JP2002505080A - オリゴヌクレオチド固定化pcrマイクロプレート上での直接rt−pcr - Google Patents
オリゴヌクレオチド固定化pcrマイクロプレート上での直接rt−pcrInfo
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Abstract
Description
伝子発現を分析するための一般的技術となっている(Kawasaki ES, Wang AM, "D
etection of gene expression: Erlich, EA. PCR technology", New York: Stoc
kton, 1989;89-97)。さらに、最近利用可能になった組み換えTth熱安定性ポリメ
ラーゼは逆転写酵素およびDNAポリメラーゼの両方の活性を有することから、両 方のステップを単一の試験管中で緩衝液系を変えることなく同時に行うことがで
きる(Myers TW, Gelfand DH, "Reverse transcription and DNA amplification
by a Thermus thermophilus DNA polymerase", Biochemistry 1991:30:7661-6) 。しかし、この場合も細胞および組織からの全RNAまたはmRNAの精製がやはり必 要であることから、時間のかかる困難な処理操作ステップがさらに要求される。
(登録商標)、日立化成工業(株)およびAGCT、Irvine, CA) (Mitsuhashi M, et
al., "Gene manipulation on plastic plates", Nature 1992:357:519-20, Miur
a Y, et al., "Fluorometric determination of total mRNA with oligo(dT) im
mobilized on microtiter plates", Clin Chem 1996:42:1758-64, Miura Y, et
al., "Rapid cytocidal and cytostatic chemosensitivity test by measuring
total amount of mRNA", Cancer Lett 1997:116:139-44)によって捕捉して、次
いでプレート上での一本鎖および二本鎖cDNA合成を行うこと(Tominaga K, et a
l., "Colorimetric ELISA measurement of specific mRNA on immobilized-olig
onucleotide-coated microtiter plates by reverse transcription with bioti
nylated mononucleotides", Clin Chem 1996:42:1750-7)に成功したことが報告 された。二本鎖cDNAがGENEPLATE(登録商標)のPSマイクロプレート上に形成され ると、センス鎖cDNAを除去して、複数のPCR実験のための鋳型として用いること ができる (Ishikawa T, et al., "Construction of cDNA bank from biopsy spe
cimens for multiple gene analysis of cancer", Clin Chem 1997:43:764-70) 。残念なことに、PCRサイクル中の変性ステップにおける熱不安定性のために、P
CRはこのPSマイクロプレート上で行うことができない。 熱安定性ポリプロピレ ン(PP)の管およびマイクロプレートがPCRのための本来の容器であるが、その 表面が化学的に極めて安定であるために、PP表面にオリゴヌクレオチドを固定化
することは難しい。しかしオリゴ(dT)-固定化ポリプロピレンプレートが最近入 手可能になった。
な技術である(Bortolin S, et al., "Quantitative RT-PCR combined with time
-resolved fluorometry for determination of BCR-ABL mRNA", Clin Chem 1996
:42:1924-9)。 しかし、RT-PCRの分析には、細胞収集、RNA/mRNAの精製、cDNA合
成、PCRおよびPCR産物の定量などの多くのステップが関与する。とくに、完全な
RNA分子の精製はRT-PCRの成功を決定する第一のステップであり、これには細胞 および組織中の内因性または外来性リボヌクレアーゼ(RNase)を排除または不 活性化するための作業集約的な多数の操作が要求される。最近のPCR技術によっ て、研究者は、増幅されたPCR産物のインラインまたはオフラインの種々の確認 法を用いてPCR産物の量を連続的にモニターすることができる(Morris T, et al
., "Rapid reverse transcription-PCR detection of hepatitis C virus RNA i
n serum by using the TaqMan fluorogenic detection system", J Clin Microb
iol 1996:34:p2933-6, Wittwer CT, et al., "The LightCycler: A microvolume
multisample fluorimeter with rapid temperature control", BioTechniques
1997:22:171-181)が、簡便なRNA調製システムの欠如がRT-PCRの完全自動化を妨
げている。
に固定化してPCRの熱サイクルに供することができるオリゴヌクレオチド固定化 マイクロプレート(PCRマイクロプレート)を用いることによって、mRNAの捕捉 と逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を同一プレート上で行うことができ る。従来、マイクロプレートは不十分な熱安定性のためにPCRに使用されたこと はなく、したがって、RT-PCRプロセスには長時間と集約的処理作業が要求された
。ポリプロピレン、ポリオレフィンまたはポリカーボネートなどで作られたPCR マイクロプレートに使用においては、それらの蛍光特性のために、固定化したオ
リゴヌクレオチド、ハイブリダイズしたmRNAおよび合成したcDNAは、核酸染色を
用いる蛍光測定によって、または蛍光または化学ルミネセンスを発生させること
によって酵素的に定量される。PCRマイクロプレートはまた、RNAまたはmRNAを精
製することなく粗細胞溶解物からmRNAを捕捉することができる。
たは逆転写とそれに続くPCRを用いるツーステップRT-PCRに有効に用いることが できるが、ツーステップRT-PCRはワンステップRT-PCRよりも驚異的に高い感度を
示す。これは、ワンステップRT-PCRが、最初にPCRマイクロプレートからmRNAを 解離させることによってより効率的な液相反応において行われるのに対して、ツ
ーステップRT-PCRは非効率的な固相逆転写反応を要求することから、驚くべきこ
とである。
ライマーを使用することによってcDNAの異なるまたは同一の部分が複数回増幅で
きる。複数のPCRをPCRマイクロプレート上のcDNAから合成するこのマルチプル-P
CRシステムは、将来の自動化への適用の可能性とともに、基礎研究、診断、およ
び薬物スクリーニングにおいて有用である。
れは長時間および集約的処理作業を要求するだけでなく、回収mRNA量を変動させ
る。本発明において、PCRマイクロプレートと組み合わせて、標的細胞をフィル ター面にむらなく配してから細胞を乱すことなく溶解用緩衝液をフィルター上の
細胞層を通過させることによって、細胞溶解物の調製を抜本的に簡略化し、回収
サイトゾル(cytosolic)RNAの収量を有意に安定化することが可能である。マイク
ロプレートとフィルタープレートが直接RT-PCR用のキットとして供給できれば、
極めて便利である。上記において、溶解用緩衝液、洗浄用緩衝液、RT-PCR/PCRの
ための試薬、およびPBSは市販されているか、容易に調製することができるので 、キットに必ずしも含める必要はない。しかし、便宜のために、フィルタープレ
ート上の細胞層を通した時に、細胞に存在するサイトゾルmRNAを放出させるため
の溶解用緩衝液はキットに含ませてもよい。上記において、溶解用緩衝液は、細
胞膜を破壊するが核を無傷に維持するマイルド(mild)な界面活性剤、および、RN
ase活性を阻害するかRNase活性を不活化する試薬からなり、ハイブリダイゼーシ
ョンのためのpHおよび塩濃度を有する。
は、将来の自動化への適用の可能性とともに、基礎研究、診断、および薬物スク
