CN117858964A - 流通池 - Google Patents
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Abstract
试剂盒的示例包括流通池、引物流体和裂解流体。该流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团或胺官能团的聚合物水凝胶官能化的表面。该引物流体包括多个含炔引物，每个含炔引物具有氨基可裂解基团，该氨基可裂解基团将该含炔引物的引物序列附接至该含炔引物的含炔部分。该裂解流体包括与该氨基可裂解基团具有反应性的物质。
Description
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背景技术
流通池用于多种方法和应用(诸如基因测序、基因分型等)中。对于核酸分析，流通池的表面可以用特定的表面化学物质(诸如引物、聚合酶等)来官能化，具体取决于将要发生的反应。在许多情况下，表面化学物质与流通池表面共价结合。在多种用途期间，在流通池的整个使用寿命内，可能需要共价连接来维持流通池活性区域中的表面化学物质。
发明内容
本文所公开的流通池可以使用多次。在其表面，流通池包括聚合物水凝胶，该聚合物水凝胶包括能够附接待用于核酸测序的引物的官能团。测序后，移除引物。在一些情况下，移除引物留下测序后的官能团，测序后的官能团不同于能够附接引物的官能团。在这些情况下，测序后的官能团被转化回能够附接引物的官能团，这使得聚合物水凝胶为随后的引物接枝和测序循环做好准备。在其他情况下，引物移除涉及引入能够附接引物的官能团的交叉复分解反应。该反应还使得聚合物水凝胶为随后的引物接枝和测序循环做好准备。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1A是示例流通池的顶视图；
图1B至图1D是流通池的流动通道的不同示例的放大视图和局部剖面图；
图2是用于在核酸分析后再生聚合物水凝胶的引物接枝官能团的方法的一个示例的示意图；
图3是用于在核酸分析后再生聚合物水凝胶的引物接枝官能团的方法的另一个示例的示意图；
图4A至图4C描绘了具有不同氨基可裂解基团的含炔引物的示例和在氨基可裂解基团处发生的裂解；
图5是用于再生流通池表面以用于随后的核酸分析的方法的示例的示意图；
图6是用于在核酸分析后再生聚合物水凝胶的引物接枝官能团的方法的另一个示例的示意图；
图7是用于在核酸分析后再生聚合物水凝胶的引物接枝官能团的方法的又另一个示例的示意图；
图8是用于在核酸分析后再生聚合物水凝胶的引物接枝官能团的方法的另一个示例的示意图；
图9是可用于本文所公开的引物流体中的第一引物组和第二引物组的示意视图；
图10A和图10B是在泳道5-泳道8中进行引物移除之后和在泳道3-泳道8中尝试引物再接枝过程之后流通池的荧光扫描仪图像；
图11A、图11B和图11C是在泳道1-泳道8中进行初始引物接枝之后，在泳道2、泳道4、泳道6和泳道8中进行引物移除之后，以及在泳道2-泳道7中尝试引物再接枝过程之后流通池的荧光扫描仪图像；
图12是描绘图11A、图11B和图11C的流通池的定量TETTM染料亚磷酰胺测定结果的图；
图13A、图13B和图13C是在泳道1-泳道8中进行初始引物接枝之后，在泳道4和泳道5中进行引物移除之后以及在泳道4和泳道5中尝试引物再接枝过程之后流通池的荧光扫描仪图像；并且
图14是描绘图13A、图13B和图13C的流通池的定量TETTM染料亚磷酰胺测定结果的图。
具体实施方式
本文公开了流通池。初始流通池表面包括聚合物水凝胶，该聚合物水凝胶包括能够附接待用于核酸测序的引物的官能团。测序后，进行一个或多个反应以移除引物并再生能够附接引物的官能团。该反应使得聚合物水凝胶为随后的引物接枝和测序循环做好准备。
流通池由于可重复使用，所以能够成为测序仪器的一部分，而不是耗材套件的一部分。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、容纳和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述流通池和/或流通池的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约400nm至约1μm(1000nm)的范围应被解释为不仅包括明确列举的约400nm至约1μm的限值，而且包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等，以及子范围，诸如约425nm至约825nm、约550nm至约940nm等。另外，当利用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与所述值的微小变化(高达+/-10％)。
“丙烯酰胺”是具有以下结构的官能团：其中每个H可以另选地是烷基、烷基氨基、烷基酰氨基、烷基硫基、芳基、二醇以及它们任选地取代的变体。
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-C6烷基”指示烷基链中存在一个至六个碳原子，即，该烷基链选自由以下项组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。
如本文所用，“烷基氨基”是指其中氢原子中的一个或多个氢原子被氨基基团替代的烷基基团，其中氨基基团是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环。
如本文所用，“烷基酰氨基”是指其中一个或多个氢原子被C-酰氨基基团或N-酰氨基基团替代的烷基基团。“C-酰氨基”基团是指“-C(＝O)N(RaRb)”基团，其中Ra和Rb可独立地选自由以下项组成的组：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、芳烷基或(杂脂环族)烷基。“N-酰氨基”基团是指“RC(＝O)N(Ra)-”基团，其中R和Ra可独立地选自由以下项组成的组：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、芳烷基或(杂脂环族)烷基。任何烷基酰氨基可为取代的或未取代的。
如本文所用，“烷硫基”是指RS-，其中R为烷基。烷硫基可为取代的或未取代的。
如本文所用，“烯”或“烯基”或“烯烃”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。
“烯丙基”是指不饱和烃基团-CH＝CHCH2。
如本文所用，“芳烷基”和“芳基(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基基团连接的芳基基团。芳烷基的低级亚烷基和芳基基团可为取代的或未取代的。示例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。
术语“芳基”是指在环主链中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。任何芳基可为在环主链中具有至少一个杂原子(即，除碳之外的元素(例如，氮、氧、硫等))的杂芳基。
如本文所用，术语“附接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到官能化聚合物。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N3。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环基环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。任何碳环可为在环主链中具有至少一个杂原子的杂环。
如本文所用，术语“交叉复分解”是指两个末端烯烃单元在复分解催化剂(例如，钌卡宾体(例如，Grubbs催化剂))的存在下的分子间反应。
如本文所用，“环烷基”是指完全饱和(无双键或三键)的单环或多环烃环系。当由两个或更多个环构成时，这些环可以稠合方式接合在一起。环烷基基团可在环中包含3至10个原子。在一些示例中，环烷基基团可在环中包含3至8个原子。环烷基基团可以是未取代的或取代的。示例性环烷基基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。又一个示例为二苯并环辛炔(DBCO)。
如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
如本文所用，术语“凹入部”是指基底或图案化材料中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有至少部分地被基底或图案化材料的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的结构，诸如脊、台阶特征部等。
当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“流通池”旨在意指具有与包含表面化学物质的表面流体连通的流动通道的容器。在一些情况下，流通池表面化学物质是可移除的和/或可再生的，因此使得表面可重复使用。流通池还包括用于将试剂输送到流动通道的入口和用于从流动通道除去试剂的出口。流通池使得能够检测涉及该表面化学物质的反应。例如，流通池可以包括一个或多个允许对流动通道内的阵列、光学标记的分子等进行光学检测的透明表面。
如本文所用，“流动通道”或“通道”可为限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可以限定在图案化或非图案化结构与封盖之间。在其他示例中，流动通道可以限定在粘结在一起的两个图案化或非图案化结构之间。
如本文所用，“杂脂环族”或“杂脂环”是指三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、至多18元的单环、双环和三环环系，其中碳原子与1至5个杂原子一起构成所述环系。杂脂环族环系可任选地含有一个或多个不饱和键，这些不饱和键的位置使得完全离域的π电子体系不会出现在所有环中。杂原子独立地选自氧、硫和氮。杂脂环族环系还可含有一个或多个羰基或硫代羰基官能团，以便使该定义包括氧代体系和硫代体系，诸如内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺和环状氨基甲酸酯。这些环可以稠合方式接合在一起。另外，杂脂环族中的任何氮可被季铵化。杂脂环或杂脂环族基团可以是未取代的或取代的。此类“杂脂环族”或“杂脂环”基团的示例包括1,3-二噁英、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、1,2-二氧杂环戊烷、1,3-二氧杂环戊烷、1,4-二氧杂环戊烷、1,3-氧硫杂环戊烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,3-氧硫杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊二烯、1,3-二硫杂环戊烷、1,4-氧硫杂环己烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三噁烷、六氢-1,3.5-三嗪、咪唑啉、咪唑烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉、环氧乙烷、哌啶N-氧化物、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、pyrrolidione、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑烷、2-氧代吡咯烷、四氢吡喃、4H-吡喃、四氢噻喃、硫代吗啉、硫代吗啉亚砜、硫代吗啉砜，以及它们的苯并稠合类似物(例如，苯并咪唑啉酮、四氢喹啉、3,4-亚甲基二氧苯基)。
“(杂脂环族)烷基”是指经由低级亚烷基基团连接作为取代基的杂环或杂脂环族基团。低级亚烷基和杂环或(杂脂环族)烷基的杂环可以是取代的或未取代的。示例包括(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基、(哌啶-4-基)乙基、(哌啶-4-基)丙基、(四氢-2H-噻喃-4-基)甲基和(1,3-噻嗪烷-4-基)甲基。
如本文所用，“羟基(hydroxy/hydroxyl)”是指-OH基团。
术语“二醇”是指端基-(CH2)nOH，其中n在2至10的范围内。作为具体示例，二醇可为乙二醇端基-CH2CH2OH、丙二醇端基-CH2CH2CH2OH或丁二醇端基-CH2CH2CH2CH2OH。
如本文所用，术语“间隙区域”是指例如基底、图案化树脂或其他支撑物的分开凹入部或突起部的区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个凹入部与阵列的另一个凹入部分开，或者将阵列的一个突起部与阵列的另一个突起部分开。彼此分开的两个凹入部或突起部可以是离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而凹入部或突起部是离散的，例如，如限定在其他连续表面中的多个凹入部的情况。在其他示例中，间隙区域和特征部(例如，凹入部或突起部)是离散的，例如，由相应间隙区域分开的多个沟槽的情况就是如此。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与凹入部或突起部的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部或突起部表面可包括聚合物水凝胶，而间隙区域不含聚合物水凝胶。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在核糖核酸RNA中，糖为核糖，而在脱氧核糖核酸DNA中，糖为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖的2'位置的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)。
在一些示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料直接位于另一个部件或材料上。当一个直接在另一个上时，两个彼此接触。在图1B中，将聚合物水凝胶28施加在单层基座支撑物14上方，使得其直接位于单层基座支撑物14上并与该单层基座支撑物接触。
在其它示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料间接位于另一个部件或材料上。所谓间接地，表示间隙或另外的部件或材料可位于两个部件或材料之间。在图1D中，聚合物水凝胶28定位于多层结构16'的基座支撑物14上方，使得两者间接接触。更具体地说，层18定位在聚合物水凝胶28和基座支撑物14之间。
如本文所用，术语“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA)。本文称为扩增引物的一些引物用作模板扩增和簇生成的起点。本文称为测序引物的其它引物用作DNA合成的起点。引物的5'端可被修饰以允许与正交聚合物的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包含多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
术语“基底”是指其上可添加流通池的各种组分(例如，聚合物水凝胶、引物等)的结构。基底可以是晶片、面板、矩形片材、管芯或任何其他合适的构型。基底通常为刚性的并且不溶于水性液体。基底可以是单层结构或多层结构(例如，包括支撑物和支撑物上的图案化材料)。合适的基底的示例将在本文中进一步描述。
如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选地取代的。
流通池
流通池10的一个示例在图1A中以顶视图示出。流通池10可包括粘结在一起的两个图案化或非图案化结构、或粘结到封盖的一个图案化或非图案化结构。
图案化结构、非图案化结构、或者图案化或非图案化结构和封盖可以通过隔层(未示出)彼此附接。隔层可以是将图案化或非图案化结构的多个部分密封在一起或者将图案化或非图案化结构的多个部分与封盖密封在一起的任何材料。作为示例，隔层可以是粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料，等等。在一些示例中，隔层是辐射吸收材料，例如black。图案化或非图案化结构或图案化结构和封盖可以使用任何合适的技术(诸如激光键合、扩散键合、阳极键合、共晶键合、等离子体活化键合、玻璃熔块键合或本领域已知的其他方法)来粘结。
流动通道12位于两个图案化或非图案化结构之间，或者位于一个图案化或非图案化结构与封盖之间。图1A所示的示例包括八个流动通道12。虽然示出了八个流动通道12，但是应当理解，流通池10中可包括任何数量的流动通道12(例如，单个流动通道12、四个流动通道12，等等)。每个流动通道12可以与另一个流动通道12分离，使得引入流动通道12中的流体不会流到相邻的流动通道12中。引入流动通道12中的流体的一些示例可以引入反应组分(例如，裂解流体、DNA样品、聚合酶、测序引物、核苷酸等)、洗涤溶液、解封闭剂等。
流动通道12可以具有任何期望的形状。在一个示例中，流动通道12具有基本上矩形的构型。流动通道12的长度部分地取决于其上形成有图案化或非图案化结构的基底的大小。流动通道12的宽度部分地取决于其上形成有图案化或非图案化结构的基底的大小、流动通道12的期望数量、相邻通道12之间的期望间隔，以及图案化或非图案化结构的周边处的期望间隔。
当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道12的壁的单独材料时，流动通道12的深度可以小到单层厚。对于其它示例，流动通道12的深度可为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度可在约10μm至约30μm的范围内。在又一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解的是，流动通道12的深度可大于、小于上文指定的值，或者介于这些值之间。
