JP2003180397A - ミトコンドリアｄｎａを用いたシロザケのハプロタイプ判定法 - Google Patents
ミトコンドリアｄｎａを用いたシロザケのハプロタイプ判定法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 シロザケのハプロタイプの判定を、効率よ
く、かつ高精度で行う方法及びキットを提供する。 【解決手段】 配列番号８に示す塩基配列を基準とする
シロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の
塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７位、
７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、２３
１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、３４
０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１位か
ら選ばれる位置における多型をハイブリダイゼーション
により検出し得るオリゴヌクレオチドの１種又は２種以
上が基板上に固定化されたオリゴヌクレオチド固定化基
板を含むキットを用いて、被検体シロザケに由来する核
酸とのハイブリダイゼーションにより多型を検出し、被
検体のハプロタイプを判定する。
く、かつ高精度で行う方法及びキットを提供する。 【解決手段】 配列番号８に示す塩基配列を基準とする
シロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の
塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７位、
７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、２３
１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、３４
０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１位か
ら選ばれる位置における多型をハイブリダイゼーション
により検出し得るオリゴヌクレオチドの１種又は２種以
上が基板上に固定化されたオリゴヌクレオチド固定化基
板を含むキットを用いて、被検体シロザケに由来する核
酸とのハイブリダイゼーションにより多型を検出し、被
検体のハプロタイプを判定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シロザケノのハプ
ロタイプを判定するための方法及びキットに関し、詳し
くは、シロザケのミトコンドリアＤＮＡを用いたハプロ
タイプの判定方法に関するものである。
ロタイプを判定するための方法及びキットに関し、詳し
くは、シロザケのミトコンドリアＤＮＡを用いたハプロ
タイプの判定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】シロザケ（Oncorhynchus keta）は、母
川回帰する回遊魚として知られている。海洋中に分布す
るシロザケの系群識別方法として標識放流、アロザイム
分析、ミトコンドリアDNAの多型分析が挙げられる。
川回帰する回遊魚として知られている。海洋中に分布す
るシロザケの系群識別方法として標識放流、アロザイム
分析、ミトコンドリアDNAの多型分析が挙げられる。
【０００３】標識放流では、沖合における標識放流によ
りシロザケの分布情報が得られてきたが、再捕されるさ
れるのは大部分がその年に産卵のため母川回帰する成魚
であり、幼魚や未成魚の海洋分布についてはほとんど情
報を得ることができない。また、標識放流を行う場所も
限定され、再捕努力には地域差があるため系群組成を推
定することもできない。
りシロザケの分布情報が得られてきたが、再捕されるさ
れるのは大部分がその年に産卵のため母川回帰する成魚
であり、幼魚や未成魚の海洋分布についてはほとんど情
報を得ることができない。また、標識放流を行う場所も
限定され、再捕努力には地域差があるため系群組成を推
定することもできない。
【０００４】アロザイム分析においては、シロザケでは
アロザイム多型遺伝子座の対立遺伝子のスコアリング方
法が統一され、基準データが作り上げられている。この
基準データと沖合いで混合するサケの遺伝子頻度を比較
することで混合群の系群組成を推定することができる。
しかしながら、この方法は組織の扱いに熟練を要する点
や、多検体を処理できないなどの問題点がある。
アロザイム多型遺伝子座の対立遺伝子のスコアリング方
法が統一され、基準データが作り上げられている。この
基準データと沖合いで混合するサケの遺伝子頻度を比較
することで混合群の系群組成を推定することができる。
しかしながら、この方法は組織の扱いに熟練を要する点
や、多検体を処理できないなどの問題点がある。
【０００５】シロザケのミトコンドリアDNA上のコント
ロール領域には、塩基変異が集中している。日本国内の
いくつかの河川にから採集されたシロザケのミトコンド
リアDNAのコントロール領域を調べたところ、シロザケ
は数種類のハプロタイプ（小規模の遺伝子型）に分類す
ることができた（Zoological science 18: 99-106）。
しかしながら、この報告では日本国内でのハプロタイプ
の分布が得られたが、海洋中に分布するシロザケの系群
識別を行うためには、シロザケの分布する地域すべてに
ついての多型情報を得る必要がある。
ロール領域には、塩基変異が集中している。日本国内の
いくつかの河川にから採集されたシロザケのミトコンド
リアDNAのコントロール領域を調べたところ、シロザケ
は数種類のハプロタイプ（小規模の遺伝子型）に分類す
ることができた（Zoological science 18: 99-106）。
しかしながら、この報告では日本国内でのハプロタイプ
の分布が得られたが、海洋中に分布するシロザケの系群
識別を行うためには、シロザケの分布する地域すべてに
ついての多型情報を得る必要がある。
【０００６】また、ミトコンドリアDNAの多型を調べる
方法として用いられている方法としては、DNAシーケン
サを用いて塩基配列を決定する方法が挙げられるが、こ
の方法は、配列の読み間違いを防ぐため１検体に対して
複数読む必要がある。また、シロザケ集団中のハプロタ
イプの分布を調べる必要があることから多検体を同時に
処理する必要があるが、DNAシーケンサでは多検体を処
理することは難しい。
方法として用いられている方法としては、DNAシーケン
サを用いて塩基配列を決定する方法が挙げられるが、こ
の方法は、配列の読み間違いを防ぐため１検体に対して
複数読む必要がある。また、シロザケ集団中のハプロタ
イプの分布を調べる必要があることから多検体を同時に
処理する必要があるが、DNAシーケンサでは多検体を処
理することは難しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、シロザケの
ハプロタイプのミトコンドリアDNAの多型による判定に
際し、多検体処理に適し、尚かつ、１つの検体に対して
一度の試験で高精度のタイピングが可能な方法及びキッ
トを提供することを課題とする。
ハプロタイプのミトコンドリアDNAの多型による判定に
際し、多検体処理に適し、尚かつ、１つの検体に対して
一度の試験で高精度のタイピングが可能な方法及びキッ
トを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために検討を行った結果、シロザケミトコン
ドリアDNAコントロール領域の５’側前半部分の塩基配
列中に存在する多型によりシロザケのハプロタイプを分
類すると、シロザケ集団中のハプロタイプの偏りが回帰
する地域に関係することを見出し、さらに、前記多型を
検出し得る固定化オリゴヌクレオチドを用いたハイブリ
ダイゼーションにより、被検体のハプロタイプを高精度
で判定することができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
を解決するために検討を行った結果、シロザケミトコン
ドリアDNAコントロール領域の５’側前半部分の塩基配
列中に存在する多型によりシロザケのハプロタイプを分
類すると、シロザケ集団中のハプロタイプの偏りが回帰
する地域に関係することを見出し、さらに、前記多型を
検出し得る固定化オリゴヌクレオチドを用いたハイブリ
ダイゼーションにより、被検体のハプロタイプを高精度
で判定することができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
【０００９】（１）配列番号８に示す塩基配列を基準と
するシロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領
域の塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７
位、７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、
２３１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、
３４０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１
位から選ばれる位置における多型をハイブリダイゼーシ
ョンにより検出し得るオリゴヌクレオチドの１種又は２
種以上が基板上に固定化されたオリゴヌクレオチド固定
化基板を含み、被検体シロザケに由来する核酸とのハイ
ブリダイゼーションにより検出される多型又はその組み
合わせによって、その被検体のハプロタイプを判定する
ためのキット。 （２）前記多型又はその組み合わせが下記の多型から選
ばれる(1)記載のキット。 （１）９６Ｄ、（２）９６Ｄ、Ｔ１０Ｃ、（３）９６
Ｄ、Ａ４２Ｇ、（４）９６Ｄ、Ａ１０８Ｃ、（５）９６
Ｄ、Ａ１９４Ｔ、（６）９６Ｄ、Ｔ２３１Ｃ、（７）９
６Ｄ、Ａ４７１Ｃ、（８）多型なし （９）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、（10）９６Ｄ、
３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、（11）９６Ｄ、３
８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｔ２３１Ｃ、（12）９６Ｄ、３８
６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ１０Ｃ、（13）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ７０Ｃ、
（14）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ
１０８Ｃ、（15）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ２３１Ｃ、（16）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｃ２４２Ｔ、（17）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ２５０Ｃ、（18）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ２６０Ｇ、
（19）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ
３３９Ａ、（20）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ４０１Ｃ、（21）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ４７１Ｃ、（22）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ３４０
Ｔ、（23）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｔ４０１Ｃ、（24）９６Ｄ、Ｔ３０
Ｃ、（25）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ａ５７Ｔ、（26）９６
Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ｔ７０Ｃ、（27）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ａ
１０８Ａ、（28）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ｔ２３１Ｃ、（但
し、数字は配列番号８における位置を、数字を挟む左右
の文字は左の塩基から右の塩基への置換を、Ｄは欠失
を、それぞれ示す。） （３）前記多型が、少なくとも（２）、（３）、
（４）、（12）、（13）、（14）、（15）、（16）、
（17）、（18）、（19）、（20）、（21）、（22）、
（23）、及び（26）から選ばれる１または２以上の多型
を含む(2)記載のキット。 （４）前記オリゴヌクレオチドが、多型部位を含む領域
の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜
４０塩基長である(1)〜(3)のいずれかに記載のキット。 （５）前記多型部位を含み、かつ、多型を示さない塩基
配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩
基長である参照オリゴヌクレオチドがさらに固定化され
た、(1)〜(4)のいずれかに記載のキット。 （６）表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基
がコートされ、このカルボジイミド基またはイソシアネ
ート基と前記オリゴヌクレオチドの末端に付加されたリ
ンカーとの反応により基板上にオリゴヌクレオチドが固
定化された(1)〜(5)のいずれかに記載のキット。 （７）前記リンカーがアミノ基または末端に、アミノ
基、またはチミジン残基のホモポリマーを有する化合物
である(6)記載のキット。 （８）前記オリゴヌクレオチドが、前記基板の表面に径
