KR20010062021A - 개인 유전자 라이브러리 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개체로부터 수득한 유전자 라이브러리가 영구적으로 결합되어 있는 고체 표면을 포함하는 장치에 관한 것이다.

Description

개인 유전자 라이브러리{Personal gene library}

본 발명은, 본원에서 전문이 참조 문헌으로서 인용되는 미국 가 특허원 제60/168,297호(1999년 12월 1일)에 대한 우선권의 이익을 청구한다.

본 발명은 영구적인 개인용 유전자 라이브러리가 설정된 장치에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기한 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 임상학적 진단 또는 연구에 상기한 장치를 사용하는 방법에 관한 것이다.

그레이 등(Gray et al., 미국 특허 제5,851,769호)의 특허는 정량적 DNA 섬유 지도화 방법에 관한 것이다. 그러나, 그레이의 미국 특허 제5,851,769호에는본 발명에서와 같이 고체 기판상에 영구적인 유전자 라이브러리를 설정하는 방법은 기술되어 있지 않다.

치 등(Chee et al., 미국 특허 제5,837,832호)의 특허는 생물학적 칩상에 핵산 프로브 정렬을 제조하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 치의 미국 특허 제5,837,832호에는 본 발명에서와 같이, 개인의 영구적인 유전자 라이브러리를 고체 표면 캐리어에 피복시키거나 결합시켜 설정한 다음, 이를 임상학적 진단 또는 연구용으로 사용하는 것은 기술되어 있지 않다.

포도 등(Fodor et al., 미국 특허 제5,445,934호)의 특허는 고체 기판상의 올리고뉴클레오타이드 정렬에 관한 것이다. 그러나, 포도의 미국 특허 제5,445,934호에는 본 발명에서와 같이 고체 기판상에 영구적인 개인 유전자 라이브러리를 설정하는 것은 기술되어 있지 않다.

장기간에 걸쳐 간단하고 비용이 절감되는 방식으로, 개인화된 게놈 정보를 저장하기 위한 장치 및 방법과 상기한 장치상에서 가능한 유전자 돌연변이를 검출하는 방법이 당해 분야에서 요구되고 있다.

도 1은 개인 유전자 정보를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 개략도를 나타낸 것이다.

도 2는 가교결합 샘플 DNA의 PCR 증폭을 나타낸 것이다.

도 3은 가교결합 사람 게놈 DNA의 PCR 증폭을 나타낸 것이다.

본 발명은 이전에 기술한 요구를 충족시킨다.

본 발명은 일반적으로는 개체로부터 수득한 유전자 라이브러리가 영구적으로결합되어 있는 고체 표면을 포함하는 장치에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 개체로부터 수득한 유전자 또는 유전자들을, 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 방법에 의해 상기한 장치에 피복시키거나 결합시키는 방법으로, 이때 유전자 또는 유전자들은 고체 캐리어에 영구적으로 결합된다.

상기한 방법에서, 유전자 또는 유전자들은 한 종류 이상의 제한효소로 처리된 염색체를 하나 이상 포함할 수 있다. 또한 유전자 또는 유전자들은 개체의 염색체 주형으로부터 합성된 핵산 단편 하나 또는 다수를 포함할 수 있다. 핵산은 데옥시리보핵산 또는 리보핵산일 수 있다. 유전자 또는 유전자들은 개체의 염색체 주형으로부터 합성된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 또는 올리고리보뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 장치상에서 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 검정을 수행하여, 흥미로운 뉴클레오타이드 염기 서열의 존재 또는 부재를 나타내는 시그날의 존재여부를 검출함으로써 개체의 유전자 구조로부터 정보를 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 방법은 유전자 증폭, 프라이머 연장, 하이브리드화, 서열화, DNA 합성, RNA 합성, 올리고 DNA 프라이머 합성, 올리고 RNA 프라이머 합성 또는 단백질 합성 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 유형 하나 이상을 검출가능한 마커로 표지한다. 검출가능한 마커에는 방사능동위원소 표지된 잔기, 발색단, 형광단, 효소 또는 검출가능한 단백질 잔기가 포함될 수 있다.