每个流动通道12与入口和出口(未示出)流体连通。每个流动通道12的入口和出口可以定位在流通池10的相对端处。相应流动通道12的入口和出口可以另选地沿流动通道12的长度和宽度定位在能够实现所需流体流动的任何位置。
入口允许将流体引入到流动通道12中，并且出口允许从流动通道12中引出流体。入口和出口中的每一者与流体控制系统(包括例如，储器、泵、阀、废物容器等)流体连接，该流体控制系统控制流体引入和排出。
图1B、图1C和图1D描绘了流动通道12内的架构的不同示例。
每个架构包括基底，诸如单层基座支撑物14(如图1B所示)或多层结构16、16'(分别如图1C和图1D所示)。
合适的单层基座支撑物14的示例包括环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其他钽氧化物(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。
多层结构16、16'的示例包括基座支撑物14和其上的至少一个其他层18，如图1C和图1D所示。
多层结构16、16'的一些示例包括玻璃或硅作为基座支撑物14，其表面上具有钽氧化物(例如，五氧化二钽或另一种钽氧化物(TaOx))或另一种陶瓷氧化物的涂层(例如，层18)。
多层结构16、16'的其他示例包括基座支撑物14(例如，玻璃、硅、五氧化二钽，或任何其他基座支撑物14材料)和作为另一层18的图案化树脂。应当理解，可选择性地沉积或者沉积并图案化以形成凹入部20和间隙区域22(图1C)或突起部24和间隙区域22(图1D)的任何材料可用作图案化树脂。
图案化树脂的示例是无机氧化物。可经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将一些无机氧化物选择性地施加到基座支撑物14。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta2O5)、氧化铝(例如Al2O3)、氧化硅(例如SiO2)、氧化铪(例如HfO2)等。
图案化树脂的另一个示例是聚合物树脂。可将一些树脂施加到基座支撑物14，然后图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷的树脂、非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的)以及它们的组合。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(以商品名“POSS”从Hybrid Plastics商购获得)是指作为二氧化硅(SiO2)与有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如，RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是Kehagias等人，MicroelectronicEngineering 86(2009)，第776-778页中描述的，该文献全文以引用方式并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。
在一个示例中，单个基座支撑物14(无论是单独使用，还是作为多层结构16、16'的一部分使用)可以是直径在约2mm至约300mm(例如约200mm至约300mm)范围内的圆形片、面板、晶片、裸片等，或者可以是最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片、面板、晶片、裸片等。例如，裸片的宽度范围可为约0.1mm至约10mm。虽然已经提供了示例性尺寸，但是应当理解的是，可以使用具有任何合适尺寸的单个基座支撑物14。
图1B中所示的架构是非图案化结构。非图案化结构的基底可以是单层基座支撑物14。在该示例中，单层基座支撑物14具有限定在其中的泳道26，该泳道被边缘区域30围绕。泳道26为聚合物水凝胶28提供指定区域。边缘区域30提供两个非图案化结构可以彼此附接或者一个非图案化结构可以附接到封盖的粘结区域。因此，在该示例中，流通池的表面是非图案化的，并且聚合物水凝胶28位于非图案化表面的泳道26内。
聚合物水凝胶28可以是任何凝胶材料，当吸收液体时该凝胶材料可溶胀，并且当例如通过干燥移除液体时该凝胶材料可收缩。在一个示例中，聚合物水凝胶28包括丙烯酰胺共聚物。丙烯酰胺共聚物的一些示例由以下结构(I)表示：
其中：
RA选自由叠氮化物和任选地取代的胺组成的组；
RB为H或任选地取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自由H和任选地取代的烷基组成的组；
-(CH2)p-中的每一者可任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
由结构(I)表示的丙烯酰胺共聚物的一个具体示例是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的分子量可以在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可以为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物是线型聚合物。在一些其他的示例中，丙烯酰胺共聚物为轻度交联聚合物。
在其他示例中，凝胶材料可以是结构(I)的变型。在该示例中，丙烯酰胺单元可以用N,N-二甲基丙烯酰胺替代。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可以用替代，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是丙烯酰胺情况下的H)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为聚合物水凝胶的另一个示例，结构(I)中重复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替代：
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，该直链具有选自由碳、氧和氮组成的组的2至20个原子以及在该链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，该直链包括选自由碳、氧和氮组成的组的1至4个原子以及在该链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。作为又一个示例，该凝胶材料可以包括结构(III)和(IV)各自的重复单元：
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R3a和R3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L1和L2独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。
在又一个示例中，使用硝基氧介导的聚合形成丙烯酰胺共聚物，并且因此至少一些共聚物链具有烷氧基胺端基。在共聚物链中，术语“烷氧基胺端基”是指休眠种-ONR1R2，其中R1和R2中的每一者可以相同或不同，并且可独立地为直链或支链烷基或环结构，并且其中氧原子附接到共聚物链的其余部分。在一些示例中，还可以将烷氧基胺引入到一些重复出现的丙烯酰胺单体中，例如在结构(I)的位置RA处。因此，在一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基；并且在另一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基和至少一些侧链中的烷氧基胺基团。
含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可以用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括树枝状聚合物(例如，多臂聚合物或星型聚合物)等等。例如，单体(例如，丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到树枝状聚合物的支链(臂)中。
为了将聚合物水凝胶28引入泳道26中，可生成聚合物水凝胶28的混合物，然后将其施加到单层基座支撑物14上。在一个示例中，聚合物水凝胶28可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂、或浸渍或浸涂、或正压或负压下的材料流或另一种合适的技术将混合物施加到相应的基底表面(包括在泳道26中)。这些类型的技术将聚合物水凝胶28毯覆式地沉积在泳道26中和沉积在边缘区域30上。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶28特定地沉积在泳道26中而不是沉积在边缘区域30上。
在一些示例中，可活化单层基座支撑物14的表面(包括泳道26)，然后可向其施加混合物(包括聚合物水凝胶28)。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在单层基座支撑物14的表面上。在另一个示例中，可将基底表面暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶28的表面活化剂(例如，-OH基团)。
根据聚合物水凝胶28的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下发生约1毫秒至约几天范围内的时间。
然后可执行抛光，以便从泳道26的周边处的边缘区域30移除聚合物水凝胶28，同时使在表面上的聚合物水凝胶28在泳道26中至少基本上完整。
图1C所示的架构是图案化结构的一个示例。该图案化结构的基底是具有限定在层18中的凹入部20的多层结构16。凹入部20为聚合物水凝胶28提供指定区域。在该示例中，流通池10的表面被由间隙区域22分开的凹入部20图案化，并且聚合物水凝胶28位于图案化表面的每个凹入部20内。
可设想凹入部20的许多不同的布局，包括规则的、重复的和不规则的图案。在一个示例中，凹入部20设置在六边形网格中，以实现紧密的堆积和改进的密度。其它布局可包括例如矩形布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可为凹入部20和间隙区域22的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可为凹入部20和间隙区域22的随机布置。
布局或图案可相对于限定区域中的凹入部20的密度(数量)来表征。例如，凹入部20可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约100,000个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，该密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间，或者可以使用其它密度(在给定范围之外)。例如，高密度阵列可被表征为具有分开小于约100nm的凹入部20，中等密度阵列可被表征为具有分开约400nm至约1μm的凹入部20，并且低密度阵列可被表征为具有分开大于约1μm的凹入部20。
凹入部20的布局或图案也可根据或另选地根据平均节距，或从一个凹入部20的中心至相邻凹入部20的中心的间距(中心到中心间距)或从一个凹入部20的右边缘至相邻凹入部20的左边缘的间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部20具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个凹入部20的大小可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。例如，体积可以在约1×10-3μm3至约100μm3的范围内，例如，为约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3，或更大，或更小。又如，开口面积可以在约1×10-3μm2至约100μm2的范围内，例如，为约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、至少约10μm2，或更大，或更小。再如，深度可以在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm，或更大，或更小。对于又一个示例，直径或长度和宽度的范围可为约0.1μm至约100μm，例如约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。
本文所公开的聚合物水凝胶28的任何示例可用于图1C中所示的架构中。
为了将聚合物水凝胶28引入凹入部20中，可生成聚合物水凝胶28的混合物，然后将其施加到多层结构16上。在一个示例中，聚合物水凝胶28可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂、或浸渍或浸涂、或正压或负压下的材料流或另一种合适的技术将混合物施加到相应的基底表面(包括在凹入部20中)。这些类型的技术将聚合物水凝胶28毯覆式地沉积在凹入部20中和沉积在间隙区域22上。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶28特定地沉积在凹入部20中而不是沉积在间隙区域22上。
在一些示例中，可活化层18的表面(包括凹入部20)，然后可向其施加混合物(包括聚合物水凝胶28)。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在层18的表面上。在另一个示例中，可将层18暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶28的表面活化剂(例如，-OH基团)。
根据聚合物水凝胶28的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下发生约1毫秒至约几天范围内的时间。
然后可执行抛光，以便从间隙区域22中移除聚合物水凝胶28，同时使表面上在凹入部20中的聚合物水凝胶28至少基本上完整。
图1D所示的架构是图案化结构的另一示例。该图案化结构的基底是具有限定在层18中的突起部24的多层结构16'。突起部24是从相邻表面向外(向上)延伸的三维结构。突起部24可以经由蚀刻、光刻、压印等产生。在该示例中，流通池10的表面被由间隙区域22分开的突起部24图案化，并且聚合物水凝胶28位于图案化表面的每个突起部24上。
虽然任何合适的三维几何形状可用于突起部24，但具有至少基本上平坦的顶表面的几何形状可能是期望的。示例性突起几何形状包括球体、圆柱体、立方体、多边形棱柱(例如，矩形棱柱、六边形棱柱等)等。
可设想突起部24的许多不同布局，包括本文针对凹入部20所描述的那些布局中的任一种布局。布局或图案可相对于限定区域中的突起部24的密度(数量)来表征。突起部24可以以大约2百万个/mm2的密度存在，或者以本文针对凹入部20阐述的任何其他示例存在。突起部24的布局或图案也可根据或另选地根据平均节距，或从一个突起部24的中心至相邻突起部24的中心的间距(中心到中心间距)或从一个突起部24的右边缘至相邻突起部24的左边缘的间距(边缘到边缘间距)来表征。
每个突起部24的大小可由其表面积表征。突起部24的表面积可在约1×10-3μm2至约100μm2的范围内，例如，为约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、至少约10μm2，或更大，或更小。
每个突起部24的高度(从间隙区域22测量)可以在约10nm至约500nm的范围内。
本文公开的聚合物水凝胶28的任何示例可用于图1D所示的架构中。为了将聚合物水凝胶28引入到突起部24上，可以产生聚合物水凝胶28的混合物，然后将其施加到突起部24上。选择性沉积技术可用于将聚合物水凝胶28沉积在突起部24上而不是间隙区域22上。当聚合物水凝胶28沉积在突起部24上时，可以使用掩模来覆盖间隙区域22。
流通池架构的每个示例还包括引物32、34。可在核酸分析开始时将引物32、34引入到流通池10中并接枝到聚合物水凝胶28的叠氮化物或胺官能团上。下文参考各种试剂盒和方法讨论了几个引物32、34。
试剂盒和方法
本文所公开的流通池10的示例可用于在已执行测序循环之后再生引物接枝官能团的多种方法中，并且可包括在具有待用于这些方法中的流体的多种试剂盒中。现将参考图2至图8描述试剂盒和方法。
试剂盒和方法#1
在第一个示例中，该试剂盒包括：流通池，该流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团或胺官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；引物流体，该引物流体包括多个含炔引物，每个含炔引物具有氨基可裂解基团，该氨基可裂解基团将含炔引物的引物序列附接至含炔引物的含炔部分；和裂解流体，该裂解流体与氨基可裂解基团具有反应性。该试剂盒可用于图2和图3所示的示例性方法中。
在该示例性试剂盒中，流通池10可以是本文参考图1B至图1D描述的任何示例。用聚合物水凝胶官能化的表面可以是本文所述的图案化或非图案化结构中的任一者，这些结构可包括聚合物水凝胶28的任何示例。
该示例性试剂盒包括引物流体。引物流体包括在载液中的多个含炔引物，例如引物32A、34A。含炔引物32A、34A可包括正向和反向扩增引物序列，这些引物序列以炔封端或含有内部炔以与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应或与附接到聚合物水凝胶28的四嗪分子反应。引物32A、34A一起使得能够扩增具有与两个不同引物32A、34A互补的末端衔接子的文库模板。
作为示例，含炔引物32A、34A的引物序列可包括P5和P7引物序列；P15和P7引物序列；或本文阐述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。
P5和P7引物序列的示例用在由Illumina Inc.销售的商用流通池的表面上，用于例如在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、ISEQTM、GENOME ANALYZERTM和其他仪器平台上进行测序。P5引物序列是：