１０μｍ〜５ｃｍのサイズで固定化された(6)又は(7)に
記載のキット。 （９）前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペ
プチド核酸、またはロックド核酸のいずれかである(1)
〜(8)のいずれかに記載のキット。 （１０）前記オリゴヌクレオチドの少なくともいずれか
が、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサ
ー化合物で置換することによりハイブリダイゼーション
における結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドであ
る(1)〜(9)のいずれかに記載のキット。 （１１）前記スペーサー化合物が、いずれの種類の塩基
との相補結合性を有しない核酸骨格である(10)記載のキ
ット。 （１２）被検体シロザケのハプロタイプにより、同被検
体が回帰する地域を推定する(1)〜(11)のいずれかに記
載のキット。 （１３）前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２９〜６
４に示す塩基配列、又はこれらの塩基配列の５’側もし
くは３’側またはその両方に伸長させるか短縮された塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれる(1)〜
(12)のいずれかに記載のキット。 （１４）配列番号８に示す塩基配列を基準とするシロザ
ケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の塩基配
列における下記の多型のいずれかをハイブリダイゼーシ
ョンにより検出し得るオリゴヌクレオチド。 （２）９６Ｄ、Ｔ１０Ｃ、（３）９６Ｄ、Ａ４２Ｇ、
（４）９６Ｄ、Ａ１０８Ｃ、（12）９６Ｄ、３８６Ｄ、
Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ１０Ｃ、（13）９６Ｄ、３
８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ７０Ｃ、（14）９
６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ１０８
Ｃ、（15）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ２３１Ｃ、（16）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５
Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｃ２４２Ｔ、（17）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ２５０Ｃ、（18）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ２６０Ｇ、
（19）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ
３３９Ａ、（20）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ４０１Ｃ、（21）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ４７１Ｃ、（22）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ３４０
Ｔ、（23）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｔ４０１Ｃ、（26）９６Ｄ、Ｔ３０
Ｃ、Ｔ７０Ｃ、（但し、数字は配列番号８における位置
を、数字を挟む左右の文字は左の塩基から右の塩基への
置換を、Ｄは欠失を、それぞれ示す。） （１５）被検体シロザケに由来する核酸を、(1)〜(13)
のいずれかに記載のキット上の各々のオリゴヌクレオチ
ドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドに
ついて被検体に由来する核酸とのハイブリッド形成の有
無を検出し、シロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコント
ロール領域の塩基配列中の多型を同定することによっ
て、被検体のハプロタイプを判定する方法。
するシロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領
域の塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７
位、７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、
２３１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、
３４０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１
位から選ばれる位置における多型をハイブリダイゼーシ
ョンにより検出し得るオリゴヌクレオチドの１種又は２
種以上が基板上に固定化されたオリゴヌクレオチド固定
化基板を含み、被検体シロザケに由来する核酸とのハイ
ブリダイゼーションにより検出される多型又はその組み
合わせによって、その被検体のハプロタイプを判定する
ためのキット。 （２）前記多型又はその組み合わせが下記の多型から選
ばれる(1)記載のキット。 （１）９６Ｄ、（２）９６Ｄ、Ｔ１０Ｃ、（３）９６
Ｄ、Ａ４２Ｇ、（４）９６Ｄ、Ａ１０８Ｃ、（５）９６
Ｄ、Ａ１９４Ｔ、（６）９６Ｄ、Ｔ２３１Ｃ、（７）９
６Ｄ、Ａ４７１Ｃ、（８）多型なし （９）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、（10）９６Ｄ、
３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、（11）９６Ｄ、３
８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｔ２３１Ｃ、（12）９６Ｄ、３８
６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ１０Ｃ、（13）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ７０Ｃ、
（14）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ
１０８Ｃ、（15）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ２３１Ｃ、（16）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｃ２４２Ｔ、（17）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ２５０Ｃ、（18）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ２６０Ｇ、
（19）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ
３３９Ａ、（20）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ４０１Ｃ、（21）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ４７１Ｃ、（22）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ３４０
Ｔ、（23）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｔ４０１Ｃ、（24）９６Ｄ、Ｔ３０
Ｃ、（25）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ａ５７Ｔ、（26）９６
Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ｔ７０Ｃ、（27）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ａ
１０８Ａ、（28）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ｔ２３１Ｃ、（但
し、数字は配列番号８における位置を、数字を挟む左右
の文字は左の塩基から右の塩基への置換を、Ｄは欠失
を、それぞれ示す。） （３）前記多型が、少なくとも（２）、（３）、
（４）、（12）、（13）、（14）、（15）、（16）、
（17）、（18）、（19）、（20）、（21）、（22）、
（23）、及び（26）から選ばれる１または２以上の多型
を含む(2)記載のキット。 （４）前記オリゴヌクレオチドが、多型部位を含む領域
の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜
４０塩基長である(1)〜(3)のいずれかに記載のキット。 （５）前記多型部位を含み、かつ、多型を示さない塩基
配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩
基長である参照オリゴヌクレオチドがさらに固定化され
た、(1)〜(4)のいずれかに記載のキット。 （６）表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基
がコートされ、このカルボジイミド基またはイソシアネ
ート基と前記オリゴヌクレオチドの末端に付加されたリ
ンカーとの反応により基板上にオリゴヌクレオチドが固
定化された(1)〜(5)のいずれかに記載のキット。 （７）前記リンカーがアミノ基または末端に、アミノ
基、またはチミジン残基のホモポリマーを有する化合物
である(6)記載のキット。 （８）前記オリゴヌクレオチドが、前記基板の表面に径
１０μｍ〜５ｃｍのサイズで固定化された(6)又は(7)に
記載のキット。 （９）前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペ
プチド核酸、またはロックド核酸のいずれかである(1)
〜(8)のいずれかに記載のキット。 （１０）前記オリゴヌクレオチドの少なくともいずれか
が、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサ
ー化合物で置換することによりハイブリダイゼーション
における結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドであ
る(1)〜(9)のいずれかに記載のキット。 （１１）前記スペーサー化合物が、いずれの種類の塩基
との相補結合性を有しない核酸骨格である(10)記載のキ
ット。 （１２）被検体シロザケのハプロタイプにより、同被検
体が回帰する地域を推定する(1)〜(11)のいずれかに記
載のキット。 （１３）前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２９〜６
４に示す塩基配列、又はこれらの塩基配列の５’側もし
くは３’側またはその両方に伸長させるか短縮された塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれる(1)〜
(12)のいずれかに記載のキット。 （１４）配列番号８に示す塩基配列を基準とするシロザ
ケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の塩基配
列における下記の多型のいずれかをハイブリダイゼーシ
ョンにより検出し得るオリゴヌクレオチド。 （２）９６Ｄ、Ｔ１０Ｃ、（３）９６Ｄ、Ａ４２Ｇ、
（４）９６Ｄ、Ａ１０８Ｃ、（12）９６Ｄ、３８６Ｄ、
Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ１０Ｃ、（13）９６Ｄ、３
８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ７０Ｃ、（14）９
６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ１０８
Ｃ、（15）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ２３１Ｃ、（16）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５
Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｃ２４２Ｔ、（17）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ２５０Ｃ、（18）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ２６０Ｇ、
（19）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ
３３９Ａ、（20）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ４０１Ｃ、（21）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ４７１Ｃ、（22）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ３４０
Ｔ、（23）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｔ４０１Ｃ、（26）９６Ｄ、Ｔ３０
Ｃ、Ｔ７０Ｃ、（但し、数字は配列番号８における位置
を、数字を挟む左右の文字は左の塩基から右の塩基への
置換を、Ｄは欠失を、それぞれ示す。） （１５）被検体シロザケに由来する核酸を、(1)〜(13)
のいずれかに記載のキット上の各々のオリゴヌクレオチ
ドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドに
ついて被検体に由来する核酸とのハイブリッド形成の有