본 발명의 이러한 목적은 하기하는 본 발명의 상세한 설명, 이에 첨부된 참조 도면 및 특허청구범위로부터 완전하게 이해될 것이다

본 발명은 하기하는 본 발명의 상세한 설명 및 예로서 제시된 도면에 의해 보다 확실하게 이해되지만, 이들이 본 발명을 제한하지는 않는다.

도 1은 개인 유전자 정보를 검출하기 위한 본 발명의 방법의 개략도를 나타낸 것이다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 개체의 게놈 라이브러리는 고체 표면상에 영구적으로 결합되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 반응을 고체 표면상에서 수행하여 고체 표면상에 결합된 특정 유전자의 다수 복사체를 수득한다. 프라이머 연장, 하이브리드화 및 서열화 반응을 수행하여 존재하는 흥미로운 특정 핵산 또는 뉴클레오타이드의 존재여부를 검출하고 또한 유전자 정보를 수득한다.

도 2는 가교결합 샘플 DNA의 PCR 증폭을 나타낸 것이다. 랫트 cDNA 클론(사람 cDNA 클론 진뱅크(GenBank) 승인번호 KIAA0720과 유사)의 플라스미드를 나이트란(Nytran) 막(Schleicher & Schuell)에 가교결합시키고, 상기 막의 단편(2×3㎜)을 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 PCR로 증폭시킨다. 막의 동일한 조각을 상이한 PCR 반응에 반복해서 사용한다. 각각의 PCR 반응은 동일 유전자의 상이한 단편을 증폭시키도록 디자인한다. 각각의 PCR에 사용되는 프라이머는 도 2A에 개략적으로 나타내었고 각 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다. 도 2B에서 1번 레인은 1kb DNA 마커이고, 2번 레인은 1회 반응으로부터의 PCR 산물이고, 3번 레인은 2회 반응으로부터의 PCR 산물이며, 4번 레인은 3회 반응으로부터의 PCR 산물이다.

프라이머 세트	5' 프라이머	3' 프라이머
프라이머 세트 1	5'TCAGGCCTGAGGCTGGAGGAC	5'ATGATTGGCTTCCTTGGC
프라이머 세트 2	5'CTCACCAAATACCCACTGCTCAAGTCC	5'TAGCTGGTTCTGTGCATT
프라이머 세트 3	5'TGATCAGCTCTGTAGA	5'TCTCCAGCTCATAC

도 3은 가교결합 사람 게놈 DNA의 PCR 증폭을 나타낸 것이다. 사람 게놈 DNA(Clontech CA)를 나이트란 막(Schleicher & Schuell)에 가교결합시키고, 상기 막의 단편(2×3㎜)은 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 PCR로 증폭시킨다. 막의 동일한 조각을 상이한 PCR 반응에 반복해서 사용한다. 각각의 PCR 반응은 사람 베타-액틴 유전자의 상이한 단편을 증폭시키도록 디자인한다. 각 프라이머의 서열은 표 2에 나타내었다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 적용시킨다. 1번 레인은 1kb의 DNA 마커이고, 2번 레인은 1회 반응으로부터의 PCR 산물이고, 3번 레인은 2회 반응으로부터의 PCR 산물이고, 4번 레인은 3회 반응으로부터의 PCR 산물이며, 5번 레인은 4회 반응으로부터의 PCR 산물이다.

