JP4718181B2 - マイクロアレイ上での逆転写 - Google Patents
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Description
本発明は、常用のハイブリダイゼーションベースのアプローチと比較した場合に、より高い感度、より良い精度及びより少ない時間消費での遺伝子発現の検出方法を提供する。
本発明は、注目のRNA分子の検出方法であって、注目の特定RNA分子と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、逆転写活性を有する酵素でそのようなRNAを逆転写するためのプライマーとして使用される方法、に関する。伸長されたプライマーは、直接的又は間接的に標識され、そして適切な手段によって検出される。当該方法の態様の概略図を図1A〜1Dに示す。支持体上の別個の部位に付着される3’末端を有するプライマー/プローブのアレイを提示する(図1A)。当該アレイは、当該プライマー/プローブと相補的な標的RNAがハイブリダイゼーションにより当該アレイ上に固定されるようにRNA試料と接触される(図1B)。固定化された標的RNAは、RNA依存性DNAポリメラーゼにより、プライマーとして前記プライマー/プローブを用い、検出可能に標識されたデオキシリボヌクレオチドの存在下で逆転写される(図1C)。RNアーゼ活性による標的RNAのその後の分解は、それぞれ別個の部位で生成する検出可能シグナルに影響を及ぼさない(図1D)。
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのポリマー形式のヌクレオチドである。この用語は、この分子の一次構造だけを意味する。従って、この用語は、二本鎖−及び一本鎖DNA及びRNAを含む。また、それは既知の型の修飾、例えば当業界で知られている標識、メチル化、「キャップ」、1又は複数の天然ヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)によるもの、ペンダント部分を含むもの、例えば、(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジン等を含む)タンパク質を含むもの、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレン等)によるもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結(例えば、アルファ−アノマー核酸等)によるもの、並びに修飾されていない形式のポリヌクレオチドによるものである。
使用するRNA鋳型は、通常、注目の生物学的供給源から精製される。最初のmRNA試料は、単細胞生物、例えば酵母を含む生理学的供給源、真核生物供給源、又は植物及び動物、特に哺乳類を含む多細胞生物、並びに当該哺乳類由来の器官、組織及び細胞を含む多細胞生物、任意の体液(例えば、血液、尿、唾液、痰、胃液等)、培養細胞、生検、又は他の組織調製物に由来してもよい。細胞、組織、器官及び生体自体から核酸を単離するためのプロトコールは、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されており、これは引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。そのような方法は、典型的に、1又は複数の組織/細胞のホモジェナイゼーション、核酸/タンパク質抽出、クロマトグラフィー、遠心、親和性結合等に対し元の生物学的供給源をかけることを包含する。当該方法はまた、事前のRNA単離無しに、細胞全体の可溶化物に対しても実施されうる。Klebe, R. J. et al. (1996) BioTechniques 21, 1094. 当該方法はまた、in vitroで転写されたRNA、並びにT3、T7、SP6又はQβ RNAポリメラーゼで転写されたRNA、に対しても実施されうる。
1.プライマーの選択
本発明は、固定され且つ分離されたオリゴヌクレオチドプライマー群を含んで成る、調製済みの固相支持体を提供する。当該プライマーは、例えば、標準的なPCRプライマー選択プログラム、例えばマサチューセッツ工科大(MIT)のPrimer3を用いて選択され、あるいは設計されうる。本発明に従うプライマーの態様において、それらは「捕獲プローブ」として使用され、そして、このために、生物学的試料中に含まれる標的核酸を捕獲するために基板上に固定される。本発明に従うプライマー/プローブは、逆転写産物の伸長を可能にする遊離3’末端を有する必要がある。好ましい態様において、プライマー/プローブは5’末端を介して基板に固定される。
