JPH03504324A

JPH03504324A - 遺伝子の検査方法

Info

Publication number: JPH03504324A
Application number: JP1505716A
Authority: JP
Inventors: パウルセン，グンナー; ソリツド，ルドヴイク，エム．; ヴアルトダル，フローデ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-05-24
Filing date: 1989-05-24
Publication date: 1991-09-26
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: WO1989011546A1; NO165894C; AU3562289A; NO882261L; NO882261D0; EP0415978B1; ATE136590T1; NO165894B; JP2854904B2; DE68926238T2; EP0415978A1; DE68926238D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子の検査方法本発明は人間、動物、植物及び微生物中の遺伝子を検査、分析する新規な方法に関する。か＼る分析は従来複雑な手法と時間のか−る技術とを必要としていた。

本発明において新規なことは、超常磁性粒子例えばウーゲルスタッド（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）粒子を使用して遺伝子を単離することであり、しかも超常磁性粒子に結合している間にこれらの単離した遺伝子を１０’〜１０’倍に複製し且つ検査することである。単離、複製及び検査は超常磁性体の固相表面上で生起するので、遺伝子の検査はかなりずっと簡便であり、迅速で労力の消費か少なくて済みしかも感度がより高い。またこの方法は容易に自動化できる。

核酸を固定するのに普通使用される固相はニトロセルロース又はナイロンの微孔質膜よりなる。ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は相補的な核酸塩基配列を含有するハイブリッド形成液に微孔性膜を浸漬することにより行なう。この技術は長期間のハイブリッド形成と低度のハイブリッド形成とを伴なう。

遺伝子の同定は相補的なりＮＡ配列で（ＤＮＡ−プローブ）でのブロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）により行なうことができる。制限断片長の多形分析（ＲＦＬＰ −アッセイ）においては、ＤＮＡ全体を制限酵素′により細胞中で処理する。次いでＤＮＡ断片を電気泳動的に分離し、フィルター上に吸取って（ｂｌｏｔ）から当該ＤＮＡ部位と相補的なりＮＡ配列でプローブする。制限酵素は相対形質（ａｌｌｅｌｅ）配列と結合不安定にあるＤＮＡをパリンドローム配列（制限酵素の特異的な部位）で切断する。従ってＤＮＡ断片の大きさ且つかくして切断バンドの形状は利用したＤＮＡ−プローブ（ｐｒｏｂｅ）と反応する部位内の相対形質変化に応じて変化できる。ＲＦＬＰ技術は完了するのに数日間の作業を要する時間のか−る且つ複雑な方法である。また、ＲＦＬＰ−プロットで検出されるバンドは幾つかの制限部位が幾つかの相対形質と共通するので、重要な遺伝情軸を示すには及ばない。この事実によってＲＦＬＰ−プロットを評価するのを困難とさせる。

ポリメラーゼ酵素鏡反応（ＰＣＲ）技術においては、有用な遺伝子を含有するゲノムの領域を増殖させてから、増殖したＤＮＡ領域内の一定の又は全ての多形配列に補完的なオリゴヌクレオチドでプローブする（以下の１．３参照）。この技術は遺伝子の分析を行なうのに必要とされる時間を実質的に低下させた。しかしながらこの方法でさえ試験管中の増殖工程を含めて供試物質の幅広い取扱いを必要とし、これによって増殖したＤＮＡ−物質をニトロセルロース膜に転換させ且つ遺伝子プローブで分析する。

本発明の目的は、人間、動物、植物及び微生物中の遺伝子を検査する新規な方法を提供するものであり、検査の諸工程は超常磁性体の固相表面上で生起し、かくしてより簡便で迅速な、労力のあまりか＼らない、より感度の良い遺伝子検査が得られる。

本発明によると、供試媒体中の遺伝子を検査する方法であって、ａ）供試媒体中のＤＮＡを変性させ、ｂ）ハイブリッド化状態にある供試媒体を、耐熱性のＤＮＡ−ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、１方が可溶性で他方が超常磁性粒子に結合している２種の相異なるオリゴヌクレオチドブライマーに対して接触させ、ｃ）ＤＮＡを増殖させ、ｄ）超常磁性粒子に結合していないＤＮＡ鎖並びに遊離のオリゴヌクレオチドブライマーを取出し、ｅ）増殖したＤＮＡ物質を検査することからなることを特徴とする供試媒体中の遺伝子の検査方法が提供される。

