KR100635926B1 - 미토콘드리아 ｄｎａ ｃｏｉｉｉ－ｎｄ３－ｎｄ４ｌ 지역 단염기다형성을 이용한 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연어(salmon) 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 새로운 단염기다형성(single nucleotide polymorphism)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 단편에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호2의 8번 염기가 C 또는 서열번호49의 719번 염기가 T로 나타나는 다형성 부위를 포함하고, 서열번호1의 염기서열로부터 유래하는 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드의 상보체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체는 중합효소연쇄반응을 위한 프라이머로 사용될 수 있거나 마이크로어레이 방법을 위한 프로브로서 사용될 수 있다.

연어, 단염기다형성

Description

미토콘드리아 ＤＮＡ ＣＯＩＩＩ－ＮＤ３－ＮＤ４Ｌ 지역 단염기다형성을 이용한 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 방법{Polynucleotide, Primer and Methods for identification of the chum salmon and its originated stocks using single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial DNA COIII-ND3-ND4L region}

도 1은 연어과 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 도면이다.

도 2 내지 도 24는 본 발명의 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 변이 염기가 포함된 744개 염기서열을 포함하는 게놈 DNA 부분을 나타내는 연결되는 도면이다.

도 25는 상기 도 2 내지 도 24에 나타난 744개 염기서열 중에서 하나 이상의 변이를 가지고 있는 개체를 유형별로 구분하여 정리한 것이다.

도 26은 본 발명의 COIII-ND3-ND4L 유전자의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다.

본 발명은 북태평양 연안국들이 방류하는 연어의 각 계군을 구별할 수 있는, 각 계군에 독특한 단염기다형성(single nucleotide polymorphisms)이 연어의 미토콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역에 존재함을 밝히고, 이를 이용하여 각 연어의 유전자형을 판별하고 그 소속 계군을 구분하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

구체적으로 본 발명은 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자내의 서열번호2의 8번 염기가 C 또는 서열번호49의 719번 염기가 T로 나타나는 다형성 부위를 포함하고, 상기 서열번호1의 염기서열로부터 유래하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체에 관한 것이다.

연어(chum salmon, Oncorhynchus keta)는 북태평양과 베링해, 오호츠크해 및 이들 바다로 유입되는 하천에 널리 분포하는 어종으로서 북태평양 연안국들에서 중요한 수산자원으로 평가되고 있다. 이 국가들은 연어 치어를 인공적으로 생산하고 방류함으로써 자국의 연어 자원을 증대시키고 있다. 연어 방류 국가들은 자원의 효율적 관리와 합리적 이용방안을 마련하기 위해 노력하고 있으며, 연어자원에 대한 주권을 확보하기 위해 과학적, 외교적 노력을 활발히 경주하고 있다. 그런데, 이와 같은 목적을 달성하기 위해서는 연어의 유전자형 판별과 계군 구별이 필수적이다.

연어과 어류의 미토콘드리아 DNA상 유전자 배열은 도1에 보여지는 바와 같다. 본 발명의 대상지역인 COIII-ND3-ND4L 지역은 종래의 연구대상이었던 조절부위(control region)와 반대쪽에 위치하며, COIII(CO3) 유전자 3'말단의 203 염기(위치 1-203), tRNA-gly 유전자 70염기(204-273), ND3 유전자 351염기(274-624), tRNA-Arg 유전자 68염기(625-692), ND4L 유전자 5'말단 52염기(693-744)를 포함한다. 현재까지 연어 유전자형을 밝히기 위한 연구는 조절부위에 한정되어 있었지만, 본 발명자들은 이와는 다른 COIII, ND3 및 ND4L 지역을 대상으로 단염기다형성을 분석함으로서 지금까지 알려지지 않은 새로운 변이를 밝혀내어 본 발명에 이르게 되었다.

연어의 유전적 계군을 구분하기 위한 방법으로 초기에는 동위효소 분석법이 시도되었다(Okazaki, 1981; Winans et al. 1994; Wilmot et al. 1998). 이 방법은 대립형질을 갖고 있는 효소단백질을 전기영동법을 이용하여 젤 상에서 구분하는 것으로서 분해능이 뛰어나지 못하고 동위효소가 충분히 분리되지 못한다는 단점이 있다 (Lewontin, 1991).

또 다른 방법으로 제한효소단편다형성(RFLPs)을 이용한 계군 구분이 시도되었다 (Cronin et al. 1993; Seeb and Crane, 1999). 그러나, 이 방법 역시 비교 생물의 유전체 전체를 제한효소로 자르고 이를 전기영동으로 분석하여 잘려진 DNA 단편들의 길이 차이를 생물체 간에 서로 비교하는 것이기 때문에 분해능이 떨어진다는 단점이 있다. 이후에는 미니새틀라이트(minisatellite) DNA의 차이를 이용하여 연어 계군을 구분하는 방법도 시도되었으나(Beacham, 1996), 북태평양에 존재하는 여러 계군에서는 수행되지 못하였으며 분명한 계군 구분을 제시하지 못하는 문제점이 있었다.

최근, 연어 미토콘드리아 DNA 상의 조절부위(control region)에 변이가 많다는 것이 알려지면서(Sato et al. 2001), 이 지역의 염기배열 전체를 분석하고 그 변이(단염기다형성, single nucleotide polymorphisms, SNPs)에 근거하여 계군을 구분하는 방법이 시도되었다(Abe et al., 2002). 이 방법은 염기배열의 일차적인 차이를 비교 척도로 한다는 측면에서 분해능이 높다. 그러나, 분석 대상이 된 조절부위(control region)는 변이가 많지 않아 연어의 여러가지 계군을 구분하기에는 적합하지 않은 단점이 있다.

따라서, 이전에 보고되지 않은 새로운 돌연변이에 대한 요구가 연어의 유전자형을 판별하고 그 소속 계군을 구별하는 분야에서 요구되고 있으며, 이들 돌연변이를 스크리닝할 필요성이 제기되고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 상기 새로운 돌연변이를 부위를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드 및 그 상보체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 새로운 돌연변이 부위를 포함하는 핵산의 전부 또는 일부와 혼성화하는 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 새로운 돌연변이 부위를 포함하는 핵산의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 핵산 돌연변이를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 연어의 유전적 계군을 구별할 수 있는, 단염기다형성 변이가 충분히 많은 유전자 표지를 확보하고, 이를 이용한 분석방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 핵산 단편은 서열번호2의 8번 염기가 T 또는 서열번호49의 719번 염기가 C로 나타나는 다형성 부위를 포함하고, 서열번호1의 염기서열로부터 유래하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드의 상보체를 포함하는 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 핵산 단편은 서열번호2의 8번 염기가 C, 서열번호3의 16번 염기가 A, 서열번호4의 48번 염기가 G, 서열번호5의 57번 염기가 C, 서열번호6의 65번 염기가 T, 서열번호7의 68번 염기가 G, 서열번호8의 70번 염기가 G, 서열번호9의 80번 염기가 T, 서열번호10의 81번 염기가 G, 서열번호11의 108번 염기가 G, 서열번호12의 111번 염기가 C, 서열번호13의 120번 염기가 T, 서열번호14의 150번 염기가 G, 서열번호15의 202번 염기가 A, 서열번호16의 224번 염기가 A, 서열번호17의 230번 염기가 G, 서열번호18의 246번 염기가 A, 서열번호19의 259번 염기가 G, 서열번호20의 260번 염기가 C, 서열번호21의 303번 염기가 T, 서열번호22의 307번 염기가 C, 서열번호23의 316번 염기가 G 나 C, 서열번호24의 319번 염기가 C, 서열번호25의 320번 염기가 A, 서열번호26의 323번 염기가 C 나 A, 서열번호27의 328번 염기가 C, 서열번호28의 347번 염기가 A, 서열번호29의 375번 염기가 A, 서열번호30의 393번 염기가 G, 서열번호31의 406번 염기가 T 나 G, 서열번호32의 416번 염기가 T, 서열번호33의 420번 염기가 G, 서열번호34의 421번 염기가 T, 서열번호35의 430번 염기가 C, 서열번호36의 436번 염기가 A, 서열번호37의 478번 염기가 A, 서열번호38의 500번 염기가 A, 서열번호39의 504번 염기가 C, 서열번호40의 529번 염기가 G, 서열번호41의 534번 염기가 G, 서열번호42의 550번 염기가 C 나 G, 서열번호43의 555번 염기가 G, 서열번호44의 574번 염기가 T, 서열번호45의 591번 염기가 G, 서열번호46의 592번 염기가 A, 서열번호47의 655번 염기가 G, 서열번호48의 685번 염기가 G 또는 서열번호49의 719번 염기가 T로 나타나는 다형성 부위를 포함한다.