프라이머 세트	5' 프라이머	3' 프라이머
프라이머 세트 1	5'CTTCGCGGGCGACGATG	5'ATTTTCTCCATGTCGT
프라이머 세트 2	5'GTGCTGCTGACCGAGG	5'GCACAGTGTGGGTGA
프라이머 세트 3	5'TACGAGGGGTATGCCCT	5'CAGGGTACATGGTGGTG

본 발명은 일반적으로는 개체로부터 수득한 유전자 또는 유전자 라이브러리를 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 수단에 의해 고체 캐리어의 표면에 영구적으로 피복시키거나 결합시키는 기술에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체의 영구적인 유전자 라이브러리가 설정된 장치에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기한 핵산이 피복되거나 결합된 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 유전자 마커를 검출하는 것과 같은 임상학적 진단 또는 연구용으로 핵산이 피복되거나 결합된 장치를 반복 사용하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 개체의 유전자 또는 유전자들이 영구적으로 피복 또는 결합되어 있는 고체 캐리어를 개체용 유전자 라이브러리(Gene Library for Individual; GLi)라 한다. 고체 캐리어가 개인의 유전자 또는 유전자들로 피복되어 있는 경우, 이를 개인용 유전자 라이브러리(Gene Library for Individual Person; GLIp)라 한다. 개별적인 동물의 유전자 또는 유전자들로 피복되어 있는 고체 캐리어는 개별적인 동물용 유전자 라이브러리(Gene Library for Individual Animal; GLIa)라 한다. 개별적인 식물의 유전자 또는 유전자들로 피복되어 있는 고체 캐리어는 개별적인 식물용 유전자 라이브러리(Gene Library for Individual Plant; GLIplan)라 한다. 또한 개별적인 미생물(예: 세균, 바이러스, 미코플라즈마)의 유전자 또는 유전자들로 피복되어 있는 고체 캐리어는 개별적인 미생물용 유전자 라이브러리(Gene Library for Individual Microorganism; GLIm)라 한다.

상기한 바와 같이 개체로부터 수득한 유전자는 한가지 유형 또는 다수 유형의 염색체로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 개체로부터 수득한 유전자는 한가지 유형 이상의 제한효소로 분해되는 염색체의 한가지 유형 또는 다수 유형일 수 있다.

상기한 바와 같이, 개체로부터 수득한 유전자는 하나 이상의 제한효소로 분해되는 염색체의 DNA 단편 한 조각일 수 있다. 또는, 개체로부터 수득한 유전자는 하나 이상의 제한효소로 분해되는 염색체 또는 염색체들의 DNA 단편의 여러 조각일 수 있다.

개체로부터 수득되는 유전자는 한 종류 이상의 제한효소로 분해되는 다수 종류 또는 상이한 종류의 염색체의 다수의 DNA 단편일 수 있다. 개체로부터의 유전자는 개체의 염색체 다수 또는 전부를 포함할 수 있다. 또한 개체로부터의 유전자는 한 종류 이상의 제한효소로 분해되는, 개체의 염색체 다수 또는 전부일 수 있다.

개체로부터의 유전자는 개체의 염색체 또는 염색체들의 주형으로부터 합성되는 DNA 단편 하나 또는 다수일 수 있다. 또는, 개체로부터의 유전자는 개체의 염색체 또는 염색체들의 주형으로부터 합성되는 RNA 단편 하나 또는 다수일 수 있다.

개체로부터의 유전자는 개체의 염색체 또는 염색체들의 주형으로부터 합성되는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다. 또한, 개체로부터 수득되는 유전자는, 개체의 염색체 또는 염색체들의 주형으로부터 합성되는 올리고리보뉴클레오타이드일 수 있다.

