28C e/ou regiões intersticiais 30. Em outros exemplos, o layout ou padrão pode ser um arranjo aleatório das depressões 28A e 28B ou 28C e/ou regiões intersticiais 30. O padrão pode incluir faixas, espiral, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, marcas, xadrez, diagonais, setas, quadrados e/ou hachuras.
[0485] Deve ser entendido que o layout ou padrão das depressões 28A e 28B ou 28C pode ser caracterizado em relação à densidade e/ou o pitch médio, conforme descrito neste documento.
[0486] Além disso, as depressões 28A e 28B ou 28C podem ter qualquer profundidade adequada.
[0487] Um exemplo de um método 100 para fazer um exemplo da célula de fluxo usando a resina padronizada 54' mostrada na Fig. 11C ou a resina padronizada 54'' mostrada na Fig. 11D é representada na Fig. 12. Como mostrado na Fig. 12, o método 100 inclui aplicar seletivamente um polímero 32 nas depressões 28A, 28B ou 28C de uma resina padronizada 54' ou 54'' em um suporte 52 (número de referência 102); enxertar um primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D no polímero 32 em pelo menos algumas das depressões 28A, 28B ou 28C (número de referência 104); e antes ou depois enxertar o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D, depositando esferas funcionalizadas 50 i) em uma porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões 28C, ou ii) nas segundas depressões 28A tendo dimensões de abertura maiores que pelo menos algumas das depressões 28B, as esferas funcionalizadas 50, incluindo um segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D', anexados em uma superfície de uma estrutura de núcleo 49, em que o primeiro e o segundo conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' são diferentes. Diferentes exemplos deste método 100 envolvendo as depressões 28A, 28B serão descritos ainda mais em referência às Figs. 13A a 13D e 14 e Figs. 154 a 15D e 16. Exemplos diferentes deste método 100 envolvendo as depressões 28C serão descritos mais adiante em referência às Figs. 17A a 17D e 18 e Figs. 19º a 19D e
20.
[0488] A Fig. 13A representa a resina padronizada 54' incluindo depressões maiores 28A e depressões menores 28B. A profundidade das depressões 16A e 16B é omitida para maior clareza.
[0489] A Fig. 13B representa a aplicação seletiva do polímero 32 em cada uma das depressões 28A e 28B. A aplicação seletiva do polímero 32 pode envolver múltiplos processos, incluindo a ativação das regiões intersticiais 30 e as superfícies expostas nas depressões 28A, 28B, depositando o polímero 32 nas regiões intersticiais ativadas 30 e nas depressões 28A, 28B e removendo o polímero 32 das regiões intersticiais 30.
[0490] Em alguns exemplos, a ativação envolve silanizar a superfície, incluindo as regiões intersticiais da resina padronizada 54' e as regiões do suporte 52 que são expostas nas depressões 28A, 28B. A silanização pode ser realizada usando qualquer silano ou derivado de silano. A seleção do silano ou derivado de silano pode depender, em parte, do polímero 32 que será formado, pois pode ser desejável formar uma ligação covalente entre o silano ou derivado de silano e o polímero 32. O método usado para anexar o silano ou derivado de silano pode variar dependendo do silano ou derivado de silano que está sendo usado. Vários exemplos são apresentados aqui.
[0491] Exemplos de métodos de silanização adequados incluem deposição de vapor (por exemplo, um método YES), revestimento por centrifugação ou outros métodos de deposição.
[0492] Em um exemplo que utiliza o forno YES CVD, o suporte 52 tendo a resina padronizada 54' nele é colocado no forno CVD. A câmara pode ser ventilada e, então, o ciclo de silanização é iniciado. Durante o ciclo, o vaso de silano ou derivado de silano pode ser mantido a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 120ºC para norborneno silano), as linhas de vapor de silano ou derivado de silano ser mantidas a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 125ºC para norborneno silano) e as linhas de vácuo ser mantidas a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 145ºC).
[0493] Em outro exemplo, o silano ou derivado de silano (por exemplo, líquido norborneno silano) pode ser depositado dentro de um frasco de vidro e colocado dentro de um dessecador a vácuo de vidro com o suporte 52 tendo a resina padronizada 54' no mesmo. O dessecador pode então ser evacuado para uma pressão que varia de cerca de 15 mTorr a cerca de 30 mTorr, e colocado dentro de um forno a uma temperatura variando de cerca de 60ºC a cerca de 125ºC. A silanização é permitida a continuar e, então, o dessecador é removido do forno, resfriado e ventilado ao ar.
[0494] A deposição de vapor, o método YES e/ou o dessecador a vácuo podem ser utilizados com uma variedade de silano ou derivados de silano, tal como aqueles silano ou derivados de silano incluindo uma porção insaturada de cicloalqueno, tal como norborneno, um derivado de norborneno (por exemplo, um (hetero) norborneno incluindo um oxigênio ou nitrogênio no lugar de um dos átomos de carbono) transcicloocteno, derivados do transcicloocteno, transciclopenteno, transciclohepteno, transciclononeno,
biciclo[3.3.1]non-1-eno, biciclo[4.3.1]dec-1(9)-eno, biciclo[4.2.1]non-1(8)-eno e biciclo[4.2.1]non-l-eno. Qualquer um desses cicloalquenos pode ser substituído, por exemplo, por um grupo R, tal como hidrogênio, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, cicloalquinil, aril, heteroaril, heteroaliciclil, aralquil ou (heteroaliciclil)alquil. Um exemplo do derivado norborneno inclui [(S-biciclo[2.2.1]hept-2- enil)etil]trimetoxissilano. Como outros exemplos, esses métodos podem ser usados quando o silano ou derivado de silano inclui uma fração insaturada de cicloalquino, como ciclooctina, um derivado de ciclooctina ou biciclononinas (por exemplo, biciclo[6.1.0]non-4-ino ou seus derivados, biciclo[6.1.0]non-2-ino ou biciclo[6.1.0]non-3-ino). Estes cicloalquinos podem ser substituídos por qualquer um dos grupos R aqui descritos.
[0495] A ligação do silano ou derivado de silano forma uma superfície ativada, tanto nas regiões intersticiais 30 quanto nas depressões 28A, 28B.
[0496] A camada de polímero 32 pode então ser aplicada como aqui descrito. Como exemplos, o polímero (por exemplo, PAZAM) pode ser depositado usando revestimento por centrifugação, ou dipping ou dip coating, ou fluxo da molécula funcionalizada sob pressão positiva ou negativa, ou outra técnica adequada. O polímero depositado para formar a camada de polímero 32 pode estar presente em uma mistura. Em um exemplo, a mistura inclui PAZAM em água ou em uma mistura de etanol e água.
[0497] Após ser revestida, a mistura incluindo o polímero também pode ser exposta a um processo de cura para formar a camada de polímero 32 através das regiões intersticiais ativadas 30 da resina padronizada 54' e nas depressões 28A, 28B. Em um exemplo, a cura pode ocorrer a uma temperatura variando da temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 25ºC) a cerca de 95ºC por um tempo variando de cerca de 1 milissegundo acerca de vários dias. Em outro exemplo, o tempo pode variar de 10 segundos a pelo menos 24 horas. Ainda em outro exemplo, o tempo pode variar de cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas.
[0498] A ligação da camada de polímero 32 às superfícies ativadas (neste exemplo silanizadas) pode ser através de ligação covalente. A ligação covalente é útil para manter pelo menos o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D nas depressões 28B durante toda a vida útil da célula de fluxo finalmente formada durante uma variedade de usos. A seguir estão alguns exemplos de reações que podem ocorrer entre as superfícies ativadas (por exemplo, silanizadas) e a camada de polímero 32.
[0499] Quando o silano ou derivado de silano inclui norborneno ou um derivado norborneno como a porção insaturada, o norborneno ou um derivado norborneno pode: 1i) sofrer uma reação de cicloadição 1,3-dipolar com um grupo azida/azido de PAZAM; ii) sofrer uma reação de acoplamento com um grupo tetrazina anexado ao PAZAM; sofrer uma reação de cicloadição com um grupo hidrazona anexado ao PAZAM; sofrer uma reação de clique com um grupo de tetrazol ligado ao PAZAM; ou sofrer uma cicloadição com um grupo de óxido de nitrila anexado ao PAZAM.
[0500] Quando o silano ou derivado de silano inclui ciclooctino ou um derivado de ciclooctino como a porção insaturada, o ciclooctino ou derivado de ciclooctino pode: i) sofrer uma reação de 1,3-cicloadição de azida-alquino promovida por tensão (SPAAC) com uma azida/azido de PAZAM, ou ii) sofrer uma reação de cicloadição de alquino-óxido de nitrila promovida por tensão com um grupo de óxido de nitrila anexado ao PAZAM.
[0501] Quando o silano ou derivado de silano inclui uma biciclononina como a porção insaturada, a biciclononina pode sofrer cicloadição de alquino SPAAC semelhante com azidas ou óxidos de nitrila anexados ao PAZAM devido à tensão no sistema do anel bicíclico.
[0502] Em outros exemplos, a incineração do plasma em vez de silanização pode ser usada para ativar as regiões intersticiais 30 e as superfícies expostas do suporte 52 nas depressões 28A, 28B. Após a incineração do plasma, a mistura que contém o polímero pode ser diretamente revestida por centrifugação (ou de outra forma depositada) nas superfícies incineradas do plasma e então curada para formar a camada de polímero 32. Neste exemplo, a incineração do plasma pode gerar agente(s) de ativação da superfície (por exemplo, grupos hidroxil(C-OH ou Si-OH) e/ou carboxil) que podem aderir o polímero às regiões intersticiais 30 e às superfícies expostas do suporte 52 nas depressões 28A, 28B. Nestes exemplos, o polímero 26 é selecionado para que ele reaja com os grupos de superfície gerados pela incineração de plasma.
[0503] Se a ativação ocorre por silanização Ou incineração de plasma, o polimento pode então ser realizado a fim de remover a camada de polímero 32 das regiões intersticiais ativadas 30. O polimento pode ser realizado como descrito aqui. Em alguns exemplos, o polimento também pode ou não remover o silano ou o derivado de silano adjacente às regiões intersticiais 30. Quando essas porções silanizadas são completamente removidas, deve ser entendido que a resina padronizada subjacente 54' está exposta.
[0504] Como mostrado na Fig. 13C, neste exemplo do método 100, as esferas funcionalizadas 50 são depositadas nas depressões 28A. Cada esfera funcionalizada 50 inclui uma estrutura de núcleo 49 e o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' anexado em uma superfície da estrutura de núcleo 49. O segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' é diferente do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D, como aqui descrito. Quaisquer exemplos dos conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' podem ser usados.
[0505] A estrutura do núcleo 49 pode ser qualquer um dos exemplos mencionados aqui para a estrutura da esfera/núcleo. Em um exemplo, a estrutura de núcleo 49 da esfera funcionalizada 50 é selecionada do grupo que consiste em dióxido de silício, um material superparamagnético, poliestireno e um acrilato. A estrutura de núcleo 49 pode ter grupos reativos em sua superfície para acoplamento covalente ao segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D'. Exemplos de tais grupos reativos incluem um ácido carboxílico, uma amina alifática primária, uma amina aromática, um clorometil aromático (por exemplo, cloreto de vinil benzil), uma amida, uma hidrazida, um aldeído, um hidroxil, um tiol e um epóxi. Esse(s) grupo(s) reativo(s) pode(m) estar inerentemente presentes na superfície da estrutura do núcleo 49, ou podem ser incorporados na superfície da estrutura do núcleo 49 através de qualquer técnica de funcionalização adequada (por exemplo, reação química, revestindo a estrutura do núcleo 49 com um polímero contendo grupo reativo, etc.). A estrutura do núcleo 49 com seu(s) grupo(s) reativo(s) inerente(s) ou seu(s) grupo(s reativo(s) adicionados ou revestimento define a região 16.
[0506] Nos exemplos aqui divulgados que utilizam a esfera 50, um conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D ou 12A', 12B', 12C', 12D' poderia ser funcionalizado com um grupo de bloqueio de fosfato na extremidade 3 'que inibiria qualquer extensão após a semeadura. Quando a primeira extensão ocorrer (com o outro conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' ou 12A, 12B, 12C, 12D), o grupo fosfato seria então removido juntamente com quaisquer fitas semeadas no conjunto iniciador bloqueado com fosfato 12A, 12B, 12C, 12D ou 12A', 12B', 12C', 12D' e amplificação entre os dois grupos de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D e 12A', 12B', 12C', 12D' poderiam então prosseguir. Este método ajudaria a reduzir as taxas de policlonalidade, já que apenas um conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D ou 12A', 12B', 12C', 12D' seria inicialmente extensível.