서열번호1은 연어(chum salmon)의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자내의 744개 염기서열을 나타낸다. 상기 744개 염기서열은 한국과 일본등의 연어 계군에 속하는 일반적인 연어의 염기서열이다. 본 발명에 따른 핵산 단편은 이와 같이 일반적인 서열번호1의 염기서열에 있어서, 8번 염기가 C로 나타나거나 719번 염기가 T 로 나타나는 등 상기 일반적인 서열번호1의 염기서열과 다르게 나타나는 단염기다형성 부위를 포함하는 것이면 가능하다. 여기서, 단염기다형성 부위는 도2 내지 도24에 나타난 바와 같이, KS01의 일반적인 염기서열과는 다른 유전자형을 보이는 염기서열 부위를 말하는 것이다. 즉, ".(점)"으로 표시되는 부위는 상기 KS01의 일반적인 염기서열과 동일한 유전자형을 표시하며, 도2의 KS02 내지 도24의 CS29에 나타난 구체적인 A, C, G 또는 T는 단염기다형성(SNP)을 나타내는 부위이다.

본 발명에 따라, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자내의 서열번호1에서 8번, 16번, 48번, 57번, 65번, 68번, 70번, 80번, 81번, 108번, 111번, 120번, 150번, 202번, 224번, 230번, 246번, 259번, 260번, 303번, 307번, 316번, 319번, 320번, 323번, 328번, 347번, 375번, 393번, 406번, 416번, 420번, 421번, 430번, 436번, 478번, 500번, 504번, 529번, 534번, 550번, 555번, 574번, 591번, 592번, 655번, 685번 또는 719번 염기와 다르게 나타나는 각각의 다형성 부위를 포함하는 유전자 서열은 서열번호2 내지 서열번호49에 각각 순서대로 표시하였다. 따라서, 본 발명에 있어서, 서열번호1의 염기서열로부터 유래하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드의 상보체라는 것은 서열번호 2 내지 49로 구성된 군으로부터 유래한 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드라는 것은 이 기술분야의 당업자에게는 명백한 것이다.

도 2 내지 도 24는 본 발명의 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 변이 염기가 포함된 744개 염기서열을 포함하는 게놈 DNA 부분을 나타내는 연결되는 도면이다. 이 연결되는 도면은 대한민국, 일본, 미국, 캐나다 연어의 미코콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역의 744개 염기서열을 분석하여 비교한 것으로서, 이 지역에 특정 연어에 독특한 단염기다형성 변이와 계군 특이적 단염기다형성 변이가 다수 존재한다는 것을 보여준다. KS 01~48은 대한민국 계군에 속하는 연어를 나타내고, JS 01~44는 일본 계군에 속하는 연어를 나타내며, AS 01~20은 미국 계군에 속하는 연어를 나타내고, CS 01~29는 캐나다 계군에 속하는 연어를 나타낸다. 지면의 한계상 60개 염기서열 단위로 분절하여 나타내었지만 도2 내지 도24는 순서대로 이어지는 도면을 의미한다. 직사각형 박스로 둘러싸인 염기서열 부분은 계군 특이적 중합효소연쇄반응 프라이머로 제작될 수 있거나, 마이크로어레이 방법에 이용될 올리고뉴클레오티드로 사용될 수 있는 계군 특이적 단염기다형성이 존재하는 지역을 나타낸다.

이와 같이, 도2 내지 도24는 본 발명의 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 변이 염기가 포함된 744개 염기서열을 포함하는 게놈 DNA 부분을 나타내는 연결되는 도면이고, 도25는 도2 내지 도 24에 나타난 유전자 변이 염기만을 일목요연하게 정리한 것이다. 도 25에서 유전자의 위치는 세로로 표시하여 염기서열 8번, 16번, 48번 내지 719번 위치를 나타낸 것이며, 유전자형 KJ 부터 C14는 도2 내지 도24에 표시된 KS 내지 CS와 대응되는 것이 아니고, 상기 도2 내지 도24에 표시된 KS01 내지 CS29 중에서 변이 염기서열 즉, 단염기다형성을 보이는 개체의 전 체 744 염기서열을 비교하여 각 개체가 가지고 있는 변이의 유형별로 분류하여 새롭게 구분하였다. 다시 말해서, 각 개체의 전체 염기 중에서 변이를 가지고 있는 유형에 따라 744개 개체를 유형별로 나타낸 것이다. 예를 들면, K1은 서열번호1의 57번 위치에 C로 나타나는 변이와 307번에 C로 나타나는 변이 그리고 534번에서 G로 나타나는 변이 유형을 가지고 있는 개체로 이와 같은 유형은 도2 내지 도24에서 5번 나타난다는 것이다. 여기서, 괄호안의 숫자는 각 개체의 전체 염기서열 유형의 빈도를 표시하며, K는 한국 연어, J는 일본 연어, A는 미국 연어, C는 캐나다 연어를 나타내는 것이고, KJ는 한국과 일본 연어 등에서 나타나는 공통의 유전자를 의미한다.

구체적으로는 도2 내지 도24에 나타난 염기서열 중에서, 순서대로 염기서열 8번, 16번, 48번, 57번, 65번, 68번, 70번, 80번, 81번, 108번, 111번, 120번, 150번, 202번, 224번, 230번, 246번, 259번, 260번, 303번, 307번, 316번, 319번, 320번, 323번, 328번, 347번, 375번, 393번, 406번, 416번, 420번, 421번, 430번, 436번, 478번, 500번, 504번, 529번, 534번, 550번, 555번, 574번, 591번, 592번, 655번, 685번 또는 719번 염기가 단염기다형성 부위이다. 단염기다형성 부위는 다형성 부위라고도 하며, 본 발명에 있어서 하나 이상의 다형성을 나타내는 부위는 상기에서 보여지는 바와 같이 8번부터 719번 염기까지 48개의 다형성 부위를 각각 가질 수 있다.

본 발명에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1%이상, 더욱 바람직하기로는 10%또는 20%이상의 발생 빈도를 나타내는 두개 이상의 대립형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.

따라서, 본 발명은 일반적인 염기서열 이외에 본 발명에 따라 다형성 부위를 하나 이상 포함하여 이루어지는 뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체도 가능하다. 더불어, 하나의 연어 개체에서 나타나는 한정적 돌연변이와 계군마다 집단적으로 몰려다니는 연어의 특성을 고려하여, 본 발명에 따른 다형성 부위의 더욱 바람직한 형태는 연어 계군간의 구별을 위해 상기 다형성 부위가 2개 이상의 개체로부터 동일한 유전자형으로 나타나는 것이다.