無を検出し、シロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコント
ロール領域の塩基配列中の多型を同定することによっ
て、被検体のハプロタイプを判定する方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、被検体シロザケのミトコンドリアＤＮＡのコ
ントロール領域に存在する多型を検出し、その多型を同
定することによって、被検体シロザケのハプロタイプを
判定する方法及びキットである。前記ミトコンドリアＤ
ＮＡのコントロール領域に存在する多型としては、配列
番号８に示す塩基配列に相当するコントロール領域の
５’側前半部分に存在する多型が挙げられる。本発明に
おいては、多型の位置及び態様は、この配列番号８に示
す塩基配列を基準として表すこととする。
本発明は、被検体シロザケのミトコンドリアＤＮＡのコ
ントロール領域に存在する多型を検出し、その多型を同
定することによって、被検体シロザケのハプロタイプを
判定する方法及びキットである。前記ミトコンドリアＤ
ＮＡのコントロール領域に存在する多型としては、配列
番号８に示す塩基配列に相当するコントロール領域の
５’側前半部分に存在する多型が挙げられる。本発明に
おいては、多型の位置及び態様は、この配列番号８に示
す塩基配列を基準として表すこととする。
【００１１】前記多型として具体的には、配列番号８に
示す塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７
位、７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、
２３１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、
３４０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１
位から選ばれる位置における多型が挙げられる。より具
体的には、１０位においてはチミンからシトシンへの置
換、３０位においてはチミンからシトシンへの置換、４
２位においてはアデニンからグアニンへの置換、５７位
においてはアデニンからチミンへの置換、７０位におい
てはチミンからシトシンへの置換、９６位においてはア
デニンの欠失、１０８位においてはアデニンからシトシ
ン又はチミンへの置換、１５４位においてはシトシンか
らグアニンへの置換、１９４位におけるアデニンからチ
ミンへの置換、２３１位におけるチミンからシトシンへ
の置換、２４２位におけるシトシンからチミンへの置
換、２５０位におけるチミンからシトシンへの置換、２
６０位におけるアデニンからグアニンへの置換、３３９
位におけるチミンからアデニンへの置換、３４０位にお
けるシトシンからチミンへの置換、３８６位においては
グアニン残基の欠失、３９５位においてはシトシンから
アデニンへの置換、４０１位においてはチミンからシト
シンへの置換、４７１位においてはアデニンからシトシ
ンへの置換が挙げられる。
示す塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７
位、７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、
２３１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、
３４０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１
位から選ばれる位置における多型が挙げられる。より具
体的には、１０位においてはチミンからシトシンへの置
換、３０位においてはチミンからシトシンへの置換、４
２位においてはアデニンからグアニンへの置換、５７位
においてはアデニンからチミンへの置換、７０位におい
てはチミンからシトシンへの置換、９６位においてはア
デニンの欠失、１０８位においてはアデニンからシトシ
ン又はチミンへの置換、１５４位においてはシトシンか
らグアニンへの置換、１９４位におけるアデニンからチ
ミンへの置換、２３１位におけるチミンからシトシンへ
の置換、２４２位におけるシトシンからチミンへの置
換、２５０位におけるチミンからシトシンへの置換、２
６０位におけるアデニンからグアニンへの置換、３３９
位におけるチミンからアデニンへの置換、３４０位にお
けるシトシンからチミンへの置換、３８６位においては
グアニン残基の欠失、３９５位においてはシトシンから
アデニンへの置換、４０１位においてはチミンからシト
シンへの置換、４７１位においてはアデニンからシトシ
ンへの置換が挙げられる。
【００１２】本発明において、ハプロタイプの判定は、
上記多型又はその組み合わせを同定することによって行
われる。表１に、シロザケについて明らかにされた２８
種の多型を示す。表１中、「多型個所」は、配列番号８
に示す塩基配列を基準とする位置を示す。これらのう
ち、No. 1、5、6、7、8、9、10、11、24、25、27、28
は、公知の多型である。残りの多型は、本発明者らによ
って見出された新規多型である。それぞれの個体のミト
コンドリアＤＮＡのコントロール領域の塩基配列を、配
列番号１〜２８に示す。配列番号は、個体No.に対応す
る。
上記多型又はその組み合わせを同定することによって行
われる。表１に、シロザケについて明らかにされた２８
種の多型を示す。表１中、「多型個所」は、配列番号８
に示す塩基配列を基準とする位置を示す。これらのう
ち、No. 1、5、6、7、8、9、10、11、24、25、27、28
は、公知の多型である。残りの多型は、本発明者らによ
って見出された新規多型である。それぞれの個体のミト
コンドリアＤＮＡのコントロール領域の塩基配列を、配
列番号１〜２８に示す。配列番号は、個体No.に対応す
る。
【００１３】
【表１】
【００１４】上記２８種類のハプロタイプを元に回帰し
たシロザケのハプロタイプを調べると、地域による偏り
が観察される。その一例を図１に示す。
たシロザケのハプロタイプを調べると、地域による偏り
が観察される。その一例を図１に示す。
【００１５】本発明において、上記多型は、それぞれの
多型をハイブリダイゼーションにより検出し得る１種ま
たは２種以上オリゴヌクレオチドが基板上に固定化され
たオリゴヌクレオチド固定化基板を用いて検出される。
以下、これらのオリゴヌクレオチドをキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドということがある。キャプチャーオリゴ
ヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補
的又は相同な塩基配列を有する。
多型をハイブリダイゼーションにより検出し得る１種ま
たは２種以上オリゴヌクレオチドが基板上に固定化され
たオリゴヌクレオチド固定化基板を用いて検出される。
以下、これらのオリゴヌクレオチドをキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドということがある。キャプチャーオリゴ
ヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補
的又は相同な塩基配列を有する。
【００１６】キャプチャーオリゴヌクレオチドの設計
は、コントロール領域に存在する各々のハプロタイプ固
有の多型部位を含むように行う。また、キャプチャーオ
リゴヌクレオチドの設計に際し、キャプチャーオリゴヌ
クレオチドのタイプ固有の塩基配列の位置は、キャプチ
ャーオリゴヌクレオチドの中央部に存在することが望ま
しい。また、１つのキャプチャーオリゴヌクレオチドの
なかに２塩基以上のタイプ固有の塩基配列が存在してい
てもかまわない。
は、コントロール領域に存在する各々のハプロタイプ固
有の多型部位を含むように行う。また、キャプチャーオ
リゴヌクレオチドの設計に際し、キャプチャーオリゴヌ
クレオチドのタイプ固有の塩基配列の位置は、キャプチ
ャーオリゴヌクレオチドの中央部に存在することが望ま
しい。また、１つのキャプチャーオリゴヌクレオチドの
なかに２塩基以上のタイプ固有の塩基配列が存在してい
てもかまわない。
【００１７】キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基の
長さは、１０〜４０塩基が望ましい。これより短いとハ
イブリダイゼーションの検出が困難になり、長いとタイ
プ固有の配列によるハイブリダイゼーションの差が少な
くなり、タイプの判定が難しくなることがある。ただ
し、このキャプチャーオリゴヌクレオチドの長さは、主
として各塩基の含有率や同一塩基の繰り返しなどの配列
の特性に依存する。また、ハイブリダイゼーションを妨
げる要因である２次構造的障害がある場合は、遺伝子の
多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物で置
換することによりハイブリダイゼーションにおける結合
親和性を緩和したオリゴヌクレオチドを用いることによ
り、前記障害を回避することもできる。このようなスペ
ーサー化合物としては、いずれの種類の塩基との相補結
合性を有しない核酸骨格が挙げられる。
長さは、１０〜４０塩基が望ましい。これより短いとハ
イブリダイゼーションの検出が困難になり、長いとタイ
プ固有の配列によるハイブリダイゼーションの差が少な
くなり、タイプの判定が難しくなることがある。ただ
し、このキャプチャーオリゴヌクレオチドの長さは、主
として各塩基の含有率や同一塩基の繰り返しなどの配列
の特性に依存する。また、ハイブリダイゼーションを妨
げる要因である２次構造的障害がある場合は、遺伝子の
多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物で置
換することによりハイブリダイゼーションにおける結合
親和性を緩和したオリゴヌクレオチドを用いることによ
り、前記障害を回避することもできる。このようなスペ
ーサー化合物としては、いずれの種類の塩基との相補結
合性を有しない核酸骨格が挙げられる。
【００１８】キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基配
列の例を配列番号２９〜６４に示す。尚、配列番号２９
〜６４に示した番号のほか、各塩基配列の５’側もしく
は３’側またはその両方において、各々の塩基配列を、
ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の塩基配列に
対応して伸長、または短縮させてもよいが、いずれの場
合もキャプチャーオリゴヌクレオチドは１０〜４０塩基
の範囲とすることが好ましい。
列の例を配列番号２９〜６４に示す。尚、配列番号２９
〜６４に示した番号のほか、各塩基配列の５’側もしく
は３’側またはその両方において、各々の塩基配列を、
ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の塩基配列に
対応して伸長、または短縮させてもよいが、いずれの場
合もキャプチャーオリゴヌクレオチドは１０〜４０塩基
の範囲とすることが好ましい。
【００１９】キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいず
れであってもよい。キャプチャーオリゴヌクレオチドの
合成方法は、通常のオリゴヌクレオチドと同様にして、
例えば市販のDNA合成機を用いる方法等によって、行う
ことができる。
Ａ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいず
れであってもよい。キャプチャーオリゴヌクレオチドの
合成方法は、通常のオリゴヌクレオチドと同様にして、
例えば市販のDNA合成機を用いる方法等によって、行う
ことができる。
【００２０】本発明において、設計されたキャプチャー
オリゴヌクレオチドは、出願時点までの研究・調査結果
を良く反映したものであるが、新しいハプロタイプの塩
基配列に関して、この後、追加的な情報が得られた場合
には、本出願に記載の方法に基づいて新たなキャプチャ
ーオリゴヌクレオチドが設計されることになり、それら
は本願発明の範囲に包含されるものである。
オリゴヌクレオチドは、出願時点までの研究・調査結果
を良く反映したものであるが、新しいハプロタイプの塩
基配列に関して、この後、追加的な情報が得られた場合
には、本出願に記載の方法に基づいて新たなキャプチャ
ーオリゴヌクレオチドが設計されることになり、それら
は本願発明の範囲に包含されるものである。
【００２１】上記のようなキャプチャーオリゴヌクレオ
チドは、基板上に固定化される。このような基板として
は、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化でき、被
検体とのハイブリダイゼーション及び、ハイブリッドの
検出に必要な反応工程に耐え得るものであれば特に制限
されない。このような基材の材質として具体的にはプラ
スチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック
等が挙げられる。
チドは、基板上に固定化される。このような基板として
は、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化でき、被
検体とのハイブリダイゼーション及び、ハイブリッドの
検出に必要な反応工程に耐え得るものであれば特に制限
されない。このような基材の材質として具体的にはプラ
スチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック
等が挙げられる。
【００２２】上記プラスチックとして具体的には、ポリ
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビリニデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアク
リル樹脂等が挙げられる。
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビリニデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアク
リル樹脂等が挙げられる。
【００２３】また、無機高分子として具体的には、ガラ
ス、水晶、カーボン、シリカゲル及び、グラファイト等