[0507] Embora não mostrado nas Figs. 13A a 13D, antes de depositar as esferas funcionalizadas 50, o método 100 pode incluir formar as esferas funcionalizadas 50 anexando o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' à estrutura do núcleo 49. A funcionalização pode ocorrer usando qualquer técnica adequada, incluindo a reação de um iniciador terminado em azido (por exemplo, succinimidil éster (NHS)) com uma hidrazina na superfície da estrutura do núcleo 49, ou reagindo um iniciador terminado em alquino com uma azida na superfície da estrutura do núcleo, ou reagindo um iniciador terminado em amino a um grupo carboxilato ativado ou éster NHS na superfície da estrutura do núcleo 49, ou um iniciador terminado em tiol com um reagente alquilante (por exemplo, iodoacetamina ou maleimida), um iniciador terminado em fosforamidita com um tioéter, ou um iniciador modificado de biotina com estreptavidina na superfície da estrutura do núcleo 49. Alguns iniciadores de ácido nucleico 19, 19', 21 21' podem ser capturados em esferas de sílica na presença de um agente caotrópico (KI, NI ou NasSCN). Como um exemplo específico, um iniciador terminado em dibenzociclooctino (DBCO, que inclui um alquino) pode ser usado para enxerto de clique livre de cobre.
[0508] As esferas funcionalizadas 50 podem ser depositadas na resina padronizada 54' usando qualquer técnica adequada. Como um exemplo, as esferas funcionalizadas 50 podem ser misturadas em um carreador líquido (por exemplo, água), que pode ser carregado na superfície da resina padronizada 54'. Em outro exemplo, as esferas funcionalizadas 50 podem ser incorporadas forçosamente nas depressões 28A agitando as esferas 50 com esferas de aço de 50 um a 150 um em um agitador que também inclui o suporte 52 tendo a resina padronizada 54' nas mesmas. Devido ao tamanho das esferas funcionalizadas 50 e ao tamanho das depressões 28A e 28B, a exclusão de tamanho impedirá que as esferas funcionalizadas 50 entrem nas depressões “menores 28B e permitirá que uma esfera funcionalizada 50 se auto-monte em uma depressão 28A. As esferas funcionalizadas 50 podem ser fisicamente aprisionadas nas respectivas depressões 28A. As esferas funcionalizadas 50 podem, alternativamente, ser ligadas quimicamente nas respectivas depressões 28A, por exemplo, através de ligantes estreptavidina/biotina.
[0509] Como mostrado na Fig. 13D, as depressões 28B podem então ser funcionalizadas com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. Os iniciadores 18, 18' e 20, 20' podem ser qualquer um dos exemplos aqui divulgados e incluem um grupo funcional que pode ser ligado a um grupo reativo da camada de polímero 32. Como a camada de polímero 32 nas depressões 28A é coberta com as esferas funcionalizadas 50, a camada de polímero 32 nas depressões 28A não são expostas e, portanto, seus grupos reativos não estão disponíveis para reação com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D.
[0510] Os iniciadores 18, 18' e 20, 20' podem ser qualquer um dos exemplos estabelecidos neste documento e são diferentes um do outro e diferentes dos iniciadores 19, 19' e 21, 21'. Por exemplo, se os iniciadores 21, 19 incluem os iniciadores P5 e P7U, então os iniciadores 20, 18 podem incluir os iniciadores PSU e P7. Neste exemplo, o primeiro conjunto de iniciadores 12A inclui um primeiro iniciador não clivável 18 (por exemplo, P7) e um segundo iniciador clivável (por exemplo, uracil modificado) (por exemplo, P5U); e o segundo conjunto de iniciadores 12A' inclui um primeiro iniciador clivável (por exemplo, uracil modificado) 19 (por exemplo, P7U) e um segundo iniciador não clivável 21 (por exemplo, P5). Como discutido aqui, a química dos conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' é ortogonal, o que permite a amplificação em ambas as populações de iniciadores (conjuntos 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D') e clivagem de algumas fitas modelo geradas (por exemplo, 42, 46), deixando as mesmas fitas modelo (senso e antisenso) 40 ou 44 em uma região particular 14 ou 16. Isso permite que os sinais distinguíveis de leitura 1 e leitura 2 sejam obtidos simultaneamente.
[0511] Um processo de enxerto pode ser realizado para enxertar os iniciadores 18, 18' e 20, 20' na camada de polímero 32 nas depressões 28B. Em um exemplo, o enxerto pode ser realizado deposição por deposição flow through (por exemplo, usando uma tampa ligada temporariamente), dunk coating, revestimento por spray, puddle dispensing, ou por outro método adequado que anexará o(s) iniciado(es) 18, 18' e 20, 20' à camada de polímero 32 nas depressões 28B. Cada uma desses exemplos de técnicas pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador (es) água, um tampão e um catalisador.
[0512] Dunk coating pode ser usado porque as esferas funcionalizadas 50, neste exemplo, são funcionalizadas antes de serem introduzidas nas depressões 28A e, portanto, não são reativas com a química dunk. Dunk coating pode envolver submergir o suporte 52, como mostrado na Fig. 13C (com resina padronizada 54' nele e esferas funcionalizadas 50 nas depressões 28A) em uma série de banhos com temperatura controlada. Os banhos também podem ser controlados por fluxo e/ou cobertos com uma camada de nitrogênio. Os banhos podem incluir a solução ou mistura de iniciador. Ao longo dos vários banhos, o(s) iniciador(es) 18, 18' e 20, 20' se anexam aos grupos reativos da camada de polímero 32. Em um exemplo, o suporte 52 será introduzido em um primeiro banho incluindo a solução ou mistura de iniciador onde uma reação ocorre para anexar o(s) iniciado(es) 18, 18' e 20, 20' e então movido para banhos adicionais para lavagem. O movimento de banho em banho pode envolver um braço robótico ou pode ser realizado manualmente. Um sistema de secagem também pode ser usado no dunk coating.
[0513] O revestimento por spray pode ser realizado pulverizando a solução ou mistura de iniciador diretamente no suporte 52, como mostrado na Fig. 13C (com resina padronizada 54' nele e esferas funcionalizadas 50 nas depressões 28A). A pastilha revestida por spray pode ser incubada por um tempo variando de cerca de 4 minutos a cerca de 60 minutos a uma temperatura variando de cerca de 0ºC a cerca de 70ºC. Após a incubação, a solução ou mistura de iniciador pode ser diluída e removida usando, por exemplo, um revestidor de centrifugação (spin coater).
[0514] Puddle dispensing pode ser realizado de acordo com um método de pool e spin-off e, portanto, pode ser realizada com um revestidor de centrifugação. A solução ou mistura de iniciador pode ser aplicada (manualmente ou através de um processo automatizado) ao suporte 52, como mostrado na Fig. 13C (com resina padronizada 54' nele e esferas funcionalizados 50 nas depressões 28A). A solução ou mistura de iniciador aplicada pode ser aplicada ou espalhada por toda a superfície, incluindo nas esferas funcionalizadas 50 e nas regiões intersticiais 30. O substrato revestido de iniciador pode ser incubado por um tempo variando de cerca de 2 minutos a cerca de 60 minutos a uma temperatura variando de cerca de 0ºC a cerca de 80ºC. Após a incubação, a solução ou mistura de iniciador pode ser diluída e removida usando, por exemplo, o revestidor de centrifugação.
[0515] Com qualquer um dos métodos de enxerto, os iniciadores 18, 18' e 20, 20' reagem com grupos reativos da camada de polímero exposta 32 nas depressões 28B e não têm afinidade pelas esferas funcionalizadas 50 ou pelas regiões intersticiais 30 da resina padronizada 54'. Como tal, os iniciadores 18, 18' e 20, 20' enxertam seletivamente na camada de polímero 32 nas depressões 28B.
[0516] A Fig. 14 é uma vista em seção transversal da porção da célula de fluxo 10A representada na Fig. 13D. A célula de fluxo 10A inclui o suporte 52; a resina padronizada 54º" no suporte 52, a resina padronizada 54' incluindo primeiras depressões 28B e segundas depressões 28A separadas por regiões intersticiais 30, as primeiras depressões 28B tendo dimensões de abertura menores que as segundas depressões 28A; o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C ou 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') anexados em pelo menos algumas das primeiras depressões 28B; e a esfera funcionalizada 50 respectivamente posicionada em pelo menos algumas das segundas depressões 28A, a esfera funcionalizada 50 incluindo um segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C' ou 12D' (incluindo os iniciadores 19, 19' e 21, 21') anexado em uma superfície de uma estrutura de núcleo 49, em que o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', ou 12D' é diferente do que o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, ou 12D. No exemplo mostrado nas Figs. 13D e 14, a camada de polímero 32 está presente nas primeiras depressões 28B e nas segundas depressões 28A, e o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, ou 12D é anexado à camada de polímero 32 nas pelo menos algumas das primeiras depressões 28B. Além disso, no exemplo mostrado nas Figs. 13D e 14, as esferas funcionalizadas 50 são posicionadas na camada de polímero 32 em pelo menos algumas das segundas depressões 28A.
[0517] Com referência agora às Figs. 15A a 15D, outro exemplo do método 100 envolvendo as depressões 28A, 28B é mostrado. A Fig. 15A representa a resina padronizada 54' incluindo depressões maiores 28A e depressões menores 28B. A profundidade das depressões 28A e 28B é omitida para maior clareza.
[0518] A Fig. 15B representa a camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28A e 28B. A camada de polímero 32 pode ser aplicada seletivamente como descrito aqui, o que pode incluir a ativação das regiões intersticiais 30 e as superfícies expostas nas depressões 28A, 28B, depositando a camada de polímero 32 nas regiões intersticiais ativadas 30 e nas depressões 28A, 28B, e remoção da camada de polímero 32 das regiões intersticiais 30.
[0519] Neste exemplo, como mostrado na Fig. 15C, o conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') é então enxertado na camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28A, 28B. Como as esferas funcionalizadas 50 não foram introduzidas, a camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28A, 28B é exposta e, portanto, seus grupos reativos estão disponíveis para reação com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. O enxerto pode ser realizado usando qualquer uma das técnicas descritas em referência à Fig. 13D. Uma vez que a camada de polímero 32 é exposta em cada uma das depressões 28A, 28B, os iniciadores 18, 18' e 20, 20' podem ser enxertados em cada uma das depressões 28A, 28B.
[0520] Como mostrado na Fig. 15D, as esferas funcionalizadas 50 podem então ser introduzidas nas depressões 28A (tendo a camada de polímero 32 e conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D nas mesmas). As esferas funcionalizadas 50 podem ser depositadas na resina padronizada 54' usando qualquer técnica adequada. Devido ao tamanho das esferas funcionalizadas 50 e ao tamanho das depressões 28A e 28B, a exclusão de tamanho impedirá que as esferas funcionalizadas 50 entrem nas depressões menores 28B e permitirá que uma esfera funcionalizada 50 se auto-monte em uma depressão 28A. Neste exemplo, as esferas funcionalizadas 50 podem ser fisicamente aprisionadas nas respectivas depressões 28A. Alternativamente, neste exemplo, as esferas funcionalizadas 50 podem ser quimicamente anexadas nas respectivas depressões 28A, por exemplo, através de ligantes de estreptavidina/biotina.
[0521] A Fig. 16 é uma vista em seção transversal da porção da célula de fluxo 10B representada na Fig. 15D. A célula de fluxo 10B inclui o suporte 52; a resina padronizada 54º" no suporte 52, a resina padronizada 54' incluindo primeiras depressões 28B e segundas depressões 28A separadas por regiões intersticiais 30, as primeiras depressões 28B tendo dimensões de abertura menores que as segundas depressões 28A; o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') anexados em pelo menos algumas das primeiras depressões 28B; e a esfera funcionalizada 50 posicionada respectivamente em pelo menos algumas das segundas depressões 28A, a esfera funcionalizada 50 incluindo um segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' (incluindo os iniciadores 19, 19' e 21, 21') anexado em uma superfície de uma estrutura de núcleo 49, em que o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' é diferente do que o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. No exemplo mostrado nas Figs. 15D e 16, a camada de polímero 32 está presente nas primeiras depressões 28B e nas segundas depressões 28A, e o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D é anexado à camada de polímero 32 nas primeiras depressões 28B e nas segundas depressões 28A. Neste exemplo, então, a esfera funcionalizada 50 é posicionada no primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') nas pelo menos algumas das segundas depressões 28A.
[0522] Com referência agora às Figs. 17A a 17D, um exemplo do método 100 envolvendo as depressões 28C é mostrado.
[0523] A Fig. 17A representa a resina padronizada
54'' incluindo depressões 28C. Cada uma das depressões 28C inclui uma porção maior 34 e uma porção menor 34'. A profundidade das depressões 28C (como mostrado na Fig. 11D) é omitida para clareza.
[0524] A Fig. 17B representa a camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28C. Como mostrado na Fig. 17B, tanto a porção maior 34 quanto a porção menor 34' de cada depressão 28C têm a camada de polímero 32 aplicada a ela. A camada de polímero 32 pode ser aplicada seletivamente conforme descrito aqui, que, em um exemplo, pode incluir a ativação das regiões intersticiais 30 e as superfícies expostas nas depressões 28C, depositando a camada de polímero 32 nas regiões intersticiais ativadas 30 e nas depressões 28C e remover a camada de polímero 32 das regiões intersticiais 30.