P5:5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC(SEQ.ID.NO.1)其中“n”是序列中的尿嘧啶或烯-胸苷(即，烯-dT)。
P7引物序列可以是以下中的任一种：
P7#1:5'→3'
C AAG C AG AAG AC G G CAT AC G AnAT(SEQ.ID.NO.2)
P7#2:5'→3'
C AAG C AG AAGAC G G CAT AC n AG AT(SEQ.ID.NO.3)其中“n”是每个序列中的8-氧代鸟嘌呤(本文称为“8-氧代-G”)。
P15引物序列是：
P15:5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC(SEQ.ID.NO.4)其中“n”是烯丙基-T。
上述其他引物序列(PA-PD)包括：
PA 5'→3'
GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG(SEQ.ID.NO.5)
cPA(PA')5'→3'
CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC(SEQ.ID.NO.6)
PB 5'→3'
CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT(SEQ.ID.NO.7)
cPB(PB')5'→3'
AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG(SEQ.ID.NO.8)
PC 5'→3'
ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT(SEQ.ID.NO.9)
cPC(PC')5'→3'
AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT(SEQ.ID.NO.10)
PD 5'→3'
GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC(SEQ.ID.NO.11)
cPD(PD')5'→3'
GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC(SEQ.ID.NO.12)
虽然PA-PD的示例性序列中未示出，但是应当理解，这些引物序列中的任一引物序列可在链中的任何点处包括裂解位点，诸如尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等。
第一示例性试剂盒中含炔引物32A、34A中的每一个含炔引物还包括附接在本文阐述的任何序列的5'端的氨基可裂解基团36(参见图2)。氨基可裂解基团36具有与用于在簇生成期间线性化的裂解位点(例如尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等)的裂解化学物质正交的裂解化学物质。因此，氨基可裂解基团36在线性化期间不裂解。当裂解时，氨基可裂解基团36在聚合物水凝胶28上留下末端胺官能团。氨基可裂解基团36的示例选自由邻苯二甲酰亚胺基团、BOC(叔丁氧羰基)酰胺和三苯基甲胺组成的组。这些可裂解基团在核酸分析期间可能发生的至少300个测序循环中是稳定的。
第一示例性试剂盒中含炔引物32A、34A中的每一个含炔引物还可包括附接至氨基可裂解基团36的连接分子。合适连接分子的示例可以包括核酸接头(例如，10个核苷酸或更少)，或者非核酸接头，诸如聚乙二醇链(例如，六乙二醇)、烷基基团或碳链、脂肪族接头、肽接头，等等。核酸接头的一个示例是polyT间隔区，但是也可以使用其他核苷酸。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。
第一示例性试剂盒中含炔引物32A、34A中的每一个含炔引物还包括会与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团或与附接到聚合物水凝胶28的四嗪分子反应的炔。炔是附接到氨基可裂解基团36的含炔部分38(图2)的一部分，该氨基可裂解基团附接到引物序列的5'端。因此，氨基可裂解基团36将含炔引物32A、34A的引物序列附接到含炔引物32A、34A的含炔部分38上。在一些示例中，炔是末端炔(如图2所示)。己炔基是可附接至氨基可裂解基团36以产生末端炔的一个示例。可替代地炔可以是内部炔(如图3所示)，例如，其中炔是附接至氨基可裂解基团36的环状化合物的一部分。双环[6.1.0]壬炔(BCN)是可以附接到氨基可裂解基团36以产生内部炔的一个示例。
含炔引物32A、34A可以以约0.5μM至约100μM范围的浓度包含在载液中。较高的浓度(例如，从约25μM至约100μM)可更适合于本文所公开的非图案化结构，而较低的浓度(例如，从约0.5μM至约25μM)可更适合于本文所公开的图案化结构。在一个示例中，引物浓度可在约5μm至约10μm的范围内。
第一示例性试剂盒中引物流体的载液可以是水。可将缓冲液和/或盐添加到载液中以将引物32A、34A接枝到聚合物水凝胶28的合适官能团上。缓冲液的pH范围为5至12，并且所用的缓冲液将取决于所用的含炔引物。可以将中性缓冲液和/或盐添加到用于接枝BCN封端的引物的引物流体中，而可以将碱性缓冲液添加到用于铜辅助接枝方法(例如点击反应)的引物流体中。在铜辅助接枝方法中使用的本文公开的任何引物流体也可包括铜催化剂。中性缓冲液的示例包括三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液，诸如TRIS-HCl或TRIS-EDTA，或碳酸盐缓冲液(例如，0.25M至1M)。硫酸钠(例如，1M至2M)是可以使用的合适的盐。碱性缓冲液的示例包括三(羟甲基)氨基甲烷(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)和碱性缓冲溶液(来自Sigma-Aldrich)。
在另一个示例中，该试剂盒中不包括引物流体。相反，炔封端的引物(例如，P5或P7)中的一个炔封端的引物接枝到流通池表面并且炔封端的引物(例如，P7或P5)中的另一个炔封端的引物处于溶液中。处于溶液中的引物掺入包括多条模板核酸链的样品中(如下所述)。
第一示例性试剂盒还包括裂解流体44。裂解流体44与氨基可裂解基团36具有反应性。在一个示例中，氨基可裂解基团36是邻苯二甲酰亚胺基团，并且裂解流体44是肼或甲基肼。在另一个示例中，氨基可裂解基团36是BOC酰胺或三苯基甲胺，并且裂解流体44是酸。示例性酸包括盐酸水溶液、三氟乙酸水溶液和甲醇。
第一示例性试剂盒还可包括再生流体46(图2)、46'(图3)。再生流体46、46'包括i)选自由以下项组成的组的叠氮化物封端的分子：叠氮基-PEG4-C2-羧酸(其中“PEG”是聚(乙二醇))、三氟甲磺酰叠氮化物、咪唑鎓磺酰叠氮化物盐酸盐、1-(氟磺酰基)-2,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓三氟甲磺酸盐、氟磺酰基叠氮化物、全氟丁磺酰叠氮化物、叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯和咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐，或ii)选自由以下项组成的组的四嗪封端的分子：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
再生流体46、46'还可包括单独的或与缓冲液组合的载液，诸如水。示例性缓冲液包括磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐或任何碱性缓冲液。再生流体的pH范围为约7至约10.5。叠氮化物封端的分子或四嗪封端的分子可以约1μM至约50mM范围内的浓度包含在载液中。在一个示例中，叠氮化物封端的分子以约1mM至约20mM范围内的浓度包含在载液中。在另一个示例中，四嗪封端的分子以约2.5μM至约50μM范围内的浓度包含在载液中。在又另一个示例中，四嗪封端的分子以约10μM至约100μM范围内的浓度包含在载液中。
第一示例性试剂盒的一些示例还可包括接头流体52、52'(图3)。在一些示例中，接头流体52包括四嗪分子，四嗪分子将会与流通池10的聚合物水凝胶28的胺官能团反应。在该接头流体52中，四嗪分子选自由以下项组成的组：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-PEGn-N-羟基琥珀酰亚胺酯，其中n＝4或5或8。在其它示例中，接头流体52'包括四嗪分子，四嗪分子将会与流通池10的聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应。在该接头流体52'中，四嗪分子是磺基-6-甲基-四嗪-二苯并环辛炔。在接头流体52、52'的任何示例中，四嗪分子可以以约1μM至约50mM范围内的浓度包含在载液中。在一个示例中，四嗪封端的分子以约10μM至约100μM范围内的浓度包含在载液中。
接头流体52、52'的载液可以是单独的或与缓冲液组合的水。示例性缓冲液包括磷酸盐缓冲液、2-乙磺酸(MES)或另一种酸性缓冲液。再生流体的pH范围为约5至约8。
在一些示例中，接头流体52可以包含在具有流通池10的试剂盒中，该流通池包括具有胺官能团的聚合物水凝胶28。在其他示例中，接头流体52或52'可以包含在具有流通池10的试剂盒中，该流通池包括具有叠氮化物官能团的聚合物水凝胶28。如果接头流体52中的四嗪分子将会与胺官能团反应，则该试剂盒还可包括叠氮化物还原剂以最初将叠氮化物官能团转化为胺官能团。合适的叠氮化物还原剂的示例包括膦、在存在NaBH4的存在下的1,2-苯二硫醇锡(IV)、氢化二氯铟、三氟化硼乙醚合物和碘化钠，以及在甲酸铵的存在下在水中的铜纳米颗粒。
利用第一示例性试剂盒的方法包括：将多个含炔引物32A、34A接枝到流通池10的表面上的聚合物水凝胶28的相应叠氮化物官能团或四嗪官能团，该多个含炔引物32A、34A中的每一个含炔引物都具有氨基可裂解基团36，该氨基可裂解基团将含炔引物的引物序列附接至含炔引物的含炔部分；进行涉及所接枝的多个含炔引物32A、34A的核酸分析；引入裂解流体44以在氨基可裂解基团36处裂解所接枝的多个含炔引物32A、34A，从而在流通池10的表面上留下多个胺官能团；以及使相应的叠氮化物封端的分子或四嗪封端的分子与该多个胺官能团中的至少一些胺官能团反应以将新的叠氮化物官能团或新的四嗪官能团引入到流通池10的表面。
应当理解，在该方法的这个示例中，该多个含炔引物32A、34A可替代地预接枝到流通池10。在这些示例中，该方法将包括进行涉及所接枝的多个含炔引物32A、34A的核酸分析；引入裂解流体以在氨基可裂解基团36处裂解所接枝的多个含炔引物32A、34A，从而在流通池10的表面上留下多个胺官能团；以及使相应的叠氮化物封端的分子或四嗪封端的分子与该多个胺官能团中的至少一些胺官能团反应以将新的叠氮化物官能团或新的四嗪官能团引入到流通池10的表面。
该方法的一个示例示于图2中。该示例描绘了在流通池10的非图案化结构的泳道26中的聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团(N3)的再生。流通池10的泳道26在图2中的字母A处描绘。应当理解，可以使用本文所公开的任何流通池架构。
如果含炔引物32A、34A未预接枝到流通池10的聚合物水凝胶28上，则该方法涉及将含炔引物32A、34A接枝到聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团中的至少一些叠氮化物官能团上。为了接枝，将第一示例性试剂盒的引物流体引入流通池10中。引物流体可以使用流通式沉积引入。接枝可在约55℃至约65℃范围内的温度下进行约20分钟至约60分钟范围内的时间。在一个示例中，接枝在60℃下进行约30分钟或60分钟。应当理解，也可以使用较低的温度和较长的时间或较高的温度和较短的时间。一些引物接枝技术，诸如涉及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或BCN接枝到四嗪单元的那些技术，可以在室温(例如18℃至约25℃)下进行。在接枝期间，含炔引物32A、34A附接到聚合物水凝胶28的至少一些叠氮基上，并且对流通池10的间隙区域22或边缘部分30没有亲和力。接枝的引物32A、34A在图2的字母B处示出。
然后可以进行核酸分析。在一个示例中，核酸分析涉及将包含多条模板核酸链的样品引入流通池中10，由此该多条模板核酸链中的至少一些模板核酸链分别与所接枝的多个含炔引物32A、34A中的至少一些含炔引物的引物序列杂交；并且进行边合成边测序。边合成边测序涉及模板核酸链的扩增和扩增的模板核酸链的测序。
包含多条模板核酸链(即，文库模板)的样品，可以首先由任何核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备。DNA核酸样品可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的DNA片段。RNA核酸样品可用于合成互补DNA(cDNA)，并且cDNA可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的cDNA片段。在制备期间，可将衔接子添加到任何片段的末端。通过减少循环扩增，可在衔接子中引入不同的基序，诸如测序引物结合位点、索引，以及与流通池表面上的引物32A、34A互补的区域。最终文库模板包括DNA或cDNA片段和两端的衔接子。DNA或cDNA片段代表最终文库模板的待测序部分。
可以将样品引入流通池10中。模板核酸链例如与两种类型之一的引物32A、34A杂交。
可启动模板核酸链的扩增以形成跨越聚合物水凝胶28的模板链簇(例如，在泳道26中、在每个凹入部20中或在每个突起部24上)。在一个示例中，扩增涉及簇生成。在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物复制文库模板。使初始文库模板变性，保留固定到聚合物水凝胶28上的拷贝。等温桥扩增或一些其它形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过在引物序列中的裂解位点(例如，尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等)处特异性裂解来移除反向链，留下正向模板链。产生的模板链40在图2中的字母C处示出。成簇导致通过引物32A或34A形成固定在聚合物水凝胶28上的若干条模板链40。成簇的该示例称为桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其它扩增技术。
该方法的一些示例然后包括阻断模板链40的未保护的(游离的)3'OH末端和没有与其附接的模板链40的引物32A或34A。可以添加封端基团(例如，3'磷酸盐)，其附接到暴露的3'末端以防止不期望的延伸。
然后可以将测序引物引入流通池10中。测序引物与模板核酸链40杂交。这些测序引物使模板链40准备好用于测序。
然后可以(例如，经由入口)将包括标记核苷酸的掺入混合物引入到流通池10中。除了标记核苷酸之外，掺入混合物还可包括水、缓冲液和聚合酶。当掺入混合物被引入到流通池10中时，该混合物进入流动通道12，并且与锚定的准备好测序的模板链40接触。
允许掺入混合物在流通池10中孵育，并且标记核苷酸(包括光学标记)通过相应的聚合酶沿模板链40掺入新生链42中。在掺入期间，通过相应的聚合酶将标记核苷酸中的一个标记核苷酸掺入一条新生链42中，该新生链延伸一个测序引物并与模板链40中的一条模板链互补。以模板链依赖性方式进行掺入，并且因此添加到新生链42中的标记核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板链40的序列。在单个测序循环期间，在跨流通池10的至少一些模板链40中发生掺入。
由于存在3'OH封端基团，掺入的标记核苷酸可包括可逆终止特性，一旦添加标记核苷酸，该可逆终止特性就终止进一步的测序引物延伸。在孵育和掺入所需的时间之后，可以在洗涤循环期间从流通池10中除去包括未掺入的标记核苷酸的掺入混合物。洗涤循环可以涉及流通技术，其中洗涤溶液(例如，缓冲液)(例如，通过泵或其他合适的机构)被引导进入、通过、然后离开流动通道12。
在不进行进一步掺入的情况下，可通过成像事件检测最近掺入的标记核苷酸。在成像事件期间，照明系统可以向流通池10提供激发光。掺入的标记核苷酸的光学标记响应于激发光而发射光信号。这些光信号可以使用成像装置来捕获。
在进行成像之后，接着可以将裂解混合物引入到流通池10中。在示例中，裂解混合物能够i)从掺入的核苷酸移除3'OH封端基团，并且ii)从掺入的核苷酸裂解光学标记。裂解混合物中3'OH封端基团和合适的解封剂/组分的示例可包括：可通过碱水解移除的酯部分；可用NaI、三甲基氯硅烷和Na2S2O3或用Hg(II)的丙酮/水溶液移除的烯丙基部分；可用膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))裂解的叠氮甲基；可用酸性条件裂解的缩醛，诸如叔丁氧基-乙氧基；可用LiBF4和CH3CN/H2O裂解的MOM(-CH2OCH3)部分；可用亲核试剂诸如苯硫酚和硫代硫酸盐裂解的2,4-二硝基苯亚磺酰基；可用Ag(I)或Hg(II)裂解的四氢呋喃基醚；以及可被磷酸酶(例如多核苷酸激酶)裂解的3'磷酸。裂解混合物中合适的光学标记裂解剂/组分的示例可包括：可裂解邻位二醇的高碘酸钠；可以裂解叠氮甲基键的膦(诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP))；可裂解烯丙基的钯和THP；可裂解酯部分的碱基；或3'OH封端基团的任何其他合适的裂解剂。
然后可以进行附加测序循环，直到对模板链40进行测序。新生链42可以去杂交，并且模板链40和引物32A或34A的3'OH末端处的封端基团可被移除。再次进行成簇，并且这次，通过在引物序列中的裂解位点(例如，尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等)处特异性裂解来移除正向链，留下反向模板链。反向模板链的测序可如本文所述进行。
在接枝期间未附接到引物32A、34A的叠氮化物官能团被测序期间使用的裂解混合物还原成氨基官能团50。这在图2中的字母C处示出。
