JP4337796B2 - オリゴヌクレオチド固定化pcrマイクロプレート上での直接rt−pcr - Google Patents
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Description
きるので、キットに必ずしも含める必要はない。しかし、便宜のために、フィルタープレート上の細胞層を通した時に、細胞に存在するサイトゾルmRNAを放出させるための溶解用緩衝液はキットに含ませてもよい。上記において、溶解用緩衝液は、細胞膜を破壊するが核を無傷に維持するマイルド(mild)な界面活性剤、および、RNase活性を阻害するかRNase活性を不活化する試薬からなり、ハイブリダイゼーションのためのpHおよび塩濃度を有する。
本発明においては、オリゴヌクレオチドを確実に固定してPCRの熱サイクルに供することができるオリゴヌクレオチド固定化マイクロプレート(PCRマイクロプレート)を用い、mRNAの捕捉と逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を同一プレート上で行うことができる。PCRマイクロプレートはまた、RNAまたはmRNAを精製することなくmRNAを粗細胞溶解物から捕捉することができる。マイクロプレートを用いるPCRを可能にしたものは、その上にオリゴヌクレオチドを確実に固定化できてPCR熱サイクルに供することができるPCRマイクロプレートの使用である。例えば、GENEPLATE(登録商標)(AGCT、Irvine, CA)のような従来のオリゴヌクレオチド固定化ポリスチレンマイクロプレートは、ポリスチレンの熱安定性が低いためにPCRに使用できない。本発明において使用可能なPCRマイクロプレートには、ポリプロピレン、ポリオレフィン、またはポリカーボネートなどで作られたオリゴヌクレオチド固定化マイクロプレート、およびPCRの熱サイクルにおいて用い得る熱耐性ポリマーまたは樹脂で作られた他のマイクロプレートが含まれるが、これらに限定はされない。上記のうち、ポリオレフィンマイクロプレートは、オリゴヌクレオチドの確実な固定化を可能にする表面特性のために、好ましいと考えられる。マイクロプレート上に固定化されるオリゴヌクレオチドには、オリゴ(dT)およびmRNAまたは標的RNAに特異的な他のオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定はされない。適切な配列は、HYBsimulatorTMソフトウェア(AGCT、Irvine, CA)を用いて、GenBank霊長類データベースに対するハイブリダイゼーションシミュレーションを用いて同定することができる(Mitsuhashi M, et al., "Oligonucleotide probe design - a new approach", Nature 1994:367:759-61, Hyndman D, et al., "Software to determine optimal oligonucleotide sequences based on hybridization simulation data", BioTechniques 1996:20:1090-7)。また、米国特許第5,556,749号(1996年9月17日、Mitsuhashi M, et al.)の「オリゴプローブ・デザインステーション:最適DNAプローブのデザインのためのコンピュータ化した方法(Oigo probe designstation: a computerized method for designing optimal DNA probes)」を参照されたい。固定化オリゴヌクレオチドの量を、ウェル当たり10〜100ピコモルまでに高くすることができる(通常10〜30ピコモル)。
リカーボネート)プレートは、最近入手可能になっている (AGCT、Irvine, CA)。
ポリプロピレン、ポリオレフィンまたはポリカーボネートプレートの蛍光特性のために、固定化オリゴヌクレオチド、ハイブリダイズされたmRNA、合成されたcDNAおよびPCR産物が、核酸染色を用いて蛍光測定によってまたはATTOPHOSTMまたはLUMIPHOSTMなどの蛍光または化学ルミネセンスを発生させることによって酵素的に定量される。核酸染料には、1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカメチレン)−ビス−4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−オキサゾル)−2−メチリデン]−キノリウメトライオダイド(YOYOTM-1)、1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカメチレン)−ビス−4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−チアゾル)−2−メチリデン]−キノリウメトライオダイド (TOTOTM-1)、1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカメチレン)−ビス−4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−チアゾール)−2−プロペニリデン]−キノリウメトライオダイド (TOTOTM-3)、SYBR(登録商標)-Green I、 IIおよび PicoGreen(登録商標)からなる群から選択される蛍光染料が含まれるが、これらに