核酸プローブは、共有結合により、例えばカップリング剤を用いた複合により、又は、共有結合又は非共有結合、例えば静電的相互作用、水素結合、抗体−抗原カップリングにより、あるいはそれらの組み合わせにより固形の支持体に付着されうる。付着の後、プローブの3’末端は、逆転写反応の間伸長のために遊離のままでなければならない。典型的なカップリング剤には、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインA−IgG抗体Fcフラグメント相互作用、及びストレプトアビジン/プロテインAキメラ(T. Sano and C. R. Cantor, Bio/Technology 9:1378-81 (1991))、あるいはこれらの物質の誘導体又は組み合わせが含まれる。核酸は、光開裂可能な結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合又はこれらの種々の結合の組み合わせにより固形支持体に付着されうる。アレイはまた、選択的に放出可能な結合、例えば、4,4’−ジメトキシトリチル又はその誘導体により固形支持体に付着されうる。有用であることが明らかとなっている誘導体には、3又は4[ビス−(4−メトキシフェニル)]−メチル−安息香酸、N−スクシンイミジル3又は4[ビス−(4−メトキシフェニル)]−メチル−安息香酸、N−スクシンイミジル3又は4[ビス−(4−メトキシフェニル)]−クロロメチル−安息香酸、及びこれらの酸の塩が含まれる。
発現レベルの調節は、生物学的試料中の構成的に発現した遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。発現レベルの調節は、細胞の全体的な健康及び代謝活性について調節するよう設計される。発現レベルの調節と標的核酸の発現レベルとの共変動は、遺伝子の発現レベルにおいて測定される変化又は変動が、その遺伝子の転写率に起因するのか、又は細胞の健康の一般的な変動に起因するのかを示唆する。従って、例えば、細胞が不健康であるか、又は必須の代謝物を欠いている場合、活性な標的遺伝子及び構成的に発現する遺伝子の両方の発現レベルが低下すると予測される。その逆も真である。従って、発現レベル調節遺伝子と標的遺伝子の両方の発現レベルが同時に低下又は増大するような場合、その変化は、概して細胞の代謝活性の変化によると思われ、そして標的遺伝子のディファレンシャルな発現によるものではないと思われる。反対に、標的遺伝子及び発現レベル調節遺伝子の発現レベルが同時に変動しない場合、標的遺伝子の発現レベルの変動は、その遺伝子の発現の差異に起因し、そして細胞の代謝活性の全体的な変動には起因しない。
標的RNAの検出は、プライマー/プローブに対するハイブリダイゼーションによりアレイ中の部位上で捕獲された標的RNAの逆転写によって生成したポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを検出することにより実施される。逆転写されたcDNA第一鎖は、プライマー/プローブの伸長によって形成され、そして伸長されたcDNA鎖は、放射性同位体、化学発光化合物、重金属原子、分光学的マーカー、磁気マーカー、連結された酵素、蛍光標識等で標識されうる。1つの態様において、dNTPは、合成されたcDNA鎖が標識されるように標識される。標識された部分は、シグナル産生系のメンバーを含んで成り、そしてその結果、直接的に又はシグナル産生系の1又は複数の追加のメンバーと組み合わせて、検出可能である。直接的に検出可能な標識の例には、通常共有結合により、ヌクレオチドモノマー内に取り込まれた同位体及び蛍光部分が含まれる。注目の同位体標識には、32P,33P,35S,3H,14C,125I等が含まれ、そして非同位体標識には、ビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、5−ブロモデスオキシウリジン、フルオレセイン等が含まれる。標識は、当業界で周知の手順、例えば非同位体的方法による直接的又は間接的に検出可能なマーカーにより、例えば質量分析標識、蛍光色素又は酵素を介して、あるいは核酸フラグメントを免疫化学的に検出可能にする種々の化学的修飾により、あるいは他の親和性反応により導入されうる。
標的及びプローブは、ポリヌクレオチドプローブを固定する方法であって:固形支持体表面と安定して会合するプローブとポリヌクレオチド標的とを組み合わせる段階であって、ここで、当該プローブと標的は相補的な鎖を含んで成り、当該プローブと標的とがハイブリダイズし、そして標的RNAがそれにより固定化される条件下で組み合わせる段階;ハイブリダイズしたプローブを逆転写酵素で伸長させる段階、及び逆転写産物を検出する段階、を含んで成る方法、において使用される。
プライマーに対するハイブリダイゼーションによりマイクロアレイ上に固定された標的RNAの逆転写により生成された産物は、DNA−RNAハイブリッド二本鎖である。好ましくは、RNアーゼHネガティブな逆転写酵素の使用は、生じたDNA−RNAハイブリッドを安定化させる。蛍光技術も核酸ハイブリッドの検出のために知られている。米国特許第5,691,146号は、標的核酸配列とハイブリダイズしない限り蛍光消光している蛍光ハイブリダイゼーションプローブの使用を記載している。米国特許第5,723,591号は、標的核酸配列に対してハイブリダイズするまで、あるいは当該プローブが消化するまで蛍光消光している蛍光ハイブリダイゼーションプローブを記載している。