供試媒体は試験用ウェル（ｗｅｌｌｓ）即ち凹所に又は透明なマルチウェル板のウェルに配置できる。次いでマルチウェル板を蓋で覆い、それから蓋、底部及びマルチウェル板上の各々のウェルの側面と密に接触している金属製ブロック中に配置する。この金属ブロックの温度は迅速に且つ自動的に変化させ得る。生物細胞を破壊し且つＤＮＡを変性させるために、金属ブロックの温度を１００℃に調節し、マルチウェル板をこの温度で５〜１０分保持する。オリゴヌクレオチドブライマーの長さ及びプリン／ピリミジン比に応じて決まる温度を設定し、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、一方が可溶性でもう一方が超常磁性粒子に結合している２種の相異なるオリゴヌクレオチドブライマーを各々のウェルに添加する。ＤＮＡの増殖は、用いたオリゴヌクレオチドブライマーによって決定される温度例えば大体２０〜８５℃と、検査すべき供試媒体に要する増殖の度合に応じて多数の作業サイクル中の９０　’Ｃとの間で金属ブロックの温度を交互させることにより行なう。反応保持期間は使用したブライマーによって決定される温度で各々の作業サイクルについて１〜２分であり、９０”Ｃでは０．５分である。次いでマルチウェル板を磁性体上に配置し且つウェルを９０”Ｃて洗浄して超常磁性粒子に結合していないＤＮＡ鎖並びに遊離のオリゴヌクレオチドブライマーを取出す。次いで増殖したＤＮＡ物質は、（Ａ）オリゴヌクレオチドでの特異的なブロービング及び更新したポリメラーゼ反応なしに又は反応後の標識されたヌクレオチドの証明又は（Ｂ）特異的なブロービング、ポリメラーゼ反応及び標識された介在物質での二重鎖ＤＮＡの証明又は（Ｃ）　Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列の分析の何れかにより検定できる。

Ａ。

オリゴヌクレオチドでの特異的なブロービングは３種の相異なる要領で実施できる；ＡＩ。

標識されたオリゴヌクレオチドプローブでのブロービングは、使用したオリゴヌクレオチドプローブによって決定される温度で各々のウェルにビオチニル化したオリゴヌクレオチドプローブを添加することにより実施できる。次いでマルチウェル板を前記の温度で５〜１０分間保持する。次いでマルチウェル板を磁性体上に配置し、各々のウェルを洗浄する。増殖されたＤＮＡに結合しているビオチン標識プローブに、酵素に結合したアビジン（又はストレプトアビジン）、フルオロクローム等を添加する。次いでビオチニル化したプローブの結合は、ペルオキシダーゼで標識されたアビジンを検出するための化学発光（ｃｈｅｍｊ　ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｓｅ）として種々の標識について関連する検出系の使用によって分析する。ビオチンで標識されたプローブの代りに、放射活性物質で標識されたプローブも使用できる。

Ａ２゜特異的なオリゴヌクレオチドブライマーの助けをかりて標識されたＤＮＡの製造は、標識されていないデオキシヌクレオチドとビオチニル化されたデオキシヌクレオチドとの混合物と、ＤＮＡポリメラーゼと、オリゴヌクレオチドプローブとを粒子に結合した増殖ＤＮＡに添加し且つこのプローブの長さ及び組成によって決定される温度で保持することにより行うことができる。粒子に結合した増殖１本鎖ＤＮＡは鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として役立つものであり、然るにオリゴヌクレオチドプローブはブライマーとして役立つものである。この要領で、標識されたヌクレオチドを含有するＤＮＡ鎖を製造するものである。ブロービング法の残りの工程はＡＩに記載される如く行なう。ビオチンで標識されたヌクレオチドの代りに、放射活性物質で標識されたプローブを慣用の技術の如く同じ要領で使用できる。

Ｂ。

特異的なオリゴヌクレオチドプローブの使用によるＤＮＡの製造及び介在物質の使用による二重鎖ＤＮＡの続いての検出はデオキシヌクレオチドの混合物とＤＮＡ−ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドプローブとを粒子に結合した増殖１本鎖ＤＮＡに添加し、且つオリゴヌクレオチドプローブの長さとヌクレオチド組成とによって決定される温度で保持することにより行うことができる。