は限定されない。さらに、上記の米国特許第5,545,528号を参照されたい。
RT-PCRを行うには大きく分けて二つの方法がある。すなわち、ワンステップ RT-PCRとツーステップRT-PCRである。ワンステップ RT-PCRにおいては、rTthポリメラーゼ、または逆転写酵素とDNAポリメラーゼとの最適組み合わせ(TitanTM、ワンチューブRT-PCRキット、Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) を用いて、RT-PCRをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上で緩衝液を交換することなく行うことができる。他のワンステップRT-PCRとしては、mRNAと固定化したオリゴ(dT)とのハイブリダイゼーションによってmRNAを捕捉した後、mRNAをRT-PCR緩衝液に移して、RT-PCRを行うことができる。これに対して、ツーステップ RT-PCRにおいては、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のハイブリダイゼーションの後、捕捉されたmRNAを同一マイクロプレート上でcDNAに逆転写して、反応物を吸引によって除去してから、熱安定性のDNAポリメラーゼ、例えばrTthやTaqポリメラーゼを適当な緩衝液とともに用いることによってPCRを行うことができる。上記において、PCRは、サーマルサイクラー中で、ハイブリダイゼーションで用いたのと同一のオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートを用いて、例えば、変性(94℃、1分間)、アニーリング(60℃、1分間)、続いて伸長(72℃、1分間)を60サイクル繰り返して行った。 PCR効率の点から見るとワンステップすなわち液相RT-PCRがツーステップRT-PCRよりも優れていることが当業者には予期されると考えられる。しかし、驚いたことに、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上で合成されたcDNAからPCR(ツーステップRT-PCR)を行うと、RT-PCRは従来のワンステップRT-PCRよりも感度が約10,000倍向上し、100個の細胞しか含まない細胞溶解物からも転写を検出することができる。ワンステップRT-PCRがmRNAをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートから最初に解離させることによってより効率的な液相反応において行われるのに対して、ツーステップRT-PCRは非効率的な固相逆転写反応を要求することから、これは極めて意外である。一つの説明として次のようなことがある。すなわち、逆転写中にプライマーがダイマー形成のために使用されると考えられる。ワンステップPCRではツーステップRT-PCRよりもより多くのプライマーダイマーが形成される。ツーステップRT-PCRではワンステップRT-PCRよりもハイブリダイゼーション効率は低いが、最初の逆転写相中に形成されたプライマーダイマーはツーステップRT-PCRにおけるPCR全体に存在し、これによってRT-PCR感度が著しく高まる。
オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上の固定化オリゴヌクレオチドによって捕捉されたmRNAから合成されるcDNAは、2回以上使用することができる。すなわち、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のcDNAは極めて安定である。この興味ある性質は、適切なプライマーを用いることによって、係るcDNAの異なるまたは同一部分を多数回増幅するために同じ固定化cDNAによる再増幅を可能にする。オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のcDNAから複数のPCRを合成するこのマルチプルPCRシステムは、将来の自動化への適用の可能性とともに、基礎研究、診断、および薬物スクリーニン
グにおいて有用である。