本発明の1つの態様において、逆転写によって生成するcDNA鎖は、PCR in situによって更に増幅される。PCRのために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の実施に必要な試薬と混合された適切な標的ポリヌクレオチドを含んで成る反応混合物は、固形の支持体上にそれぞれ固定されたcDNA:RNAハイブリッドと接触して据えられる。適切な標的ポリヌクレオチドは、RNA鋳型の逆転写によって生成する一本鎖cDNA、又は、PCR増幅が逆転写検出反応と連結される場合にはmRNA試料、であってもよい。反応混合物は、標的の鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖の合成を容易にするために酵素、例えばポリメラーゼを含む。適当なポリメラーゼには、熱安定性ポリメラーゼ酵素、例えばTaq DNAポリメラーゼ、Tth1 DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、及び熱安定性逆転写酵素が含まれる。反応混合物はまた、ポリメラーゼ連鎖反応の間に、増幅産物がPRCR後に固形の支持体上で検出されるように新生鎖内に取り込むことができる標識分子を含むことがある。当該標識は、当業界で周知の方法に従い、直接又は間接的に検出されうる。
更に提供されるものとして、本発明を実施するためのキットがあり、当該キットには、プライマー−プローブ因子が別個のヌクレオチド配列及びスタンダードのポリヌクレオチド配列を含むように製作された1又は複数のマイクロアレイ、当該スタンダードの配列に対する標識されたスタンダードの相補体、及び対象の方法を実施するための教材、が含まれる。当該キットは更に、対象の発明の遺伝子発現を実施するのに必要な1又は複数の追加の成分を含んでもよく、ここで、そのような追加の成分には、酵素、例えばポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、dNTP、緩衝液等が含まれる。当該キットは、例えば他の方法では固形の支持体上で検出することが困難な多数の標的ポリヌクレオチドを検出するための材料及び試薬を含んでもよい。当該キットは、例えば固形の支持体、標的ポリヌクレオチドの特異的集合のためのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ連鎖反応試薬及び成分、例えば、DNA合成のための酵素、標識材料、並びに洗浄のための緩衝液及び試薬、を含んでもよい。当該キットはまた、固形の支持体上で特異的な標的を増幅するための当該キットの使用のための説明書を含むことがある。当該キットが、固形の支持体上にプライマーセットが既に固定されている調製済みの固形の支持体を含む場合、そのような固形の支持体は、消費者が検出することを望む標的ポリヌクレオチドに依存して、個々のキットについて特注されてもよい。当該固形の支持体は、当該固形の支持体上の指定された位置に貼り付けられたプライマーを提供する。
細胞はしばしば、後期の対数増殖期に収集される。RNAは、チオシアン酸グアニジン法(Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem. 162(1): 156-159 (1987))によって単離される。RNA単離後、核酸はエタノール沈殿される。沈殿物は遠心によりペレット化され、そして水で再溶解される。再溶解された核酸は、RNアーゼを含まないDNアーゼI(Boehringer Mannheim, Inc.)を用いて、取扱説明書に従い消化され、続いてフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で有機抽出され、そしてエタノールで再沈殿される。
SuperAldehyde(Arraylt(商標))表面に対して一本鎖核酸及び二本鎖核酸をプリントし、そして付着させるためのプロトコールは、基板表面上で反応性アルデヒドとシッフ塩基共有結合を形成する第一級アミンで修飾されたDNAを使用し:(1)最初に、C6アミノ修飾(Glen Research)が各オリゴヌクレオチドの5’末端に付着し;(2)アミノ連結DNAを1倍Micro-Spotting Solution Plus (TeleChem)中で再懸濁し;(3)アミノ連結DNAをSuperAldehyde基板(Arraylt(商標))上にStealth Micro-Spotting Pin (TeleChem)を用いてプリントし;(4)基板を12時間室温(〜25℃)、30%の相対湿度で乾燥させ;(5)基板を2回0.2%SDS中で2分間室温で激しく振とうしながらすすいで結合しなかったDNAを除去し;(6)基板を2回脱イオン水中で2分間室温で激しく振とうしながらすすぎ;(7)基板を95〜100℃の脱イオン水中に2分間移し、DNAを変性させ;(8)基板を室温で〜5分間冷却させ;(9)基板を水素化ホウ素ナトリウム溶液で5分間室温で処理して、遊離アルデヒドを減らし(水素化ホウ素ナトリウム溶液を調製するためには、1.5gのNaBH4(Sigma)を450mlのリン酸緩衝液(PBS)に溶解し、続いて133mlの100%エタノールを添加して泡立ちを減らし、そして使用直前に調製する);(10)基板を3回0.2%SDS中で1分間それぞれ室温ですすぎ;(11)基板を1回脱イオン水中で1分間室温ですすぎ;(12)プリントされた基板を500xgで1分間の遠心により乾燥させる。処理された基板は、適切な条件下で保存した場合、1年間室温で安定である。プリントされたマイクロアレイは、続いて標的RNA試料と反応させられる。マイクロアレイ反応は、カバースリップ1cm2あたり2.0μlの体積でガラスのカバースリップのもと最も良く実施される。核酸のハイブリダイゼーション反応のために、緩衝液は典型的に5xSSC又は6xSSPE及び0.1%SDSを含み、且つ標的及びプローブの性質に依存して37℃〜65℃で実施される。
RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)は、第一鎖cDNAの合成段階に使用される。適当なDNAポリメラーゼの例には、好熱性細菌、古細菌、レトロウイルス、酵母、ニューロスポラ、ショウジョウバエ、霊長類及びげっ歯類を含む生物由来のDNAポリメラーゼが含まれる。
本発明の1つの態様において、熱安定性逆転写酵素(RT)は、一連の変性及び再生段階を通じて検出可能な一群のリニア増幅に使用される。更に、熱安定性ポリメラーゼの使用は、高温で逆転写を起こしてRNAの二次構造の効果を軽減させ、そしてそれにより追加の検出可能標識の取り込みを可能にする。
ハイブリダイゼーションは、約12,000個の特徴を含むHO5(商標)マイクロアレイチップ(Mergen Ltd., San Leandro, Calif.)上で実施された。それぞれの特徴は、長さがそれぞれ30ヌクレオチドであり且つ特異的なRNA鎖と相補的な配列とハイブリダイズするよう設計された均一なオリゴヌクレオチド群である。これらの30量体はチップと離して合成され、そして末端アミン基を有する炭化水素リンカーがオリゴヌクレオチドの5’末端に付着された。オリゴヌクレオチドは、その結果、オリゴヌクレオチドの5’末端を介して形成したシッフ塩基によって基板上のアルデヒド基と共有結合的に付着し、逆転写酵素によるプライマー伸長に利用可能なように3’末端を遊離させている。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、天然の「センス」RNA鎖にハイブリダイズすることができるような相補的「アンチセンス」鎖の配列を含んで成る。
2.0xSSC+0.1% SDS 42℃ 10分間 2回
0.2xSSC 37℃ 10分間
0.1xSSC 37℃ 10分間
4μlの5xRT緩衝液
2μlの0.1Mジチオスレイトール(DTT)
2μlのAMV逆転写酵素
1μlの10mM dATP
1μlの10mM dGTP
1μlの10mM dTTP
6μlの1mM dCTP
3μlの1mMビオチン−14−dCTP
を含んで成る反応混合物中、アレイ上で実施された。
ハイブリダイゼーションは、約12,000個の特徴を含むHO5(商標)マイクロアレイチップ(Mergen Ltd., San Leandro, Calif.)上で実施される。それぞれの特徴は、長さがそれぞれ30ヌクレオチドであり且つ特異的なRNA鎖と相補的な配列とハイブリダイズするよう設計された均一なオリゴヌクレオチド群である。これらの30量体はチップと離して合成され、そして末端アミン基を有する炭化水素リンカーがオリゴヌクレオチドの5’末端に付着される。オリゴヌクレオチドは、その結果、オリゴヌクレオチドの5’末端を介して形成したシッフ塩基によって基板上のアルデヒド基と共有結合的に付着し、逆転写酵素によるプライマー伸長に利用可能なように3’末端を遊離させる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、天然の「センス」RNA鎖にハイブリダイズすることができるような相補的「アンチセンス」鎖の配列を含んで成る。
2.0xSSC+0.1% SDS 42℃ 10分間 2回
0.2xSSC 37℃ 10分間
0.1xSSC 37℃ 10分間
4μlの5xRT緩衝液
2μlの0.1Mジチオスレイトール(DTT)
2μlのRetroAmp(商標)熱安定性RT(Epicentre; 又はAMV RT)
1μlの10mM dATP
1μlの10mM dGTP
1μlの10mM dTTP
6μlの1mM dCTP
3μlの1mMビオチン−14−dCTP
を含んで成る反応混合物中、アレイ上で実施される。
(a)94℃で2分間維持し;
(b)4℃で5分間維持し;そして
(c)42℃で60分間維持する。
Claims (26)
- 試料中の標的RNAを検出する方法であって。
(a)当該標的RNAと相補的な配列を含んで成るDNAプライマーを含んで成るアレイを準備し;
(b)当該プライマーとRNA試料とを、当該プライマーと標的RNAとの間の特異的なハイブリダイゼーションを促進する条件下で接触させ;
(c)プライマー−RNAヘテロ二本鎖と熱安定性逆転写酵素とを、当該RNAのcDNAへの逆転写を可能にする条件であって、検出可能な標識が当該cDNA内に取り込まれるような条件下でインキュベートし;そして