粒子に結合した１本鎖ＤＮＡは鋳型として役立つものであり、然るにオリゴヌクレオチドプローブはブライマーとして役立つことができ、鋳型に相補的なりＮＡ鎖の合成が生起する。この二重鎖ＤＮＡは、二重鎖ＤＮＡで非特異的に介在するビオチニル化化合物を添加することにより今や証明できる。

検出の残りの工程はＡＩに記載の如く行なう。

Ｃ０配列の分析結合した増殖ＤＮＡを存する超常磁性粒子を５分１１’Ｊ９５℃に加熱し、洗浄し、ＤＮＡ−ポリメラーゼと可溶性ブライマーとをもう一度添加しく今回は例えば標識された！！ｐ）、ジデオキシ法（以下の２参照）を塩基配列順序の解明に使用できる。分析前に、試料を数分間例えば２分間９５°Ｃに加熱し、超常磁性粒子に結合したＤＮＡを磁性体の助けにより取出す。この場合には例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動により塩基配列の分析それ自体を可溶性のフラクションについて行なう。

本発明の基本的に新規な特徴は、オリゴヌクレオチドに結合した超常磁性粒子を同時に使用して（１）種々の生物学的物質（真核生物）又は微生物から類縁ＤＮＡ配列を単離しく捕捉し）、（２）ＤＮＡをポリメラーゼ鎖反応によって増殖する固相を得、しかも（３）標識された相対形質又は部位特異的オリゴヌクレオチドの使用で特異的ブロービングにより増殖ＤＮＡ物質の検出を行なう固体の担体を得るものであり：前記の標識された相対形質又は部位特異的オリゴヌクレオチドはまた標識されたヌクレオチドを剰員で配合するためにポリメラーゼ反応用のブライマーとして機能できしかも従って感度を増大させ又は介在物質で二重鎖ＤＮＡの証明を行なうために機能できる。前記の遺伝子検出法について、遺伝子分析の特異性は粒子上のオリゴヌクレオチドブライマーによって介在でき（ｍｅｄｉａｔｅ）何故ならＤＮＡの増殖は相補的な配列へのオリゴヌクレオチドブライマーの塩基対形成後にしかもブロービング工程中にのみ達成されるからである。

本発明の利点は多数ある。超常磁性粒子への増殖されたＤＮＡ物質の結合によって、ＤＮ’Ａの増殖及び単離に器同志の間の供試媒体の取扱いや移動が減少され、供試媒体の簡単で自動的な製造を可能とするものである。増殖されたＤＮＡは超常磁性粒子の表面に結合しているので、捕捉、ブロービング及び検出の工程における洗浄は磁性体の使用によって容易に、有効に且つきわめて迅速に実施でき、これによって検査全体の完全な自動化を可能とする。

超常磁性粒子上のプローブされた増殖ＤＮＡ物質は磁性体を使用することによりＵ字形微小凹み板の底部上の小さなスポット中に別の場所におけるよりも少ない量で集中てきる。これによって検査系の感度かずっと改良される。何故なら１ｍｍ２当りに放出されるエネルギーの強度はスポットの表面か低下した時に増大するからである。

ＤＮＡ鎖は磁性粒子の表面上で増殖され、ＰＣＲ−増殖後に結合されていないＤＮＡ鎖から容易に分離し得るこのＤ　Ｎ　Ａ　鎖は次いで相対形質の特異的なアニーリング後に又は粒子に結合したＤＮＡ鎖に相補的な部位特異的オリゴヌクレオチドプローブ後に開始されるビオチニル化したＤＮＡ鎖の合成用の鋳型として使用できる。かくして標識化の程度及び分析感度は大幅に増大される。オリゴヌクレオチドに結合した粒子を使用することにより、類縁性のＤＮＡのみか増殖され且つ単離される。これは該技術を使用して生物体液又は真核″生物からの組織中のウィルス及び細菌の様な感染性ＤＮＡを同定する時に特に有利である。

１本鎖ＤＮＡを単離する前記の方法はまたＤＮＡ配列の分析にも使用できることが更に強調される。

ＤＮＡ塩基配列の分析はその適正な配列分析前に時間のか＼る一連の作業工程を必要とする。該工程は例えはプラスミド中に存用なりＮＡ配列の導入、プラスミドの細菌による感染、細菌のクローン化、細菌クローンの増大、細菌クローンからプラスミドの精製、制限酵素による存用なりＮＡ配列の切断、及びこのＤＮＡ配列の精製よりなり、次いてこのＤＮＡ配列を分析できる。超常磁性粒子を用いての増殖により、適正な配列分析前に行われる労力のか＼る工程を省略できる。