测序后，将裂解流体44例如经由入口引入流通池10中，以在氨基可裂解基团36处裂解所接枝的多个含炔引物32A、34A，从而在流通池10的表面处留下多个胺官能团50'。这在图2中的字母D处示出。图4A至图4C示出了当引入裂解流体44时在氨基可裂解基团36处发生的反应的不同示例。
在图4A中，氨基可裂解基团36A是邻苯二甲酰亚胺基团，并且裂解流体44A是甲基肼。在该示例中，也可以使用肼代替甲基肼。在图4B中，氨基可裂解基团36B是BOC酰胺，并且裂解流体44B是盐酸(HCl)水溶液。在该示例中，可以使用另一种酸代替HCl。在图4C中，氨基可裂解基团36C是三苯基甲胺，并且裂解流体44C是盐酸(HCl)水溶液或三氟乙酸(TFA)水溶液。如图所示，每个反应产生裂解部分48A、48B、48C并留下附接到流通池10中的聚合物水凝胶28的氨基官能团(NH2)50'。
在裂解期望的时间之后，可以进行洗涤循环以移除裂解部分48A、48B、48C。
如图2中字母D处所示，核酸分析和氨基可裂解基团36的裂解留下附接于聚合物水凝胶28的氨基官能团50、50'。
再生流体46然后例如经由入口(参见图2的字母E)引入流通池10中。在该示例中，再生流体46包括叠氮化物封端的分子，该叠氮化物封端的分子选自由以下项组成的组：叠氮基-PEG4-C2-羧酸(其中“PEG”是聚(乙二醇))、三氟甲磺酰叠氮化物、咪唑鎓磺酰叠氮化物盐酸盐、1-(氟磺酰基)-2,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓三氟甲磺酸盐、氟磺酰基叠氮化物、全氟丁磺酰叠氮化物、叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯和咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐。再生流体46中的叠氮化物封端的分子与氨基官能团50、50'反应以将新鲜的叠氮化物官能团61'引入到聚合物水凝胶28中，如图2中字母F处所示。
在该示例性方法中，流通池10包含叠氮化物官能团；叠氮化物官能团61中的一些叠氮化物官能团在接枝后保持游离(如图2中字母B处所示)；游离的(未接枝的)叠氮化物官能团61在核酸分析期间被还原成胺基50(如图2中字母C处所示)；并且叠氮化物封端的分子(引入再生流体46中)中的至少一些叠氮化物封端的分子与多个胺官能团50'中的至少一些胺官能团(当氨基可裂解基团36被裂解时产生的，如图2中字母D处所示)反应，并且叠氮化物封端的分子(引入再生流体46中)中的至少一些其他叠氮化物封端的分子与胺基50反应。
在新鲜的叠氮化物官能团61'位于聚合物水凝胶28的表面的情况下，流通池表面再生用于另一轮的引物32A、34A接枝和核酸分析。参考字母B至字母F示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
该方法的两个其他示例示于图3中。这些示例描绘了在流通池10的图案化结构的凹入部20中的聚合物水凝胶28上的四嗪官能团的再生。应当理解，本文所公开的任何流通池架构可用于这些方法中。
当聚合物水凝胶28包含叠氮化物官能团(N3)时，图3中的两种示例性方法在字母A处开始。
在一个示例中，该方法可以通过将流通池表面暴露于叠氮化物还原剂而开始。作为示例，叠氮化物还原剂是膦(例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)(TCEP)、三(羟丙基)膦等)或亚磷酸盐，并且还原反应在约50℃至约60℃范围内的温度下发生约5分钟至约10分钟范围内的时间。还原反应可在数秒(例如，30秒)内发生。也可以使暴露于叠氮化物还原剂进行更长的持续时间，例如60分钟或更长。还原反应将叠氮化物官能团还原成胺官能团50，如图3中的字母B处所示。
可替代地，当聚合物水凝胶28从开始就包括酰胺官能团50时，该示例性方法从图3中的字母B开始。在该示例中，不进行叠氮化物官能团的还原。
当聚合物水凝胶28最初包含胺官能团50或经处理以产生该胺官能团时，将接头流体52例如经由入口引入流通池10中。接头流体52的四嗪分子与聚合物水凝胶28的胺官能团50反应。可以与胺官能团50反应的任何四嗪分子均可用于接头流体52中。可允许接头流体52在流通池10中在约60℃下孵育约30分钟。这将四嗪官能团54引入到聚合物水凝胶28中，如图3中字母C处所示。应当理解，虽然未在图3中示出，但在该方法开始时未附接到四嗪官能团54的胺官能团50在再生期间保持自由地附接到新鲜的四嗪官能团54。
在另一个示例中，图3的方法可以通过将四嗪分子54附接到聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团上开始。在这些示例中，该方法从字母A进行到字母C，因为没有进行叠氮化物还原反应。当聚合物水凝胶28包含叠氮化物官能团，并且这些基团不被还原成胺官能团时，将接头流体52'例如经由入口引入流通池10中。接头流体52的四嗪分子与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应。可允许接头流体52'在流通池10中在约60℃下孵育约30分钟。这将四嗪官能团54引入到聚合物水凝胶28中，如图3中字母C处所示。
图3中所示的两种示例性方法然后涉及将含炔引物32A、34A接枝到聚合物水凝胶28的至少一些四嗪官能团54上。为了接枝，将第一示例性试剂盒的引物流体引入流通池10中。引物流体可以使用流通式沉积引入。在接枝期间，含炔引物32A、34A附接到聚合物水凝胶28的至少一些四嗪官能团54上，并且对流通池10的间隙区域22或边缘部分30没有亲和力。接枝的引物32A、34A在图3的字母D处示出。
接头流体52或52'的孵育和引物接枝可以在约15℃至约75℃范围内的温度下发生约5分钟至约75分钟范围内的时间段。在一个示例中，每个反应(接头流体52或52'的四嗪分子的附接和随后的引物接枝)可以在约20℃至约60℃范围内的的温度发生约30分钟。
然后可如参考图2所述那样进行核酸分析。模板链40和新生链42在图3中的字母E处示出。
测序后，将裂解流体44例如经由入口引入流通池10中，以在氨基可裂解基团36处裂解所接枝的多个含炔引物32A、34A，从而在流通池10的表面处留下多个胺官能团50'。这在图3中的字母F处示出。如参考图4A至图4C所述，所用的裂解流体44将取决于掺入含炔引物32A、34A中的氨基可裂解基团36。在裂解期望的时间之后，可以进行洗涤循环以移除裂解部分。
再生流体46'然后例如经由入口引入流通池10中。在该示例中，再生流体46'包括可与胺官能团(例如50、50')反应的四嗪封端的分子。在该示例中，再生流体46'包括四嗪封端的分子，该四嗪封端的分子选自由四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯组成的组。再生流体46'中的一些四嗪封端的分子与氨基官能团50'反应以将新鲜的四嗪官能团引入到聚合物水凝胶28中。四嗪封端的分子还可与胺官能团50反应，该胺官能团：i)当暴露于接头流体52时不反应，或ii)是由叠氮化物官能团产生的，该叠氮化物官能团当暴露于接头流体52'时不反应且在核酸分析期间被还原。
在新鲜的四嗪官能团位于聚合物水凝胶28的表面的情况下，流通池表面再生用于另一轮的引物32A、34A接枝和核酸分析。参考图3的字母B至字母F示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
图3所示的方法的其他示例可以不使用再生流体46'。引物接枝可导致5％或更少的四嗪官能团54具有与其附接的引物32A、34A，并且因此在聚合物水凝胶28上可存在未接枝的四嗪官能团54。该方法的这个示例继续进行另一轮引物32A、34A接枝(其将附接至未接枝的四嗪官能团54)和核酸分析。参考字母D至字母F示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
试剂盒和方法#2
在第二个示例中，该试剂盒包括：流通池，该流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；表面制备试剂盒，该表面制备试剂盒选自由以下项组成的组：i)接头流体，该接头流体包含四嗪封端的分子以与叠氮化物官能团反应；和ii)叠氮化物还原剂，用于将叠氮化物官能团还原为胺官能团；和第二接头流体，该接头流体包含四嗪封端的分子以与胺官能团反应；引物流体，该引物流体包含多个含炔引物；以及酶促裂解流体，该酶促裂解流体包含酶促消化单链脱氧核糖核酸的物质。该试剂盒可用于图5所示的示例性方法中。
在该示例性试剂盒中，流通池10可以是本文参考图1B至图1D描述的任何示例。用聚合物水凝胶官能化的表面可以是本文所述的图案化或非图案化结构中的任一者，这些结构可包括聚合物水凝胶28的任何示例。
第二示例性试剂盒包括表面制备试剂盒。在一个示例中，表面制备试剂盒包括接头流体，例如接头流体52'，该接头流体包含四嗪封端的分子以与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应。本文参考第一示例性试剂盒描述的任何接头流体52'均可用于第二示例性试剂盒。在另一个示例中，该表面制备试剂盒包括将叠氮化物官能团还原为胺官能团的叠氮化物还原剂；和接头流体，例如接头流体52，该接头流体包含四嗪封端的分子以与胺官能团反应。参考第一示例性试剂盒描述的任何叠氮化物还原剂和接头流体52均可用于第二示例性试剂盒。在表面制备试剂盒的一个示例中，接头流体52'中四嗪封端的分子是磺基-6-甲基-四嗪-二苯并环辛炔；或者在表面制备试剂盒的另一示例中，(第二)接头流体52中四嗪封端的分子选自由以下项组成的组：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-PEGn-N羟基琥珀酰亚胺酯，其中n＝4或5或8。
第二示例性试剂盒还包括引物流体。该引物流体的示例包括在载液中的多个含炔引物，例如引物32B、34B。含炔引物32B、34B可包括正向和反向扩增引物序列，这些引物序列以炔封端或含有内部炔以与附接到聚合物水凝胶28的四嗪分子反应。引物32B、34B一起使得能够扩增具有与两个不同引物32B、34B互补的末端衔接子的文库模板。
作为示例，含炔引物32B、34B的引物序列可包括P5和P7引物序列；P15和P7引物序列；或本文阐述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。
第二示例性试剂盒中的含炔引物32B、34B可包括附接在本文阐述的任何序列的5'端附近的可酶促裂解的基团56。可酶促裂解的基团56具有与用于在簇生成期间线性化的裂解位点(例如尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等)的裂解化学物质正交的裂解化学物质。因此，可酶促裂解的基团56在线性化期间不裂解，但是当期望再生流通池表面时裂解。在一个示例中，含炔引物32B、34B是双环壬炔封端的引物(如图5所示)，并且可酶促裂解的基团56选自由酶促裂解的核碱基(例如，尿嘧啶)和磷酸二酯键组成的组。在该示例中，用于线性化的裂解位点将不是相同的可酶促裂解的核碱基(如可酶促裂解的基团56)或磷酸二酯键。在一个具体示例中，含炔引物32B、34B是分别包括P5和P7引物序列的双环壬炔，其中P5序列包括尿嘧啶作为可酶促裂解的基团56和烯-dT作为其线性化裂解位点，并且P7序列包括尿嘧啶作为可酶促裂解的基团56和8-氧代-G作为其线性化裂解位点。
含炔引物32B、34B不必包括可酶促裂解的基团56，因为酶促裂解流体能够酶促消化单链脱氧核糖核酸。
第二示例性试剂盒中的含炔引物32B、34B中的每一个含炔引物还可以包括附接在引物序列的5'端的polyT序列或其他连接分子。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。
第二示例性试剂盒中的含炔引物32B、34B中的每一个含炔引物还包括与附接到聚合物水凝胶28的四嗪分子反应的炔。炔是含炔部分38的一部分，其附接到引物序列的5'端或附接到与引物序列的5'端附接的polyT序列或其他连接分子。在一些示例中，炔是末端炔。己炔基是可附接以产生末端炔的一个示例。可替代地炔可以是内部炔(如图5所示)，例如，其中炔是附接至引物32B、34B的引物序列的5'端的环状化合物的一部分。双环[6.1.0]壬炔(BCN)是可以附接以产生内部炔的一个示例。
第二示例性试剂盒中的引物流体的载液可以是水，并且可以将任何中性缓冲液添加到用于接枝含炔引物32B、34B的引物流体中。含炔引物32B、34B可以以约0.5μM至约100μM范围的浓度包含在载液中。作为示例，引物浓度范围为约50μM至约100μM或引物浓度范围为约0.5μM至约20μM。
第二示例性试剂盒还包括酶促裂解流体58，其包括与可酶促裂解的基团56具有反应性的物质。因此，酶促裂解流体58的组分将取决于引物32B、34B的可酶促裂解的基团58。在一个示例中，可酶促裂解的基团56是可酶促裂解的核碱基，并且酶促裂解流体58包括可以裂解可酶促裂解的核碱基的酶。例如，当可酶促裂解的基团56是尿嘧啶时，酶促裂解流体58包括USERTM酶，该酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物。对于另一示例，当可酶促裂解的基团56是磷酸二酯键时，酶促裂解流体58包括DNA酶。酶促裂解流体58还可包括阳离子，诸如Ca2+和Mg2+，以激活酶活性或使酶活性成为可能。酶促裂解流体58还可以包括液体，诸如水。
利用第二示例性试剂盒的方法包括：将多个引物32B、34B分别接枝到流通池10的表面上的聚合物水凝胶28的相应四嗪官能团54上，该多个引物32B、34B中的每一个引物都具有可酶促裂解的基团56；进行涉及所接枝的多个引物32B、34B的核酸分析；酶促裂解所接枝的多个引物32B、34B；以及将第二多个引物32B、34B接枝到聚合物水凝胶28的残留的相应四嗪官能团54上。
应当理解，在该方法的这个示例中，该多个引物32B、34B可替代地预接枝到流通池10。在这些示例中，该方法将包括进行涉及所接枝的多个引物32B、34B的核酸分析；酶促裂解所接枝的多个引物32B、34B；以及将第二多个引物32B、34B接枝到聚合物水凝胶28的残留的相应四嗪官能团54上。
该方法的两个示例示于图5中。这些示例描绘了使用聚合物水凝胶28上未接枝的四嗪官能团54进行核酸分析后流通池表面的再生。在一些情况下，引物接枝(图5中的字母D)可导致5％或更少的四嗪官能团54具有与其附接的引物32B、34B。这些未接枝的四嗪官能团54可以用于随后的核酸分析，并且因此流通池10可以再接枝多达20次以便使用所有四嗪官能团54。
图5描绘了流通池10的图案化结构的凹入部20中的聚合物水凝胶28。应当理解，本文所公开的任何流通池架构可用于这些方法中。
当聚合物水凝胶28包含叠氮化物官能团(N3)时，图5中的两种示例性方法在字母A处开始。
在一个示例中，该方法可以通过将流通池表面暴露于叠氮化物还原剂而开始。在该示例中，该方法包括将聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团还原成胺官能团；以及使四嗪封端的分子与胺官能团反应性，从而将四嗪官能团54引入到聚合物水凝胶28中。作为示例，叠氮化物还原剂是膦(例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)(TCEP)、三(羟丙基)膦等)或亚磷酸盐，并且还原反应在约50℃至约60℃范围内的温度下发生约5分钟至约10分钟范围内的时间。还原反应将叠氮化物官能团还原成胺官能团50，如图5中的字母B处所示。
可替代地，当聚合物水凝胶28从开始就包括酰胺官能团50时，该示例性方法从图5中的字母B开始。在该示例中，不进行叠氮化物官能团的还原。
当聚合物水凝胶28最初包含胺官能团50或经处理以产生该胺官能团时，将接头流体52例如经由入口引入流通池10中。接头流体52的四嗪分子与聚合物水凝胶28的胺官能团50反应。可以与胺官能团反应的任何四嗪分子均可用于接头流体52中。可允许接头流体52在流通池10中在约60℃下孵育约30分钟。这将四嗪官能团54引入到聚合物水凝胶28中，如图5中字母C处所示。
在另一个示例中，该方法可以通过将四嗪分子54附接到聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团上开始。在这些示例中，该方法从字母A进行到字母C，因为没有进行叠氮化物还原反应。当聚合物水凝胶28包含叠氮化物官能团，并且这些基团不被还原成胺官能团50时，将接头流体52'例如经由入口引入流通池10中。接头流体52的四嗪分子与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应。可允许接头流体52'在流通池10中在约60℃下孵育约30分钟。这将四嗪官能团54引入到聚合物水凝胶28中，如图5中字母C处所示。
图5中所示的两种示例性方法然后涉及将含炔引物32B、34B接枝到聚合物水凝胶28的至少一些四嗪官能团54上。为了接枝，将第二示例性试剂盒的引物流体引入流通池10中。引物流体可以使用流通式沉积引入。接枝可如本文所述，例如在约55℃至约65℃范围内的温度下进行约20分钟至约35分钟范围内的时间。在一个示例中，接枝在60℃下进行约30分钟。在接枝期间，含炔引物32B、34B附接到聚合物水凝胶28的至少一些四嗪官能团54上，并且对流通池10的间隙区域22或边缘部分30没有亲和力。接枝的引物32B、34B在图5的字母D处示出。
然后可如参考图2所述那样进行核酸分析。模板链40和新生链42在图5中的字母E处示出。
测序后，将酶促裂解流体58例如经由入口引入流通池10中，以在可酶促裂解的基团56处裂解所接枝的多个含炔引物32B、34B。这样留下引物32B、34B的附接到聚合物水凝胶28上的非反应性部分，诸如polyT尾或其他连接分子。这在图5中的字母F处示出。如本文所述，使用的酶促裂解流体58将取决于掺入含炔引物32B、34B中的可酶促裂解的基团56。在裂解期望的时间之后，可以进行洗涤循环以移除裂解部分。
因为在聚合物水凝胶28上存在未接枝的四嗪官能团54，所以当期望进行另一核酸分析时，可重复该方法。该方法继续进行另一轮引物32B、34B接枝(其将附接至未接枝的四嗪官能团54)和核酸分析。参考字母D至字母F示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
