TWI721450B - 流動池、包含流動池之套組、製備流動池之方法及製備用於核酸定序之結構之方法 - Google Patents

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Abstract

流動池的實例包括：底材；第一引子組，所述第一引子組被附接至在所述底材上的第一區域，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；和第二引子組，所述第二引子組被附接至在所述底材上的第二區域，所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。

Description

流動池、包含流動池之套組、製備流動池之方法及製備用於核酸定序之結構之方法
相關申請的交叉引用
本申請案主張2018年6月29日提申的美國臨時申請案系列號62/692,511和2018年10月9日提申的美國臨時申請系列號62/743,373的權益，所述臨時申請案的每一項的內容通過引用以其整體併入本文。
對序列表的引用
經由EFS-Web隨附提交的序列表通過引用以其整體特此併入。文件名為ILI172APCT_IP-1806-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，文件大小為551位元組，並且文件的創建日期為2019年5月20日。
用於對核酸定序的一些可用的平臺利用以合成定序方法。利用該方法，合成新生股，並且以光學和/或電學方式偵測每種單體(例如核苷酸)向生長的股的添加。因為模版股指導新生股的合成，技術人員可以從在合成期間添 加到生長的股的一系列核苷酸單體推斷出模版DNA的序列。在一些實例中，可以使用配對末端定序，其中正向股被定序和去除，並且然後反向股被構建和定序。
本文揭露的第一方面是流動池，所述流動池包括：底材；第一引子組，其被附接至在所述底材上的第一區域，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；和第二引子組，其被附接至在所述底材上的第二區域，所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
在所述第一方面的一個實例中，所述第一區域包含具有第一官能基的材料；並且所述第二區域包含具有不同於所述第一官能基的第二官能基的材料。
在所述第一方面的一個實例中，所述流動池還包括分隔所述第一引子組與所述第二引子組的空隙(gap)。
在所述第一方面的一個實例中，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷(depression)；並且各個所述凹陷包括：位於第一部分的所述第一區域；和位於第二部分的所述第二區域。在該實例的一個版本中，所述流動池還可以包括分隔所述第一區域與所述第二區域的空隙。在該實例的另一個版本中，所述第一區域和所述第二區域部分地重疊。在該實例的仍另一個版本中，所述第一部分和所述第二部分具有不同的深度。在該實例的另外的版本中，所述第一區域和所述第二區域是嵌段共聚物的不同嵌段。
在所述第一方面的一個實例中，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；各個所述凹陷包括所述第一區域；並且所述第二區域位於至少一些所述間隙區域上。
在所述第一方面的一個實例中，所述第一區域包含第一聚合物，並且所述第一引子組被接枝到所述第一聚合物；並且所述第二區域包含第二聚合物，並且所述第二引子組被接枝到所述第二聚合物。在該實例的一個版本中，所述流動池還包括在所述第一引子組上和在所述第一聚合物上的保護塗層。在該實例的另一個版本中，所述第一聚合物是在所述底材上的第一層；所述第二聚合物是在所述第一層上的第二層；所述流動池還包括：在所述第二層上的鈍化樹脂；以及在所述鈍化樹脂、所述第二聚合物和所述第一聚合物中限定的特徵(feature)；並且所述第一引子組和所述第二引子組各自在各個所述特徵處暴露。
在所述第一方面的一個實例中，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；各個所述凹陷包括：所述第一區域位於其中的第一部分；和第二部分；並且所述流動池還包括位於所述第二部分中的珠，其中所述第二區域在所述珠的表面。
在所述第一方面的一個實例中，所述可切割的第一引子包括第一切割位點，所述可切割的第二引子包括第二切割位點，並且所述第一切割位點和所述第二切割位點是相同類型的。在該實例的一個版本中，所述不可切割的第一引子、所述可切割的第二引子、所述可切割的第一引子和所述可切割的第二引子各自包括相應的連接子；所述第一可切割的引子的第一切割位點位於其連接子內；並且所述第二可切割的引子的第二切割位點位於其連接子內。
在所述第一方面的一個實例中，所述可切割的第一引子包括第一切割位點，所述可切割的第二引子包括第二切割位點，並且所述第一切割位點和所述第二切割位點是不同類型的。在該實例的一個版本中，所述不可切割的第一引子、所述可切割的第二引子、所述可切割的第一引子和所述可切割的第二引子各自包括相應的連接子；所述第一可切割引子的第一切割位點位於其連 接子內；並且所述第二可切割引子的第二切割位點位於其連接子內。
在所述第一方面的一個實例中，所述第一引子組被附接至第一支撐結構；所述第一區域是被附接至所述第一支撐結構的第一捕獲位點；所述第二引子組被附接至不同於所述第一支撐結構的第二支撐結構；並且所述第二區域是被附接至所述第二支撐結構的第二捕獲位點。
應當理解，本文揭露的第一方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。
本文揭露的第二方面是一種流動池，所述流動池包括：第一底材；被附接至所述第一底材的第一引子組，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；與所述第一底材相對的第二底材；和被附接至所述第二底材的第二引子組，所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
應當理解，所述第二方面的任何特徵可以以任何期望的方式組合在一起。此外，應當理解，所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第三方面是一種套組，所述套組包括流動池和引發液，所述流動池包括：底材，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；在各個所述凹陷中的第一聚合物層，其中所述第一聚合物層的一些官能基被封端；第一引子組，其被附接至在各個所述凹陷中的第一聚合物層的其他官能基；和在所述間隙區域上的第二聚合物層；所述引發液包括：液體載體；和不同於所述第一引子組的第二引子組。
在所述第三方面的一個實例中，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；並且所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
應當理解，所述第三方面的任何特徵可以以任何期望的方式組合在一起。此外，應當理解，所述第三方面和/或所述第二方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第四方面是一種方法，所述方法包括將模版液引入流動池，所述流動池包括：底材，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；在各個所述凹陷中的第一聚合物層，其中所述第一聚合物層的暴露的官能基被封端；被附接至在各個所述凹陷中的所述第一聚合物層的第一引子組，所述第一引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子；和在所述間隙區域上的第二聚合物層；由此來自所述模版液的模版被擴增以在至少一些所述凹陷中形成簇；將包含不可切割的第一引子和可切割的第二引子的引發液引入所述流動池，由此所述不可切割的第一引子和所述可切割的第二引子接枝到所述第二聚合物層；以及啟動從所述簇到所述不可切割的第一引子和所述可切割的第二引子的橋擴增，從而在至少一些所述間隙區域上形成第二簇。
應當理解，所述第四方面的任何特徵可以以任何期望的方式組合在一起。此外，應當理解，所述第四方面和/或所述第三方面和/或所述第二方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第五方面是一種方法，所述方法包括：將模版液引入流動池，所述流動池包括：底材，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；在各個所述凹陷中的第一聚合物層；被附接至所述第一聚合物層的第一引子組，所述第一引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子；在所述第一聚合物層上和在所述第一引子組上的可選的保護塗層；在所述間隙區域上的第二聚合物層；和被附接至所述第二聚合物層的第二引子組，所述第二引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；由此來自所述模版液的模版被擴增以 在至少一些所述凹陷中和在至少一些所述間隙區域上形成簇；以及切割所述可切割的第一引子和所述可切割的第二引子。
應當理解，所述第五方面的任何特徵可以以任何期望的方式組合在一起。此外，應當理解，所述第五方面和/或所述第三方面和/或所述第二方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第六方面是一種流動池，所述流動池包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域分隔的第一凹陷和第二凹陷，所述第一凹陷具有比所述第二凹陷更小的開口尺寸；被附接在至少一些所述第一凹陷中的第一引子組；以及分別位於至少一些所述第二凹陷中的經官能化珠，所述經官能化珠包括被附接在核心結構的表面的第二引子組，其中所述第二引子組不同於所述第一引子組。
在所述第六方面的一個實例中，所述經官能化珠的核心結構選自由二氧化矽、超順磁性材料、聚苯乙烯、和丙烯酸酯組成的組。
在所述第六方面的一個實例中，所述經圖案化樹脂選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(polyhedral oligomeric silsesquioxane resin，POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。
在所述第六方面的一個實例中，所述流動池還在所述第一凹陷中和在所述第二凹陷中包括聚合物，並且其中所述第一引子組被附接至在所述至少一些第一凹陷中的所述聚合物。在該實例的一個版本中，所述經官能化珠位於在所述至少一些第二凹陷中的所述聚合物上。在該實例的另一個版本中，所述第一引子組也被附接至在所述至少一些第二凹陷中的所述聚合物；並且所述經官能化珠位於在所述至少一些第二凹陷中的所述第一引子組上。
在所述第六方面的一個實例中，所述第一引子組包括第一引子和經尿嘧啶修飾的第二引子；並且所述第二引子組包括經尿嘧啶修飾的第一引子和第二引子。
應當理解，本文揭露的第六方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。
本文揭露的第七方面是一種流動池，所述流動池包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；被附接至至少一些所述凹陷的第一引子組；被放置在所述至少一些凹陷中使得所述第一引子組的至少一些引子被暴露的經官能化珠，所述經官能化珠包括被附接在核心結構的表面的第二引子組，其中所述第二引子組不同於所述第一引子組。
在所述第七方面的一個實例中，各個所述凹陷包括第一部分和第二部分，所述第一部分具有大於或等於所述經官能化珠的直徑的第一開口尺寸，所述第二部分具有小於所述經官能化珠的直徑的第二開口尺寸；並且所述經官能化珠位於所述至少一些凹陷的各個凹陷的所述第一部分中。
在所述第七方面的一個實例中，所述經官能化珠的核心結構選自由二氧化矽、超順磁性材料、聚苯乙烯、和丙烯酸酯組成的組。
在所述第七方面的一個實例中，所述經圖案化樹脂選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。
在所述第七方面的一個實例中，所述流動池還在所述凹陷中包括聚合物。在該方面的一個版本中，所述第一引子組被附接至未被所述經官能化珠佔據的所述聚合物的部分。在該版本的一個實例中，所述第一引子組被附接至在所述凹陷中的所述聚合物；並且所述經官能化珠位於所述第一引子組的一 些其他引子上。
應當理解，本文揭露的第七方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。
本文揭露的第八方面是一種方法，所述方法包括：選擇性地將聚合物施加於在支撐物上的經圖案化樹脂的凹陷中；將第一引子組接枝到在至少一些所述凹陷中的所述聚合物；以及在接枝所述第一引子組之前或之後，將經官能化珠沉積在i)所述至少一些凹陷的各個凹陷的一部分中，或沉積在ii)具有比所述至少一些凹陷更大的開口尺寸的第二凹陷中，所述經官能化珠包括被附接在核心結構的表面的第二引子組，其中所述第一引子組和所述第二引子組不同。
在所述第八方面的一個實例中，其中在沉積所述經官能化珠之前，所述方法還包括通過將所述第二引子組附接至所述核心結構來形成所述經官能化珠。
在所述第八方面的一個實例中，所述至少一些凹陷的各個凹陷的部分具有大於或等於各個所述經官能化珠的直徑的開口尺寸；所述至少一些凹陷包括與所述部分互連的第二部分，其中所述第二部分具有小於各個所述經官能化珠的直徑的第二開口尺寸；並且所述經官能化珠通過尺寸排阻自組裝到所述至少一些凹陷的各個凹陷的部分中。
在所述第八方面的一個實例中，其中在選擇性地施加所述聚合物之前，所述方法還包括通過以下在所述支撐物上形成所述經圖案化樹脂：將樹脂沉積在所述支撐物上；和使用奈米壓模微影術使所述樹脂圖案化。
應當理解，所述第八方面的任何特徵可以以任何期望的方式組合在一起。此外，應當理解，所述第八方面和/或所述第七方面和/或所述第六方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第九方面是一種流動池，所述流動池包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；於在所述凹陷中的所述經圖案化樹脂上的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物的各個嵌段具有不同於所述嵌段共聚物的各個其他嵌段的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基；和引子，所述引子被附接至至少一個所述嵌段的嵌段特異性官能基。
在所述第九方面的一個實例中，所述經圖案化樹脂選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。 在該實例的一個版本中，所述經圖案化樹脂是POSS基樹脂，並且其中所述POSS基樹脂是交聯的環氧POSS樹脂。在該實例的另一個版本中，所述嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有胺基基團作為其嵌段特異性官能基的丙烯醯胺單體；和第二嵌段，所述第二嵌段包括具有疊氮基基團作為其嵌段特異性官能基的疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺單體。在該其他版本的一個實例中，所述嵌段共聚物是：
Figure 108120316-A0305-02-0010-49
 其中R是氫或聚合物引發物質端基，n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至 10,000。在該實例的仍另一個版本中，所述嵌段共聚物是：
Figure 108120316-A0305-02-0011-50
 其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。
在所述第九方面的一個實例中，所述經圖案化樹脂是無定形的氟聚合物。在該實例的一個版本中，所述嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有三氟甲基基團作為其嵌段特異性官能基的單體；和第二嵌段，所述第二嵌段包括具有引子接枝性官能基作為其嵌段特異性官能基的單體。
在所述第九方面的一個實例中，所述嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有引子接枝性官能基作為其嵌段特異性官能基的單體；和第二嵌段，所述第二嵌段包括調整相互作用參數以驅動所述第一嵌段和所述第二嵌段的相分離的單體。在該實例的一個版本中，所述引子接枝性官能基是疊氮基基團；並且所述第二嵌段的單體的嵌段特異性官能基選自由以下組成的組：胺基基團、醇基團、芳基基團、和帶電基團。
在所述第九方面的一個實例中，所述嵌段共聚物是包含第一嵌段、第二嵌段、和第三嵌段的三元聚合物；所述第一嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述經圖案化樹脂；所述第二嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述引子；並且所述第三嵌段的嵌段特異性官能基被附接至不同於所述引子的一其他引子或被附接至酶。
在所述第九方面的一個實例中，所述嵌段共聚物是包含第一嵌段、第二嵌段、和第三嵌段的三元聚合物；所述第一嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述經圖案化樹脂；所述第二嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述引子；並且所述第三嵌段的嵌段特異性官能基影響所述嵌段共聚物的表面自由能或影響所述嵌段共聚物的穩定性。
在所述第九方面的一個實例中，其中所述凹陷選自由井和溝槽組成的組。
在所述第九方面的一個實例中，所述經圖案化樹脂和所述嵌段共聚物各自具有在從約25mN/m至約50mN/m的範圍內的表面自由能。
應當理解，本文揭露的第九方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第九方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十方面是一種流動池，所述流動池包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂，所述經圖案化POSS基樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；於在所述凹陷中的經圖案化POSS基樹脂上的分離的嵌段共聚物，其中所述分離的嵌段共聚物的一個嵌段具有被附接至所述經圖案化POSS基樹脂的官能基，並且所述分離的嵌段共聚物的一其他嵌段具有一其他官能基；和被附接至所述其他官能基的引子。
在所述第十方面的一個實例中，所述分離的嵌段共聚物選自由以下組成的組： i)
Figure 108120316-A0305-02-0013-51
其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000；和 ii)
Figure 108120316-A0305-02-0013-52
其中R是氫或聚合物引發物質端基，n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。
應當理解，本文揭露的第十方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十方面和/或所述第九方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十一方面是一種方法，所述方法包括：使樹脂圖案化以形成包括由間隙區域分隔的凹陷的經圖案化樹脂；在所述經圖案化樹脂上引入包含嵌段共聚物的溶液，所述嵌段共聚物的各個嵌段具有不同於所述嵌段 共聚物的各個其他嵌段的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基；使所述溶液暴露於溶劑蒸氣退火，由此所述嵌段共聚物在所述凹陷中相分離且自組裝；和將引子接枝到至少一個所述嵌段的嵌段特異性官能基。
在所述第十一方面的一個實例中，使所述樹脂圖案化包括奈米壓模微影術。
在所述第十一方面的一個實例中，所述包含嵌段共聚物的溶液具有範圍在從約0.04至約0.30的Flory-Huggins相互作用參數。
在所述第十一方面的一個實例中，其中在接枝之前，所述方法還包括使所述經圖案化樹脂暴露於固化程序，所述經圖案化樹脂包括在所述凹陷中的經相分離且自組裝的嵌段共聚物。
應當理解，本文揭露的第十一方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十一方面和/或所述第十方面和/或所述第九方面和/或所述第一方面的特徵的任何組合可以一起被使用和/或可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十二方面是一種方法，所述方法包括：將第一經官能化層施加於底材上；使所述第一經官能化層圖案化，從而形成被光阻劑覆蓋的第一經官能化區域；將第二經官能化層施加於所述光阻劑和所述底材的一些部分上；剝離所述光阻劑和在其上的任何所述第二經官能化層；去除所述第二經官能化層的一部分，從而形成鄰近所述第一經官能化區域的第二經官能化區域；和將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
在所述第十二方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接 枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十二方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十二方面的一個實例中，所述方法還包括：分別將第一經自組裝單層沉積在所述第一經官能化區域上並且將第二經自組裝單層沉積在所述第二經官能化區域上；其中所述第一引子組的附接包括將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經自組裝單層；並且其中所述第二引子組的附接包括將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經自組裝單層。
在所述第十二方面的一個實例中，其中所述去除包括：將第二光阻劑施加於所述第一經官能化區域和將成為所述第二經官能化區域的所述第二經官能化層的第二部分上；和蝕刻所述第二經官能化層的部分。
在所述第十二方面的一個實例中，所述底材包括在支撐物上的樹脂；所述樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；所述第一經官能化區域在各個凹陷的第一部分上；所述第二經官能化層在各個凹陷的第二部分上和在間隙區域上；並且所述去除包括從所述間隙區域拋光所述第二經官能化層。
在所述第十二方面的一個實例中，所述底材包括在支撐物上的樹脂；所述樹脂包括由間隙區域分隔的多級凹陷；所述第一經官能化區域在各個多級凹陷的第一級；並且在施加所述第二經官能化層之前，所述方法還包括： 將犧牲層施加於所述光阻劑和所述樹脂的一些部分上；從所述樹脂的部分去除所述犧牲層；和從所述多級凹陷去除所述樹脂的一個區域以產生鄰近所述第一經官能化區域的地區；並且將所述第二經官能化層施加於在所述光阻劑上的犧牲層上、所述地區上和間隙區域上。
應當理解，本文揭露的第十二方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十二方面和/或所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十三方面是一種方法，所述方法包括：將第一光阻劑施加於底材上，使得第一底材部分被暴露；將第一經官能化層施加於所述光阻劑和所述第一底材部分上；剝離所述光阻劑和在其上的任何所述第一經官能化層，從而在所述第一底材部分上形成第一經官能化區域；將第二光阻劑施加於所述第一經官能化區域和所述底材上，使得鄰近所述第一經官能化區域的第二底材部分被暴露；將第二經官能化層施加於所述第二光阻劑和所述第二底材部分上；剝離所述第二光阻劑和在其上的任何所述第二經官能化層，從而形成鄰近所述第一經官能化區域的第二經官能化區域；以及將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
在所述第十三方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十三方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在 所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十三方面的一個實例中，所述方法還包括分別將第一經自組裝單層沉積在所述第一經官能化區域上並且將第二經自組裝單層沉積在所述第二經官能化區域上；其中所述第一引子組的附接包括將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經自組裝單層；並且其中所述第二引子組的附接包括將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經自組裝單層。
應當理解，本文揭露的第十三方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，第十三方面和/或第一方面和/或第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十四方面是一種方法，所述方法包括：將第一經官能化層施加於底材上，所述底材包括由間隙區域分隔的溝槽和在各個所述溝槽的第一部分中的犧牲材料區域；使所述第一經官能化層圖案化，從而在各個所述溝槽的第二部分中形成被光阻劑覆蓋的第一經官能化區域；去除所述犧牲材料區域以暴露各個所述溝槽的所述第一部分；將第二經官能化層施加於所述間隙區域上、所述第一部分上和所述光阻劑上；剝離所述光阻劑和在其上的任何所述第二經官能化層；從所述間隙區域去除任何所述第二經官能化層，由此一第二經官能化區域被保留在各個所述溝槽的所述第一部分中；以至少基本上垂直於所述溝槽的空間上分開的條帶的圖案施加第二光阻劑；去除在所述空間上分開的條帶之間暴露的所述第一經官能化區域和所述第二經官能化區域的部分；去除所述第二光阻劑；和將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述 第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
在所述第十四方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十四方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十四方面的一個實例中，所述底材包括在各個所述溝槽的第二部分中的第二犧牲材料區域；所述底材、所述犧牲材料區域和所述第二犧牲材料區域具有不同的蝕刻速率；並且在施加所述第一經官能化層之前，所述方法還包括從各個所述溝槽的第二部分去除所述第二犧牲材料區域。在該實例的一個版本中，其中在去除所述第二犧牲材料區域之前，所述方法還包括通過以下形成所述犧牲材料區域和第二犧牲材料區域：將犧牲材料施加於所述底材上，所述底材包括由所述間隙區域分隔的所述溝槽；去除所述犧牲材料的一部分，使得所述犧牲材料的一個區域保持直接鄰接各個所述溝槽的各側壁；將第二犧牲材料施加於所述底材上和所述犧牲材料區域上；去除所述第二犧牲材料的一部分，使得所述第二犧牲材料的一個區域保持直接鄰近各個所述犧牲材料區域；和施加材料以填充所述第二犧牲材料區域之間的任何空間。在該版本的一個實例中，所述底材是多層底材；所述溝槽被限定在所述多層底材的最外 層中；並且所述材料和所述最外層是相同的。
應當理解，本文揭露的第十四方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十四方面和/或所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十五方面是一種方法，所述方法包括：將犧牲材料施加於包括由第一間隙區域分隔的凹陷的底材，其中各個所述凹陷包括由階梯部分限定的深部分和淺部分，並且其中所述犧牲層部分地填充所述深部分；順序地去除所述犧牲層的一部分和所述底材的一部分以形成至少基本上與所述犧牲層的剩餘部分齊平的第二間隙區域，並且去除所述階梯部分以形成與所述犧牲層的剩餘部分相鄰的地區；將第一經官能化層施加於所述第二間隙區域上、所述犧牲層的剩餘部分上、和所述地區上；將光阻劑施加於第一經官能化層上；去除所述光阻劑的一部分和所述第一經官能化層的基底性部分，使得所述犧牲層的剩餘部分和所述第二間隙區域暴露，並且其上具有所述光阻劑的第二部分的所述第一經官能化層的一部分被保留在所述地區；去除所述犧牲層的剩餘部分以形成與所述第一經官能化區域的部分相鄰的第二地區；將第二經官能化層施加於所述地區，從而形成第二經官能化區域；剝離所述光阻劑的第二部分，從而形成第一經官能化區域；以及將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
在所述第十五方面的一個實例中，還將所述第二經官能化層施加於所述光阻劑的第二部分和所述第二間隙區域；用所述光阻劑的第二部分去除所述第二經官能化層的第一部分；並且所述方法還包括從所述第二間隙區域拋光所述第二經官能化層。
在所述第十五方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在 施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十五方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
應當理解，本文揭露的第十五方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十五方面和/或所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十六方面是一種方法，所述方法包括：壓印多層底材，所述多層底材包括：支撐物；在所述支撐物上的第一經官能化層；在所述第一經官能化層上的第二經官能化層；和在所述第二經官能化層上的鈍化層；從而形成由所述鈍化層的間隙區域分隔的特徵，其中所述第一經官能化層和所述第二經官能化層各自的一個區域在各個特徵處暴露；將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
在所述第十六方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層被併入所述多層底材之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層被併入所述多層底材之前將可切割的第一引子和不可切割的第 二引子預接枝到所述第二經官能化層。
在所述第十六方面的一個實例中，所述第一引子組的附接包括將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到在各個凹陷中的所述第一經官能化區域；並且第二引子組的附接包括將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到在各個凹陷中的所述第二經官能化區域。
應當理解，本文揭露的第十六方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十六方面和/或所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十七方面是一種方法，所述方法包括：壓印第一樹脂以形成凹陷，所述凹陷包括由階梯部分限定的深部分和淺部分，其中所述第一樹脂位於犧牲層上，所述犧牲層位於第二樹脂上；蝕刻所述第一樹脂的第一部分和為所述深部分的基底的所述犧牲層的部分，從而暴露所述第二樹脂的一部分；蝕刻所述階梯部分，從而暴露所述犧牲層的第二部分；將第一經官能化層施加於所述第二樹脂的部分以形成第一經官能化區域；去除所述犧牲層的第二部分，從而暴露所述第二樹脂的第二部分；將第二經官能化層施加於所述第二樹脂的第二部分以形成第二經官能化區域；以及將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
在所述第十七方面的一個實例中，在施加所述第二經官能化層期間，所述第二經官能化層被沉積在所述凹陷周圍的間隙區域上，而不被沉積在所述第一經官能化區域上；並且所述方法還包括從所述間隙區域拋光所述第二經官能化層。
應當理解，本文揭露的第十七方面的任何特徵可以以任何期望的 方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十七方面和/或所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
本文揭露的第十八方面是一種方法，所述方法包括：將第一引子組附接至第一支撐結構；將第二引子組附接至第二支撐結構，其中所述第二引子組和所述第二支撐結構不同於所述第一引子組和所述第一支撐結構；以及將所述第一支撐結構和所述第二支撐結構加載在底材表面上，所述底材表面具有選擇性地附接至所述第一支撐結構的多於一個(a plurality of)的第一捕獲位點和選擇性地附接至所述第二支撐結構的多於一個的第二捕獲位點。