[0525] Como mostrado na Fig. 17C, neste exemplo do método 100, as esferas funcionalizadas 50 são depositadas nas porções maiores 34 das depressões 28C. Qualquer uma das esferas funcionalizadas 50 aqui descritas pode ser usada neste exemplo.
[0526] As esferas funcionalizadas 50 (incluindo os iniciadores 19, 19' e 21, 21') podem ser depositadas na resina padronizada 54 '' usando qualquer técnica adequada, tal como aquelas aqui descritas. Devido ao tamanho das esferas funcionalizadas 50 e ao tamanho das porções 34 e 34', a exclusão de tamanho impedirá que as esferas funcionalizadas 50 entrem nas porções menores 34' e permitirá que uma esfera funcionalizada 50 se auto-monte em uma porção maior 34 de cada depressão 28C. Neste exemplo, as esferas funcionalizadas 50 podem ser fisicamente aprisionadas nas respectivas porções maiores 34 ou podem ser quimicamente anexadas nas respectivas porções maiores 34, por exemplo, através de ligantes de estreptavidina/biotina.
[0527] Como mostrado na Fig. 17D, as porções menores 34' das depressões 28C podem então ser funcionalizadas com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. Quaisquer exemplos dos iniciadores 18, 18' e 20, 20' descritos aqui podem ser utilizados, desde que eles sejam selecionados para serem diferentes de e ortogonais aos iniciadores 19, 19' e 21, 21' das esferas funcionalizadas 5. Neste exemplo, a camada de polímero 32 nas porções maiores 34 das depressões 28C é coberta com as esferas funcionalizadas 50 e, portanto, a camada de polímero 32 nas porções maiores 34 das depressões 28C não é exposta. Como tal, os grupos reativos do polímero não estão disponíveis para reação com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. Os grupos reativos do polímero nas porções menores 34' permanecem expostos e, portanto, estão disponíveis para reação com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. O enxerto dos iniciadores 18, 18' e 20, 20' na camada de polímero 32 nas porções menores 34' pode ser realizada usando qualquer uma das técnicas descritas em referência à Fig. 13D.
[0528] A Fig. 18 é uma vista em seção transversal da porção da célula de fluxo 10C representada na Fig. 17D. A célula de fluxo 10C inclui o suporte 52; a resina padronizada 54º'* no suporte 52, a resina padronizada 54'' incluindo depressões 28C separadas por regiões intersticiais 30; o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') anexados a pelo menos algumas das depressões 28C; e a esfera funcionalizada 50 posicionada em pelo menos algumas das depressões 28C, de modo que pelo menos alguns iniciadores 18, 18' e 20, 20' do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D sejam expostos, a esfera funcionalizada 50 incluindo o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' anexado em uma superfície da estrutura do núcleo 49, em que o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' é diferente do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. No exemplo mostrado nas Figs. 17D e 18, cada uma das depressões 28C inclui uma primeira porção 34 com uma primeira dimensão de abertura que é maior que ou igual a um diâmetro da esfera funcionalizada 50, e uma segunda porção 34' com uma segunda dimensão de abertura que é menor que o diâmetro da esfera funcionalizada 50; e a esfera funcionalizada 50 está posicionada na primeira porção 34 de cada uma das pelo menos algumas das depressões 28C. Também no exemplo mostrado nas Figs. 17D e 18, a camada de polímero 32 está presente nas depressões 28C, e o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D é anexado a uma porção da camada de polímero 32 desocupada pela esfera funcionalizado 50 (isto é, à porção de a camada de polímero 32 na porção menor 34' da depressão 28C).
[0529] Com referência agora às Figs. 19A a 19D, outro exemplo do método 100 envolvendo as depressões 28C é mostrado. Cada uma das depressões 28C inclui uma porção maior 34 e uma porção menor 34'. A profundidade das depressões 28C
(como mostrado na Fig. 11D) é omitida para clareza.
[0530] A Fig. 19B representa a camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28C. Como mostrado na Fig. 19B, tanto a porção maior 34 quanto a porção menor 34' de cada depressão 28C têm a camada de polímero 32 aplicada a ela. A camada de polímero 32 pode ser aplicada seletivamente conforme descrito aqui, que, neste exemplo, pode incluir a ativação das regiões intersticiais 30 e as superfícies expostas nas depressões 28C, depositando a camada de polímero 32 nas regiões intersticiais ativadas 30 e nas depressões 28C e remoção da camada de polímero 32 das regiões intersticiais 30.
[0531] Neste exemplo, como mostrado na Fig. 19C, o conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') é então enxertado na camada de polímero 32 em cada uma das depressões 28C. Como as esferas funcionalizadas 50 não foram introduzidas, a camada de polímero 32 em cada porção 34, 34' das depressões 28C é exposta e, portanto, seus grupos reativos estão disponíveis para reação com o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. O enxerto pode ser realizado usando qualquer uma das técnicas descritas em referência à Fig. 13D. Como a camada de polímero 32 é exposta em cada porção 34, 34' das depressões 28C, os iniciadores 18, 18' e 20, 20' podem ser enxertados em cada uma das partes 34, 34'.
[0532] Como mostrado na Fig. 19D, as esferas funcionalizadas 50 podem então ser introduzidas nas porções maiores 34 das depressões 28C (tendo a camada de polímero 32 e conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D nas mesmas). As esferas funcionalizadas 50 podem ser depositadas na resina padronizada 54'' usando qualquer técnica adequada. Devido ao tamanho das esferas funcionalizadas 50 e ao tamanho das porções 34 e 34', a exclusão de tamanho impedirá que as esferas funcionalizadas 50 entrem nas porções menores 34' e permitirá que uma esfera funcionalizada 50 se auto-monte em uma porção maior 34. Neste exemplo, as esferas funcionalizadas 50 podem ser fisicamente aprisionadas nas respectivas porções maiores 34, ou podem ser quimicamente anexadas nas respectivas porções maiores 34, por exemplo através de ligantes de estreptavidina/biotina.
[0533] A Fig. 20 é uma vista em seção transversal da porção da célula de fluxo 10D representada na Fig. 19D. A célula de fluxo 10D inclui o suporte 52; a resina padronizada 54º" no suporte 52, a resina padronizada 54'' incluindo depressões 28C separadas por regiões intersticiais 30; o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20') anexados a pelo menos algumas das depressões 28C; e a esfera funcionalizada 50 posicionada em pelo menos algumas das depressões 28C, de modo que pelo menos alguns iniciadores 18, 18' e 20, 20' do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D sejam expostos, a esfera funcionalizada 50 incluindo o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' anexado em uma superfície da estrutura do núcleo 49, em que o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D' é diferente do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D. No exemplo mostrado nas Figs. 19D e 20, cada uma das depressões 28C inclui uma primeira porção 34 com uma primeira dimensão de abertura que é maior que ou igual a um diâmetro da esfera funcionalizada 50, e uma segunda porção 34' com uma segunda dimensão de abertura que é menor que o diâmetro da esfera funcionalizada 50; e a esfera funcionalizada 50 é posicionada na primeira porção 34 de cada uma das pelo menos algumas das depressões 28C. Também no exemplo mostrado nas Figs. 19D e 20, a camada de polímero 32 está presente nas depressões 28C, o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D é anexado à camada de polímero 32 nas depressões 28C e a esfera funcionalizada 50 está posicionada em alguns dos iniciadores 18, 18' e 20, 20' do primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D (isto é, nos iniciadores 18, 18' e 20, 20' anexados à camada de polímero 32 na porção maior 34 da depressão 28C).
[0534] O exemplo das células de fluxo 10A, 10B, 10C, 10D são mostradas sem uma tampa ligada a elas. Embora não mostradas, as células de fluxo 10A, 10B, 10C, 10D podem ter a tampa ligada a pelo menos uma porção da região intersticial 30, como descrito. Em alguns exemplos, a tampa pode ser ligada após a célula de fluxo 10A, 10B, 10C, 10D ser formada.
[0535] As células de fluxo 10A, 10B, 10C, 10D podem ser usadas em uma variedade de abordagens ou tecnologias de sequenciamento, incluindo técnicas frequentemente conhecidas como sequenciamento por síntese (SBS), sequenciamento cíclico em matriz (cyclic-array sequencing) , sequenciamento por ligação, pirosequenciamento e assim por diante. Em um exemplo específico, as células de fluxo 10A, 10B, 10C, 10D podem ser expostas ao fluido/ mistura do modelo e a amplificação pode ser realizada conforme descrito aqui para gerar a primeira fita modelo não clivável 40, a primeira fita modelo clivável 46, a segunda fita modelo não clivável 44, a segunda fita modelo clivável 42. A clivagem pode ser realizada e, então, o método de sequenciamento paired-end simultaneamente divulgado neste documento pode ser realizado.
[0536] Com qualquer uma das técnicas utilizadas com as células de fluxo 10A, 10B, 10C, 10D, uma vez que os conjuntos de iniciadores 12A, 12A' ou 12B, 12B' ou 12C, 12C' ou 12D, 12D' estão presentes nas depressões 28A ou 28B ou porções 34 ou 34' da depressão 28C e não nas regiões intersticiais 30, a amplificação e o sequenciamento serão confinados às depressões 28A e 28B ou 28C.
Célula de Fluxo Baseada em Copolímero em Bloco
[0537] Alguns exemplos da célula de fluxo aqui divulgada incluem o copolímero em bloco, que é usado com o substrato de múltiplas camadas, incluindo uma resina padronizada. Estes exemplos são descritos em referência às Fig. 21 a Fig. 25B.
[0538] Nestes exemplos, a resina padronizada (por exemplo, 54') pode ser fabricada usando uma abordagem "top down", tal como a litografia por nanoimpressão. As abordagenstop down podem gerar uma série de depressões 28 com alta densidade, baixo pitch e pequenos nanoelementos. Quando combinados com a automontagem direcionada do copolímero em bloco, que é uma abordagem "bottom up", elementos ainda menores (tendo domínios de tamanho sub- litográfico) podem ser formados dentro das depressões 28. Elementos pequenos podem ser desejáveis porque um cluster de maior densidade pode ser obtido. Cluster de maior densidade significa que mais bases podem ser lidas em uma determinada área de unidade, o que aumenta o rendimento genético da célula de fluxo padronizada. Além disso, as regiões não enxertadas (por exemplo, regiões intersticiais 30) circundam os pequenos elementos, que permitem maior acessibilidade aos iniciadores enxertados no copolímero em bloco. Como tal, a utilização dos iniciadores pode aumentar.
[0539] Nestes exemplos, o copolímero em bloco é auto- montado nas depressões 28 da resina padronizada, e não nas regiões intersticiais 30 entre as depressões 28. Como tal, o processamento adicional para remoção de material das regiões intersticiais 30 não está envolvido.
[0540] Estes exemplos da célula de fluxo incluem um suporte 52; uma resina padronizada no suporte 52, a resina padronizada incluindo depressões 28 separadas por regiões intersticiais 30; um copolímero em bloco na resina padronizada nas depressões 28, cada bloco do copolímero em bloco tendo um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco do copolímero em bloco; e um iniciador anexado ao grupo funcional específico do bloco de pelo menos um dos blocos. Em alguns exemplos, os iniciadores incluem os iniciadores não cliváveis 18, 18' e 21, 21' anexados a um bloco do copolímero em bloco, e a célula de fluxo pode ser usada em técnicas de sequenciamento paired-end que envolvem sequencialmente o sequenciamento de fitas modelo senso e, então, fitas modelo antisenso que são anexadas à um bloco. Em outros exemplos, os respectivos conjuntos de iniciadores
12A, 12A', ou 12B, 12B', ou 12C, 12C', ou 12D, 12D' divulgados neste documento são anexados a diferentes blocos do copolímero de bloco. Neste exemplo, um bloco inclui os iniciadores 18, 18' e 20, 20' e outro bloco inclui os iniciadores 19, 19' e 21, 21'. Este exemplo da célula de fluxo pode ser usado nas técnicas de sequenciamento paired- end simultâneo aqui divulgadas.
[0541] Exemplos de porções das células de fluxo são mostrados nas Figs. 22E e 23, e serão descritos mais adiante neste documento.
[0542] Um exemplo de um método 200 para fazer um exemplo da célula de fluxo é mostrado na Fig. 21. Como mostrado na Fig. 21, o método 100 inclui padronizar uma resina para formar uma resina padronizada incluindo depressões 28 separadas por regiões intersticiais 30 (número de referência 202); introduzir de uma solução incluindo um copolímero em bloco na resina padronizada, cada bloco do copolímero em bloco tendo um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco do copolímero em bloco (número de referência 204); expor a solução ao anelamento de vapor de solvente, pelo qual a fase de copolímero em bloco se separa e se auto-monta nas depressões 28 (número de referência 206); e enxertar um iniciador no grupo funcional específico do bloco de pelo menos um dos blocos (número de referência 208). Este método 200 será descrito ainda mais em referência às Figs. 22A a 22E.