또한, 상기 본 발명에 따른 다형성 부위는 유전학적으로 결정된 집단내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질이 발생하는 것을 의미하는바, 도2 내지 도24에 나타난 다형성 부위의 염기서열과 대체적이거나 대립되는 다른 서열로 다형성 되는 것도 가능한 것은 명백하다.

이와 같은 다형성 부위에, 서열번호1의 염기서열로부터 유래하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 것이면 어느 것이나 본 발명에 해당하며, COIII-ND3- ND4L 유전자 그 자체도 포함된다. 바람직하기로는, 상기 서열번호1의 서열에 개시된 10개 이상이고 100개 이하의 연속적 뉴클레오티드 또는 그 상보체이고, 더욱 바람직하기로는 10개 이상이고 50개 이하의 것이고, 가장 바람직하기로는 10개 이상이고 20개 이하의 것이다. 상기 다형성 부위는 이들 단편의 어느 부위에나 위치할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 단편 또는 그의 상보체는 연어(chum salmon) 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자내의 744개 염기서열에서, 서열번호2 내지 49에 나타난 것과 같이, 하나 이상의 다형성을 보이는 48개의 다형성 부위 각각의 조합을 포함하고, 서열번호1의 염기서열로부터 유래하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체에 관한 것으로, 대체적 또는 대립적 염기서열을 가질 수 있으며, 다형성 부위가 2개 이상의 개체로부터 나타나는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산단편에 따른 다형성 부위는 상기한 48개의 다형성 부위 각각과 이에 대한 어떤 조합도 가능하다. 구체적으로는 서열번호5의 57번 염기 C로 나타나는 다형성 부위가 가능하고, 서열번호21의 303번 염기 T로 나타나는 것도 가능하며, 서열번호22의 307번 염기 C로 나타나는 다형성 부위도 가능하다. 여기에 10개 이상의 뉴클레오티드가 포함되는 핵산 단편의 구체적인 서열은, 예를 들면 표1과 같은 서열이 포함된다.

[표1 : 서열번호5의 57번 염기가 C로 나타나는 다형성 부위를 포함하는 핵산 단편 의 염기 서열 예]

길이(bp)	서열
10	CTCTAC C TTT
	G CTCTAC C TT
	C TTT CTGGC T
20	ATCGG CTCTAC C TTT CTGGC
	G TAATCATCGG CTCTAC C TT
	C TTT CTGGCTGTTT GCCTTC
50	GGCCTACACG TAATCATCGG CTCTAC C TTT CTGGCTGTTT GCCTTCTACG
100	TTGTCGCCAC AGGATTCCAC GGCCTACACG TAATCATCGG CTCTAC C TTT CTGGCTGTTT GCCTTCTACG ACAAATTCAA TACCATTTCA CATCTGAACA

C : 서열번호5의 57번 다형성 부위에 있는 염기를 나타낸다.

또한, 본 발명에 따라 서열번호21의 303번 염기 T로 나타나는 다형성 부위와 함께 서열번호22의 307번 염기 C로 나타나는 다형성 부위를 포함하는 것으로, 10개 이상의 뉴클레오티드가 포함되는 폴리뉴클레오티드의 구체적인 서열은, 예를 들면 표2와 같은 서열이 포함된다.

[표2 : 서열번호21의 303번 염기 T로 나타나고 서열번호 307번 염기 C로 나타나는 다형성 부위를 포함하는 핵산 단편의 염기 서열 예]

길이(bp)	서열
10	AT T ACC C TCA
	CT AT T ACC C T
	T ACC C TCA CA
20	TTACT AT T ACC C TCA CATTG
	AATCATTACT AT T ACC C TCA
	T ACC C TCA CATTGTCCGC AG
50	TAATTACAAC AATCATTACT AT T ACC C TCA CATTGTCCGC AGTACTAGCC
100	TGGTTAAAAT CCAAGGAAAG ATAATGAACT TAATTACAAC AATCATTACT AT T ACC C TCA CATTGTCCGC AGTACTAGCC ACTATCTCTT TCTGATTACC

T :서열번호21의 303번 다형성 부위에 있는 염기를 나타낸다..

C :서열번호22의 307번 다형성 부위에 있는 염기를 나타낸다.

나아가, 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA일 수 있으며, 단일가닥 또는 이중가닥의 형태일 수도 있고, 이러한 핵산 단편은 천연 또는 합성된 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열번호2에서 8번 염기가 T 또는 서열번호49에서 719번 염기가 C 로 나타나는 등의 48개 다형성 부위 각각의 조합을 포함하고, 서열번호1의 서열 또는 그 상보체와 혼성화하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 '대립형질 특이적(allele-specific)'이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 서열번호의 57번 염기가 T인 단일염기다형(SNP)을 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기서 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이상의 염 농도 및 적어도 15 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행된다. 예를 들면, 5xSSPE(750mM NaCl,50mM Na Phosphate,5mM EDTA,pH 7.4)및 25 ∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드는 프로브일 수 있다.본 발명에서 '프로브'란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙부위(즉, 10뉴클레오티드로된 프로브이면 5번 위치가, 20뉴클레오티드로된 프로브이면 10 또는 11번 위치)가 상기 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태의 마이크로어레이로 제공될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드는 프라이머일 수 있다. 본 발명에서 '프라이머'란 적절한 버퍼 및 온도에서 적당한 조건(즉,4종류의 뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 역전사효소와 같은 중합제의 존재)하에서 주형으로부터 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 그 3 ′말단이 서열번호1에서 57번 염기가 C 또는 303번 염기가 T 또는 307번 염기가 C로 나타나는 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립 형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다.

3´말단 부위가 변화된 프라이머의 제작은 전체 길이가 20-25개의 염기로 구성하여, 3´말단 첫 염기를 상기한 단염기 다형성 부위의 각 유전자형과 일치하도록 선정하고, 3´말단 염기의 직전 염기(5´쪽)를 어느 유전자형과도 부합되지 않는 불일치(mismatch) 염기(즉, 상기 다형성 부위의 직전 유전자와 결합할 수 없는 유전자)로 선정하며, 그 나머지 5´쪽 염기는 모든 유전자형에서 보존된 공통의 염기서열과 일치하는(즉, 상기 직전 유전자의 앞번호 유전자와 일치하는 유전자) 것으로서 이루어진다. 이와 같이, 3'말단이 특정 유전자형의 단염기다형성에 부합되는 프라이머는 그 유전자형의 염기서열과 3'말단의 직전 염기 1개가 불일치 되는 것이다. 3'말단의 직전 염기가 2개 이상 불일치 되는 경우는 프라이머가 주형에 붙지않아 DNA를 증폭 시킬 수 없는 것이다. 이러한 프라이머들은 3' > 5' exonuclease 활성이 없는 DNA 합성효소(예, 재조합 Taq 효소)로 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시할 경우 3'말단의 염기가 일치하는 유전자형만이 특이적으로 증폭하게 된다. 이에 따라, 본 발명의 다른 실시예는 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에 속하는 것으로, 서열번호 1의 염기서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 중합효소연쇄반응 프라이머로서, 상기 서열번호 1의 8번, 16번, 48번, 57번, 65번, 68번, 70번, 80번, 81번, 108번, 111번, 120번, 150번, 202번, 224번, 230번, 246번, 259번, 260번, 303번, 307번, 316번, 319번, 320번, 323번, 328번, 347번, 375번, 393번, 406번, 416번, 420번, 421번, 430번, 436번, 478번, 500번, 504번, 529번, 534번, 550번, 555번, 574번, 591번, 592번, 655번, 685번 또는 719번 염기의 다형성 부위와 일치하는 염기를 3' 말단 염기로 가지고, 상기 다형성 부위에 해당하는 염기의 앞번호 염기과 결합할 수 없는 불일치 염기를 상기 3' 말단 염기의 5'쪽 직전 염기로 가지며, 상기 앞번호 염기보다 앞선 번호를 가진 염기들과 일치하는 염기들을 상기 5'쪽 직전 염기의 5'쪽 나머지 염기로 가지는 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 프라이머 또는 그의 상보적 프라이머일 수 있다.