應當理解，本文揭露的第十八方面的任何特徵可以以任何期望的方式和/或配置組合在一起。此外，應當理解，所述第十八方面和/或所述第一方面和/或所述第二方面的特徵的任何組合可以與本文揭露的任何實例組合。
10A:流動池
10B:流動池
10C:流動池
10D:流動池
10E:流動池
12A:引子組
12A’:引子組
12B:引子組
12B’:引子組
12C:引子組
12C’:引子組
12D:引子組
12D’:引子組
14:區域/樹脂
16:區域/凹陷
18:不可切割的引子
18’:不可切割的引子
19:可切割的引子
19’:可切割的引子
20:可切割的引子
20’:可切割的引子
21:不可切割的引子
21’:不可切割的引子
22:切割位點
22’:切割位點
23:切割位點
24:連接子
24’:連接子
26:聚合物/底材
26’:底材
28:凹陷
28’:凹陷
28”:溝槽
28''':溝槽
28A:凹陷
28B:凹陷
28C:凹陷
30:間隙區域
30’:間隙區域
32:聚合物層
32’:聚合物層
34:部分
34’:部分
36:空隙
38:重疊區域
40:不可切割的模版股
42:可切割的模版股
44:不可切割的模版股
46:可切割的模版股
48:保護塗層
49:核心結構
50:珠
52:支撐物
54:樹脂
54’:經圖案化樹脂
54”:經圖案化樹脂
54A:樹脂
54A’:經圖案化樹脂
54A”:經圖案化樹脂
54B:覆蓋材料
54C:覆蓋材料
56:工作印模
58:嵌段共聚物
58’:嵌段共聚物
58A:嵌段
58A’:嵌段
58B:嵌段
58B’:嵌段
58C:嵌段
60:經官能化層
62:光阻劑
62’:光阻劑
62”:光阻劑的部分
64:經官能化層
66:底材部分
68:底材部分/層
70:深部分
72:淺部分
74:階梯部分/階梯區域
76:部分/犧牲層/地區
78:部分/地區
80:犧牲層
82:部分
84:犧牲層
84’:犧牲層
84”:犧牲材料的區域/層
86:鈍化層
88:犧牲層
88’:犧牲材料的區域/層
90:側壁
92:材料
93:經官能化支撐結構
94:經官能化支撐結構
95:捕獲位點
96:捕獲位點
98:犧牲金屬層
100:部分
101:方法
102:部分
102’:部分
103:步驟
104:部分
105:步驟
106:步驟
200:方法
202:步驟
204:步驟
206:步驟
208:步驟
D1:深度
D2:深度
D3:厚度
S:底材表面
通過參考以下詳細描述和附圖，本文之揭露內容的實例的特徵將變得明顯，其中相似的參考數字對應於相似的但可能不相同的部件。為了簡潔起見，具有先前描述的功能的參考數字或特徵可以結合或可以不結合其中它們出現的其他附圖來描述。
圖1A至圖1D是被附接至在底材上的第一區域和第二區域的第一引子組和第二引子組的不同實例的示意圖；圖2是在底材表面上的第一區域和第二區域的實例的示意性橫截面圖；圖3A和圖3B分別是在凹陷中的第一區域和第二區域的實例的示意性橫截面圖和俯視圖；圖4A至圖4C是在凹陷中的第一區域和第二區域的不同實例的示 意性橫截面圖；圖5是在凹陷中的第一區域和在底材表面上的第二區域的實例的示意性橫截面圖；圖6A和圖6B分別是在凹陷中的第一區域和在底材表面上的第二區域的實例的示意性橫截面圖和俯視圖；圖7A至圖7G是一起描繪了用於製造示例性流動池的方法的實例的示意性橫截面圖，該示例性流動池包括在凹陷中的第一區域和在底材表面上的第二區域的實例；圖8A至圖8F是一起描繪了用於製造另一種示例性流動池的方法的另一個實例的示意性橫截面圖，該示例性流動池包括在凹陷中的第一區域和在底材表面上的第二區域的實例；圖9是在凹陷中的第一區域和作為位於凹陷中的珠的部分的第二區域的實例的示意性橫截面圖；圖10是被附接至分開的底材的第一引子組和第二引子組的實例的示意性橫截面圖；圖11A至圖11C是一起描繪了在支撐物上形成經圖案化樹脂的一個實例的示意性透視圖；圖11A、圖11B和圖11D是一起描繪了在支撐物上形成經圖案化樹脂的另一個實例的示意性透視圖；圖12是圖示出本文揭露的方法的一個實例的流程圖；圖13A至圖13D是一起描繪了使用圖11C的經圖案化底材的本文揭露的方法的實例的示意性透視圖；圖14是沿圖13D的線14-14截取的橫截面圖；圖15A至圖15D是一起描繪了使用圖11C的經圖案化底材的本文 揭露的方法的另一個實例的示意性透視圖；圖16是沿圖15D的線16-16截取的橫截面圖；圖17A至圖17D是一起描繪了使用圖11D的經圖案化底材的本文揭露的方法的實例的示意性透視圖；圖18是沿圖17D的線18-18截取的橫截面圖；圖19A至圖19D是一起描繪了使用圖11D的經圖案化底材的本文揭露的方法的另一個實例的示意性透視圖；圖20是沿圖19D的線20-20截取的橫截面圖；圖21是圖示出本文揭露的方法的另一個實例的流程圖；圖22A至圖22E是一起描繪了本文揭露的其他方法的實例的示意性透視圖；圖22F是圖22E示出的流動池的實例的凹陷的放大圖，其中該凹陷包括嵌段共聚物和被接枝到一個嵌段的引子；圖23A和圖23B是凹陷和周圍的間隙區域的實例的示意性俯視圖，其中嵌段共聚物的不同實例在凹陷中自組裝並相分離，其中各圖示出了嵌段的不同圖案；圖24描繪了本文揭露的流動池的實例的示意性透視圖；圖25A和圖25B是描述本文揭露的包括三嵌段共聚物的流動池的不同實例的示意性橫截面圖；圖26A至圖26H是一起圖示出用於形成圖2中示出的示例性區域的示例性方法的示意圖；圖27A至圖27F是一起圖示出用於形成圖2中示出的示例性區域的另一示例性方法的示意圖；圖28A至圖28G是一起圖示出用於形成圖3A和圖3B中示出的示 例性區域的示例性方法的示意圖；圖29A至圖29H是一起圖示出用於形成圖3A和圖3B中示出的示例性區域的另一示例性方法的示意圖；圖30A至圖30F是一起圖示出用於形成圖3A和圖3B中示出的示例性區域的又一示例性方法的示意圖；圖31A至圖31I是一起圖示出用於形成圖3A和圖3B中示出的示例性區域的示例性方法的示意圖；圖32A至圖32F是一起圖示出用於形成圖4C中示出的示例性區域的示例性方法的示意圖；圖33A是用於形成本文揭露的區域的另一個實例的示例性方法的示意圖；圖33B是圖示出了區域的圖33A的凹陷之一的俯視圖；圖34A至圖34S是一起圖示出用於形成溝槽中的示例性區域的示例性方法的示意圖；和圖35示意性地圖示出了經官能化支撐結構的實例；圖36A和圖36B是一起圖示出用於使用圖35的經官能化支撐結構形成示例性區域的示例性方法的示意圖；圖37A和圖37B是一起圖示出用於使用圖35的經官能化支撐結構形成示例性區域的示例性方法的示意圖；圖38A和圖38B是一起圖示出涉及嵌段共聚物的另一個實例的示例性方法的示意圖；圖39A是流動池底材的掃描電子顯微術(SEM)圖像，該流動池底材具有由間隙區域分隔的50μm直徑凹陷，其上沉積有經預接枝的聚合物層；圖39B是圖39A的流動池底材的SEM圖像，其中保護層被沉積在 經預接枝的聚合物層上；圖39C是圖39B的流動池底材在蝕刻從間隙區域去除保護層後的SEM圖像；圖40A和圖40B描繪了用於同時配對末端讀段(圖40A)和順序配對末端讀段(圖40B)的數據分析；圖41A至圖41G是一起圖示出用於形成圖2中示出的示例性區域的另一示例性方法的示意圖；和圖42A至圖42H是一起圖示出用於形成圖2中示出的示例性區域的又另一示例性方法的示意圖。
本文揭露的流動池的實例可以用於核酸定序。
一些流動池包括被附接至流動池底材的不同區域的不同引子組。在這些實例中，可以控制引子組，使得切割(線性化)化學在不同區域是正交的。正交切割化學可以通過被附接至不同組中的不同引子的相同切割位點來實現，或者通過被附接至不同組中的不同引子的不同切割位點來實現。這使得能夠在底材的一個區域中產生一簇正向股且在底材的另一個區域中產生一簇反向股。在一個實例中，區域彼此直接相鄰。在另一個實例中，區域之間的任何空間足夠小，使得聚簇可以跨越兩個區域。對於本文揭露的一些流動池配置，正向股和反向股在空間上分離，這分離來自兩個讀段的螢光信號，同時允許各個讀段的同時鹼基調用。因此，本文揭露的流動池的一些實例使得能夠獲得同時配對末端讀段。
流動池的其他實例可以用於獲得同時配對末端讀段；或者可以用於獲得順序配對末端讀段，其中正向股被定序並去除，並且然後反向股被定序 並去除。在這些其他實例中，在流動池支撐物上的經圖案化樹脂用嵌段共聚物塗覆，該嵌段共聚物在經圖案化樹脂的凹陷中經歷定向自組裝。經圖案化樹脂用作嵌段共聚物的佈置的指南。在受控條件下，嵌段共聚物自組裝成特定的結構域。在本文揭露的一些實例中，結構域的功能性被控制成正交的，使得一個或更多個結構域可以與經圖案化樹脂反應，並且一個或更多個其他結構域可以接枝引子。在一些實例中，可以控制結構域的功能性來改變該結構域的特性。 這些示例性流動池可以適合用於光學或非光學偵測方法。
定義
應當理解，除非另外說明，否則本文使用的術語將採用它們在相關領域中的普通含義。下文闡述了本文使用的若干術語和它們的含義。
除非上下文另外清楚地指出，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」、和「該(the)」包括複數指示物。
術語包含(comprising)、包括(including)、含有(containing)和這些術語的各種形式彼此同義，並且意欲範圍相同。
術語頂、底、下部、上部、上等在本文中用於描述流動池和/或流動池的各種部件。應當理解，這些方向術語並不意欲暗示特定的方向，而是用於指示部件之間的相對方向。方向術語的使用不應被解釋為將本文揭露的實例限制於任何特定的方向。
「丙烯醯胺單體」是具有結構
Figure 108120316-A0305-02-0027-53
的單體或包括具有該 結構的丙烯醯胺基團的單體。包含丙烯醯胺基團的單體的實例包括疊氮基乙醯 胺基戊基丙烯醯胺：
Figure 108120316-A0305-02-0028-87
和N-異丙基丙烯醯胺：
Figure 108120316-A0305-02-0028-88
。可以使用其他丙烯醯胺單體。
如本文使用的，醛是含有具有結構-CHO的官能基的有機化合物，該官能基包括羰基中心(即與氧雙鍵鍵合的碳)，該羰基中心的碳原子也與氫 和R基團(諸如烷基)或其他側鏈鍵合。醛的一般結構是：
Figure 108120316-A0305-02-0028-89
。
如本文使用的，「烷基」指的是完全飽和(即，不包含雙鍵或三鍵)的直鏈或支鏈的烴鏈。烷基基團可以具有1個至20個碳原子。示例性的烷基基團包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基及類似基團。作為實例，名稱「C1-4烷基」指示在烷基鏈中存在一個至四個碳原子，即該烷基鏈選自由以下組成的組：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文使用的，「烯基」指的是包含一個或更多個雙鍵的直鏈或支鏈的烴鏈。烯基基團可以具有2個至20個碳原子。示例性的烯基基團包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及類似基團。
如本文使用的，「炔烴」或「炔基」指的是包含一個或更多個三鍵的直鏈或支鏈的烴鏈。炔基基團可以具有2個至20個碳原子。
如本文使用的，「芳基」指的是在環骨架中僅包含碳的芳香族環或芳香族環體系(即，共享兩個相鄰的碳原子的兩個或更多個稠環)。當芳基是環 體系時，在該體系中的每一個環是芳香族的。芳基基團可以具有6個至18個碳原子。芳基基團的實例包括苯基、萘基、薁基以及蒽基。
「胺基」官能基指的是-NRaRb基團，其中Ra和Rb各自獨立地選自氫(例如，
Figure 108120316-A0305-02-0029-75
NH2)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環基、C6-10芳基、5-10員雜芳基以及5-10員雜環基，如本文定義的。
如本文使用的，術語「附接」指的是兩個事物彼此直接地或間接地接合、緊固、黏附、連接或結合的狀態。例如，被附接至凹陷的珠在物理上可以被截留在凹陷中。對於另一個實例，核酸可以通過共價鍵或非共價鍵被附接至經官能化聚合物。共價鍵的特徵在於共享原子之間的電子對。非共價鍵是不涉及電子對的共享的物理鍵，並且可以包括例如氫鍵、離子鍵、凡得瓦力、親水相互作用和疏水相互作用。對於仍另一個實例，引子可以通過支撐結構被附接至在底材上的區域。
「疊氮化物」或「疊氮基」官能基指的是-N3。
術語經官能化珠的「珠」或「核心結構」指的是由剛性材料或半剛性材料製成的小的主體。主體可以具有特徵為例如球體、橢圓形、微球體或其他公認的顆粒形狀的形狀，無論其具有規則尺寸還是不規則尺寸。可用於珠/核心結構的示例性材料包括但不限於玻璃；塑膠，諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一種材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(鐵氟龍®，來自Chemours)；多糖或交聯的多糖，諸如瓊脂糖或Sepharose；尼龍；硝化纖維素；樹脂；矽石或基於矽石的材料，包括矽和經修飾的矽；碳纖維、金屬；無機玻璃；光纖束或各種其他聚合物。珠/核心結構的實例包括可控孔度玻璃珠、順磁性珠、二氧化釷溶膠(thoria sol)、Sepharose珠、奈米晶體和本領域已知的其他物質，如例如在來自Bangs Laboratories,Fishers Ind的Microsphere Detection Guide中描述的。珠還可以用具有可以附接至引子的官能基的聚合物塗 覆。
「嵌段共聚物」是當兩種或更多種單體聚集在一起並形成重複單元的嵌段時形成的共聚物。各個嵌段應具有在相鄰嵌段中不存在的至少一個特徵和/或至少一個嵌段特異性官能基。在本文揭露的實例中，當暴露於特定的退火條件時，嵌段共聚物能夠通過成分聚合物嵌段的微相分離自組裝成奈米級尺寸的有序結構域。嵌段共聚物的具體實例將在下文進一步描述。
「嵌段特異性官能基」指的是在嵌段聚合物的特定嵌段內具有特定功能的原子和/或鍵的部分，所述特定功能諸如與經圖案化樹脂反應、附接引子、調整相互作用參數以驅動微相分離、改變嵌段共聚物的特性、等等。在本文揭露的一些實例中，各個嵌段包括不同的嵌段特異性官能基。各個嵌段特異性官能基的具體實例將在下文進一步描述。
如本文使用的，「結合區域」指的是支撐物上將與另一種材料結合的區域，該另一種材料例如可以是間隔層、蓋、另一種底材、等等、或其等之組合(例如，間隔層和蓋)。在結合區域形成的鍵可以是化學鍵(如上文描述的)，或者機械結合(例如，使用緊固件等等)。
如本文使用的「捕獲位點」指的是流動池表面已經被物理地修飾和/或用允許經官能化支撐結構定位的化學性質修飾的部分。在一個實例中，捕獲位點可以包括化學捕獲劑。
如本文使用的，「碳環基」意指在環體系骨架中僅包含碳原子的非芳香族環或非芳香族環體系。當碳環基是環體系時，兩個或更多個環可以以稠合的、橋接的或螺連接的方式連接在一起。碳環基可以具有任何飽和度，條件是在環體系中的至少一個環不是芳香族的。因此，碳環基包括環烷基、環烯基以及環炔基。碳環基基團可以具有3個至20個碳原子。碳環基環的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環己烯基、2,3-二氫-茚、雙環[2.2.2]辛基、金 剛烷基以及螺[4.4]壬基。
如本文使用的，術語「羧酸基」或「羧基」指的是-COOH。
「化學捕獲劑」是能夠附接、容納或結合靶分子(例如經官能化支撐結構)的材料、分子或部分。一種示例性化學捕獲劑包括捕獲核酸(例如，捕獲寡核苷酸)，其與靶分子的靶核酸的至少一部分互補或附接至靶分子。仍另一種示例性化學捕獲劑包括受體-配體結合對的成員(例如，抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸結合蛋白、表位、抗體、等等)，其能夠結合靶分子(或結合被附接至靶分子的連接部分)。化學捕獲劑的又另一個實例是能夠與靶分子形成靜電相互作用、氫鍵或共價鍵(例如硫醇-二硫化物交換、點擊化學、Diels-Alder、等等)的化學試劑。
如本文使用的，「伸環烷基」意指經由兩個附接點附接至分子的剩餘部分的完全飽和的碳環基環或碳環基環體系。
如本文使用的，「環烯基」或「環烯烴」意指具有至少一個雙鍵的碳環基環或碳環基環體系，其中在環體系中沒有環是芳香族的。實例包括環己烯基或環己烯和降冰片烯基或降冰片烯。也如本文使用的，「雜環烯基」或「雜環烯烴」意指具有至少一個雙鍵的、在環骨架中具有至少一個雜原子的碳環基環或碳環基環體系，其中在環體系中沒有環是芳香族的。
如本文使用的，「環炔基」或「環炔烴」意指具有至少一個三鍵的碳環基環或碳環基環體系，其中在環體系中沒有環是芳香族的。實例是環辛炔。另一個實例是雙環壬炔。也如本文使用的，「雜環炔基」或「雜環炔烴」意指具有至少一個三鍵的、在環骨架中具有至少一個雜原子的碳環基環或碳環基環體系，其中在環體系中沒有環是芳香族的。
如本文使用的術語「沉積」指的是任何合適的施加技術，其可以是手動的或自動的，並且在一些情況下導致表面性質的改變。通常，沉積可以 使用氣相沉積技術、塗覆技術、接枝技術或類似技術來進行。一些具體的實例包括化學氣相沉積(CVD)、噴塗(例如超音波噴塗)、旋塗、浸泡或浸塗、刮刀塗佈、小池分配(puddle dispensing)、流過塗佈、氣溶膠印刷、網板印刷、微接觸印刷、噴墨印刷或類似技術。
如本文使用的，術語「凹陷」指的是在底材或經圖案化樹脂中的分立的凹形特徵，其具有至少部分被底材或經圖案化樹脂的間隙區域包圍的表面開口。凹陷可以在其表面中的開口處具有多種形狀中的任一種，作為實例包括圓形、橢圓形、正方形、多邊形、星形(具有任何數目的頂點)、等等。與表面正交地截取的凹陷的橫截面可以是彎曲的、正方形的、多邊形的、雙曲線的、錐形的、角形的(angular)、等等。作為實例，凹陷可以是井或兩個互連的井。凹陷也可以具有更複雜的結構，諸如脊、階梯特徵、等等。
當用於提及項目的集合使用時，術語「各個(each)」意圖識別集合中的單個項目，但不一定指的是集合中的每個項目。如果明確披露或上下文另外明確規定，則可能存在例外。
如本文使用的術語「環氧基」(也被稱為縮水甘油基或氧
Figure 108120316-A0305-02-0032-86
基團) 指的是
Figure 108120316-A0305-02-0032-55
或
Figure 108120316-A0305-02-0032-56
。
如本文使用的，術語「流動池」意圖意指容器，該容器具有可以進行反應的腔室(即流動通道)、用於將試劑輸送至腔室的入口、和用於從腔室移出試劑的出口。在一些實例中，腔室使得能夠偵測在腔室中發生的反應。例如，腔室/流動通道可以包括一個或更多個透明表面，其允許對凹陷處的陣列、經光學標記的分子或類似物的光學偵測。
如本文使用的，「流動通道」可以是被限定在兩個結合的部件之間的地區，其可以選擇性地接納液體樣本。在一些實例中，流動通道可以被限定在經圖案化樹脂和蓋之間，並且因此可以與在經圖案化樹脂中限定的一個或 更多個凹陷流體連通。
「經官能化支撐結構」指的是由剛性材料或半剛性材料製成的小的主體，其具有附接至其表面的本文揭露的引子組之一。主體可以具有特徵為例如球體、橢圓形、微球體或其他公認的顆粒形狀的形狀，無論其具有規則尺寸還是不規則尺寸。可用於主體的示例性材料包括但不限於玻璃；塑膠，諸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯與另一種材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(鐵氟龍®，來自Chemours)；多糖或交聯的多糖，諸如瓊脂糖或Sepharose；尼龍；硝化纖維素；樹脂；矽石或基於矽石的材料，包括矽和經修飾的矽；碳纖維、金屬；無機玻璃；光纖束或各種其他聚合物。
如本文使用的，「雜芳基」指的是在環骨架中包含一個或更多個雜原子(即，不同於碳的元素，包括但不限於氮、氧以及硫)的芳香族環或芳香族環體系(即，共享兩個相鄰原子的兩個或更多個稠環)。當雜芳基是環體系時，在該體系中的每一個環皆是芳香族的。雜芳基基團可以具有5個-18個環成員。
如本文使用的，「雜環基」意指在環骨架中包含至少一個雜原子的非芳香族環或非芳香族環體系。雜環基可以以稠合的、橋接的或螺連接的方式連接在一起。雜環基可以具有任何飽和度，條件是在環體系中的至少一個環不是芳香族的。在環體系中，雜原子可以存在於非芳香族環或芳香族環中。雜環基基團可以具有3個至20個環成員(即，構成環骨架的原子的數目，包括碳原子和雜原子)。在一些實例中，雜原子是O、N或S。
如本文使用的，術語「肼」或「肼基」指的是-NHNH2基團。
如本文使用的，術語「腙」或「腙基」指的是
Figure 108120316-A0305-02-0033-57
基團， 其中Ra和Rb各自獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環基、C6-10芳基、5-10員雜芳基以及5-10員雜環基，如本文定義的。
如本文使用的，「氫氧基」或「羥基」指的是-OH基團。
如本文使用的，術語「間隙區域」指的是例如底材、經圖案化樹脂或其他支撐物的分隔凹陷的區域。例如，間隙區域可以將陣列的一個凹陷與陣列的另一個凹陷分開。彼此分開的兩個區域可以是分立的，即，彼此缺乏物理接觸。在許多實例中，間隙區域是連續的，而凹陷是分立的，例如，如在其他處連續的表面中限定的多於一個的凹陷的情況。在其他實例中，間隙區域和特徵是分立的，例如，如在由相應的間隙區域分隔的多於一個溝槽的情況。由間隙區域提供的分隔可以是部分的或完全的分開。間隙區域可以具有與在表面中限定的凹陷的表面材料不同的表面材料。例如，凹陷中可以具有聚合物和第一引子組，並且間隙區域上可以具有聚合物和第二引子組。對於另一個實例，陣列的凹陷可以在其中具有珠，而間隙區域上不具有珠。
如本文使用的「腈氧化物」意指「RaC≡N+O-」基團，其中Ra在本文中定義。製備腈氧化物的實例包括從醛肟通過用氯醯胺-T處理或通過鹼對亞胺醯氯[RC(Cl)=NOH]的作用或從羥胺和醛之間的反應原位生成。
如本文使用的「硝酮」意指
Figure 108120316-A0305-02-0034-13
基團，其中R1、R2和R3 可以是本文中定義的Ra基團和Rb基團中的任一種。
如本文使用的，「核苷酸」包括含氮雜環鹼基、糖以及一個或更多個磷酸酯基團。核苷酸是核酸序列的單體單元。在RNA中，糖是核糖，並且在DNA中糖是去氧核糖，即缺少存在於核糖中的2’位處的羥基基團的糖。含氮雜環鹼基(即核鹼基)可以是嘌呤鹼基或嘧啶鹼基。嘌呤鹼基包括腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)及其經修飾的衍生物或類似物。嘧啶鹼基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其經修飾的衍生物或類似物。去氧核糖的C-1原子結合至嘧啶的 N-1或嘌呤的N-9。核酸類似物可以具有被改變的磷酸酯主鏈、糖或核鹼基中的任何者。核酸類似物的實例包括，例如，通用鹼基或磷酸酯-糖骨架類似物，諸如肽核酸(PNA)。
「經圖案化樹脂」指的是可以具有被限定於其中的凹陷的任何聚合物。樹脂的具體實例和用於使樹脂圖案化的技術將在下文進一步描述。在本文揭露的一些實例中，經圖案化樹脂可以用作用於嵌段共聚物在其上自組裝的指導模版。使聚合物為「指導模版」的特性的具體實例將在下文進一步描述。
如本文使用的，「引子」被定義為單股核酸序列(例如，單股DNA或單股RNA)。一些引子，在本文中被稱為擴增引子，用作用於模版擴增和簇生成的起點。其他引子，在本文中被稱為定序引子，用作用於DNA或RNA合成的起點。引子的5’末端可以被修飾以允許與聚合物的官能基或與珠表面偶聯反應。引子長度可以是任何數目的鹼基長的並且可以包括多種非天然的核苷酸。在一個實例中，定序引子是範圍在從10個至60個鹼基或從20個至40個鹼基的短股。
如本文使用的「間隔層」指的是將兩種組分結合在一起的材料。在一些實例中，間隔層可以是有助於結合的輻射吸收材料，或者可以與有助於結合的輻射吸收材料接觸。
「溶劑退火」或「溶劑蒸氣退火」包括使聚合物(例如，呈膜或層的形式)暴露於在密封的外殼中的過量的溶劑，以在聚合物上方產生飽和蒸氣(即，溶劑氣氛)。聚合物膜或層可以被保持在室溫(例如，從約18℃至約25℃)或升高的溫度，這導致聚合物膨脹，並增加其鏈遷移率。
術語「底材」指的是流動池的各種部件(例如聚合物、引子、等等)可以被添加至在其上的結構。底材可以是晶圓(wafer)、面板(panel)、矩形片、裸晶(die)或任何其他合適的配置。底材通常是剛性的，並且不溶於水性液體。底材對用於修飾凹陷或存在於凹陷中的化學物質可以是惰性的。例如，底材對用 於形成聚合物、附接引子、等等的化學物質可以是惰性的。底材可以是單層結構，或多層結構(例如，包括支撐物和在支撐物上的經圖案化樹脂)。合適的底材的實例將在下文進一步描述。
「硫醇」官能基指的是-SH。
如本文使用的，術語「四
Figure 108120316-A0305-02-0036-83
」和「四
Figure 108120316-A0305-02-0036-84
基」指的是包含四個氮原子的六員雜芳基基團。四
Figure 108120316-A0305-02-0036-85
可以是可選地被取代的。
如本文使用的「四唑」指的是包含四個氮原子的五員雜環基團。 四唑可以是可選地被取代的。
用於同時配對末端讀段定序的流動池
本文揭露的流動池的實例包括：底材；第一引子組，其被附接至在底材上的第一區域，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；和第二引子組，其被附接至在底材上的第二區域，所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
合適的底材的實例包括環氧矽氧烷、玻璃和經修飾的或官能化的玻璃、塑膠(包括丙烯酸系、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(諸如來自Chemours的鐵氟龍®)、環烯烴/環烯烴聚合物(COP)(諸如來自Zeon的ZEONOR®)、聚醯亞胺、等等)、尼龍、陶瓷/陶瓷氧化物、矽石、熔融矽石或基於矽石的材料、矽酸鋁、矽和經修飾的矽(例如，硼摻雜的p+矽)、氮化矽(Si3N4)、氧化矽(SiO2)、五氧化二鉭(Ta2O5)或其他鉭氧化物(TaOx)、氧化鉿(HaO2)、碳、金屬、無機玻璃或類似物。底材也可以是多層結構。多層結構的一些實例包括玻璃或矽，其在表面處具有鉭氧化物或另一種陶瓷氧化物的塗層。多層結構的其他實例包括其上具有經圖案化樹脂的基底性支撐物(例如玻璃或矽)。多層底材的仍其他實例可以包括絕緣體上矽 (silicon-on-insulator,SOI)底材。
在一個實例中，底材可以具有範圍在從約2mm至約300mm的直徑，或者具有最大尺寸至多達約10英尺(~3公尺)的矩形片或面板。在一個實例中，底材是具有範圍在從約200mm至約300mm的直徑的晶圓。在另一個實例中，底材是具有範圍在從約0.1mm至約10mm的寬度的裸晶。雖然已經提供了示例性的尺寸，但是應當理解，可以使用具有任何合適的尺寸的底材。對於另一個實例，可以使用為矩形支撐物的面板，其具有比300mm圓形晶圓更大的表面積。
在流動池的一些實例中，第一引子組被附接至在底材上的第一區域，並且第二引子組被附接至在底材上的第二區域。圖1A至圖1D描繪了被附接至不同區域14、16的引子組12A、12A’、12B、12B’、12C、12C’和12D、12D’的不同配置。
第一引子組12A、12B、12C和12D中的每一個包括不可切割的第一引子18或18’和可切割的第二引子20或20’；並且第二引子組12A’、12B’、12C’和12D’中的每一個包括可切割的第一引子19和不可切割的第二引子21。
不可切割的第一引子18或18’和可切割的第二引子20或20’是寡核苷酸對，例如，其中不可切割的第一引子18或18’是正向擴增引子且可切割的第二引子20或20’是反向擴增引子，或者其中可切割的第二引子20或20’是正向擴增引子且不可切割的第一引子18或18’是反向擴增引子。在第一引子組12A、12B、12C和12D的各個實例中，可切割的第二引子20或20’包括切割位點22，而不可切割的第一引子18或18’不包括切割位點22。
可切割的第一引子19或19’和不可切割的第二引子21或21’也是寡核苷酸對，例如，其中可切割的第一引子19或19’是正向擴增引子且不可切割的第二引子21或21’是反向擴增引子，或者其中不可切割的第二引子21或21’是正 向擴增引子且可切割的第一引子19或19’是反向擴增引子。在第二引子組12A’、12B’、12C’和12D’的各個實例中，可切割的第一引子19或19’包括切割位點22’或23，而不可切割的第二引子21或21’不包括切割位點22’或23。
應當理解，第一引子組12A、12B、12C、12D的不可切割的第一引子18或18’和第二引子組12A’、12B’、12C’和12D’的可切割的第一引子19或19’具有相同的核苷酸序列(例如，兩者都是正向擴增引子)，除了可切割的第一引子19或19’包括整合到其核苷酸序列或附接至其核苷酸序列的連接子24’中的切割位點22’或23。類似地，第一引子組12A、12B、12C、12D的可切割的第二引子20或20’和第二引子組12A’、12B’、12C’和12D’的不可切割的第二引子21或21’具有相同的核苷酸序列(例如，兩者都是反向擴增引子)，除了可切割的第二引子20或20’包括整合到其核苷酸序列或附接至其核苷酸序列的連接子24中的切割位點22之外。
應當理解，當第一引子18和19或18’和19’是正向擴增引子時，第二引子20和21或20’和21’是反向引子，並且反之亦然。
不可切割的引子18、21或18’、21’的實例包括P5引子和P7引子，其實例用於在由Illumina Inc.出售的商業流動池的表面上用於例如在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、ISEQTM、GENOME ANALYZERTM和其他儀器平臺上定序。P5引子和P7引子具有用於捕獲和/或擴增目的的通用序列。在一個實例中，P5引子和P7引子包括以下：P5：5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ.ID.NO.1)
P7：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ.ID.NO.2)
P5引子和P7引子是不可切割的引子18、21或18’、21’，因為它們不包括切割位點22、22’、23。應當理解，任何合適的通用序列可以用作不可切割的引子18、21或18’、21’。
可切割的引子19、20或19’、20’的實例包括P5和P7(或其他通用序列)引子，其中切割位點22、22’、23被分別併入相應的核酸序列中(例如，圖1A和圖1C)，或被併入分別將可切割的引子19、20或19’、20’附接至相應區域16、14的連接子24’、24中(圖1B和圖1D)。合適的切割位點22、22’、23的實例包括酶可切割的核鹼基或化學可切割的核鹼基、經修飾的核鹼基或連接子(例如，在核鹼基之間)。酶可切割的核鹼基可能容易通過與醣苷酶和內切核酸酶或與核酸外切酶的反應來切割。可切割的核鹼基的一個具體實例是去氧尿嘧啶(dU)，其可以被USER酶靶向。在一個實例中，尿嘧啶鹼基可以被併入P5引子的3’末端的第7個鹼基位置(P5U)或P7引子的3’末端的第7個鹼基位置(P7U)。其他無鹼基位點還可以被使用。化學可切割的核鹼基、經修飾的核鹼基或連接子的實例包括鄰位二醇、二硫化物、矽烷、偶氮苯、可光切割的基團、烯丙基T(具有烯丙基官能性的胸腺嘧啶核苷酸類似物)、烯丙基醚或疊氮基官能醚。
各個引子組12A和12A’或12B和12B’或12C和12C’或12D和12D’被分別附接至在底材上的區域14或16。在一些實例中，區域14、16具有相同的表面化學性，並且本文闡述的任何技術可以用於將一組引子18、20或18’、20’接枝到區域14上，並將另一組引子19、21或19’、21’接枝到區域16上。在其他實例中，區域14或16包括不同的表面化學性質(例如官能基)，其可以選擇性地分別與引子18、20或18’、20’或19、21或19’、21’反應。在這些其他實例中，第一區域14具有第一官能基，並且第二區域16具有不同於第一官能基的第二官能基。
如所提及的，圖1A至圖1D描繪了被附接至不同區域14、16的引子組12A、12A’、12B、12B’、12C、12C’和12D、12D’的不同配置。更具體地， 圖1A至圖1D描繪了可以使用的引子18、20和19、21或18’、20’和19’、21’的不同配置。
在圖1A中示出的實例中，引子組12A和12A’的引子18、20和19、21被直接附接至區域14和16，例如，沒有連接子24、24’。區域14可以具有可以在引子18、20的5’末端固定末端基團的表面官能基。類似地，區域16可以具有可以在引子19、21的5’末端固定末端基團的表面官能基。在一個實例中，區域14和引子18、20之間的固定化學以及區域16和引子19、21之間的固定化學可以不同，使得引子18、20或19、21選擇性地附接至期望的區域14或16。在另一個實例中，對於區域14、16和相應的引子18、20或19、21，固定化學可以是相同的，並且可以使用圖案化技術一次接枝一個引子組12A、12A’。在仍另一個實例中，被應用來形成區域14、16的材料可以分別具有被預接枝到在其上的引子18、20或19、21，並且因此固定化學可以相同或不同。
在該實例中，固定可以通過單點共價分別附接至引子18和20或19和21的5’末端的相應區域14或16。本領域已知的任何合適的共價附接手段可以在區域14、16使用。可以使用的封端的引子的實例包括炔烴封端的引子、四