[0543] A Fig. 22A representa o suporte 52, e a Fig. 22B representa uma resina 54A depositada no suporte 52.
Quaisquer exemplos do suporte 52 aqui descrito podem ser utilizados. Com o copolímero em bloco, a resina 54A é capaz de ter depressões 28 (Fig. 22C) definidas nela e também é capaz de atuar como um modelo de orientação para o copolímero de bloco subsequentemente depositado 58 ("BCP" entre as Fig. 22C e 22D). Como tal, qualquer resina 54A que pode ser padronizada usando fotolitografia, litografia por nanoimpressão, técnicas de estampagem, técnicas de gravação, técnicas de moldagem, técnicas de microgravação, técnicas de impressão, etc. pode ser usada. Além disso, a resina 54A, depois de ser padronizada (isto é, resina padronizada 54A'), deve ter uma energia de superfície que está dentro da mesma faixa do copolímero em bloco 58 que deve ser depositado nela. Em um exemplo, a resina 54A/resina padronizada 54A' e o copolímero em bloco 58 cada um tem uma energia de superfície dentro de um intervalo de cerca de 25 mN/m a cerca de 50 mM/m.
[0544] Alguns exemplos de resinas 54A que podem ser padronizadas e atuar como modelos de orientação são selecionados do grupo que consiste em uma resina à base de resina oligomérica poliédrica de silsesquioxano (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli(etileno glicol), uma resina poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato e suas combinações. Embora vários exemplos tenham sido fornecidos, acredita-se que qualquer resina que possa ser curada por radicais possa ser usada. Qualquer uma das resinas 54 aqui divulgadas pode ser usada para a resina 54A.
[0545] Como mostrado entre as Fig. 22A e Fig. 22B, a resina 54A é depositada no suporte 52. Em um exemplo do método 200, a deposição da resina 44 envolve deposição química de vapor, dip coating, dunk coating, revestimento por centrifugação, revestimento por spray, puddle dispensing, revestimento por spray ultrassônico, doctor blade coating, aerosol printing , screen printing , impressão por microcontato ou impressão a jato de tinta.
[0546] A resina depositada 54 é então padronizada, utilizando qualquer uma das técnicas de padronização mencionadas neste documento. No exemplo mostrado na e entre as figuras 22A e 22B, a litografia por nanoimpressão é usada para padronizar a resina 54. Após a resina 54 ser depositada, ela pode ser submetida a softbake para remover o excesso de solvente. Um molde de litografia por nanoimpressão ou carimbo de trabalho 56 é pressionado contra a camada de resina 54 para criar uma impressão na resina 54. Em outras palavras, a resina 54 é recuada ou perfurada pelas protusões do carimbo de trabalho 56. A resina 54 pode ser então curada com o carimbo de trabalho 56 no lugar. A cura pode ser realizada por exposição a radiação actínica, tal como radiação de luz visível ou radiação ultravioleta (UV), ou radiação de comprimento de onda variando de cerca de 240 nm e 380 nm quando um fotorresistente é usado; ou pela exposição ao calor quando uma resistência curável térmica é usada. A cura pode promover polimerização e/ou reticulação. Como um exemplo, a cura pode incluir vários estágios, incluindo um softbake (por exemplo, para remover o(s) solvente(s)) e um hardbake. O softbake pode ocorrer a uma temperatura mais baixa, variando de cerca de 50ºC a cerca de 150ºC. A duração do hardbake pode durar de cerca de 5 segundos a cerca de 10 minutos a uma temperatura variando de cerca de 100ºC a cerca de 300ºC. Exemplos de dispositivos que podem ser usados para o softbaking e/ ou hardbaking incluem uma placa aquecedora, forno, etc.
[0547] Após a cura, o carimbo de trabalho 56 é liberado. Isso cria elementos topográficos, isto é, as depressões 16, na resina 54. Como mostrado na Fig. 22C, a resina 54 tendo as depressões 28 definidas nela é referida como a resina padronizada 54'. A resina padronizada 54' pode estar sujeita a um hard baking adicional para completar a cura e bloquear a topografia impressa. Em alguns exemplos, o hard baking pode ser realizado a uma temperatura variando de cerca de 60ºC a cerca de 300ºC.
[0548] Como mostrado na Fig. 22C, a resina padronizada 54' inclui as depressões 28 definidas na mesma e as regiões intersticiais 30 separando as depressões adjacentes 28. Nos exemplos aqui divulgados, as depressões 28 tornam-se funcionalizadas com o copolímero em bloco (BCP) 58 e iniciadores 18, 21 (Fig. 22F), enquanto porções das regiões intersticiais 20 podem ser usadas para ligação mas não terão o copolímero em bloco 58 ou o(s) iniciador(es) 18,
21.
[0549] Como mostrado na Fig. 22C, a resina padronizada 54' pode então ser exposta a processos para formar o copolímero de bloco separado por fase 58 (incluindo os blocos 58A e 58B) nas depressões 28. Como mostrado entre a Fig. 22C e a Fig. 22D, uma solução do copolímero em bloco 58 é depositada na resina padronizada 54', onde cada bloco
58A, 58B do copolímero em bloco 58 tem um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco 58B, 58A do copolímero em bloco 58. Vários exemplos do copolímero em bloco 58 serão agora descritos.
[0550] O copolímero em bloco 58 é um heteropolímero constituído por pelo menos dois monômeros diferentes. Em um exemplo, o copolímero em bloco 58 inclui um primeiro bloco 58A incluindo um monômero tendo um grupo funcional de enxerto primário como seu grupo funcional específico do bloco, e um segundo bloco 58B incluindo um monômero que é para ajustar um parâmetro de interação para conduzir a separação de fases do primeiro e o segundo blocos. Neste exemplo, o monômero do segundo bloco 58B também pode incluir um grupo funcional específico do bloco que pode reagir com (e assim anexar à) resina padronizada 54'. O grupo funcional específico do bloco que pode reagir com (e, portanto, anexar à) resina padronizada 54' é aqui referido como o grupo funcional de fixação a resina. Deve ser entendido que as designações primeiro e segundo não indicam nenhuma ordem específica no copolímero em bloco, e que qualquer bloco pode incluir um grupo funcional de enxerto primário ou um grupo funcional para ajustar um parâmetro de interação. Por exemplo, o primeiro bloco 58A pode incluir um monômero tendo um grupo funcional específico do bloco que é capaz de enxertar um iniciador (por exemplo, 18, 21) e que é capaz de ajustar um parâmetro de interação para conduzir a separação de fase do primeiro e segundo blocos e o segundo bloco 58B podem incluir um monômero tendo grupo funcional de fixação a resina. Para outro exemplo, o primeiro bloco 58A pode incluir um monômero tendo um grupo funcional específico do bloco que é capaz de enxertar um iniciador (por exemplo, 18, 21) e se anexar à resina 54', e que o segundo bloco 58B pode incluir um monômero que é capaz de ajustar um parâmetro de interação para conduzir a separação de fase do primeiro e do segundo blocos.
[0551] Em quaisquer exemplos do copolímero em bloco 58 aqui divulgado, o grupo funcional enxerto primário é selecionado a partir do grupo consistindo de azida/azido, amino opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, aldeído, hidrazona opcionalmente substituída, hidrazina opcionalmente substituída, carboxil , hidróxi, tetrazol opcionalmente substituído, tetrazina opcionalmente substituída, óxido de nitrila, nitrona, tiol e suas combinações. Quando múltiplos grupos funcionais de enxerto primário são incluídos em um único bloco, diferentes iniciadores podem ser anexados ao bloco único. Quando diferentes grupos funcionais de enxerto primário são incluídos em diferentes blocos, diferentes iniciadores podem ser anexados aos diferentes blocos.
[0552] O grupo funcional de enxerto de primário pode ser capaz de reagir com um grupo funcional anexado à extremidade 5' do iniciador. Por exemplo, um iniciador terminado em biciclo[6.1.0]non-4-ino(BCN) pode ser capturado por um grupo funcional de enxerto primário de azida do copolímero em bloco 58 através da química de clique livre de catalisador promovido por tensão. Para outro exemplo, um iniciador terminado em alquino pode ser capturado por um grupo funcional de enxerto primário de azida do copolímero em bloco 58 através química de clique catalisada por cobre. Para ainda outro exemplo, um iniciador terminado com norborneno pode sofrer uma reação de clique promovida por tensão em anel livre de catalisador com um grupo funcional de enxerto primário de tetrazina do copolímero de bloco 58.
[0553] Em um exemplo, o grupo funcional de enxerto primário é um grupo azido anexado a um monômero de acrilamida. Um exemplo deste monômero é azido acetamido pentil acrilamida. Em outro exemplo, o grupo funcional de enxerto primário é um grupo azido anexado a um monômero contendo benzeno. Dois exemplos deste monômero incluem benzil azida ou uma azida estireno funcionalizada (por m exemplo, Na).
[0554] Em quaisquer exemplos do copolímero em bloco 58 divulgado neste documento, o grupo funcional de fixação de resina é selecionado do grupo consistindo de um grupo amino, um grupo álcool, um grupo aril e um grupo carregado. Grupos carregados aniônicos adequados incluem sulfatos ou ácidos carboxílicos. Grupos carregados catiônicos adequados incluem amônio, guanidínio ou imidazólio. Em outros exemplos, o grupo funcional de fixação de resina pode um grupo trifluorometil (-CF;). Em ainda outro exemplo do copolímero em bloco 18 aqui divulgado, o monômero incluindo o grupo funcional de fixação de resina pode ser um monômero de siloxano, tal como SiO(CH3),.
[0555] Em um exemplo, o grupo funcional de fixação de resina é um grupo amino anexado a um monômero de NH>2 acrilamida. Um exemplo desse monômero é 2d . Neste exemplo, a ponte de etila (entre os nitrogênios) pode ser substituída por uma ponte de propila ou qualquer outro comprimento de ponte que não interfira com a função desejada do monômero. Em um exemplo, o comprimento da ponte pode ser até 16 átomos de carbono. Em outro exemplo, o grupo funcional de fixação de resina é um grupo aril de um monômero de estireno. Outros grupos de fixação de resina (para fixação covalente) dependem de como a resina 14 é funcionalizada. Por exemplo, se a resina incluir grupos epóxi, uma amina ou álcool pode ser um grupo funcional de fixação de resina adequado.
[0556] Alguns exemplos do copolímero em bloco 58 incluem o grupo funcional de enxerto primário e o grupo funcional de fixação de resina. Esses grupos podem depender, respectivamente e em parte, do iniciador (por exemplo, 18, 21 ou 18, 20 ou 18', 20' ou 19, 21 ou 19', 21') a ser enxertado e da resina padronizada 54' que é para anexar ao copolímero de bloco 58. A seguir estão alguns exemplos de copolímeros de bloco 58 que incluem ambos, o grupo funcional de enxerto de iniciador e o grupo funcional de fixação de resina.
[0557] Em um exemplo onde a resina padronizada 54' é um POSS epóxi, o copolímero em bloco 58 inclui um primeiro bloco 58A incluindo um monômero de acrilamida tendo um grupo amino como seu grupo funcional específico do bloco e um segundo bloco 58B incluindo um monômero azido acetamido pentil acrilamida tendo um grupo azido como seu grupo funcional específico de bloco. Neste exemplo, o primeiro bloco 58A inclui o grupo funcional de fixação de resina e o segundo bloco 58B inclui o grupo funcional de enxerto primário, embora o segundo bloco 58B também possa funcionar como um grupo funcional de fixação de resina. Um exemplo específico deste copolímero em bloco 18 é: Os q AN
NH NH, [ O NH Os NH RA Pr LR n m em que R é hidrogênio ou um grupo final de espécies iniciadoras de polímero, n varia de 1 a 10.000, em varia de 1 a 10.000. Exemplos do grupo final de espécies iniciadoras de polímeros incluem um grupo final de transferência reversível de cadeia por adição-fragmentação (RAFT), um grupo final de polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP), um grupo final de polimerização radicalar mediada por nitrogênio (NMP), um grupo final de tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou um grupo final de polimerização via radicais livres (FRP). Em outro exemplo, n e m variam independentemente de cerca de 1 a cerca de
1.000.
[0558] Em outro exemplo onde a resina padronizada 54' é um POSS epóxi, o copolímero em bloco 58 inclui um primeiro bloco 58A incluindo um monômero de estireno tendo um grupo aril como grupo funcional específico do bloco e um segundo bloco 58B incluindo uma azida estireno funcionalizada tendo um azido como grupo funcional específico do bloco. Neste exemplo, o primeiro bloco 58A inclui o grupo funcional de fixação de resina e o segundo bloco 58B inclui o grupo funcional de enxerto primário, embora o segundo bloco 58B também possa funcionar como um grupo funcional de fixação de resina. Um exemplo específico deste copolímero em bloco 58 é: x n m N3 em que n varia de 1 a 10.000, e m varia de 1 a 10.000. Em outro exemplo, n e m variam independentemente de cerca de 1 a cerca de 1.000.