従来、細胞溶解物は、溶解用緩衝液を用いて細胞を破壊してサイトゾルmRNAを放出させてから、遠心分離することによって調製される。上清をハイブリダイゼーションに用いる。この激しい均質化プロセスは、長時間と集約的作業処理を要求するばかりではなく、回収mRNA量を変動させる。細胞を機械的に均質化することなく、細胞をフィルター膜にむらなく配してから溶解用緩衝液をフィルター膜上の細胞層を通過させることによって、細胞溶解物の調製を抜本的に簡略化し、かつ回収サイトゾルRNAの収量を有意に安定化することが可能である。
1.フィルタープレートを減圧マニホルド上に置く。
2.例えば、マルチチャネルピペットを用いて、細胞を培養プレートからフィルタープレートに移す。
3.フィルタープレートを減圧吸引して、細胞を膜上に捕捉する。
4.各ウェルを、例えば、各50μlのPBSを用いて、1または2回洗浄する(任意)。
1.フィルタープレートを減圧マニホルドから取り出して、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートの上部に設置する。
2.例えば、50μlの溶解用緩衝液(例えば、10 mMトリス、pH 8.0、1mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5% NP-40、20 mMバナジルリボヌクレオシド複合体;RNaseを含まない)を加えて、例えば、1,500×gで10分間遠心分離する。
3.固定化されたオリゴ(dT)と細胞のサイトゾル分画に存在するmRNAのポリ(A)テールとのハイブリダイゼーションのために、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートを室温で1時間インキュベートする。
1.各ウェルを50μlの溶解用緩衝液(例えば、10 mMトリス、pH 8.0、1mM EDTA、0.3 M NaCl;RNaseを含まない)を用いて、1または2回洗浄する。
2.RT-PCRを開始して、自動化PCR装置におけるPCR産物の量をモニターする。
オリゴ(dT)固定化したオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート(GENEPLATE(登録商標)-PP、Hitachi Chemical Research Center、Irvine, CA)、YOYOTM-1(1,1'−(4,4,7,7−テトラメチル−4,7−ジアザウンデカメチレン)−ビス−4−[3−メチル−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−オキサゾール)−2−メチリデン]−キノリウメトライオダイド、Molecular Probes、Eugene, OR)、PCR用試薬(Taqポリメラーゼ、EZ rTth RNA-PCRキット)(Perkin Elmar、Foster City, CA)、K562細胞系(American Type Culture Colle
ction、Rockville, MD)、100 bp DNAラダー、燐酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、バナジルリボヌクレオシド複合体(VRC)、ウサギグロビンmRNA、細胞培養培地および適切な抗生物質、緩衝液-飽和フェノール(Gibco-BRL、Geithersburg, MD)、胎児ウシ血清(FBS、HyClone、Logan, UT)、ビオチン−dUTP(Clontech、Palo Alto, CA)、ATTOPHOSTM(アルカリホスファターゼ基質、JBL Scientific、San Luis Obispo, CA)、cd4465 DNA (Genome Systems、St. Louis, MO)を表示した供給者から購入した。MAGEXTRACTORTM用のRNA調製試薬は、東洋紡(大阪)からの好意で提供された。他の化学物質は全て、シグマ社(St. Louis, MO)から購入した。
K562細胞を10%FBS、500ユニット/ml ペニシリン、500μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI 1640中で増殖させて、約1:10の比で週に2回継代培養した。細胞生存率をトリパンブルー排除試験で評価したが、常に95%以上であった。
細胞をPBSで2回洗浄して、溶解用緩衝液(10 mmol/Lトリス、pH 7.6、1mmol/L EDTA、0.1%NP-40および20 mmol/L VRC)中に氷上で5分間懸濁させて、サイトゾルmRNAを上記したようにして放出させる(Miura Y, et al., Clin Chem 1996:42:1758-64)。次いで、試料を15,000×gで4℃で5分間遠心分離して、上清をハイブリダイゼーションのためにGENEPLATE(登録商標)-PPに適用した。実験によっては、細胞をVRCを含まない溶解用緩衝液に懸濁して、ただちに等量のフェノール/クロロホルムで2回処理して、タンパク質およびヌクレアーゼを吸収した。次いで、脱タンパクした溶液をハイブリダイゼーションに供した。