(d)前記熱安定性逆転写酵素により合成された新生cDNA鎖内に取り込まれた検出可能な標識を検出すること、を含んで成り、更に、(c)と(d)の間で少なくとも2サイクルのハイブリダイゼーションと逆転写を、RNA:cDNA二本鎖の融点より高い温度を含んで成る条件下で実施すること、を含んでなり、ここで、前記cDNAにおける標識の存在が、試料中の標的RNAの存在を示唆する、方法。 - (e)試料細胞中の標的RNAの存在又は不在を、参照細胞のものと比較すること、
を更に含んで成る請求項1に記載の方法。 - (e)試料細胞中の標的RNAのレベルを決定し、そして参照細胞におけるレベルと比較すること、を更に含んで成る請求項1に記載の方法。
- 多数のDNAプライマーが試料中の多数の標的RNAを検出するのに準備され、ここで、各プライマーが異なる標的RNA分子と相補的であり、そして各プライマーが固形の支持体上の別個の且つ同定可能な位置にある、請求項1に記載の方法。
- 検出可能な標識が、放射標識された分子、蛍光分子、及び色素生産性分子、から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 検出可能な標識が修飾されたヌクレオチド内に取り込まれ、更に、当該修飾されたヌクレオチドが鎖終結ヌクレオチドではない、請求項5に記載の方法。
- 検出可能な標識が、放射性標識されたdNTP、フルオロ−dNTP、ビオチン化されたdNTP又はジゴキシゲニン−dNTPのうちの少なくとも1つである、請求項6に記載の方法。
- 検出可能な標識が、新生のポリヌクレオチド内に取り込まれた第二の標識と結合する分子と複合される、請求項1に記載の方法。
- アレイが少なくとも100〜少なくとも1,000,000のプライマーを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- アレイが、少なくとも1,000のプライマーを含んで成る、請求項9に記載の方法。
- 試料が細胞由来であり、且つ少なくとも1つの標的RNAの存在が、感染、病状、病状に対する素因、発生上の状態、物理的状態、化学的状態及び生物学的状態、から成る群から選択される状態を示唆する、請求項1に記載の方法。
- 試料が細胞由来であり、且つ少なくとも1つの標的RNAの不在が、感染、病状、病状に対する素因、発生上の状態、物理的状態、化学的状態及び生物学的状態、から成る群から選択される状態を示唆する、請求項1に記載の方法。
- プライマーが基板上に固定されている、請求項1に記載の方法。
- プライマーが、当該プライマーの3’末端が遊離するように、共有結合により基板上に固定されている、請求項13に記載の方法。
- 共有結合が、シッフ塩基、光開裂可能な結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、及び選択的に放出可能な結合、から成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
- プライマーが、当該プライマーの3’末端が遊離するように非共有結合的なカップリングにより基板上に固定されている、請求項13に記載の方法。
- 非共有結合的なカップリングが、静電的相互作用、水素結合、抗体−抗原カップリング、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインA−IgG抗体Fcフラグメント相互作用、及びストレプトアビジン/プロテインAキメラ、から成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 基板が、プラスチック、セラミック、ナイロン、ポリエステル、金属、樹脂、ゲル、メンブレン、ニトロセルロース膜、板、ビーズ、薄膜、ガラス、シリンダー、タグ付きビーズ、磁気ビーズ、光ファイバー、及び繊維織物、から成る群から選択される、請求項13に記載の方法。
- RNA試料が生物学的供給源から単離される、請求項1に記載の方法。
- RNA試料が生物学的供給源からの単離後に増幅される、請求項19に記載の方法。
- RNA試料がin vitroでの転写によって調製される、請求項1に記載の方法。
- RNA試料が少なくとも1つの発現調節RNAを含んで成る。請求項1に記載の方法。
- プライマーがDNA依存性RNAポリメラーゼのプロモーター配列を更に含んで成る、請求項1に記載の方法。
- DNA依存性RNAポリメラーゼが、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラーゼから成る群から選択される、請求項23に記載の方法。
- (e)in situで実施されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってcDNA鎖を増幅させること、を更に含んで成る、請求項1に記載の方法。
- PCR反応が、Taq DNAポリメラーゼ、Tth1 DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、又は熱安定性逆転写酵素を用いて実施される、請求項25に記載の方法。
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