[0559] Ainda em outro exemplo onde a resina padronizada 54' é um POSS de epóxi, o copolímero em bloco 58 inclui um primeiro bloco 58A incluindo uma azida estireno funcionalizada tendo um azido como seu grupo funcional específico de bloco, e um segundo bloco 58B incluindo um monômero de siloxano tendo o siloxano como seu grupo funcional específico de bloco. Neste exemplo, o primeiro bloco 58A inclui o grupo funcional de enxerto primário, embora o primeiro bloco 58A também possa funcionar como um grupo funcional de fixação de resina, e o segundo bloco 58B inclui o grupo funcional de fixação de resina. Um exemplo específico deste copolímero de bloco 58 é: | + > " SS 15 Me) n | Pm o | Td Na em que n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000. Em outro exemplo, n e m variam independentemente de cerca de 1 a cerca de 1.000.
[0560] Em um exemplo onde a resina padronizada 54' é um fluoropolímero amorfo (como CYTOPO), o copolímero em bloco 58 inclui um primeiro bloco 58A incluindo um monômero tendo um grupo trifluorometil como seu grupo funcional específico do bloco e um segundo bloco 58B incluindo um monômero tendo grupo funcional de enxerto primário e enxerto de resina como seu grupo funcional específico de bloco. Em um exemplo deste copolímero em bloco 58, o segundo bloco 58B inclui o monômero de azido acetamido pentil acrilamida e o primeiro bloco 58A (que, neste exemplo, pode ser um grupo funcional que altera a energia da superfície) pode ser um acrilato fluorado ou uma acrilamida fluorada. Exemplos específicos deste copolímero em bloco 18 têm a estrutura: o ox
NH Xx= O, NH CF3
É Ox. X Ox NH n m em que n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000. Em outro exemplo, n e m variam independentemente de cerca de 1 a cerca de 1.000. Em outro exemplo deste copolímero em bloco 58 (que é adequado para uso com um fluoropolímero amorfo), o segundo bloco 58B inclui azida estireno funcionalizada e o primeiro bloco 58A (neste exemplo o grupo funcional que altera a energia da superfície) pode ser acrilato de trifluoroetila Um exemplo específico deste copolímero em bloco 58 tem a estrutura:
A rA> f É 9 o |
SJ T CF; N3z em que n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000. Em outro exemplo, n e m variam independentemente de cerca de 1 a cerca de 1.000.
[0561] Deve ser entendido ainda que os copolímeros em bloco 58 divulgados neste documento também podem incluir um ou mais outros monômeros que não interferem nas funções respectivas dos blocos 58A e/ou 58B (por exemplo, enxerto de iniciador, fixação de resina, separação de fase etc.). O(s) monômero (s) adicional (ais) (e especificamente o grupo funcional específico do bloco do(s) monômero (s) adicional (ais) do(s) bloco(s) adicional(ais) pode ser selecionado para afetar/alterar uma energia livre de superfície do copolímero em bloco 58, para afetar a estabilidade do copolímero em bloco 58, para anexar outro iniciador, e/ou para anexar uma enzima. Exemplos de monômeros que podem afetar/alterar a energia livre de superfície incluem um grupo trifluorometil de um monômero de acrilato (por exemplo, acrilato de trifluoroetila ou metacrilato de trifluoroetila) ou de acrilamida trifluoroetila. Exemplos de monômeros que podem anexar uma enzima podem incluir os seguintes grupos funcionais específicos do bloco: tióis, aminas ou álcoois, que podem reagir com as enzimas com N-
hidroxissuccinimida (NHS) funcionalizadas. Deve ser entendido que outros grupos funcionais podem ser utilizados para anexar enzimas ou outras biomoléculas. Como tal, alguns exemplos do copolímero em bloco 58 são terpolímeros, que serão discutidos em mais detalhes em referência às Fig. 24A e Fig. 24B.
[0562] Como mencionado acima, no método 200, uma solução do copolímero em bloco 58 é introduzida na resina padronizada 54' (como mostrado entre as Figuras 22C e 22D). A solução pode ser uma solução diluída (por exemplo, variando de cerca de 0,01% em peso a cerca de 10% em peso) do copolímero em bloco 58 em um solvente adequado, tal como tolueno. A solução do copolímero em bloco 58 pode ser depositada usando qualquer técnica adequada, tal como revestimento por centrifugação, etc.
[0563] Para que o copolímero em bloco 58 se auto- monte e se submeta à separação por microfase no suporte topologicamente padronizado (por exemplo, resina padronizada 54'), a solução incluindo o copolímero em bloco é ter um alto parâmetro de interação de Huggins com a resina padronizada subjacente 54'. Em um exemplo, a solução do copolímero em bloco 58 tem um parâmetro de interação Flory- Huggins variando de cerca de 0,04 a cerca de 0,30. Em outro exemplo, a solução do copolímero em bloco 58 tem um parâmetro de interação Flory-Huggins de cerca de 0,26.
[0564] o copolímero em bloco depositado (as- deposited block copolymer) 58 na resina padronizada 54' é então exposto ao solvente de anelamento. O vapor do solvente, temperatura e o tempo usados no solvente de anelamento podem depender do copolímero de bloco 58 usado e, em particular,
das condições nas quais o copolímero em bloco 58 se auto- monta nas depressões 28 e a microfase se separa nos respectivos blocos 58A e 58B. Em um exemplo, o vapor do solvente é tolueno, a temperatura é a temperatura ambiente (por exemplo, de cerca de 14ºC a cerca de 25ºC) e o tempo é de cerca de 3 horas. Deve ser entendido que a seleção do solvente, o tempo de anelamento e a temperatura de anelamento dependem do copolímero em bloco. Alguns solventes adequados podem ser tolueno, heptano, alcanos superiores e suas misturas. O tempo e a temperatura podem influenciar a morfologia nas depressões 28 e, portanto, podem ser controlados. Como exemplo, o tempo de anelamento pode variar de 1 minuto a 180 minutos ou até mais, por exemplo, de cerca de 3 horas a cerca de 48 horas; e a temperatura de anelamento pode variar de 18ºC a cerca de 250ºC.
[0565] Como resultado do solvente de anelamento, o copolímero em bloco 58 se auto-monta nas depressões 16 (e, portanto, não está presente nas regiões intersticiais 30) e também a fase se separa em domínios segregados ou blocos 58A, 58B. Na Fig. 2D, os blocos segregados 58A, 58B têm um padrão circular ou espiral, embora o padrão possa depender do copolímero em bloco 58 usado. Outros exemplos do padrão do copolímero em bloco 58 são mostrados, por exemplo, nas Figs. 23A e 23B. A Fig. 23A é uma vista superior de uma depressão 28 e algumas da região intersticial circundante 30, onde o copolímero em bloco 58 na fase da depressão 28 se separa em blocos 58A e 58B que exibem um padrão de fingerprint. A Fig. 23B é uma vista superior de uma depressão 28 e algumas da região intersticial circundante 30, onde o copolímero em bloco 58 na fase da depressão 28 se separa em blocos 58A e 58B que exibem um padrão de linha. Os blocos 58A, 58B têm domínios de tamanho sub-litográfico.
[0566] Durante o anelamento do solvente, o bloco 58A ou 58B incluindo o grupo funcional de fixação de resina pode reagir com a resina padronizada 54' e, portanto, pode se anexar à resina padronizada 54'.
[0567] Embora não mostrada, em alguns exemplos do método 200, a resina padronizada 54', incluindo o copolímero de bloco separado por fase e auto-montado 58A, 58B nas depressões 28 é exposta a um processo de cura adicional. A cura pode ser realizada conforme descrito anteriormente.
[0568] Como mostrado entre as Figs. 22D e 22E, um processo de enxerto é realizado para enxertar os iniciadores (18, 21 ou 18', 21º para sequenciamento paired-end sequencial) ou (18, 20 ou 18', 20' e 19, 21 ou 19', 21' para sequenciamento paired-end simultâneo) em qualquer grupo funcional de enxerto primário do(s) bloco(s) 58A e/ou 58(B) na(s) depressão(ões) 28.
[0569] Em um exemplo, o enxerto pode ser realizado por deposição flow through (por exemplo, usando uma tampa temporariamente ligada), dunk coating, revestimento por spray, puddle dispensing ou por outro método adequado que anexará o(s) iniciador (es) (18, 21 ou 18', 21' para sequenciamento paired-end sequencial) ou (18, 20 ou 18', 20' e 19, 21 ou 19', 21' para sequenciamento paired-end simultâneo) para os grupos funcionais de enxerto primário do(s) bloco(s) 58A e/ou 58B. Em um exemplo de sequenciamento paired-end simultâneo, os iniciadores 18, 20 ou 18', 20'
podem ser enxertados em um bloco 58A e os iniciadores 19, 21 ou 19', 21' podem ser enxertados no outro bloco 58B. Cada um desses exemplos de técnicas pode ser realizado conforme descrito aqui e pode utilizar uma solução ou mistura de iniciadores, que podem incluir o(s) iniciador(es), água, um tampão e um catalisador.
[0570] Deve ser entendido que o(s) iniciador(es (iniciadores não cliváveis 18, 21 ou 18', 21º para sequenciamento paired-end sequencial) ou (pares de iniciadores não cliváveis/cliváveis 18, 20 ou 18', 20' e 19 21 ou 19', 21' para sequenciamento paired-end simultâneo) serão anexados ao(s) bloco(s) 58A e/ou 58(B) que incluem os grupos funcionais de enxerto primário. No exemplo mostrado nas Fig. 22E e 22F, o(s) iniciador(es) 18, 21 são anexados no bloco 58B e não no bloco 58A. Neste exemplo, o bloco 58A pode ter contribuído com o parâmetro de interação para conduzir a separação de fases do primeiro e segundo blocos 58A, 58B e também pode ser anexado à resina padronizada 54' através de um grupo funcional de fixação de resina.
[0571] Com referência agora à Fig. 24, outro exemplo é representado com a fase do copolímero de bloco 58 separado em dois blocos 58A e 58B. Neste exemplo, dois conjuntos de iniciadores diferentes, um incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20' e o outro incluindo os iniciadores 19, 19' e 21, 21' são anexados aos respectivos blocos 58A, 58B. Este exemplo permite leituras paired-end simultâneas durante o sequenciamento, conforme descrito aqui. Neste exemplo, cada um dos respectivos blocos 58A, 58B inclui grupos funcionais de enxerto primário que podem anexar os respectivos conjuntos de iniciadores.
[0572] Como mencionado acima, alguns dos copolímeros em bloco 58 são terpolímeros, onde cada bloco inclui um grupo funcional específico de bloco diferente. Em um exemplo, o copolímero em bloco 58 é um terpolímero incluindo um primeiro bloco, um segundo bloco e um terceiro bloco; onde o grupo funcional específico do bloco do primeiro bloco está anexado à resina padronizada (isto é, é o grupo funcional de fixação da resina); o grupo funcional específico do bloco do segundo bloco está anexado ao(s) iniciador(es) (isto é, é o grupo funcional de enxerto primário); e o grupo funcional específico do bloco do terceiro bloco está anexado a i) outro iniciador (es) que seja diferente do(s) iniciador (es) anexado(s) ao grupo funcional específico do bloco do segundo bloco ou ii) a uma enzima (por exemplo, Transposomas NEXTERA”"). Um exemplo do terpolímero separado por fase é mostrado na Fig. 25A. Neste exemplo, o terpolímero segregado inclui os blocos 58A, 58B, 58C, onde 58A inclui o grupo funcional de enxerto primário, 58B inclui o grupo funcional de fixação de resina e/ou afeta uma energia livre de superfície do copolímero em bloco e/ou afeta a estabilidade do copolímero em bloco, e 58C inclui um grupo funcional de enxerto primário diferente ou um grupo funcional de ligação de enzima. Como representado, o bloco 58A anexa o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D, incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20', e o bloco 58C anexa o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D', incluindo os iniciadores 19, 19' e 21, 21'. Neste exemplo, o bloco 58A serve como região 14 e o bloco 58C serve como região 16. Em outro exemplo, as regiões 14, 16 podem ser blocos (por exemplo, 58A e 58B ou 58B e 58C) que são diretamente adjacentes um ao outro.
[0573] Em outro exemplo, o copolímero em bloco 58 é um terpolímero incluindo um primeiro bloco, um segundo bloco e um terceiro bloco; onde o grupo funcional específico do bloco do primeiro bloco está anexado à resina padronizada 54' (isto é, é o grupo funcional de fixação da resina); o grupo funcional específico do bloco do segundo bloco está anexado ao(s) iniciador(es) (isto é, é o grupo funcional de enxerto primário); e o grupo funcional específico do bloco do terceiro bloco afeta uma energia livre de superfície do copolímero em bloco ou afeta a estabilidade do copolímero em bloco. Um exemplo do terpolímero separado por fase é mostrado na Fig. 25B. Neste exemplo, o terpolímero segregado inclui os blocos 58A, 58B, 58C, onde 58A inclui o grupo funcional de fixação de resina, 58B afeta a energia livre de superfície do copolímero em bloco ou afeta a estabilidade do copolímero em bloco e 58C inclui um grupo funcional de enxerto primário. Neste exemplo, os iniciadores não cliváveis 18, 21 são anexados e, portanto, este exemplo pode ser particularmente adequado para o sequenciamento paired-end sequencial.