试剂盒和方法#3
在第三个示例中，该试剂盒包括：流通池，该流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；引物流体，该引物流体包含多个含炔引物，每个含炔引物具有可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团；裂解流体，该裂解流体包含与所述可化学裂解的基团或所述可酶促裂解的基团具有反应性的物质；和再生流体，该再生流体包含胺氧化剂。该试剂盒可用于图6所示的示例性方法中。
在该示例性试剂盒中，流通池10可以是本文参考图1B至图1D描述的任何示例。用聚合物水凝胶官能化的表面可以是本文所述的图案化或非图案化结构中的任一者，这些结构可包括包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶28的任何示例。
该示例性试剂盒包括引物流体的再另一个示例。该引物流体包括在载液中的多个含炔引物32C、34C。含炔引物32C、34C可包括正向和反向扩增引物序列，这些引物序列以炔封端或含有内部炔以与附接到聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应。引物32C、34C一起使得能够扩增具有与两个不同引物32C、34C互补的末端衔接子的文库模板。
作为示例，含炔引物32C、34C的引物序列可包括P5和P7引物序列；P15和P7引物序列；或本文阐述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。
第三示例性试剂盒中的含炔引物32C、34C中的每一个含炔引物还包括可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'。可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'附接在本文阐述的任何序列的5'端或其附近。可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'具有与用于在簇生成期间线性化的裂解位点(例如尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T等)的裂解化学物质正交的裂解化学物质。因此，可化学裂解的基团60或可酶促裂解基团60'在线性化期间不裂解，但是当期望再生流通池表面时裂解。可化学裂解的基团60易于通过与特定化学品或光反应而裂解。可化学裂解的基团60的示例包括邻二醇、偶氮苯、可光裂解基团、烯丙基T(具有烯丙基官能团的胸腺嘧啶核苷酸类似物)、烯丙基醚或叠氮基官能醚。可酶促裂解的基团60'易于通过与酶或酶混合物(例如，糖基化酶和内切核酸酶)反应而裂解，随后可引入外切核酸酶以移除剩余的碱基。可酶促裂解的基团60'的一个具体示例是可以被USERTM酶靶向的尿嘧啶。
在一个具体示例中，含炔引物32C、34C是分别包括P5和P7引物序列的己炔基封端的引物，其中P5序列包括邻二醇作为可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团60、60'和尿嘧啶作为其线性化裂解位点，并且P7序列包括邻二醇作为可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团60、60'和8-氧代-G作为线性化裂解位点。在另一个具体示例中，含炔引物32C、34C是分别包括P5和P7引物序列的己炔基封端的引物，其中P5序列包括尿嘧啶作为可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团60、60'和烯丙基-T作为其线性化裂解位点，并且P7序列包括尿嘧啶作为可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团60、60'和8-氧代-G作为其线性化裂解位点。
第三示例性试剂盒中的含炔引物32C、34C中的每一个含炔引物还可以包括附接在引物序列的5'端的polyT序列或其他连接分子。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。
第三示例性试剂盒中的含炔引物32C、34C中的每一个含炔引物还包括将与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应的炔。炔是含炔部分38的一部分，其附接到引物序列的5'端或附接到与引物序列的5'端附接的polyT序列或其他连接分子。在一些示例中，炔是末端炔(如图6所示)。己炔基是可附接以产生末端炔的一个示例。可替代地炔可以是内部炔，例如，其中炔是附接至引物32B、34B的引物序列的5'端的环状化合物的一部分。双环[6.1.0]壬炔(BCN)是可以附接以产生内部炔的一个示例。
第三示例性试剂盒中的引物流体的载液可以是水，并且可以将任何中性或碱性缓冲液添加到用于接枝含炔引物32C、34C的引物流体中。如本文所述，使用的缓冲液将取决于含炔部分38及其接枝技术。含炔引物32C、34C可以以约0.5μM至约100μM(或其间的任何子范围)的浓度包含在载液中。
第三示例性试剂盒还包括裂解流体的示例。第三示例性试剂盒中的裂解流体44'包括与含炔引物32C、34C的可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'具有反应性的物质。因此，裂解流体44'的组分将取决于引物32C、34C的可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团60、60'。化学裂解流体44'可以是含有钯的缓冲液(例如，[Pd(烯丙基)Cl]2)。酶促裂解流体44'可包括USERTM酶。
在一些示例中，将裂解流体44'配制成裂解可酶促裂解的基团60'。该示例性试剂盒还可包括在可酶促裂解的基团60'裂解后将被引入流通池10中的外切核酸酶流体。外切核酸酶可以移除在可酶促裂解的基团60'裂解后留在流通池表面上的碱基。例如，在激酶裂解并将3'从磷酸转移至-OH后，外切核酸酶可在流通池中流动以逐碱基咀嚼。
第三示例性试剂盒还包括再生流体的示例。第三示例性试剂盒中的再生流体46”包括胺氧化剂。在一个示例中，再生流体46”包括咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐(作为胺氧化剂)。再生流体46”的这个示例是包含一种或多种盐的醇溶液(例如甲醇、异丙醇、叔丁醇等)，这些盐诸如碳酸钾(钾浓度为约1摩尔％且碳酸钾为1.5当量)、碳酸氢钠和/或硫酸铜(例如，CuSO4·5H2O)。
利用第三示例性试剂盒的方法包括：将多个引物32C、34C接枝到流通池10的表面上的聚合物水凝胶28的相应叠氮化物官能团上，该多个引物32C、34C中的每一个引物具有可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'；进行涉及所接枝的多个引物32C、34C的核酸分析，由此将游离叠氮化物官能团还原成胺基；裂解所接枝的多个引物32C、34C；以及将聚合物水凝胶28暴露于再生流体46”，从而从胺基再生叠氮化物官能团。
应当理解，在该方法的这个示例中，该多个引物32C、34C可替代地预接枝到流通池10。在这些示例中，该方法将包括进行涉及所接枝的多个引物32C、34C的核酸分析，由此将游离叠氮化物官能团还原成胺基；裂解所接枝的多个引物32C、34C；以及将聚合物水凝胶28暴露于再生流体46”，从而从胺基再生叠氮化物官能团。
该方法的一个示例示于图6中。该示例描绘了在流通池10的非图案化结构的泳道26中的聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团(N3)的再生。流通池10的泳道26在图6中的字母A处描绘。应当理解，可以使用本文所公开的任何流通池架构。
该示例性方法描绘了流通池表面上未接枝的叠氮化物官能团61的再生。在一些情况下，引物接枝(图6中的字母B)导致5％或更少的叠氮化物官能团具有与其附接的引物32C、34C。这些未接枝的叠氮化物官能团61在核酸分析期间被还原成胺官能团50(参见图6中的字母C)。该示例性方法氧化这些胺官能团50以再生叠氮化物官能团61”以进行随后的接枝和核酸分析(参见图6中的字母D和字母E)。该方法使得流通池10能够被再接枝多达20次，以便使用所有叠氮化物官能团。
图6所示的方法以将含炔引物32C、34C接枝到聚合物水凝胶28的至少一些叠氮化物官能团(N3)上开始。为了接枝，将第三示例性试剂盒的引物流体引入流通池10中。引物流体可以使用流通式沉积引入。接枝可在约55℃至约65℃范围内的温度下进行约20分钟至约35分钟范围内的时间。在一个示例中，接枝在60℃下进行约30分钟。在接枝期间，含炔引物32C、34C附接到聚合物水凝胶28的至少一些叠氮化物官能团上，并且对流通池10的间隙区域22或边缘部分30没有亲和力。接枝的引物32C、34C和一些未接枝的叠氮化物官能团61在图6的字母B处示出。
然后可如参考图2所述那样进行核酸分析。模板链40和新生链42在图6中的字母C处示出。如图6中字母C处所示，未接枝的叠氮化物官能团61被还原成胺基50。
测序后，将酶促裂解流体44'例如经由入口引入流通池10中，以在可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'处裂解所接枝的多个含炔引物32C、34C。这在图6中的字母D处示出。所使用的裂解流体44'将取决于掺入含炔引物32C、34C中的可化学裂解的基团60或可酶促裂解的基团60'。在裂解期望的时间之后，可以进行洗涤循环以移除裂解部分。
再生流体46'然后例如经由入口引入流通池10中。在该示例中，再生流体46”包含可氧化胺基50以再生叠氮化物官能团61”的胺氧化剂。这在图6中的字母E处示出。
在新鲜的叠氮化物官能团61”位于聚合物水凝胶28的表面的情况下，流通池表面再生用于另一轮的引物32C、34C接枝和核酸分析。新引入的引物32C、34C将接枝到新鲜的叠氮化物官能团61”。参考字母B至字母E示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
试剂盒和方法#4
在第四个示例中，该试剂盒包括：流通池，该流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；接头流体，该接头流体包含烯烃封端的分子，每个烯烃封端的分子包含末端炔官能团以与叠氮化物官能团中相应一个叠氮化物官能团反应；引物流体，该引物流体包含多个烯烃封端的引物；钌卡宾络合物；和再生流体，该再生流体包含另一种烯烃封端的分子。该试剂盒可用于图7所示的示例性方法中。
在该示例性试剂盒中，流通池10可以是本文参考图1B至图1D描述的任何示例。用聚合物水凝胶官能化的表面可以是本文所述的图案化或非图案化结构中的任一者，这些结构可包括包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶28的任何示例。
该示例性试剂盒包括接头流体52”的另一个示例。在该示例中，接头流体52”包括烯烃封端的分子。每个烯烃封端的分子还包括末端炔官能团以与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应。烯烃封端的分子的示例具有结构(I)：
其中n的范围为1至6，并且m的范围为4至12。
接头流体52”还包括载液，诸如水、水性缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)或缓冲液与DMSO的混合物。可以使用不与烯烃反应的任何缓冲液。烯烃封端的分子可以以约0.5μM至约100μM范围的浓度包含在载液中。较高的浓度(例如，从约25μM至约100μM)可更适合于本文所公开的非图案化结构，而较低的浓度(例如，从约0.5μM至约25μM)可更适合于本文所公开的图案化结构。在一个示例中，引物浓度可在约5μm至约10μm的范围内。接头流体52”还可以包括用于点击反应的铜催化剂。
第四示例性试剂盒包括引物流体的另一示例。第四示例性试剂盒中的引物流体包括在载液中的多个烯烃封端的引物32D、34D。烯烃封端的引物32D、34D可包括以烯烃封端的正向和反向扩增引物序列，烯烃可参与和引入聚合物水凝胶28中的烯烃封端的分子的交叉复分解反应。引物32D、34D一起使得能够扩增具有与两个不同引物32D、34D互补的末端衔接子的文库模板。
作为示例，烯烃封端的引物32D、34D的引物序列可包括P5和P7引物序列；P15和P7引物序列；或本文阐述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。
第四示例性试剂盒中的烯烃封端的引物32D、34D中的每一个烯烃封端的引物还可以包括附接在引物序列的5'端的polyT序列或另一连接分子。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。
第四示例性试剂盒中的烯烃封端的引物32D、34D中的每一个烯烃封端的引物还包括末端烯烃。末端烯烃是含烯烃的部分62的一部分，其附接到引物序列的5'端或附接到与引物序列的5'端附接的polyT序列或其他连接分子。含烯烃的部分62的一个示例是烯丙基型亚磷酰胺，诸如该部分62可用于产生：
其中是引物序列。
第四示例性试剂盒中的引物流体的载液可以是单独的或与本文阐述的任何中性缓冲液组合的水。引物流体还可包括铜催化剂。烯烃封端的引物32D、34D可以以约0.5μM至约100μM范围的浓度包含在载液中。所选择的浓度可取决于如本文所述的流通池10的架构。
第四示例性试剂盒还包括钌卡宾络合物64。钌卡宾络合物64在交叉复分解反应期间用于接枝烯烃封端的引物32D、34D，并且在交叉复分解反应期间用于在核酸分析之后再生流通池表面(参见图7)。钌卡宾络合物64的示例包括被称为Grubbs催化剂的那些或Grubbs催化剂的衍生物。可以使用本文所阐述的任何示例。
第1代Grubbs催化剂是亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌：
第2代Grubbs催化剂是1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌：
第3代Grubbs催化剂是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)：
第1代Hoveyda-Grubbs催化剂是二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)：
第2代Hoveyda-Grubbs催化剂是[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦基)钌：
Grubbs催化剂的一些衍生物是铵标记的。铵标记的催化剂的示例包括以下1至9：
其中n分别＝0、1和3，以及
并且在结构1至9的任一个结构中：
Grubbs催化剂的其他衍生物是聚(乙二醇)(PEG)拴系的。PEG拴系的催化剂的示例包括以下10至12：
其中在结构10至12的任一个结构中：Mes＝并且Cy＝
在一个示例中，钌卡宾络合物选自由以下项组成的组：亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌(第1代Grubbs催化剂)、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(第2代Hoveyda-Grubbs催化剂)、二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)(第1代Hoveyda-Grubbs催化剂)、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌(第2代Grubbs催化剂)和二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)(第3代Grubbs催化剂)。
第四示例性试剂盒还包括再生流体。再生流体64”的这个示例包括另一烯烃封端的分子，诸如乙烯(呈液体形式)。合适的烯烃封端的分子的其他示例包括：
利用第四示例性试剂盒的方法包括：将多个烯烃封端的分子附接到流通池10的表面上的聚合物水凝胶28的相应叠氮化物官能团上，每个烯烃封端的分子包括末端炔烃官能团以与叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应；在钌卡宾络合物64的存在下引发第一交叉复分解反应，以分别将烯烃封端的引物32D、34D接枝到烯烃封端的分子中的至少一些烯烃封端的分子上；进行涉及所接枝的烯烃封端的引物32D、34D的核酸分析；以及在钌卡宾络合物64的存在下引发第二交叉复分解反应，以裂解所接枝的烯烃封端的引物32D、34D并产生新的烯烃封端的分子。
应当理解，在该方法的这个示例中，该多个烯烃封端的引物32D、34D可替代地预接枝到流通池10。在这些示例中，该方法将包括进行涉及所接枝的烯烃封端的引物32D、34D的核酸分析；以及在钌卡宾络合物64的存在下引发交叉复分解反应，以裂解所接枝的烯烃封端的引物32D、34D并产生新的烯烃封端的分子。
图7所示的示例性方法描绘了附接到聚合物水凝胶28的烯烃封端的分子的再生，该聚合物水凝胶定位在流通池10的图案化结构的突起部24上。流通池10的一个突起部24在图7中的字母A处描绘。应当理解，可以使用本文所公开的任何流通池架构。
在图7所示的方法开始时，接头流体52”例如经由入口引入流通池10中。如以上所提到的，接头流体52”包括烯烃封端的分子，这些烯烃封端的分子还包含末端炔官能团。末端炔官能团经历与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团的点击反应。可允许接头流体52”在流通池10中在约60℃下孵育约30分钟。这将末端烯烃66引入到聚合物水凝胶28中，如图7中字母B处所示。
该示例性方法然后涉及接枝烯烃封端的引物32D、34D。该接枝过程使用交叉复分解反应进行，其中烯烃封端的引物32D、34D的末端烯烃(烯)62和聚合物水凝胶28的末端烯烃(烯)66经历亚烷基转移(transalkylidenation)。两个末端烯烃单元62、66的分子间反应在复分解催化剂诸如钌卡宾络合物64的存在下进行。