リーニングを含む種々の分子分析において極めて有用である。
レート)を用い、mRNAの捕捉と逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を同一プレ
ート上で行うことができる。PCRマイクロプレートはまた、RNAまたはmRNAを精製
することなくmRNAを粗細胞溶解物から捕捉することができる。マイクロプレート
を用いるPCRを可能にしたものは、その上にオリゴヌクレオチドを確実に固定化 できてPCR熱サイクルに供することができるPCRマイクロプレートの使用である。
例えば、GENEPLATE(登録商標)(AGCT、Irvine, CA)のような従来のオリゴヌク レオチド固定化ポリスチレンマイクロプレートは、ポリスチレンの熱安定性が低
いためにPCRに使用できない。本発明において使用可能なPCRマイクロプレートに
は、ポリプロピレン、ポリオレフィン、またはポリカーボネートなどで作られた
オリゴヌクレオチド固定化マイクロプレート、およびPCRの熱サイクルにおいて 用い得る熱耐性ポリマーまたは樹脂で作られた他のマイクロプレートが含まれる
が、これらに限定はされない。上記のうち、ポリオレフィンマイクロプレートは
、オリゴヌクレオチドの確実な固定化を可能にする表面特性のために、好ましい
と考えられる。マイクロプレート上に固定化されるオリゴヌクレオチドには、オ
リゴ(dT)およびmRNAまたは標的RNAに特異的な他のオリゴヌクレオチドが含まれ るが、これらに限定はされない。適切な配列は、HYBsimulatorTMソフトウェア(
AGCT、Irvine, CA)を用いて、GenBank霊長類データベースに対するハイブリダ イゼーションシミュレーションを用いて同定することができる(Mitsuhashi M, e
t al., "Oligonucleotide probe design - a new approach", Nature 1994:367:
759-61, Hyndman D, et al., "Software to determine optimal oligonucleotid
e sequences based on hybridization simulation data", BioTechniques 1996:
20:1090-7)。また、米国特許第5,556,749号(1996年9月17日、Mitsuhashi M, e
t al.)の「オリゴプローブ・デザインステーション:最適DNAプローブのデザイ
ンのためのコンピュータ化した方法(Oigo probe designstation: a computeriz
ed method for designing optimal DNA probes)」を参照されたい。固定化オリ
ゴヌクレオチドの量を、ウェル当たり10〜100ピコモルまでに高くすることがで きる(通常10〜30ピコモル)。
易に固定化することができない。しかし、最近、いくつかの製造業者が分子生物
学的適用のためのPCRマイクロプレートを生産し、これによって研究者は高処理 量(high throughput)PCRを行うことができるようになった。加えて、ヒタチ・ケ
ミカル・リサーチ・センター(Hitachi Chemical Research Center、Irvine, CA
)のような会社は、任意の市販のPCRプレートを、オリゴヌクレオチドをその上 に固定化できるように前処理することができる。したがって、このオリゴヌクレ
オチド固定化ポリプロピレン(またはポリオレフィンまたはポリカーボネート)
プレートは、最近入手可能になっている (AGCT、Irvine, CA)。
において広く使用されるPCRマイクロチューブのように、PCRマイクロプレートは
、タンパク質およびDNA/RNAの非特異的吸収容量が低く、有機化学物質(すなわ ち、フェノール/クロロホルム)に対する耐性を有する。これらの特徴は、オリ
ゴヌクレオチドがその上に固定化されても維持され得る。
RNA、tRNAまたはDNAになくmRNAに厳しく限定されることであり、この特異性によ
って、セルロースやビーズが検出可能量のrRNA、tRNAおよびDNAをしばしば含む のに対して、混入したゲノムDNAからの偽PCR増幅の潜在的問題が排除される。さ
らに、ウェル間およびプレート間の変動が少なく、安定性に優れ、種々の品質管
理プロトコールが利用できることは、この技術を極めて卓越したものにしている
。
ることが示されてきたが、これには全mRNAおよび特異的mRNAの捕捉、ss-cDNAお よびds-cDNA合成、特異的mRNAの定量、およびセンスおよびアンチセンスmRNA合 成が含まれる。オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートはまた、PSマイ クロプレートと同じ目的のためにも使用できる。米国特許第5,656,462号(1997 年8月12日発行、Keller C, et al.)の「ポリヌクレオチド固定化サポートの合
成法(Method for synthesizing polynucleotide immobilized support)」を参
照されたい。
等の染料の蛍光測定はPSマイクロプレートよりもPCRマイクロプレートにおける 方が良い結果を示した(Ogura M, Mitsuhashi M, "Screening method for a larg
e quantity of polymerase chain reaction products by measuring YOYO-1 flu
orescence on 96-well polypropylene plates", Anal Biochem 1994:218:458-9)
。さらに、ここに参考文献として添付した米国特許第5,545,528号(1996年8月1
3日発行、Mitsuhashi M, et al.)の「ポリプロピレンプレートにおける遺伝子 増幅産物の迅速スクリーニング法(Rapid screening method of gene amplifica
tion products in polypropylene plates)」も参照されたい。これによって、 種々の分析が極めて容易に行うことができる。例えば、双方の固定化オリゴヌク
レオチド、すなわち捕捉されたmRNAおよび合成されたcDNAの量を、放射性物質を
使用せずに蛍光測定によって測定することができる。
のために、固定化オリゴヌクレオチド、ハイブリダイズされたmRNA、合成された
cDNAおよびPCR産物が、核酸染色を用いて蛍光測定によってまたはATTOPHOSTMま たはLUMIPHOSTMなどの蛍光または化学ルミネセンスを発生させることによって酵
素的に定量される。核酸染料には、1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジア ザウンデカメチレン)−ビス−4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3− オキサゾル)−2−メチリデン]−キノリウメトライオダイド(YOYOTM-1)、1,1'−(
4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカメチレン)−ビス−4−[3−メチル
−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−チアゾル)−2−メチリデン]−キノリウメトラ
イオダイド (TOTOTM-1)、1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカ
メチレン)−ビス−4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−チアゾール)
−2−プロペニリデン]−キノリウメトライオダイド (TOTOTM-3)、SYBR(登録商標
)-Green I、 IIおよび PicoGreen(登録商標)からなる群から選択される蛍光染料
が含まれるが、これらには限定されない。さらに、上記の米国特許第5,545,528 号を参照されたい。
またはポリカーボネートプレートは最近入手可能となっている。
PLATE(登録商標)-PP(ヒタチ・ケミカル・リサーチ・センター(Hitachi Chemic
al Research Center)、Irvine, CA) を用いた。しかし、オリゴヌクレオチド固
定化PCRマイクロプレートは上記には限定されず、オリゴヌクレオチドが確実に 固定化され、かつPCRの熱サイクルに供することができるオリゴヌクレオチド固 定化マイクロプレートであればいかなるものでもよい。
T-PCRとツーステップRT-PCRである。ワンステップ RT-PCRにおいては、rTthポリ