본 발명의 한가지 양태에서는, 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 방법(예: 유전자 증폭, 프라이머 연장, 하이브리드화, 서열화, DNA 합성, RNA 합성, 올리고 DNA 프라이머 합성, 올리고 RNA 프라이머 합성 또는 단백질 합성)에 의해 개별적인 유전자 또는 게놈 DNA 정보를 확인하는데 GLi를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서는, 상기한 방법에 사용되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 검출가능한 마커로 표지할 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 결합되어 있는 검출가능한 마커 각각은 방사능동위원소 표지된 잔기, 발색단, 형광단, 또는 방사능동위원소, 발색단, 형광단, 효소 또는 단백질 잔기가 결합될 수 있는 잔기일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 개체의 유전자 또는 게놈 DNA 정보를 확인하는데 사용되는 프라이머 또는 프로브를 검출가능한 마커로 표지할 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 결합된 검출가능한 마커는 방사능동위원소 표지된 잔기, 발색단, 형광단, 또는 방사능동위원소, 발색단, 형광단, 효소 또는 단백질 잔기가 결합될 수 있는 잔기일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라서 개체의 유전자 또는 게놈 DNA 정보를 확인하는 방법에 사용되는 프라이머 또는 프로브는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 올리고리보뉴클레오타이드, DNA 단편, RNA 단편 또는 합성 뉴클레오타이드 중합체일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "고체 표면 캐리어", 표면 고체 캐리어", "고체 캐리어" 또는 "고체 표면"은 모두 단일 개체로부터 수득한 핵산이 영구적으로 결합될 수 있는 고체 상을 의미한다. 결합, 가교결합 또는 피복 방법은, 이용가능한 임의의 핵산 검출 방법에 의해 핵산을 나중에도 검출할 수 있는 한은 어떠한 방법으로도 수행할 수 있다.

이로써 고체 상에 결합되거나 피복된 핵산이 영구적으로 결합된다. 그 결과, 본 발명의 장치가 갖는 한가지 잇점은, 하이브리드화 시그날을 갖는 상보적인프로브를 간단히 제거한 다음, 장치를 상이한 유전자 프로브와 하이브리드화시키는데 재사용함으로써 유전자 라이브러리가 제조된 개체에서 유전자 시험을 수회 실시할 수 있다는 점이다. 본 방법은 유전자 라이브러리를 제조하는데 단지 1회의 혈액 채취만을 필요로한다. 따라서, 본 발명의 유전자 시험 방법은 각종 가능한 유전자 병변을 시험하기 위해, 당해 분야에서 현재 실시되고 있는 유전자 시험 프로토콜의 단점으로서 개체로부터 혈액을 매우 다량으로 채취할 필요가 없다.

핵산 검출 방법은 당해 분야에서 일반적으로 공지되어 있다

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만 본 발명을 제한하지는 않는다.

실시예

실시예 1

랫트 cDNA 클론(사람 cDNA 클론 진뱅크 승인번호 KIAA0720과 유사)을 포함하는 플라스미드를 시험 샘플(DNA 샘플)로 선택한다. DNA 샘플을 물로 희석시켜 ㎕당 최종 농도가 1㎍이 되도록 하고, 100℃에서 3분 동안 가열하여 변성시킨 다음, 얼음에서 5분 동안 퀀칭시킨다. 변성된 샘플 1㎕를 2×6㎜의 나이트란 막(Schleicher & Schuell)에 적용하고 80℃에서 2시간 동안 건조시켜 샘플을 나이트란 막에 영구적으로 결합시킨다. DNA 샘플로 피복된 나이트란 막의 조각(2×2㎜)을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)용 주형으로서 사용한다. 10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 2mM MgCl₂, 0.2μmol 프라이머, 20μM dNTP 및 5단위의 Taq DNA 폴리머라제를 함유하는 완충액 중 총 50㎕의 용적으로 PCR 반응을 수행한다. 94℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분 동안 30사이클을 더모사이클러(thermocycler; Perkin Elmer, GeneAmp 9600)에서 수행한다. PCR 반응을 수행한 후, 나이트란 막의 동일한 조각을 반응 혼합물로부터 제거하고 물로 세정한 다음, 다음 PCR 반응에 다시 적용한다. 각각의 PCR은, 주형으로서 나이트란 막의 동일한 조각을 사용하여 DNA 샘플의 상이한 단편을 증폭시키도록 디자인한다. 최종적으로, PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 적용하며, 결과는 도 2에 나타내었다.