在该示例性方法中，接枝通常涉及将钌卡宾络合物64和烯烃封端的引物32D、34D添加到液体载体中以产生混合物，并且将该混合物引入到流通池10中。所使用的液体载体将取决于钌卡宾络合物64。在一个示例中，钌卡宾络合物64是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)；并且引发第一交叉复分解反应涉及将钌卡宾络合物64和烯烃封端的引物32D、34D添加到包含水、叔丁醇和氯化镁的液体载体中，从而产生混合物；并且将混合物引入流通池10中。在另一个示例中，钌卡宾络合物64是二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌，或铵标记的催化剂的任何示例，或聚(乙二醇)拴系的催化剂的任何示例，或亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌；并且引发第一交叉复分解反应涉及将钌卡宾络合物64和烯烃封端的引物32D、34D添加到包含钌卡宾络合物64的溶剂的液体载体中，从而产生混合物；并且将混合物引入流通池10中。合适溶剂的示例包括DMSO、四氢呋喃(THF)或这些溶剂的含水混合物。
在一些示例中，可能期望在将混合物引入流通池10中并引发交叉复分解反应之前，将钌卡宾络合物64在含烯烃封端的引物32D、34D的有机溶剂中孵育。这样可以产生具有附接到其上的烯烃封端的引物的水溶性钌卡宾络合物。该方法对于使另外的非水溶性钌卡宾络合物成为水溶性可能是理想的。在一个示例中，钌卡宾络合物是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)；并且在进行第一交叉复分解反应之前，该方法还包括在含有钌卡宾络合物64的有机溶剂中孵育烯烃封端的引物32D、34D，从而产生具有附接到其上的烯烃封端的引物32D、34D的水溶性钌卡宾络合物64。在该示例中，在第一交叉复分解反应中使用具有附接到其上的烯烃封端的引物的水溶性钌卡宾络合物。在该示例中，有机溶剂可以是四氢呋喃，并且孵育可以在约18℃至约60℃范围的温度下发生10分钟或更短的时间。为了避免或至少减少孵育期间寡核苷酸与寡核苷酸的偶联，可以使用烯烃封端的引物32D、34D、有机溶剂和钌卡宾络合物64的更稀的混合物。
钌卡宾络合物64和烯烃封端的引物32D、34D的混合物或具有附接到其上的烯烃封端的引物的水溶性钌卡宾络合物可以使用流通式沉积引入到流通池10中。接枝可在约55℃至约65℃范围内的温度下进行约20分钟至约35分钟范围内的时间。在一个示例中，接枝在60℃下进行约30分钟。在接枝期间，烯烃封端的引物32D、34D替代聚合物水凝胶28的末端烯烃66，并且对流通池10的间隙区域22或边缘部分30没有亲和力。接枝的引物32D、34D在图7的字母C处示出。
然后可如参考图2所述那样进行核酸分析。模板链40和新生链42在图7中的字母D处示出。
测序后，再生流体46”'例如经由入口引入流通池10中，以裂解接枝的烯烃封端的引物32D、34D(以及与其附接的模板链40和新生链42)并产生新的烯烃封端的分子。再生流体46”'包括可以与烯烃封端的引物32D、34D的末端烯烃(烯烃)62经历交叉复分解反应的另一烯烃封端的分子。可以将钌卡宾络合物64与再生流体46”'一起引入流通池10中以引发该附加交叉复分解反应。该反应沿着聚合物水凝胶28引入新的烯烃封端的分子。
因为在聚合物水凝胶28上存在新的烯烃封端的分子，所以当期望进行另一核酸分析时，可重复该方法。该方法继续进行另一轮引物32D、34D接枝和核酸分析。参考字母B至字母D示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
试剂盒和方法#5
在第五个示例中，该试剂盒包括：流通池，该流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；第一接头流体，该第一接头流体包含烯丙基部分，每个烯丙基部分包含内部氧、硫或硒原子和末端炔，以与叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应；第二接头流体，该第二接头流体包含烯烃封端的分子，每个烯烃封端的分子包含末端叠氮化物官能团；引物流体，该引物流体包含多个含炔引物；钌卡宾络合物；和再生流体，该再生流体包含烯烃封端的分子。该试剂盒可用于图8所示的示例性方法中。
在该示例性试剂盒中，流通池10可以是本文参考图1B至图1D描述的任何示例。用聚合物水凝胶官能化的表面可以是本文所述的图案化或非图案化结构中的任一者，这些结构可包括包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶28的任何示例。
第五示例性试剂盒包括两种接头流体52”'、52””。接头流体52”'、52””用于将烯烃引入聚合物水凝胶28中，该聚合物水凝胶用于裂解和再生，并且用于重新引入用于引物接枝的叠氮化物官能团。第五示例性试剂盒及其使用的方法利用烯烃复分解进行裂解和再生，但避免在烯烃复分解反应中涉及引物32E、34E。
第五示例性试剂盒中的第一接头流体52”'包括烯丙基部分。反应的烯丙基部分在图8中的附图标号68处示出。每个烯丙基部分68包括末端烯烃、内部氧、硫或硒原子和末端炔以与(聚合物水凝胶28的)叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应。氧、硫或硒原子中的每一者在交叉复分解反应中具有反应性。烯丙基部分68的一个示例是：
其中n的范围为1至6，m的范围为4至12，并且X＝氧、硫或硒。
第二接头流体52””包括烯烃封端的分子。每个烯烃封端的分子包括末端烯烃66'并且还包含末端叠氮化物官能团。在一个示例中，第二接头流体52””中的烯烃封端的分子中的每个烯烃封端的分子均具有结构(II)：
其中n的范围为4至10。
接头流体52”'、52””还包括相应的载液，诸如水、水性缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)或缓冲液与DMSO的混合物。烯丙基部分68可以约10nM至约50mM范围内的浓度包含在接头流体52”'的载液中。在另一个示例中，烯丙基部分68可以以约1μM至约1mM范围内的浓度包含在接头流体52”'的载液中。烯烃封端的分子可以以约10nM至约50mM范围的浓度包含在接头流体52””的载液中。在另一示例中，烯烃封端的分子可以以约1μM至约1mM范围内的浓度包含在接头流体52””的载液中。
第五示例性试剂盒包括引物流体的另一示例。第五示例性试剂盒中的引物流体包括在载液中的多个含炔引物32E、34E。含炔引物32E、34E可包括以炔封端的正向和反向扩增引物序列，炔可参与和引入聚合物水凝胶28(例如，在图8中的字母D处)中的叠氮化物官能团的点击反应。引物32E、34E一起使得能够扩增具有与两个不同引物32E、34E互补的末端衔接子的文库模板。
作为示例，含炔引物32E、34E的引物序列可包括P5和P7引物序列；P15和P7引物序列；或本文阐述的PA引物序列、PB引物序列、PC引物序列和PD引物序列的任何组合。
第五示例性试剂盒中的含炔引物32E、34E中的每一个含炔引物还可以包括附接在引物序列的5'端的polyT序列或其他连接分子。在一些示例中，polyT区包含2个T碱基至20个T碱基。作为具体示例，polyT区可包含3、4、5、6、7或10个T碱基。
第五示例性试剂盒中的含炔引物32E、34E中的每一个含炔引物还包括将与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团反应的炔。炔可以是末端炔或内部炔。末端炔是含炔部分38的一部分，诸如己炔，其附接到引物序列的5'端或附接到与引物序列的5'端附接的polyT序列或其他连接分子。内部炔是环状化合物的一部分，其附接到引物序列的5'端或附接到与引物序列的5'端附接的polyT序列或其他连接分子。双环[6.1.0]壬炔(BCN)是可以附接以产生内部炔的一个示例。
第五示例性试剂盒中的引物流体的载液可以是单独的或与本文阐述的任何碱性缓冲液组合的水。含炔引物32E、34E可以以约0.5μM至约100μM范围内的浓度包含在载液中，0.5μM至约25μM的范围特别适用于本文所公开的图案化结构。
第五示例性试剂盒还包括钌卡宾络合物64。本文所述的钌卡宾络合物64的任何示例均可用于第五示例性试剂盒中。在一个示例中，钌卡宾络合物64选自由以下项组成的组：亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌(第1代Grubbs催化剂)、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(第2代Hoveyda-Grubbs催化剂)、二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)(第1代Hoveyda-Grubbs催化剂)、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌(第2代Grubbs催化剂)和二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)(第3代Grubbs催化剂)。
第五示例性试剂盒还包括再生流体46””。第五示例性试剂盒中的再生流体46””包含与第二接头流体52””中所包含的相同类型的烯烃封端的分子。
利用第五示例性试剂盒的方法包括：用烯丙基部分68替代流通池10的表面上的聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团；在钌卡宾络合物64的存在下引发第一交叉复分解反应，以将叠氮化物封端的分子引入至少一些烯丙基部分68中，这些叠氮化物封端的分子包括末端烯烃66'以与烯丙基部分68反应并产生相应的碳-碳双键；将多个含炔引物32E、34E接枝到相应的叠氮化物封端的分子上；进行涉及所接枝的多个含炔引物32E、34E的核酸分析；以及在钌卡宾络合物64的存在下引发第二交叉复分解反应，以向碳-碳双键中的至少一些碳-碳双键处引入新的叠氮化物封端的分子，这些新的叠氮化物封端的分子包括末端烯烃，以与碳-碳双键反应。
应当理解，在该方法的这个示例中，该多个含炔引物32E、34E可替代地预接枝到流通池10。在该示例中，可在接枝期间使用掩蔽。在这些示例中，该方法将包括进行涉及所接枝的多个含炔引物32E、34E的核酸分析；以及在钌卡宾络合物64的存在下引发第二交叉复分解反应，以向碳-碳双键中的至少一些碳-碳双键处引入新的叠氮化物封端的分子，这些新的叠氮化物封端的分子包括末端烯烃，以与碳-碳双键反应。
图8所示的示例性方法描绘了在聚合物水凝胶28上的叠氮化物官能团的再生，该聚合物水凝胶定位在流通池10的非图案化结构的泳道26中。流通池10的一个泳道26在图8中的字母A处描绘。应当理解，可以使用本文所公开的任何流通池架构。
在图8所示的方法开始时，接头流体52”'例如经由入口引入流通池10中。如以上所提到的，接头流体52””包括烯丙基部分68。烯丙基部分68的末端炔与聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应，并因此将末端烯烃(烯丙基)引入聚合物水凝胶中，如图8中的字母B处所示。可允许接头流体52”'在流通池10中在约60℃下或在适于点击反应的其他条件下孵育约30分钟。
该示例性方法然后涉及引入接头流体52””和钌卡宾络合物64。接头流体52””和钌卡宾络合物64可以例如经由入口引入流通池10中。接头流体52””和钌卡宾络合物64引发烯丙基部分68与接头流体52””中烯烃封端的分子的末端烯烃66'之间的交叉复分解反应。在该示例中，烯丙基部分68的末端烯烃(烯)和末端烯烃(烯)66'经历亚烷基转移。所产生的所得碳-碳双键在图8中的字母D处的附图标号70处示出。因为接头流体52””中烯烃封端的分子还包括末端叠氮化物，所以该交叉复分解反应将叠氮化物官能团(N2)引入聚合物水凝胶28中。这也在图8中的字母D处示出。
在该示例性方法中，将钌卡宾络合物64和接头流体52””混合在一起以产生混合物，并将该混合物引入流通池10中。在一个示例中，钌卡宾络合物64是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)；并且引发第一交叉复分解反应涉及添加钌卡宾络合物64和接头流体52””(例如，包括在包括水、叔丁醇和氯化镁的液体载体中的叠氮化物封端的分子)，从而产生混合物；并且将混合物引入流通池10中。在另一个示例中，钌卡宾络合物64是二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌，或铵标记的催化剂的任何示例，或聚(乙二醇)拴系的催化剂的任何示例，或亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌；并且引发第一交叉复分解反应涉及添加钌卡宾络合物64和接头流体52””(例如，包括在包括钌卡宾络合物64的溶剂的液体载体中的叠氮化物封端的分子)，从而产生混合物；并且将混合物引入流通池10中。
该示例性方法然后涉及将含炔引物32E、34E接枝到聚合物水凝胶28的至少一些叠氮化物官能团上。为了接枝，将第五示例性试剂盒的引物流体引入流通池10中。引物流体可以使用流通式沉积引入。接枝可在约55℃至约65℃范围内的温度下进行约20分钟至约35分钟范围内的时间，或在点击反应的任何其他合适的条件下进行。在一个示例中，接枝在60℃下进行约30分钟。在接枝期间，含炔引物32B、34B附接到聚合物水凝胶28的至少一些叠氮化物官能团上，并且对流通池10的间隙区域22或边缘部分30没有亲和力。接枝的引物32E、34E在图8的字母E处示出。
然后可如参考图2所述那样进行核酸分析。模板链40和新生链42在图8中的字母F处示出。
测序后，再生流体46””和钌卡宾络合物64例如经由入口引入流通池10中，以引发第二交叉复分解反应。第二交叉复分解反应从聚合物水凝胶28裂解引物32E、34E(和链40、42)，并且将新的叠氮化物官能团(存在于再生流体46””中)引入聚合物水凝胶28引中。再生流体46””包括烯烃封端的分子，每个烯烃封端的分子包括末端烯烃66'和末端叠氮化物官能团。第二交叉复分解反应发生在水凝胶结合的烯烃(即，碳-碳双键)70与再生流体46””中烯烃封端的分子的末端烯烃66'之间。因为再生流体46””中烯烃封端的分子包括末端叠氮化物，所以该交叉复分解反应将新的叠氮化物官能团引入聚合物水凝胶28中。这在图8中的字母D处示出。
因为在聚合物水凝胶28上存在新的叠氮化物官能团，所以当期望进行另一核酸分析时，可重复该方法。该方法继续进行另一轮引物32E、34E接枝和核酸分析。参考字母D至字母F示出和描述的过程可以根据需要重复以进行多次核酸分析。
同时配对的末端读段引物组
参考图2至图8描述的引物32A、34A至32E、34E中的每一个引物都能够进行连续的配对末端读段核酸分析。在该方法中，将产生的相应正向链测序并移除，然后将产生的相应反向链测序并移除。
本文所公开的任何引物流体中的引物32A、34A至32E、34E可以用引物组80、82(参见图9)替代，这使得能够进行同时的配对末端读段核酸分析。引物组80、82使得能够在聚合物水凝胶28的一个区域A中生成正向链的簇，并且在聚合物水凝胶28的另一个区域B中生成反向链的簇。如本文所述，控制引物组80、82，使得裂解(线性化)化学物质在不同的聚合物水凝胶区域28A和28B处是正交的。更具体地，引物组80、82是相关的，其中一组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物，并且另一组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物。虽然引物组80、82的不可裂解的第一引物和第二引物在簇的线性化期间是不可裂解的，但是这些引物可以包括氨基可裂解基团36、可酶促裂解的基团56、可化学裂解或可酶促裂解的基团60、60'或含烯烃部分62，其使得它们能够被裂解或参与用于根据本文阐述的示例的流通池表面再生的交叉复分解反应。
第一引物组80包括不可裂解的第一引物84和可裂解的第二引物86；并且第二引物组82包括可裂解的第一引物88和不可裂解的第二引物90。
不可裂解的第一引物84和可裂解的第二引物86是寡核苷酸对，例如，其中不可裂解的第一引物84是正向扩增引物，而可裂解的第二引物86是反向扩增引物，或者其中可裂解的第二引物86是正向扩增引物，而不可裂解的第一引物84是反向扩增引物。在第一引物组80中，可裂解的第二引物86包括裂解位点92，而不可裂解的第一引物84不包括裂解位点92。
可裂解的第一引物88和不可裂解的第二引物90也是寡核苷酸对，例如，其中可裂解的第一引物88是正向扩增引物，而不可裂解的第二引物90是反向扩增引物，或者其中不可裂解的第二引物90是正向扩增引物，而可裂解的第一引物88是反向扩增引物。在第二引物组82中，可裂解的第一引物88包括裂解位点92'或94，而不可裂解的第二引物90不包括裂解位点92'或44。
应当理解，第一引物组80的不可裂解的第一引物84和第二引物组82的可裂解的第一引物88具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是正向扩增引物)，不同的是可裂解的第一引物88包括整合到引物序列中或整合到与引物序列附接的连接分子中的裂解位点92'或94。类似地，第一引物组80的可裂解的第二引物86和第二引物组82的不可裂解的第二引物90具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是反向扩增引物)，不同的是可裂解的第二引物86包括整合到引物序列中或整合到与引物序列附接的连接分子中的裂解位点92。
应当理解，当第一引物或84和88是正向扩增引物时，第二引物86和90是反向引物，反之亦然。
不可裂解引物84、90可以是具有用于捕获和/或扩增目的的通用序列的任何引物序列，诸如P5和P7引物、P15和P7引物，或PA、PD、PC、PD引物的任何组合(例如，PA和PB或PA和PD等)，没有裂解位点92、92'、94(例如，在本文阐述的一些序列中的“n”)。在一些示例中，P5引物和P7引物是不可裂解引物84、90，因为它们不包括裂解位点92、92'、94。应当理解，任何合适的通用序列均可以用作不可裂解引物或84、90。