이와 같이 본 발명은 연어(salmon)의 미토콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역을 유전자 표지로 삼아, 그 지역에 존재하는 집단 특이적 단염기다형성을 확보하며, 이를 이용하여 각 연어의 유전자형을 판별하고 그 소속 계군을 구분하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 핵산의 분석방법은 서열번호1의 8번, 16번, 48번, 57번, 65번, 68번, 70번, 80번, 81번, 108번, 111번, 120번, 150번, 202번, 224번, 230번, 246번, 259번, 260번, 303번, 307번, 316번, 319번, 320번, 323번, 328번, 347번, 375번, 393번, 406번, 416번, 420번, 421번, 430번, 436번, 478번, 500번, 504번, 529번, 534번, 550번, 555번, 574번, 591번, 592번, 655번, 685번 또는 719번 다형성 부위를 차지하는 염기(즉, 서열번호 2 내지 49의 다형성 부위의 염기)서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방법은 먼저 피검체로부터 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 분리하는 단계 및 이 분리된 상기 핵산의 서열을 결정하고, 위와 같은 서열번호1의 8번 내지 719번의 48개 다형성 부위 각각의 염기를 결정하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

분석 결과를 예로 들면, 상기 서열번호1의 57번 다형성 부위 서열이 T 이외의 다른 염기, 구체적으로 C 이면 피검체는 미국 또는 캐나다 계군에 속하는 연어일 가능성이 많고, 상기 서열번호1의 303번 다형성 부위 서열이 C 이외의 다른 염기, 구체적으로 T 이면 피검체는 미국 계군에 속하는 연어일 가능성이 많으며, 상기 서열번호1의 307번 염기서열이 A 이외의 다른 염기, 구체적으로 C 이면, 피검체는 한국 계군에 속하는 연어일 가능성이 많은 것으로 판단할 수 있다. 이와 마찬가지로 본 발명에 따른 핵산분석 방법은 8번 염기가 C이면 한국 계군에 속하거나, 16번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 48번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 65번 염기가 T이면 캐나다 계군에 속하거나, 68번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 70번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 80번 염기가 T이면 한국 계군에 속하거나, 81번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 108번 염기가 G이면 일본 계 군에 속하거나, 111번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 120번 염기가 T이면 캐나다 계군에 속하거나, 150번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 202번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 224번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 230번 염기가 G이면 한국 계군에 속하거나, 246번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 259번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 260번 염기가 C이면 캐나다 계군에 속하거나, 316번 염기가 G이면 한국 계군에 속하거나, 319번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 320번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 323번 염기가 C이면 한국 계군에 속하고 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 328번 염기가 C이면 미국 계군에 속하거나, 347번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 375번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 393번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 406번 염기가 T이면 한국 계군에 속하고 G이면 일본 계군에 속하거나, 416번 염기가 T이면 한국 계군에 속하거나, 420번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 421번 염기가 T이면 캐나다 계군에 속하거나, 430번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 436번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 478번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 500번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 504번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 529번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 534번 염기가 G이면 미국 또는 캐나다 계군에 속하거나, 550번 염기가 C이면 한국 계군에 속하거나, 555번 염기가 G이면 미국 계군에 속하거나, 574번 염기가 T이면 한국 계군에 속하거나, 591번 염기가 G이면 미국 또는 캐나다 계군에 속하거나, 592번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 655번 염기가 G이면 미국 계군에 속하거나, 685번 염기가 G이면 일본 계 군에 속하거나 또는 719번 염기가 T이면 한국 또는 캐나다 계군에 속할 가능성이 높은 연어로 판단하는 것을 특징으로 하는 것이다. 여기에서 염기서열의 결정은 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들면, 디디옥시법(dideoxy method)(Sambrook 등,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2판,CSHP,뉴욕 1989))등이 사용될 수 있으며, 자동화된 기기를 사용할 수도 있다.

본 발명의 다른 특징으로, 연어 유전자형 판별과 그 소속계군 구별법은 먼저, 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자를 비교 대상으로 삼고, 상기 유전자에서 각 연어 계군에 독특한 단염기다형성을 밝힌 후, 상기 단염기다형성을 이용하여 계군을 판별하는 방법이다. 여기서 계군을 판별하기 위해서는 중합효소연쇄반응(PCR)이나 마이크로어레이 방법을 사용할 수 있다.

중합효소연쇄반응에서는 피검체 연어 미토콘드리아 DNA의 COIII-ND3-ND4L 유전자 전체를 증폭하고 이렇게 증폭된 DNA 단편 각각의 실제 염기서열을 밝혀 냄으로서 연어의 유전자형을 판별하고 그 소속 집단을 구별할 수 있다. PCR을 사용하는 다른 방법은 단염기다형성에 근거하여 3´말단 부위가 변화된 중합효소연쇄반응 프라이머들을 제작하고, 상기 제작된 프라이머들의 다양한 조합으로 중합효소연쇄반응을 실시하여 DNA의 증폭 가부와 단염기다형성을 비교하여 각 연어의 유전자형과 소속계군을 신속히 구별할 수 있다.

연어의 계군을 판별하기 위한 마이크로어레이 방법으로는 본 발명에 따른 단염기다형성이 포함된 올리고뉴클레오티드를 제작하여 슬라이드글래스 위에 고정시키고, 피검체 유전자의 COIII-ND3-ND4L 지역을 증폭시켜 증폭된 DNA 단편을 상기 슬라이드글래스 위에 고정된 올리고뉴클레오티드와 혼성화시켜서 혼성화 가부에 따라 각 연어의 유전자형과 소속계군을 구별하는 방법이다. 마이크로어레이 방법에서는 계군 특이적 단염기다형성이 포함된 올리고뉴클레오티드를 제작하고, COIII-ND3-ND4L 지역의 DNA 단편과 혼성화시키면 그 유전자형에 따라 혼성화의 가부가 결정된다. 이에 따라 혼성화의 가부로서 대상연어의 유전자형과 소속계군을 판별할 수 있다.

이와 같은 발견에 근거하면, 임의의 대상 연어에서 이 지역의 염기서열을 분석하면 그 연어의 유전자형과 소속 계군을 구별할 수 있는 것이다. 또한, 단염기다형성에 근거하여 3´말단 부위를 계군 특이적으로 변화시킨 중합효소연쇄반응 프라이머들을 제작하고, 이를 이용하여 임의의 대상 연어 DNA를 증폭하면 그 유전자형에 따라 DNA 증폭 가부가 결정된다. 이에 따라, DNA 증폭 가부로써 대상 연어의 유전자형과 소속 계군을 구별할 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 다음 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예1 : 연어 미토콘드리아 DNA 중 DNA COIII-ND3-ND4L 유전자의 증폭

연어의 미토콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역에서 단염기다형성(SNPs)의 발견은 다음과 같은 과정으로 이루어졌다. 먼저, 연어 141개체 (우리 나라, 48; 일본, 44; 미국, 20; 캐나다, 29)로부터 혈액을 채취하고, 이로부터 Blood and Cell culture DNA 미디 키트(Qiagen; Germany)를 사용하여 게놈 DNA를 분리한 후, 141개의 COIII-ND3-ND4L 유전자는 PCR 반응용액을 이용하여 증폭하였다.