Figure 108120316-A0305-02-0040-82
封端的引子、疊氮基封端的引子、胺基封端的引子、環氧基或縮水甘油基封端的引子、硫代磷酸酯封端的引子、硫醇封端的引子、醛封端的引子、肼封端的引子、亞磷醯胺(phosphoramidite)封端的引子和三唑啉二酮封端的引子。在一些具體的實例中，琥珀醯亞胺(NHS)酯封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與胺反應，醛封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與肼反應，或者炔烴封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與疊氮化物反應，或者疊氮化物封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與炔烴或DBCO(二苯并環辛炔)反應，或者胺基封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與經活化的羧酸基或NHS酯反應，或者硫醇封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與烷基化反應物(例如，碘代乙 醯胺(iodoacetamine)或馬來醯亞胺)反應，亞磷醯胺封端的引子可以在區域14和/或16的表面處與硫醚反應，或者經生物素修飾的引子可以在區域14和/或16的表面處與鏈黴抗生物素蛋白反應。
同樣在圖1A中示出的實例中，每種可切割的引子20、19的切割位點22、22’被併入到引子20、19的序列。在該實例中，在分別為引子組12A、12A’的可切割的引子20、19中使用相同類型的切割位點22、22’。作為實例，切割位點22、22’是尿嘧啶鹼基，並且可切割的引子20、19是P5U和P7U。在該實例中，寡核苷酸對18、20的不可切割的引子18可以是P7，並且寡核苷酸對19、21的不可切割的引子21可以是P5。因此，在該實例中，第一引子組12A包括P7、P5U，並且第二引子組12A’包括P5、P7U。引子組12A、12A’具有相反的線性化學性，在擴增、簇生成和線性化之後，其使得能夠在一個區域14或16上形成正向模版股，並且在另一個區域16或14上形成反向股。
在圖1B中示出的實例中，引子組12B和12B’的引子18’、20’和19’、21’例如通過連接子24、24’被附接至區域14和16。區域14可以具有可以在引子18’、20’的5’末端固定連接子24的表面官能基。類似地，區域16可以具有可以在引子19’、21’的5’末端固定連接子24的表面官能基。在一個實例中，區域14和連接子24的固定化學以及區域16和連接子24’的固定化學可以不同，使得引子18’、20’或19’、21’被選擇性地接枝到期望的區域14或16。在另一個實例中，區域14、16和連接子24、24’的固定化學可以是相同的，並且本文揭露的任何合適的技術可以用於一次接枝一個引子組12B、12B’。在仍另一個實例中，應用於形成區域14、16的材料可以分別具有被預接枝到在其上的引子18’、20’和19’、21’，並且因此固定化學可以相同或不同。合適的連接子24、24’的實例可以包括核酸連接子(例如，10個核苷酸或更少)或非核酸連接子，諸如聚乙二醇鏈、烷基基團或碳鏈、具有鄰位二醇的脂肪族連接子、肽連接子、等等。核酸連接子的實例 是polyT間隔子，儘管也可以使用其他核苷酸。在一個實例中，間隔子是6T至10T的間隔子。以下是核苷酸的一些實例，包括非核酸連接子(其中B是核鹼基，並且「寡核苷酸」是引子)：
Figure 108120316-A0305-02-0042-15
在圖1B中示出的實例中，引子18’、19’具有相同的序列和相同的或不同的連接子24、24’。引子18’係不可切割的，而引子19’包括被併入到連接子24’中的切割位點22’。同樣在該實例中，引子20’、21’具有相同的序列(例如P7)和相同的或不同的連接子24、24’。引子21’係不可切割的，並且引子20’包括被併入到連接子24的切割位點22。在各可切割的引子20’、19’的連接子24、24’中使用相同類型的切割位點22、22’。作為實例，切割位點22、22’可以是被併入到核酸連接子24、24’的尿嘧啶鹼基。引子組12B、12B’具有相反的線性化學性，在擴增、簇生成和線性化之後，其使得能夠在一個區域14或16上形成正向模版股，並且在另一個區域16或14上形成反向股。
圖1C中示出的實例類似於圖1A中示出的實例，除了分別在引子組12C、12C’的可切割的引子20、19中使用不同類型的切割位點22、23。作為實 例，可以使用兩個不同的酶切割位點，可以使用兩個不同的化學切割位點，或者可以使用一個酶切割位點和一個化學切割位點。可以分別用於可切割的引子20、19的不同切割位點22、23的實例包括鄰位二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制酶位點和8-氧代鳥嘌呤的任何組合。
圖1D中示出的實例類似於圖1B示出的實例，除了在被分別附接至引子組12D、12D’的可切割的引子20’、19’的連接子24、24’中使用不同類型的切割位點22、23。可以用於分別被附接至可切割的引子20、19的連接子24、24’的不同切割位點22、23的實例包括鄰位二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制酶位點和8-氧代鳥嘌呤的任何組合。
在圖1A至圖1D中示出的任何實例中，引子18、20和19、21或18’、20’和19’、21’與區域14、16的附接使得引子18、20和19、21或18’、20’和19’、21’的模版特異性部分自由黏著至其同源模版，並且3’羥基基團自由用於引子延伸。
區域14、16表示在底材上的不同地區，所述底材具有附接至其的不同的引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’。區域14、16可以包括具有不同官能基的材料。在一些情況下，不同的官能基是底材的表面官能基或已經被併入底材的表面的官能基，或者可以是被沉積在底材上的另一組分(例如聚合物層、珠、等等)的官能基。
在一些實例中，區域14、16在化學上是相同的，並且本文揭露的任何技術可以用於分別將分別為組12A和12A’、或12B和12B’、或12C和12C’、或12D和12D’的引子18、20和19、21或18’、20’和19’、21’順序附接至區域14、16。
在區域14、16化學上相同的一個實例中，區域14、16皆包括相同的聚合物層。聚合物層可以是對液體和氣體可滲透的半剛性聚合物材料。聚合 物層的實例包括丙烯醯胺共聚物，諸如聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺，PAZAM。PAZAM和丙烯醯胺共聚物的一些其他形式由以下結構(I)表示：
Figure 108120316-A0305-02-0044-16
其中：RA選自由以下組成的組：疊氮基、可選地被取代的胺基、可選地被取代的烯基、可選地被取代的腙、可選地被取代的肼、羧基、羥基、可選地被取代的四唑、可選地被取代的四
Figure 108120316-A0305-02-0044-81
、腈氧化物、硝酮和硫醇；RB是H或可選地被取代的烷基；RC、RD和RE各自獨立地選自由H和可選地被取代的烷基組成的組；各個-(CH2)p-可以可選地被取代；p是範圍在1至50的整數；n是範圍在1至50,000的整數；且m是範圍在1至100,000的整數。
本領域普通技術人員會認識到，結構(I)中重複的「n」和「m」特徵的佈置是代表性的，並且單體子單元可以以任何順序存在於聚合物結構中(例如，隨機 的、嵌段的、模式化的或其等之組合)。
PAZAM的分子量範圍可以在從約10kDa至約1500kDa，或者在具體的實例中，可以是約312kDa。
在一些實例中，PAZAM是線性聚合物。在一些其他實例中，PAZAM是輕度交聯的聚合物。
在其他實例中，聚合物26可以是結構(I)的變體。在一個實例中， 丙烯醯胺單元可以用N,N-二甲基丙烯醯胺(
Figure 108120316-A0305-02-0045-58
)置換。在該實例中，結 構(I)中的丙烯醯胺單元可以用
Figure 108120316-A0305-02-0045-90
置換，其中RD、RE和RF各 自為H，並且RG和RH各自為甲基基團(代替如丙烯醯胺的情況中的H)。在該實例中，q可以是範圍在1至100,000的整數。在另一個實例中，除了丙烯醯胺單元之外，可以使用N,N-二甲基丙烯醯胺。在該實例中，除了重複的「n」和「m」特 徵之外，結構(I)可以包括
Figure 108120316-A0305-02-0045-59
，其中RD、RE和RF各自為H，並 且RG和RH各自為甲基基團。在該實例中，q可以是範圍在1至100,000的整數。
作為另一種示例性聚合物，結構(I)中重複的「n」特徵可以用包含具有結構(II)的雜環疊氮基基團的單體置換：
Figure 108120316-A0305-02-0046-23
其中R1是H或C1-C4烷基；R2是H或C1-C4烷基；L是連接子，其包含具有2個至20個選自由碳、氧和氮組成的組的原子以及在鏈中碳和任何氮原子上的10個可選的取代基的線性鏈；E是線性鏈，其包含1個至4個選自由碳、氧和氮組成的組的原子，以及在鏈中碳和任何氮原子上的可選的取代基；A是N取代的醯胺，其中H或C1-C4烷基被附接至N；並且Z是含氮雜環。Z的實例包括以單環結構或稠合結構存在的5個至10個環成員。
作為仍另一個實例，聚合物可以包含結構(III)和結構(IV)中的每一個的重複單元：
Figure 108120316-A0305-02-0046-91
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一個獨立地選自氫、可選地被取代的烷基或可選地被取代的苯基；R3a和R3b各自獨立地選自氫、可選地被取代的烷基、可選 地被取代的苯基或可選地被取代的C7-14芳烷基；並且L1和L2各自獨立地選自可選地被取代的伸烷基連接子或可選地被取代的伸雜烷基連接子。
應當理解，其他分子可以用於形成聚合物層，只要它們被官能化以與第一引子組和第二引子組12A、12A’或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’相互作用。合適的聚合物層的其他實例包括具有膠體結構的那些，諸如瓊脂糖；或聚合物網狀結構，諸如明膠；或交聯的聚合物結構，諸如聚丙烯醯胺聚合物和共聚物、無矽烷丙烯醯胺(SFA)或SFA的疊氮化版本。合適的聚丙烯醯胺聚合物的實例可以從丙烯醯胺和丙烯酸或含有乙烯基基團的丙烯酸合成，或者從形成[2+2]光環加成反應的單體合成。合適的聚合物層的仍其他實例包括丙烯醯胺和丙烯酸酯的混合共聚物。還可以使用支鏈聚合物，諸如星形聚合物(star polymer)、星狀或星形嵌段聚合物(star-shaped or star-block polymer)、樹狀聚合物及類似物。
在其他實例中，區域14、16在化學上是不同的。例如，區域14可以具有可以固定第一引子組12A、12B、12C、12D的引子18、20或18’、20’的表面官能基，並且區域16可以具有可以固定第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’的引子19、21或19’、21’的不同表面官能基。
在其中區域14、16在化學上不同的一個實例中，使用嵌段共聚物。在該實例中，嵌段共聚物包含兩個不同的嵌段，一個嵌段具有可以附接至第一引子組12A、12B、12C、12D的引子18、20或18’、20’的引子接枝性官能基，並且另一個嵌段具有可以附接至第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’的引子19、21或19’、21’的引子接枝性官能基。引子接枝性官能基的實例選自由以下組成的組：疊氮化物/疊氮基、可選地被取代的胺基、可選地被取代的烯基、醛、可選地被取代的腙、可選地被取代的肼、羧基、羥基、可選地被取代的四唑、可選地被取代的四
Figure 108120316-A0305-02-0047-80
、腈氧化物、硝酮、硫醇、及其等之組合。
化學上不同的區域14、16的其他實例包括金和PAZAM、金和鋁、具有兩個不同表面官能基(例如疊氮化物和胺)的矽烷、在金上的硫醇經自組裝單層和在鋁或氧化鉿上的膦酸酯經自組裝單層、SiO2和Ta2O5、環氧樹脂和Ta2O5、包含疊氮化物基團的第一聚合物和包含胺基基團的第二聚合物、SiO2和銅、或環氧樹脂和銅。雖然已經提供了若干實例，但是應當理解，可以使用化學上不同的區域14、16的其他組合。
區域14、16也可以具有不同的物理配置。圖2至圖6B圖示出了這些配置的不同實例。在這些實例中，底材26係以單層/材料，諸如玻璃、矽、等等示出。然而，應當理解，多層底材可以與這些示例性配置中的任一種一起使用。例如，這些實例中的任一種可以包括支撐物和在支撐物上形成的經圖案化樹脂。
圖2圖示出了區域14、16位於底材26的表面S的不同地區的實例。
用於製造圖2中示出的實例的一種示例性方法在圖26A至圖26H中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。
如圖26A示出的，第一經官能化層60被施加於底材26上。第一經官能化層60可以是聚合物(PAZAM)、矽烷、金屬(金、鋁、等等)或任何其他具有可以附接至第一引子組12A、12B、12C、12D的官能基的材料。第一經官能化層60可以使用本文描述的任何技術來沉積。
取決於所使用的第一經官能化層60，底材26可以使用矽烷化或電漿灰化來活化，以產生可以與第一經官能化層60反應的表面基團。矽烷化和電漿灰化的實例參考圖13A更詳細地描述。然後，第一經官能化層60可以使用本文描述的任何技術來沉積。取決於所使用的材料，第一經官能化層60也可以被固化。
在圖26B和圖26C中，第一經官能化層60然後被圖案化以形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域(區域14)。在一個實例中，光阻劑62是負性光阻劑(暴露的區域變得不可溶)。合適的負性光阻劑的實例包括基於環氧基的SU-8光阻劑(從MicroChemicals可獲得)。光阻劑62被施加至第一經官能化層60，選擇性地暴露於某些波長的光以形成不溶性區域(62處示出的)，並且暴露於顯影劑溶液以去除可溶性部分。在另一個實例中，光阻劑62是正性光阻劑(暴露的區域變得可溶)。合適的正性光阻劑的實例包括MICROPOSIT® S1800系列或AZ® 1500系列，這兩個系列均從MicroChemicals可獲得。光阻劑62被施加至底材26，選擇性地暴露於某些波長的光以形成可溶性區域，並且暴露於顯影劑溶液以去除可溶性部分，留下不溶性部分(62處示出的)。在其他實例中，光阻劑62可以用奈米壓模微影術樹脂替代，該奈米壓模微影術樹脂被圖案化以形成區域(例如，62)。
如圖26C中示出的，第一經官能化層60的暴露的部分(例如，未被光阻劑62覆蓋的部分)然後可以例如經由蝕刻或另一種合適的技術來去除。
如圖26D中示出的，然後使用任何合適的沉積技術，在光阻劑62和底材26的一些部分(例如，暴露的表面S)上施加第二經官能化層64。取決於所使用的材料，第二經官能化層64也可以被固化。
如圖26E中示出的，然後可以剝離光阻劑62，這也去除了在其上的任何第二經官能化層64。
在圖26F和圖26G中，第二經官能化層64的一部分被去除。為了去除該部分，施加、暴露和顯影第二光阻劑62’，使得不溶性區域(62’處示出的)覆蓋第一經官能化區域14和第二經官能化層64的期望部分，該第二經官能化層64的期望部分i)鄰接第一經官能化區域14並且ii)將成為第二經官能化區域16。一旦形成光阻劑62’，第二經官能化層64的暴露的部分(例如，未被光阻劑62’覆蓋的部分)然後可以例如經由蝕刻或另一種合適的技術來去除。
如圖26H中示出的，然後可以剝離光阻劑62’，這暴露了第一經官能化區域14和第二經官能化區域16。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖26A至圖26H中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖26A至圖26H中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖26A)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖26H)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖26D)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖26H)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以通過流過沉積(例如，使用臨時結合的蓋)、浸泡塗佈、噴塗、小池分配來完成，或者通過會將引子18、20或18’、20’附接至區域14或會將引子19、21或19’、21’附接至區域16的另一種合適的方法來完成。這些示例性技術中的每一種可以利用引子溶液或混合物，其可以包含引子18、20或18’、20’、19、21或19’、21’、水、緩衝液和催化劑。 用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對底材26不具有親和力。
雖然在圖26A至圖26H中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在一個實例中，區域14是金，並且第一SAM包含可以附接至金的硫醇基團和可以附接至引子18、20或18’、20’的疊氮化物基團。在另一個實例中，區域16是氧化鉿或氧化鋁，並且第二SAM包含可以附接至氧化鉿或氧化鋁的膦酸酯基團和可以附接至引子19、21或19’、21’的胺基團。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
用於製造圖2中示出的實例的另一種示例性方法在圖27A至圖27F中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。
如圖27A示出的，第一光阻劑62被施加於底材26上，使得第一底材部分66保持暴露。在該實例中，光阻劑62可以是正性光阻劑(暴露的區域變得可溶)或負性光阻劑(暴露的區域變得不可溶)。光阻劑62還可以用奈米壓模微影術樹脂替代，該奈米壓模微影術樹脂被圖案化以形成一區域(例如，62)。
如圖27B示出的，第一經官能化層60可以使用本文描述的任何技術沉積在光阻劑62上和第一底材部分66上。在一些情況下，第一經官能化層60也可以被固化。
如圖27C中示出的，然後可以剝離光阻劑62，這也去除了在其上的任何第一經官能化層60。這留下了在底材表面S上形成的區域14。
施加、暴露和顯影第二光阻劑62’，使得不溶性區域(62’處示出的)覆蓋除了鄰接第一經官能化區域14的第二底材部分68以外的第一經官能化區域14和底材26。
如圖27E中示出的，然後使將第二經官能化層64用任何合適的沉 積技術施加，並且在一些情況下固化在光阻劑62’上和第二底材部分68上。
如圖27F中示出的，然後可以剝離光阻劑62’，這去除了在其上的任何第二經官能化層64。這暴露了第一經官能化區域14和第二經官能化區域16。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖27A至圖27F中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖27A至圖27F中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖27B或圖27C)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖27F)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖27E)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖27F)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對底材26不具有親和力。
雖然在圖27A至圖27F中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區 域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
用於製造圖2中示出的實例的又另一種示例性方法在圖41A至圖41G中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。
底材26可以是本文揭露的底材的任何實例。雖然未示出，但是應當理解，底材也可以是多層底材，其包括在支撐物上的未經圖案化樹脂(例如，在玻璃支撐物上的奈米壓模微影術樹脂，或者本文描述的樹脂54和支撐物52的任何其他實例，參見「基於珠的流動池」部分)。
如圖41A中示出的，在該實例中，犧牲金屬層98被施加在底材26上。在一個實例中，可使多層底材的奈米壓模微影術樹脂/抗蝕劑暴露於氧電漿，並且然後可以使用任何合適的金屬沉積技術沉積犧牲金屬層98。在一個實例中，使用濺射沉積犧牲金屬層98。犧牲金屬層98的實例包括鋁或銅，並且層98可以具有範圍在從約10nm至約100nm的厚度。
如圖41B中示出的，抗蝕劑被施加至犧牲金屬層98，並且被圖案化以在其中限定多級或多深度凹陷。經圖案化樹脂以元件符號54’示出。在該實例中，樹脂可以是任何奈米壓模微影術樹脂。在一個實例中，樹脂被旋塗和軟烘烤，並且然後被壓印和固化(例如，使用紫外線固化)以限定多級或多深度凹陷，其包括被經圖案化樹脂54’的階梯部分74部分地限定的深部分70和淺部分72。
然後，可以使用濕蝕刻或乾蝕刻以暴露為深部分70的基底的底材26的部分100(例如，多層底材的未經圖案化樹脂或玻璃的一部分)和為淺部分72的基底的犧牲金屬層98的部分102。暴露的部分在圖41C中示出。在濕蝕刻的實例中，FeCl3可以用於去除銅犧牲金屬層98。在濕蝕刻的另一個實例中，KOH可以用於去除鋁犧牲金屬層98。在乾蝕刻的實例中，氧電漿可以首先用於去除經 圖案化樹脂54’的殘留物，並且然後Cl2和BCl3電漿的組合可以用於蝕刻鋁犧牲金屬層98。氧電漿可以再次用於清潔暴露的部分100和102。在該實例中，深度D1(例如，淺部分72的深度)和D2(例如，從深部分70的底部到階梯部分74的頂部)，以及犧牲金屬層98的厚度D3可以相同或相似(例如，在彼此的一奈米內)，使得在蝕刻期間去除材料54’和98各自的期望的厚度，以便暴露部分100和102。
如圖41D中示出的，第一經官能化層60可以被沉積在剩餘的經圖案化樹脂54’上、在底材26的暴露的部分100上以及在犧牲金屬層98的暴露的部分102上。第一經官能化層60可以是任何所述實例，並且可以使用本文描述的任何技術來沉積。在一些情況下，第一經官能化層60也被固化。
在圖41E中，濕蝕刻用於選擇性地去除第一經官能化層60的一部分和犧牲金屬層98的另一部分，以便暴露底材26的另一部分104。濕蝕刻可以如本文描述地進行。所使用的蝕刻劑可以蝕刻犧牲金屬層98，從而剝離第一經官能化層60。
如圖41F中示出的，然後第二經官能化層64被施加在暴露的部分104上和第一經官能化層60上。任何合適的沉積技術可以用於第二經官能化層64。在本文揭露的任何示例性方法中，當在高離子強度下(例如，在10x PBS、NaCl、KCl、等等存在下)進行沉積時，第二經官能化層64不沉積在第一經官能化層60上或黏附到第一經官能化層60。因此，第二經官能化層64不會污染第一經官能化層60，留下區域16。
如圖41G中示出的，然後可以剝離剩餘的經圖案化樹脂54，這去除了在其上的任何第一經官能化層60。該剝離程序可以在二甲基亞碸(DMSO)中使用音波振動進行，或者在丙酮中，或者使用基於NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剝除劑進行。然後暴露剩餘的犧牲金屬層98，並且可以使用如本文描述地濕蝕刻去除其。在濕蝕刻後，區域14、16在底材表面上保持完整，部分是因為犧牲 金屬層98不存在於區域14、16的下方。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖41A至圖41G中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖41A至圖41G中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖41D)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖41G)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖41F)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖41G)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以通過流過沉積(例如，使用臨時結合的蓋)、浸泡塗佈、噴塗、小池分配來完成，或者通過會將引子18、20或18’、20’附接至區域14或會將引子19、21或19’、21’附接至區域16的另一種合適的方法來完成。這些示例性技術各自可以利用引子溶液或混合物，其可以包含引子18、20或18’、20’、19、21或19’、21’、水、緩衝液和催化劑。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對底材26不具有親和力。
用於製造圖2中示出的實例的仍另一種示例性方法在圖42A至圖 42H中示出。同樣，雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。
底材26可以是本文揭露的底材的任何實例。類似於圖41A至圖41G中描述的實例，底材也可以是包括在支撐物上的未經圖案化樹脂的多層底材。
如圖42A中示出的，在該實例中，犧牲金屬層98被施加在底材26上。犧牲金屬層98可以是任何所述示例性材料，並且可以通過任何所述實例參考圖41A來沉積。
如圖42B中示出的，抗蝕劑被施加至犧牲金屬層98，並且被圖案化以在其中限定多級或多深度凹陷。經圖案化樹脂以元件符號54’示出。在該實例中，樹脂可以是任何奈米壓模微影術樹脂。在一個實例中，樹脂被旋塗和軟烘烤，並且然後被壓印和固化(例如，使用紫外線固化)以限定多級或多深度凹陷，其包括被經圖案化樹脂54’的階梯部分74部分地限定的深部分70和淺部分72。
然後，可以使用濕蝕刻或乾蝕刻以暴露為深部分70的基底的底材26的部分100(例如，多層底材的未經圖案化樹脂的一部分)和為淺部分72的基底的犧牲金屬層98的部分102。暴露的部分100和102在圖42C中示出。濕蝕刻或乾蝕刻可以如所述參考圖41C來進行。
如圖42D中示出的，第一經官能化層60可以被沉積在剩餘的經圖案化樹脂54’上、在底材26的暴露的部分100上以及在犧牲金屬層98的暴露的部分102上。第一經官能化層60可以是任何所述實例，並且可以使用本文描述的任何技術來沉積。在一些情況下，第一經官能化層60也可以被固化。
在圖42E和圖42F中，第一經官能化層60然後被圖案化以形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域(區域14)。在該實例中，光阻劑62是負性光阻劑。光阻劑62可以被施加至第一經官能化層60，選擇性地暴露於某些波長的光 以形成不溶性區域，並且暴露於顯影劑溶液以去除可溶性部分。剩餘的光阻劑62位於第一經官能化層60的於在深部分70中的部分100上的部分上。
如圖42F中示出的，第一經官能化層60的暴露的部分(例如，未被光阻劑62覆蓋的部分)然後可以例如經由蝕刻或另一種合適的技術來去除。該蝕刻程序(例如氧電漿)還去除了一些經圖案化樹脂54’和一些光阻劑62。在分開的蝕刻程序中，去除為淺部分72的基底的犧牲金屬層98(參見圖42B)。在該實例中，可以參考圖41C使用所述的濕蝕刻或乾蝕刻。該程序暴露了底材26的另一部分104。
如圖42G中示出的，然後使用任何合適的沉積技術，在樹脂54’的暴露的部分、光阻劑62和底材26的暴露的部分104上施加第二經官能化層64。 在一個實例中，第二經官能化層64可以被沉積在光阻劑62上，但是當光阻劑62被剝離時，可以與光阻劑62一起去除。
如圖42H中示出的，然後可以剝離剩餘的經圖案化樹脂54’和光阻劑62，這去除了在其上的任何第二經官能化層64。該剝離程序可以在二甲基亞碸(DMSO)中使用音波振動進行，或者在丙酮中，或者使用基於NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剝除劑進行。然後暴露剩餘的犧牲金屬層98，並且可以使用如本文描述地濕蝕刻去除其。在濕蝕刻後，區域14、16在底材表面上保持完整，部分是因為犧牲金屬層98不存在於區域14、16的下方。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖42A至圖42H中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖42A至圖42H中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能 化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖42D)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖42H)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖42G)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖42H)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以通過流過沉積(例如，使用臨時結合的蓋)、浸泡塗佈、噴塗、小池分配來完成，或者通過會將引子18、20或18’、20’附接至區域14或將引子19、21或19’、21’附接至區域16的另一種合適的方法來完成。這些示例性技術中的每一種可以利用引子溶液或混合物，其可以包含引子18、20或18’、20’、19、21或19’、21’、水、緩衝液和催化劑。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對底材26不具有親和力。
圖2中示出的示例性區域14、16也可以使用微接觸印刷或直接印刷技術，諸如噴墨印刷來形成。當期望產生微米級諸如約1μm至約50μm的區域時，這些方法可以是特別合適的。
在圖2中示出的實例中，應當理解，多組分開的區域14、16可以橫跨底材表面S以陣列形成。許多不同的佈局可以用於陣列，只要分開的組內的區域14、16彼此相鄰即可。
圖3A至圖6B圖示出了不同的實例，其中區域14、16中的至少一個位於在底材26中限定的凹陷28中。凹陷28可以形成在單層底材(例如，底材26) 中，或者可以形成在多層底材的最外層中。
凹陷28可以使用任何合適的技術形成，諸如微影術、奈米壓模微影術(NIL)、衝壓技術、壓花技術、模製技術、微蝕刻技術、等等。
雖然在圖3A至圖6B的每一個中示出了單個凹陷28，但是應當理解，流動池可以包括由間隙區域30分隔的多於一個的凹陷28，其中各個凹陷28包括位於第一部分的第一區域14和位於第二部分的第二區域16。仍然進一步地，本文揭露的一些實例包括具有不同尺寸的凹陷28A和28B(參見例如圖11C)，或包括互連的但具有不同尺寸的兩個部分34、34’的凹陷28C(參見例如圖11D)。 應當理解，以下關於凹陷28的討論可以適用於本文揭露的凹陷28、28A、28B、28C的任何實例。
可以設想凹陷28的許多不同佈局，包括規則的、重複的和非規則的圖案。在一個實例中，凹陷28被設置成六邊形網格以用於緊密的填充和改進的密度。其他佈局可以包括例如直線(即矩形)佈局(參見圖24)、三角形佈局、等等。在一些實例中，佈局或圖案可以是呈行和列的凹陷28的x-y形式。在一些其他實例中，佈局或圖案可以是凹陷28和/或間隙區域30的重複佈置。在仍其他實例中，佈局或圖案可以是凹陷28和/或間隙區域30的隨機佈置。圖案可以包括條帶、漩渦、線、三角形、矩形、圓形、弧形、棋盤格(check)、方格(plaid)、對角線、箭頭、正方形和/或交叉影線。
佈局或圖案可以以在所限定的地區中的凹陷28的密度(即，凹陷28的數目)來表徵。例如，凹陷28可以以每mm2約200萬的密度存在。密度可以被調整到不同的密度，包括例如每mm2至少約100、每mm2至少約1,000、每mm2至少約10萬、每mm2至少約100萬、每mm2至少約200萬、每mm2至少約500萬、每mm2至少約1000萬、每mm2至少約5000萬或更大的密度。可選擇地或另外地，密度可以被調整為每mm2不大於約5000萬、每mm2不大於約1000萬、每mm2不大於 約500萬、每mm2不大於約200萬、每mm2不大於約100萬、每mm2不大於約10萬、每mm2不大於約1,000、每mm2不大於約100或更小。還應當理解，凹陷28的密度可以在選自上文的範圍的較低值之一和較高值之一之間。作為實例，高密度陣列可以被表徵為具有被分隔開小於約100nm的凹陷28，中等密度陣列可以被表徵為具有被分隔開約400nm至約1μm的凹陷28，並且低密度陣列可以被表徵為具有被分隔開大於約1μm的凹陷28。雖然已經提供了示例性密度，但是應當理解，可以使用具有任何合適的密度的底材。