参考文献１　：　Ｒ，に、５ａｉｋｉ、　Ｔ、Ｌ、Ｂｕｇａｖａｎ、　Ｇ、Ｔ、Ｈｏｒｎ、　Ｋ、Ｂ。

λｆｕ　Ｉ　ｌ　ｉ　ｓ及びＨ，Ｈ，Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２４．　１６３゜１６６　（１９８６）。

参考文献２　：　Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎｌ１ｋｌｅｎ及びＡ、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、７４．５４６３−５４６７゜（＋９７７）。

参考文献３　：　Ｒ，に、５ａｉｋｉ、　Ｄ、Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｓ、５ｔｏｆｆｅ１．　Ｓ、Ｊ。

５ｃｈａｒｆ、　　Ｒ，Ｈｉｇｕｃｈｉ、　　Ｇ、Ｔ、Ｈｏｒｎ、　　Ｋ、Ｂ、Ｍｕｌｌｉｓ及びＨ，Ａ、εｒｌｉｃｈ、　Ｎａｔｕｒｅ　２３９．４８７−４９１（＋９８８）。

国際調査報告、、、、、え−、ゎ　ＰＣＴ／ＮＯ８９１０００５０

Claims

【特許請求の範囲】

１．供試媒体中の遺伝子を検査する方法であって、ａ）供試媒体中のＤＮＡを変性させ、ｂ）ハイブリッド化状態にある供試媒体を、耐熱性のＤＮＡ−ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、１方が可溶性で他方が超常磁性粒子に結合している２種の相異なるオリゴヌクレオチドプライマーに対して接触させ、ｃ）ＤＮＡを増殖させ、ｄ）超常磁性粒子に結合されていないＤＮＡ鎖並びに遊離のオリゴヌクレオチドプライマーを取出し、ｅ）増殖したＤＮＡ物質を検査することからなることを特徴とする供試媒体中の遺伝子の検査方法。
２．ＤＮＡは５〜１０分の期間９５〜１０５℃の範囲の温度で、好ましくは１００℃で変性させる請求の範囲第１項記載の方法。
３．変性した供試媒体を耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、１方が可溶性で他方が超常磁性粒子に結合されている２種の相異なるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、増殖温度はプライマーの長さ及びヌクレオチド組成によって決定される請求の範囲第１項記載の方法。
４．ＤＮＡは増殖温度で１〜２分の期間及び８５〜９５℃好ましくは９０℃で０．５分間、温度を交互に変えることにより多数の作業サイクルで増殖させる請求の範囲第１項記載の方法。
５．９５℃で大体２分間加熱した後、超常磁性粒子に結合されていないＤＮＡ鎖並びに遊離のオリゴヌクレオチドプライマーを洗浄及び磁性体の使用により取出す請求の範囲第１項記載の方法。
６．増殖したＤＮＡ物質は特異的な標識されたプローブで検査し、所望ならば特異的なプロービング及びマークしたヌクレオチドとの別のポリメラーゼ反応により検査し、所望ならば二重鎖ＤＮＡに結合している標識された介在物質で検査する請求の範囲第１項記載の方法。
７．ＤＮＡを増殖させた後に、前記工程（ｄ）及び（ｅ）の取出し及び検査は、所望ならば標識化されていても良い可溶性のプライマー、一方が標識化されていても良いジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドとの混合物、ＤＮＡ− ポリメラーゼの添加により行ない；保持、反応は数分間進行させ、加熱は９５℃ で大体２分行ない、ＤＮＡを有する超常磁性粒子を取出し、可溶性物質のＤＮＡ塩基配列分析を行なう請求の範囲第１項記載の方法。
８．供試媒体中のＤＮＡを変性させた後に、供試媒体をハイブリット化快態で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、２種の相異なるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、ＤＮＡを増殖し、その際に超常磁性粒子を特異的なプローブに対して添加し、ポリメラーゼ反応を少なくとも１回は行ない、続いて磁性体を用いての洗浄、変性を行ないしかも標識されたデオキシヌクレオチド、可溶性のプライマー、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを添加し、増殖し、変性し、磁性体を用いて洗浄し、超常磁性粒子上の標識された１本鎖ＤＮＡを検査する請求の範囲第１項、第２項及び第６項の何れかに記載の方法。