メラーゼ、または逆転写酵素とDNAポリメラーゼとの最適組み合わせ(TitanTM、 ワンチューブRT-PCRキット、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) を用い て、RT-PCRをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上で緩衝液を交換 することなく行うことができる。他のワンステップRT-PCRとしては、mRNAと固定
化したオリゴ(dT)とのハイブリダイゼーションによってmRNAを捕捉した後、mRNA
をRT-PCR緩衝液に移して、RT-PCRを行うことができる。これに対して、ツーステ
ップ RT-PCRにおいては、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のハ
イブリダイゼーションの後、捕捉されたmRNAを同一マイクロプレート上でcDNAに
逆転写して、反応物を吸引によって除去してから、熱安定性のDNAポリメラーゼ 、例えばrTthやTaqポリメラーゼを適当な緩衝液とともに用いることによってPCR
を行うことができる。上記において、PCRは、サーマルサイクラー中で、ハイブ リダイゼーションで用いたのと同一のオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプ レートを用いて、例えば、変性(94℃、1分間)、アニーリング(60℃、1分間
)、続いて伸長(72℃、1分間)を60サイクル繰り返して行った。 PCR効率の点
から見るとワンステップすなわち液相RT-PCRがツーステップRT-PCRよりも優れて
いることが当業者には予期されると考えられる。しかし、驚いたことに、オリゴ
ヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上で合成されたcDNAからPCR(ツーステ
ップRT-PCR)を行うと、RT-PCRは従来のワンステップRT-PCRよりも感度が約10,0
00倍向上し、100個の細胞しか含まない細胞溶解物からも転写を検出することが できる。ワンステップRT-PCRがmRNAをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプ レートから最初に解離させることによってより効率的な液相反応において行われ
るのに対して、ツーステップRT-PCRは非効率的な固相逆転写反応を要求すること
から、これは極めて意外である。一つの説明として次のようなことがある。すな
わち、逆転写中にプライマーがダイマー形成のために使用されると考えられる。
ワンステップPCRではツーステップRT-PCRよりもより多くのプライマーダイマー が形成される。ツーステップRT-PCRではワンステップRT-PCRよりもハイブリダイ
ゼーション効率は低いが、最初の逆転写相中に形成されたプライマーダイマーは
ツーステップRT-PCRにおけるPCR全体に存在し、これによってRT-PCR感度が著し く高まる。
る。すなわち、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のcDNAは極め て安定である。この興味ある性質は、適切なプライマーを用いることによって、
係るcDNAの異なるまたは同一部分を多数回増幅するために同じ固定化cDNAによる
再増幅を可能にする。オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のcDNA から複数のPCRを合成するこのマルチプルPCRシステムは、将来の自動化への適用
の可能性とともに、基礎研究、診断、および薬物スクリーニングにおいて有用で
ある。
放出させてから、遠心分離することによって調製される。上清をハイブリダイゼ
ーションに用いる。この激しい均質化プロセスは、長時間と集約的作業処理を要
求するばかりではなく、回収mRNA量を変動させる。細胞を機械的に均質化するこ
となく、細胞をフィルター膜にむらなく配してから溶解用緩衝液をフィルター膜
上の細胞層を通過させることによって、細胞溶解物の調製を抜本的に簡略化し、
かつ回収サイトゾルRNAの収量を有意に安定化することが可能である。
セス全体を簡略化するために、細胞をフィルタープレートに移して、減圧吸引、
陽圧または遠心分離によってその膜に捕捉する。次いで、フィルタープレートを
多数のウェルを有するオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートの上部に 設置して、各ウェルに溶解用緩衝液を加えて、細胞膜をゆるやかに破壊する。こ
れらツープレートサンドイッチを遠心分離した後、サイトゾルmRNAを含む細胞溶
解物をオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートにハイブリダイゼーショ ンのために移す。室温で1時間ハイブリダイゼーションした後、例えば、RT-PCR
を自動化器械中で行う。上記において、フィルタープレートのフィルターまたは
膜には、膜から細胞が漏れることなく標的細胞が捕捉されるがサイトゾルmRNAは
通過できるような孔サイズを有する、グラスファイバー、ポリプロピレンまたは
ポリオレフィンメッシュ、ウール、および他の膜が含まれるが、これらには限定
されない。例えばグラスファイバー (グレード934AH、Cambridge Technology、I
nc. Watertown, MA) または Whatman GF/Fグレードグラスファイバー膜を用いて
、ほとんどの培養細胞および血液白血球を捕捉することができる。上記において
、グラスファイバープレートが好ましい。さらに、フィルタープレートをオリゴ
ヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートの上部に設置することから、フィルタ ープレートの構造は、例えば、ウェル数に関して、オリゴヌクレオチド固定化PC
Rマイクロプレートの構造に対応する必要があり、そこではフィルタープレート のウェルは遠心分離にかける時にオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレー トの各ウェルと連通している。ウェル当たりの細胞の最大容量は通常、104〜107 個である。
してフィルタープレートの膜を通過させることができる。細胞溶解物を膜を通し
て通過させるのに必要な力は、簡単な実験によって容易に決定することができる
。
にハイブリダイゼーションのためのpH調整剤および塩を含む。上記において、RN
aseは、溶解用緩衝液中で活性でなくてはならない。さらに、核の混入を防ぐよ うに細胞膜を穏やかに破壊するために、マイルドな界面活性剤の使用が好ましい
(例えば、NP-40またはTRITONTM-X)。上記した溶解用緩衝液は有用であり、フィ
ルタープレートを使用することなくオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレ ートのために使用することができる。
れない。
ルタープレートに移す。 3.フィルタープレートを減圧吸引して、細胞を膜上に捕捉する。 4.各ウェルを、例えば、各50μlのPBSを用いて、1または2回洗浄する( 任意)。
めのオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに移す。 1.フィルタープレートを減圧マニホルドから取り出して、オリゴヌクレオチ
ド固定化PCRマイクロプレートの上部に設置する。 2.例えば、50μlの溶解用緩衝液(例えば、10 mMトリス、pH 8.0、1mM ED
TA、0.5 M NaCl、0.5% NP-40、20 mMバナジルリボヌクレオシド複合体;RNase を含まない)を加えて、例えば、1,500×gで10分間遠心分離する。 3.固定化されたオリゴ(dT)と細胞のサイトゾル分画に存在するmRNAのポリ
(A)テールとのハイブリダイゼーションのために、オリゴヌクレオチド固定化
PCRマイクロプレートを室温で1時間インキュベートする。
EDTA、0.3 M NaCl;RNaseを含まない)を用いて、1または2回洗浄する。 2.RT-PCRを開始して、自動化PCR装置におけるPCR産物の量をモニターする。
高処理量の容易に自動化される方法が提供できる。
et al., "A rapid scanning strip for tri and dinucleotide short tandem re
peats", Nucleic Acids Res 1994:22:1701-4)。末梢血細胞または骨髄細胞から のBCR-ABL mRNAの特異的RT-PCR増幅は、残余白血病細胞の検出のための高感度で
定量的な方法を提供する。残余白血病細胞の検出は、CNE治療のための重要な指 標の一つであることから、BCR-ABL mRNAのRT-PCR試験は多くの機関で広く利用さ