凹陷28的佈局或圖案可以也或可選擇地以平均間距，即從凹陷28的中心到相鄰凹陷28的中心的間距(中心到中心的間距)或從一個凹陷28的邊緣到相鄰凹陷28的邊緣的間距(邊緣到邊緣的間距)來表徵。圖案可以是規則的，使得關於平均間距的變異係數小，或者圖案可以是不規則的，在這種情況下，變異係數可以是相對大的。在任一情況下，平均間距可以是例如至少約10nm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約100μm或更大。可選擇地或另外地，平均間距可以是例如至多約100μm、約10μm、約5μm、約1μm、約0.5μm、約0.1μm或更小。凹陷28的特定圖案的平均間距可以在選自上文的範圍的較低值之一和較高值之一之間。在一個實例中，凹陷28具有約1.5μm的間距(中心到中心的間距)。雖然已經提供了示例性的平均間距值，但是應當理解，也可以使用其他平均間距值。
在圖3A至圖6B中示出的實例中，凹陷28是井。井可以是微井或奈米井。各個井的尺寸可以通過其體積、井開口面積、深度和/或直徑來表徵。
各個井可以具有能夠容納液體的任何體積。最小體積或最大體積可以被選擇，例如以適應對流動池的下游使用所預期的吞吐量(例如，多重性)、解析度、分析物組成或分析物反應性。例如，體積可以是至少約1×10-3μm3、至少約1×10-2μm3、至少約0.1μm3、至少約1μm3、至少約10μm3、至少約100μm3 或更大。可選擇地或另外地，體積可以是至多約1×104μm3、至多約1×103μm3、至多約100μm3、至多約10μm3、至多約1μm3、至多約0.1μm3或更小。應當理解，區域14、16可以填充井的全部或部分體積。在單獨的井中的例如聚合物層的體積可以大於上文指定的值、小於上文指定的值或在上文指定的值之間。
可以基於與上文關於井體積闡述的標準相似的標準來選擇由在表面上的各個井開口佔據的面積。例如，在表面上的各個井開口的面積可以是至少約1×10-3μm2、至少約1×10-2μm2、至少約0.1μm2、至少約1μm2、至少約10μm2、至少約100μm2或更大。可選擇地或另外地，面積可以是至多約1×103μm2、至多約100μm3、至多約10μm2、至多約1μm2、至多約0.1μm2、約1×10-2μm2或更小。由各個井開口佔據的面積可以大於上文指定的值、小於上文指定的值或在上文指定的值之間。
各個井(或任何其他類型的凹陷28)的深度可以是至少約0.1μm、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。可選擇地或另外地，深度可以是至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.1μm或更小。各個井(或其他凹陷28)的深度可以大於上文指定的值、小於上文指定的值或在上文指定的值之間。
在一些情況下，各個井(或其他凹陷28)的直徑可以是至少約50nm、至少約0.1μm、至少約0.5μm、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。可選擇地或另外地，直徑可以是至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.5μm、至多約0.1μm或更小(例如，約50nm)。 各個井(或其他凹陷28)的直徑可以大於上文指定的值、小於上文指定的值或在上文指定的值之間。
當凹陷28是溝槽時(參見例如圖34H)，溝槽和間隙區域兩者可以具有直線配置。各個溝槽的深度可以是至少約0.02μm(20nm)、至少約0.1μm (100nm)、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。可選擇地或另外地，深度可以是至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.1μm或更小。各個溝槽的深度可以大於上文指定的值、小於上文指定的值或在上文指定的值之間。
在一些情況下，各個溝槽的寬度可以是至少約0.02μm、至少約0.1μm、至少約0.5μm、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。可選擇地或另外地，寬度可以是至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.5μm、至多約0.1μm或更小(例如，約50nm)。各個溝槽的寬度可以大於上文指定的值、小於上文指定的值或在上文指定的值之間。
圖3A和圖3B分別描繪了區域14、16位於凹陷28的不同地區的一個實例的橫截面圖和俯視圖。在該實例中，區域14、16在凹陷28內彼此直接相鄰。
用於製造圖3A和圖3B中示出的實例的一種示例性方法在圖28A至圖28G中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。此外，圖3A和圖3B描繪了限定在單層底材26中的凹陷28，而示例性方法描繪了限定在多層底材的支撐物52上的經圖案化樹脂54’中的凹陷28。應當理解，該方法可以用於單層底材。
在該實例中，多層底材包括在支撐物52上的(圖案化)樹脂54’。可以使用樹脂54(例如，參見「基於珠的流動池」部分)、支撐物52和用於使本文描述的經圖案化樹脂54的方法的任何實例。
如圖28A中示出的，在經圖案化樹脂54’中限定的凹陷28鄰接間隙區域30，間隙區域30分隔彼此相鄰的凹陷28。如圖28B中示出的，第一經官能化層60使用本文描述的任何技術被施加(例如，沉積或沉積和固化)在經圖案化樹脂 54’上。
在圖28C和圖28D中，第一經官能化層60然後被圖案化以形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域(區域14)。在該實例中，光阻劑62可以是負性光阻劑(暴露的區域變得不可溶)或正性光阻劑(暴露的區域變得可溶)。光阻劑62被施加至第一經官能化層60，選擇性地暴露於某些波長的光以形成不溶性區域或可溶性區域，並且暴露於顯影劑溶液以去除可溶性部分。在其他實例中，光阻劑62可以用奈米壓模微影術樹脂替代。如圖28C中示出的，在該實例中，光阻劑62覆蓋在凹陷28的第一部分76上的第一經官能化層60的一部分(例如，將成為區域14的層60的部分)，並且不覆蓋在凹陷28的第二部分78上的第一經官能化層60的第二部分。
如圖28D中示出的，第一經官能化層60的暴露的部分(例如，未被光阻劑62覆蓋的部分)然後可以例如經由蝕刻或另一種合適的技術來去除。這暴露了凹陷28的第二部分78和間隙區域30。
如圖28E中示出的，然後使用任何合適的沉積技術(取決於材料，固化或不固化)，將第二經官能化層64施加在光阻劑62上和底材26的一些部分(例如，暴露的表面S)上，包括凹陷28的第二部分78上以及間隙區域30上。
如圖28F中示出的，然後可以剝離光阻劑62，這也去除了在其上的任何第二經官能化層64。
在圖28G中，第二經官能化層64的一部分被去除。特別地，將第二經官能化層64從間隙區域30去除。在該實例中，去除包括從間隙區域30拋光第二經官能化層64(和可能存在的任何第一經官能化層60)。
拋光程序可以用溫和的化學漿料(包括，例如，研磨劑、緩衝液、螯合劑、表面活性劑和/或分散劑)來進行，該溫和的化學漿料可以從間隙區域30去除第二經官能化層64(和可能存在的任何第一經官能化層60)，而不有害地影響 在這些區域處的基底性底材26或經圖案化樹脂54’。可選擇地，拋光可以用不包含研磨顆粒的溶液來進行。
化學漿料可以用於化學機械拋光系統中以拋光間隙區域30的表面。拋光頭/襯墊或其他拋光工具能夠從間隙區域30拋光第二經官能化層64(和可能存在的任何第一經官能化層60)，同時使在凹陷28中的區域14、16至少大體上保持完整。作為實例，拋光頭可以是Strasbaugh ViPRR II拋光頭。
清潔和乾燥程序可以在拋光後進行。清潔程序可以利用水浴和音波振動。水浴可以被保持於範圍在從約22℃至約30℃的相對低的溫度。乾燥程序可以包括旋轉乾燥，或經由另一種合適的技術的乾燥。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖28A至圖28G中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖28A至圖28G中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖28B)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖28G)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖28E)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖28G)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對經圖案化樹脂54’不具有親和力。
雖然在圖28A至圖28G中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
用於製造圖3A和圖3B中示出的實例的另一種示例性方法在圖29A至圖29H中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。此外，圖3A和圖3B描繪了限定在單層底材26中的凹陷28，而示例性方法描繪了限定在多層底材的支撐物52上的經圖案化樹脂54’中的凹陷28’。應當理解，該方法可以用於單層底材。
在該實例中，多層底材包括在支撐物52上的(圖案化)樹脂54’。如圖29A中示出的，在經圖案化樹脂54’中限定的凹陷28’鄰接間隙區域30，間隙區域30分隔彼此相鄰的凹陷28’。凹陷28’是多級或多深度凹陷，其包括部分地由經圖案化樹脂54’的階梯部分74限定的深部分70和淺部分72。
在該實例中，犧牲層被施加在經圖案化樹脂54’上，使得犧牲層至少部分地填充凹陷28’中的深部分70。示例性犧牲層76是具有不同於該方法中使用的樹脂54’和光阻劑62的蝕刻速率的任何材料。合適的犧牲層材料76的實例包括矽、鋁、負性光阻劑或正性光阻劑、銅、等等。這些材料可以使用本文揭露的任何合適的技術來沉積。雖然未示出，但是應當理解，除了被沉積在深部分70的至少一部分中，犧牲層也可以被沉積在間隙區域30上和階梯部分74上， 或者完全填充凹陷28’。
然後順序地去除犧牲層的一部分和樹脂54’的一部分。犧牲層可以首先被回蝕刻，使得它從間隙區域30和從階梯部分74被去除，並且使得犧牲層在深部分70中的剩餘部分(在圖29B中以元件符號80示出)基本上與階梯部分74齊平。如圖29B中示出的，樹脂54’的若干部分被去除。例如，樹脂54’的一些部分被去除以形成新的(被稱為第二)間隙區域30’，間隙區域30’基本上與犧牲層80的剩餘部分齊平，並且樹脂54’被去除以除去階梯部分74。階梯部分74的去除形成了與犧牲層80的剩餘部分相鄰的凹陷28’的地區/部分76。
如圖29C中示出的，第一經官能化層60被施加在犧牲層80的剩餘部分、地區/部分76和(第二)間隙區域30’上。如圖29D中示出的，然後光阻劑62被施加在第一經官能化層60上。
光阻劑62的一些部分和基底性第一經官能化層60然後可以被去除，以暴露犧牲層80的剩餘部分和間隙區域30’。這在圖29E中示出。該去除程序可以通過用蝕刻劑蝕刻來完成，該蝕刻劑選擇性地去除光阻劑62的部分和基底性第一經官能化層60，但是不去除犧牲層80的剩餘部分。在該實例中，濕蝕刻可以用鹼性pH顯影劑溶液諸如NaOH、KOH或TMAH(四甲基氫氧化銨)進行，或者乾蝕刻可以用氧電漿進行。在該實例中，當犧牲層80的剩餘部分被暴露時，蝕刻停止。這在地區/部分76處留下了其上具有光阻劑的第二部分62”的第一經官能化層60的第二部分(例如，區域14)。
如圖29F示出的，然後犧牲層80的剩餘部分被去除以暴露與第一經官能化層60的第二部分(例如，區域14)相鄰的第二地區/部分78。該去除程序可以通過用蝕刻劑蝕刻來完成，該蝕刻劑選擇性地去除剩餘的犧牲層76，但是不去除其上具有光阻劑的第二部分62”的第一經官能化層60的第二部分(例如，區域14)。作為實例，鋁犧牲層80可以在酸性條件或鹼性條件下去除，銅犧牲層 80可以使用FeCl3來去除，光阻劑犧牲層80可以使用有機溶劑諸如丙酮來去除，或者在鹼性(pH)條件下去除；並且矽犧牲層80可以在鹼性(pH)條件下去除。
如圖29G中示出的，然後使用任何合適的沉積(以及如果適用的話，固化)技術，將第二經官能化層64施加至地區/部分78。這形成了第二經官能化區域16。如圖29G中示出的，第二經官能化層64還可以被施加在光阻劑的第二部分62”上和間隙區域30上。
如圖29G中示出的，然後可以剝離光阻劑的第二部分62”，這也去除了在其上的任何第二經官能化層64。這形成了第一經官能化區域14。還可以進行拋光以從間隙區域30’去除第二經官能化層64。
雖然圖29A至29H中示出的實例包括光阻劑62，但是應當理解，如果第二經官能化層64未黏附到第一經官能化層60，則光阻劑62可以被省略。 此外，如果犧牲層80是第一經官能化層60不黏附至其的透明材料，則犧牲層80可以不被去除，並且區域16可以在犧牲層80上形成。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖29A至圖29H中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖29A至圖29H中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖29C)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖29H)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化 層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖29G)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖29H)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對經圖案化樹脂54’不具有親和力。
雖然在圖29A至圖29H中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
用於製造圖3A和圖3B中示出的實例的仍另一種示例性方法在圖30A至圖30F中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。此外，圖3A和圖3B描繪了限定在單層底材26中的凹陷28’，而示例性方法描繪了限定在多層底材的支撐物52上的經圖案化樹脂54’中的凹陷28’。應當理解，該方法可以用於單層底材。
如圖30A中示出的，在該實例中，多層底材包括在支撐物52上的未經圖案化樹脂54和在樹脂54上的犧牲層80。可以使用樹脂54、支撐物52和犧牲層80的任何實例。
如圖30B中示出的，另外的樹脂被施加至犧牲層80，並且被圖案化以在其中限定凹陷28’。另外的樹脂可以與樹脂54相同或不同。凹陷28’是多級或多深度凹陷，其包括部分地由經圖案化樹脂54’的階梯部分74限定的深部分70 和淺部分72。
如圖30C中示出的，蝕刻經圖案化樹脂54’的第一部分(鄰接深部分70)和為深部分70的基底的犧牲層80的部分。這暴露了樹脂54的部分82。在一個實例中，經圖案化樹脂54’可以使用各向異性氧電漿來蝕刻，以暴露犧牲層80的基底性部分，並且然後可以例如使用BCl3和Cl2電漿去除犧牲層80的部分。
如圖30D中示出的，經圖案化樹脂54’的階梯部分74被例如使用氧電漿蝕刻掉。這暴露了為階梯部分74的基底的犧牲層80。所使用的蝕刻劑可以蝕刻樹脂54’，但不可以蝕刻犧牲層80。因此，犧牲層80充當蝕刻停止層，並且因此犧牲層80的部分102’被暴露。
應當理解，當蝕刻樹脂54’時，初始間隙區域30可以縮短。因此，形成間隙區域30’。
同樣如圖30D中示出的，可以沉積第一經官能化層60(並且在一些情況下固化)。第一經官能化層60可以不黏附到犧牲層80的暴露的部分102’，但是將黏附到樹脂54的部分82和凹陷28’周圍的間隙區域30’。
然後可以蝕刻掉犧牲層80的暴露的部分102’(例如，取決於材料，使用鹼性溶液或FeCl3)，並且可以沉積第二經官能化層64(並且取決於材料固化)。如圖30E中示出的，第二經官能化層64被施加至樹脂54的新暴露的部分(此處部分102’已經被去除)。在一個實例中，第一經官能化層60對第二經官能化層64不具有親和力，並且因此第二經官能化層64不沉積在第一經官能化層60上。 在所述方法的該實例中，如圖30F中示出的，可以進行拋光以從間隙區域30’去除第一經官能化層60。
在圖30A至圖30F的方法的一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖30A至圖30中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖30A-圖30F中未示出) 可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。 在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖30A或圖30D)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖30F)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖30E)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖30F)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對經圖案化樹脂54’不具有親和力。
雖然在圖30A至圖30F中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
用於製造圖3A和圖3B中示出的實例的仍另一種示例性方法在圖31A至圖31I中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。此外，圖3A和圖3B描繪了限定在單層底材26中的凹陷28’，而示例性方法描繪了限定在多層底 材的支撐物52上的經圖案化樹脂54’中的凹陷28’。應當理解，該方法可以用於單層底材。
如圖31A示出的，多層底材包括在支撐物52上的(圖案化)樹脂54’。在經圖案化樹脂54’中限定的凹陷28’鄰接間隙區域30，間隙區域30分隔彼此相鄰的凹陷28’。凹陷28’是多級或多深度凹陷，其包括部分地由經圖案化樹脂54’的階梯部分74限定的深部分70和淺部分72。
如圖31B中示出的，第一經官能化層60被施加在經圖案化樹脂54’上。第一經官能化層60可以是本文揭露的任何實例，並且可以使用本文描述的任何技術來沉積。
在圖31C和圖31D中，第一經官能化層60然後被圖案化以形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域(區域14)。在該實例中，光阻劑62是負性光阻劑(暴露的區域變得不可溶)。如圖31C中示出的，光阻劑62被施加至第一經官能化層60，選擇性地暴露於某些波長的光以形成不溶性區域(在圖31D中的62處示出的)，並且暴露於顯影劑溶液以去除可溶性部分。如圖31D中示出的，第一經官能化層60的暴露的部分(例如，未被光阻劑62覆蓋的部分)然後可以例如經由蝕刻或另一種合適的技術來去除。第一經官能化層60的剩餘部分(例如，區域14)在各個多級凹陷的第一級。在該實例中，第一級在支撐物52上的深部分70中。
在該實例中，犧牲層84被施加在光阻劑62和樹脂54’的一些部分(例如，間隙區域30、階梯部分74的表面)上。犧牲層84在圖31E中示出。任何材料可以用作相對於樹脂54’具有蝕刻差異的犧牲層84。在一個實例中，鋁可以用作犧牲層84。
如圖31F中示出的，犧牲層84被從樹脂54’的部分去除。犧牲層84可以首先被回蝕刻，使得它從間隙區域30和從階梯部分74被去除，並且使得犧牲層的剩餘部分(在圖31F中以元件符號84’示出)被保留在深部分70中的光阻劑 62上。
然後樹脂54’的一個區域(具體地為階梯區域74)被從多層凹陷28’去除，以產生鄰接第一經官能化區域14的地區/部分78(例如，為光阻劑62的基底的第一經官能化層60的的部分)和犧牲層的剩餘部分84’。該程序還可以去除間隙區域30的一些部分，產生新的間隙區域30’。該去除程序可以通過用蝕刻劑諸如氧電漿蝕刻來完成，該蝕刻劑選擇性地去除樹脂54’，但不去除犧牲層的剩餘部分84’。
如圖31H中示出的，然後使用任何合適的沉積技術將第二經官能化層64施加在犧牲層84的剩餘部分上、地區/部分78上以及間隙區域30’上。
如圖31I中示出的，然後可以剝離光阻劑62，這也去除了犧牲層的剩餘部分84’和在其上的任何第二經官能化層64。在間隙區域30’上的任何第二經官能化層64也可以經由拋光去除。
在圖31A至圖31I的方法的一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖31A至圖31I中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖31A至圖31I中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖31B)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖31I)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後 接枝(例如，在圖31H)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖31I)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對經圖案化樹脂54’不具有親和力。
雖然在圖31A至圖31I中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
在圖31A至圖31I中示出的實例中的整個處理中，多級凹陷28’變成單級凹陷28，如圖3A中示出的。
圖4A至圖4C圖示出了位於凹陷28的不同部分的區域14、16的不同實例。
在圖4A中，區域14、16之間有空隙36。因此，流動池的該實例包括分隔第一引子組12A、12B、12C、12D(在區域14，未在圖4A中示出)和第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’(在區域16，未在圖4B中示出)的空隙36。在一個實例中，空隙36是其中形成區域14、16的各個聚合物部分之間的空間。圖31A至圖31I中示出的任何方法方法可以被修改以形成空隙36。空隙36可以具有大於零的任何可測量的長度。在一個實例中，空隙36是大於1nm。在一個實例中，空隙範圍在從約1nm至約10nm。
在圖4B中，區域14、16部分地重疊。重疊區域38是其中引子18、20或18’、20’和引子19、21或19’、21’兩者被接枝的地區。在一個實例中，當引 子18、20或18’、20’被接枝時以及當引子19、21或19’、21’被接枝時，通過使聚合物層32的相同部分暴露，可以在圖案化和接枝程序期間形成該重疊區域38。 在另一個實例中，當被分別接枝的引子18、20或18’、20’和引子19、21或19’、21’在該程序期間或之後物理重疊或相互擴散時，可以形成該重疊區域38。
在圖4C中，其中分別產生區域14、16的凹陷28’的第一部分和第二部分具有不同的深度。可以使用本文描述的任何凹陷深度，只要凹陷28’的一部分比凹陷28’的其他部分深即可。當經由例如奈米壓印、蝕刻、等等形成凹陷28’時，可以產生不同的深度。
用於製造圖4C中示出的實例的一種示例性方法在圖32A至圖32F中示出。雖然在整個說明書中提及了引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’，但是為了清楚起見，沒有示出它們。此外，圖4C描繪了限定在單層底材26中的凹陷28’，而示例性方法描繪了限定在多層底材的支撐物52上的經圖案化樹脂54’中的凹陷28’。應當理解，該方法可以用於單層底材。
如圖32A示出的，多層底材包括在支撐物52上的(圖案化)樹脂54’。在經圖案化樹脂54’中限定的凹陷28’鄰接間隙區域30，間隙區域30分隔彼此相鄰的凹陷28’。凹陷28’是多級或多深度凹陷，其包括部分地由經圖案化樹脂54’的階梯部分74限定的深部分70和淺部分72。
如圖32B中示出的，第一經官能化層60被施加在經圖案化樹脂54’上。第一經官能化層60可以是本文揭露的任何實例，並且可以使用本文描述的任何技術來沉積，並且如果合適的話，還可以被固化。
在圖32C和圖32D中，第一經官能化層60然後被圖案化以形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域(區域14)。在該實例中，光阻劑62是負性光阻劑或正性光阻劑。如圖32C中示出的，光阻劑62被施加至第一經官能化層60，選擇性地暴露於某些波長的光以形成不溶性區域或可溶性區域(取決於所使用的抗 蝕劑)，並且暴露於顯影劑溶液以去除可溶性部分。如圖32D中示出的，第一經官能化層60的暴露的部分(例如，未被光阻劑62覆蓋的部分)然後可以經由例如蝕刻或另一種合適的技術來去除。在該實例中，第一經官能化層60和樹脂54’可以具有蝕刻差異。第一經官能化層60的剩餘部分(例如，區域14)在各個多級凹陷的第一級。在該實例中，第一級在樹脂54’上的深部分70中。
如圖32E中示出的，然後使用任何合適的沉積技術將第二經官能化層64施加在樹脂54’的暴露的部分上(例如，間隙區域30上和階梯區域74上)。 取決於材料，第二經官能化層64也可以被固化。在一個實例中，光阻劑62對第二經官能化層64不具有親和力，並且因此第二經官能化層64不沉積在光阻劑62上。在另一個實例中，第二經官能化層64可以被沉積在光阻劑62上，但是當光阻劑62被剝離時，可以與光阻劑62一起去除。
如圖32F中示出的，然後可以剝離光阻劑62，這在一些情況下也去除了在其上的任何第二經官能化層64。在間隙區域30上的任何第二經官能化層64也可以經由拋光去除。
在圖32A至圖32F的方法的一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖32A至圖32F中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖32A至圖32F中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖32B)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖32F)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖32E)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖32F)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對經圖案化樹脂54’不具有親和力。
雖然在圖32A至圖32F中未示出，但是該示例性方法還可以包括在第一經官能化區域14上沉積第一經自組裝單層(SAM)，並且在第二經官能化區域16上沉積第二經自組裝單層(SAM)。在使用自組裝的單層的實例中，在SAMS形成之後，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’被接枝。
圖5、圖6A和圖6B圖示出了不同實例，其中底材26包括由間隙區域30分隔的凹陷28；各個凹陷包括第一區域14；並且第二區域16位於至少一些間隙區域30上。因此，在這些實例中，一個區域14位於凹陷28中，而另一個區域16位於鄰接凹陷28的底材表面S上。在圖5中示出的實例中，在底材表面S上的區域16緊鄰凹陷28。在圖6A和圖6B中示出的實例中，在底材表面S上的區域16圍繞凹陷28。現在將參考圖7A至圖7G和圖8A至圖8F描述用於製造在凹陷28中的區域14、16中的一個和在底材表面S的至少一部分上的區域16、14中的另一個的示例性方法。
用於製造圖6A和圖6B中示出的實例的一種示例性方法在圖7A至圖7G中示出。如圖7A中示出的，所述方法利用具有由間隙區域30分隔的多於一個的凹陷28的底材26。在該示例性方法中，聚合物層32被沉積在底材26上， 並且從間隙區域30拋光，如參考圖3A和圖3B描述的。這將聚合物層32留在凹陷28中，而不留在間隙區域30上。如果期望區域14處於凹陷28中，則引子18、20或18’、20’可以使用本文揭露的任何實例來接枝。如果期望區域16處於凹陷28中，則引子19、21或19’、21’可以使用本文揭露的任何實例來接枝。在圖7B中示出的實例中，引子18、20或18’、20’被接枝到聚合物層32。應當理解，引子18、20或18’、20’將接枝到凹陷28中的聚合物層32，而不會接枝到間隙區域30，如圖7B中示出的。
在該方法的一些實例中，使底材26(其具有在凹陷28中形成的區域14或16)暴露於封端劑。封端劑包括可與聚合物層32的任何未反應的官能基(例如，尚未與引子18、20或18’、20”反應的任何官能基)反應的化學物質，以便使這些官能基在後續處理期間不起作用。該程序可以降低後續沉積的聚合物層32’黏附到區域14的能力。換句話說，聚合物層32和後續沉積的聚合物層32’之間的相互作用降低，使得很少或沒有聚合物層32’黏附到聚合物層32。這繼而降低了後續沉積的引子(例如19、21或19’、21’)接枝到覆蓋區域14的地區的能力。
在聚合物層32包括疊氮化物官能基的實例中，封端劑中的化學物質可以是還原劑，諸如膦。示例性的膦是三(羥丙基)膦。聚合物層32的未反應的疊氮化物將被膦還原，這使它們對於額外的引子接枝不起作用。
如圖7C中示出的，所述方法然後包括沉積第二聚合物層32’。聚合物層32’可以是與在聚合物層32中使用者相同的聚合物，或者可以是與在聚合物層32中使用者類型不同的聚合物。在一個實例中，第一聚合物32和第二聚合物32’中的每種是丙烯醯胺共聚物，諸如PAZAM。聚合物層32’可以僅塗覆間隙區域30，或者可以除間隙區域30之外還塗覆至少一些區域14。聚合物層32’是否至少部分地塗覆區域14將取決於在聚合物層32上使用的封端劑。
在該實例中，模版多核苷酸股，包括不可切割的第一模版股40 和可切割的第二模版股42，可以分別使用引子18或18’和20，20’在區域14中形成。在模版多核苷酸股形成的開始，文庫模版可以從任何核酸樣本(例如，DNA樣本或RNA樣本)製備。核酸樣本可以被片段化為單股的、相似大小(例如，<1000bp)的DNA或RNA片段。在製備期間，轉接子可以被添加至這些片段的末端。通過減少循環擴增，不同基序可以被引入轉接子，諸如定序結合位點、索引(indice)和與區域14中的引子18或18’和20、20’互補的區域。最終的文庫模版包括DNA或RNA片段和在兩個末端的轉接子。在一些實例中，來自單個核酸樣本的片段具有添加至其的相同的轉接子。
多於一個的文庫模版可以被引入底材26。這可以包括將模版液引入流動池。模版液可以包括液體載體和多於一個的文庫模版。因為底材26包括在凹陷28中的區域14的陣列，所以多個文庫模版例如與固定在其中的兩種類型的引子18、18’或20、20’中的一種雜交。
然後可以進行簇生成。在簇生成期間，來自模版液的模版被擴增以在至少一些凹陷28中形成簇。在簇生成的一個實例中，使用高保真的DNA聚合酶從雜交的引子18，18’或20，20’通過3’延伸來複製文庫模版。原始文庫模版被變性，使副本被固定在區域14中。等溫橋擴增可以用於擴增經固定的副本。 例如，經複製的模版在相鄰的互補引子20、20’或18、18’上成環並與其等雜交，並且聚合酶複製經複製的模版以形成雙股橋，雙股橋被變性以形成兩條單股。 這兩股在相鄰的互補引子20、20’或18、18’上成環並且與其等雜交，並且再次延伸以形成兩條新的雙股環。通過等溫變性和擴增的循環對各個模版副本重複該程序，以產生密集的株系簇。每簇雙股橋被變性，產生被附接至不可切割的第一引子18、18’的不可切割的第一模版股40和被附接至可切割的第二引子20、20’的可切割的第二模版股42，如圖7D中示出的。應當理解，引子的可切割性驅動附接至其的模版股的可切割性。因為被附接至可切割的第二引子20、20’的第二 模版股42包括切割位點22，所以可切割的第二模版股42是可切割的。聚簇的該實例是橋擴增，並且是可以進行的擴增的一個實例。應當理解，可以使用其他擴增技術，諸如排除擴增(Examp)工作流程(Illumina Inc.)。
應當理解，因為第二聚合物層32’不具有被接枝至其的引子18、18’或20、20’，所以擴增程序不會延伸超過各個凹陷28。
然後引發液可以被引入底材26。引發液包括液體載體和第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’，其不同於已經被引入凹陷28中的第一引子組12A、12B、12C、12D。引發液中的液體載體可以是任何能夠支持點擊化學的液體，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、鹽水-檸檬酸鈉(SSC)、基於碳酸鹽的緩衝液、等等。 在該實例中，引發液中的引子組包括引子19或19’和21或21’。應當理解，如果引子組12A’、12B’、12C’、12D’(包括引子19或19’和21或21’)被首先接枝以在凹陷28中形成區域16，則引發液可以包括引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18或18’和20或20’)。