COIII-ND3-ND4L 유전자 증폭을 위해 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다. 상기 게놈 DNA를 주형으로 삼아 COIII 유전자 3‘말단 쪽에 위치하는 전위프라이머 (5’-TTACAATCGCTGACGGCG-3')과 ND4L 유전자의 5‘말단 쪽에 위치하는 역위프라이머 (5’-GGTGCGGTGAAACGCGAGTC-3')를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시함으로써 COIII-ND3-ND4L 지역 744개 염기를 증폭하였다.

PCR 반응용액은 5 uL 10xPCR buffer (Qiagen), 2.5 uL 10 mM each dNTPs, 2.5 uL 10 pmole 프라이머 (전위와 역위 프라이머), 0.5-1.0 μg DNA, 2.5 unit Hotstar Taq polymerase (Qiagen)를 혼합하여 전체 50 uL을 만들었다. PCR 반응과정과 시간, 온도 조건은 다음과 같다: 초기 활성화 (95℃, 15분); 35회 반복 과정의 denaturation (95℃, 1분), annealing (50℃, 1분), extension (72℃, 1분); 최후 반응 (72℃, 10분); 보관 (4℃). PCR 반응기로는 GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer) 또는 TGradient Thermocycler (Whatman, Biometra)가 사용되었다.

실시예2 : 연어 미토콘드리아 DNA 중 DNA COIII-ND3-ND4L 유전자의 염기서열 분석

상기와 같이 증폭된 DNA는 pCRII-TOPO 벡터(Invitrogen)에 연결되어 클로닝되거나, 증폭된 각각의 산물을 키트를 사용하여 정제하였다. 이렇게 클로닝되고 정제된 각 산물들은 염기서열분석용 반응의 주형으로 사용하였다.

이와 같이 얻어진 산물은 Automated DNA sequencer 377 (Applied Biosystems, 미국)으로 서열분석을 수행하였다.

실시예3 : 연어 미토콘드리아 DNA 중 DNA COIII-ND3-ND4L 유전자의 변이 검출 분석

서열분석 결과 얻어진 DNA 서열을，NCBI의 데이터베이스에 있는 염기서열과 비교하여，DNAstar 프로그램(DNASTAR,Inc,미국)을 이용하여 유전자 변이를 분석하였다.

그 결과, 연어 141개체(우리 나라, 48; 일본, 44; 미국, 20; 캐나다, 29)에서 유래된 DNA로부터 분리한 COIII-ND3-ND4L 유전자 744개 염기서열은 도2에 나타난 바와 같다. 각나라 별로 4개의 계군에 있어서, 일관성 있는 변이를 보이는 염기서열을 중심으로 계군을 구별하기에 적합한 단염기다형성 부위를 선택할 수 있고, 도2에서 직사각형 박스로 둘러싸인 염기서열 부분이 계군 특이적 중합효소연쇄반응 프라이머로 제작될 수 있거나, 마이크로어레이 방법에 이용될 올리고뉴클레오티드로 사용될 수 있는 계군 특이적 단염기다형성이 존재하는 지역을 나타내는 것이다. 구체적으로는 도2에서 57번 염기 T가 미국 연어, 캐나다 연어 전부와 대한민국 연어 일 부에서 C로 변이된 것이 발견되었고, 303번 염기 C가 미국 연어 대부분에서 T로 변이 되었으며, 307번 염기 A가 대한민국 연어 일부에서 C로 변이된 것이 발견되었다.

실시예4 : DNA COIII-ND3-ND4L 유전자에 근거한 PCR 프라이머 제작

도1에서 제시한 COIII-ND3-ND4L 지역의 염기서열에 근거하여 단염기 다형성 변이가 3'말단 부위에 위치하도록 설계된 중합효소연쇄반응 프라이머를 다음과 같이 제작하였다

전위(forward) 프라이머 SF1: 5´CACGTAATCATCGGCTCTAAC 3´(서열번호51)

역위(reverse) 프라이머 SR1: 5´TAGTACTGCGGACAATGTGCG 3´(서열번호60)

역위(reverse) 프라이머 SR2: 5´ACTGCGGACAATGTGATGGAA 3´(서열번호61)

프라이머 SF1은 서열번호5의 염기서열 중 57번째에 위치한 단염기다형성에 기초하여 제작되었으며, SR1은 307번째, SR2은 303번째의 단염기다형성을 고려하여 제작되었다. SF1은 미국, 캐나다 연어와 우리 나라 연어 일부에 특이적으로 작용하며(3'말단 염기 C; 다른 연어는 T), SR1은 우리 나라 연어 일부에만 특이적이며(3'말단 역위 염기 G; 다른 연어는 T), SR2는 미국 연어에 특이적으로(3'말단 역위 염기 A; 다른 연어는 G) 작용한다.

본 발명에 따른 프라이머 제작 방법에 따라, SF1의 3'말단 염기는 서열번호 5의 57번 단염기 다형성 부위와 일치하도록 C로 시작하였고, 두번째 3'말단 직전 염기인 A는 어느 유전자 형과도 부합하지 않는 불일치 유전자(상기 다형성 부위의 직전 앞번호 유전자와 결합할 수 없는 불일치 유전자)로 선정하기 위해, A로 구성하였으며, 그 나머지 염기는 모든 유전자형에서 보존된 공통의 염기서열에 일치(상기 직전 유전자의 앞번호 유전자와 일치하는 유전자와 일치)하도록 ATCTCGG~CAC순으로 구성하였다. 이것은 상기 프라이머가 COIII-ND3-ND4L 유전자의 38번 염기부터 57번 염기까지의 구간에 부합하여 DNA를 증폭시킬 수 있도록 제작하였고 중합효소연쇄반응에서 각 유전자형에 특이적인 DNA만을 증폭시키기 위함이다.

본 발명에 따른 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2프라이머(역위프라이머)와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 이와 같은 역위 프라이머로서 SR1 은 307번째 단염기 다형성을 토대로 제작된 것이다. SR1의 3'말단 염기는 307번 단염기다형성 유전자(C)의 반대편 염기에 부합하도록 G로 시작하였고, 두번째 3'말단 직전 염기인 C는 어느 유전자 형과도 부합하지 않는 불일치 염기로 선정하기 위해 C로 구성하였으며, 그 나머지 염기는 모든 유전자형에서 보존된 공통의 반대편 염기서열과 부합하도록 (5')GTGTAAC~GAT(3')순으로 구성하였다. 이것은 상기 프라이머가 COIII-ND3-ND4L 유전자의 307번 염기부터 327번 염기까지의 반대편 염기 구간에 부합하여 DNA를 증폭시킬 수 있도록 제작된 것이다. 이와 같은 사항은 SR2 역위 프라이머에 있어서도 같은 이유로 제작되었다.

이와같은 제작방법에 따라 각 유전자형에 특이적인 프라이머는 그 유전자형의 염기서열과 3‘ 말단의 직전 염기 1개가 불일치하는 것에 비하여 비특이적인 프라이머 는 3’말단 염기 2개가 불일치한다. 중합효소연쇄반응에서 3‘말단의 불일치정도에 따라 프라이머와 주형 DNA의 결합정도가 다르게 되고, 3‘>5’ exonuclease 활성이 없는 DNA 합성효소는 그 차이를 인식함으로써 3‘말단 염기가 일치하는 특정 유전자형의 DNA만 증폭하게 되는 것이다.