が挙げられる。また、天然高分子としてはポリアミノ
酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及び、
それらの誘導体等が挙げられる。
ス、水晶、カーボン、シリカゲル及び、グラファイト等
が挙げられる。また、天然高分子としてはポリアミノ
酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及び、
それらの誘導体等が挙げられる。
【００２４】また、セラミックとして具体的にはアパタ
イト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及
び、炭化ホウ素等が挙げられる。本発明においてキャプ
チャーオリゴヌクレオチドの固定化に用いる基板の形状
はキャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化されれば、
特に制限されない。このような基材の形状として平板、
メンブレン、微粒子などが挙げられる。
イト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及
び、炭化ホウ素等が挙げられる。本発明においてキャプ
チャーオリゴヌクレオチドの固定化に用いる基板の形状
はキャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化されれば、
特に制限されない。このような基材の形状として平板、
メンブレン、微粒子などが挙げられる。
【００２５】本発明において上記基板にキャプチャーオ
リゴヌクレオチドを固定化する際、基板にキャプチャー
オリゴヌクレオチドを直接固定化してもよく、担体を基
板に担持させて、担体を介してキャプチャーオリゴヌク
レオチドを基板に固定化してもよい。担体としては、担
体自体がキャプチャーオリゴヌクレオチドに結合性を有
してもよく、キャプチャーオリゴヌクレオチドに結合性
を有するリガンドを介してキャプチャーオリゴヌクレオ
チドを固定化できるものであってもよい。ここで、「担
持」とは、担体にキャプチャーオリゴヌクレオチドを固
定化する際やキャプチャーオリゴヌクレオチド固定化基
材を実際の検出に用いる際等に用いられる水溶性溶剤、
有機溶剤等の各種溶剤中で、基材から上記担体が実質的
に脱離しないことを意味する。
リゴヌクレオチドを固定化する際、基板にキャプチャー
オリゴヌクレオチドを直接固定化してもよく、担体を基
板に担持させて、担体を介してキャプチャーオリゴヌク
レオチドを基板に固定化してもよい。担体としては、担
体自体がキャプチャーオリゴヌクレオチドに結合性を有
してもよく、キャプチャーオリゴヌクレオチドに結合性
を有するリガンドを介してキャプチャーオリゴヌクレオ
チドを固定化できるものであってもよい。ここで、「担
持」とは、担体にキャプチャーオリゴヌクレオチドを固
定化する際やキャプチャーオリゴヌクレオチド固定化基
材を実際の検出に用いる際等に用いられる水溶性溶剤、
有機溶剤等の各種溶剤中で、基材から上記担体が実質的
に脱離しないことを意味する。
【００２６】本発明に用いられる上記担体は、上記基材
上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担
持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介し
て担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応
じ、基材上の全面において担持されていても、また、そ
の一部において担持されていてもよい。
上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担
持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介し
て担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応
じ、基材上の全面において担持されていても、また、そ
の一部において担持されていてもよい。
【００２７】担体としては、有機低分子、プラスチッ
ク、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙
げられる。上記有機低分子として具体的には、カルボジ
イミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒
素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、
アミノ基含有化合物等が挙げられる。
ク、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙
げられる。上記有機低分子として具体的には、カルボジ
イミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒
素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、
アミノ基含有化合物等が挙げられる。
【００２８】また、プラスチック、無機高分子、金属、
セラミックは、前記したものと同様のものを使用するこ
とができる。本発明において特に好ましい担体は、カル
ボジイミド基含有化合物またはイソシアネート基含有化
合物である。
セラミックは、前記したものと同様のものを使用するこ
とができる。本発明において特に好ましい担体は、カル
ボジイミド基含有化合物またはイソシアネート基含有化
合物である。
【００２９】各キャプチャーオリゴヌクレオチドの基板
への供給はキャプチャーオリゴヌクレオチドの活性が維
持されるように、通常、水またはバッファー中に含まれ
る形で供給される。また、供給の際の温度としては固定
化されるキャプチャーオリゴヌクレオチドの活性が失わ
れないように０℃〜１００℃とすることが望ましい。
への供給はキャプチャーオリゴヌクレオチドの活性が維
持されるように、通常、水またはバッファー中に含まれ
る形で供給される。また、供給の際の温度としては固定
化されるキャプチャーオリゴヌクレオチドの活性が失わ
れないように０℃〜１００℃とすることが望ましい。
【００３０】本発明においてキャプチャーオリゴヌクレ
オチドを、通常は核酸を含有する水またはバッファーと
して、基板に供給する手段は、キャプチャーオリゴヌク
レオチドの活性が維持された状態で供給されれば特に制
限はされない。このような例としてディスペンサを用い
る方法、ピンを用いる方法、インクジェットを用いる方
法などが挙げられる。
オチドを、通常は核酸を含有する水またはバッファーと
して、基板に供給する手段は、キャプチャーオリゴヌク
レオチドの活性が維持された状態で供給されれば特に制
限はされない。このような例としてディスペンサを用い
る方法、ピンを用いる方法、インクジェットを用いる方
法などが挙げられる。
【００３１】キャプチャーオリゴヌクレオチドを基板上
へ固定化する際、その形状はハイブリダイゼーションに
影響を及ぼさず、また、検出が困難にならなければ特に
その形状は制限されない。このような例として円形、四
角形等が挙げられる。基板上へ各キャプチャーオリゴヌ
クレオチドが固定化される部位のサイズは、径10μm〜5
cmが好ましい。これより小さいと検出が困難になり、ま
た、これより大きいと配置されたキャプチャーオリゴヌ
クレオチド全体の占める面積が大きくなり、操作性が悪
くなるという問題が生じることがある。
へ固定化する際、その形状はハイブリダイゼーションに
影響を及ぼさず、また、検出が困難にならなければ特に
その形状は制限されない。このような例として円形、四
角形等が挙げられる。基板上へ各キャプチャーオリゴヌ
クレオチドが固定化される部位のサイズは、径10μm〜5
cmが好ましい。これより小さいと検出が困難になり、ま
た、これより大きいと配置されたキャプチャーオリゴヌ
クレオチド全体の占める面積が大きくなり、操作性が悪
くなるという問題が生じることがある。
【００３２】基板上への各キャプチャーオリゴヌクレオ
チドの固定化の際、各オリゴヌクレオチドをそのまま固
定化しても良いが、反応性を高めることによって、オリ
ゴヌクレオチドの末端にリンカーを付加し、リンカーと
基板又は担体とを反応させてもよい。そのようなリンカ
ーとしては、アミノ基、またはホモポリマー、例えばチ
ミジン残基のホモポリマーが挙げられる。
チドの固定化の際、各オリゴヌクレオチドをそのまま固
定化しても良いが、反応性を高めることによって、オリ
ゴヌクレオチドの末端にリンカーを付加し、リンカーと
基板又は担体とを反応させてもよい。そのようなリンカ
ーとしては、アミノ基、またはホモポリマー、例えばチ
ミジン残基のホモポリマーが挙げられる。
【００３３】各キャプチャーオリゴヌクレオチドの基板
上への配置は、ハプロタイプタイピングを容易にするた
めに、ハプロタイプの判定に用いられるキャプチャーオ
リゴヌクレオチドを１区画にまとめるか、あるいは一列
に並べるなどして配置することが好ましい。さらに望ま
しくは、多型を直接比較するキャプチャーオリゴヌクレ
オチド同士を縦または横に並べることである。図２に基
板上に固定化されるキャプチャーオリゴヌクレオチドの
好ましい配置の一例を示した。図中の四角は、各キャプ
チャーオリゴヌクレオチドが固定される位置を表し、記
載された数字は配列表の配列番号を表し、各キャプチャ
ーオリゴヌクレオチドは相当する塩基配列を有してい
る。
上への配置は、ハプロタイプタイピングを容易にするた
めに、ハプロタイプの判定に用いられるキャプチャーオ
リゴヌクレオチドを１区画にまとめるか、あるいは一列
に並べるなどして配置することが好ましい。さらに望ま
しくは、多型を直接比較するキャプチャーオリゴヌクレ
オチド同士を縦または横に並べることである。図２に基
板上に固定化されるキャプチャーオリゴヌクレオチドの
好ましい配置の一例を示した。図中の四角は、各キャプ
チャーオリゴヌクレオチドが固定される位置を表し、記
載された数字は配列表の配列番号を表し、各キャプチャ
ーオリゴヌクレオチドは相当する塩基配列を有してい
る。
【００３４】基板上へ固定されるキャプチャーオリゴヌ
クレオチドは、１種であっても、２種以上であってもよ
い。また、共通する塩基配列を有し、鎖長の異なるキャ
プチャーオリゴヌクレオチドを２種以上固定化してもよ
い。このように鎖長の異なるオリゴヌクレオチドを２種
以上用いると、実験条件が異なっても安定した結果が得
られる。また、相当する多型部位が異なる２種以上のキ
ャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化してもよい。さ
らに、多型部位を含み、かつ、多型を示さない塩基配列
に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩基長
である参照オリゴヌクレオチドをさらに基板に固定化す
ることによって、精度の高いタイピングが可能となる。
ここで多型を示さないとは、多型部位が配列番号８に示
す基準配列に一致していることをいう。
クレオチドは、１種であっても、２種以上であってもよ
い。また、共通する塩基配列を有し、鎖長の異なるキャ
プチャーオリゴヌクレオチドを２種以上固定化してもよ
い。このように鎖長の異なるオリゴヌクレオチドを２種
以上用いると、実験条件が異なっても安定した結果が得
られる。また、相当する多型部位が異なる２種以上のキ
ャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化してもよい。さ
らに、多型部位を含み、かつ、多型を示さない塩基配列
に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩基長
である参照オリゴヌクレオチドをさらに基板に固定化す
ることによって、精度の高いタイピングが可能となる。
ここで多型を示さないとは、多型部位が配列番号８に示
す基準配列に一致していることをいう。
【００３５】固定化されたキャプチャーオリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションに用いる被検体シロザ
ケに由来する核酸（以下、「核酸プローブ」ともいう）
は、ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域を含む核
酸である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーションを
阻害しないものであれば特に制限されないが、通常、DN
AまたはRNAなどが用いられる。また、核酸プローブの作
製方法は、ハイブリダイゼーションを阻害しない方法で
あれば特に制限されない。具体的には、シロザケの細胞
又は組織から核酸を抽出し、ミトコンドリアＤＮＡのコ
ントロール領域を含む配列をPolymerase Chain Reactio
n（PCR）法、in vitro transcription法、Loop-mediate
d Isothermal Amplification法等の方法によって増幅又
は単離することによって、核酸プローブを調製すること
ができる。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられて
いる方法を採用することができる。例えばzoological s
cience 18: 99-106で紹介されている方法が挙げられ
る。
チドとのハイブリダイゼーションに用いる被検体シロザ
ケに由来する核酸（以下、「核酸プローブ」ともいう）
は、ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域を含む核
酸である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーションを
阻害しないものであれば特に制限されないが、通常、DN
AまたはRNAなどが用いられる。また、核酸プローブの作
製方法は、ハイブリダイゼーションを阻害しない方法で
あれば特に制限されない。具体的には、シロザケの細胞
又は組織から核酸を抽出し、ミトコンドリアＤＮＡのコ
ントロール領域を含む配列をPolymerase Chain Reactio
n（PCR）法、in vitro transcription法、Loop-mediate