실시예 2

시판중인 사람 게놈 DNA(Clontech, CA)를 시험 샘플(DNA 샘플)로서 사용한다. DNA 샘플(㎕당 5㎍)을 100℃에서 3분 동안 가열하여 변성시킨 다음, 얼음에서 5분 동안 퀀칭시킨다. 변성된 샘플 4㎕를 2×6㎜의 나이트란 막(Schleicher & Schuell)에 적용하고 80℃에서 2시간 동안 건조시켜 샘플을 나이트란 막에 영구적으로 결합시킨다. DNA 샘플로 피복된 나이트란 막의 조각(2×3mm)을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)용 주형으로서 사용한다. 10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 2mM MgCl₂, 0.2μmol 프라이머, 20μM dNTP 및 5단위의 Taq DNA 폴리머라제를 함유하는 완충액 중 총 50㎕의 용적으로 PCR 증폭을 수행한다. 94℃에서 1분, 55℃에서 2분 및 72℃에서 2분 동안 30사이클을 더모사이클러(Perkin Elmer, GeneAmp 9600)에서 수행한다. PCR 반응을 수행한 후, 나이트란 막의 동일한 조각을 반응 혼합물로부터 제거하고 물로 세정한 다음, 다음 PCR 반응에 다시 적용한다. 각각의 PCR은, 주형으로서 나이트란 막의 동일한 조각을 사용하여 DNA 샘플의 상이한 단편을 증폭시키도록 디자인한다. 최종적으로, PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 적용하며, 결과는 도 3에 나타내었다.

본원에서 인용한 모든 참조문헌은 이의 전문이 참고로 인용된다.

개인용 유전자 라이브러리가 고체 기판에 영구적으로 결합되어 있는 본 발명의 장치를 사용하면, 혈액 샘플을 다시 채취할 필요없이 유전자 검사 시험을 여러번 수행할 수 있다.

Claims (11)

1. 개체로부터 수득한 유전자 라이브러리가 영구적으로 결합되어 있는 고체 표면을 포함하는 장치.
2. 개체로부터 수득한 유전자 또는 유전자들을 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 수단에 의해 제1항에 따른 장치상에 피복시키거나 결합시켜 상기 유전자 또는 유전자들을 고체 캐리어에 영구적으로 결합시키는 방법.
3. 제2항에 있어서, 유전자 또는 유전자들이 한 종류 이상의 제한효소로 처리된 염색체 하나 이상을 포함하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 유전자 또는 유전자들이 개체의 염색체 또는 염색체들의 주형으로부터 합성된 핵산 단편 하나 또는 단편 다수를 포함하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산 또는 리보핵산인 방법.
6. 제2항에 있어서, 유전자 또는 유전자들이 개체의 염색체 또는 염색체들의 주형으로부터 합성된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 또는 올리고리보뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
7. 제1항에 따른 장치상에서 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 검정을 수행하여, 흥미로운 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 존재 또는 부재를 지시하는 시그널의 존재여부를 검출함을 포함하여, 개체의 유전자 구조로부터 정보를 수득하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 물리적, 화학적, 생화학적 또는 효소적 방법이 유전자 증폭, 폴리머라제 연쇄 반응, 프라이머 연장, 하이브리드화, 서열화, DNA 합성, RNA 합성, 올리고 DNA 프라이머 합성, 올리고 RNA 프라이머 합성 또는 단백질 합성 방법을 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 검출가능한 마커로 표지된 한 종류 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 반응에 사용되는 방법.
10. 제9항에 있어서, 검출가능한 마커가 방사능동위원소 표지된 잔기, 발색단, 형광단, 효소, 또는 검출가능한 단백질 잔기를 포함하는 방법.
11. 제2항에 있어서, 유전자 또는 유전자들이 어떠한 제한효소로도 처리되지 않은 염색체를 하나 이상 포함하는 방법.