引發液中的引子19或19’和21或21’可以接枝到覆蓋間隙區域30的第二聚合物層32’。因為第二聚合物層32’可以不黏附到聚合物層32，因為擴增已經在區域14中進行，並且因為基底性聚合物層32的官能基已經變得不起作用，所以引子19或19’和21或21’可以不接枝到暴露的聚合物層32。
如圖7E中示出的，被接枝的引子19或19’和21或21’附接至覆蓋間隙區域30的第二聚合物層32’，這形成區域16。
然後可以進行另外的擴增。例如，橋擴增可以從簇往被接枝的引子19或19’和21或21’啟動，以便在至少一些間隙區域上形成第二簇。在該輪擴增期間，不可切割的第一模版股40在相鄰的互補引子21、21’上成環並且與其雜交，而可切割的第二模版股42在相鄰的互補引子19、19’上成環並且與其雜交。股40、42分別被延伸以形成兩個新的雙股環。通過等溫變性和擴增的循環對各個模版 副本重複該程序，以產生從凹陷28往外生長到間隙區域30的密集的株系簇。各另外簇的雙股橋被變性，產生被附接至不可切割的第二引子21、21’的不可切割的第二模版股44和被附接至可切割的第一引子19、19’的可切割的第一模版股46，如圖7F中示出的。因為被附接至可切割的第一引子19、19’的可切割的第一模版股46包括切割位點22’或23，所以可切割的第一模版股46是可切割的。
應當理解，當不可切割的第一模版股40是正向股時，不可切割的第二模版股44是反向股，並且當不可切割的第一模版股40是反向股時，不可切割的第二模版股44是正向股。類似地，當可切割的第一模版股46是正向股時，可切割的第二模版股42是反向股，並且當可切割的第一模版股46是反向股時，可切割的第二模版股42是正向股。
然後，取決於切割位點22、22’或22、23，通過引入化學劑或酶促切割劑，可切割的第一模版股46和可切割的第二模版股42可以被去除。如圖7G中示出的，在切割後，不可切割的第一模版股40被保留在凹陷28中的區域14中，並且不可切割的第二模版股44被保留在間隙區域30上的區域16中。在進行切割後的一個實例中，區域14包括正向股，並且區域16包括反向股。
用於製造圖5、圖6A和圖6B中示出的實例的另一種示例性方法在圖8A至圖8G中示出。如圖8A中示出的，所述方法利用具有由間隙區域30分隔的多於一個的凹陷28的底材26。在該示例性方法中，聚合物層32被沉積在底材26上，使得它存在於凹陷28中和間隙區域30上。如果期望區域14處於凹陷28中，則引子18、20或18’、20’可以使用本文揭露的任何實例來接枝。如果期望區域16處於凹陷28中，則引子19、21或19’、21’可以使用本文揭露的任何實例來接枝。 在圖8B中示出的實例中，引子18、20或18’、20’被接枝到聚合物層32。應當理解，引子18、20或18’、20’將橫跨整個底材26接枝到的聚合物層32，如圖8B中示出的。
在該示例性方法中，如圖8C中示出的，然後將保護塗層48沉積 在具有被接枝至其的引子組12A、12B、12C、12D的聚合物層32上。保護塗層48可以是剝離抗蝕劑。該類型的保護塗層48可以在程序中在期望的時間旋塗、固化並隨後去除。保護塗層48還可以是水溶性塗層。
然後可以進行蝕刻以暴露其中期望產生包括引子組12A’、12B’、12C’、12D’的區域16的間隙區域30。例如，與各個凹陷28相鄰的底材表面S的分開的部分可以經由蝕刻來暴露，以形成圖5中示出的實例。對於另一個實例，圍繞整個凹陷28的底材表面S的部分可以經由蝕刻來暴露，以形成圖6A和圖6B中示出的實例。圖8D圖示出了在進行蝕刻以暴露間隙區域30之後的底材26的一個實例。在該實例中，電漿蝕刻可以用空氣或氧氣進行。
然後，該示例性方法可以包括將底材表面S的暴露的部分矽烷化。矽烷化將黏附促進劑引入底材表面S，以幫助第二聚合物層32’黏附至其。
然後沉積第二聚合物層32’。如圖8E中示出的，第二聚合物層32’可以被沉積在底材表面S的暴露的部分上(例如，在間隙區域30處)和保護塗層48上。在該示例性方法中，聚合物層32’可以是與在聚合物層32中使用者相同的聚合物，或者可以是與在聚合物層32中使用者類型不同的聚合物。
如圖8F中示出的，第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’的引子19、19’和21、21’然後可以被接枝到聚合物層32’以產生區域16。接枝可以使用本文描述的任何方法進行。在另一個實例中，聚合物層32’可以用引子19、19’和21、21’預接枝。
雖然未示出，但是應當理解，該示例性方法然後可以包括去除保護塗層48。作為實例，剝離方法可以用於去除保護塗層48和在其上的任何聚合物層32’以及引子19、19’和21、21’。如果保護塗層48是水溶性的，去除可以包括將塗層48溶解在水中，這也將去除任何覆蓋性聚合物層32’和引子19、19’和21、21’。保護塗層的去除暴露了區域14處的所有引子18、18’和20、20’，以及 區域16處的所有引子19、19’和21、21’。
雖然在圖8A至圖8F中未示出，但是應當理解，然後可以將多於一個的文庫模版引入底材26。因為底材26包括在凹陷28中的區域14的陣列，所以多個(mutiple)文庫模版例如與固定在其中的兩種類型的引子18、18’或20、20’中的一種雜交。在該實例中，因為底材26還包括在至少一些間隙區域30上的區域16的陣列，所以多個文庫模版例如與固定在其中的兩種類型的引子19、19’或21、21’中的一種雜交。然後可以如本文描述地進行簇生成。可切割模版的切割也可以通過切割可切割的第一引子19、19’和可切割的第二引子20、20’來進行。
圖9圖示出了位於凹陷28的不同部分的區域14、16的又另一個實例。在該實例中，區域14或16中的一個是位於凹陷28中的珠50的一部分。珠50包括核心結構49和位於核心結構49表面的區域16。在該實例中，區域16可以包括固有地存在於核心結構49的表面的官能基，或通過任何合適的官能化技術(例如，化學反應、用含反應性基團的聚合物塗覆核心結構49、等等)被併入到在核心結構49的表面上的官能基。
雖然圖9中示出了單個凹陷28，但是應當理解，在一些實例中，底材26包括由間隙區域30分隔的多於一個的凹陷28；並且各個凹陷包括：第一區域14所位於的第一部分；和第二部分；並且流動池還包括位於第二部分的珠50，其中第二區域16在珠的表面。參考圖11A至圖20，在本文中在「基於珠的流動池」部分中進一步描述了該實例的若干變體。
圖10描繪了區域14、16的仍另一個示例性配置。在該實例中，區域14、16位於分開的底材26、26’上。因此，流動池的該實例包括：第一底材26；被附接至第一底材26的第一引子組12A，其包括不可切割的第一引子18、18’和可切割的第二引子20、20’；與第一底材26相對的第二底材26’；和被附接至第二底材26’的第二引子組12A’，其包括可切割的第一引子19、19’和不可切割的第二 引子21、21’。作為用於製造該流動池的方法的一個實例，底材26、26’各自可以用聚合物層(例如，32，在圖10中未示出)塗覆，第一引子組12A(或12B、12C或12D)可以被接枝到一個底材26，並且第二引子組12A’(或12B’、12C’或12D’)可以被接枝到另一個底材26’。
雖然在相應的底材表面S上示出，但是應當理解，區域14、16可以可選擇地分別位於底材26、26’的凹陷28中。在該實例中，聚合物層可以被沉積在凹陷28中和間隙區域30上，並且然後可以經由拋光從間隙區域30去除。第一引子組12A(或12B、12C或12D)可以被接枝到一個底材26的凹陷28，並且第二引子組12A’(或12B’、12C’或12D’)可以被接枝到另一個底材26’的凹陷。
在該實例中，可以期望底材26、26’緊密靠近，使得模版接種和聚簇可以成功地進行。在一個實例中，「緊密靠近」意指兩個底材26、26’之間的距離為約100μm或更小。在另一個實例中，兩個底材26、26’之間的距離範圍在約10μm至約90μm。
第一區域14和第二區域16以及引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’可以在底材表面S上宏觀地分開，或者可以存在於彼此宏觀地分開的分開的凹陷28中，而不是位於分開的底材26、26’上。宏觀地分開意指區域14、16彼此分開至少5μm。在一個實例中，區域14、16彼此分開範圍在從約5μm至約100μm的距離。
圖33A描繪了區域14、16的仍另一個示例性配置。在該實例中，第一經官能化層60和第二經官能化層64被整合到多層底材的樹脂部分中。如圖33A中示出的，多層底材的該實例包括支撐物52；在支撐物52上的第一經官能化層60；在第一經官能化層60上的第二經官能化層64；和在第二經官能化層64上的鈍化層86。
在該實例中，第一經官能化層60和第二經官能化層64可以是任何 奈米壓模微影術樹脂，其具有或能夠具有引入至其的表面官能基，該表面官能基可以分別附接至引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’。 在一個實例中，層60可以用環氧基基團官能化，並且層64可以用胺基團官能化。
如果在形成圖33A中示出的多層底材之前，將引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’分別預接枝到層60、64中，則層60、64的樹脂可以是相同的。在該方法的這些實例中，在第一經官能化層60被併入到多層底材之前，第一引子組12A、12B、12C、12D(例如，不可切割的第一引子18、18’和可切割的第二引子20、20’)可以被預接枝到第一經官能化層60；並且在第二經官能化層64被併入到多層底材之前，第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’(例如，可切割的第一引子19、19’和不可切割的第二引子21、21’)可以被預接枝到第二經官能化層64。
這些層(無論是否被預接枝)可以使用本文揭露的任何實例來沉積在支撐物52上。
當引子在壓印後被接枝時，應當理解，層60、64至少具有可以分別附接至引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’的不同的表面官能基。可以使用本文揭露的任何樹脂。
鈍化層86可以是可以被壓印的任何疏水層。作為實例，鈍化層86選自由以下組成的組：氟化聚合物、全氟化聚合物、矽聚合物、及其等之混合物。作為實例，鈍化層86可以包括無定形的氟聚合物(其商業上可獲得的實例包括來自AGC Chemicals的CYTOP®系列中的那些，它們具有以下末端官能基中的一種：A類型：-COOH，M類型：-CONH-Si(OR)n或S類型：-CF3)、聚四氟乙烯(其商業上可獲得的實例是來自Chemours的鐵氟龍®)、聚對二甲苯、氟化烴、氟丙烯酸共聚物(其商業上可獲得的實例包括來自Cytonix的FLUOROPEL®)。鈍化層86可以使用本文揭露的任何實例來沉積在支撐物52上。
如圖33A中示出的，所述方法的該實例包括壓印多層底材，從而形成由鈍化層86的間隙區域30分隔的特徵(例如凹陷28)，其中第一經官能化層和第二經官能化層各自的區域14、16分別在各個特徵/凹陷28處暴露。單個特徵/凹陷28的暴露的區域14、16和鈍化層86的周圍間隙區域30於圖33B中的從俯視圖示出。對於各個區域14、16，特徵/凹陷28具有傾斜的底部或階梯區域或一些幾何上的變體，其從特徵/凹陷28的頂部暴露層60的一部分和層64的一部分。
為了壓印多層底材，將奈米壓模微影術模具或工作印模56壓靠在樹脂層54上，以在層60、64、68中產生特徵的壓印。換句話說，層60、64、68中的每個透過工作印模56的突出部分而變得曲折或穿孔。然後，層60、64、68可以在工作印模56就位的情況下固化。固化可以通過以下來完成：暴露於光化輻射，諸如可見光輻射或紫外線(UV)輻射，或者當使用光阻劑時暴露於範圍在從約240nm至380nm的波長的輻射；或者當使用可熱固化的抗蝕劑時通過暴露於熱。固化可以促進聚合和/或交聯。作為實例，固化可以包括多個階段，包括軟烘烤(例如，去除溶劑)和硬烘烤。軟烘烤可以於範圍在從約50℃至約150℃的較低溫度進行。硬烘烤的持續時間可以於範圍在從約100℃至約300℃的溫度持續從約5秒至約10分鐘。可以用於軟烘烤和/或硬烘烤的裝置的實例包括熱板、烘箱、等等。
在固化後，釋放工作印模56。這在層60、64、68中產生形貌特徵，即凹陷28。
如提及的，引子18、20或18’、20’(在圖33A或圖33B中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14；並且引子19、21或19’、21’(在圖33A或圖33B中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’和/或引子19、21或19’、21’沒有被分別預接枝到第一經官能化層60和第二經官能化層64。在這些實例中，區域14、16具有不同的官能基，並且引子18、20或18’、20’和引子19、21或19’、21’可以在壓印後被接枝。
當在壓印後進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何接枝技術來完成。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對鈍化層86不具有親和力。
如提及的，凹陷28的一些實例可以呈溝槽的形式。圖34S描繪了區域14、16的仍另一個示例性配置(俯視圖)，其中它們在溝槽28”中形成。
如圖34A示出的，多層底材包括在支撐物52上的(圖案化)樹脂54’。經圖案化樹脂54’(例如，NIL樹脂、SiO2、等等)中限定的溝槽28”鄰接間隙區域30，間隙區域30將相鄰的溝槽28”彼此分開(參見，例如圖34H，其圖示出了多個溝槽28”的俯視圖)。
如圖34B中示出的，犧牲層84被施加在樹脂54’(例如，間隙區域30和溝槽28」中)上。任何材料可以用作相對於樹脂54’和相對於所使用的第二犧牲層88具有蝕刻差異的犧牲層84。在一個實例中，犧牲層84是矽、鋁或鉻。
如圖34C中示出的，犧牲層84被從樹脂54’的部分去除。在該實例中，犧牲層84可以被蝕刻，使得犧牲材料的區域84”保持直接鄰接各個溝槽28”的各側壁90。在蝕刻後，間隙區域30和各個溝槽28”的底部部分被暴露。
如圖34D中示出的，第二犧牲層88被施加在犧牲材料的區域84”上和樹脂54”的任何暴露的區域(例如間隙區域30和溝槽28”的底部部分中)上。任何材料可以用作相對於樹脂54’和相對於所使用的犧牲層84具有蝕刻差異的第二犧牲層88。例如，如果層84是矽，則層88可以是鋁或鉻。
犧牲層84、88可以使用本文描述的任何沉積技術來施加。
如圖34E中示出的，第二犧牲層88被從犧牲材料的區域84”和從樹脂54’的一些部分去除。在該實例中，第二犧牲層88可以被蝕刻，使得第二犧牲材料的區域88”保持直接鄰接各個犧牲材料區域84”。在該實例中，在蝕刻後，間隙區域30和各個溝槽28」的另一個(更小)底部部分被暴露。
如圖34F(描繪俯視圖)中示出的，材料92被沉積以填充第二犧牲材料區域84”之間的任何空間。換句話說，另外的材料92覆蓋各個溝槽28”的底部部分，並且完全分隔第二犧牲材料的區域88’。另外的材料92可以是與樹脂54’相同的材料。例如，如果二氧化矽用作樹脂54’，則另外的材料92可以是二氧化矽。另外的材料92幫助限定小於溝槽28”的新的溝槽28'''(其中區域14、16將被限定)。
在所述方法的該實例中，如圖34G中示出的，可以進行拋光以從間隙區域30’去除另外的材料92。
圖34H描繪了用兩個犧牲材料/層84”、88’填充的溝槽28'''的俯視圖。如所示的，各個犧牲材料/層84”、88’延伸各個溝槽28'''的長度。
圖34I描繪了用兩個犧牲材料/層84”、88’填充的溝槽28'''中的一個的橫截面圖。
如圖34J中示出的，犧牲材料區域84”從各個溝槽28'''的一部分去除。這暴露了第一經官能化區域14將要於該處形成的地區/部分76。犧牲材料區域84”可以被蝕刻，並且由於不同的蝕刻速率，該蝕刻程序不影響樹脂54’或第二犧牲材料區域88’。
在圖34K中，第一經官能化層60被施加在間隙區域30、地區76和第二犧牲材料區域88’上。第一經官能化層60可以是本文揭露的任何實例，並且可以使用本文描述的任何技術來沉積。
在圖34K、圖34L和圖34M中，第一經官能化層60然後被圖案化以在地區/部分76中形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域(區域14)。光阻劑62和基底性第一經官能化層60可以被拋光或蝕刻掉，使用間隙區域30和第二犧牲材料區域88’作為蝕刻停止區域。這在溝槽28'''的地區/部分76中形成被光阻劑62覆蓋的第一經官能化區域14。
如圖34N中示出的，第二犧牲材料區域88’從各個溝槽28'''的一部分去除。這暴露了第二經官能化區域16將要於該處形成的地區/部分78。第二犧牲材料區域88’可以被蝕刻，並且由於不同的蝕刻速率，該蝕刻程序不影響樹脂54’或光阻劑62。第一經官能化層60的暴露的部分可以在該蝕刻程序期間被去除。
在圖34O中，第二經官能化層64被施加在間隙區域30、地區78、光阻劑62和區域14的任何暴露的部分上。第二經官能化層64可以是本文揭露的任何實例，並且可以使用本文描述的任何技術來沉積。
在圖34P中，然後可以剝離光阻劑62，這去除了在其上的任何第二經官能化層64。在本文揭露的任何實例中，可以進行音波振動以改進光阻劑剝除或剝離程序的效率。
在圖34Q中，間隙區域30可以被拋光以去除在其上的任何第二經官能化層64。如圖34Q中示出的，區域14、16在溝槽28'''的相應區域中形成。應當理解，區域14、16延伸溝槽28'''的長度(如圖34R中示出的)。區域14、16的該配置可以用於使用本文揭露的引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’進行同時的配對末端讀段定序。
在圖34R中，第二光阻劑62’被施加(並暴露和顯影)，以形成至少基本上垂直於溝槽28'''的空間上分開的條帶的圖案。該圖案留下了第一經官能化區域14和第二經官能化區域16暴露在空間上分開的條帶之間的部分，如圖34R中示出的。第一經官能化區域14和第二經官能化區域16暴露在空間上分開的條帶 之間的部分被去除(例如，經由蝕刻)，並且然後空間上分開的條帶(第二光阻劑62’)被去除(例如，經由蝕刻)。在去除空間上分開的條帶(第二光阻劑62’)之後，為空間上分開的條帶(第二光阻劑62’)的基底的區域14、16保持完整，如圖34S中示出的。在該實例中，各個區域14、16是沿溝槽28'''的分開的對。
在一些實例中，引子18、20或18’、20’(在圖34A至圖34S中未示出)可以被預接枝到第一經官能化層60，並且因此被附接至第一經官能化區域14。類似地，引子19、21或19’、21’(在圖34A至圖34S中未示出)可以被預接枝到第二經官能化層64，並且因此被附接至第二經官能化區域16。在這些實例中，不進行另外的引子接枝。
在其他實例中，引子18、20或18’、20’未被預接枝到第一經官能化層60。在這些實例中，引子18、20或18’、20’可以在施加第一經官能化層60之後接枝(例如，在圖34K)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子18、20或18’、20’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖34S)，因為它們將不會接枝到區域16的表面官能基。
類似地，引子19、21或19’、21’可以不被預接枝到第二經官能化層64。在這些實例中，引子19、21或19’、21’可以在施加第二經官能化層64之後接枝(例如，在圖34O)。如果區域14、16具有不同的官能基，引子19、21或19’、21’可以在所述方法最後接枝(例如，在圖34S)，因為它們將不會接枝到區域14的表面官能基。
當在所述方法期間進行接枝時，接枝可以使用本文揭露的任何實例來進行。用任何接枝方法，引子18、20或18’、20’與區域14的反應性基團反應，或者引子19、21或19’、21’與區域16的反應性基團反應，並且對樹脂54’不具有親和力。
在流動池的仍另一個實例中，區域14、16可以分別在經官能化支 撐結構93、94上形成，如圖35中示出的。經官能化支撐結構93、94具有表面官能基，使得它們可以分別附接本文揭露的引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’。本文揭露的核心結構49的任何實例可以用於經官能化支撐結構93、94。還可以使用本文揭露的能夠附接不同引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’的任何表面官能基。經官能化支撐結構93、94可以例如使用本文揭露的用於形成經官能化珠50的方法來形成(參見「基於珠的流動池」部分)。
在一些實例中，經官能化支撐結構93、94也可以具有不同的形狀。在一些實例中，其等各自的形狀分別對應於在底材(其可以是如本文描述的單層底材或多層底材)的表面S上的或在表面S中限定的捕獲位點95、96的形狀(圖36A、圖36B、圖37A和圖37B中示出的)。例如，經官能化支撐結構93、94可以分別具有與井捕獲位點95、96相同的形狀(下文描述的)。不同的形狀將有助於經官能化支撐結構93被物理地截留在互補形狀的井捕獲位點95中，並且有助於經官能化支撐結構94被物理地截留在互補形狀的井捕獲位點96中。
在一些實例中，經官能化支撐結構93、94也可以具有不同的捕獲化學性質。捕獲化學性質是能夠使結構93、94附接至在底材表面S上的期望位置的化學性質。在一些實例中，經官能化支撐結構93、94的捕獲化學性質分別對應於將接收相應的經官能化支撐結構93、94的捕獲位點95、96的捕獲化學性質。 例如，經官能化支撐結構93和捕獲位點95各自可以包括一種類型的受體-配體結合對的成員，而經官能化支撐結構94和捕獲位點96各自可以包括不同類型的受體-配體結合對的成員。不同的化學性質可以幫助確保經官能化支撐結構93、94(以及分別對應的區域14、16)被捕獲在底材表面S上的期望的區域。
捕獲位點95、96能夠物理地和/或化學地分別將經官能化支撐結構93、94固定在底材26(或多層底材的樹脂54’)上。捕獲位點95、96可以位於期 望具有相鄰區域14、16的任何合適的位置。捕獲位點95、96橫跨底材26的位置可以是均勻的(參見圖36A和圖36B)或者可以是非均勻的。捕獲位點95、96可以具有任何合適的形狀、幾何和尺寸，這可以至少部分地取決於捕獲位點95、96的配置(例如，小塊、井、突出物、等等)，以及將由捕獲位點95、96捕獲的經官能化支撐結構93、94的類型。
在一些實例中，捕獲位點95、96是被施加在底材表面S的一部分上的不同化學捕獲劑。可以使用本文揭露的化學捕獲劑的任何實例。在一個實例中，相應的化學捕獲劑可以使用微接觸印刷或另一種合適的技術來沉積在期望的位置。
在其他實例中，捕獲位點95、96包括限定在底材26(或樹脂54’)的表面S中的相應的井。取決於所使用的底材(例如，單層或多層)，可以使用蝕刻或壓印來形成井。井可以具有任何合適的形狀和幾何，諸如本文針對凹陷28所闡述者。
在一些實例中，井不具有被添加至其的另外的化學捕獲劑。在這些實例中，其開口尺寸使得經官能化支撐結構93、94能夠分別自組裝到相應的井中(例如，基於形狀)。在其他實例中，井確實具有被添加至其的相應的化學捕獲劑。
捕獲位點95、96的其他實例包括井和在其表面上具有化學捕獲劑的捕獲珠。可使捕獲珠的尺寸適合放入井中。在一些實例中，捕獲珠可以與相鄰的間隙區域30、30’共平面或者略微延伸高於相鄰的間隙區域30、30’，使得最終附接至其的經官能化支撐結構93、94不被限制在井內。在一個實例中，捕獲珠選自由二氧化矽、超順磁性材料、聚苯乙烯、和丙烯酸酯組成的組。本文揭露的化學捕獲劑的任何實例可以用在捕獲珠的表面上，並且可以在捕獲珠被引入井中之前塗覆在捕獲珠上。這些捕獲位點95、96的井和珠的配置可以使得經 官能化支撐結構93、94(當附接時)形成彼此相鄰接的區域14、16。
捕獲位點95、96井的深度可以取決於是否將要將化學捕獲劑引入其中以及是否將要將捕獲珠引入其中而變化。深度可以選擇成至少容納這些材料(即，材料被包含在井內)。在一個實例中，井的深度範圍在從約1nm至約5微米。
作為另一個實例，捕獲位點95、96包括限定在底材26(或樹脂54’)中的突出物。突出物是從相鄰表面向外(向上)延伸的三維結構。突出物可以經由蝕刻、微影術、壓印、等等產生。
雖然任何合適的三維幾何可以用於突出物捕獲位點95、96，但是具有至少基本平坦的頂表面的幾何可以是合意的。示例性突出物幾何包括球體、圓柱體、立方體、多邊棱柱形(例如，矩形棱柱形、六邊形棱柱形、等等)或類似者。
不同的化學捕獲劑可以被分別施加在突出物捕獲位點95、96的頂表面上。可以使用本文揭露的化學捕獲劑的任何實例，並且可以使用任何沉積技術將化學捕獲劑施加至突出物的頂表面。
應當理解，雖然捕獲位點95、96已經被描述為都是捕獲劑、井、等等，但捕獲位點95、96的類型的任何組合可以一起在流動池上使用(例如捕獲劑和井)。
在圖36A中，在表面S上的捕獲位點95、96具有不同的形狀。當分別具有相應形狀的經官能化支撐結構93、94被加載到流動池中時(圖36B)，經官能化支撐結構93、94通過物理擠出和/或通過捕獲化學來自組裝，使得經官能化支撐結構93附接至捕獲位點95，且經官能化支撐結構94附接至捕獲位點96。
在圖37A中，在表面S上的捕獲位點95、96也具有不同的形狀，但是與圖36A中示出的實例不同地佈置。當分別具有相應形狀的經官能化支撐結 構93、94被加載到流動池中時(圖37B)，經官能化支撐結構93、94通過物理擠出和/或通過捕獲化學來自組裝，使得經官能化支撐結構93附接至捕獲位點95，且經官能化支撐結構94附接至捕獲位點96。
圖36B和圖37B中示出的兩種配置皆導致處於橫跨底材表面S的分開的位置的區域14、16的陣列。
圖2至圖10、圖33A、圖34S、圖36B和圖37B圖示出了流動池的區域14、16的不同配置，其中沒有結合至底材26(或樹脂54’)的蓋。雖然未示出，但是應當理解，流動池可以具有結合至間隙區域30、30’的至少一部分的蓋。在一些實例中，蓋可以在引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’接枝之前或之後結合。當在引子接枝之前結合蓋時，應當理解，可以使用流通程序以用於接枝。在流通程序中，引子溶液或混合物可以通過相應的輸入端口(未示出)被引入流動通道(限定在蓋和間隙區域30、30’之間)，可以在流動通道中保持充分的時間(即培養期)，以用於將引子18、18’、20、20’、19、19’、21、21’分別附接至區域14、16，並且然後可以從相應的輸出端口(未示出)去除。在引子18、18’、20、20’、19、19’、21、21’附接之後，另外的流體可以被引導通過流動通道以洗滌現已官能化的凹陷和流動通道。
蓋可以位於間隙區域30上，使得它限定單個流動通道或多個流體分離的流動通道。
蓋可以是對指向底材26的激發光透明的任何材料。作為實例，蓋可以是玻璃(例如硼矽酸鹽、熔融矽石、等等)、塑膠或類似物。合適的硼矽酸鹽玻璃的商業上可獲得的實例是從Schott North America,Inc.可獲得的D 263®。合適的塑膠材料，即環烯烴聚合物的商業上可獲得的實例是從Zeon Chemicals L.P.可獲得的ZEONOR®產品。
在一些實例中，蓋可以與側壁一體形成，側壁對應於將與其結合 的間隙區域30的部分的形狀。例如，凹槽(recess)可以被蝕刻到透明塊中，以形成大體上平坦的(例如，頂)部分和從大體上平坦的部分延伸的側壁。當經蝕刻的塊被安裝至間隙區域30時，凹槽可以成為流動通道。在其他實例中，側壁和蓋可以是彼此耦合的分開的部件。例如，蓋可以是大體上矩形的塊，其具有至少大體上平坦的外表面和至少大體上平坦的內表面，所述塊限定流動通道的一部分(例如，頂部部分)(一旦結合至間隙區域30的部分)。該塊可以安裝到(例如，結合至)側壁上，該側壁結合至間隙區域30的部分並形成流動通道的側壁。在該實例中，側壁可以包括在本文中針對間隔層闡述的任何材料(下文描述)。
蓋可以使用任何合適的技術，諸如雷射結合、擴散結合、陽極結合、共晶結合、電漿活化結合、玻璃熔塊結合或本領域中已知的其他方法來結合。在一個實例中，間隔層可以用於將蓋結合至間隙區域30的部分。間隔層可以是將至少一些間隙區域30和蓋密封在一起的任何材料。
在一個實例中，間隔層可以是吸收在由蓋和/或底材26(或，例如底材26的經圖案化樹脂)透射的波長的輻射的輻射吸收材料。所吸收的能量繼而在間隔層和蓋之間以及在間隔層和底材26之間形成結合。該輻射吸收材料的實例是在約1064nm吸收的來自DuPont(USA)的黑色KAPTON®(含炭黑的聚醯亞胺)。應當理解，聚醯亞胺可以在不添加炭黑的情況下使用，除了其波長必須被改變為由天然聚醯亞胺材料顯著吸收的波長(例如，480nm)。作為另一個實例，當用532nm的光照射時，聚醯亞胺CEN JP可以被結合。當間隔層是輻射吸收材料時，間隔層可以位於在蓋和間隙區域30的部分之間的界面處，使得間隔層接觸期望的結合區域。可以施加壓縮(例如，約100PSI的壓力)，同時將合適波長的雷射能量施加至界面(即，輻射吸收材料被照射)。雷射能量可以從頂部和底部兩者施加至界面，以便實現合適的結合。
在另一個實例中，間隔層可以包括與其接觸的輻射吸收材料。輻 射吸收材料可以施加在間隔層和蓋之間的界面處以及在間隔層和間隙區域30的部分之間的界面處。作為實例，間隔層可以是聚醯亞胺，並且分開的輻射吸收材料可以是炭黑。在該實例中，分開的輻射吸收材料吸收雷射能量，該雷射能量形成間隔層和蓋之間以及間隔層和間隙區域30的部分之間的結合。在該實例中，可以在相應的界面處施加壓縮，同時將在合適波長處的雷射能量施加至界面(即輻射吸收材料被照射)。
同時配對末端定序方法
包括本文描述的引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’的流動池的任何實例可以用於同時配對末端定序，其中正向股和反向股(例如，股40和44)被同時讀取。
一旦在區域14中產生不可切割的第一模版股40的簇，並且在區域16中產生不可切割的第二模版股44的簇(參考圖7C至圖7G描述的)，游離端可以被封閉以防止不期望的引發。應當理解，保持的任何引子的游離端也可以被封閉。
在這些方法中，可以添加併入混合物，其包括能夠分別與不可切割的第一模版股40和不可切割的第二模版股44雜交的定序引子。監視定序引子分別沿模版股40、44的延伸，以確定模版股40、44中的核苷酸序列。基底性化學程序可以是聚合(例如，由聚合酶催化)或連接(例如，由連接酶催化)。在特定的基於聚合酶的程序中，經螢光標記的核苷酸以模版依賴模式被添加至相應的定序引子，使得被添加至相應的定序引子的核苷酸的順序和類型之偵測可以被用來確定模版的序列。例如，為了透過合成循環啟動第一個定序，一個或更多個經標記的核苷酸、DNA聚合酶、等等可以被遞送至流動池/遞送通過流動池，其中定序引子延伸導致經標記的核苷酸被併入分別與模版40、44互補的新生股 中。可以通過沒有分別在的模版40、44處產生的螢光信號的實質物理重疊的成像事件串聯偵測併入事件。這允許分別在模版40、44處的同時鹼基調用。在成像事件期間，照明系統(未示出)可以向流動池提供激發光，並且可以捕獲和分析圖像。作為實例，照明可以用雷射、發光二極管、平面光波導或類似物來實現。
在一些實例中，經螢光標記的核苷酸還可以包括可逆終止特性，所述可逆終止特性在核苷酸已被分別添加至模版40、44後終止進一步的引子延伸。例如，具有可逆終止子部分的核苷酸類似物可以被添加至模版40、44，使得隨後的延伸不能發生，直到解封劑被遞送以去除該部分。因此，對於使用可逆終止的實例，解封試劑可以被遞送至流動池、等等(在偵測發生之後)。
洗滌可以在不同的流體遞送步驟之間進行。然後定序循環可以重複n次以將模版延伸n個核苷酸，從而偵測長度n的序列。
配對末端定序允許使用者對片段的兩端定序，並產生高質量、可排比的序列數據。配對末端定序有助於偵測基因組重排和重複序列元件，以及基因融合和新的轉錄物。雖然已經詳細描述了一個示例性的配對末端定序方法，但是應當理解，本文描述的流動池可以與其他定序方案一起用於基因分型，或者用於其他化學應用和/或生物應用。在又另一個實例中，本文揭露的流動池可以用於細胞上文庫產生。
套組
本文描述的流動池的任何實例可以是套組的一部分。
套組的一些實例包括流動池、模版混合物/液體和併入混合物(incorporation mix)。流動池的這些實例都具有附接至其的引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’。模版混合物/液體包括待定序的模版，並且併入混合物包括能夠分別與不可切割的第一模版股40和不可切割的第 二模版股44(使用模版形成)雜交的定序引子。
套組的其他實例包括本文描述的流動池和引發液。流動池的這些實例具有被附接至其的一個引子組12A、12B、12C或12D，並且引發液可以用於引入另一個引子組12A’、12B’、12C’或12D’。在套組的一個實例中，流動池包括：底材26，其包括由間隙區域30分隔的凹陷28；各個凹陷中的第一聚合物層32，其中第一聚合物層的一些官能基被封端；第一引子組12A、12B、12C或12D，其被附接至各個凹陷28中的第一聚合物層32的其他官能基；以及在間隙區域30上的第二聚合物層32’；並且引發液包括液體載體和不同於第一引子組12A、12B、12C或12D的第二引子組12A’、12B’、12C’或12D’。該示例性套組還可以包括模版混合物和併入混合物。