한편, 중합효소연쇄반응에는 전위프라이머와 역위프라이머가 두 개가 쌍을 이루어 사용되는데, 본 실시예에서는 한쪽만 특이적인 프라이머를 사용한 경우와 양쪽 모두 특이적인 프라이머를 사용한 경우를 다각적으로 비교하기 위하여, 단염기다형성이 없는 보존된 지역과 부합하고, 3´말단 부위가 변화되지 않은 프라이머들을 다음과 같이 제작하였다:

전위(forward) 프라이머 SF0: 5´CTTTGTCGCCACAGGATTCCA 3´(서열번호50)

역위(reverse) 프라이머 SR0: 5´CCTATTCGGCTCATTCCAAGC 3´(서열번호59)

실시예5 : 제작된 PCR 프라이머에 의한 계군 특이적 중합효소연쇄반응 실시

다음 표3은 연어의 미코콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역의 단염기다형성에 근거하여 계군 특이적인 중합효소연쇄반응을 실시하기 위한 프라이머 쌍을 예로 나타낸 것이다. 이것은 상기 실시예4에서 제작된 다섯까지 프라이머를 가지고 가능한 조합을 모두 시도하였지만, SF0와 SR0로 이루어진 프라이머 쌍으로는 시도 하지 않았다. 왜냐하면 상기 두 프라이머는 모두 단염기다형성 변이가 없는 지역에서 제작되었으므로 당연히 모든 연어에서 증폭되기에 시도할 필요가 없는 것이다.

[표 3]

유전자	프라이머 쌍	증폭 DNA 크기(bp)	증폭되는 계군 (예측)
COIII-ND3-ND4L	SF0-SR1	300	한국 연어 (일부)
COIII-ND3-ND4L	SF0-SR2	300	미국 연어
COIII-ND3-ND4L	SF1-SR1	250	한국 연어 (일부)
COIII-ND3-ND4L	SF1-SR2	250	미국 연어
COIII-ND3-ND4L	SF1-SR0	550	미국, 캐나다 연어 한국, 일본 연어 (일부)

불일치의 정도에 따라 각 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 정도가 다르고, 중합효소연쇄반응에 사용되는 DNA 합성효소가 이를 다르게 인식하여 3‘말단이 일치하는 DNA만이 증폭되는 것이다.

각각의 중합효소연쇄반응은 다음과 같이 실시되었다: 연어 시료에서 추출한 전체 DNA와 표3의 각 프라이머쌍을 포함하는 반응용액 50ul(5uL 10xPCR buffer, 2.5 uL 10 mM each dNTPs, 2.5 uL 10 pmole 프라이머 (전위와 역위 프라이머), 0.5-1.0 μg DNA, 2.5 unit Taq polymerase)를 만들었다. PCR 반응과정과 시간, 온도 조건은 다음과 같다: 초기 denaturation (94℃, 2분); 35회 반복 과정의 denaturation (94℃, 1분), annealing (60℃-63℃, 1분), extension (72℃, 1분); 최후 반응 (72℃, 10분); 보관 (4℃). PCR 반응기로서 GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer)나 DNA Engine (MJ Research)가 사용되었다. 반응이 끝난 후 DNA 증폭 유무를 반응용액 10ul를 1% 아가로스젤에 전기영동함으로써 확인하였다.

실시예6 : 각 시료에 대한 프라이머 쌍 결과로 연어 소속 계군 구별

도26은 대한민국(1-5), 일본(6-10), 캐나다(11-15), 미국(16-20) 연어 시료 수 개를 대상으로 전체 게놈 DNA를 추출한 후, 위의 프라이머 쌍을 가지고 60 ℃ 아닐링 온도로 중합효소연쇄반응을 실시하였으며, 그 산물을 아가로스 젤에 전기영동한 사진이다. 각 시료는 중합효소연쇄반응에서 프라이머가 그 계군에 특이적인 단염기다형성과 부합되는 3말단 염기를 갖고 있을 경우에만 증폭되었다. 도26에 나타난 바와 같이, 칸 1, 3, 5, 15, 17, 18, 19 및 20에서 DNA의 증폭이 강하게 일어났음을 볼 수 있다.

아래 표4는 도2에서 사용된 시료와 표3의 프라이머 쌍, 3´말단의 합치 여부, DNA 증폭 가부 등을 정리하여 나타낸 것이다.

[표 4: 각 시료에 대한 프라이머 쌍의 결과]

분석 시료	프라이머 쌍	3‘말단 일치 여부	증폭 가부	도26상의 위치
KS0018	SF0	+	○	칸1
	SR1	+
KS0018	SF0	+	×	칸2
	SR2	-
KS0018	SF1	+	○	칸3
	SR1	+
KS0018	SF1	+	×	칸4
	SR2	-
KS0018	SF1	+	○	칸5
	SR0	+
JS0012	SF0	+	×	칸6
	SR1	-
JS0012	SF0	+	×	칸7
	SR2	-
JS0012	SF1	-	×	칸8
	SR1	-
JS0012	SF1	---	×	칸9
	SR2	---
JS0012	SF1	-	×	칸10
	SR0	+
CFR-6	SF0	+	×	칸11
	SR1	-
CFR-6	SF0	+	×	칸12
	SR2	-
CFR-6	SF1	+	×	칸13
	SR1	-
CFR-6	SF1	+	×	칸14
	SR2	-
CFR-6	SF1	+	○	칸15
	SR0	+
AS0019	SF0	+	×	칸16
	SR1	-
AS0019	SF0	+	○	칸17
	SR2	+
AS0019	SF1	+	×	칸18
	SR1	-
AS0019	SF1	+	○	칸19
	SR2	+
AS0019	SF1	+	○	칸20
	SR0	+

상기 표4에 나타나 있는 바와 같이, 각 시료의 프라이머 쌍이 3´말단과 일치하는 경우에만 DNA가 특이적으로 증폭되었고, 표3에 의한 다섯까지 프라이머 쌍에 의하는 경우 대한민국 연어 계군에 속하는 시료는 1,3,5번째 칸에서 증폭되었고, 일본 연어 계군에 속하는 시료는 증폭된 것이 없었으며, 캐나다 계군에 속하는 시료는 5번째 칸에서 증폭되었다. 또한, 미국 계군에 속하는 시료에서는 2,4,5번째 칸에서 증폭된 것을 알 수 있다.

그러므로, 각 시료에 대한 증폭부분을 관찰함으로서 각 시료가 어떠한 계군에 속하는지를 구별할 수 있는 것이다. 즉, 각 시료를 다섯까지 프라이머쌍으로 증폭시킨 이후에 1,3,5 프라이머쌍에 의해 증폭된 시료면 한국계군에 속하는 것이고, 하나도 증폭된게 없으면 일본, 5번째 쌍에 의해서만 증폭되면 캐나다, 2,4,5프라이머쌍에 의해 증폭되면 미국계군에 속하는 것이다.

위와 같은 실시예에 있어서는 서열번호5의 57번, 서열번호21의 303번, 서열번호22의 307번의 단염기다형성 염기에 기초하여 SF1, SR1, SR2 프라이머를 제작하고 연어의 소속 계군을 판별하였다. 그러나, 본 발명에서 상기 SF1, SR1, SR2 프라이머 이외에 연어 유전자형을 판별하고 소속 계군을 구별하는데 사용될 수 있는 프라이머는, COIII-ND3-ND4L 지역 내 단염기다형성이 위치하는 다른 부분(도2 내지 도24의 염기서열 중 박스로 표시한 부분 주위)에서도 제작될 수 있다는 사실은 이 기술분야에 있어서 보통의 지식을 가진자에게 당연한 것이다. 위 실시예에서 사용한 프라이머 이외에 각 단염기다형성에 특이적으로 작용할 수 있는 프라이머들의 또 다른 예는 다음 표5와 같다.