れる。しかし、多くの場合、全RNAまたはmRNAが最初に細胞懸濁液から精製され る。本システムを用いた場合、細胞溶解物をハイブリダイゼーションのためにオ
リゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートにいったん適用すれば、ここに記 述した直接RT-PCRのみならず、mRNA全量のYOYOTM-1定量(Miura Y, et al., Cli
n Chem 1996:42:1758-64)をも行うことができ、これによって試験材料の標準化 および品質管理の追加手段が提供され得る。その平易さおよび蛍光的特徴のため
に、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートは、将来の自動化への適用 可能性とともに、とくにフィルタープレートと組み合わせて、基礎研究、診断お
よび薬物スクリーニングを含む種々の分子分析の基盤として受け入れられ得る。
材料および方法は以下の通りである。
EPLATE(登録商標)-PP、Hitachi Chemical Research Center、Irvine, CA)、YOYO TM -1(1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカメチレン)−ビス −4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−オキサゾール)−2−メチ リデン]−キノリウメトライオダイド、Molecular Probes、Eugene, OR)、PCR用
試薬(Taqポリメラーゼ、EZ rTth RNA-PCRキット)(Perkin Elmar、Foster Cit
y, CA)、K562細胞系(American Type Culture Collection、Rockville, MD)、
100 bp DNAラダー、燐酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、バナジルリボヌクレオシド 複合体(VRC)、ウサギグロビンmRNA、細胞培養培地および適切な抗生物質、緩 衝液-飽和フェノール(Gibco-BRL、Geithersburg, MD)、胎児ウシ血清(FBS、H
yClone、Logan, UT)、ビオチン−dUTP(Clontech、Palo Alto, CA)、ATTOPHOS TM (アルカリホスファターゼ基質、JBL Scientific、San Luis Obispo, CA)、c
d4465 DNA (Genome Systems、St. Louis, MO)を表示した供給者から購入した 。MAGEXTRACTORTM用のRNA調製試薬は、東洋紡(大阪)からの好意で提供された 。他の化学物質は全て、シグマ社(St. Louis, MO)から購入した。
l/L EDTA、0.1%NP-40および20 mmol/L VRC)中に氷上で5分間懸濁させて、 サイトゾルmRNAを上記したようにして放出させる(Miura Y, et al., Clin Chem
1996:42:1758-64)。次いで、試料を15,000×gで4℃で5分間遠心分離して、 上清をハイブリダイゼーションのためにGENEPLATE(登録商標)-PPに適用した。実
験によっては、細胞をVRCを含まない溶解用緩衝液に懸濁して、ただちに等量の フェノール/クロロホルムで2回処理して、タンパク質およびヌクレアーゼを吸 収した。次いで、脱タンパクした溶液をハイブリダイゼーションに供した。
プレートをRNAの回収に用いた場合、上記の激しい均質化プロセスは完全に省略 された。培養細胞を、マルチチャネルピペットを用いてグラスファイバープレー
トに移した(後述)。
た。簡略に説明すれば、キットに含まれたカオトロピック剤に細胞ペレットを懸
濁してから、MAGEXTRACTOR中に置いて、そこでRNAをシリカフェライト粒子の表 面に吸着させて、続いて磁気分離した。次いで、RNAを自動的に40μlの低塩緩 衝液に溶出して、使用時まで−80℃で冷凍庫保存した。最終RNAをアガロースゲ ル電気泳動によって分析して、18sおよび28s rRNAバンドを確認した。
:5'-cgtggagaggatgttcttgg-3'、アンチセンス:5'-aacgatatttggaggtcagcac-3'
)およびbcr-abl用プライマー(センス:5'-gaccaactcgtgtgtgaaactcca-3'、ア ンチセンス:5'-aaagtcagatgctactggccgct-3')をHYBシミュレーターTMソフトウ
ェア(AGCT, Irvine, CA)により、GenBank霊長類データベース(Mitsuhashi M,
et al., Nature 1994:367:759-61, Hyndman D, et al., BioTechniques 1996:2
0:1090-7)に対するハイブリダイゼーションシュミレーションを用いてデザイン
した。bcr-ablの場合、センスプライマーはbcrエクソン2に位置し、アンチセン
スプライマーはablエクソン2に位置した。プライマーは、製造者のプロトコル に従ってDNA合成機(380B、Applied Biosystem, Foster City)によって合成し た。
mmol/Lの Mn(OAc)2、各0.5μmol/Lのプライマーおよび0.1μlのrTthポリメ ラーゼを混合して最終容量5〜50μlにして、ヌクレアーゼを含まないミネラル
油(シグマ社)1滴とともに積層した。PCRをサーマルサイクラー(MJ Research
、Watertown, MA)中で、逆転写(60℃、30分間)および変性(94℃、1分間) の1サイクルに続いて、アニーリング/伸長(60℃、1分間)および変性(94℃
、1分間)を40サイクル繰り返して行った。PCR完了後、電気泳動チャンバー中 で0.5μg/ml臭化エチジウムを用いる2.0%アガロースゲル電気泳動を行ってPCR
産物を分析した。写真映像をポラロイドフィルム(667、Cambridge, MA)上に記
録した。
によって、捕捉したmRNAをcDNAに逆転写した。反応物を吸引によって除去して、
rTthまたはTaqポリメラーゼのいずれかを用いてPCRを行った。Taqポリメラーゼ を用いたPCRでは、緩衝液は、1×緩衝液、1.25 mmol/LMgCl2、各300μmol/L のdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、各0.5μmol/Lのプライマーならびに0.5μlTa
qポリメラーゼを最終容量10〜50μl中に含んだ。PCRはサーマルサイクラー(MJ
Research)中で、60サイクルの変性(94℃、1分間)、アニーリング(60℃、 1分間)に続いての伸長(72℃、1分間)によって行った。
Pマイクロプレート(Nunc、Naparville, IL)をAGCT(Irvine, CA)から入手し て、それにオリゴヌクレオチドを固定化した。固定化前後のオリゴヌクレオチド
濃度を、1.0 OD260ユニット=30μg/mlとして測定して、測定値の差から固定化
されたオリゴヌクレオチド量を算出した。別の実験で、YOYO-1をTE(10 mmol/L トリス、pH 8.0、1mmol/L EDTA)で最終稀釈率が1:1000になるように稀釈して 、GENEPLATE(登録商標)-PPマイクロプレートに適用した。蛍光をCYTOFLUORTM 23
00(Millipore、Bedford, MA)によってそれぞれ485 nm(バンド幅20 nm)およ び530 nm(バンド幅25 nm)の励起および放射波長で既述のようにして測定した (Miura Y, et al., Clin Chem 1996:42:1758-64, Miura Y, et al., Cancer Le
tt 1997:116:139-44)。
OD260として測定して、その測定値の差から固定化されたオリゴヌクレオチド量 を算出した(○)。平行実験で、1:1000 稀釈したYOYO-1を各ウェルに加えて、 その蛍光を測定した(●)。棒グラフは適用したオリゴ(dT)20からの固定化割 合(%)を示す。各データの点は3重測定値の平均をとった。オリゴヌクレオチ
ド固定化PCRマイクロプレートは従来のPSプレートと較べると不透明で透過性を 欠くが、図1(●)に示すように、10 pmol以上のオリゴヌクレオチドを適用し た場合は、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートの蛍光は有意に増加 して平坦に達した。オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上に固定化 されたオリゴヌクレオチドの実際量のさらなる定量において、図1(○)に示す