基於珠的流動池
圖9描繪了流動池的一種配置，其中區域14或16之一是珠50的一部分。本部分描述了該流動池配置的各種實例和方法。
本文揭露的該流動池10A(圖13D和圖14)、流動池10B(圖15D和圖16)、流動池10C(圖17D和圖18)、流動池10D(圖19D和圖20)的實例包括支撐物52和在支撐物52上的經圖案化樹脂54’、54”，經圖案化樹脂包括由間隙區域30分隔的凹陷28A、28B或28C。圖11A至圖11D一起描繪了用於經圖案化樹脂54以形成凹陷28A、28B或28C的方法的實例。更具體地，圖11A至圖11C描繪了凹陷28A、28B的形成，並且圖11A、圖11B和圖11D描繪了凹陷28C的形成。
圖11A描繪了支撐物52，並且圖11B描繪了在支撐物52上沉積的樹脂54。本文描述的底材12的任何實例可以用於支撐物52。
合適的樹脂54的一些實例選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、 丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。雖然已經提供了若干實例，但是認為可以使用任何可以被固化的樹脂。
如本文使用的，術語「多面體寡聚矽倍半氧烷(POSS)」和「POSS基樹脂」指的是一種化學組合物，其是矽石(SiO2)和矽氧烷(R2SiO)之間的混合中間體(RSiO1.5)。POSS的實例可以是在Kehagias等人，Microelectronic Engineering 86(2009)，第776-778頁中描述的，其通過引用以其整體被併入。該組合物是具有化學式[RSiO3/2]n的有機矽化合物，其中R基團可以相同或不同的。該組合物可以包含一個或更多個不同的籠或核心結構作為單體單元。在一些情況下，結構包括以下多八面體籠或核心結構。在一些情況下，多面體結構可以是T8結構， 諸如：
Figure 108120316-A0305-02-0098-25
並且由
Figure 108120316-A0305-02-0098-26
表示。該單體單元通 常具有八個官能基臂R1至R8。
單體單元可以具有含有10個矽原子和10個R基團的籠結構，被稱 為T10，諸如
Figure 108120316-A0305-02-0098-27
，或者可以具有含有12個矽原子和12個R基團 的籠結構，被稱為T12，諸如：
Figure 108120316-A0305-02-0098-28
。POSS基材料可以包括T6、T14 或T16籠結構。平均籠含量可以在合成期間調整，和/或通過純化方法來控制，並且單體單元的籠尺寸的分佈可以用於本文揭露的實例。作為實例，任何籠結構 可以以範圍在所使用的全部POSS單體單元的約30%至約100%內的量存在。 POSS基材料可以是籠結構與開放和部分開放籠結構的混合物。因此，POSS基樹脂前體或樹脂可以包括環氧基POSS材料，其可以是矽倍半氧烷構型的混合物。 例如，本文描述的任何POSS材料可以是分立的POSS籠和非分立的矽倍半氧烷結構和/或不完全縮合的分立結構的混合物，諸如聚合物、梯形物(ladder)及類似物。因此，部分縮合的材料將在一些矽頂點包括如本文描述的環氧基R基團，但是一些矽原子不會被R基團取代，而可以被OH基團取代。在一些實例中，POSS材料包括各種形式的混合物，諸如： 稠合的籠 (a)
Figure 108120316-A0305-02-0099-60
不完全稠合的籠 (b)
Figure 108120316-A0305-02-0099-92
非籠含量大的&錯誤限定的結構 和/或(c)
Figure 108120316-A0305-02-0100-62
。
在本文揭露的一些實例中，R1至R8或R10或R12中的至少一個包含環氧基，並且因此POSS被稱為環氧基POSS。在一些實例中，大多數臂，諸如八個、十個或十二個臂或R基團，包括環氧基基團。在其他實例中，R1至R8或R10或R12是相同的，並且因此R1至R8或R10或R12中的每一個包含環氧基基團。在仍其他實例中，R1至R8或R10或R12不相同，並且因此R1至R8或R10或R12中的至少一個包含環氧基，並且R1至R8或R10或R12中的至少另一個是非環氧基官能基。非環氧基官能基可以是(a)與環氧基基團正交反應的反應性基團(即，在不同於環氧基基團的條件下反應)，其用作用於將樹脂與擴增引子、聚合物或聚合劑偶聯的柄；或者(b)調整樹脂的機械性質或功能性質，例如表面能調整的基團。在一些實例中，非環氧基官能基選自由以下組成的組：疊氮化物/疊氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四
Figure 108120316-A0305-02-0100-79
、胺基、羥基、炔基、酮、醛、酯基團、烷基、芳基、烷氧基和鹵代烷基。在一些方面中，選擇非環氧基官能基以增加樹脂的表面能。在這些其他實例中，環氧基基團與非環氧基基團的比率範圍在從7：1至1：7、或9：1至1：9、或11：1至1：11。在任何實例中，二取代或單取代的(末端)環氧基基團允許單 體單元在使用紫外(UV)光和酸引發時聚合成交聯的基質。在一些方面中，環氧基POSS包含末端環氧基基團。該類型的POSS的實例是具有以下結構的縮水甘油基POSS：
Figure 108120316-A0305-02-0101-63
環氧基POSS也可以是經修飾的環氧基POSS，其包括被併入樹脂或核心結構或籠結構中作為官能基R1至R8或R10或R12中的一個或更多個的受控自由基聚合(CRP)劑和/或另一個感興趣的官能基。
在本文揭露的POSS基樹脂的其他實例中，R1至R8或R10或R12中的每一個包括任何非環氧基基團，諸如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙二醇或短聚乙二醇鏈(至多達50個重複單元)。可以使用可以自由基聚合的任何非環氧基POSS單體。一個實例是具有以下結構的甲基丙烯醯基POSS籠混合物：
Figure 108120316-A0305-02-0102-64
另一個實例是具有以下結構的PEG-POSS籠混合物：
Figure 108120316-A0305-02-0102-65
 在PEG-POSS實例中，R基團的末端甲基基團(CH3)可以被X替代，其中X是丙烯醯基基團、甲基丙烯醯基基團或另一種合適的端基。
還可以使用其他樹脂54。實例包括(非POSS)環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂(其可以是開環的環氧化物)、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。作為實例，可以使用包括環氧基和丙烯酸酯單體的樹脂，或者可以使用包括環氧基和乙烯單體的樹脂。
合適的樹脂54的另一個實例是無定形的氟聚合物。商業上可獲得的無定形(非結晶)的氟聚合物的實例是來自Bellex的CYTOP®。
如圖11B中示出的，樹脂54被沉積在支撐物52上。在一個實例中，樹脂54的沉積包括化學氣相沉積、浸塗、浸泡塗佈、旋塗、噴塗、小池分配、超音波噴塗、刮刀塗佈、氣溶膠印刷、網板印刷、微接觸印刷或噴墨印刷。
然後，使用本文提及的任何圖案化技術使經沉積的樹脂54圖案化。在圖11B中示出的實例中，奈米壓模微影術用於使樹脂54圖案化。在樹脂54經沉積後，可以將其軟烘烤以去除過量的溶劑。將奈米壓模微影術模具或工作印模56壓靠在樹脂54層上，以在樹脂54上產生壓印。換句話說，樹脂54透過工作印模56的突出部分而變得曲折或穿孔。然後，樹脂54可以在工作印模56就位的情況下固化。固化可以通過通過以下來完成：暴露於光化輻射，諸如可見光輻射或紫外線(UV)輻射，或者當使用光阻劑時暴露於範圍在從約240nm至380nm的波長的輻射；或者當使用可熱固化的抗蝕劑時通過暴露於熱。固化可以促進聚合和/或交聯。作為實例，固化可以包括多個階段，包括軟烘烤(例如，以去除溶劑)和硬烘烤。軟烘烤可以於範圍在從約50℃至約150℃的較低溫度進行。硬烘烤的持續時間可以於範圍在從約100℃至約300℃的溫度持續從約5秒至約10分鐘。可以用於軟烘烤和/或硬烘烤的裝置的實例包括熱板、烘箱、等等。
在固化後，釋放工作印模56。這在樹脂54中產生形貌特徵，即凹陷28A和28B或28C。如圖11C中示出的，具有被限定於其中的凹陷28A和28B的樹脂54被稱為經圖案化樹脂54’。如圖11D中示出的，具有被限定於其中的凹陷28C的樹脂54被稱為經圖案化樹脂54”。經圖案化樹脂54’、54”可以經歷進一步的硬烘烤以完成固化並鎖定在經壓印的形貌中。在一些實例中，硬烘烤可以於範圍在從約60℃至約300℃的溫度進行。
圖11C中示出的凹陷28A和28B具有不同的尺寸。在該實例中，「不 同尺寸」意指一些凹陷28B具有比一些其他凹陷28A更小的開口尺寸。在該實例中，「開口尺寸」指的是被在經圖案化樹脂54’上的各個凹陷開口佔據的面積和/或在經圖案化樹脂54’上的各個凹陷開口的直徑。在圖11C中示出的實例中，各個凹陷28B的開口的面積和直徑小於各個凹陷28A的開口的面積和直徑。較大凹陷28A的開口的面積和直徑取決於待引入其中的珠50的粒度(例如直徑)。較小凹陷28B的開口的面積和直徑小於珠50的粒度。這些開口尺寸使得珠50能夠通過尺寸排阻自組裝到凹陷28A而不是凹陷28B中。
圖11D中示出的凹陷28C包括兩個互連但具有不同的尺寸的部分34、34’。在該實例中，「不同尺寸」意指各個凹陷28C的部分34’具有比部分34更小的開口尺寸。同樣在該實例中，「開口尺寸」指的是被在經圖案化樹脂54”上的各個部分開口佔據的面積和/或在經圖案化樹脂54”上的各個部分開口的直徑。在圖11D中示出的實例中，各個部分34’的開口的面積和直徑小於各個部分34的開口的面積和直徑。較大部分34的開口的面積和直徑取決於待引入其中的珠50的粒度(例如直徑)。較小部分34’的開口的面積和直徑小於珠50的粒度。這些開口尺寸使得珠50能夠通過尺寸排阻自組裝到部分34而不是部分34’中。
在表面上的各個凹陷開口或部分開口的面積的實例可以是至少約1×10-3μm2、至少約1×10-2μm2、至少約0.1μm2、至少約1μm2、至少約10μm2、至少約100μm2或更大。可選擇地或另外地，面積可以是至多約1×103μm2、至多約100μm3、至多約10μm2、至多約1μm2、至多約0.1μm2、至多約1×10-2μm2或更小。在一些情況下，各個凹陷28A、28B或部分34、34’的直徑可以是至少約50nm、至少約0.1μm、至少約0.5μm、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。可選擇地或另外地，直徑可以是至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.5μm、至多約0.1μm或更小(例如，約50nm)。 各個凹陷開口或部分開口的面積和直徑可以大於上文指定的值、小於上文指定 的值或在上文指定的值之間。可以使用任何期望的面積和直徑，只要凹陷28A的開口的面積和直徑大於凹陷28B的開口的面積和直徑，或者只要凹陷28C的部分34的開口的面積和直徑大於凹陷28C的部分34’的開口的面積和直徑即可。
可以設想凹陷28A和28B或28C的許多不同佈局，包括規則的、重複的和非規則的圖案。在一個實例中，凹陷28A和28B或28C被設置成六邊形網格以用於緊密的填充和改進的密度。其他佈局可以包括例如直線(即矩形)佈局、三角形佈局、等等，只要凹陷28A或部分34可以容納經官能化珠50(例如，其上形成有區域16的核心結構49，如例如圖13C、圖14、等等中示出的)。在一些實例中，佈局或圖案可以是呈行和列的凹陷28A和28B或28C的x-y形式。在一些其他實例中，佈局或圖案可以是凹陷28A和28B或28C和/或間隙區域30的重複佈置。在仍其他實例中，佈局或圖案可以是凹陷28A和28B或28C和/或間隙區域30的隨機佈置。圖案可以包括條帶、漩渦、線、三角形、矩形、圓形、弧形、棋盤格、方格、對角線、箭頭、正方形和/或交叉影線。
應當理解，凹陷28A和28B或28C的佈局或圖案可以以密度和/或平均間距來表徵，如本文描述地。
仍進一步地，凹陷28A和28B或28C可以具有任何合適的深度。
用於使用圖11C中示出的經圖案化樹脂54’或圖11D中示出的經圖案化樹脂54”製造流動池的實例的方法101的實例在圖12中被描繪。如圖12中示出的，方法101包括選擇性地將聚合物32施加於在支撐物52上的經圖案化樹脂54’或54”的凹陷28A、28B或28C中(元件符號103)；將第一引子組12A、12B、12C、12D接枝到至少一些凹陷28A、28B或28C中的聚合物32(元件符號105)；以及在接枝第一引子組12A、12B、12C、12D之前或之後，將經官能化珠50沉積在i)至少一些凹陷28C的各個凹陷的一部分中，或沉積在ii)具有比至少一些凹陷28B的開口尺寸更大的開口尺寸的第二凹陷28A中，所述經官能化珠50包括被附接在核 心結構49的表面的第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’，其中第一引子組和第二引子組12A、12A’或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’不同。涉及凹陷28A、28B的該方法101的不同實例將參考圖13A至圖13D和圖14以及圖15A至圖15D和圖16來進一步描述。涉及凹陷28C的該方法101的不同實例將參考圖17A至圖17D和圖18以及圖19A至圖19D和圖20來進一步描述。
圖13A描繪了包括較大凹陷28A和較小凹陷28B的經圖案化樹脂54’。為了清楚起見，省略了凹陷16A和16B的深度。
圖13B描繪了將聚合物32選擇性地施加到各個凹陷28A和28B中。聚合物32的選擇性施加可以包括多個程序，包括間隙區域30和凹陷28A、28B中的暴露的表面的活化，將聚合物32沉積在經活化的間隙區域30上和凹陷28A、28B中，以及從間隙區域30去除聚合物32。
在一些實例中，活化包括將包括經圖案化樹脂54’的間隙區域30和在凹陷28A、28B中暴露的支撐物52的區域的表面矽烷化。矽烷化可以使用任何矽烷或矽烷衍生物來完成。矽烷或矽烷衍生物的選擇可以部分取決於待形成的聚合物32，因為可能期望在矽烷或矽烷衍生物和聚合物32之間形成共價鍵。 用於附接矽烷或矽烷衍生物的方法可以取決於所使用的矽烷或矽烷衍生物而變化。本文闡述了若干實例。
合適的矽烷化方法的實例包括氣相沉積(例如，YES方法)、旋塗或其他沉積方法。
在使用YES CVD烘箱的實例中，將其上具有經圖案化樹脂54’的支撐物52放置在CVD烘箱中。可使腔室排氣，並且然後開始矽烷化循環。在循環期間，矽烷或矽烷衍生物容器可以保持在合適的溫度(例如，對於降冰片烯矽烷約120℃)，矽烷或矽烷衍生物蒸氣管線可以保持在合適的溫度(例如，對於降冰片烯矽烷約125℃)，並且真空管線可以保持在合適的溫度(例如，約145℃)。
在另一個實例中，矽烷或矽烷衍生物(例如，液體降冰片烯矽烷)可以被沉積在玻璃瓶內，並與其上具有經圖案化樹脂54’的支撐物52放置在玻璃真空乾燥器內。然後可以將乾燥器抽真空至範圍在從約15mTorr至約30mTorr的壓力，並放置於範圍在從約60℃至約125℃的溫度的烘箱內。允許矽烷化進行，並且然後將乾燥器從烘箱中取出，冷卻並在空氣中排氣。
氣相沉積、YES方法和/或真空乾燥器可以與各種矽烷或矽烷衍生物一起使用，所述各種矽烷或矽烷衍生物諸如包括以下者的矽烷或矽烷衍生物：環烯烴不飽和部分，諸如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，包括氧或氮代替碳原子之一的(雜)降冰片烯)、反式環辛烯、反式環辛烯衍生物、反式環戊烯、反式環庚烯、反式環壬烯、雙環[3.3.1]壬-1-烯、雙環[4.3.1]癸-1(9)-烯、雙環[4.2.1]壬-1(8)-烯以及雙環[4.2.1]壬-1-烯。這些環烯烴中的任一種可以例如被諸如以下者的R基團取代：氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基(heteroalicyclyl)、芳烷基或(雜脂環基)烷基。降冰片烯衍生物的實例包括[(5-雙環[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基矽烷。作為其他實例，當矽烷或矽烷衍生物包括環炔烴不飽和部分，諸如環辛炔、環辛炔衍生物或雙環壬炔(例如雙環[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、雙環[6.1.0]壬-2-炔或雙環[6.1.0]壬-3-炔)時，可以使用這些方法。這些環炔烴可以被本文描述的任何R基團取代。
矽烷或矽烷衍生物的附接在間隙區域30上和在凹陷28A、28B中形成經活化的表面。
聚合物層32然後可以如本文描述地施加。作為實例，聚合物(例如PAZAM)可以使用旋塗、或浸漬或浸塗、或經官能化分子在正壓或負壓下的流動、或另一種合適的技術來沉積。沉積形成聚合物層32的聚合物可以存在於混合物中。在一個實例中，混合物包括在水中或在乙醇和水的混合物中的PAZAM。
在塗覆後，也可以使包含聚合物的混合物暴露於固化程序，以橫 跨經圖案化樹脂54’的經活化的間隙區域30和在凹陷28A、28B中形成聚合物層32。在一個實例中，固化可以於範圍在從室溫(例如，約25℃)至約95℃的溫度進行範圍在從約1毫秒至約幾天的時間。在另一個實例中，時間範圍可以在從10秒至至少24小時。在仍另一個實例中，時間範圍可以在從約5分鐘至約2小時。
聚合物層32與經活化(在該實例中經矽烷化)的表面的附接可以通過共價鍵結。共價連接對在各種使用期間在最終形成的流動池的整個壽命期間將至少第一引子組12A、12B、12C、12D保持在凹陷28B中是有幫助的。以下是在經活化(例如，矽烷化)的表面和聚合物層32之間可以發生的反應的一些實例。
當矽烷或矽烷衍生物包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作為不飽和部分時，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)經歷與PAZAM的疊氮化物/疊氮基基團的1,3-偶極環加成反應；ii)經歷與附接至PAZAM的四
Figure 108120316-A0305-02-0108-78
基團的偶聯反應；經歷與附接至PAZAM的腙基團的環加成反應；經歷與附接至PAZAM的四唑基團的光點擊反應；或者經歷與附接至PAZAM的腈氧化物基團的環加成。
當矽烷或矽烷衍生物包括環辛炔或環辛炔衍生物作為不飽和部分時，環辛炔或環辛炔衍生物可以：i)經歷與PAZAM的疊氮化物/疊氮基的應變(strain)促進的疊氮化物-炔烴1,3-環加成(SPAAC)反應，或者ii)經歷與附接至PAZAM的腈氧化物基團的應變促進的炔烴-腈氧化物環加成反應。
當矽烷或矽烷衍生物包括雙環壬炔(bicyclononyne)作為不飽和部分時，由於雙環環體系中的應變，雙環壬炔可以經歷與附接至PAZAM的疊氮化物或腈氧化物的類似的SPAAC炔烴環加成。
在其他實例中，電漿灰化而不是矽烷化可以用於活化間隙區域30和在凹陷28A、28B中的支撐物52的暴露的表面。在電漿灰化後，包含聚合物的混合物可以直接旋塗(或否則沉積)在經電漿灰化的表面上，並且然後固化以形成 聚合物層32。在該實例中，電漿灰化可以產生表面活化劑(例如羥基基團(C-OH或Si-OH)和/或羧基基團)，其可以將聚合物黏附到間隙區域30和凹在陷28A、28B中的支撐物52的暴露的表面。在這些實例中，選擇聚合物26，使得它與通過電漿灰化產生的表面基團反應。
無論活化經由矽烷化還是電漿灰化發生，然後可以進行拋光，以便從經活化的間隙區域30去除聚合物層32。拋光可以如本文描述地進行。在一些實例中，拋光還可以去除或還可以不去除鄰接間隙區域30的矽烷或矽烷衍生物。當這些經矽烷化的部分被完全去除時，應當理解，基底性經圖案化樹脂54’被暴露。
如圖13C中示出的，在方法101的該實例中，經官能化珠50被沉積到凹陷28A中。各個經官能化珠50包括核心結構49和被附接在核心結構49的表面的第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’。第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’不同於如本文描述的第一引子組12A、12B、12C、12D。可以使用引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’的任何實例。
核心結構49可以是本文針對珠/核心結構提及的任何實例。在一個實例中，經官能化珠50的核心結構49選自由矽石、超順磁性材料、聚苯乙烯、和丙烯酸酯組成的組。核心結構49可以在其表面上具有用於與第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’共價偶聯的反應性基團。這樣的反應性基團的實例包括羧酸、脂肪族伯胺(primary apliphatic amine)、芳香族胺、芳香族氯甲基(例如乙烯基苄基氯化物)、醯胺、醯肼、醛、羥基、硫醇和環氧基。這些反應性基團可以固有地存在於核心結構49的表面，或者可以通過任何合適的官能化技術(例如，化學反應、用含反應性基團的聚合物塗覆核心結構49、等等)被併入核心結構49的表面上。具有其固有的反應性基團或其添加的反應性基團或塗層的核心結構49限定了區域16。
在本文揭露的利用珠50的實例中，一個引子組12A、12B、12C、12D或12A’、12B’、12C’、12D’可以在3’末端用磷酸基封端基團官能化，這將抑制接種後發生任何延伸。一旦發生第一次延伸(用另一引子組12A’、12B’、12C’、12D’或12A、12B、12C、12D)，磷酸基將然後與接種到經磷酸基封端的引子組12A、12B、12C、12D或12A’、12B’、12C’、12D’的任何股一起被去除，並且然後可以進行兩個引子組12A、12B、12C、12D和12A’、12B’、12C’、12D’之間的擴增。該方法將幫助降低多株(polyclonality)率，因為最初僅一個引子組12A、12B、12C、12D或12A’、12B’、12C’、12D’是可延伸的。
雖然在圖13A至圖13D中未示出，但是在沉積經官能化珠50之前，方法101可以包括通過將第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’附接至核心結構49來形成經官能化珠50。官能化可以使用任何合適的技術進行，包括使疊氮基(例如琥珀醯亞胺(NHS)酯)封端的引子與在核心結構49表面上的肼反應，或者使炔烴封端的引子與在核心結構表面上的疊氮化物反應，或者使胺基封端的引子與在核心結構49表面上的經活化的羧酸基或NHS酯反應，或者使硫醇封端的引子與烷基化反應物(例如碘代乙醯胺或馬來醯亞胺)反應，使亞磷醯胺封端的引子與硫醚反應，或者使經生物素修飾的引子與在核心結構49表面上的鏈黴抗生物素蛋白反應。一些核酸引子19、19’、21、21’可以在離散劑(chaotropic agent)(KI、NI或NaSCN)的存在下被捕獲到矽石珠上。作為一個具體的實例，二苯并環辛炔(DBCO，其包括炔烴)封端的引子可以用於無銅點擊接枝。
經官能化珠50可以使用任何合適的技術被沉積在經圖案化樹脂54’上。作為一個實例，經官能化珠50可以在液體載體(例如水)中混合，該液體載體可以被加載到經圖案化樹脂54’的表面上。在另一個實例中，經官能化珠50可以通過在其上還包括具有經圖案化樹脂54’的支撐物52的振盪器中振盪珠50與50μm至150μm的鋼珠而被強制嵌入凹陷28A中。由於經官能化珠50的尺寸以及 凹陷28A和28B的尺寸，尺寸排阻將防止經官能化珠50進入較小的凹陷28B，並且將使得一個經官能化珠50能夠自組裝到一個凹陷28A中。經官能化珠50可以被物理地截留在相應的凹陷28A中。經官能化珠50可以可選擇地被化學附接在相應的凹陷28A中，例如經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素連接子。
如圖13D中示出的，凹陷28B然後可以用第一引子組12A、12B、12C、12D官能化。引子18、18’和20、20’可以是本文揭露的任何實例，並且包括可以附接至聚合物層32的反應性基團的官能基。因為在凹陷28A中的聚合物層32被經官能化珠50覆蓋，在凹陷28A中的聚合物層32未被暴露，並且因此其反應性基團不可用於與第一引子組12A、12B、12C、12D的反應。
引子18、18’和20、20’可以是本文闡述的任何實例，並且彼此不同，並且不同於引子19、19’和21、21’。例如，如果引子21、19包括P5和P7U引子，則引子20、18可以包括P5U和P7引子。在該實例中，第一引子組12A包括不可切割的第一引子18(例如P7)和可切割的(例如經尿嘧啶修飾的)第二引子(例如P5U)；並且第二引子組12A’包括可切割的(例如經尿嘧啶修飾的)第一引子19(例如P7U)和不可切割的第二引子21(例如P5)。如本文討論的，引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’的化學性是正交的，這允許跨越兩個引子群體(組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’)的擴增，以及一些所產生的模版股(例如42、46)的切割，在特定區域14或16中留下相同的(正向或反向)模版股40或44。這使得能夠同時獲得可區分的讀段1和讀段2信號。
可以進行接枝程序以將引子18、18’和20、20’接枝到在凹陷28B中的聚合物層32。在一個實例中，接枝可以通過流過沉積(例如，使用臨時結合的蓋)、浸泡塗佈、噴塗、小池分配來完成，或者通過會將引子18、18’和20、20’附接至在凹陷28B中的聚合物層32的另一種合適的方法來完成。這些示例性技術中的每一種可以利用引子溶液或混合物，引子溶液或混合物可以包含引子、水、 緩衝液和催化劑。
可以使用浸泡塗佈，因為在該實例中，經官能化珠50在被引入凹陷28A中之前被官能化，並且因此不與浸泡化學物質反應。浸泡塗佈可以包括將如圖13C中示出的支撐物52(具有在其上的經圖案化樹脂54’和在凹陷28A中的經官能化珠50)浸沒在一系列溫度受控的浴中。浴也可以是流受控的和/或用氮氣層覆蓋。浴可以包含引子溶液或混合物。在各種浴中，引子18、18’和20、20’附接至聚合物層32的反應性基團。在一個實例中，將支撐物52引入包含引子溶液或混合物的第一浴中，在該第一浴中發生反應以附接引子18、18’和20、20’，並且然後移動到另外的浴中以用於洗滌。從浴到浴的移動可能涉及機械臂，或可以手動進行。乾燥系統也可以用在浸泡塗佈中。
噴塗可以通過將引子溶液或混合物直接噴霧到如圖13C中示出的支撐物52(具有在其上的經圖案化樹脂54’和在凹陷28A中的經官能化珠50)上來完成。經噴塗的晶圓可以於範圍在從約0℃至約70℃的溫度培養範圍在從約4分鐘至約60分鐘的時間。在培養後，可以使用例如旋塗器稀釋和去除引子溶液或混合物。
小池分配可以根據池和旋轉剝離方法來進行，並且因此可以用旋塗器來完成。引子溶液或混合物可以被(手動地或經由自動化程序)施加到如圖13C中示出的支撐物52(具有在其上的經圖案化樹脂54’和在凹陷28A中的經官能化珠50)上。施加的引子溶液或混合物可以被施加至整個表面上或散佈到整個表面，包括在經官能化珠50和間隙區域30上。經引子塗覆的底材可以於範圍在從約0℃至約80℃的溫度培養範圍在從約2分鐘至約60分鐘的時間。在培養後，可以使用例如旋塗器稀釋和去除引子溶液或混合物。
用任何接枝方法，引子18、18’和20、20’與在凹陷28B中的暴露的聚合物層32的反應性基團反應，並且對經官能化珠50或經圖案化樹脂54’的間 隙區域30不具有親和力。因此，引子18、18’和20、20’選擇性地接枝到凹陷28B中的聚合物層32。
圖14是圖13D中描繪的流動池10A的部分的橫截面圖。流動池10A包括：支撐物52；在支撐物52上的經圖案化樹脂54’，所述經圖案化樹脂54’包括由間隙區域30分隔的第一凹陷28B和第二凹陷28A，第一凹陷28B具有比第二凹陷28A更小的開口尺寸；被附接在至少一些第一凹陷28B中的第一引子組12A、12B、12C或12D(包括引子18、18’和20、20’)；和分別位於至少一些第二凹陷28A中的經官能化珠50，所述經官能化珠50包括被附接在核心結構49的表面的第二引子組12A’、12B’、12C’或12D’(包括引子19、19’和21、21’)，其中第二引子組12A’、12B’、12C’或12D’不同於第一引子組12A、12B、12C或12D。在圖13D和圖14中示出的實例中，聚合物層32存在於第一凹陷28B中和存在於第二凹陷28A中，並且第一引子組12A、12B、12C或12D被附接至在至少一些第一凹陷28B中的聚合物層32。此外，在圖13D和圖14中示出的實例中，經官能化珠50被放置於在至少一些第二凹陷28A中的聚合物層32上。
現在參考圖15A至圖15D，示出了涉及凹陷28A、28B的方法101的另一個實例。圖15A描繪了包括較大凹陷28A和較小凹陷28B的經圖案化樹脂54’。為了清楚起見，省略了凹陷28A和28B的深度。
圖15B描繪了在凹陷28A和28B各自中的聚合物層32。聚合物層32可以如本文描述地選擇性地施加，這可以包括：活化間隙區域30和在凹陷28A、28B中的暴露的表面，將聚合物層32沉積在經活化的間隙區域30上和在凹陷28A、28B中，以及從間隙區域30去除聚合物層32。
在該實例中，如圖15C中示出的，然後將引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18、18’和20、20’)接枝到在各個凹陷28A、28B中的聚合物層32。 因為經官能化珠50未被引入，所以在各個凹陷28A、28B中的聚合物層32被暴露， 並且因此其反應性基團可用於與第一引子組12A、12B、12C、12D反應。接枝可以使用任何所述技術參考圖13D來完成。因為聚合物層32在各個凹陷28A、28B中暴露，所以引子18、18’和20、20’可以被接枝到各個凹陷28A、28B中。
如圖15D中示出的，經官能化珠50然後可以被引入凹陷28A(其中具有聚合物層32和引子組12A、12B、12C、12D)中。經官能化珠50可以使用任何合適的技術被沉積在經圖案化樹脂54’上。由於經官能化珠50的尺寸以及凹陷28A和28B的尺寸，尺寸排阻將防止經官能化珠50進入較小的凹陷28B，並且將使得一個經官能化珠50能夠自組裝到一個凹陷28A中。在該實例中，經官能化珠50可以被物理地截留在相應的凹陷28A中。可選擇地，在該實例中，經官能化珠50可以被化學地附接在相應的凹陷28A中，例如經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素連接子。
圖16是圖15D中描繪的流動池10B的部分的橫截面圖。流動池10B包括：支撐物52；在支撐物52上的經圖案化樹脂54’，所述經圖案化樹脂54’包括由間隙區域30分隔的第一凹陷28B和第二凹陷28A，第一凹陷28B具有比第二凹陷28A更小的開口尺寸；被附接在至少一些第一凹陷28B中的第一引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18、18’和20、20’)；和分別位於至少一些第二凹陷28A中的經官能化珠50，所述經官能化珠50包括被附接在核心結構49的表面的第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’(包括引子19、19’和21、21’)，其中第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’不同於第一引子組12A、12B、12C、12D。在圖15D和圖16中示出的實例中，聚合物層32存在於第一凹陷28B中和存在於第二凹陷28A中，並且第一引子組12A、12B、12C、12D被附接至在第一凹陷28B中和在第二凹陷28A中的聚合物層32。然後，在該實例中，經官能化珠50被放置於在至少一些第二凹陷28A中的第一引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18、18’和20、20’)上。
現在參考圖17A至圖17D，示出了涉及凹陷28C的方法101的實例。
圖17A描繪了包括凹陷28C的經圖案化樹脂54”。各個凹陷28C包括較大部分34和較小部分34’。為了清楚起見，省略了凹陷28C(如圖11D中示出的)的深度。
圖17B描繪了在各個凹陷28C中的聚合物層32。如圖17B中示出的，各個凹陷28C的較大部分34和較小部分34’兩者皆具有被施加至其的聚合物層32。聚合物層32可以如本文描述地選擇性地施加，這在一個實例中可以包括：活化間隙區域30和在凹陷28C中的暴露的表面，將聚合物層32沉積在經活化的間隙區域30上和在凹陷28C中，以及從間隙區域30去除聚合物層32。
如圖17C中示出的，在方法101的該實例中，經官能化珠50被沉積到凹陷28C的較大部分34中。本文描述的任何經官能化珠50可以用於該實例。
經官能化珠50(包括引子19、19’和21、21’)可以使用任何合適的技術，諸如本文描述的技術，沉積在經圖案化樹脂54”上。由於經官能化珠50的尺寸以及部分34和34’的尺寸，尺寸排阻將防止經官能化珠50進入較小部分34’，並且將使得一個經官能化珠50能夠自組裝到各凹陷28C的一個較大部分34中。在該實例中，經官能化珠50可以被物理地截留在相應的較大部分34中，或者可以被化學地附接在相應的較大部分34中，例如經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素連接子。