[0574] A Fig. 38A e a Fig. 38B juntas representam outro exemplo de método envolvendo um copolímero em bloco 58'. Neste exemplo, o copolímero em bloco 58' é um copolímero em bloco lamelar. Um copolímero em bloco lamelar se auto- montará de modo que os diferentes blocos 58A' e 58B' sejam colocados em camadas uns sobre os outros, de modo que fiquem paralelos aos materiais subjacentes 54B, 54C e suporte 52.
Exemplos de copolímeros de blocos lamelares incluem copolímeros incluindo unidades azida heterocíclicas. Os materiais 54B, 54C podem ser exemplos diferentes da resina 54A aqui descrita, silanos ou resinas silanizadas, e podem ser selecionados para orientar a auto-montagem do copolímero em bloco 58'. Sob condições controladas, o copolímero em bloco 58' se monta em domínios/blocos específicos 58A' e 58B' que são colocados em camadas nos materiais subjacentes 54B, 54C. No exemplo mostrado nas Fig. 38A e 38B, como um resultado do anelamento, os domínios/blocos 58A' e 58B' se auto-montam, de modo que o bloco 58'B é exposto na superfície em uma área (material sobrejacente 54B) e assim que o outro bloco 58A' é exposto na superfície em outra área (material sobrejacente 54C). O bloco 58B' pode incluir grupos funcionais de fixação de iniciadores que podem anexar o primeiro conjunto de iniciadores 12A, 12B, 12C, 12D, incluindo os iniciadores 18, 18' e 20, 20'; e o bloco 58A' pode incluir diferentes grupos funcionais de fixação de iniciadores que podem anexar o segundo conjunto de iniciadores 12A', 12B', 12C', 12D ', incluindo os iniciadores 19, 19' e 21, 21'. Neste exemplo, o bloco 58B' serve como região 14 e o bloco 58A' serve como região 16.
[0575] As células de fluxo incluindo o copolímero em bloco 58, 58', podem ser usadas em uma variedade de abordagens ou tecnologias de sequenciamento, incluindo técnicas frequentemente referidas como sequenciamento por síntese (SBS), sequenciamento cíclico em matriz, sequenciamento por ligação, pirosequenciamento e assim por diante. Em alguns desses exemplos, uma vez que os blocos separados por fase 58A, 58B, 58C e o(s) iniciador(es) anexado(s) (iniciadores não cliváveis 18, 21 ou 18 ', 21º para sequenciamento paired-end sequencial) ou (pares de iniciadores não cliváveis/ cliváveis 18, 20 ou 18', 20' e 19, 21 ou 19', 21' para sequenciamento paired-end simultâneo) estão presentes nas depressões 28 e não nas regiões intersticiais 30, a amplificação será confinada às depressões 28 .
[0576] Como exemplo, uma reação de sequenciamento por síntese (SBS) pode ser executada em um sistema como o HISEQ'"", HISEQX"", MISEQ'”, MISEQDX"", MINISEQ"", NOVASEQ"", NEXTSEQDX'"", NEXTSEQ”" ou qualquer outro outros sistemas de sequenciadores da Illumina (San Diego, CA). No SBS, a extensão de um iniciador de sequenciamento ao longo de um modelo de ácido nucleico (por exemplo, o modelo de sequenciamento) é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no modelo. O processo químico subjacente pode ser polimerização (por exemplo, catalisada por uma enzima polimerase) ou ligação (por exemplo, catalisada por uma enzima ligase). Em um processo SBS específico à base de polimerase, os nucleotídeos marcados fluorescentemente são adicionados ao iniciador de sequenciamento (estendendo assim o iniciador) de uma maneira dependente do modelo de modo que a detecção da ordem e do tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador de sequenciamento possa ser usada para determinar a sequência do modelo.
[0577] Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos marcados, DNA polimerase, etc., podem ser entregues no/através do canal de fluxo, etc.,
que abriga uma matriz de fitas senso ou antisenso anexadas a iniciadores não cliváveis 18, 21 ou 18', 21º (para sequenciamento paired-end sequencial), ou ambas as fitas senso e antisenso anexadas aos pares de iniciadores não cliváveis/cliváveis 18, 20 ou 18', 20' (para sequenciamento paired-end simultâneo), onde a extensão do iniciador de sequenciamento faz com que um nucleotídeo marcado seja incorporado, pode ser detectada através de um evento de geração de imagens. Durante um evento de geração de imagens, um sistema de iluminação (não mostrado) pode fornecer uma luz de excitação para as depressões funcionalizadas.
[0578] Neste exemplo, os nucleotídeos podem incluir ainda uma propriedade de terminação reversível que termina outra extensão do iniciador uma vez que um nucleotídeo foi adicionado, e um agente de desbloqueio pode ser usado para continuar sequenciando. Lavagem(ns) podem ocorrer entre as várias etapas de entrega do fluido. O ciclo SBS pode então ser repetido n vezes para estender o iniciador de sequenciamento por n nucleotídeos, detectando assim uma sequência de comprimento n.
[0579] Embora o SBS tenha sido descrito em detalhes, deve ser entendido que as células de fluxo aqui descritas podem ser utilizadas com outro protocolo de sequenciamento, para genotipagem ou em outras aplicações químicas e/ou biológicas.
[0580] Para ilustrar ainda mais a presente divulgação, exemplos são dados neste documento. Deve ser entendido que esses exemplos são fornecidos para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitativos do escopo da presente divulgação.
EXEMPLOS Exemplo 1
[0581] PAZAM com os iniciadores P7 e P5U pré- enxertados foi depositado em um substrato de célula de fluxo tendo elementos semelhantes a pilares que tinham cerca de 400 nm de altura e cerca de 350 nm de diâmetro. Uma imagem de micrografia eletrônica de varredura (SEM) de uma porção da camada de PAZAM pré-enxertada depositada é mostrada na Fig. 39A. Uma resistência de remoção foi depositada nesta primeira camada de PAZAM enxertada para formar um exemplo da camada de proteção aqui descrita. Uma imagem SEM de uma porção da camada de proteção depositada é mostrada na Fig. 39B. A gravação foi então realizada para remover a camada de proteção e a primeira camada de PAZAM enxertada das partes superiores dos elementos do pilar. Uma imagem SEM de uma porção do substrato após a gravação é mostrada na Fig. 39C. PAZAM foi depositado na parte superior dos elementos semelhantes a pilar e na camada de proteção restante para formar uma segunda camada de PAZAM. A segunda camada de PAZAM foi enxertada com os iniciadores P5 e PT7U.
[0582] Um processo de remoção foi utilizado para remover a camada de proteção e qualquer uma da segunda camada de PAZAM enxertada da primeira camada de PAZAM enxertada.
[0583] Os fragmentos da biblioteca do mesmo genoma (do genoma humano) foram introduzidos na célula de fluxo. Os fragmentos da biblioteca incluiram uma porção que era complementar às sequências iniciadoras P5 de P7, juntamente com as sequências de índice, e sequências de leitura (read)l e leitura (read) 2. Os fragmentos da biblioteca foram semeados e o agrupamento foi realizado usando amplificação em ponte. Sequenciamento paired-end simultâneo foi então realizado.
[0584] Na área da borda entre os elementos similares ao pilar e as regiões vizinhas, verificou-se que cerca de 34% de todas as leituras estavam emparelhadas.
[0585] As leituras foram extraídas de um único local e foram alinhadas ao genoma. A Fig. 40A ilustra duas leituras Rl (R1 e R1') que são imputadas para serem leituras paired- end simultâneas.
[0586] A célula de fluxo também foi processada através de uma síntese paired-end sequencial (fitas senso sequenciadas e removidas seguidas por sequenciamento da fita antisenso). A Fig. 40B ilustra os resultados da Fig. 40A com a segunda leitura (R2) da síntese paired-end sequencial invertida para mostrar que ela realmente corresponde ao par de leitura paired-end simultânea. A parte cortada no R2 pode ser devido à queda na qualidade, enquanto a leitura R1 é uma leitura não cortada de qualidade superior. Estes resultados demonstram que os métodos aqui divulgados podem produzir informações equivalentes ao sequenciamento paired-end padrão (Fig. 40B) usando pares gerados simultaneamente (Fig. 40A).
[0587] Ainda mais, as distribuições de tamanho de inserto dos fragmentos da biblioteca foram aproximadamente equivalentes para dados com base no sequenciamento paired- end simultâneo e no sequenciamento paired-end padrão (sequencial). Estes resultados demonstram ainda que os métodos divulgados neste documento, usando pares gerados simultaneamente, podem produzir informações equivalentes ao sequenciamento paired-end padrão. Exemplo 2
[0588] O PAZAM foi depositado em um substrato de célula de fluxo plano e enxertado com os iniciadores P7 e PSU. Uma camada de proteção (fotoresistente Shipley 1813) foi depositada no topo desta primeira camada de PAZAM enxertada. A luz UV foi usada através de uma fotomáscara para expor porções definidas da camada de proteção, que foram então desenvolvidas em solvente, deixando atrás almofadas circulares de 50 um da camada de proteção. O plasma de ar foi usado para gravar as porções expostas da primeira camada de PAZAM enxertada nas regiões intersticiais, enquanto as porções sob as almofadas protetoras permaneceram intactas. Uma segunda camada de PAZAM foi então depositada nas regiões intersticiais e na camada de proteção restante. Este segundo PAZAM depositado foi então enxertado com iniciadores P5 e PTU.
[0589] Um processo de remoção foi utilizado para remover a camada de proteção e qualquer uma da segunda camada de PAZAM enxertada da primeira camada de PAZAM enxertada.
[0590] Fragmentos da biblioteca do mesmo genoma (do genoma humano) foram introduzidos na célula de fluxo. Os fragmentos da biblioteca incluíram uma porção que era complementar às sequências de iniciadores P5 de P7, juntamente com as sequências de índice, e as sequências leitura 1 e leitura 2. Os fragmentos da biblioteca foram semeados e o agrupamento foi realizado usando amplificação em ponte. Sequenciamento paired-end simultâneo foi então realizado.
[0591] Na área da borda entre o primeiro enxertado e o segundo PAZAMs enxertados, verificou-se que cerca de 2,2% de todas as leituras foram emparelhadas. Isso significava que duas leituras estavam dentro de 2 um uma da outra e estavam dentro de 2 kb uma da outra no genoma. Notas adicionais
[0592] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos anteriores e conceitos adicionais discutidos em mais detalhes abaixo (desde que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) sejam contempladas como parte da matéria inventiva divulgada neste documento. Em particular, todas as combinações da matéria reivindicada que aparecem no final desta divulgação são contempladas como parte da matéria inventiva divulgada neste documento. Também deve ser apreciado que a terminologia explicitamente empregada aqui que também pode aparecer em qualquer divulgação incorporada por referência deve ser concedido um significado mais consistente com os conceitos particulares aqui divulgados.
[0593] A referência em todo o relatório descritivo a "um (1) exemplo", "outro exemplo", "um exemplo" e assim por diante significa que um elemento específico (por exemplo recurso, estrutura e/ou característica) descrito em conexão com o exemplo está incluído em pelo menos um exemplo aqui descrito, e pode ou não estar presente em outros exemplos. Além disso, deve ser entendido que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados de qualquer maneira adequada nos vários exemplos, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0594] Deve ser entendido que os intervalos aqui fornecidos incluem o intervalo referido e qualquer valor ou subintervalo dentro do intervalo referido, como se tais valores ou subintervalos fossem explicitamente recitados. Por exemplo, um intervalo de cerca de 400 nm a cerca de 1 um (1000 nm) deve ser interpretado para incluir não apenas os limites explicitamente recitados de cerca de 400 nm a cerca de 1 um, mas também para incluir valores individuais, tal como cerca de 708 nm , cerca de 95,5 nm, etc., e subintervalos, tal como de cerca de 425 nm a cerca de 825 nm, de cerca de 550 nm a cerca de 940 nm, etc. Além disso, quando "cerca de" e/ou "substancialmente" é/são utilizado(s) para descrever um valor, devem abranger pequenas variações (até +/- 10%) do valor referido.
[0595] Embora vários exemplos tenham sido descritos em detalhes, deve ser entendido que os exemplos divulgados podem ser modificados. Portanto, a descrição anterior deve ser considerada não limitativa.

Claims (40)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula de fluxo caracterizada pelo fato de que compreende: um substrato; um primeiro conjunto de iniciadores anexado a uma primeira região no substrato, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; e um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma segunda região no substrato, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
2. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a primeira região inclui um material tendo um primeiro grupo funcional; e a segunda região inclui um material tendo um segundo grupo funcional que é diferente do primeiro grupo funcional.
3. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma lacuna que separa o primeiro conjunto de iniciadores do segundo conjunto de iniciadores.
4, Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: A) o substrato inclui depressões separadas por regiões intersticiais; e cada uma das depressões inclui: a primeira região localizada em uma primeira porção; e a segunda região localizada em uma segunda porção; opcionalmente: i) compreende ainda uma lacuna que separa a primeira região da segunda região; e/ou ii) em que a primeira região e a segunda região se sobrepõem parcialmente; e/ou iii) em que a primeira e a segunda porções possuem profundidades diferentes; e/ou iv) em que a primeira e a segunda regiões são blocos diferentes de um copolímero de bloco; ou B) o substrato inclui depressões separadas por regiões intersticiais; cada uma das depressões inclui a primeira região; e a segunda região está localizada em pelo menos algumas das regiões intersticiais.
5. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a primeira região inclui um primeiro polímero e o primeiro conjunto de iniciadores é enxertado no primeiro polímero; e a segunda região inclui um segundo polímero e o segundo conjunto de iniciadores é enxertado no segundo polímero; Opcionamente, em que: i) a célula de fluxo compreende ainda um revestimento protetor no primeiro conjunto de iniciadores e no primeiro polímero; e/ou ii) o primeiro polímero é uma primeira camada no substrato;
o segundo polímero é uma segunda camada na primeira camada; a célula de fluxo compreende ainda: uma resina de passivação na segunda camada; e características definidas na resina de passivação, no segundo polímero e no primeiro polímero; e cada um dos primeiro e segundo conjuntos de iniciadores é exposto em cada um dos recursos.
6. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: o substrato inclui depressões separadas por regiões intersticiais; cada uma das depressões inclui: uma primeira porção, em que a primeira região está localizada; e uma segunda porção; e a célula de fluxo compreende ainda um esfera localizado na segunda porção, em que a segunda região está em uma superfície do esfera.
7. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: 1) o primeiro iniciador clivável inclui um primeiro local de clivagem, o segundo iniciador clivável inclui um segundo local de clivagem e o primeiro e o segundo locais de clivagem são de um tipo idêntico; opcionalmente,em que: cada um do primeiro iniciador não clivável, o segundo iniciador clivável, o primeiro iniciador clivável e o segundo iniciador clivável incluem um respectivo ligante;
o primeiro local de clivagem do primeiro iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante; e o segundo local de clivagem do segundo iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante; ou ii) o primeiro iniciador clivável inclui um primeiro local de clivagem, o segundo iniciador clivável inclui um segundo local de clivagem e o primeiro e o segundo locais de clivagem são de um tipo diferente; opcionalmente, em que: cada um do primeiro iniciador não clivável, o segundo iniciador clivável, o primeiro iniciador clivável e o segundo iniciador clivável incluem um respectivo ligante; o primeiro local de clivagem do primeiro iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante; e o segundo local de clivagem do segundo iniciador clivável está localizado ao longo de seu ligante.
8. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: o primeiro conjunto de iniciadores é anexado a uma primeira estrutura de suporte; a primeira região é um primeiro site de captura anexado à primeira estrutura de suporte; o segundo conjunto de iniciadores é anexado a uma segunda estrutura de suporte que é diferente da primeira estrutura de suporte; e a segunda região é um segundo site de captura anexado à segunda estrutura de suporte.
9. Célula de fluxo caracterizada pelo fato de que compreende: um primeiro substrato;
um primeiro conjunto de iniciadores anexado ao primeiro substrato, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; um segundo substrato oposto ao primeiro substrato; e um segundo conjunto de iniciadores anexado ao segundo substrato, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
10. Kit caracterizado pelo fato de que compreende: uma célula de fluxo incluindo: um substrato incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma primeira camada de polímero, em cada uma das depressões, em que alguns grupos funcionais da primeira camada de polímero são tapados; um primeiro conjunto de iniciadores ligado a outros grupos funcionais da primeira camada de polímero em cada uma das depressões; e uma segunda camada de polímero nas regiões intersticiais; e um fluido de preparação incluindo: um transportador de fluido; e um segundo conjunto de iniciadores diferente do primeiro conjunto de iniciadores.
11. Kit, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: o primeiro conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; e o segundo conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável.
12. Método caracterizado pelo fato de que compreende: introdução de um fluido modelo a uma célula de fluxo, incluindo: um substrato incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma primeira camada de polímero, em cada uma das depressões, em que os grupos funcionais expostos da primeira camada de polímero são tapados; um primeiro conjunto de iniciadores ligado à primeira camada de polímero em cada uma das depressões, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável; e uma segunda camada de polímero nas regiões intersticiais; em que um molde do fluido modelo é amplificado para formar um agrupamento em pelo menos algumas das depressões; introduzir um fluido de iniciação, incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável, na célula de fluxo, em que o primeiro iniciador não clivável e o segundo iniciador clivável são enxertados na segunda camada de polímero; e iniciar a amplificação de ponte do cluster para o primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável, formando assim um segundo cluster em pelo menos algumas das regiões intersticiais.
13. Método caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um fluido modelo a uma célula de fluxo, incluindo: um substrato incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; uma primeira camada de polímero em cada uma das depressões; um primeiro conjunto de iniciadores ligado à primeira camada de polímero, o primeiro conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável; uma camada de revestimento protetora opcional na primeira camada de polímero e no primeiro conjunto de iniciadores; uma segunda camada de polímero nas regiões intersticiais; e um segundo conjunto de iniciadores ligado à segunda camada de polímero, o segundo conjunto de iniciadores incluindo um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável; em que um modelo do fluido modelo é amplificado para formar um aglomerado em pelo menos algumas das depressões e em pelo menos algumas das regiões intersticiais; e clivar o primeiro iniciador clivável e do segundo iniciador clivável.
14. Célula de fluxo caracterizada pelo fato de que compreende: um suporte;
uma resina padronizada no suporte, a resina padronizada incluindo primeiras depressões e segundas depressões separadas por regiões intersticiais, as primeiras depressões tendo dimensões de abertura menores que as segundas depressões; um primeiro conjunto de iniciadores ligado em pelo menos algumas das primeiras depressões; e uma efera funcionalizada posicionada respectivamente em pelo menos algumas das segundas depressões, a esfera funcionalizada incluindo um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma superfície de uma estrutura de núcleo, em que o segundo conjunto de iniciadores é diferente do primeiro conjunto de iniciadores.
15. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que: a) a estrutura do núcleo da esfera funcionalizada é selecionada do grupo que consiste em dióxido de silício, um material superparamagnético, poliestireno e um acrilato; e/ou b) a resina padronizada é selecionada do grupo que consiste em uma resina à base de resina oligomérica de silsesquioxano poliédrica (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli (etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato e suas combinações; e/ou c) a célula de fluxo compreende ainda um polímero nas primeiras depressões e nas segundas depressões, e em que o primeiro conjunto de iniciadores está ligado ao polímero nas pelo menos algumas das primeiras depressões; opcionalmente, em que: i) a esfera funcionalizada está posicionada no polímero nas pelo menos algumas das segundas depressões; ou ii) o primeiro conjunto de iniciadores também está ligado ao polímero nas pelo menos algumas das segundas depressões; e a esfera funcionalizada é posicionada no primeiro conjunto de iniciadores nas pelo menos algumas das segundas depressões; e/ou d) o primeiro conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador e um segundo iniciador modificado por uracila; e o segundo conjunto de iniciadores inclui um primeiro iniciador modificado por uracila e um segundo iniciador.
16. Célula de fluxo caracterizada pelo fato de que compreende: um suporte; uma resina padronizada no suporte, a resina padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; um primeiro conjunto de iniciadores ligado a pelo menos algumas das depressões; e uma esfera funcionalizada posicionada em pelo menos algumas das depressões, de modo que pelo menos alguns iniciadores do primeiro conjunto de iniciadores sejam expostos, a esfera funcionalizada incluindo um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma superfície de uma estrutura de núcleo, em que o segundo conjunto de iniciadores é diferente do que o primeiro conjunto de iniciadores.
17. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que:
a) cada uma das depressões inclui uma primeira porção com uma primeira dimensão de abertura que é maior que ou igual a um diâmetro do esfera funcionalizado e uma segunda porção com uma segunda dimensão de abertura que é menor que o diâmetro do esfera funcionalizado; e a esfera funcionalizada é posicionada na primeira porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões; e/ou b) a estrutura central da esfera funcionalizada é selecionada do grupo que consiste em dióxido de silício, um material superparamagnético, poliestireno e um acrilato; e/ou
Cc) a resina padronizada é selecionada do grupo que consiste em uma resina à base de resina de silsesquioxano poliédrica oligomérica (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli (etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato e suas combinações; e/ou d) a célula de fluxo compreende ainda um polímero nas depressões; opcionalmente,
em que o primeiro conjunto de iniciadores é fixado a uma porção do polímero desocupada pelo esfera funcionalizado; ainda, opcionalmente, em que:
o primeiro conjunto de iniciadores é anexado ao polímero nas depressões; e a esfera funcionalizada é posicionada em alguns outros iniciadores do primeiro conjunto de iniciadores.
18. Método caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar seletivamente um polímero nas depressões de uma resina padronizada em um suporte; enxertar um primeiro conjunto de iniciadores no polímero em pelo menos algumas das depressões; e antes ou depois do enxerto do primeiro conjunto de iniciadores, depositar esferas funcionalizadas i) em uma porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões, ou ii) nas segundas depressões com dimensões de abertura maiores que as pelo menos algumas das depressões, as esferas funcionalizadas incluindo um segundo conjunto de iniciadores anexado a uma superfície de uma estrutura de núcleo, em que o primeiro e o segundo conjuntos de iniciadores são diferentes.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: i) antes de depositar as esferas funcionalizadas, o método compreende ainda formar as esferas funcionalizadas anexando o segundo conjunto de iniciadores à estrutura do núcleo; e/ou ii) a porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões tem uma dimensão de abertura que é maior que ou igual a um diâmetro de cada uma das esferas funcionalizadas; as pelo menos algumas das depressões incluem uma segunda porção interconectada com a porção, onde a segunda porção tem uma segunda dimensão de abertura que é menor que o diâmetro de cada uma das contas funcionalizadas; e as contas funcionalizadas se auto-montam na porção de cada uma das pelo menos algumas das depressões por exclusão de tamanho; e/ou iii) antes de aplicar seletivamente o polímero, o método compreende ainda formar a resina padronizada no suporte por: depositar uma resina no suporte; e padronizar a resina usando litografia nanoimprint.
20. Célula de fluxo caracterizada pelo fato de que compreende: um suporte; uma resina padronizada no suporte, a resina padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; um copolímero em bloco na resina padronizada nas depressões, cada bloco do copolímero em bloco tendo um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco do copolímero em bloco; e um iniciador ligado ao grupo funcional específico do bloco de pelo menos um dos blocos.
21. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a resina padronizada é selecionada do grupo que consiste em uma resina à base de resina de silsesquioxano poliédrica oligomérica (POSS), uma resina epóxi, uma resina de poli (etileno glicol), uma resina de poliéter, uma resina acrílica, uma resina de acrilato uma resina de metacrilato e suas combinações; opcionalmente, em que a resina padronizada é a resina baseada em POSS e em que a resina baseada em POSS é uma resina POSS de epóxi reticulada; ainda, opcionalmente, em que: i) o copolímero em bloco inclui:
um primeiro bloco incluindo um monômero de acrilamida tendo um grupo amino como seu grupo funcional específico do bloco; e um segundo bloco incluindo um monômero de azido acetamido pentil acrilamida tendo um grupo azido como seu grupo funcional específico do bloco; opcionalmente, em que o copolímero de bloco é: Oo ã. N;
NH NH, O NH O. NH
RA AIR n m em que R é hidrogênio ou um grupo final de espécies iniciadoras de polímero, n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000; ou ii) em que o copolímero de bloco é: n m N3 em que n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000.
22. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que:
A) a resina padronizada é um fluoropolímero amorfo; opcionalmente, em que o copolímero em bloco inclui:
um primeiro bloco incluindo um monômero com um grupo trifluorometil como seu grupo funcional específico do bloco; e um segundo bloco incluindo um monômero que tem um grupo funcional de enxerto primário como seu grupo funcional específico do bloco; ou
B) o copolímero em bloco inclui:
um primeiro bloco incluindo um monômero que tem um grupo funcional de enxerto primário como seu grupo funcional específico do bloco; e um segundo bloco incluindo um monômero para ajustar um parâmetro de interação para conduzir a separação de fases do primeiro e do segundo blocos; opcionalmente, em que:
o grupo funcional de enxerto primário é um grupo azido; e o grupo funcional específico do bloco do monômero do segundo bloco é selecionado do grupo que consiste em um grupo amino, um grupo álcool, um grupo aril e um grupo carregado; ou
C) o copolímero em bloco é um terpolímero incluindo um primeiro bloco, um segundo bloco e um terceiro bloco;
o grupo funcional específico do bloco do primeiro bloco é anexado à resina padronizada;
o grupo funcional específico do bloco do segundo bloco está ligado ao iniciador; e o grupo funcional específico do bloco do terceiro bloco é anexado a um outro iniciador diferente do iniciador ou a uma enzima; ou D) o copolímero em bloco é um terpolímero incluindo um primeiro bloco, um segundo bloco e um terceiro bloco; o grupo funcional específico do bloco do primeiro bloco é anexado à resina padronizada; o grupo funcional específico do bloco do segundo bloco está ligado ao iniciador; e o grupo funcional específico do bloco do terceiro bloco afeta uma energia livre de superfície do copolímero de bloco ou afeta a estabilidade do copolímero de bloco.
23. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que: i) as depressões são selecionadas do grupo que consiste em poços e trincheiras; ou ii) a resina padronizada e o copolímero em bloco têm uma energia livre de superfície dentro de um intervalo de cerca de 25 mN/ma cerca de 50 mN/m.
24, Célula de fluxo caracterizada pelo fato de que compreende: um suporte; uma resina baseada em silsesquioxano poliédrico padronizado (POSS) no suporte, a resina baseada em POSS padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; um copolímero de bloco segregado na resina à base de POSS padronizada nas depressões, em que um bloco do copolímero de bloco segregado tem um grupo funcional anexado à resina à base de POSS padronizada e um outro bloco do copolímero de bloco segregado tem um outro grupo funcional; e um iniciador ligado ao outro grupo funcional.
25. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 24 caracterizada pelo fato de que o copolímero de bloco segregado é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) n m N3 em que n varia de 1 a 10.000, em varia de 1 a 10.000; e ii) O. 1 Ns
NH NH> rr J ) O NH O. NH RA) AMAIR no m em que R é hidrogênio ou um grupo final de espécies iniciadoras de polímero, n varia de 1 a 10.000 e m varia de 1 a 10.000.
26. Método caracterizado pelo fato de que compreende: padronizar uma resina para formar uma resina padronizada incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; introduzir uma solução incluindo um copolímero em bloco na resina padronizada, cada bloco do copolímero em bloco tendo um grupo funcional específico do bloco que é diferente do grupo funcional específico do bloco um do outro bloco do copolímero em bloco; expor a solução ao anelamento de vapor de solvente, pelo qual a fase de copolímero em bloco se separa e se autor monta nas depressões; e enxertar um iniciador no grupo funcional específico do bloco de pelo menos um dos blocos.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que: i) o padrão da resina envolve litografia com nano impressão; e/ou ii) a solução incluindo o copolímero em bloco tem um parâmetro de interação Flory-Huggins variando de cerca de 0,04 a cerca de 0,30; e/ou iii) antes do enxerto, o método compreende ainda expor a resina padronizada, incluindo o copolímero em bloco separado por fase e auto-montado nas depressões, a um processo de cura.
28. Método caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar uma primeira camada funcionalizada em um substrato;
padronizar a primeira camada funcionalizada, formando, assim, uma primeira região funcionalizada coberta por um fotorresistente; aplicar uma segunda camada funcionalizada no fotorresistente e nas porções do substrato; levantar o fotorresiste e qualquer uma da segunda camada funcionalizada sobre o mesmo; remover uma porção da segunda camada funcionalizada, formando, assim, uma segunda região funcionalizada adjacente à primeira região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que: i) a remoção envolve: aplicar um segundo fotorresistente na primeira região funcionalizada e uma segunda porção da segunda camada funcionalizada que se tornará a segunda região funcionalizada; e gravando a porção da segunda camada funcionalizada; e/ou ii) em que: a) o substrato inclui uma resina em um suporte; a resina inclui depressões separadas por regiões intersticiais;
a primeira região funcionalizada está em uma primeira porção de cada depressão; a segunda camada funcionalizada está em uma segunda porção de cada depressão e nas regiões intersticiais; e a remoção envolve o polimento da segunda camada funcionalizada das regiões intersticiais; ou b) o substrato inclui uma resina em um suporte; a resina inclui depressões de vários níveis separadas por regiões intersticiais; a primeira região funcionalizada está no primeiro nível de cada depressão multinível; e antes de aplicar a segunda camada funcionalizada, o método compreende ainda: aplicar uma camada de sacrifício no fotorresistente e nas porções da resina; remover a camada de sacrifício das porções da resina; e remover uma região da resina da depressão multicamada para criar uma área adjacente à primeira região funcionalizada; e a segunda camada funcionalizada é aplicada na camada sacrificial no fotorresistente, na área e nas regiões intersticiais.
30. Método caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar um primeiro fotorresistente em um substrato, de modo que uma primeira porção de substrato seja exposta; aplicar uma primeira camada funcionalizada no fotorresistente e na primeira porção de substrato;
levantar o fotorresistente e qualquer uma da primeira camada funcionalizada sobre o mesmo, formando, assim, uma primeira região funcionalizada na primeira porção de substrato; aplicar um segundo fotorresistente na primeira região funcionalizada e no substrato, de modo que uma segunda porção de substrato adjacente à primeira região funcionalizada seja exposta; aplicar uma segunda camada funcionalizada no segundo fotorresistente e na segunda porção de substrato; levantar o segundo fotorresistente e qualquer uma da segunda camada funcionalizada sobre o mesmo, formando, assim, uma segunda região funcionalizada adjacente à primeira região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 e 30, caracterizado pelo fato de que: o método compreende ainda: depositar, respectivamente, uma primeira monocamada auto-montada na primeira região funcionalizada e uma segunda monocamada auto-montada na segunda região funcionalizada; em que a ligação do primeiro conjunto de iniciadores inclui enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira monocamada auto- montada; e em que a fixação do segundo conjunto de iniciadores inclui enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda monocamada auto-montada.
32. Método caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar uma primeira camada funcionalizada em um substrato incluindo valas separadas por regiões intersticiais e uma região de material de sacrifício em uma primeira porção de cada uma das trincheiras; padronizar a primeira camada funcionalizada, formando, assim, uma primeira região funcionalizada coberta por um fotorresistente em uma segunda porção de cada uma das trincheiras; remover a região do material de sacrifício para expor a primeira porção de cada uma das trincheiras; aplicar uma segunda camada funcionalizada nas regiões intersticiais, na primeira porção e no fotorresistente; levantar o fotorresiste e qualquer uma da segunda camada funcionalizada sobre o mesmo; remover qualquer uma da segunda camada funcionalizada das regiões intersticiais, em que uma segunda região funcionalizada permanece na primeira porção de cada uma das trincheiras; aplicar um segundo fotorresistente em um padrão de faixas espacialmente separadas que são pelo menos substancialmente perpendiculares às trincheiras;
remover porções das primeiras regiões funcionalizadas e das segundas regiões funcionalizadas que são expostas entre as faixas espacialmente separadas; remover o segundo fotorresistente; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou às primeiras regiões funcionalizadas e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou às segundas regiões funcionalizadas, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que: o substrato inclui uma segunda região de material de sacrifício na segunda porção de cada uma das trincheiras; o substrato, a região do material de sacrifício e a segunda região do material de sacrifício têm diferentes taxas de ataque químico; e antes de aplicar a primeira camada funcionalizada, o método compreende ainda remover a segunda região de material de sacrifício da segunda porção de cada uma das trincheiras; opcionalmente, em que antes de remover a segunda região do material de sacrifício, o método compreende ainda formar a região do material de sacrifício e a segunda região do material de sacrifício por: aplicar um material de sacrifício no substrato, incluindo as trincheiras separadas pelas regiões intersticiais;
remover uma porção do material de sacrifício, de modo que uma região do material de sacrifício permaneça diretamente adjacente a cada parede lateral de cada uma das trincheiras; aplicar um segundo material de sacrifício no substrato e nas regiões do material de sacrifício; remover uma porção do segundo material de sacrifício, de modo que uma região do segundo material de sacrifício permaneça diretamente adjacente a cada uma das regiões do material de sacrifício; e aplicar um material para preencher quaisquer espaços entre as segundas regiões do material de sacrifício; ainda, opcionalmente, em que: o substrato é um substrato de várias camadas; as trincheiras são definidas em uma camada mais externa do substrato multicamada; e o material e a camada mais externa são os mesmos.
34. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar um material de sacrifício a um substrato incluindo depressões separadas pelas primeiras regiões intersticiais, em que cada depressão inclui uma porção profunda e uma porção rasa definida por uma porção de etapa, e em que a camada de sacrifício preenche parcialmente a porção profunda; remover "sequencialmente uma porção da camada de sacrifício e uma porção do substrato para formar segundas regiões intersticiais que estão pelo menos substancialmente niveladas com uma porção restante da camada de sacrifício e remover a porção da etapa para formar uma área próxima à porção restante da camada de sacrifício; aplicar uma primeira camada funcionalizada nas segundas regiões intersticiais, a porção restante da camada sacrificial e a área; aplicar um fotorresistente na primeira camada funcionalizada; remover uma porção do fotorresistente e uma porção subjacente da primeira camada funcionalizada para que a porção restante da camada de sacrifício e as segundas regiões intersticiais sejam expostas e uma porção da primeira camada funcionalizada com uma segunda porção do fotorresistente permaneça em a área; remover a porção restante da camada de sacrifício para uma segunda área próxima à porção da primeira região funcionalizada; aplicar uma segunda camada funcionalizada à Área, formando assim uma segunda região funcionalizada; levantar a segunda porção do fotorresiste, formando assim uma primeira região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que:
a segunda camada funcionalizada também é aplicada à segunda porção das regiões fotorresistente e segunda intersticial; uma primeira porção da segunda camada funcionalizada é removida com a segunda porção do fotorresistente; e o método compreende ainda o polimento da segunda camada funcionalizada das segundas regiões intersticiais.
36. Método caracterizado pelo fato de que compreende: imprimir um substrato de várias camadas, incluindo: um suporte; uma primeira camada funcionalizada no suporte; uma segunda camada funcionalizada na primeira camada funcionalizada; e uma camada de passivação na segunda camada funcionalizada; formando, desse modo, recursos separados por regiões intersticiais da camada de passivação, em que uma região de cada uma das primeira e segunda camadas funcionalizadas é exposta em cada recurso; anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 30, 32, 35 e 36, caracterizado pelo fato de que: a fixação do primeiro conjunto de iniciadores envolve:
i) pré-enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira região funcionalizada antes que a primeira camada funcionalizada seja incorporada no substrato de múltiplas camadas; e a fixação do segundo conjunto de iniciadores envolve pré-enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda camada funcionalizada antes que a segunda camada funcionalizada seja incorporada no substrato de múltiplas camadas; ou ii) enxertar um primeiro iniciador não clivável e um segundo iniciador clivável na primeira região funcionalizada em cada depressão; e a ligação do segundo conjunto de iniciadores envolve enxertar um primeiro iniciador clivável e um segundo iniciador não clivável na segunda região funcionalizada em cada depressão.
38. Método caracterizado pelo fato de que compreende: imprimir uma primeira resina para formar uma depressão, incluindo uma porção profunda e uma porção rasa definida por uma porção de etapa, em que a primeira resina é posicionada em uma camada de sacrifício que é posicionada em uma segunda resina; gravar uma primeira porção da primeira resina e uma porção da camada de sacrifício subjacente à porção profunda, expondo, assim, uma porção da segunda resina; gravar a parte da etapa, expondo, assim, uma segunda porção da camada de sacrifício;
aplicar uma primeira camada funcionalizada à porção da segunda resina para formar uma primeira região funcionalizada; remover a segunda porção da camada de sacrifício, expondo assim uma segunda porção da segunda resina; aplicar uma segunda camada funcionalizada à segunda porção da segunda resina para formar uma segunda região funcionalizada; e anexar um primeiro conjunto de iniciadores à primeira camada funcionalizada ou à primeira região funcionalizada e um segundo conjunto de iniciadores à segunda camada funcionalizada ou à segunda região funcionalizada, em que o primeiro conjunto de iniciadores é diferente do segundo conjunto de iniciadores.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que: durante a aplicação da segunda camada funcionalizada, a segunda camada funcionalizada é depositada nas regiões intersticiais ao redor da depressão e não é depositada na primeira região funcionalizada; e o método compreende ainda o polimento da segunda camada funcionalizada das regiões intersticiais.
40. Método caracterizado pelo fato de que compreende: anexar um primeiro conjunto de iniciadores a uma primeira estrutura de suporte; anexar um segundo conjunto de iniciadores a uma segunda estrutura de suporte, em que o segundo conjunto de iniciadores e a segunda estrutura de suporte são diferentes do que o primeiro conjunto de iniciadores e a primeira estrutura de suporte; e carregar a primeira e a segunda estruturas de suporte em uma superfície de substrato tendo uma pluralidade de primeiros locais de captura para fixar seletivamente às primeiras estruturas de suporte e uma pluralidade de segundos locais de captura para fixar seletivamente às segundas estruturas de suporte.
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