d Isothermal Amplification法等の方法によって増幅又
は単離することによって、核酸プローブを調製すること
ができる。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられて
いる方法を採用することができる。例えばzoological s
cience 18: 99-106で紹介されている方法が挙げられ
る。
【００３６】核酸プローブは、各ハプロタイプ固有の多
型を少なくとも１箇所含むようにする。また、核酸プロ
ーブの作製に用いるPCRプライマーは、各ハプロタイプ
固有の配列領域を除き、キャプチャーオリゴヌクレオチ
ドと相補的な塩基配列になるように設計される。なお、
ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、核
酸プローブは、キャプチャーオリゴヌクレオチドより長
くても短くても良い。また、PCR反応の特異性を高める
ために、目的とする核酸プローブよりも広い領域を作製
する予備的プライマーを用いて初回の作製をおこない、
作製された核酸を鋳型として核酸プローブを得るための
２次プライマーを用いて核酸増幅をおこなっても良い。
このようなプライマーとしては、配列番号６５及び６６
に示すプライマーの組合せと、配列番号６７及び６８に
示すプライマーの組合せが挙げられる。また、タイピン
グにかかわる固有の塩基配列領域が離れたところにある
場合、各固有領域に応じた核酸プローブを作製すること
ができる。
型を少なくとも１箇所含むようにする。また、核酸プロ
ーブの作製に用いるPCRプライマーは、各ハプロタイプ
固有の配列領域を除き、キャプチャーオリゴヌクレオチ
ドと相補的な塩基配列になるように設計される。なお、
ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、核
酸プローブは、キャプチャーオリゴヌクレオチドより長
くても短くても良い。また、PCR反応の特異性を高める
ために、目的とする核酸プローブよりも広い領域を作製
する予備的プライマーを用いて初回の作製をおこない、
作製された核酸を鋳型として核酸プローブを得るための
２次プライマーを用いて核酸増幅をおこなっても良い。
このようなプライマーとしては、配列番号６５及び６６
に示すプライマーの組合せと、配列番号６７及び６８に
示すプライマーの組合せが挙げられる。また、タイピン
グにかかわる固有の塩基配列領域が離れたところにある
場合、各固有領域に応じた核酸プローブを作製すること
ができる。
【００３７】核酸プローブは、ハイブリダイゼーション
を検出するために通常標識される。標識された核酸プロ
ーブを得る方法は、ハイブリダイゼーションを阻害しな
い方法であれば特に制限されない。このような方法とし
て、最終的な核酸プローブ作製に用いるプライマーを予
め標識しておく方法、核酸プローブ作製中に標識する方
法、及び、核酸プローブ作製後に標識する方法等が挙げ
られる。
を検出するために通常標識される。標識された核酸プロ
ーブを得る方法は、ハイブリダイゼーションを阻害しな
い方法であれば特に制限されない。このような方法とし
て、最終的な核酸プローブ作製に用いるプライマーを予
め標識しておく方法、核酸プローブ作製中に標識する方
法、及び、核酸プローブ作製後に標識する方法等が挙げ
られる。
【００３８】プライマーを予め標識しておく方法として
は、標識ヌクレオチドを用いてプライマー合成を行う方
法などが挙げられる。核酸プローブ作製中に標識する方
法として、核酸プローブ作製反応中に標識したヌクレオ
チドをとりこませる方法などが挙げられる。また、作製
反応後に標識する方法としては、特許公開平１０−２８
７８７０に示される方法で標識する方法などが挙げられ
る。
は、標識ヌクレオチドを用いてプライマー合成を行う方
法などが挙げられる。核酸プローブ作製中に標識する方
法として、核酸プローブ作製反応中に標識したヌクレオ
チドをとりこませる方法などが挙げられる。また、作製
反応後に標識する方法としては、特許公開平１０−２８
７８７０に示される方法で標識する方法などが挙げられ
る。
【００３９】核酸プローブを標識する物質は、通常のハ
イブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用す
ることができる。このような標識物質として蛍光物質や
ハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイ
ン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、
シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジ
ゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
イブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用す
ることができる。このような標識物質として蛍光物質や
ハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイ
ン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、
シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジ
ゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００４０】核酸プローブを作製するためのプライマー
は、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板
と共に、ハプロタイプタイピングキットに含めることが
できる。
は、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板
と共に、ハプロタイプタイピングキットに含めることが
できる。
【００４１】ハイブリダイゼーションは、通常の核酸の
ハイブリダイゼーションと同様にして行うことができ
る。以下に具体的な方法を例示する。SSC（Standard Sa
line Citrate）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング溶
液、および反応促進のための添加剤からなる混合液に核
酸プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱など
による変性を行う。基板上に核酸プローブ溶液を数μL
滴下した後、数時間加熱操作（通常３０℃〜８０℃）を
行い、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴヌ
クレオチドと核酸プローブでハイブリッドを形成させ
る。
ハイブリダイゼーションと同様にして行うことができ
る。以下に具体的な方法を例示する。SSC（Standard Sa
line Citrate）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング溶
液、および反応促進のための添加剤からなる混合液に核
酸プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱など
による変性を行う。基板上に核酸プローブ溶液を数μL
滴下した後、数時間加熱操作（通常３０℃〜８０℃）を
行い、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴヌ
クレオチドと核酸プローブでハイブリッドを形成させ
る。
【００４２】適当な濃度のSSC溶液またはテトラメチル
アンモニウムクロリド溶液中に基板上を沈め、加熱（通
常３７℃〜７０℃）し、特異的なハイブリッドのみを選
択的に基板上に残す。このとき、SDSなどを加えても良
い。
アンモニウムクロリド溶液中に基板上を沈め、加熱（通
常３７℃〜７０℃）し、特異的なハイブリッドのみを選
択的に基板上に残す。このとき、SDSなどを加えても良
い。
【００４３】ハイブリッドの検出には核酸プローブに標
識されている蛍光物質またはハプテンを使用する。蛍光
物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いて
ハイブリダイズした核酸プローブに標識された蛍光を検
出する。
識されている蛍光物質またはハプテンを使用する。蛍光
物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いて
ハイブリダイズした核酸プローブに標識された蛍光を検
出する。
【００４４】ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認
識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アル
カリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パー
オキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含
む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。
なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を
行う前に、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した
領域以外の基板の領域をカゼインやウシ血清アルブミン
などのタンパクを用いて被覆することによって酵素コン
ジュゲートと基板の非特異的吸着を阻止することができ
る。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、基
板上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数
１０分間放置することによって行うことができる。
識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アル
カリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パー
オキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含
む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。
なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を
行う前に、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した
領域以外の基板の領域をカゼインやウシ血清アルブミン
などのタンパクを用いて被覆することによって酵素コン
ジュゲートと基板の非特異的吸着を阻止することができ
る。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、基
板上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数
１０分間放置することによって行うことができる。
【００４５】酵素コンジュゲートと核酸プローブのハプ
テンとの結合反応後、ハプテンと結合しなかった酵素コ
ンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄
することによって、基板上にはターゲット核酸中のハプ
テンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることにな
る。
テンとの結合反応後、ハプテンと結合しなかった酵素コ
ンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄
することによって、基板上にはターゲット核酸中のハプ
テンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることにな
る。
【００４６】この後酵素コンジュゲートに結合されたア
ルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するよ
うな化合物を添加することでハイブリッドを形成してい
る部分だけが可視化される。
ルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するよ
うな化合物を添加することでハイブリッドを形成してい
る部分だけが可視化される。
【００４７】ここで用いられる化合物としては、ニトロ
ブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルリン酸−p−トルイジン塩）、
３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなどが用
いられる。
ブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルリン酸−p−トルイジン塩）、
３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなどが用
いられる。
【００４８】多型の検出は、得られたハイブリダイゼー
ションの結果をもとに、キャプチャーオリゴヌクレオチ
ドを固定化した位置における沈着した色素または蛍光を
検出することで行う。具体的には、キャプチャーオリゴ
ヌクレオチド毎の発色量および蛍光強度を比較し、その
量の大きい方を、ハイブリダイゼーション陽性と判定す
る。それを、多型部位毎に行い、各々の多型部位がいず
れかのハプロタイプと一致したとき、そのタイプである
と判定される。
ションの結果をもとに、キャプチャーオリゴヌクレオチ
ドを固定化した位置における沈着した色素または蛍光を
検出することで行う。具体的には、キャプチャーオリゴ
ヌクレオチド毎の発色量および蛍光強度を比較し、その
量の大きい方を、ハイブリダイゼーション陽性と判定す
る。それを、多型部位毎に行い、各々の多型部位がいず
れかのハプロタイプと一致したとき、そのタイプである
と判定される。
【００４９】判定に際し、キャプチャーオリゴヌクレオ