[표 5: 연어 소속 계군을 구별하기 위한 프라이머]

유전자명과 방향	프라이머 염기서열
COIII-ND3-ND4L 전위(forward) 프라이머	SF1: 5' CACGTAATCATCGGCTCTAAC 3'(서열번호51) SF2: 5' CACGTAATCATCGGCTCTAAT 3'(서열번호52) SF3: 5' GCTCTAATTTTCTGGCTGTAT 3'(서열번호53) SF4: 5' GCTCTAATTTTCTGGCTGTAG 3'(서열번호54) SF5: 5' ACATCTGAACATCATTTTGAC 3'(서열번호55) SF6: 5' ACATCTGAACATCATTTTGAT 3'(서열번호56) SF7: 5' ATTACAACAATCATTACTAAC 3'(서열번호57) SF8: 5' ATTACAACAATCATTACTAAT 3'(서열번호58)
COIII-ND3-ND4L 역위(reverse) 프라이머	SR1: 5' TAGTACTGCGGACAATGTGCG 3'(서열번호60) SR2: 5' ACTGCGGACAATGTGATGGAA 3'(서열번호61) SR3: 5' TAGTACTGCGGACAATGTGCT 3'(서열번호62) SR4: 5' ACTGCGGACAATGTGATGGAG 3'(서열번호63) SR5: 5' GCAGTGGATCAAATAAGTGAT 3'(서열번호64) SR6: 5' GCAGTGGATCAAATAAGTGAC 3'(서열번호65) SR7: 5' TCCAAGCCTCCTTGGGTTCTT 3'(서열번호66) SR8: 5' TCCAAGCCTCCTTGGGTTCTC 3'(서열번호67)

이와 같이 본 발명의 또 다른 특징은 연어 유전자형을 판별하거나 소속 계군을 구별하기 위해, 서열번호51 내지 서열번호58의 염기서열 중에서 선택되는 하나의 전위 프라이머 및 서열번호60 내지 서열번호67의 염기서열 중에서 선택되는 하나의 후위 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트에 관한 것일 수 있고, 상기 프라이머 쌍은 5종류인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트가 바람직하다.

상기 표5에 나타난 프라이머는 도2 내지 도24의 염기서열 중 박스로 표시한 부분을 근거로 하여 제작되었고, 이와 같은 프라이머 제작은 상기 실시예4에 나타난 방법과 동일한 방법으로 제작되었으며, 이를 이용해서 연어의 유전자형을 판별하고 그 소속 계군을 구별하는 것은 위에 나타난 실시예의 방법과 동일한 방법으로 수행 될 수 있는 것이다.

본 발명에서 제시한 미토콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역을 유전자 표지로 삼아, 연어의 유전자형과 소속 계군을 판별하는 방법은 분해능이 낮았던 선행기술(동위효소 분석법, 제한효소단편다형성 분석법 등)의 단점을 보완하여 분해능을 크게 향상시켰다.

한편, 본 발명은 미토콘드리아 DNA 조절부위(control region)를 유전자 표지로 이용하는 종래의 계군구별법과는 기술적 공통점이 있지만, 단염기다형성이 더 많은 것으로 확인된 COIII-ND3-ND4L 지역을 분석의 척도로 이용함으로써 연어의 유전자형을 판별하고 그 계군을 구별할 수 있는 분해능을 한층 증가시켰다.

또한, 본 발명은 단염기다형성에 근거하여 3´말단 부위가 변화된 계군 특이적 중합효소연쇄반응 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후, DNA의 증폭 가부에 따라 염기서열을 분석하지 않고도 연어의 유전자형과 그 소속 계군을 신속히 판정할 수 있는 장점을 갖고 있다.

한편, 본 발명은 마이크로어레이 방법을 활용하면 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써 염기서열을 분석하지 않고도 연어의 유전자형과 그 계군을 신속히 판정할 수 있는 적용성을 갖고 있다.

따라서, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있게 하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에 속하는 것으로, 서열번호 2 내지 49로 구성된 군으로부터 유래한 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,

   서열번호2의 8번 염기가 C, 서열번호3의 16번 염기가 A, 서열번호4의 48번 염기가 G, 서열번호5의 57번 염기가 C, 서열번호6의 65번 염기가 T, 서열번호7의 68번 염기가 G, 서열번호8의 70번 염기가 G, 서열번호9의 80번 염기가 T, 서열번호10의 81번 염기가 G, 서열번호11의 108번 염기가 G, 서열번호12의 111번 염기가 C, 서열번호13의 120번 염기가 T, 서열번호14의 150번 염기가 G, 서열번호15의 202번 염기가 A, 서열번호16의 224번 염기가 A, 서열번호17의 230번 염기가 G, 서열번호18의 246번 염기가 A, 서열번호19의 259번 염기가 G, 서열번호20의 260번 염기가 C, 서열번호21의 303번 염기가 T, 서열번호22의 307번 염기가 C, 서열번호23의 316번 염기가 G 나 C, 서열번호24의 319번 염기가 C, 서열번호25의 320번 염기가 A, 서열번호26의 323번 염기가 C 나 A, 서열번호27의 328번 염기가 C, 서열번호28의 347번 염기가 A, 서열번호29의 375번 염기가 A, 서열번호30의 393번 염기가 G, 서열번호31의 406번 염기가 T 나 G, 서열번호32의 416번 염기가 T, 서열번호33의 420번 염기가 G, 서열번호34의 421번 염기가 T, 서열번호35의 430번 염기가 C, 서열번호36의 436번 염기가 A, 서열번호37의 478번 염기가 A, 서열번호38의 500번 염기가 A, 서열번호39의 504번 염기가 C, 서열번호40의 529번 염기가 G, 서열번호41의 534번 염기가 G, 서열번호42의 550번 염기가 C 나 G, 서열번호43의 555번 염기가 G, 서열번호44의 574번 염기가 T, 서열번호45의 591번 염기가 G, 서열번호46의 592번 염기가 A, 서열번호47의 655번 염기가 G, 서열번호48의 685번 염기가 G 또는 서열번호49의 719번 염기가 T로 나타나는 다형성 부위를 포함하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
2. 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에 속하는 것으로, 서열번호 1의 염기서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,

   상기 서열번호 1의 8번 염기가 A 또는 G, 16번 염기가 C 또는 T, 48번 염기가 A 또는 T, 57번 염기가 A 또는 G, 65번 염기가 A 또는 G, 68번 염기가 A 또는 C, 70번 염기가 A 또는 C, 80번 염기가 A 또는 C, 81번 염기가 C 또는 T, 108번 염기가 T 또는 C, 111번 염기가 A 또는 G, 120번 염기가 A 또는 G, 150번 염기가 A 또는 C, 202번 염기가 C 또는 G, 224번 염기가 C 또는 G, 230번 염기가 A 또는 C, 246번 염기가 C 또는 T, 259번 염기가 C 또는 T, 260번 염기가 A 또는 G, 303번 염기가 A 또는 G, 307번 염기가 T 또는 G, 316번 염기가 A, 319번 염기가 A 또는 T, 320번 염기가 T 또는 G, 323번 염기가 G, 328번 염기가 A 또는 T, 347번 염기가 C 또는 G, 375번 염기가 C 또는 T, 393번 염기가 A 또는 T, 406번 염기가 A, 416번 염기가 A 또는 G, 420번 염기가 A 또는 T, 421번 염기가 A 또는 G, 430번 염기가 A 또는 G, 436번 염기가 C 또는 G, 478번 염기가 C 또는 T, 500번 염기가 C 또는 G, 504번 염기가 A 또는 G, 529번 염기가 C 또는 T, 534번 염기가 C 또는 T, 550번 염기가 T, 555번 염기가 A 또는 T, 574번 염기가 A 또는 G, 591번 염기가 C 또는 T, 592번 염기가 C 또는 G, 655번 염기가 A 또는 T, 685번 염기가 C 또는 T 또는 719번 염기가 A 또는 G로 나타나는 다형성 부위를 포함하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
3. 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에 속하는 것으로, 서열번호 1의 염기서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,