ように、100 pmolのオリゴヌクレオチドを各ウェルに適用した後、21.1 pmolの オリゴヌクレオチドが固定化された。10 pmol以上のオリゴヌクレオチドが適用 された場合、固定化されたオリゴヌクレオチドの量は10〜20 pmolまでに飽和さ れた。適用されたオリゴヌクレオチド(10 pmol)の約69%がマイクロプレート の表面に固定化された(図1、棒グラフ)。
プレートのmRNA特異性を示すグラフで、基質ATTOPHOSTMは、mRNA (●)に対して の特異性がDNA (■)、rRNA (△) およびtRNA (▽)を上回って高いことを示して いる。
図2AにおいてYOYOTM-1を TE(10 mmol/Lトリス、pH 8.0、1mmol/L EDTA)に最
終稀釈率1:1000になるように稀釈して、各ウェルに適用して、蛍光をCYTOFLUORT M 2300で測定した。図2Bにおいて、各ウェルを50μlのcDNA合成用緩衝液(50
mmol/Lトリス、pH 8.3; 75 mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT、各1
0 mmol/LのdATP、dGTP、dCTP、250μmol/Lビオチン-dUTP、および400ユニットの
MMLV 逆転写酵素を含む)中に再懸濁して、37℃で1時間インキュベートした。 各ウェルを洗浄用緩衝液(10 mmol/Lトリス、pH 7.6;300 mmol/L NaClおよび10
mmol/L Tween 20を含む)で3回洗浄した後、1:1000稀釈したストレプトアビジ
ン-アルカリホスファターゼ結合体を含む洗浄用緩衝液50μlを加えて、室温で3
0分間インキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、50μl の基質(ATTOPHOSTM)を加えて、室温で20分間インキュベートした。等量(50μ
l)の100 mmol/L EDTAを添加して反応を終止させてから、蛍光をCYTOFLUORTM 2
300によって測定した。各データの点は、3重測定の平均±標準偏差で示した。
0μgのような多量が適用された場合でも得られなかった。オリゴヌクレオチド 固定化PCRマイクロプレート上の定量的cDNA合成の特異性もまた、上記のように して試験した。図2Bに示すように、有意のATTOPHOSTM蛍光が0.1 ng/ウェル以上
のmRNAを適用したウェルから得られたが、rRNA、tRNAおよびDNAのウェルからは1
0μgのような多量が適用された場合でも増加しなかった。
μgの全肝臓RNAを50μlのハイブリダイゼーション用緩衝液に懸濁して、オリ ゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートのウェルに適用した。室温で1時間 のハイブリダイゼーションの後、ウェルをDEPC水を用いて異なる温度(25℃、55
℃または沸騰温度)で3回洗浄した。次いで、YOYOTM-1を各ウェルに適用して、
蛍光をCYTOFLUORTM 2300によって上記したようにして測定した(Miura Y, et al
., Clin Chem 1996:42:1758-64)。各データの点は3重測定の平均±標準偏差で
示した。図3に示すように、YOYOTM-1蛍光は、沸騰DEPC水を加えることによって
基底レベルまで低下した。
ンmRNA、全肝臓RNAまたは細胞溶解物をハイブリダイゼーション用オリゴヌクレ オチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。次いで、ハイブリダイズしたmRN
Aを沸騰水を加えることによってプレートから回収して、2回目のハイブリダイ ゼーションのために緩衝液(濃度を調整した)を新鮮なオリゴヌクレオチド固定
化PCRマイクロプレートに適用した。平行実験で、既知濃度のグロビンmRNAもま た対照として適用した。次いで、定量的cDNA合成を下記のように行って、溶液中
のmRNA量を標準グロビンmRNAの値に基づいて測定した。cDNA合成量を、Tominaga
ら(Clin Chem 1996:42:1750-7)によって公表されたプロトコルを一部修飾した 方法に従って定量した。簡単に説明すれば、mRNA-ハイブリダイズしたオリゴヌ クレオチド固定化PCRマイクロプレートを50μlのcDNA合成用緩衝液(50 mmol/L
トリス、pH 8.3; 75 mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT、各10 mmol
/LのdATP、dGTP、dCTP、250μmol/Lのビオチン-dUTPおよび400ユニットのMMLV 逆転写酵素を含む)中に再懸濁して37℃で1時間インキュベートした。各ウェル
を洗浄用緩衝液(10 mmol/Lトリス、pH 7.6;300 mmol/L NaClおよび10 mmol/L
Tween 20を含む)で3回洗浄した後、1:1000稀釈したストレプトアビジン-アル カリホスファターゼ結合体を含む洗浄用緩衝液50μlを加えて、室温で30分間イ
ンキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、50μlの基質(
ATTOPHOSTM、1×濃度)を加えて、室温で20分間インキュベートした。等量(50
μl)の100 mmol/L EDTAを添加して反応を終止させてから、蛍光をCYTOFLUORTM 2300(Millipore)によってそれぞれ485 nm(バンド幅20 nm)および560 nm(バ
ンド幅25 nm)の励起および放射波長を用いて測定した。
ブリダイズされた。適用したグロビンmRNAは500 ngが用いられた場合でさえもプ
レートを飽和しなかった。500 ngのグロビンmRNAは21pmolの固定化オリゴヌクレ
オチドと比較して約1〜2pmolに等しい。さらに、mRNA濃度が低い場合は約34〜
48%の全RNAまたは細胞溶解物がプレートによって捕捉されたが、高濃度では捕 捉効率が下がった。これは、おそらく高粘度によるハイブリダイゼーション効率
の低下によると思われる。
されなかったが、これはまた、96ウェルプレートの小表面領域当たり約500μg の全RNAまたは107個の細胞を意味する。これは、大部分の実験には充分以上の量
である。
化PCRマイクロプレートに適用した。室温で1時間ハイブリダイゼーションした 後に、結合しなかった材料をハイブリダイゼーション用緩衝液で2回洗浄するこ
とによって除去し、RT-PCRを同じウェル中で開始した。
7.6、1mmol/L EDTA、0.1% NP-40および20 mmol/L VRC)中に氷上で5分間懸濁 して、サイトゾルmRNAを放出させた。次いで、試料を15,000×gで4℃で5分間
遠心分離して、上清をハイブリダイゼーションのためにオリゴヌクレオチド固定
化PCRマイクロプレートに供した(レーン1)。レーン2では、細胞をVRCを含ま
ない溶解用緩衝液に懸濁して、ただちに等量のフェノール/クロロホルムで2回 処理して、タンパク質/ヌクレアーゼを吸収した。次いで、脱タンパク質した溶 液をハイブリダイゼーションに供した。レーン3では、全RNAを方法の項で記述 したようにして自動化機を用いて調製した。ハイブリダイゼーションの後、RT-P
CRを方法の項で記述したようにして、サーマルサイクラー中で、逆転写(60℃、
30分間)および変性(94℃、1分間)の1サイクルに続いて、アニーリング/伸
長(60℃、1分間)および変性(94℃、1分間)を40サイクル繰り返して行った
。レーン4は対照のcd4465 DNAであった。
たmRNAからうまく増幅され、168塩基対の期待されたサイズを有した。PCR産物の
サイズは、同じ細胞における精製全RNAからのPCR産物のサイズと一致した(図4
A、レーン3)。フェノール/クロロホルム処理細胞溶解物は、 VRC含有細胞溶解
物よりも密なPCR産物を示した(図4A、レーン2)。
は沸騰DEPC水によって除去して、ワンステップRT-PCRを行った。すなわち、図4
Bにおいて、全RNAをハイブリダイズさせた後、ウェルを55℃のDEPC水または沸騰
DEPC水で3回洗浄して、ワンステップRT-PCRを行った。図4Bに示すように、 BC
R-ABL転写のPCR産物は、ウェルを沸騰水で洗浄した場合は消失したが、55℃の水
で洗浄した場合は消失しなかった。これらの結果は、図3の結果に匹敵した。
て、全RNAをハイブリダイズさせた後、cDNAを一つの管(+)で合成して、一つ の管(−)は逆転写をせずに残した。 次いで、Taqポリメラーゼを用いて1.25 m
M MgCl2の存在下で、60サイクルの変性(94℃、1分間)、アニーリング(60℃ 、1分間)に続いての伸長(72℃、1分間)によってPCRを行った。PCR産物を2.