チドの種類が１つの場合、そのキャプチャーオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションシグナルの強度の強
弱で判定する。同一個所に対応する長さの異なるキャプ
チャーオリゴヌクレオチドを２種類以上用いた場合は、
例えば、それらすべてのハイブリダイゼーションシグナ
ルの和または平均値を比較して判定を行うか、ハイブリ
ダイゼーションシグナルの得られたキャプチャーオリゴ
ヌクレオチドの特定のパターンによって判定を行う。
チドの種類が１つの場合、そのキャプチャーオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションシグナルの強度の強
弱で判定する。同一個所に対応する長さの異なるキャプ
チャーオリゴヌクレオチドを２種類以上用いた場合は、
例えば、それらすべてのハイブリダイゼーションシグナ
ルの和または平均値を比較して判定を行うか、ハイブリ
ダイゼーションシグナルの得られたキャプチャーオリゴ
ヌクレオチドの特定のパターンによって判定を行う。
【００５０】表２に、配列番号２９〜６４に示す塩基配
列を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドを用いたと
きの、ハイブリダイゼーションシグナルとハプロタイプ
の対応を示す。
列を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドを用いたと
きの、ハイブリダイゼーションシグナルとハプロタイプ
の対応を示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】本発明のキットは、キャプチャーオリゴヌ
クレオチドを固定化した基板を含む。また、本発明のキ
ットは、核酸プローブを作製するためのプライマーまた
は標識化核酸プローブ、緩衝液、ハプテンを認識する酵
素コンジュゲート等のハイブリダイゼーション用の試薬
などを含めることができる。
クレオチドを固定化した基板を含む。また、本発明のキ
ットは、核酸プローブを作製するためのプライマーまた
は標識化核酸プローブ、緩衝液、ハプテンを認識する酵
素コンジュゲート等のハイブリダイゼーション用の試薬
などを含めることができる。
【００５３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００５４】＜１＞オリゴヌクレオチドの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-elmer
Applied biosystems）を用いて、オリゴヌクレオチド
を合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴ
ヌクレオチド乾燥体を、10mM Tris-HCl(ｐH7.5)、1mM E
DTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μLのオリゴヌクレ
オチド溶液を調製した。この合成法は、キャプチャーオ
リゴヌクレオチド又はプライマーとして使用するいずれ
のオリゴヌクレオチドに対しても同様である。合成した
オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号29〜68に示
す。これらのうち、配列番号29〜64がキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドであり、配列番号65〜68がプライマーで
ある。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記
合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させた。
Applied biosystems）を用いて、オリゴヌクレオチド
を合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴ
ヌクレオチド乾燥体を、10mM Tris-HCl(ｐH7.5)、1mM E
DTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μLのオリゴヌクレ
オチド溶液を調製した。この合成法は、キャプチャーオ
リゴヌクレオチド又はプライマーとして使用するいずれ
のオリゴヌクレオチドに対しても同様である。合成した
オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号29〜68に示
す。これらのうち、配列番号29〜64がキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドであり、配列番号65〜68がプライマーで
ある。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記
合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させた。
【００５５】＜２＞基板へのキャプチャーオリゴヌクレ
オチドのスポッティング ５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10
μLに対してマイクロスポッティング溶液（TeleChem In
ternational Inc.）を10μL混合し、マイクロタイター
プレート（Greiner Laboratory Inc.）上に分注した。
スポッティングマシンの所定の位置にシラン化スライド
グラス（Matsunami Glass Ind. Ltd.）を配置し、スポ
ッティングマシンを作動させた。スポッティング終了
後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、そ
の後紫外線を30mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した
後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を
除去した。0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液でスライ
ドグラスをすすいだ後、蒸留水ですすいだ。スライドグ
ラスを3% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mM Tris
-HCl(pH7.5), 100mM NaCl，0.1% Triton X-100に室温で
30分間浸し、ブロッキングした。その後室温で乾燥させ
た後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で洗浄し
た。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用まで乾
燥状態で冷暗所にて保存した。
オチドのスポッティング ５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10
μLに対してマイクロスポッティング溶液（TeleChem In
ternational Inc.）を10μL混合し、マイクロタイター
プレート（Greiner Laboratory Inc.）上に分注した。
スポッティングマシンの所定の位置にシラン化スライド
グラス（Matsunami Glass Ind. Ltd.）を配置し、スポ
ッティングマシンを作動させた。スポッティング終了
後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、そ
の後紫外線を30mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した
後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を
除去した。0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液でスライ
ドグラスをすすいだ後、蒸留水ですすいだ。スライドグ
ラスを3% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mM Tris
-HCl(pH7.5), 100mM NaCl，0.1% Triton X-100に室温で
30分間浸し、ブロッキングした。その後室温で乾燥させ
た後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で洗浄し
た。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用まで乾
燥状態で冷暗所にて保存した。
【００５６】＜３＞プローブ核酸の調製
シロザケのDNAを鋳型として、PCRによりプローブ核酸を
調製した。シロザケから得られた血液50μLをマイクロ
チューブに入れ、生理食塩水で3回洗浄した。これに10m
M Tris-HCl pH8.0, 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 0.5% SDS, 5
00μg/mL proteinase Kを500μl加え混和したのち、37
℃で一晩インキュベートした。フェノール：クロロフォ
ルム：イソアミルアルコール（25:24:1）溶液を500μL
加え、撹拌した後遠心（12000rpm、1分間）し、水相を
回収した。この操作を3回繰り返した。得られた水相に
クロロフォルム：イソアミルアルコール（24:1）溶液を
500μL加え、撹拌した後遠心（12000rpm、1分間）し、
水相を回収した。この操作を2回繰り返した。得られた
水相中のDNAをエタノール沈殿により回収し、乾燥させ
後、TEバッファー（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5）
に溶解し、PCRテンプレート溶液とした。
調製した。シロザケから得られた血液50μLをマイクロ
チューブに入れ、生理食塩水で3回洗浄した。これに10m
M Tris-HCl pH8.0, 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 0.5% SDS, 5
00μg/mL proteinase Kを500μl加え混和したのち、37
℃で一晩インキュベートした。フェノール：クロロフォ
ルム：イソアミルアルコール（25:24:1）溶液を500μL
加え、撹拌した後遠心（12000rpm、1分間）し、水相を
回収した。この操作を3回繰り返した。得られた水相に
クロロフォルム：イソアミルアルコール（24:1）溶液を
500μL加え、撹拌した後遠心（12000rpm、1分間）し、
水相を回収した。この操作を2回繰り返した。得られた
水相中のDNAをエタノール沈殿により回収し、乾燥させ
後、TEバッファー（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.5）
に溶解し、PCRテンプレート溶液とした。
【００５７】一方、PCRプライマーには、配列番号６５
及び６６に示すプライマーの組合せと、配列番号６７及
び６８に示すプライマーの組合せを用いた。
及び６６に示すプライマーの組合せと、配列番号６７及
び６８に示すプライマーの組合せを用いた。
【００５８】PCR反応液の組成は、Taqポリメレースを1U
nit、プライマーを各10pmol、反応用緩衝液5μl、dNTP
を各10nmol、テンプレートDNA溶液を0.5μl、および滅
菌水を加えて総量50μlとした。チューブに入れた溶液
をサーマルサイクラーにセットして、94℃で3分間加熱
した後、94℃：45秒間、58℃：45秒間、72℃：1分間の
反応を３０サイクル行い、その後72℃：7分間反応させ
た。
nit、プライマーを各10pmol、反応用緩衝液5μl、dNTP
を各10nmol、テンプレートDNA溶液を0.5μl、および滅
菌水を加えて総量50μlとした。チューブに入れた溶液
をサーマルサイクラーにセットして、94℃で3分間加熱
した後、94℃：45秒間、58℃：45秒間、72℃：1分間の
反応を３０サイクル行い、その後72℃：7分間反応させ
た。
【００５９】本実施例では、確認試験として、次に記載
のアガロースゲルを用いた電気泳動を行ったが、実際の
臨床における鑑別の際には不要である。PCR反応混合物
を1μl取り、6×泳動色素(30%グリセロール、0.25%ブロ
モフェノールブルー、0.25%キシレンシアノール)を1μ
l、蒸留水4μlと混和した。2%アガロースゲル上で、100
V、90分間の条件で泳動させたのち、0.5μg/mlエチジウ
ムブロマイドを含む蒸留水に30分間浸し、紫外線照射下
でゲルをCCDカメラで撮影した。その結果、所望の増幅
断片が得られたことが確認された。
のアガロースゲルを用いた電気泳動を行ったが、実際の
臨床における鑑別の際には不要である。PCR反応混合物
を1μl取り、6×泳動色素(30%グリセロール、0.25%ブロ
モフェノールブルー、0.25%キシレンシアノール)を1μ
l、蒸留水4μlと混和した。2%アガロースゲル上で、100
V、90分間の条件で泳動させたのち、0.5μg/mlエチジウ
ムブロマイドを含む蒸留水に30分間浸し、紫外線照射下
でゲルをCCDカメラで撮影した。その結果、所望の増幅
断片が得られたことが確認された。
【００６０】＜４＞ハイブリダイゼーション
＜３＞で作製したプローブ核酸溶液を2μl取り、ArrayI
t Unihyb Hybridization Solution（TeleChem Internat
ional Inc.）8μlを加えて混合し、100℃で10分間加熱
処理を行った後、氷中に5分間浸した。このプローブ核
酸溶液を5μlとり、＜２＞で作製したキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドを固定化した基板にのせ、その上にカバ
ーグラスをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに35℃に
設定した恒温器に入れて120分間静置した。基板を取り
出し、すばやく室温下で2×SSC, 0.1％SDS溶液（2×SS
C：0.033M NaCl, 0.033Mクエン酸ナトリウム）に浸して
カバーグラスを除去した。基板を室温下で2×SSC, 0.1