可裂解引物86、88的示例包括P5和P7引物、P15和P7引物或其他通用序列引物(例如，PA、PB、PC、PD引物)，其中相应的裂解位点92、92'、94(例如，本文阐述的一些序列中的“n”)掺入到引物序列中或掺入到与引物序列附接的连接分子中。合适的裂解位点92、92'、94的示例包括如本文所述的可酶促裂解的核碱基或可化学裂解的核碱基、修饰的核碱基或接头(例如，在核碱基之间)，只要裂解位点92和92'或94彼此正交并且与引物组80、82中包括的任何其他可裂解部分(例如，30、56、60、60')正交。
每个引物组80和82与聚合物水凝胶28的相应区域A或B附接。区域28A和28B在化学上是相同的，并且可以使用合适的技术将引物组80、82依序固定到期望的区域28A和28B。可替代地，可将引物组80、82预接枝到不同批次的聚合物水凝胶28上并沉积以形成期望的区域28A和28B。
引物组80和82的引物84、86和88、90例如通过本文所述的含炔部分38或含烯烃部分62附接至区域28A和28B。如图2至图8的示例中所述，聚合物水凝胶28具有可固定引物84、86和88、90的5'端处的末端基团的表面基团。
如本文所述，例如，关于引物32A、34A和序列中标记为“n”的裂解位点，可裂解引物86、88中每一个可裂解引物的裂解位点92、92'、94掺入引物序列中。
在一个示例中，相同类型的裂解位点92、92'用于相应引物组80、82的可裂解引物86、88中。作为一个示例，裂解位点92、92'是尿嘧啶碱基，并且可裂解引物86、88是P5U和P7U。尿嘧啶碱基或其他裂解位点也可掺入PA、PB、PC和PD引物中的任一个引物中以产生可裂解引物86、88。在该示例中，寡核苷酸对84、86的不可裂解引物84可以是P7(没有序列中示出的裂解位点“n”)，并且寡核苷酸对88、90的不可裂解引物90可以是P5(没有序列中示出的裂解位点“n”)。因此，在该示例中，第一引物组80包括P7、P5U，并且第二引物组82包括P5、P7U。引物组80、82具有相反的线性化化学物质，其在扩增、簇生成和线性化之后，允许在一个聚合物水凝胶区域28A上形成正向模板链，并且在另一个聚合物水凝胶区域28B上形成反向链。
在另一个示例中，不同类型的裂解位点92、94用于相应引物组80、82的可裂解引物86、88中。例如，可使用两种不同的酶促裂解位点，可使用两种不同的化学裂解位点，或者可使用一种酶促裂解位点和一种化学裂解位点作为线性化裂解位点92、94。可以在相应可裂解引物86、88中使用的不同裂解位点92、94的示例包括以下的任何组合：邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤。
虽然图9中未示出，但引物组80、82中的所有引物还包括32A、34A、或32B、34B、或32C、34C、或32D、34D、或32E、34E的相应引物的氨基可裂解基团36和含炔部分38，或可酶促裂解的基团56和含炔部分38，或可化学裂解的或可酶促裂解的基团60、60'和含炔部分38，或含烯烃的部分62，或含炔部分38。因此，引物组80、82中的引物可以参与再生流通池表面的裂解或交叉复分解反应。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作实施例
实施例1
使用包括8个泳道的图案化流通池，每个泳道具有限定在其中的凹入部。每个凹入部在其中具有聚合物水凝胶PAZAM。最初将BCN封端的引物(BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7)接枝到至少一些凹入部中的PAZAM的至少一些叠氮化物官能团上。泳道1-泳道4中的引物不暴露于外切核酸酶I或含膦的裂解混合物。相反，泳道5-泳道8中的引物暴露于外切核酸酶I和含膦的裂解混合物以便消化引物并将未反应的叠氮化物还原为胺。
然后进行Cal Fluor Red(CFR)测定以确定来自泳道5-泳道8的引物的消化是否成功。在CFR测定期间，将流通池的所有泳道暴露于缓冲溶液中的荧光标记的(CAL 红(CFR)染料)寡核苷酸。这些寡核苷酸与最初接枝的BCN封端的引物互补。荧光标记的互补寡核苷酸与表面结合的引物结合，并且过量的CFR标记的互补寡核苷酸被洗掉。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的CFR强度。流通池的荧光扫描仪图像在图10A中有描述。如图所示，在泳道1-泳道4中检测到荧光信号，而在泳道5-泳道8中没有检测到信号。图10A中的结果证明最初接枝的引物从泳道5-泳道8中移除。
然后尝试在一些泳道中再接枝BCN封端的引物。在一些泳道(5、6和8)中，尝试叠氮化物再生，随后进行BCN封端的引物接枝。在另一泳道(7)中，尝试BCN封端的引物接枝，而不是先尝试叠氮化物再生。在泳道1-泳道4中没有进行叠氮化物再生，因为这些泳道没有暴露于含膦的裂解混合物，膦将叠氮化物还原为胺。每个泳道中使用的再接枝条件如表1所示。
表1
| 泳道 | 叠氮化物再生 | 再接枝 |
| 1 | 否 | 否 |
| 2 | 否 | 否 |
| 3 | 否 | BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7 |
| 4 | 否 | BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7 |
| 5 | 叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯 | BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7 |
| 6 | 叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯 | BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7 |
| 7 | 否 | BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7 |
| 8 | 叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯 | BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7 |
对于叠氮化物再生，将10mM叠氮基-PEG水溶液引入到泳道5、泳道6和泳道8中并允许在约25℃下孵育约30分钟。泳道1-泳道4和泳道7没有暴露于该处理。然后将每个泳道暴露于洗涤溶液。
然后，将含有10μM BCN封端的引物的引物流体引入泳道3-泳道8中。使引物流体在60℃下孵育约2小时。
然后重复Cal Fluor Red(CFR)测定以确定泳道3-泳道8的引物再接枝是否成功。流通池在再接枝后的荧光扫描仪图像在图10B中有描述。泳道3和泳道4的结果指示，确实发生了额外的引物接枝到表面叠氮化物(由于裂解混合物暴露而尚未还原成胺)上。泳道5、泳道6和泳道8中的结果指示叠氮化物再生和引物接枝是成功的。泳道7中缺乏荧光信号指示裂解混合物确实将叠氮化物还原为胺，并且需要叠氮化物再生以便对引物进行再接枝。
引入文库片段(来自PhiX基因组)并使用桥式扩增进行成簇。然后对流通池进行第一次测序运行。
收集的测序数据包括荧光强度、通过过滤(％PF)(百分比)和大于Q30的质量评分(Qscores)百分比。通过过滤(PF)是用于描述通过纯度(chastity)阈值并用于对测序数据进行进一步处理和分析的簇的度量。％PF计算涉及将纯度过滤器应用于每个簇。“纯度”定义为最亮的碱基信号强度除以最亮的和第二亮的碱基信号强度之和的比值。如果在前25个循环中不超过1个碱基检出具有低于0.6的纯度值，则簇“通过过滤”。该过滤过程从图像分析结果中移除最不可靠的簇。因此，较高的通过过滤％结果指示用于测序数据的独特簇的增加的产率。30的质量评分(Q30)相当于1000次中出现错误碱基检出1次的概率。这意味着碱基检出准确度(即，正确碱基检出的概率)为99.9％。99％的较低碱基检出准确度(Q20)将具有100次中出现错误碱基检出1次的概率，这意味着每100个碱基对测序读段将可能包含一个错误。当测序质量达到Q30时，几乎所有的读段都将是完美的，准确度为99.9％。
来自泳道2(阳性对照)、泳道5(成功再生和再接枝)和泳道7(阴性对照)的第一次测序运行的测序数据再现在表2中。
表2-第一次测序运行
| 泳道 | 强度 | 簇PF(％) | ％>＝Q30 |
| 2 | 258±18 | 82.93±1.71 | 92.96 |
| 5 | 530±57 | 75.54±1.84 | 93.01 |
| 7 | 4±5 | 0.00±0.00 | 0.00 |
测序后，通过暴露于脱氧核糖核酸酶(以移除成簇的DNA)，然后暴露于外切核酸酶I(以移除单链DNA和剩余引物)来移除泳道2-泳道8中的引物，并且如本实施例所述进行叠氮化物生成和另一轮引物接枝。
再次引入文库片段(来自PhiX基因组)并使用桥式扩增进行成簇。然后对流通池进行第二次测序运行。在第二次测序运行中收集与第一次测序运行相同的测序数据。来自泳道2(阳性对照)、泳道5(成功再生和再接枝)和泳道7(阴性对照)的第二次测序运行的数据再现在表3中。
表3-第二次测序运行
| 泳道 | 强度 | 簇PF(％) | ％>＝Q30 |
| 2 | 362±43 | 76.60±7.18 | 94.73 |
| 5 | 329±38 | 76.96±7.39 | 95.13 |
| 7 | 402±37 | 79.16±6.74 | 95.25 |
这些结果说明在引物移除、叠氮化物再生和引物再接枝后可成功地进行测序。
实施例2
使用包括8个泳道的图案化流通池，每个泳道具有限定在其中的凹入部。每个凹入部在其中具有聚合物水凝胶PAZAM。
泳道1和泳道8是包括与PAZAM的叠氮化物基团附接的P5/P7引物的对照泳道。泳道1不暴露于引物移除或再接枝，而泳道8暴露于P5/P7引物移除和再接枝。
在泳道2-泳道7中将不同的四嗪分子引入PAZAM中。BCN封端的引物(BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7)最初接枝到至少一些四嗪分子上。在泳道2、泳道4、泳道6和泳道8中进行引物移除。在泳道2-泳道7中进行引物再接枝。引物移除后进行：i)另外的四嗪分子的引入和另一轮引物接枝(泳道2、泳道4、泳道6、泳道8)或ii)另一轮引物接枝，而不先引入另外的四嗪分子(泳道3、泳道5和泳道7)。
在引物接枝、引物移除和尝试引物再接枝后，进行TET(TETTM染料亚磷酰胺)质量控制(QC)测定以确定相应过程是否成功。在TET QC测定期间，将流通池的所有泳道暴露于缓冲溶液中的荧光标记的(TETTM染料亚磷酰胺)寡核苷酸。这些寡核苷酸与接枝的P5/P7和BCN封端的引物互补。荧光标记的互补寡核苷酸与表面结合的引物结合，并且过量的TET标记的互补寡核苷酸被洗掉。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的TET强度。荧光标记的互补寡核苷酸在成像后使用0.1M NaOH去杂交。
表4A和表4B描绘了在流通池的每个泳道中进行的一系列步骤。以下缩写用于表4A和表4B中：MT-S-NHSE＝甲基四嗪-磺基-NHS酯；MT-PEG-NHS-E＝甲基四嗪-PEG4-NHS酯；S-6-MT-DBCO＝磺基-6-甲基-四嗪-DBCO；Exo I＝外切核酸酶I；以及DNA酶＝脱氧核糖核酸酶。
表4A-泳道2-泳道7
表4B-泳道1和泳道8
图11A、图11B和图11C中分别描绘了初始引物接枝过程之后、引物移除之后和引物再接枝过程之后流通池的荧光扫描仪图像。如图所示，在引物接枝之后(图11A)和再接枝之后(图11C)在所有泳道1-泳道8中都检测到荧光信号，而在引物移除之后(图11B)在泳道2、泳道4、泳道6和泳道8中几乎没有检测到信号。初始引物接枝过程之后、引物移除之后和引物再接枝过程之后的TET QC测定的相应定量结果示于图12中。
结果说明在泳道2、泳道4、泳道6和8的每一个泳道中引物移除和再接枝是成功的。泳道3、泳道5和泳道7的结果(其中在进行另外的引物接枝之前没有进行引物移除)指示，新的引物可以接枝到在先前接枝过程中尚未接枝的四嗪分子上。
引入文库片段(来自PhiX基因组)并使用桥式扩增进行成簇。然后对流通池进行第一次测序运行。
收集的测序数据包括荧光强度、通过过滤(％PF)(百分比)和大于Q30的质量评分(Qscores)百分比。
来自泳道1和8(对照)以及泳道2、泳道4和泳道6(成功再接枝)的第一次测序运行的测序数据再现在表5中。
表5-第一次测序运行
| 泳道 | 强度 | 簇PF(％) | ％>＝Q30 |
| 1 | 298±16 | 79.57±7.09 | 94.10 |
| 2 | 250±18 | 69.70±6.53 | 85.68 |
| 4 | 284±21 | 69.54±5.14 | 85.46 |
| 6 | 362±43 | 63.78±11.39 | 82.98 |
| 8 | 246±21 | 78.82±5.98 | 93.31 |
这些结果说明在引物移除和再接枝后可成功地进行测序。
实施例3
使用包括8个泳道的图案化流通池，每个泳道具有限定在其中的凹入部。每个凹入部在其中具有聚合物水凝胶PAZAM。
在泳道1-泳道8中将不同的四嗪分子引入PAZAM中。BCN封端的引物(BCN可裂解的P5和BCN不可裂解的P7)最初接枝到每个泳道中的至少一些四嗪分子上。在泳道4和泳道5中进行引物移除。引物移除后进行：i)另外的四嗪分子的引入和另一轮引物接枝(泳道4)或ii)另一轮引物接枝(泳道5)。
在引物接枝、引物移除和尝试引物再接枝后，如实施例2所述进行TET质量控制(QC)测定。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的TET强度。荧光标记的互补寡核苷酸在成像后使用0.1M NaOH去杂交。
表6A和表6B描绘了在流通池的每个泳道中进行的一系列步骤。以下缩写用于表5A和表5B中：MT-S-NHSE＝甲基四嗪-磺基-NHS酯；MT-PEG-NHS-E＝甲基四嗪-PEG4-NHS酯；S-6-MT-DBCO＝磺基-6-甲基-四嗪-DBCO；Exo I＝外切核酸酶I；以及DNA酶＝脱氧核糖核酸酶。
表6A-泳道1-泳道5
表6B-泳道6-泳道8
图13A、图13B和图13C中分别描绘了初始引物接枝过程之后、引物移除之后和引物再接枝过程之后流通池的荧光扫描仪图像。如图所示，在引物接枝之后(图13A)和再接枝之后(图13C)在所有泳道1-泳道8中都检测到荧光信号，而在引物移除之后(图13B)在泳道4和泳道5中几乎没有检测到信号。初始引物接枝过程之后、引物移除之后(在泳道4和泳道5中)和引物再接枝过程之后的TET QC测定的相应定量结果示于图14中。
结果说明在泳道4和泳道5中引物移除和再接枝是成功的。泳道5的结果(其中在引物移除后没有进行另外的四嗪偶联)也指示新的引物可以接枝到在先前接枝过程中尚未接枝的四嗪分子上。
附加说明
应当理解，本文所阐述示例的任何特征均能够以任何期望的方式组合在一起，以实现本公开中描述的益处，包括例如获得流通池。
还应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
序列表
<110> 因美纳有限公司（Illumina, Inc.）
因美纳剑桥有限公司（Illumina Cambridge Limited）
<120> 流通池
<130> IP-2151-PCT
<150> 63/218,091
<151> 2021-07-02
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (23)..(23)
<223> 尿嘧啶或烯烃-胸苷
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga ganctacac 29
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> 8-氧代鸟嘌呤
<400> 2
caagcagaag acggcatacg anat 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (20)..(20)
<223> 8-氧代鸟嘌呤
<400> 3
caagcagaag acggcatacn agat 24
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (23)..(23)
<223> 烯丙基-T
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga ganctacac 29
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
gctggcacgt ccgaacgctt cgttaatccg ttgag 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
ctcaacggat taacgaagcg ttcggacgtg ccagc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
cgtcgtctgc catggcgctt cggtggatat gaact 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
agttcatatc caccgaagcg ccatggcaga cgacg 35
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
acggccgcta atatcaacgc gtcgaatccg caact 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
agttgcggat tcgacgcgtt gatattagcg gccgt 35
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
gccgcgttac gttagccgga ctattcgatg cagc 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
gctgcatcga atagtccggc taacgtaacg cggc 34
Claims (44)
1.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团或胺官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；