0%アガロースゲル電気泳動で分離した後、臭化エチジウムで染色した。Mkは100
bpのラダーを示す。図4Cに示すように、BCR-ABL転写のPCR産物は、高Mg濃度に
よる低ストリンジェント(stringent)条件下でさえも負の逆転写のウェルから は増幅されなかったが、正の逆転写のウェルからは有意量のPCR産物が得られた 。
tRNAおよびDNAを含むのに対して、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレー
トの利点は特異性がmRNAに限定されていて、rRNA、tRNAまたはDNAに対してない ことで(図2A、2B、4A、4B、4C)、混入ゲノムDNAからの偽PCR増幅の問題の
可能性を除去することができることである。
イブリダイゼーション用のオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適 用した。得られたハイブリダイズしたmRNAをYOYO-1の測定またはrTthポリメラー
ゼを用いるRT-PCRに用いた。すなわち、図5Aおよび図5Bにおいて、種々の数(
0〜6×106)のK562細胞を溶解用緩衝液に懸濁して、ハイブリダイゼーション のためにオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。図5Aにお
いて、ハイブリダイズしたmRNA量をYOYOTM-1蛍光によって上記のように測定した
。平行実験で、捕捉したmRNAを直ちにrTthポリメラーゼを用いるワンステップRT
-PCRに上記のように供した(挿入図上)。図5Bにおいて、別の一連の実験で、 上記のようにして、ビオチン-dUTPの存在下でMMLV逆転写酵素およびプライマー として固定化オリゴ(dT)を用いて、捕捉したmRNAからcDNAを合成した後、cDNA
合成を定量した。平行実験で、ビオチン-dUTPを無標識dTTPで置換することによ ってcDNAをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上で合成して、上記 したようにしてrTthポリメラーゼを用いてPCRを行った(挿入図下)。PCR産物を
2.0%アガロースゲル電気泳動によって分離した後、臭化エチジウムで染色した 。Mは100 bpラダーを表す。各データの点は、3重測定の平均±標準偏差を示し た。
グナルが得られ、これはYOYOTM-1よりも100倍感度が高いことを示唆した。より 有利には、合成したcDNAからPCRをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレー
ト上で行った場合、PCRバンドは10個のような少ない細胞からでも検出された( 図5A挿入図下)。
まない細胞溶解物から検出された(図5A挿入図上)。ワンステップRT-PCRが先 ずmRNAをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートから解離させることに よってより効率のよい液相反応で行われるのに対して、ツーステップRT-PCRは低
効率の固体相逆転写反応を要求することから、これは驚きである。rTthが両実験
で用いられたことから、この違いは酵素によるものではなかった。ツーステップ
PCRに比べてワンステップRT-PCRにおいてより多くのプライマーダイマーが形成 されたことから(図5A上および下挿入図;上挿入図の各レーンの明瞭なバンド はプライマーダイマーを示す)、プライマーは逆転写中のダイマー形成に用いら
れると考えられる。ツーステップRT-PCRにおいては、最初の逆転写相で形成され
たプライマーダイマーがPCRを通して存在するのに対して、これらプライマーダ イマーは反応混合物がcDNA合成からPCRに切り替わったときに除去することがで きる。
の内(intra)-および間(inter)-分析 オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上での定量的分析を行うため に、ウェルとウェルとの間の変動は重要な問題である。100 pmolオリゴヌクレオ
チドをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに固定化のために適用し て、続いて上記したようにして蛍光プレートリーダー中でYOYOTM-1蛍光を測定し
た(図6A、●)。100 ngのウサギグロビンmRNAをハイブリダイゼーションのた めに各ウェルに適用して、続いて上記したようにして蛍光プレートリーダー中で
YOYOTM-1蛍光を測定した(図6A、■)。100 ngのウサギグロビンmRNAをハイブ リダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いてビオチン-dUTPの存在下 でcDNAを合成した。次いで、上記したようにして蛍光プレートリーダーでATTOPH
OSTM蛍光を測定した(図6B、△)。各データの点は、10回(内分析)〜3回( 間分析)の別々の測定からの平均±標準偏差を示した。
以下であった。より重要なことに、これら内分析および間分析におけるPCR産物 の量の変動もまた10%以下であった(図7)。図7において、100 ngのウサギグ
ロビンmRNAをハイブリダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いて無標
識dTTPの存在下でcDNAを合成した。次いで、ウサギグロビン特異性プライマーお
よびTaqポリメラーゼを用いて、方法の項で記述したようにしてPCRを行った。PC
R産物を2.0%アガロースゲル電気泳動によって分離した後、臭化エチジウムで染
色した。右レーンは、100 bpラダーを表す。PCR産物の量をOD260を測定すること
によって測定した(●)。 各データの点は、10回(内分析)〜3回(間分析) の別々の測定からの平均±標準偏差を示した。
および利用できる種々の品質管理プロトコール(例えば、図6A、6Bおよび7)
は、この技術をきわめて競争に強いものにする。
ンmRNAをハイブリダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いてビオチン
-dUTPの存在下でcDNAを合成した。次いで、上記したようにして蛍光プレートリ ーダーでATTOPHOSTM蛍光を測定した。各データの点は、3重測定の平均±標準偏
差を示した。
少を示さなかった。
のためにオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。上記のよ うにして、捕捉したmRNAをMMLV逆転写酵素を用いてcDNAに変換した。対照として
、いくつかのウェルを同様に、ただしMMLV逆転写酵素を除いて、処理した。次い
で、上記のようにして、bcr-abl転写物をTaqポリメラーゼを用いてPCRによって 増幅した(第1bcr-abl)。PCRの後、各ウェルを沸騰DEPC水を用いて5回洗浄し
て、PCRを同じプライマーセットを用いて繰り返した(第2bcr-abl)。次いで、
PCRをG3PDHのプライマー対を用いて3度目を繰り返した(第3G3PDH)。PCR産物
を2.0%アガロースゲル電気泳動を用いて分離した後、臭化エチジウムで染色し た。その結果、アガロースゲル電気泳動は、bcr-ablおよびG3PDH転写物のPCR産 物は、負の逆転写のウェルからは増幅されなかったことを示すが、これはプレー
ト中の混入ゲノムcDNAからの「偽」PCR産物がないことを示す。より興味深いこ とに、アガロースゲル電気泳動は、bcr-ablおよびG3PDH転写物はウェルの固定化
cDNAから複数回再増幅されたことを確認する。
画分のオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートへの収集 種々のヒト培養細胞系、すなわち、K562V白血病細胞、U937白血病細胞、CaRI
結腸癌細胞、HepGII肝癌細胞、KatoIII胃癌細胞およびCRL 5800肺腺癌細胞(Ame
rican Type Culture Collection、Rockville, MD)をこの実験に用いた。細胞を
捕捉するための単層の96ウェルフィルタープレートはグラスファイバー製(Camb