如圖17D中示出的，凹陷28C的較小部分34’然後可以用第一引子組12A、12B、12C、12D官能化。可以使用本文描述的引子18、18’和20、20’的任何實例，只要它們被選擇為不同於經官能化珠50的引子19、19’和21、21’並與經官能化珠50的引子19、19’和21、21’正交。在該實例中，在凹陷28C的較大部分34中的聚合物層32被經官能化珠50覆蓋，並且因此在凹陷28C的較大部分34中 的聚合物層32未被暴露。因此，聚合物反應性基團不可用於與第一引子組12A、12B、12C、12D的反應。在較小部分34’中的聚合物反應性基團保持暴露，並且因此可用於與第一引子組12A、12B、12C、12D的反應。引子18、18’和20、20’與在較小部分34’中的聚合物層32的接枝可以使用任何所述技術參考圖13D來完成。
圖18是圖17D中描繪的流動池10C的部分的橫截面圖。流動池10C包括：支撐物52；在支撐物52上的經圖案化樹脂54”，所述經圖案化樹脂54”包括由間隙區域30分隔的凹陷28C；被附接至至少一些凹陷28C的第一引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18、18’和20、20’)；和被放置在至少一些凹陷28C中使得第一引子組12A、12B、12C、12D的至少一些引子18、18’和20、20’被暴露的經官能化珠50，所述經官能化珠50包括被附接在核心結構49的表面的第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’，其中第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’不同於第一引子組12A、12B、12C、12D。在圖17D和圖18中示出的實例中，各個凹陷28C包括第一部分34和第二部分34’，所述第一部分34具有大於或等於經官能化珠50的直徑的第一開口尺寸，所述第二部分34’具有小於經官能化珠50的直徑的第二開口尺寸；並且經官能化珠50被放置在至少一些凹陷28C的各個凹陷的第一部分34中。同樣在圖17D和圖18中示出的實例中，聚合物層32存在於凹陷28C中，並且第一引子組12A、12B、12C、12D被附接至聚合物層32的未被經官能化珠50佔據的部分(即，被附接至在凹陷28C的較小部分34’中的聚合物層32的部分)。
現在參考圖19A至圖19D，示出了涉及凹陷28C的方法101的另一個實例。各個凹陷28C包括較大部分34和較小部分34’。為了清楚起見，省略了凹陷28C(如圖11D中示出的)的深度。
圖19B描繪了在各個凹陷28C中的聚合物層32。如圖19B中示出 的，各個凹陷28C的較大部分34和較小部分34’兩者皆具有被施加至其的聚合物層32。聚合物層32可以如本文描述地選擇性地施加，在該實例中，這可以包括：活化間隙區域30和在凹陷28C中的暴露的表面，將聚合物層32沉積在經活化的間隙區域30上和在凹陷28C中，以及從間隙區域30去除聚合物層32。
在該實例中，如圖19C中示出的，然後將引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18、18’和20、20’)接枝到在各個凹陷28C中的聚合物層32。因為經官能化珠50未被引入，所以在凹陷28C的各個部分34、34’中的聚合物層32被暴露，並且因此其反應性基團可用於與第一引子組12A、12B、12C、12D的反應。 接枝可以使用任何所述技術參考圖13D來完成。由於聚合物層32在凹陷28C的各個部分34、34’中暴露，因此引子18、18’和20、20’可以被接枝到各個部分34、34’中。
如圖19D中示出的，經官能化珠50然後可以被引入凹陷28C(其中具有聚合物層32和引子組12A、12B、12C、12D)的較大部分34中。經官能化珠50可以使用任何合適的技術被沉積在經圖案化樹脂54”上。由於經官能化珠50的尺寸以及部分34和34’的尺寸，尺寸排阻將防止經官能化珠50進入較小部分34’，並且將使得一個經官能化珠50能夠自組裝到一個較大部分34中。在該實例中，經官能化珠50可以被物理地截留在相應的較大部分34中，或者可以被化學地附接在相應的較大部分34中，例如經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素連接子。
圖20是圖19D中描繪的流動池10D的部分的橫截面圖。流動池10D包括：支撐物52；在支撐物52上的經圖案化樹脂54”，所述經圖案化樹脂54”包括由間隙區域30分隔的凹陷28C；被附接至至少一些凹陷28C的第一引子組12A、12B、12C、12D(包括引子18、18’和20、20’)；和被放置在至少一些凹陷28C中使得第一引子組12A、12B、12C、12D的至少一些引子18、18’和20、20’被暴露的經官能化珠50，所述經官能化珠50包括被附接在核心結構49的表面的 第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’，其中第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’不同於第一引子組12A、12B、12C、12D。在圖19D和圖20中示出的實例中，各個凹陷28C包括第一部分34和第二部分34’，所述第一部分34具有大於或等於經官能化珠50的直徑的第一開口尺寸，所述第二部分34’具有小於經官能化珠50的直徑的第二開口尺寸；並且經官能化珠50被放置在至少一些凹陷28C的各個凹陷的第一部分34中。同樣在圖19D和圖20中示出的實例中，聚合物層32存在於凹陷28C中，第一引子組12A、12B、12C、12D被附接至在凹陷28C中的聚合物層32，並且經官能化珠50被放置在第一引子組12A、12B、12C、12D的一些引子18、18’和20、20’上(即，被附接至在凹陷28C的較大部分34中的聚合物層32的引子18、18’和20、20’上)。
示出了沒有結合至其的蓋的示例性流動池10A、10B、10C、10D。 儘管未示出，流動池10A、10B、10C、10D可以具有結合至如描述的間隙區域30的至少一部分的蓋。在一些實例中，蓋可以在流動池10A、10B、10C、10D形成之後被結合。
流動池10A、10B、10C、10D可以用於多種定序方法或技術，包括通常被稱為合成定序法(sequencing-by-synthesis，SBS)、循環陣列定序法、連接定序法(sequencing-by-ligation)、焦磷酸根定序法、等等的技術。在一個具體的實例中，流動池10A、10B、10C、10D可以被暴露於模版液/混合物，並且可以如本文描述地進行擴增以產生不可切割的第一模版股40、可切割的第一模版股46、不可切割的第二模版股44、可切割的第二模版股42。可以進行切割，並且然後可以進行本文揭露的同時配對末端定序方法。
使用利用流動池10A、10B、10C、10D的任何技術，由於引子組12A、12A’或12B、12B’或12C、12C’或12D、12D’存在於凹陷28A或28B或凹陷28C的部分34或34’中，而不存在於間隙區域30上，擴增和定序將被限於凹陷28A 和28B或28C。
基於嵌段共聚物的流動池
本文揭露的流動池的一些實例包括嵌段共聚物，其與包括經圖案化樹脂的多層底材一起使用。參考圖21至圖25B描述了這些實例。
在這些實例中，經圖案化樹脂(例如，54’)可以使用「自上而下(top down)」方法，諸如奈米壓模微影術來製造。自上而下方法可以產生具有高密度、低間距和小奈米特徵的凹陷28的陣列。當與嵌段共聚物的定向自組裝組合時，這是一種「自下而上(bottom up)」方法，甚至更小的特徵(具有亞微影術尺寸結構域)可以在凹陷28內形成。小的特徵可以是合意的，因為可以獲得更高的簇密度。更高的簇密度意味可以從給定的單位面積讀取更多的鹼基，這增加了來自經圖案化流動池的遺傳產率。此外，非經接枝區域(例如，間隙區域30)圍繞小特徵，這使得更容易接近被接枝到嵌段共聚物的引子。因此，引子的利用可以增加。
在這些實例中，嵌段共聚物在經圖案化樹脂的凹陷28中自組裝，而不是自組裝至在凹陷28之間的間隙區域30。因此，不包括用於從間隙區域30去除材料的另外的處理。
流動池的這些實例包括：支撐物52；在支撐物52上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域30分隔的凹陷28；在凹陷28中的經圖案化樹脂上的嵌段共聚物，嵌段共聚物的各個嵌段具有不同於嵌段共聚物的各個其他嵌段的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基；和引子，所述引子被附接至至少一個嵌段的嵌段特異性官能基。在一些實例中，引子包括被附接至嵌段共聚物的一個嵌段的不可切割的引子18、18’和21、21’，並且流動池可以用於配對末端定序技術，該配對末端定序技術包括順序地定序被附接至一個嵌段的正 向模版股並且然後反向模版股。在其他實例中，本文揭露的引子組12A、12A’、或12B、12B’、或12C、12C’、或12D、12D’被分別附接至嵌段共聚物的不同嵌段。在該實例中，一個嵌段包括引子18、18’和20、20’，並且另一個嵌段包括引子19、19’和21、21’。流動池的該實例可以用於本文揭露的同時配對末端定序技術。
流動池的部分的實例在圖22E和圖23中示出，並且將在本文中進一步描述。
用於製造流動池的實例的方法200的實例在圖21示出。如圖21中示出的，方法101包括：使樹脂圖案化以形成包括由間隙區域30分隔的凹陷28的經圖案化樹脂(元件符號202)；在經圖案化樹脂上引入包含嵌段共聚物的溶液，嵌段共聚物的各個嵌段具有不同於嵌段共聚物的各個其他嵌段的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基(元件符號204)；將溶液暴露於溶劑蒸氣退火，由此嵌段共聚物在凹陷28中相分離並自組裝(元件符號206)；和將引子接枝到至少一個嵌段的嵌段特異性官能基(元件符號208)。該方法200將參考圖22A至22E來進一步描述。
圖22A描繪了支撐物52，並且圖22B描繪了在支撐物52上沉積的樹脂54A。可以使用本文描述的支撐物52的任何實例。用嵌段共聚物，樹脂54A能夠具有被限定於其中的凹陷28(圖22C)，並且還能夠充當用於隨後沉積的嵌段共聚物58的指導模版(圖22C和圖22D之間的「BCP」)。因此，可以使用微影術、奈米壓模微影術、衝壓技術、壓花技術、模製技術、微蝕刻技術、印刷技術、等等圖案化的任何樹脂54A可以被使用。此外，樹脂54A在被圖案化後(即，經圖案化樹脂54A’)應當與待被沉積在其上的嵌段共聚物58具有在相同範圍內的表面能。在一個實例中，樹脂54A/經圖案化樹脂54A’和嵌段共聚物58各自具有在從約25mN/m至約50mN/m的範圍內的表面能。
可以被圖案化並且充當指導模版的樹脂54A的一些實例選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。雖然已經提供了若干實例，但是認為可以使用任何可以被自由基固化的樹脂。本文揭露的任何樹脂54可以用於樹脂54A。
如圖22A和圖22B之間示出的，樹脂54A被沉積在支撐物52上。 在方法200的實例中，樹脂54A的沉積包括化學氣相沉積、浸塗、浸泡塗佈、旋塗、噴塗、小池分配、超音波噴塗、刮刀塗佈、氣溶膠印刷、網板印刷、微接觸印刷或噴墨印刷。
然後，使用本文提及的任何圖案化技術使沉積的樹脂54A圖案化。於在圖22A和圖22B中和在圖22A和圖22B之間示出的實例中，奈米壓模微影術用於使樹脂54A圖案化。在樹脂54A被沉積後，可以將其軟烘烤以去除過量的溶劑。將奈米壓模微影術模具或工作印模56壓靠在樹脂54A層上，以在樹脂54A上產生壓印。換句話說，樹脂54A透過工作印模56的突出部分而變得曲折或穿孔。然後，樹脂54A可以在工作印模56就位的情況下固化。固化可以通過暴露於光化輻射，諸如可見光輻射或紫外線(UV)輻射，或者當使用光阻劑時暴露於範圍在從約240nm至380nm的波長的輻射；或者當使用可熱固化的抗蝕劑時通過暴露於熱來完成。固化可以促進聚合和/或交聯。作為實例，固化可以包括多個階段，包括軟烘烤(例如，去除溶劑)和硬烘烤。軟烘烤可以於範圍在從約50℃至約150℃的較低溫度進行。硬烘烤的持續時間可以於範圍在從約100℃至約300℃的溫度持續從約5秒至約10分鐘。可以用於軟烘烤和/或硬烘烤的裝置的實例包括熱板、烘箱、等等。
在固化後，釋放工作印模56。這在樹脂54A中產生形貌特徵，即凹陷16。如圖22C中示出的，具有被限定於其中的凹陷28的樹脂54A被稱為經圖 案化樹脂54A’。經圖案化樹脂54A’可以經歷進一步的硬烘烤以完成固化並鎖定在經壓印的形貌中。在一些實例中，硬烘烤可以於範圍在從約60℃至約300℃的溫度進行。
如圖22C中示出的，經圖案化樹脂54A’包括被限定於其中的凹陷28和分隔相鄰的凹陷28的間隙區域30。在本文揭露的實例中，凹陷28變得用嵌段共聚物(BCP)58和引子18、21官能化(圖22F)，而間隙區域30的一些部分可以用於鍵結，但不具有嵌段共聚物58或引子18、21。
如圖22C中示出的，經圖案化樹脂54A’然後可以被暴露於在凹陷28中形成經相分離的嵌段共聚物58(包括嵌段58A和58B)的程序中。如圖22C和圖22D之間示出的，嵌段共聚物58的溶液被沉積在經圖案化樹脂54A’上，其中嵌段共聚物58的各個嵌段58A、58B具有不同於嵌段共聚物58的各個其他嵌段58B、58A的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基。現在將描述嵌段共聚物58的各種實例。
嵌段共聚物58是由至少兩種不同的單體構成的雜聚物。在一個實例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58A，所述第一嵌段58A包括具有引子接枝性官能基作為其嵌段特異性官能基的單體；和第二嵌段58B，所述第二嵌段58B包括調整相互作用參數以驅動第一嵌段和第二嵌段的相分離的單體。在該實例中，第二嵌段58B的單體還可以包括嵌段特異性官能基，其可以與經圖案化樹脂54’反應(並且因此附接至經圖案化樹脂54’)。可以與經圖案化樹脂54’反應(並且因此附接至經圖案化樹脂54’)的嵌段特異性官能基在本文中被稱為樹脂附接性官能基。應當理解，第一和第二的命名並不表示在嵌段共聚物中的任何特定順序，並且任何嵌段可以包括引子接枝性官能基或調整相互作用參數的官能基。 例如，第一嵌段58A可以包括具有嵌段特異性官能基的單體，該嵌段特異性官能基能夠接枝引子(例如，18、21)，並且能夠調整相互作用參數以驅動第一嵌段和 第二嵌段的相分離，並且第二嵌段58B可以包括具有樹脂附接性官能基的單體。 對於另一個實例，第一嵌段58A可以包括具有嵌段特異性官能基的單體，該嵌段特異性官能基能夠接枝引子(例如，18、21)並且附接至樹脂54’，並且第二嵌段58B可以包括能夠調整相互作用參數以驅動第一嵌段和第二嵌段的相分離的單體。
在本文揭露的嵌段共聚物58的任何實例中，引子接枝性官能基選自由以下組成的組：疊氮化物/疊氮基、可選地被取代的胺基、可選地被取代的烯基、醛、可選地被取代的腙、可選地被取代的肼、羧基、羥基、可選地被取代的四唑、可選地被取代的四
Figure 108120316-A0305-02-0123-76
、腈氧化物、硝酮、硫醇、及其等之組合。當多個引子接枝性官能基被包含在單個嵌段中時，不同的引子可以被附接至單個嵌段。當不同的引子接枝性官能基被包含在不同的嵌段中時，不同的引子可以被附接至不同的嵌段。
引子接枝性官能基可以能夠與被附接至引子的5’末端的官能基反應。例如，雙環[6.1.0]壬-4-炔(BCN)封端的引子可以經由應變促進的無催化劑點擊化學被嵌段共聚物58的疊氮化物引子接枝性官能基捕獲。對於另一個實例，炔烴封端的引子可以經由銅催化的點擊化學被嵌段共聚物58的疊氮化物引子接枝性官能基捕獲。對於仍另一個實例，降冰片烯封端的引子可以與嵌段共聚物58的四
Figure 108120316-A0305-02-0123-77
引子接枝性官能基一起經歷無催化劑環應變促進的點擊反應。
在一個實例中，引子接枝性官能基是被附接至丙烯醯胺單體的疊氮基基團。該單體的實例是疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺。在另一個實例中，引子接枝性官能基是被附接至含苯單體的疊氮基基團。該單體的兩個實例包括 苄基疊氮化物或經疊氮化物官能化的苯乙烯(例如，
Figure 108120316-A0305-02-0124-66
)。
在本文揭露的嵌段共聚物58的任何實例中，樹脂附接性官能基選自由以下組成的組：胺基基團、醇基團、芳基基團、和帶電基團。合適的陰離子帶電基團包括硫酸基或羧酸基。合適的陽離子帶電基團包括銨、鈲或咪唑鎓。 在其他實例中，樹脂附接性官能基可以是三氟甲基基團(-CF3)。在本文揭露的嵌段共聚物58的仍另一個實例中，包括樹脂附接性官能基的單體可以是矽氧烷單體，諸如SiO(CH3)2。
在一個實例中，樹脂附接性官能基是被附接至丙烯醯胺單體的胺 基基團。該單體的實例是
Figure 108120316-A0305-02-0124-37
。在該實例中，乙基橋(氮之間)可以用丙 基橋或不干擾單體的期望功能的任何其他橋長度來替代。在一個實例中，橋長度可以至多達16個碳原子。在另一個實例中，樹脂附接性官能基是苯乙烯單體的芳基基團。其他樹脂附接性基團(用於共價附接)取決於樹脂54是如何被官能化的。例如，如果樹脂包含環氧基基團，胺或醇可以是合適的樹脂附接性官能基。
嵌段共聚物58的一些實例包括引子接枝性官能基和樹脂附接性官能基。這些基團可以分別和部分地取決於待接枝的引子(例如，18、21或18、20或18’、20’或19、21或19’、21’)並且取決於待附接至嵌段共聚物58的經圖案化樹脂54’。以下是嵌段共聚物58的一些實例，其包括引子接枝性官能基和樹脂附接性官能基兩者。
在經圖案化樹脂54’是環氧POSS的實例中，嵌段共聚物58包含： 第一嵌段58A，所述第一嵌段58A包括具有胺基基團作為其嵌段特異性官能基的丙烯醯胺單體；和第二嵌段58B，所述第二嵌段58B包括具有疊氮基基團作為其嵌段特異性官能基的疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺單體。在該實例中，第一嵌段58A包括樹脂附接性官能基，並且第二嵌段58B包括引子接枝性官能基，儘管第二嵌段58B也可以起樹脂附接性官能基的作用。該嵌段共聚物58的具體實例是：
Figure 108120316-A0305-02-0125-38
其中R是氫或聚合物引發物質端基，n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。聚合物引發物質端基的實例包括可逆加成-片段化鏈轉移(RAFT)端基、原子轉移自由基聚合(ATRP)端基、氮氧化物介導的自由基聚合(NMP)端基、四甲基乙二胺(TEMED)端基或自由基聚合(FRP)端基。在另一個實例中，n和m範圍獨立地在從約1至約1,000。
在經圖案化樹脂54’是環氧POSS的另一個實例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58A，所述第一嵌段58A包括具有芳基基團作為其嵌段特異性官能基的苯乙烯單體；和第二嵌段58B，所述第二嵌段58B包括具有疊氮基基團作為其嵌段特異性官能基的經疊氮化物官能化的苯乙烯。在該實例中，第一嵌段58A包括樹脂附接性官能基，並且第二嵌段58B包括引子接枝性官能基，儘管第 二嵌段58B也可以起作為樹脂附接性官能基的作用。該嵌段共聚物58的具體實例是：
Figure 108120316-A0305-02-0126-67
 其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。在另一個實例中，n和m範圍獨立地在從約1至約1,000。
在經圖案化樹脂54’是環氧POSS的仍另一個實例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58A，所述第一嵌段58A包括具有疊氮基作為其嵌段特異性官能基的經疊氮化物官能化的苯乙烯；和第二嵌段58B，所述第二嵌段58B包括具有矽氧烷作為其嵌段特異性官能基的矽氧烷單體。在該實例中，第一嵌段58A包括引子接枝性官能基，儘管第一嵌段58A也可以起樹脂附接性官能基的作用，並且第二嵌段58B包括樹脂附接性官能基。該嵌段共聚物58的具體實例是：
Figure 108120316-A0305-02-0126-68
 其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。在另一個實例中，n和m範圍獨立地在從約1至約1,000。
在經圖案化樹脂54’是無定形的氟聚合物(諸如CYTOP®)的實例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58A，所述第一嵌段58A包括具有三氟甲基基團作為其嵌段特異性官能基的單體；和第二嵌段58B，所述第二嵌段58B包括具有引子接枝性官能基和樹脂附接性官能基作為其嵌段特異性官能基的單體。在該嵌段共聚物58的一個實例中，第二嵌段58B包括疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺單體，並且第一嵌段58A(在該實例中，其可以是表面能改變性官能基)可以是經氟化的丙烯酸酯或經氟化的丙烯醯胺。該嵌段共聚物58的具體實例具有以下結構：
Figure 108120316-A0305-02-0127-41
 其中n範圍在從1至10,000內，並且m範圍在從1至10,000內。在另一個實例中，n和m獨立地範圍在從約1至約1,000。在該嵌段共聚物58(其適合與無定形的氟聚合物一起使用)的另一個實例中，第二嵌段58B包括經疊氮化物官能化的苯乙烯，並且第一嵌段58A(在該實例中是表面能改變性官能基)可以是丙烯酸三氟乙酯。該嵌段共聚物58的具體實例具有以下結構：
Figure 108120316-A0305-02-0128-69
 其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。在另一個實例中，n和m範圍獨立地在從約1至約1,000。
還應當理解，本文揭露的嵌段共聚物58還可以包括一種或更多種不干擾嵌段58A和/或58B各自的功能(例如，引子接枝、樹脂附接、相分離、等等)的其他單體。可以選擇另外的嵌段的另外的單體(以及特別是另外的單體的嵌段特異性官能基)來影響/改變嵌段共聚物58的表面自由能、影響嵌段共聚物58的穩定性、附接至另一種引子和/或附接酶。可以影響/改變表面自由能的單體的實例包括丙烯酸酯單體(例如丙烯酸三氟乙酯或甲基丙烯酸三氟乙酯)或三氟乙基丙烯醯胺的三氟甲基基團。可以附接酶的單體的實例可以包括以下嵌段特異性官能基：硫醇、胺或醇，它們可以與經N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)官能化的酶反應。 應當理解，其他官能基可以用於附接酶或其他生物分子。因此，嵌段共聚物58的一些實例是三元聚合物，這將參考圖24B和圖24A來進一步詳細的討論。
如上文提及的，在方法200中，嵌段共聚物58的溶液被引入經圖案化樹脂54’(如圖22C和圖22D之間示出的)。溶液可以是嵌段共聚物58在合適的溶劑(諸如甲苯)中的稀溶液(例如，範圍在從約0.01wt%至約10wt%)。嵌段共聚物58溶液可以使用任何合適的技術(諸如旋塗等)來沉積。
為了使嵌段共聚物58在經拓撲圖案化支撐物(例如經圖案化樹脂54’)上自組裝並經歷微相分離，包含嵌段共聚物的溶液應與基底性經圖案化樹脂54’具有高Huggins相互作用參數。在一個實例中，嵌段共聚物58的溶液具有範圍 在從約0.04至約0.30的Flory-Huggins相互作用參數。在另一個實例中，嵌段共聚物58的溶液具有約0.26的Flory-Huggins相互作用參數。
然後將在經圖案化樹脂54’上的沉積後未進一步處理的嵌段共聚物58暴露於溶劑退火。在溶劑退火中使用的溶劑蒸氣、溫度和時間可以取決於所使用的嵌段共聚物58，並且具體地取決於嵌段共聚物58自組裝到凹陷28中和微相分離成個別的嵌段58A和58B的條件。在一個實例中，溶劑蒸氣是甲苯，溫度是室溫(例如，從約14℃至約25℃)，並且時間是約3小時。應當理解，溶劑選擇、退火時間和退火溫度取決於嵌段共聚物。一些合適的溶劑可以是甲苯、庚烷、高級烷烴、及其等之混合物。時間和溫度可以影響在凹陷28中的形態，並且因此可以被控制。作為實例，退火時間範圍可以在從1分鐘至180分鐘，或者甚至更長，例如從約3小時至約48小時；並且退火溫度範圍可以在從18℃至約250℃。
作為溶劑退火的結果，嵌段共聚物58自組裝到凹陷16中(並且因此不存在於間隙區域30上)，並且還相分離成分離的結構域或嵌段58A、58B。在圖2D中，分離的嵌段58A、58B具有圓形圖案或螺旋形圖案，儘管該圖案可以取決於所使用的嵌段共聚物58。嵌段共聚物58的圖案的其他實例例如在圖23A和圖23B中示出。圖23A是凹陷28和一些周圍的間隙區域30的俯視圖，其中在凹陷28中的嵌段共聚物58相分離成呈現出指紋圖案的嵌段58A和58B。圖23B是凹陷28和一些周圍的間隙區域30的俯視圖，其中在凹陷28中的嵌段共聚物58相分離成呈現出線性圖案的嵌段58A和58B。嵌段58A、58B具有亞微影術尺寸結構域。
在溶劑退火期間，包括樹脂附接性官能基的嵌段58A或58B可以與經圖案化樹脂54’反應，並且因此可以附接至經圖案化樹脂54’。
雖然未示出，在方法200的一些實例中，包括經相分離且自組裝的嵌段共聚物58A、58B的在凹陷28中的經圖案化樹脂54’被暴露於另外的固化程 序。固化可以如先前描述的進行。
如圖22D和圖22E之間示出的，進行接枝程序，以便將引子(18、21或18’、21’，用於順序配對末端定序、或18、20或18’、20’和19、21或19’、21’，用於同時配對末端定序)接枝到在凹陷28中的嵌段58A和/或58B的任何引子接枝性官能基。
在一個實例中，接枝可以通過流過沉積(例如，使用臨時結合的蓋)、浸泡塗佈、噴塗、小池分配來完成，或者通過會將引子(18、21或18’、21’，用於順序配對末端定序、或18、20或18’、20’和19、21或19’、21’，用於同時配對末端定序)附接至嵌段58A和/或58B的引子接枝性官能基的另一種合適的方法來完成。在同時配對末端定序的實例中，引子18、20或18’、20’可以被接枝到一個嵌段58A，並且引子19、21或19’、21’可以被接枝到另一個嵌段58B。這些示例性技術中的每一種可以如本文描述的進行，並且可以利用引子溶液或混合物，其可以包含引子、水、緩衝液、和催化劑。
應當理解，引子(不可切割的引子18、21或18’、21’，用於順序配對末端定序、或不可切割/可切割的引子對18、20或18’、20’和19、21或19’、21’，用於同時配對末端定序)會附接至包含引子接枝性官能基的嵌段58A和/或58B。 在圖22E和圖22F中示出的實例中，引子18、21被附接至嵌段58B而不被附接至嵌段58A。在該實例中，嵌段58A可以對相互作用參數有貢獻以驅動第一嵌段58A和第二嵌段58B的相分離，並且還可以通過樹脂附接性官能基被附接至經圖案化樹脂54’。
現在參考圖24，其描繪了其中嵌段共聚物58相分離成兩個嵌段58A和58B的另一個實例。在該實例中，兩個不同的引子組，一個包括引子18、18’和20、20’，並且另一個包括引子19、19’和21、21’，分別被附接至嵌段58A、58B。該實例如本文描述地使得在定序期間的同時配對末端讀段成為可能。在該 實例中，嵌段58A、58B各自包括可以分別附接相應的引子組的引子接枝性官能基。
如上文提及的，一些嵌段共聚物58是三元聚合物，其中各個嵌段包含不同的嵌段特異性官能基。在一個實例中，嵌段共聚物58是包含第一嵌段、第二嵌段、和第三嵌段的三元聚合物；其中第一嵌段的嵌段特異性官能基被附接至經圖案化樹脂(即，是樹脂附接性官能基)；第二嵌段的嵌段特異性官能基被附接至引子(即，是引子接枝性官能基)；並且第三嵌段的嵌段特異性官能基被附接至i)不同於被附接至第二嵌段的嵌段特異性官能基的引子的另一種引子或者被附接至ii)酶(例如NEXTERATM轉座子(transposome))。經相分離的三元聚合物的實例在圖25A中示出。在該實例中，經分離的三元聚合物包含嵌段58A、58B、58C，其中58A包括引子接枝性官能基，58B包括樹脂附接性官能基和/或影響嵌段共聚物的表面自由能和/或影響嵌段共聚物的穩定性，並且58C包括不同的引子接枝性官能基或酶附接官能基。如所描繪的，嵌段58A附接第一引子組12A、12B、12C、12D，包括引子18、18’和20、20’，並且嵌段58C附接第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’，包括引子19、19’和21、21’。在該實例中，嵌段58A充當區域14，並且嵌段58C充當區域16。在另一個實例中，區域14、16可以是彼此直接鄰接的嵌段(例如，58A和58B或58B和58C)。
在另一個實例中，嵌段共聚物58是包含第一嵌段、第二嵌段、和第三嵌段的三元聚合物；其中第一嵌段的嵌段特異性官能基被附接至經圖案化樹脂54’(即，是樹脂附接性官能基)；第二嵌段的嵌段特異性官能基被附接至引子(即，是引子接枝性官能基)；並且第三嵌段的嵌段特異性官能基影響嵌段共聚物的表面自由能或影響嵌段共聚物的穩定性。相分離的三元聚合物的實例在圖25B中示出。在該實施例中，經分離的三元聚合物包括嵌段58A、58B、58C，其中58A包括樹脂附接性官能基，58B影響嵌段共聚物的表面自由能或影響嵌段共 聚物的穩定性，並且58C包括引子接枝性官能基。在該實例中，不可切割的引子18、21被附接，並且因此該實例可能特別適合於順序配對末端定序。
圖38A和圖38B一起描繪了涉及嵌段共聚物58’的另一種示例性方法。在該實例中，嵌段共聚物58’是層狀嵌段共聚物。層狀嵌段共聚物會自組裝，使得不同的嵌段58A’和58B’一者在另一者上形成層，使得它們平行於基底性材料54B、54C和支撐物52。層狀嵌段共聚物的實例包括含有雜環疊氮化物單元的共聚物。材料54B、54C可以是本文描述的樹脂54A的不同實例、矽烷、或經矽烷化樹脂，並且可以被選擇以指導嵌段共聚物58’的自組裝。在受控條件下，嵌段共聚物58’自組裝成特定的結構域/嵌段58A’和58B’，這些結構域/嵌段58A’和58B’在基底性材料54B、54C上成層。在圖38A和38B中示出的實例中，作為退火的結果，結構域/嵌段58A’和58B’自組裝，使得嵌段58B’於表面在一個地區處暴露(覆蓋材料54B)，並且使得另一個嵌段58A’於表面在另一個地區處暴露(覆蓋材料54C)。嵌段58B’可以包括引子附接性官能基，該引子附接性官能基可以附接包括引子18、18’和20、20’的第一引子組12A、12B、12C、12D；並且嵌段58A’可以包括不同的引子附接性官能基，該不同的引子附接性官能基可以附接包括引子19、19’和21、21’的第二引子組12A’、12B’、12C’、12D’。在該實例中，嵌段58B’充當區域14，並且嵌段58A’充當區域16。
包括嵌段共聚物58、58’的流動池可以用於多種定序方法或技術，包括通常被稱為合成定序法(SBS)、循環陣列定序法、連接定序法、焦磷酸根定序法、等等的技術。在這些實例的一些中，由於經相分離的嵌段58A、58B、58C和經附接的引子(不可切割的引子18、21或18’、21’，用於順序配對末端定序、或不可切割/可切割的引子對18、20或18’、20’和19、21或19’、21’，用於同時配對末端定序)存在於凹陷28中，而不存在於間隙區域30上，擴增將限於凹陷28。
作為一個實例，合成定序(SBS)反應可以在諸如以下的系統上運 行：HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NOVASEQTM、NEXTSEQDXTM、NEXTSEQTM、或來自Illumina(San Diego,CA)的任何其他定序儀系統。在SBS中，監視定序引子沿著核酸模版(例如，定序模版)的延伸以確定模版中核苷酸的序列。基底性化學程序可以是聚合(例如，由聚合酶催化)或連接(例如，由連接酶催化)。在特定的基於聚合酶的SBS程序中，經螢光標記的核苷酸以模版依賴模式被添加至定序引子(從而延伸引子)，使得添加至定序引子的核苷酸的順序和類型之偵測可以用於確定模版的序列。
例如，為了啟動第一個SBS循環，一個或更多個經標記的核苷酸、DNA聚合酶、等等可以被遞送至流動通道內/遞送通過流動通道、等等，該流動通道容納被附接至不可切割的引子18、21或18’、21’的正向股或反向股的陣列(用於順序配對末端定序)，或者被附接至不可切割/可切割的引子對18、20或18’、20’的正向股和反向股兩者的陣列(用於同時配對末端定序)，其中定序引子延伸導致經標記的核苷酸被併入，可以通過成像事件來偵測。在成像事件期間，照明系統(未示出)可以向經官能化的凹陷提供激發光。
在這些實例中，核苷酸還可以包括在核苷酸已經被添加之後使進一步的引子延伸終止的可逆終止性質，並且解封劑可以用於繼續定序。洗滌可以在不同的流體遞送步驟之間進行。然後SBS循環可以重複n次以將定序引子延伸n個核苷酸，從而偵測長度為n的序列。
雖然已經詳細描述了SBS，但是應當理解，本文描述的流動池可以與其他定序方案一起用於基因分型，或者用於其他化學應用和/或生物應用。
為了進一步說明本文之揭露內容，本文給出了實施例。應當理解，這些實施例為了說明性的目的被提供，並且不應被解釋為限制本文之揭露內容的範圍。
實施例 實施例1
將具有被預接枝的P7和P5U引子的PAZAM沉積在具有柱狀特徵的流動池底材上，柱狀特徵為約400nm高並且直徑約350nm。經沉積的經預接枝PAZAM層的一部分的掃描電子顯微術(SEM)圖像在圖39A中示出。將剝離抗蝕劑沉積在該第一經接枝PAZAM層上，以形成本文描述的保護層的實例。經沉積的保護層的一部分的SEM圖像在圖39B中示出。然後進行蝕刻以從柱狀特徵的頂部去除保護層和第一經接枝PAZAM層。蝕刻後的底材的一部分的SEM圖像在圖39C示出。將PAZAM沉積在柱狀特徵的頂部上和剩餘的保護層上，以形成第二PAZAM層。將第二PAZAM層用P5和P7U引子接枝。