％SDS溶液に5分間浸す操作を２回行い、43℃の2×SSC,
0.1％SDS溶液（0.2×SSC：0.0033M NaCl, 0.0033Mクエ
ン酸ナトリウム）に5分間浸す操作を２回行い、最後に2
×SSCに浸した。
t Unihyb Hybridization Solution（TeleChem Internat
ional Inc.）8μlを加えて混合し、100℃で10分間加熱
処理を行った後、氷中に5分間浸した。このプローブ核
酸溶液を5μlとり、＜２＞で作製したキャプチャーオリ
ゴヌクレオチドを固定化した基板にのせ、その上にカバ
ーグラスをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに35℃に
設定した恒温器に入れて120分間静置した。基板を取り
出し、すばやく室温下で2×SSC, 0.1％SDS溶液（2×SS
C：0.033M NaCl, 0.033Mクエン酸ナトリウム）に浸して
カバーグラスを除去した。基板を室温下で2×SSC, 0.1
％SDS溶液に5分間浸す操作を２回行い、43℃の2×SSC,
0.1％SDS溶液（0.2×SSC：0.0033M NaCl, 0.0033Mクエ
ン酸ナトリウム）に5分間浸す操作を２回行い、最後に2
×SSCに浸した。
【００６１】＜５＞蛍光の検出
ハイブリダイゼーションを終えた基板を2×SSCから取り
出し、遠心機（Beckman社製）にセットし、2000rpmで１
分間遠心した。次にScanArray4000（GSI Lumonics社
製）に基板をセットし、蛍光検出を行った。
出し、遠心機（Beckman社製）にセットし、2000rpmで１
分間遠心した。次にScanArray4000（GSI Lumonics社
製）に基板をセットし、蛍光検出を行った。
【００６２】以上の結果を図３に示す。また、DNAシー
ケンス法によるタイピングとの結果関係を表３に示し
た。本発明の方法により、シロザケハプロタイプタイピ
ングが可能なことが明らかである。
ケンス法によるタイピングとの結果関係を表３に示し
た。本発明の方法により、シロザケハプロタイプタイピ
ングが可能なことが明らかである。
【００６３】
【表３】
【００６４】
【発明の効果】本発明により、シロザケのハプロタイプ
の判定を、効率よく、かつ高精度で行うことができる。
また、本発明によりシロザケが回帰する地域を推定する
ことができる。
の判定を、効率よく、かつ高精度で行うことができる。
また、本発明によりシロザケが回帰する地域を推定する
ことができる。
【００６５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Nisshinbo Industries, Inc.
<120> ミトコンドリアＤＮＡを用いたシロザケのハプロタイプ判定法
<130> P-9128
<141> 2001-12-13
<160> 68
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 481
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 1
gcggctacat cccgcacatt tgtaaatgct ataacttgta aacccaatgt tatactacac 60
tatgtataat attacatatt atgtatttac ccatatataa tactgcacgt gagtagtaca 120
ttatatgtat tatcaacata tacttatttt aacccctcat acatcagcac taatccaagg 180
tttacattaa gcaaaacacg tgataataac caactaagtt gtctgcaact gattaattgc 240
cgcatcaata aacctccaac taacacgggc tccgtcttta cccaccaact ttcagcatca 300
gtcctgctta atgtagtaag aaccgaccaa cgatatatca gtaggcatac tcttaatgat 360
ggtcagggac agaaatcgta ttaggtcgca tctcgtgaat tattcctggc atttggttcc 420
taagtcaagg gctatcctta agaaaccacc ccctgaaagc cgaatgtaaa gcatctggtt 480
a 481
【００６６】
<210> 2
<211> 481
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 2
gcggctacac cccgcacatt tgtaaatgct ataacttgta aacccaatgt tatactacac 60
tatgtataat attacatatt atgtatttac ccatatataa tactgcacgt gagtagtaca 120
ttatatgtat tatcaacata tacttatttt aacccctcat acatcagcac taatccaagg 180
tttacattaa gcaaaacacg tgataataac caactaagtt gtctgcaact gattaattgc 240
cgcatcaata aacctccaac taacacgggc tccgtcttta cccaccaact ttcagcatca 300
gtcctgctta atgtagtaag aaccgaccaa cgatatatca gtaggcatac tcttaatgat 360
ggtcagggac agaaatcgta ttaggtcgca tctcgtgaat tattcctggc atttggttcc 420
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a 481
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<213> Oncorhynchus keta
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tatgtataat attacatatt atgtatttac ccatatataa tactgcacgt gagtagtaca 120
ttatatgtat tatcaacata tacttatttt aacccctcat acatcagcac taatccaagg 180
tttacattaa gcaaaacacg tgataataac caactaagtt gtctgcaact gattaattgc 240
cgcatcaata aacctccaac taacacgggc tccgtcttta cccaccaact ttcagcatca 300
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tatgtataat attacatatt atgtatttac ccatatataa tactgcccgt gagtagtaca 120
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【００６９】
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ttatatgtat tatcaacata tacttatttt aacccctcat acatcagcac taatccaagg 180
tttacattaa gcaaaacacg tgataataac caactaagtt gtctgcaacc gattaattgc 240
cgcatcaata aacctccaac taacacgggc tccgtcttta cccaccaact ttcagcatca 300
gtcctgctta atgtagtaag aaccgaccaa cgatatatca gtaggcatac tcttaatgat 360
ggtcagggac agaaatcgta ttaggtcgca tctcgtgaat tattcctggc atttggttcc 420
taagtcaagg gctatcctta agaaaccacc ccctgaaagc cgaatgtaaa gcatctggtt 480
a 481
【００９３】
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Oncorhynchus keta
<400> 29
gcggctacat cccgcacatt 20
【００９４】
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 30
gcggctacac cccgcacatt 20
【００９５】
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 31
tgtaaatgct ataacttgta 20
【００９６】
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 32
tgtaaatgcc ataacttgta 20
【００９７】
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 33
aacttgtaaa cccaatgtt 19
【００９８】
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 34
aacttgtaag cccaatgtt 19
【００９９】
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 35
tgttatacta cactatgtat 20
【０１００】
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 36
tgttatactt cactatgtat 20
【０１０１】
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 37
tatgtataat attacatatt 20
【０１０２】
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 38
tatgtataac attacatatt 20
【０１０３】
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 39
ttacccatat ataatactg 19
【０１０４】
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 40
ttacccataa tataatactg 20
【０１０５】
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 41
taatactgca cgtgagtagt 20
【０１０６】
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 42
taatactgcc cgtgagtagt 20
【０１０７】
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 43
taatactgct cgtgagtagt 20
【０１０８】
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 44
cttattttaa cccctcatac 20
【０１０９】
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 45
cttattttaa gccctcatac 20
【０１１０】
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 46
tacattaagc aaaacacgtg 20
【０１１１】
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 47
tacattaagc taaacacgtg 20
【０１１２】
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 48
gtctgcaact gattaattgc 20
【０１１３】
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 49
gtctgcaacc gattaattgc 20
【０１１４】
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 50
gattaattgc cgcatcaa 18
【０１１５】
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 51
gattaattgc tgcatcaa 18
【０１１６】
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 52
gcatcaataa acctcca 17
【０１１７】
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 53
gcatcaacaa acctcca 17
【０１１８】
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 54
aaacctccaa ctaacacggg 20
【０１１９】
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 55
aaacctccag ctaacacggg 20
【０１２０】
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 56
acgatatatc agtaggcata 20
【０１２１】
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 57
acgatataac agtaggcata 20
【０１２２】
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 58
acgatataat agtaggcata 20
【０１２３】