鋳型DNA/RNA、各300μmol/LのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、1×EZ緩衝液、2 mmol/Lの Mn(OAc)2、各0.5μmol/Lのプライマーおよび0.1μlのrTthポリメラーゼを混合して
最終容量5〜50μlにして、ヌクレアーゼを含まないミネラル油(シグマ社)1滴とともに積層した。PCRをサーマルサイクラー(MJ Research、Watertown, MA)中で、逆転写(60℃、30分間)および変性(94℃、1分間)
の1サイクルに続いて、アニーリング/伸長(60℃、1分間)および変性(94℃、1分間)を40サイクル繰り返して行った。PCR完了後、電気泳動チャンバー中で0.5μg/ml臭化エチジウムを用いる2.0%アガロースゲル電気泳動を行ってPCR産物を分析した。写真映像をポラロイドフィルム(667、Cambridge, MA)上に記録した。
ハイブリダイゼーションの後、ビオチン-dUTPを10mmol/LdTTPで置換することによって、捕捉したmRNAをcDNAに逆転写した。反応物を吸引によって除去して、rTthまたはTaqポリメラーゼのいずれかを用いてPCRを行った。Taqポリメラーゼを用いたPCRでは、緩衝液は、1×緩衝液、1.25 mmol/LMgCl2、各300μmol/LのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、各0.5μmol/Lのプライマーならびに0.5μlTaqポリメラーゼを最終容量10〜50μl中に含んだ。PCRはサーマルサイクラー(MJ Research)中で、60サイクルの変性(94℃、1分間)、アニーリング(60℃、1分間)に続いての伸長(72℃、1分間)によって行った。
ヒタチ・ケミカル・リサーチ・センター(Irvine, CA)で処理したGENUNCTM PPマイクロプレート(Nunc、Naparville, IL)をAGCT(Irvine, CA)から入手して、それにオリゴヌクレオチドを固定化した。固定化前後のオリゴヌクレオチド濃度を、1.0 OD260ユニット=30μg/mlとして測定して、測定値の差から固定化されたオリゴヌクレオチド量を算出した。別の実験で、YOYO-1をTE(10 mmol/Lトリス、pH 8.0、1mmol/L EDTA)で最終稀釈率が1:1000になるように稀釈して、GENEPLATE(登録商標)-PPマイクロプレートに適用した。蛍光をCYTOFLUORTM 2300(Millipore、Bedford, MA)によってそれぞれ485 nm(バンド幅20 nm)および530 nm(バンド幅25 nm)の励起および放射波長で既述のようにして測定した(Miura Y, et al., Clin Chem 1996:42:1758-64, Miura Y, et al., Cancer Lett
1997:116:139-44)。
次の一連の実験はmRNA特異性を示すために行われた。図2Aは、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートのmRNA特異性を示すグラフで、YOYO-1蛍光強度は、 mRNA (●)に対しての特異性がDNA (■)、rRNA (△) およびtRNA (▽)を上回って高いことを示している。図2Bはオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートのmRNA特異性を示すグラフで、基質ATTOPHOSTMは、mRNA (●)に対しての特異性がDNA (■)、rRNA (△) およびtRNA
(▽)を上回って高いことを示している。
各ウェルを洗浄用緩衝液(10 mmol/Lトリス、pH 7.6;300 mmol/L NaClおよび10 mmol/L Tween 20を含む)で3回洗浄した後、1:1000稀釈したストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体を含む洗浄用緩衝液50μlを加えて、室温で30分間インキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、50μlの基質(ATTOPHOSTM)を加えて、室温で20分間インキュベートした。等量(50μl)の100 mmol/L EDTAを添加して反応を終止させてから、蛍光をCYTOFLUORTM 2300によって測定した。各データの点は、3重測定の平均±標準偏差で示した。
図3は、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上のmRNAの可逆ハイブリダイゼーションを示すグラフである。1μgのウサギグロビンmRNAまたは20μgの全肝臓RNAを50μlのハイブリダイゼーション用緩衝液に懸濁して、オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートのウェルに適用した。室温で1時間のハイブリダイゼーションの後、ウェルをDEPC水を用いて異なる温度(25℃、55℃または沸騰温度)で3回洗浄した。次いで、YOYOTM-1を各ウェルに適用して、蛍光をCYTOFLUORTM 2300によって上記したようにして測定した(Miura Y, et al., Clin Chem 1996:42:1758-64)。各データの点は3重測定の平均±標準偏差で示した。図3に示すように、YOYOTM-1蛍光は、沸騰DEPC水を加えることによって基底レベルまで低下した。