   상기 서열번호 1의 57번 염기가 C, 70번 염기가 G, 120번 염기가 T, 224번 염기가 A, 246번 염기가 A, 303번 염기가 T, 307번 염기가 C, 393번 염기가 G, 534번 염기가 G 또는 591번 염기가 G로 나타나는 다형성 부위로 이루어진 군에서 적어도 2개 이상의 다형성 부위를 포함하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머인 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브인 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 마이크로어레이.
8. 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에 속하는 것으로, 서열번호 1의 염기서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 중합효소연쇄반응 프라이머로서,

   상기 서열번호 1의 8번, 16번, 48번, 57번, 65번, 68번, 70번, 80번, 81번, 108번, 111번, 120번, 150번, 202번, 224번, 230번, 246번, 259번, 260번, 303번, 307번, 316번, 319번, 320번, 323번, 328번, 347번, 375번, 393번, 406번, 416번, 420번, 421번, 430번, 436번, 478번, 500번, 504번, 529번, 534번, 550번, 555번, 574번, 591번, 592번, 655번, 685번 또는 719번 염기의 다형성 부위와 일치하는 염기를 3' 말단 염기로 가지고, 상기 다형성 부위에 해당하는 염기의 앞번호 염기과 결합할 수 없는 불일치 염기를 상기 3' 말단 염기의 5'쪽 직전 염기로 가지며, 상기 앞번호 염기보다 앞선 번호를 가진 염기들과 일치하는 염기들을 상기 5'쪽 직전 염기의 5'쪽 나머지 염기로 가지는 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 프라이머 또는 그의 상보적 프라이머.
9. 제8항에 있어서, 서열번호51 내지 58의 염기서열 중에서 선택되는 하나의 전위 프라이머 또는 서열번호 60 내지 67의 염기서열 중에서 선택되는 하나의 역위 프라이머인 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 프라이머 또는 그의 상보적 프라이머.
10. 제8항에 있어서, 상기 다형성 부위는 서열번호2의 8번 염기가 C, 서열번호3의 16번 염기가 A, 서열번호4의 48번 염기가 G, 서열번호5의 57번 염기가 C, 서열번호6의 65번 염기가 T, 서열번호7의 68번 염기가 G, 서열번호8의 70번 염기가 G, 서열번호9의 80번 염기가 T, 서열번호10의 81번 염기가 G, 서열번호11의 108번 염기가 G, 서열번호12의 111번 염기가 C, 서열번호13의 120번 염기가 T, 서열번호14의 150번 염기가 G, 서열번호15의 202번 염기가 A, 서열번호16의 224번 염기가 A, 서열번호17의 230번 염기가 G, 서열번호18의 246번 염기가 A, 서열번호19의 259번 염기가 G, 서열번호20의 260번 염기가 C, 서열번호21의 303번 염기가 T, 서열번호22의 307번 염기가 C, 서열번호23의 316번 염기가 G 나 C, 서열번호24의 319번 염기가 C, 서열번호25의 320번 염기가 A, 서열번호26의 323번 염기가 C 나 A, 서열번호27의 328번 염기가 C, 서열번호28의 347번 염기가 A, 서열번호29의 375번 염기가 A, 서열번호30의 393번 염기가 G, 서열번호31의 406번 염기가 T 나 G, 서열번호32의 416번 염기가 T, 서열번호33의 420번 염기가 G, 서열번호34의 421번 염기가 T, 서열번호35의 430번 염기가 C, 서열번호36의 436번 염기가 A, 서열번호37의 478번 염기가 A, 서열번호38의 500번 염기가 A, 서열번호39의 504번 염기가 C, 서열번호40의 529번 염기가 G, 서열번호41의 534번 염기가 G, 서열번호42의 550번 염기가 C 나 G, 서열번호43의 555번 염기가 G, 서열번호44의 574번 염기가 T, 서열번호45의 591번 염기가 G, 서열번호46의 592번 염기가 A, 서열번호47의 655번 염기가 G, 서열번호48의 685번 염기가 G 또는 서열번호49의 719번 염기가 T로 나타나는 다형성 부위인 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별용 프라이머 또는 그의 상보적 프라이머.
11. 피검체로부터 핵산을 분리하는 단계; 및

    서열번호 2 내지 49의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 다형성 부위의 염기서열을 결정하는 단계;를 포함하는 것으로,

    상기 다형성 부위는 서열번호 1의 8번, 16번, 48번, 57번, 65번, 68번, 70번, 80번, 81번, 108번, 111번, 120번, 150번, 202번, 224번, 230번, 246번, 259번, 260번, 303번, 307번, 316번, 319번, 320번, 323번, 328번, 347번, 375번, 393번, 406번, 416번, 420번, 421번, 430번, 436번, 478번, 500번, 504번, 529번, 534번, 550번, 555번, 574번, 591번, 592번, 655번, 685번 또는 719번 위치에 있는 염기인 것을 특징으로 하는 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별 방법.
12. (삭제)
13. 제11항에 있어서, 상기 8번 염기가 C이면 한국 계군에 속하거나, 16번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 48번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 57번 염기가 C이면 미국 또는 캐나다 연어 계군에 속하거나, 65번 염기가 T이면 캐나다 계군에 속하거나, 68번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 70번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 80번 염기가 T이면 한국 계군에 속하거나, 81번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 108번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 111번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 120번 염기가 T이면 캐나다 계군에 속하거나, 150번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 202번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 224번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 230번 염기가 G이면 한국 계군에 속하거나, 246번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 259번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 260번 염기가 C이면 캐나다 계군에 속하거나, 303번 염기가 T이면 미국 또는 일본 계군에 속하거나, 307번 염기가 C이면 한국 계군에 속하거나, 316번 염기가 G이면 한국 계군에 속하거나, 319번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 320번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 323번 염기가 C이면 한국 계군에 속하고 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 328번 염기가 C이면 미국 계군에 속하거나, 347번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 375번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 393번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 406번 염기가 T이면 한국 계군에 속하고 G이면 일본 계군에 속하거나, 416번 염기가 T이면 한국 계군에 속하거나, 420번 염기가 G이면 캐나다 계군에 속하거나, 421번 염기가 T이면 캐나다 계군에 속하거나, 430번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 436번 염기가 A이면 캐나다 계군에 속하거나, 478번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 500번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 504번 염기가 C이면 일본 계군에 속하거나, 529번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나, 534번 염기가 G이면 미국 또는 캐나다 계군에 속하거나, 550번 염기가 C이면 한국 계군에 속하거나, 555번 염기가 G이면 미국 계군에 속하거나, 574번 염기가 T이면 한국 계군에 속하거나, 591번 염기가 G이면 미국 또는 캐나다 계군에 속하거나, 592번 염기가 A이면 한국 계군에 속하거나, 655번 염기가 G이면 미국 계군에 속하거나, 685번 염기가 G이면 일본 계군에 속하거나 또는 719번 염기가 T이면 한국 또는 캐나다 계군에 속할 가능성이 높은 연어인 것으로 판단하는 것을 특징으로 연어 유전자형 판별 및 소속 계군 구별 방법.

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