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 59
gtattaggtc gcatctcgtg 20
【０１２４】
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 60
gtattagtcg catctagtg 19
【０１２５】
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 61
gtgaattatt cctggcattt 20
【０１２６】
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 62
gtgaactatt cctggcattt 20
【０１２７】
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 63
gaatgtaaag catctggtta 20
【０１２８】
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:capture
<400> 64
gaatgtaacg catctggtta 20
【０１２９】
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 65
aactactctc tggcggct 18
【０１３０】
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 66
ttggtgggta aagacgga 18
【０１３１】
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 67
agtcctgctt aatgtagt 18
【０１３２】
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 68
ataagattga caccatta 18
【図１】 ２８種類のシロザケのハプロタイプと、シロ
ザケが回帰する地域の偏りを示す図。
ザケが回帰する地域の偏りを示す図。
【図２】 基板上に固定化されるキャプチャーオリゴヌ
クレオチドの好ましい配置の一例を示す図。
クレオチドの好ましい配置の一例を示す図。
【図３】 本発明の方法によるハイブリダイゼーション
の結果を示す図。 ○：本発明の方法とDNAシーケンス法で一致したハプロ
タイプ ×：本発明の方法とDNAシーケンス法で一致しなかった
ハプロタイプ
の結果を示す図。 ○：本発明の方法とDNAシーケンス法で一致したハプロ
タイプ ×：本発明の方法とDNAシーケンス法で一致しなかった
ハプロタイプ
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
(72)発明者 鈴木 収
千葉県千葉市緑区大野台１−２−３ 日清
紡績株式会社研究開発センター内
(72)発明者 浦野 明央
札幌市中央区南13条西21丁目２−１−502
(72)発明者 阿部 周一
札幌市手稲区前田６条７丁目３−31
Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 AA19 CA01 CA09
CA11 CA20 HA11 HA13 HA14
4B029 AA07 BB20 CC01 CC02 CC03
CC08 FA12 FA15
4B063 QA13 QA17 QA18 QA20 QQ02
QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35
QR40 QR55 QR62 QR84 QS25
QS34 QX02
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号８に示す塩基配列を基準とする
シロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域の
塩基配列において、１０位、３０位、４２位、５７位、
７０位、９６位、１０８位、１５４位、１９４位、２３
１位、２４２位、２５０位、２６０位、３３９位、３４
０位、３８６位、３９５位、４０１位、及び４７１位か
ら選ばれる位置における多型をハイブリダイゼーション
により検出し得るオリゴヌクレオチドの１種又は２種以
上が基板上に固定化されたオリゴヌクレオチド固定化基
板を含み、被検体シロザケに由来する核酸とのハイブリ
ダイゼーションにより検出される多型又はその組み合わ
せによって、その被検体のハプロタイプを判定するため
のキット。 - 【請求項２】 前記多型又はその組み合わせが下記の多
型から選ばれる請求項１記載のキット。 （１）９６Ｄ、（２）９６Ｄ、Ｔ１０Ｃ、（３）９６
Ｄ、Ａ４２Ｇ、（４）９６Ｄ、Ａ１０８Ｃ、（５）９６
Ｄ、Ａ１９４Ｔ、（６）９６Ｄ、Ｔ２３１Ｃ、（７）９
６Ｄ、Ａ４７１Ｃ、（８）多型なし （９）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、（10）９６Ｄ、
３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、（11）９６Ｄ、３
８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｔ２３１Ｃ、（12）９６Ｄ、３８
６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ１０Ｃ、（13）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ７０Ｃ、
（14）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ
１０８Ｃ、（15）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ２３１Ｃ、（16）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｃ２４２Ｔ、（17）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ２５０Ｃ、（18）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ２６０Ｇ、
（19）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ
３３９Ａ、（20）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ４０１Ｃ、（21）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ４７１Ｃ、（22）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ３４０
Ｔ、（23）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｔ４０１Ｃ、（24）９６Ｄ、Ｔ３０
Ｃ、（25）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ａ５７Ｔ、（26）９６
Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ｔ７０Ｃ、（27）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ａ
１０８Ａ、（28）９６Ｄ、Ｔ３０Ｃ、Ｔ２３１Ｃ、（但
し、数字は配列番号８における位置を、数字を挟む左右
の文字は左の塩基から右の塩基への置換を、Ｄは欠失
を、それぞれ示す。） - 【請求項３】 前記多型が、少なくとも（２）、
（３）、（４）、（12）、（13）、（14）、（15）、
（16）、（17）、（18）、（19）、（20）、（21）、
（22）、（23）、及び（26）から選ばれる１または２以
上の多型を含む請求項２記載のキット。 - 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドが、多型部位を
含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有
し、１０〜４０塩基長である請求項１〜３のいずれか一
項に記載のキット。 - 【請求項５】 前記多型部位を含み、かつ、多型を示さ
ない塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０
〜４０塩基長である参照オリゴヌクレオチドがさらに固
定化された、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキッ
ト。 - 【請求項６】 表面にカルボジイミド基またはイソシア
ネート基がコートされ、このカルボジイミド基またはイ
ソシアネート基と前記オリゴヌクレオチドの末端に付加
されたリンカーとの反応により基板上にオリゴヌクレオ
チドが固定化された請求項１〜５のいずれか一項に記載
のキット。 - 【請求項７】 前記リンカーがアミノ基または末端に、
アミノ基、またはチミジン残基のホモポリマーを有する
化合物である請求項６記載のキット。 - 【請求項８】 前記オリゴヌクレオチドが、前記基板の
表面に径１０μｍ〜５ｃｍのサイズで固定化された請求
項６又は７に記載のキット。 - 【請求項９】 前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいずれかで
ある請求項１〜８のいずれか一項に記載のキット。 - 【請求項１０】 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも
いずれかが、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基を
スペーサー化合物で置換することによりハイブリダイゼ
ーションにおける結合親和性を緩和したオリゴヌクレオ
チドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のキッ
ト。 - 【請求項１１】 前記スペーサー化合物が、いずれの種
類の塩基との相補結合性を有しない核酸骨格である請求
項１０記載のキット。 - 【請求項１２】 被検体シロザケのハプロタイプによ
り、同被検体が回帰する地域を推定する請求項１〜１１
のいずれか一項に記載のキット。 - 【請求項１３】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号
２９〜６４に示す塩基配列、又はこれらの塩基配列の
５’側もしくは３’側またはその両方に伸長させるか短
縮された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選ば
れる請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキット。 - 【請求項１４】 配列番号８に示す塩基配列を基準とす
るシロザケ ミトコンドリアＤＮＡのコントロール領域
の塩基配列における下記の多型のいずれかをハイブリダ
イゼーションにより検出し得るオリゴヌクレオチド。 （２）９６Ｄ、Ｔ１０Ｃ、（３）９６Ｄ、Ａ４２Ｇ、
（４）９６Ｄ、Ａ１０８Ｃ、（12）９６Ｄ、３８６Ｄ、
Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ１０Ｃ、（13）９６Ｄ、３
８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ７０Ｃ、（14）９
６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ１０８
Ｃ、（15）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ２３１Ｃ、（16）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５
Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｃ２４２Ｔ、（17）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ２５０Ｃ、（18）９６
Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ２６０Ｇ、
（19）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ
３３９Ａ、（20）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１
５４Ｇ、Ｔ４０１Ｃ、（21）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９
５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ａ４７１Ｃ、（22）９６Ｄ、３８６
Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ３４０
Ｔ、（23）９６Ｄ、３８６Ｄ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ１５４
Ｇ、Ｔ３３９Ａ、Ｔ４０１Ｃ、（26）９６Ｄ、Ｔ３０
Ｃ、Ｔ７０Ｃ、（但し、数字は配列番号８における位置
を、数字を挟む左右の文字は左の塩基から右の塩基への
置換を、Ｄは欠失を、それぞれ示す。） - 【請求項１５】 被検体シロザケに由来する核酸を、請
求項１〜１３のいずれか一項に記載のキット上の各々の
オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリ
ゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸とのハイ
ブリッド形成の有無を検出し、シロザケ ミトコンドリ
アＤＮＡのコントロール領域の塩基配列中の多型を同定
することによって、被検体のハプロタイプを判定する方
法。
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-
2001
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