さらに、ハイブリダイゼーションの容量を評価するために、種々の量のグロビンmRNA、全肝臓RNAまたは細胞溶解物をハイブリダイゼーション用オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。次いで、ハイブリダイズしたmRNAを沸騰水を加えることによってプレートから回収して、2回目のハイブリダイゼーションのために緩衝液(濃度を調整した)を新鮮なオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。平行実験で、既知濃度のグロビンmRNAもまた対照として適用した。次いで、定量的cDNA合成を下記のように行って、溶液中のmRNA量を標準グロビンmRNAの値に基づいて測定した。cDNA合成量を、Tominagaら(Clin Chem 1996:42:1750-7)によって公表されたプロトコルを一部修飾した方法に従って定量した。簡単に説明すれば、mRNA-ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートを50μlのcDNA合成用緩衝液(50 mmol/Lトリス、pH
8.3; 75 mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT、各10 mmol/LのdATP、dGTP、dCTP、250μmol/Lのビオチン-dUTPおよび400ユニットのMMLV 逆転写酵素を含む)中に再懸濁して37℃で1時間インキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液(10 mmol/Lトリス、pH 7.6;300 mmol/L NaClおよび10 mmol/L Tween 20を含む)で3回洗浄した後、1:1000稀釈したストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体を含む洗浄用緩衝液50μlを加えて、室温で30分間インキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、50μlの基質(ATTOPHOSTM、1×濃度)を加えて、室温で20分間インキュベートした。等量(50μl)の100 mmol/L EDTAを添加して反応を終止させてから、蛍光をCYTOFLUORTM 2300(Millipore)によってそれぞれ485 nm(バンド幅20 nm)および560 nm(バンド幅25 nm)の励起および放射波長を用いて測定した。
Ph1転座からb3a2転写物を発現するヒトK562白血病細胞を溶解用緩衝液を用いて溶解した後、遠心分離して細胞破片および核DNAを除去した。次いで、サイトゾルmRNAを含む上清をハイブリダイゼーションのためにオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに
適用した。室温で1時間ハイブリダイゼーションした後に、結合しなかった材料をハイブリダイゼーション用緩衝液で2回洗浄することによって除去し、RT-PCRを同じウェル中で開始した。
直接RT-PCR実験を細胞懸濁液の異なる稀釈で行った。種々の数のK562細胞をハイブリダイゼーション用のオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。得られたハイブリダイズしたmRNAをYOYO-1の測定またはrTthポリメラーゼを用いるRT-PCRに用いた
。すなわち、図5Aおよび図5Bにおいて、種々の数(0〜6×106)のK562細胞を溶解用緩衝液に懸濁して、ハイブリダイゼーションのためにオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。図5Aにおいて、ハイブリダイズしたmRNA量をYOYOTM-1蛍光によって上記のように測定した。平行実験で、捕捉したmRNAを直ちにrTthポリメラーゼを用いるワンステップRT-PCRに上記のように供した(挿入図上)。図5Bにおいて、別の一連の実験で、上記のようにして、ビオチン-dUTPの存在下でMMLV逆転写酵素およびプライマーとして固定化オリゴ(dT)を用いて、捕捉したmRNAからcDNAを合成した後、cDNA合成を定量した。平行実験で、ビオチン-dUTPを無標識dTTPで置換することによってcDNAをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上で合成して、上記したようにしてrTthポリメラーゼを用いてPCRを行った(挿入図下)。PCR産物を2.0%アガロースゲル電気泳動によって分離した後、臭化エチジウムで染色した。Mは100 bpラダーを表す。各データの点は、3重測定の平均±標準偏差を示した。
オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレート上での定量的分析を行うために、ウェルとウェルとの間の変動は重要な問題である。100 pmolオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに固定化のために適用して、続いて上記したようにして蛍光プレートリーダー中でYOYOTM-1蛍光を測定した(図6A、●)。100 ngのウサギグロビンmRNAをハイブリダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いて上記したようにして蛍光プレートリーダー中でYOYOTM-1蛍光を測定した(図6A、■)。100 ngのウサギグロビンmRNAをハイブリダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いてビオチン-dUTPの存在下でcDNAを合成した。次いで、上記したようにして蛍光プレートリーダーでATTOPHOSTM蛍光を測定した(図6B、△)。各データの点は、10回(内分析)〜3回(間分析)の別々の測定からの平均±標準偏差を示した。
。図7において、100 ngのウサギグロビンmRNAをハイブリダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いて無標識dTTPの存在下でcDNAを合成した。次いで、ウサギグロビン特異性プライマーおよびTaqポリメラーゼを用いて、方法の項で記述したようにしてPCRを行った。PCR産物を2.0%アガロースゲル電気泳動によって分離した後、臭化エチジウムで染色した。右レーンは、100 bpラダーを表す。PCR産物の量をOD260を測定することによって測定した(●)。 各データの点は、10回(内分析)〜3回(間分析)の別々の測定からの平均±標準偏差を示した。
オリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートを室温(●)、55℃(■)または72℃(△)で2、8または15日間保存した。次いで、100 ngのウサギグロビンmRNAをハイブリダイゼーションのために各ウェルに適用して、続いてビオチン-dUTPの存在下でcDNAを合成した。次いで、上記したようにして蛍光プレートリーダーでATTOPHOSTM蛍光を測定した。各データの点は、3重測定の平均±標準偏差を示した。
K562細胞(104〜106個)を溶解用緩衝液に懸濁して、ハイブリダイゼーションのためにオリゴヌクレオチド固定化PCRマイクロプレートに適用した。上記のようにして、捕捉したmRNAをMMLV逆転写酵素を用いてcDNAに変換した。対照として、いくつかのウェルを同様に、ただしMMLV逆転写酵素を除いて、処理した。次いで、上記のようにして、bcr-abl転写物をTaqポリメラーゼを用いてPCRによって増幅した(第1bcr-abl)。PCRの後、各ウェルを沸騰DEPC水を用いて5回洗浄して、PCRを同じプライマーセットを用いて繰り返した(第2bcr-abl)。次いで、PCRをG3PDHのプライマー対を用いて3度目を繰り返した(第3G3PDH)。PCR産物を2.0%アガロースゲル電気泳動を用いて分離した後、臭化エチジウムで染色した。その結果、アガロースゲル電気泳動は、bcr-ablおよびG3PDH転写物のPCR産物は、負の逆転写のウェルからは増幅されなかったことを示すが、これはプレート中の混入ゲノムcDNAからの「偽」PCR産物がないことを示す。より興味深いことに、アガロースゲル電気泳動は、bcr-ablおよびG3PDH転写物はウェルの固定化cDNAから複数回再増幅されたことを確認する。
種々のヒト培養細胞系、すなわち、K562V白血病細胞、U937白血病細胞、CaRI 結腸癌細胞、HepGII肝癌細胞、KatoIII胃癌細胞およびCRL 5800肺腺癌細胞(American Type Culture Collection、Rockville, MD)をこの実験に用いた。細胞を捕捉するための単層の96ウェルフィルタープレートはグラスファイバー製(Cambride Technologyグレード934AH、Brandel、Gaithersburg, MD)を用いた。予備実験において、96ウェルフィルタープレートの各ウェル中のグラスファイバーフィルター膜の単層上に捕捉される細胞の最大量を決定した。種々の数の細胞(102〜5×106個) を通常の96ウェルマイクロプレートの上部にアセンブルしたフィルタープレートに適用して、500×gで10分間遠心分離した。下方プレートのウェルに集まった通過画分中の細胞数を、血球計を用いて測定した。その結果、ウェル当たりの細胞の最大量は、K562、U937、CaRI、HepGII、KatoIIIおよびCRL 5800細胞に