使用剝離程序從第一經接枝PAZAM層去除保護層和任何第二經接枝PAZAM層。
將來自同一基因組(來自人類基因組)的文庫片段引入流動池。文庫片段包括與P5和P7引子序列互補的部分、以及索引序列、以及讀段1和讀段2序列。接種文庫片段，並且使用橋擴增進行聚簇。然後進行同時配對末端定序。
在柱狀特徵和相鄰區域之間的邊界地區，發現所有讀段的約34%是配對的。
這些讀段是從單個位置提取的，並且與基因組排比。圖40A圖示出了兩個R1讀段(R1和R1’)，這兩個讀段被認為是同時配對末端讀段。
流動池也通過順序配對末端合成來處理(對正向股定序並去除之，然後為反向股定序)。圖40B圖示出了來自圖40A的結果，其中來自順序配對末端合成的第二讀段(R2)被翻轉，以示出它確實匹配同時配對末端讀段對。R2中的被剪切(clipped)部分可能是由於品質下降，而R1讀段是更高品質的未被剪切讀段。這些結果證明，本文揭露的方法可以使用同時產生的對(圖40A)產生與標準配對末端定序(圖40B)等效的信息。
仍進一步地，對於基於同時配對末端定序和標準(順序)配對末端定序的數據，文庫片段的插入物大小分佈大致相等。這些結果進一步證明，本文揭露的方法，使用同時產生的對，可以產生與標準配對末端定序等效的信息。
實施例2
將PAZAM沉積在平面流動池底材上，並且用P7和P5U引子接枝。將保護層(Shipley 1813光阻劑)沉積在該第一經接枝PAZAM層的頂部。使用紫外光通過光遮罩暴露保護層的一些限定部分，然後在溶劑中顯影，留下50μm的保護層的圓形墊。將空氣電漿用於蝕刻掉在間隙區域中的第一經接枝PAZAM層的暴露的部分，而保護墊下面的部分保持完整。然後將第二層PAZAM沉積在間隙區域上和剩餘的保護層上。然後將此第二經沉積PAZAM用P5和P7U引子接枝。
使用剝離程序從第一經接枝PAZAM層去除保護層和任何第二經接枝PAZAM層。
將來自同一基因組(來自人類基因組)的文庫片段引入流動池。文庫片段包括與P5和P7引子序列互補的部分、以及索引序列、以及讀段1和讀段2序列。接種文庫片段，並且使用橋擴增進行聚簇。然後進行同時配對末端定序。
在第一經接枝PAZAM和第二經接枝PAZAM之間的邊界地區，發現所有讀段的約2.2%是配對的。這意味著兩個讀段在彼此的2μm內，並且在基因組中在彼此的2kb內。
另外的注釋
應當認識到，前述概念的所有組合和下文更詳細討論的另外的概念(假設這樣的概念不相互不一致)被設想為本文揭露的發明性主題的部分。特別 是，出現在本文之揭露內容的結尾處的所要求保護的主題的所有組合被設想為本文揭露的發明性主題的一部分。還應當認識到，也可以出現在通過引用併入的任何揭露內容中的本文中明確使用的術語應當符合與在本文揭露的特定概念最一致的含義。
在整個說明書中對「一個實例」、「另一個實例」、「實例」、等等的提及意指針對該實例描述的特定元素(例如，特徵、結構和/或特性)被包含在本文描述的至少一個實例中，並且可以存在於或可以不存在於其他實例中。此外，應當理解，除非上下文另有明確指示，否則針對任何實例描述的元素可以在各種實例中以任何合適的方式組合。
應當理解，本文提供的範圍包括所述範圍和在所述範圍內的任何值或子範圍，其程度如同這樣的值或子範圍被明確地敘述。例如，從約400nm至約1μm(1000nm)的範圍應當被解釋為不僅包括從約400nm至約1μm的明確敘述的限制，而且還包括單個值，諸如約708nm、約945.5nm、等等、和子範圍，諸如從約425nm至約825nm、從約550nm至約940nm、等等。此外，當使用「約」和/或「基本上」來描述一個值時，它們意指涵蓋所陳述的值的微小變化(至多達+/- 10%)。
雖然已經詳細描述了若干實例，但是應當理解，可以修改所揭露的實例。因此，以上的描述應被認為是非限制性的。
<110> 伊路米納有限公司(Illumina,Inc.) 伊路米納劍橋有限公司(Illumina Cambridge Limited)
<120> 流動池、包含流動池之套組、製備流動池之方法及製備用於核酸定序之結構之方法
<150> US 62/692,511
<151> 2018-06-29
<150> US 62/743,373
<151> 2018-10-09
<160> 2
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
Figure 108120316-A0305-02-0142-70
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 2
Figure 108120316-A0305-02-0142-71

Claims (88)

  1. 一種流動池，其包括：底材；第一引子組，所述第一引子組被附接至在所述底材上的第一區域，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；和第二引子組，所述第二引子組被附接至在所述底材上的第二區域，所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
  2. 如請求項1所述的流動池，其中：所述第一區域包括具有第一官能基的材料；並且所述第二區域包括具有不同於所述第一官能基的第二官能基的材料。
  3. 如請求項1所述的流動池，其還包括分隔所述第一引子組與所述第二引子組的空隙(gap)。
  4. 如請求項1所述的流動池，其中：所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷(depression)；並且各個所述凹陷包括：位於第一部分的所述第一區域；和位於第二部分的所述第二區域。
  5. 如請求項4所述的流動池，其還包括分隔所述第一區域與所述第二區域的空隙。
  6. 如請求項4所述的流動池，其中所述第一區域和所述第二區域部分重疊。
  7. 如請求項4所述的流動池，其中所述第一部分和所述第二部分具有不同的深度。
  8. 如請求項4所述的流動池，其中所述第一區域和所述第二區域是 嵌段共聚物的不同嵌段。
  9. 如請求項1所述的流動池，其中：所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；各個所述凹陷包括所述第一區域；並且所述第二區域位於至少一些所述間隙區域上。
  10. 如請求項1所述的流動池，其中：所述第一區域包含第一聚合物，並且所述第一引子組被接枝到所述第一聚合物；並且所述第二區域包含第二聚合物，並且所述第二引子組被接枝到所述第二聚合物。
  11. 如請求項10所述的流動池，其中所述流動池還包括在所述第一引子組上和在所述第一聚合物上的保護塗層。
  12. 如請求項10所述的流動池，其中：所述第一聚合物是在所述底材上的第一層；所述第二聚合物是在所述第一層上的第二層；所述流動池還包括：在所述第二層上的鈍化樹脂；和在所述鈍化樹脂、所述第二聚合物和所述第一聚合物中限定的特徵(feature)；並且所述第一引子組和所述第二引子組各自於各個所述特徵處暴露。
  13. 如請求項1所述的流動池，其中：所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；各個所述凹陷包括：所述第一區域所位於的第一部分；和第二部分；並且 所述流動池還包括位於所述第二部分中的珠，其中所述第二區域在所述珠的表面。
  14. 如請求項1所述的流動池，其中所述可切割的第一引子包括第一切割位點，所述可切割的第二引子包括第二切割位點，並且所述第一切割位點和所述第二切割位點是相同類型的。
  15. 如請求項14所述的流動池，其中：所述不可切割的第一引子、所述可切割的第二引子、所述可切割的第一引子和所述可切割的第二引子包括各自的連接子；所述第一可切割引子的第一切割位點位於其連接子內；並且所述第二可切割引子的第二切割位點位於其連接子內。
  16. 如請求項1所述的流動池，其中所述可切割的第一引子包括第一切割位點，所述可切割的第二引子包括第二切割位點，並且所述第一切割位點和所述第二切割位點是不同類型的。
  17. 如請求項16所述的流動池，其中：所述不可切割的第一引子、所述可切割的第二引子、所述可切割的第一引子和所述可切割的第二引子包括各自的連接子；所述第一可切割引子的第一切割位點位於其連接子內；並且所述第二可切割引子的第二切割位點位於其連接子內。
  18. 如請求項1所述的流動池，其中：所述第一引子組被附接至第一支撐結構；所述第一區域是被附接至所述第一支撐結構的第一捕獲位點；所述第二引子組被附接至不同於所述第一支撐結構的第二支撐結構；並且所述第二區域是被附接至所述第二支撐結構的第二捕獲位點。
  19. 一種流動池，其包括： 第一底材；被附接至所述第一底材的第一引子組，所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；與所述第一底材相對的第二底材；和被附接至所述第二底材的第二引子組，所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
  20. 一種套組，所述套組包括：流動池，所述流動池包括：底材，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；在各個所述凹陷中的第一聚合物層，其中所述第一聚合物層的一些官能基被封端；第一引子組，所述第一引子組被附接至在各個所述凹陷中的第一聚合物層的其他官能基；和在所述間隙區域上的第二聚合物層；以及引發液，所述引發液包括：液體載體；和不同於所述第一引子組的第二引子組。
  21. 如請求項20所述的套組，其中：所述第一引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；並且所述第二引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子。
  22. 一種製備用於核酸定序之流動池之方法，所述方法包括：將模版液引入流動池，所述流動池包括：底材，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；在各個所述凹陷中的第一聚合物層，其中所述第一聚合物層的暴露的官能基被 封端；第一引子組，所述第一引子組被附接至在各個所述凹陷中的所述第一聚合物層，所述第一引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子；和在所述間隙區域上的第二聚合物層；由此來自所述模版液的模版被擴增以在至少一些所述凹陷中形成簇；將包含不可切割的第一引子和可切割的第二引子的引發液引入所述流動池，由此所述不可切割的第一引子和所述可切割的第二引子接枝到所述第二聚合物層；以及啟動從所述簇到所述不可切割的第一引子和可切割的第二引子的橋擴增，從而在至少一些所述間隙區域上形成第二簇。
  23. 一種製備用於核酸定序之流動池之方法，所述方法包括：將模版液引入流動池，所述流動池包括：底材，所述底材包括由間隙區域分隔的凹陷；在各個所述凹陷中的第一聚合物層；被附接至所述第一聚合物層的第一引子組，所述第一引子組包括可切割的第一引子和不可切割的第二引子；在所述第一聚合物層上和在所述第一引子組上的可選的保護塗層；在所述間隙區域上的第二聚合物層；以及被附接至所述第二聚合物層的第二引子組，所述第二引子組包括不可切割的第一引子和可切割的第二引子；由此來自所述模版液的模版被擴增以在至少一些所述凹陷中和在至少一些所述間隙區域上形成簇；以及切割所述可切割的第一引子和所述可切割的第二引子。
  24. 一種流動池，其包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域分隔的第一凹陷和第二凹陷，所述第一凹陷具有比所述第二凹陷更小的開口尺寸；被附接在至少一些所述第一凹陷中的第一引子組；和分別被置於至少一些所述第二凹陷中的經官能化珠，所述經官能化珠包括被附接在所述經官能化珠的核心結構的表面的第二引子組，其中所述第二引子組不同於所述第一引子組。
  25. 如請求項24所述的流動池，其中所述經官能化珠的核心結構選自由二氧化矽、超順磁性材料、聚苯乙烯、和丙烯酸酯組成的組。
  26. 如請求項24所述的流動池，其中所述經圖案化樹脂選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。
  27. 如請求項24所述的流動池，還在所述第一凹陷中和在所述第二凹陷中包括聚合物，並且其中所述第一引子組被附接至在所述至少一些第一凹陷中的所述聚合物。
  28. 如請求項27所述的流動池，其中所述經官能化珠被置於在所述至少一些第二凹陷中的所述聚合物上。
  29. 如請求項27所述的流動池，其中：所述第一引子組還被附接至在所述至少一些第二凹陷中的所述聚合物；並且所述經官能化珠被置於在所述至少一些第二凹陷中的所述第一引子組上。
  30. 如請求項24所述的流動池，其中：所述第一引子組包括第一引子和經尿嘧啶修飾的第二引子；並且 所述第二引子組包括經尿嘧啶修飾的第一引子和第二引子。
  31. 一種流動池，其包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；被附接至至少一些所述凹陷的第一引子組；和被置於所述至少一些凹陷中使得所述第一引子組的至少一些引子被暴露的經官能化珠，所述經官能化珠包括被附接於所述經官能化珠的核心結構的表面的第二引子組，其中所述第二引子組不同於所述第一引子組。
  32. 如請求項31所述的流動池，其中：各個所述凹陷包括第一部分和第二部分，所述第一部分具有大於或等於所述經官能化珠的直徑的第一開口尺寸，所述第二部分具有小於所述經官能化珠的直徑的第二開口尺寸；並且所述經官能化珠被置於所述至少一些凹陷的各個凹陷的所述第一部分中。
  33. 如請求項31所述的流動池，其中所述經官能化珠的核心結構選自由二氧化矽、超順磁性材料、聚苯乙烯、和丙烯酸酯組成的組。
  34. 如請求項31所述的流動池，其中所述經圖案化樹脂選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。
  35. 如請求項31所述的流動池，其還在所述凹陷中包括聚合物。
  36. 如請求項35所述的流動池，其中所述第一引子組被附接至未被所述經官能化珠佔據的所述聚合物的部分。
  37. 如請求項36所述的流動池，其中： 所述第一引子組被附接至在所述凹陷中的所述聚合物；並且所述經官能化珠被置於所述第一引子組的一些其他引子上。
  38. 一種製備用於核酸定序之樹脂結構之方法，所述方法包括：選擇性地將聚合物施加於在支撐物上的經圖案化樹脂的凹陷中；將第一引子組接枝到在至少一些所述凹陷中的所述聚合物；以及在接枝所述第一引子組之前或之後，將經官能化珠沉積在i)所述至少一些凹陷的各個凹陷的部分中，或沉積在ii)具有比所述至少一些凹陷更大的開口尺寸的第二凹陷中，所述經官能化珠包括被附接在所述經官能化珠的核心結構的表面的第二引子組，其中所述第一引子組和所述第二引子組不同。
  39. 如請求項38所述的方法，其中在沉積所述經官能化珠之前，所述方法還包括通過將所述第二引子組附接至所述核心結構來形成所述經官能化珠。
  40. 如請求項38所述的方法，其中：所述至少一些凹陷的各個凹陷的部分具有大於或等於各個所述經官能化珠的直徑的開口尺寸；所述至少一些凹陷包括與所述部分互連的第二部分，其中所述第二部分具有小於各個所述經官能化珠的直徑的第二開口尺寸；和所述經官能化珠通過尺寸排阻自組裝到所述至少一些凹陷的各個凹陷的部分中。
  41. 如請求項38所述的方法，其中在選擇性地施加所述聚合物之前，所述方法還包括通過以下在所述支撐物上形成所述經圖案化樹脂：將樹脂沉積在所述支撐物上；和使用奈米壓模微影術使所述樹脂圖案化。
  42. 一種流動池，其包括： 支撐物；在所述支撐物上的經圖案化樹脂，所述經圖案化樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；於在所述凹陷中的所述經圖案化樹脂上的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物的各個嵌段具有不同於所述嵌段共聚物的各個其它嵌段的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基；和引子，所述引子被附接至所述嵌段的至少一個嵌段的所述嵌段特異性官能基。
  43. 如請求項42所述的流動池，其中所述經圖案化樹脂選自由以下組成的組：多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂、環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、及其等之組合。
  44. 如請求項43所述的流動池，其中所述經圖案化樹脂是POSS基樹脂，並且其中所述POSS基樹脂是交聯的環氧POSS樹脂。
  45. 如請求項43所述的流動池，其中所述嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有胺基基團作為其嵌段特異性官能基的丙烯醯胺單體；和第二嵌段，所述第二嵌段包括具有疊氮基基團作為其嵌段特異性官能基的疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺單體。
  46. 如請求項45所述的流動池，其中所述嵌段共聚物是：
    Figure 108120316-A0305-02-0152-43
     其中R是氫或聚合物引發物質端基，n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。
  47. 如請求項43所述的流動池，其中所述嵌段共聚物是：
    Figure 108120316-A0305-02-0152-72
     其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。
  48. 如請求項42所述的流動池，其中所述經圖案化樹脂是無定形的氟聚合物。
  49. 如請求項48所述的流動池，其中所述嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有三氟甲基基團作為其嵌段特異性官能基的單體；和 第二嵌段，所述第二嵌段包括具有引子接枝性官能基作為其嵌段特異性官能基的單體。
  50. 如請求項42所述的流動池，其中所述嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有引子接枝性官能基作為其嵌段特異性官能基的單體；和第二嵌段，所述第二嵌段包括調整相互作用參數以驅動所述第一嵌段和所述第二嵌段的相分離的單體。
  51. 如請求項50所述的流動池，其中：所述引子接枝性官能基是疊氮基基團；並且所述第二嵌段的單體的嵌段特異性官能基選自由以下組成的組：胺基基團、醇基團、芳基基團、和帶電基團。
  52. 如請求項42所述的流動池，其中：所述嵌段共聚物是包含第一嵌段、第二嵌段、和第三嵌段的三元聚合物；所述第一嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述經圖案化樹脂；所述第二嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述引子；並且所述第三嵌段的嵌段特異性官能基被附接至不同於所述引子的一其他引子或被附接至酶。
  53. 如請求項42所述的流動池，其中：所述嵌段共聚物是包含第一嵌段、第二嵌段、和第三嵌段的三元聚合物；所述第一嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述經圖案化樹脂；所述第二嵌段的嵌段特異性官能基被附接至所述引子；並且所述第三嵌段的嵌段特異性官能基影響所述嵌段共聚物的表面自由能或影響所述嵌段共聚物的穩定性。
  54. 如請求項42所述的流動池，其中所述凹陷選自由井(well)和溝槽 組成的組。
  55. 如請求項42所述的流動池，其中所述經圖案化樹脂和所述嵌段共聚物各自具有在從約25mN/m至約50mN/m的範圍內的表面自由能。
  56. 一種流動池，其包括：支撐物；在所述支撐物上的經圖案化多面體寡聚矽倍半氧烷樹脂(POSS)基樹脂，所述經圖案化POSS基樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；於在所述凹陷中的所述經圖案化POSS基樹脂上的分離的嵌段共聚物，其中所述分離的嵌段共聚物的一個嵌段具有被附接至所述經圖案化POSS基樹脂的官能基，並且所述分離的嵌段共聚物的一其他嵌段具有一其他官能基；和被附接至所述其他官能基的引子。
  57. 如請求項56所述的流動池，其中所述分離的嵌段共聚物選自由以下組成的組： i)
    Figure 108120316-A0305-02-0154-73
    其中n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000；和 ii)
    Figure 108120316-A0305-02-0155-74
    其中R是氫或聚合物引發物質端基，n範圍在從1至10,000，並且m範圍在從1至10,000。
  58. 一種製備用於核酸定序之樹脂結構之方法，所述方法包括：使樹脂圖案化以形成包括由間隙區域分隔的凹陷的經圖案化樹脂；在所述經圖案化樹脂上引入包含嵌段共聚物的溶液，所述嵌段共聚物的各個嵌段具有不同於所述嵌段共聚物的各個其它嵌段的嵌段特異性官能基的嵌段特異性官能基；將所述溶液暴露於溶劑蒸氣退火，由此所述嵌段共聚物在所述凹陷中相分離並自組裝；和將引子接枝到所述嵌段中的至少一個嵌段的所述嵌段特異性官能基。
  59. 如請求項58所述的方法，其中使所述樹脂圖案化包括奈米壓模微影術。
  60. 如請求項58所述的方法，其中包含所述嵌段共聚物的溶液具有範圍在從約0.04至約0.30的Flory-Huggins相互作用參數。
  61. 如請求項58所述的方法，其中在接枝之前，所述方法還包括將所述經圖案化樹脂暴露於固化程序，所述經圖案化樹脂包括在所述凹陷中的經相分離和自組裝的嵌段共聚物。
  62. 一種製備用於核酸定序之底材結構之方法，所述方法包括：將第一經官能化層施加於底材上；使所述第一經官能化層圖案化，從而形成被光阻劑覆蓋的第一經官能化區域；將第二經官能化層施加於所述光阻劑和所述底材的一些部分上；剝離所述光阻劑和在其上的任何第二經官能化層；去除所述第二經官能化層的一部分，從而形成鄰接所述第一經官能化區域的第二經官能化區域；和將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
  63. 如請求項62所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
  64. 如請求項62所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
  65. 如請求項62所述的方法，其還包括：分別將第一經自組裝單層沉積在所述第一經官能化區域上，並且將第二經自組裝單層沉積在所述第二經官能化區域上；其中所述第一引子組的附接包括將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接 枝到所述第一經自組裝單層；並且其中所述第二引子組的附接包括將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經自組裝單層。
  66. 如請求項62所述的方法，其中所述去除包括：將第二光阻劑施加於所述第一經官能化區域和將成為所述第二經官能化區域的所述第二經官能化層的第二部分上；和蝕刻所述第二經官能化層的部分。
  67. 如請求項62所述的方法，其中：所述底材包括在支撐物上的樹脂；所述樹脂包括由間隙區域分隔的凹陷；所述第一經官能化區域在各個凹陷的第一部分上；所述第二經官能化層在各個凹陷的第二部分上和在所述間隙區域上；並且所述去除包括從所述間隙區域拋光所述第二經官能化層。
  68. 如請求項62所述的方法，其中：所述底材包括在支撐物上的樹脂；所述樹脂包括由間隙區域分隔的多級凹陷；所述第一經官能化區域在各個多級凹陷的第一級；並且在施加所述第二經官能化層之前，所述方法還包括：將犧牲層施加於所述光阻劑和所述樹脂的一些部分上；從所述樹脂的部分去除所述犧牲層；和從所述多級凹陷去除所述樹脂的一個區域，以產生鄰接所述第一經官能化區域的地區；並且將所述第二經官能化層施加於在所述光阻劑上的犧牲層上、施加於所述地區上和施加於所述間隙區域上。
  69. 一種製備用於核酸定序之底材結構之方法，所述方法包括：將第一光阻劑施加於底材上，使得第一底材部分被暴露；將第一經官能化層施加於所述光阻劑和所述第一底材部分上；剝離所述光阻劑和在其上的任何第一經官能化層，從而在所述第一底材部分上形成第一經官能化區域；將第二光阻劑施加於所述第一經官能化區域上和所述底材上，使得鄰接所述第一經官能化區域的第二底材部分被暴露；將第二經官能化層施加於所述第二光阻劑和所述第二底材部分上；剝離所述第二光阻劑和在其上的任何第二經官能化層，從而形成鄰接所述第一經官能化區域的第二經官能化區域；以及將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
  70. 如請求項69所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
  71. 如請求項69所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
  72. 如請求項69所述的方法，其還包括： 分別將第一經自組裝單層沉積在所述第一經官能化區域上，並且將第二經自組裝單層沉積在所述第二經官能化區域上；其中所述第一引子組的附接包括將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經自組裝單層；並且其中所述第二引子組的附接包括將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經自組裝單層。
  73. 一種製備用於核酸定序之底材結構之方法，所述方法包括：將第一經官能化層施加於底材上，所述底材包括由間隙區域分隔的溝槽和在各個所述溝槽的第一部分中的犧牲材料區域；使所述第一經官能化層圖案化，從而在各個所述溝槽的第二部分中形成被光阻劑覆蓋的第一經官能化區域；去除所述犧牲材料區域以暴露各個所述溝槽的所述第一部分；將第二經官能化層施加於所述間隙區域上、所述第一部分上和所述光阻劑上；剝離所述光阻劑和在其上的任何第二經官能化層；從所述間隙區域去除任何第二經官能化層，由此一第二經官能化區域被保留在各個所述溝槽的所述第一部分中；以至少基本上垂直於所述溝槽的空間上分開的條帶的圖案施加第二光阻劑；去除在所述空間上分開的條帶之間暴露的所述第一經官能化區域和所述第二經官能化區域的部分；去除所述第二光阻劑；和將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
  74. 如請求項73所述的方法，其中： 所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
  75. 如請求項73所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
  76. 如請求項73所述的方法，其中：所述底材包括在各個所述溝槽的第二部分中的第二犧牲材料區域；所述底材、所述犧牲材料區域和所述第二犧牲材料區域具有不同的蝕刻速率；並且在施加所述第一經官能化層之前，所述方法還包括從各個所述溝槽的第二部分去除所述第二犧牲材料區域。
  77. 如請求項76所述的方法，其中在去除所述第二犧牲材料區域之前，所述方法還包括通過以下形成所述犧牲材料區域和第二犧牲材料區域：將犧牲材料施加於所述底材上，所述底材包括由所述間隙區域分隔的溝槽；去除所述犧牲材料的一部分，使得所述犧牲材料的一個區域保持直接鄰接各個所述溝槽的各側壁；將第二犧牲材料施加於所述底材上和所述犧牲材料區域上；去除所述第二犧牲材料的一部分，使得所述第二犧牲材料的一個區域保持直接鄰接各個所述犧牲材料區域；和施加材料以填充所述第二犧牲材料區域之間的任何空間。
  78. 如請求項77所述的方法，其中：所述底材是多層底材；所述溝槽被限定在所述多層底材的最外層中；並且所述材料和所述最外層是相同的。
  79. 一種製備用於核酸定序之底材結構之方法，所述方法包括：將犧牲材料施加於包括由第一間隙區域分隔的凹陷的底材，其中各個凹陷包括由階梯部分限定的深部分和淺部分，並且其中所述犧牲層部分地填充所述深部分；順序地去除所述犧牲層的一部分和所述底材的一部分以形成至少基本上與所述犧牲層的剩餘部分齊平的第二間隙區域，並且去除所述階梯部分以形成與所述犧牲層的剩餘部分相鄰的地區；將第一經官能化層施加於所述第二間隙區域、所述犧牲層的剩餘部分、和所述地區上；將光阻劑施加於第一經官能化層上；去除所述光阻劑的一部分和所述第一經官能化層的基底性部分，使得所述犧牲層的剩餘部分和所述第二間隙區域被暴露，並且在其上具有所述光阻劑的第二部分的所述第一經官能化層的部分被保留在所述地區；去除所述犧牲層的剩餘部分以形成與所述第一經官能化區域的部分相鄰的第二地區；將第二經官能化層施加於所述地區，從而形成第二經官能化區域；剝離所述光阻劑的第二部分，從而形成第一經官能化區域；以及將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
  80. 如請求項79所述的方法，其中：還將所述第二經官能化層施加於所述光阻劑的第二部分和所述第二間隙區域；用所述光阻劑的第二部分去除所述第二經官能化層的第一部分；並且所述方法還包括從所述第二間隙區域拋光所述第二經官能化層。
  81. 如請求項79所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在施加所述第一經官能化層之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在施加所述第二經官能化層之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
  82. 如請求項79所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層施加之後將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層施加之後將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到所述第二經官能化層。
  83. 一種製備用於核酸定序之底材結構之方法，所述方法包括：壓印多層底材，所述多層底材包括：支撐物；在所述支撐物上的第一經官能化層；在所述第一經官能化層上的第二經官能化層；和在所述第二經官能化層上的鈍化層；從而形成由所述鈍化層的間隙區域分隔的特徵，其中所述第一經官能化層和所述第二經官能化層各自的一個區域在各個特徵處暴露；將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一 引子組不同於所述第二引子組。
  84. 如請求項83所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括在所述第一經官能化層被併入所述多層底材之前將不可切割的第一引子和可切割的第二引子預接枝到所述第一經官能化層；並且所述第二引子組的附接包括在所述第二經官能化層被併入所述多層底材之前將可切割的第一引子和不可切割的第二引子預接枝到所述第二經官能化層。
  85. 如請求項83所述的方法，其中：所述第一引子組的附接包括將不可切割的第一引子和可切割的第二引子接枝到在各個凹陷中的所述第一經官能化區域；並且所述第二引子組的附接包括將可切割的第一引子和不可切割的第二引子接枝到在各個凹陷中的所述第二經官能化區域。
  86. 一種製備用於核酸定序之樹脂結構之方法，所述方法包括：壓印第一樹脂以形成凹陷，所述凹陷包括由階梯部分限定的深部分和淺部分，其中所述第一樹脂被置於犧牲層上，所述犧牲層被置於第二樹脂上；蝕刻所述第一樹脂的第一部分和為所述深部分的基底的所述犧牲層的部分，從而暴露所述第二樹脂的一部分；蝕刻所述階梯部分，從而暴露所述犧牲層的第二部分；將第一經官能化層施加於所述第二樹脂的部分以形成第一經官能化區域；去除所述犧牲層的第二部分，從而暴露所述第二樹脂的第二部分；將第二經官能化層施加於所述第二樹脂的第二部分以形成第二經官能化區域；以及將第一引子組附接至所述第一經官能化層或所述第一經官能化區域，並且將第二引子組附接至所述第二經官能化層或所述第二經官能化區域，其中所述第一引子組不同於所述第二引子組。
  87. 如請求項86所述的方法，其中：在施加所述第二經官能化層期間，所述第二經官能化層被沉積在所述凹陷周圍的間隙區域上，而不被沉積在所述第一經官能化區域上；並且所述方法還包括從所述間隙區域拋光所述第二經官能化層。
  88. 一種製備用於核酸定序之支撐結構之方法，所述方法包括：將第一引子組附接至第一支撐結構；將第二引子組附接至第二支撐結構，其中所述第二引子組和所述第二支撐結構不同於所述第一引子組和所述第一支撐結構；以及將所述第一支撐結構和所述第二支撐結構加載在底材表面上，所述底材表面具有選擇性地附接至所述第一支撐結構的多於一個的第一捕獲位點和選擇性地附接至所述第二支撐結構的多於一個的第二捕獲位點。
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