ride Technologyグレード934AH、Brandel、Gaithersburg, MD)を用いた。予備 実験において、96ウェルフィルタープレートの各ウェル中のグラスファイバーフ
ィルター膜の単層上に捕捉される細胞の最大量を決定した。種々の数の細胞(10 2 〜5×106個) を通常の96ウェルマイクロプレートの上部にアセンブルしたフィ ルタープレートに適用して、500×gで10分間遠心分離した。下方プレートのウェ
ルに集まった通過画分中の細胞数を、血球計を用いて測定した。その結果、ウェ
ル当たりの細胞の最大量は、K562、U937、CaRI、HepGII、KatoIIIおよびCRL 580
0細胞に関して、それぞれ 約 2×106、2×106、106、5×105、5×105および3×1
05で、グラスファイバー膜からの細胞の漏れはなかった。
定化ポリプロピレン/ポリオレフィンマイクロプレート(GENEPLATE(登録商標)-P
P、AGCT)の上に載せて、これを次にオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレ
ートとして用いた。50μlの溶解用緩衝液(10 mMトリス、pH 8.0、1 mM EDTA 、0.5 M NaCl、0.5% NP-40界面活性剤および20 mMバナジル-リボヌクレオシド 複合体(VRC、Gibco-BRL、Geithersburg, MD))を各ウェルに加えて、直ちに500
×gで10分間遠心分離して、サイトゾルRNA画分をオリゴヌクレオチド固定化PCR マイクロプレート中に回収した。溶解用緩衝液によって、RNaseインヒビターVRC
の存在下でオリゴ(dT)とmRNAのポリ(A)配列とをハイブリダイズさせた。室 温で1時間のハイブリダイゼーションの後、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイ クロプレートを洗浄用緩衝液(10 mM トリス、pH 8.0、1 mM EDTAおよび0.5 M
NaCl)で2回洗浄した。この段階で、全mRNAが分析のためのオリゴヌクレオチド
固定化PCRマイクロプレートの各ウェル中に捕捉された。オリゴヌクレオチド固 定化PCRマイクロプレートが熱安定性であるために、mRNAをPCR容器に移すことな
く、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートを直接にPCRに供した。
子の増幅であった。cDNAをRT-緩衝液(50 mMトリス、pH 8.3; 75 mM KCl、3mM
MgCl2、および10 mM DTT、各10 mMのdNTPおよび100ユニットのMMLV逆転写酵素 (Gibco-BRL)を含む)を加えて合成して、37℃で1時間インキュベートした。 次いで、 PCRを同じプレート上でRT-緩衝液をPCR-緩衝液(10×PCR-緩衝液、1.5
mM MgCl2、各100μM のdNTP、1.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elm
er、Fostercity, CA)、各0.5μMのヒトβアクチンの上流センスプライマーおよ
び下流アンチセンスプライマー(Clontech、Palo Alto, CA)に置き換えて 最終 容量20μlで行った。PCRは、サーマルサイクラー(MJ Research、PTC-100、Wat
ertown, MA)中で、94℃で45秒間、60℃で45秒間および72℃で2分間を35サイク
ルして行った。PCR産物を1.0%アガロースゲル電気泳動中で0.5μg/mlの臭化エ
チジウムを用いて分析した。図9(左挿入図、レーンM、100 bp DNAラダー;レ
ーン1、K562;レーン2、U937;レーン3、CaRI;レーン4、HepGII;レーン5
、KatoIII;レーン6、CRL5800)に示すように、種々の培養細胞からのβ-アク チン遺伝子の増幅に成功した。イントロン配列はセンスプライマーとアンチセン
スプライマーとの間に存在することから、β-アクチンPCR産物の大きさはイント
ロンを含まないmRNAと同じであった。さらに、cDNA合成なしでPCRを始めた場合 はβ-アクチン遺伝子は増幅されず、これはPCRがmRNAに特異的であって、混入し
たDNAに由来しないことを示唆した。
, "Colorimetric ELISA measurement of specific mRNA on immobilized-oligon
ucleotide-coated microtiter plates by reverse transcription with biotiny
lated mononucleotides", Clin Chem 1996:1750-1757, 1996)を一部改変した方
法によって定量した。簡単に述べると、10 mMのdTTPの代わりに250μMのビオチ ン-dUTPを含むRT-緩衝液を加えてマイクロプレート上で第一鎖cDNAを合成して、
37℃で1時間インキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄して、1:
1000稀釈のストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体(Clontech、Pal
o Alto, CA)を含む洗浄用緩衝液50μlを各ウェルに加えた。各ウェルを室温で
30分間インキュベートして、次いで洗浄用緩衝液で3回洗浄した。最後に、100 μlのAttoPhos(JBL Scientific、San Luis Obispo, CA)を各ウェルに加えて 、室温で15分間インキュベートした。蛍光をCytoFluor 2300(Millipore、Bedfo
rd, MA)中で430 nm励起および560 nm放射で測定した。蛍光強度からmRNAの量を
定量するために、ウサギグロビンmRNAを上記したように対照として用いた(Tomi
naga K, et al.、Clin Chem 1996:1750-1757、1996)。図9に示すように104個 の細胞から捕捉したmRNAは、五つの異なる細胞系から約5ngであった。
イトゾル画分をハイブリダイゼーション後に収集して、フェノール/クロロホル ム/イソアミルアルコール抽出処理を2回繰り返してから、エタノール沈澱させ た。次いで、RNAをアガロースゲル電気泳動によって分析した。図9(右挿入図 、 レーンM、λHind III; レーン1、 K562; レーン2、U937; レーン3、CaRI;
レーン4、HepGII;レーン5、KatoIII;レーン6、CRL5800)に示すように、18s および28s rRNAバンドが室温で1時間のインキュベーション後でさえも全細胞で
明らかに存在し、これはVRCの存在下での単純ななサイトゾル画分が実質的にRNa
se活性を有しないことを示唆した。
グラスファイバープレートおよびオリゴ(dT)固定化ポリプロピレン/ポリオレ フィンプレートだけの使用で行うことができる。さらに96ウェル構成によって、
研究者は高処理量の全自動化の可能なRT-PCRを行うことができる。この実験例に
おいて、PCR産物はアガロースゲル電気泳動で分析されるが、PCR産物はTaqManシ
ステム(Morris T, et al., J Clin Microbiol 34:p2933-6, 1996)によって連 続して定量してもよい。この実験例は、このシステムが大量処理量RT-PCRのため
の有用なツールであることを証明した。
理解されよう。したがって、本発明の態様は、もっぱら説明のためであって、本
発明の範囲を制約するものではないことを理解すべきである。
プレート上に固定化されたオリゴ(dT)の量を示すグラフであって、使用したオリ
ゴヌクレオチド(10ピコモル)の約69%がマイクロプレートの表面に固定化され
たことを示す。
YO-1蛍光強度は、mRNA(●)に対しての特異性がDNA(■)、rRNA(△)およびtRNA(▽
)を上回って高いことを示す。Bは、PCRマイクロプレートのmRNA特異性を示すグ ラフであって、アルカリホスファターゼ基質(ATTOPHOSTM)は、mRNA(●)に対し ての特異性がDNA(■)、rRNA(△)およびtRNA(▽)に対するものを上回って高いこ とを示す。