関して、それぞれ 約 2×106、2×106、106、5×105、5×105および3×105で、グラスファイバー膜からの細胞の漏れはなかった。
実験例10に続いて、最初の分析は、捕捉したmRNAからのハウスキーピング遺伝子の増幅であった。cDNAをRT-緩衝液(50 mMトリス、pH 8.3; 75 mM KCl、3mM MgCl2、および10
mM DTT、各10 mMのdNTPおよび100ユニットのMMLV逆転写酵素(Gibco-BRL)を含む)を加えて合成して、37℃で1時間インキュベートした。
次いで、PCRを同じプレート上でRT-緩衝液をPCR-緩衝液(10×PCR-緩衝液、1.5 mM MgCl2、各100μM のdNTP、1.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer、Fostercity, CA)、各0.5μMのヒトβアクチンの上流センスプライマーおよび下流アンチセンスプライマー(Clontech、Palo Alto, CA)に置き換えて 最終容量20μlで行った。PCRは、サーマルサイクラー(MJ Research、PTC-100、Watertown, MA)中で、94℃で45秒間、60℃で45秒間および72℃で2分間を35サイクルして行った。PCR産物を1.0%アガロースゲル電気泳動中で0.5μg/mlの臭化エチジウムを用いて分析した。図9(左挿入図、レーンM、100 bp DNAラダー;レーン1、K562;レーン2、U937;レーン3、CaRI;レーン4、HepGII;レーン5、KatoIII;レーン6、CRL5800)に示すように、種々の培養細胞からのβ-アクチン遺伝子の増幅に成功した。イントロン配列はセンスプライマーとアンチセンスプライマーとの間に存在することから、β-アクチンPCR産物の大きさはイントロンを含まないmRNAと同じであった。さらに、cDNA合成なしでPCRを始めた場合はβ-アクチン遺伝子は増幅されず、これはPCRがmRNAに特異的であって、混入したDNAに由来しないことを示唆した。
1996:1750-1757, 1996)を一部改変した方法によって定量した。簡単に述べると、10 mMのdTTPの代わりに250μMのビオチン-dUTPを含むRT-緩衝液を加えてマイクロプレート上で第一鎖cDNAを合成して、37℃で1時間インキュベートした。各ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄して、1:1000稀釈のストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体(Clontech、Palo Alto, CA)を含む洗浄用緩衝液50μlを各ウェルに加えた。各ウェルを室温で30分間インキュベートして、次いで洗浄用緩衝液で3回洗浄した。最後に、100μlのAttoPhos(JBL Scientific、San Luis Obispo, CA)を各ウェルに加えて、室温で15分間インキュベートした。蛍光をCytoFluor 2300(Millipore、Bedford, MA)中で430 nm励起および
560 nm放射で測定した。蛍光強度からmRNAの量を定量するために、ウサギグロビンmRNAを上記したように対照として用いた(Tominaga K, et al.、Clin Chem 1996:1750-1757、1996)。図9に示すように104個の細胞から捕捉したmRNAは、五つの異なる細胞系から約5ngであった。
K562; レーン2、U937; レーン3、CaRI;レーン4、HepGII;レーン5、KatoIII;レーン6、CRL5800)に示すように、18sおよび28s rRNAバンドが室温で1時間のインキュベーション後でさえも全細胞で明らかに存在し、これはVRCの存在下での単純ななサイトゾル画分が実質的にRNase活性を有しないことを示唆した。
Claims (3)
- 標的細胞を、標的細胞を捕捉するが細胞に存在するサイトゾルmRNAは通過させるような孔サイズを有する膜を備えたフィルタープレートに移し、標的細胞を膜上に位置させ、溶解用緩衝液を膜上の細胞層に通し、標的細胞の細胞溶解液を得ることを含む、標的細胞から細胞溶解液を調製する方法であって、
前記溶解用緩衝液が、細胞膜を破壊するが核を無傷に維持する非イオン性界面活性剤と、RNase活性を阻害するかRNaseを不活化する試薬とを含み、ハイブリダイゼーションのためのpH及び塩濃度を有する緩衝液である、
方法。 - 前記非イオン性界面活性剤が、NP−40(商標)またはTRITON(登録商標)−Xである、請求項1に記載の方法。
- 細胞溶解物を、フィルタープレートの膜を通して遠心分離、減圧または陽圧の手段によって通過させる請求項1または2に記載の方法。
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