引物流体，所述引物流体包括多个含炔引物，每个含炔引物具有氨基可裂解基团，所述氨基可裂解基团将所述含炔引物的引物序列附接至所述含炔引物的含炔部分；和
裂解流体，所述裂解流体与所述氨基可裂解基团具有反应性。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述多个含炔引物中的每一个含炔引物的所述氨基可裂解基团选自由邻苯二甲酰亚胺基团、BOC酰胺和三苯基甲胺组成的组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中：
所述氨基可裂解基团是邻苯二甲酰亚胺基团；并且
所述裂解流体为肼或甲基肼。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中：
所述氨基可裂解基团是所述BOC酰胺或所述三苯基甲胺；并且
所述裂解流体是酸。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述流通池的所述表面是非图案化的，并且所述聚合物水凝胶位于所述非图案化表面的泳道内。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述流通池的所述表面被由间隙区域分开的凹入部图案化，并且所述聚合物水凝胶位于所述图案化表面的每个凹入部内。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述流通池的所述表面被由间隙区域分开的突起部图案化，并且所述聚合物水凝胶位于所述图案化表面的每个突起部上。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括再生流体，所述再生流体包含i)选自由以下项组成的组的叠氮化物封端的分子：叠氮基-PEG4-C2-羧酸、三氟甲磺酰叠氮化物、咪唑鎓磺酰叠氮化物盐酸盐、1-(氟磺酰基)-2,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓三氟甲磺酸盐、氟磺酰基叠氮化物、全氟丁磺酰叠氮化物、叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯和咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐，或ii)选自由以下项组成的组的四嗪封端的分子：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括接头流体，所述接头流体包括以下的一者：
与所述流通池的所述胺官能团反应的四嗪分子，所述四嗪分子选自由以下项组成的组：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-PEGn-N-羟基琥珀酰亚胺酯，其中n＝4或5或8；或
与所述流通池的所述叠氮化物官能团反应的四嗪分子，所述四嗪分子是磺基-6-甲基-四嗪-二苯并环辛炔。
10.一种方法，所述方法包括：
将多个含炔引物接枝到流通池的表面上的聚合物水凝胶的相应叠氮化物官能团或四嗪官能团，所述多个含炔引物中的每一个含炔引物都具有氨基可裂解基团，所述氨基可裂解基团将所述含炔引物的引物序列附接至所述含炔引物的含炔部分；
进行涉及所接枝的多个含炔引物的核酸分析；
引入裂解流体以在所述氨基可裂解基团处裂解所接枝的多个含炔引物，从而在所述流通池的所述表面留下多个胺官能团；以及
使相应叠氮化物封端的分子或四嗪封端的分子与所述多个胺官能团中的至少一些胺官能团反应以将新的叠氮化物官能团或新的四嗪官能团引入到流通池的所述表面。
11.根据权利要求10所述的方法，其中进行所述核酸分析涉及：
将包含多条模板核酸链的样品引入所述流通池中，由此所述多条模板核酸链中的至少一些模板核酸链分别与所接枝的多个含炔引物中的至少一些含炔引物的所述引物序列杂交；以及
进行边合成边测序。
12.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述叠氮化物封端的分子选自由以下项组成的组：叠氮基-PEG4-C2-羧酸、三氟甲磺酰叠氮化物、咪唑鎓磺酰叠氮化物盐酸盐、1-(氟磺酰基)-2,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓三氟甲磺酸盐、氟磺酰基叠氮化物、全氟丁磺酰叠氮化物、叠氮基-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯和咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐；或者
所述四嗪封端的分子选自由以下项组成的组：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-6-甲基-四嗪-
二苯并环辛炔和甲基四嗪-PEGn-N-羟基琥珀酰亚胺酯，其中n＝4或5或8。
13.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述流通池包含所述叠氮化物官能团；
所述叠氮化物官能团中的一些叠氮化物官能团在接枝后保持游离；
所述游离的叠氮化物官能团在所述核酸分析期间被还原成胺基；并且
所述叠氮化物封端的分子中的至少一些叠氮化物封端的分子与所述多个胺官能团中的至少一些胺官能团反应，并且所述叠氮化物封端的分子中的至少一些其他叠氮化物封端的分子与所述胺基反应。
14.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述氨基可裂解基团是邻苯二甲酰亚胺基团；并且
所述裂解流体包含肼或甲基肼。
15.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述氨基可裂解基团是BOC酰胺或三苯基甲胺；并且
所述裂解流体包含酸。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；
接头流体，所述接头流体包含烯烃封端的分子，每个烯烃封端的分子包含末端炔官能团以与所述叠氮化物官能团中相应一个叠氮化物官能团反应；
引物流体，所述引物流体包含多个烯烃封端的引物；
钌卡宾络合物；和
再生流体，所述再生流体包含其他烯烃封端的分子。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述烯烃封端的分子中的每一个烯烃封端的分子具有结构(I)：
其中n的范围为1至6，并且m的范围为4至12。
18.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述钌卡宾络合物选自由以下项组成的组：亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌、二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌和二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)。
19.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述流通池的所述表面是非图案化的，并且所述聚合物水凝胶位于所述非图案化表面的泳道内。
20.根据权利要求16所述的试剂盒，其中满足以下项中的一项：
所述流通池的所述表面被由间隙区域分开的凹入部图案化，并且所述聚合物水凝胶位于所述图案化表面的每个凹入部内；或者
所述流通池的所述表面被由间隙区域分开的突起部图案化，并且所述聚合物水凝胶位于所述图案化表面的每个突起部上。
21.一种方法，所述方法包括：
将多个烯烃封端的分子附接到流通池的表面上的聚合物水凝胶的相应叠氮化物官能团上，每个烯烃封端的分子包含末端炔烃官能团以与所述叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应；
在钌卡宾络合物的存在下引发第一交叉复分解反应，以分别将烯烃封端的引物接枝到所述烯烃封端的分子中的至少一些烯烃封端的分子上；
进行涉及所接枝的烯烃封端的引物的核酸分析；以及
在所述钌卡宾络合物的存在下引发第二交叉复分解反应，以裂解所接枝的烯烃封端的引物并产生新的烯烃封端的分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述钌卡宾络合物是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)；并且
引发所述第一交叉复分解反应涉及：
将所述钌卡宾络合物和所述烯烃封端的引物添加到包含水、叔丁醇和氯化镁的液体载体中，从而产生混合物；以及
将所述混合物引入所述流通池中。
23.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述钌卡宾络合物是二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌或铵标记的催化剂或聚(乙二醇)拴系的催化剂，或亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌；并且
引发所述第一交叉复分解反应涉及：
将所述钌卡宾络合物和所述烯烃封端的引物添加到包含所述钌卡宾络合物的溶剂的液体载体中，从而产生混合物；以及
将所述混合物引入所述流通池中。
24.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述钌卡宾络合物是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)；
在进行所述第一交叉复分解反应之前，所述方法还包括在含有所述钌卡宾络合物的有机溶剂中孵育所述烯烃封端的引物，从而产生具有附接到其上的所述烯烃封端的引物的水溶性钌卡宾络合物；并且
在所述第一交叉复分解反应中使用具有附接到其上的所述烯烃封端的引物的所述水溶性钌卡宾络合物。
25.根据权利要求21所述的方法，其中进行所述核酸分析涉及：
将包含多条模板核酸链的样品引入所述流通池中，由此所述多条模板核酸链中的至少一些模板核酸链分别与所接枝的烯烃封端的引物中的至少一些烯烃封端的引物的引物序列杂交；以及
进行边合成边测序。
26.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；
第一接头流体，所述第一接头流体包含烯丙基部分，每个烯丙基部分包含内部氧、硫或硒原子和末端炔，以与所述叠氮化物官能团中的相应一个叠氮化物官能团反应；
第二接头流体，所述第二接头流体包含烯烃封端的分子，每个烯烃封端的分子包含末端叠氮化物官能团；
引物流体，所述引物流体包含多个含炔引物；
钌卡宾络合物；和
再生流体，所述再生流体包含所述烯烃封端的分子。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述钌卡宾络合物选自由以下项组成的组：亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌、二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)、[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌和二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)。
28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述烯烃封端的分子中的每一个烯烃封端的分子具有结构(II)：
其中n的范围为4至10。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述流通池的所述表面是非图案化的，并且所述聚合物水凝胶位于所述非图案化表面的泳道内。
30.根据权利要求26所述的试剂盒，其中满足以下项中的一项：
所述流通池的所述表面被由间隙区域分开的凹入部图案化，并且所述聚合物水凝胶位于所述图案化表面的每个凹入部内；或者
所述流通池的所述表面被由间隙区域分开的突起部图案化，并且所述聚合物水凝胶位于所述图案化表面的每个突起部上。
31.一种方法，所述方法包括：
用烯丙基部分替代流通池的表面上的聚合物水凝胶的叠氮化物官能团；
在钌卡宾络合物的存在下引发第一交叉复分解反应，以在所述烯丙基部分中的至少一些烯丙基部分处引入叠氮化物封端的分子，所述叠氮化物封端的分子包括末端烯烃，以与所述烯丙基部分反应并且产生相应的碳-碳双键；
将多个含炔引物接枝到相应叠氮化物封端的分子上；
进行涉及所接枝的多个含炔引物的核酸分析；以及
在钌卡宾络合物的存在下引发第二交叉复分解反应，以在所述碳-碳双键中的至少一些碳-碳双键处引入新的叠氮化物封端的分子，所述新的叠氮化物封端的分子包括末端烯烃，以与所述碳-碳双键反应。
32.根据权利要求31所述的方法，其中：
所述钌卡宾络合物是二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)双(3-溴吡啶)钌(II)；并且
引发所述第一交叉复分解反应涉及：
将所述钌卡宾络合物和所述叠氮化物封端的分子添加到包含水、叔丁醇和氯化镁的液体载体中，从而产生混合物；以及
将所述混合物引入所述流通池中。
33.根据权利要求31所述的方法，其中：
所述钌卡宾络合物是二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(II)或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(邻-异丙氧基苯基亚甲基)钌或铵标记的催化剂或聚(乙二醇)拴系的催化剂，或亚苄基-双(三环己基膦)-二氯化钌或[1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基]二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌；并且
引发所述第一交叉复分解反应涉及：
将所述钌卡宾络合物和所述叠氮化物封端的分子添加到包含所述钌卡宾络合物的溶剂的液体载体中，从而产生混合物；以及
将所述混合物引入所述流通池中。
34.根据权利要求31所述的方法，其中进行所述核酸分析涉及：
将包含多条模板核酸链的样品引入所述流通池中，由此所述多条模板核酸链中的至少一些模板核酸链分别与所接枝的多个含炔引物中的至少一些含炔引物的引物序列杂交；以及
进行边合成边测序。
35.根据权利要求31所述的方法，其中：
所述叠氮化物封端的分子的一些叠氮化物官能团在接枝后保持游离；
所述游离的叠氮化物官能团在所述核酸分析期间被还原成胺官能团；并且
在所述第二交叉复分解反应期间移除所述胺官能团。
36.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；
表面制备试剂盒，所述表面制备试剂盒选自由以下项组成的组：
i)接头流体，所述接头流体包含四嗪封端的分子以与所述叠氮化物官能团反应；和
ii)叠氮化物还原剂，所述叠氮化物还原剂用于将所述叠氮化物官能团还原为胺官能团；和
第二接头流体，所述接头流体包含四嗪封端的分子以与所述胺官能团反应；
引物流体，所述引物流体包含多个含炔引物；和
酶促裂解流体，所述酶促裂解流体包含酶促消化单链脱氧核糖核酸的物质。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中：
所述接头流体中的所述四嗪封端的分子是磺基-6-甲基-四嗪-二苯并环辛炔；或者
所述第二接头流体中的所述四嗪封端的分子选自由以下项组成的组：四嗪-N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基四嗪-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基四嗪-PEGn-N-羟基琥珀酰亚胺酯，其中n＝4或5或8。
38.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述含炔引物是双环壬炔封端的引物，并且所述含炔引物包括选自由可酶促裂解的核碱基和磷酸二酯键组成的组的可酶促裂解的基团。
39.一种方法，所述方法包括：
将多个引物接枝到流通池的表面上的聚合物水凝胶的相应四嗪官能团上，所述多个引物中的每一个引物具有可酶促裂解的基团；
进行涉及所接枝的多个引物的核酸分析；
酶促裂解所接枝的多个引物；以及
将第二多个引物接枝到所述聚合物水凝胶的残留的相应四嗪官能团上。
40.根据权利要求39所述的方法，其中在接枝之前，所述方法还包括：
将所述聚合物水凝胶的叠氮化物官能团还原成胺官能团；以及
使四嗪封端的分子与所述胺官能团反应，从而将所述四嗪官能团引入到所述聚合物水凝胶中。
41.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括至少一个用包含叠氮化物官能团的聚合物水凝胶官能化的表面；
引物流体，所述引物流体包含多个含炔引物，每个含炔引物具有可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团；
裂解流体，所述裂解流体包含与所述可化学裂解的基团或所述可酶促裂解的基团具有反应性的物质；和
再生流体，所述再生流体包含胺氧化剂。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述再生流体包含咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐。
43.一种方法，所述方法包括：
将多个引物接枝到流通池的表面上的聚合物水凝胶的相应叠氮化物官能团上，所述多个引物中的每一个引物具有可化学裂解的基团或可酶促裂解的基团；
进行涉及所接枝的多个引物的核酸分析，由此将游离的叠氮化物官能团还原成胺基；
裂解所接枝的多个引物；以及
将所述聚合物水凝胶暴露于再生流体，从而从所述胺基再生所述叠氮化物官能团。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述再生流体包含咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐。
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