可逆性を示す。
RT-PCR産物を示す、アガロースゲル電気泳動の結果を示す。Bは、プレートに混 入したゲノムDNAからの有意でない偽PCRを示すアガロースゲル電気泳動の結果を
示し、バンドは沸騰DEPC (ピロ炭酸ジエチル)水で洗浄した後で消失したが、55 ℃のDEPC水で洗浄した後では消失しなかった。Cは、逆転写を伴ってまたは伴わ ずに行ったPCRを示す、アガロースゲル電気泳動の結果を示す。
ゼを用いるワンステップRT-PCRによって測定したハイブリダイズされたmRNAを示
すアガロースゲル電気泳動の結果を示す。下挿入図は、rTthポリメラーゼを用い
るツーステップRT-PCRによって測定したハイブリダイズされたmRNAを示すアガロ
ースゲル電気泳動の結果を示す。Bは、細胞懸濁物の異なる稀釈度においてATTOP
HOSTM蛍光によって測定されたハイブリダイズされたmRNAを示すグラフである。
ラフである。Bは、ATTOPHOSTM蛍光によって測定された、捕捉されたウサギグロ ビンmRNAからの合成cDNAの量のウェル間の変動を示すグラフである。
固定化ポリプロピレンマイクロプレート上でmRNAを捕捉するためにグラスファイ
バーフィルター上での溶解に供した。
Claims (21)
- 【請求項1】 逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法であって、 標的細胞の細胞溶解物を調製し; 細胞溶解物を、細胞溶解物に存在する目的mRNAに特異的に相補的な核酸配列を
有するオリゴヌクレオチドが確実に固定化されたウェルを有し、PCRの熱サイク ルに対して熱安定性を有するオリゴヌクレオチド固定化マイクロプレートに移し
; mRNAをマイクロプレートのオリゴヌクレオチドによって捕捉し; 適切な緩衝液を用いてRT-PCRを同じマイクロプレート上で行い;そして 目的PCR産物を検出する ステップを含むRT-PCR法。 - 【請求項2】 マイクロプレートが、ポリプロピレン、ポリオレフィンまたは
ポリカーボネート製である請求項1に記載のRT-PCR法。 - 【請求項3】 検出ステップにおいて、PCR産物を、核酸染色を用いて蛍光測 定的にまたは蛍光もしくは化学ルミネセンスを発生させることによって酵素的に
定量する請求項1に記載のRT-PCR法。 - 【請求項4】 オリゴヌクレオチドがオリゴ(dT)である請求項1に記載のRT
-PCR法。 - 【請求項5】 移しステップにおいて、粗細胞溶解物をRNAまたはmRNAの精製 なしにマイクロプレートに移す請求項1に記載のRT-PCR法。
- 【請求項6】 PT-PCRステップが、PCRを、rTthポリメラーゼを用いてマイク ロプレート上で緩衝液の交換なしにまたは固定化オリゴヌクレオチドとハイブリ
ダイズさせたmRNAの除去なしに行う液相RT-PCRである請求項1に記載のRT-PCR法
。 - 【請求項7】 PT-PCRステップが、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプ レート上でのハイブリダイゼーションの後、捕捉したmRNAをcDNAに逆転写し、反
応物を吸引除去して、PCRを熱安定性DNAポリメラーゼを用いて行う固相RT-PCRで
ある請求項1に記載のRT-PCR法。 - 【請求項8】 細胞溶解物調製ステップにおいて、細胞膜を破壊するが核を無
傷に維持するようなマイルドな界面活性剤、および、RNase活性を阻害するまた はRNaseを不活化するための試薬を含み、ハイブリダイゼーションのためのpHお よび塩濃度を有する溶解用緩衝液を用いて細胞溶解物を調製する請求項1に記載
のRT-PCR法。 - 【請求項9】 PCR産物の検出後、マイクロプレート上に合成されたcDNAが固 定化されたまま残るようにマイクロプレートを洗浄し; RT-PCRステップで用いたものと同じかまたは異なる適切なプライマーを用いて
PCRを行い;そして 目的PCR産物を測定する ステップをさらに含む請求項1に記載のRT-PCR法。 - 【請求項10】 洗浄ステップ、PCRステップおよび測定ステップを繰り返す 請求項9に記載のRT-PCR法。
- 【請求項11】 細胞溶解ステップが、 標的細胞を捕捉するが細胞に存在するサイトゾルmRNAは通過させるような孔サ
イズを有する膜を備えたウェルを有するフィルタープレートに標的細胞を移し、
標的細胞を膜上に位置させ;そして 溶解用緩衝液を膜上の細胞層に通す ステップを含む請求項1に記載のRT-PCR法。 - 【請求項12】 溶解用緩衝液を膜に通す前にフィルタープレートをマイクロ
プレートの上部に取り付け、該フィルタープレートが、フィルタープレートとマ
イクロプレートとの間のウェルとウェルとの連通を確立するためにフィルタープ
レートをマイクロプレートの上部に取り付けられるような構造を有する請求項1
1に記載のRT-PCR法。 - 【請求項13】 溶解用緩衝液が細胞膜を破壊するが核を無傷に維持するマイ
ルドな界面活性剤、および、RNase活性を阻害するかRNaseを不活化する試薬を含
み、該溶解用緩衝液がハイブリダイゼーションのためのpHおよび塩濃度を有する
請求項11に記載のRT-PCR法。 - 【請求項14】 溶解物通過ステップにおいて、細胞溶解物をフィルタープレ
ートの膜を通して遠心分離、減圧、または陽圧の手段によって通過させる請求項
11に記載のRT-PCR法。 - 【請求項15】 細胞溶解物からmRNAを捕捉するためのオリゴヌクレオチド固
定化マイクロプレートであって、オリゴヌクレオチドが確実に固定化されたウェ
ルを有し、PCRの熱サイクルに対して熱安定性を有し、該オリゴヌクレオチドは 細胞溶解物中に存在する目的mRNAと特異的に相補的な核酸配列を有するマイクロ
プレート;および 細胞溶解物を調製するためのフィルタープレートであって、標的細胞を捕捉す
るが細胞に存在するサイトゾルmRNAは通過させるような孔サイズを有する膜を備
えたウェルを有し、標的細胞を膜上に位置させ、フィルタープレートとマイクロ
プレートとの間のウェルとウェルとの連通を確立するためにフィルタープレート
をマイクロプレートの上部に取り付けられるような構造を有し、使用時にはフィ
ルタープレートをマイクロプレートの上部に取り付け、そして、適切な溶解用緩
衝液を細胞を乱すことなく膜上の細胞層に通して、細胞溶解物をマイクロプレー
トに移動させた後に、そのマイクロプレートを用いてRT-PCRを行うフィルタープ
レート を含む、直接RT-PCRのためのキット。 - 【請求項16】 フィルタープレートがポリプロピレンまたはポリオレフィン
製である請求項15に記載の直接RT-PCRのためのキット。 - 【請求項17】 フィルタープレートがグラスファイバー製である請求項15
に記載の直接RT-PCRのためのキット。 - 【請求項18】 フィルタープレート上の細胞層を通過する時に細胞中に存在
するサイトゾルmRNAを放出させるための溶解用緩衝液であって、細胞膜を破壊す
るが核を無傷に維持するマイルドな界面活性剤、および、RNase活性を阻害する かまたはRNaseを不活化する試薬を含み、ハイブリダイゼーションのためのpHお よび塩濃度を有する溶解用緩衝液をさらに含む請求項15に記載の直接RT-PCRの
ためのキットキット。 - 【請求項19】 標的細胞を、標的細胞を捕捉するが細胞に存在するサイトゾ
ルmRNAは通過させるような孔サイズを有する膜を備えたフィルタープレートに移
し、標的細胞を膜上に位置させ、 溶解用緩衝液を膜上の細胞層に通し、標的細胞の細胞溶解液を得る ことを含む、標的細胞から細胞溶解液を調製する方法。 - 【請求項20】 溶解用緩衝液が細胞膜を破壊するが核を無傷に維持するマイ
ルドな界面活性剤、および、RNase活性を阻害するかRNaseを不活化する試薬を含
み、該溶解用緩衝液がハイブリダイゼーションのためのpHおよび塩濃度を有する
請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 細胞溶解物を、フィルタープレートの膜を通して遠心分離、
減圧または陽圧の手段によって通過させる請求項19に記載の方法。
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