CN106867993A - 一种逆转录方法、逆转录试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种逆转录方法、逆转录试剂盒及其应用，所述的逆转录试剂盒包含NP‑40裂解液或碱裂解试剂；所述的裂解试剂为NP‑40裂解液，所述的NP‑40裂解液配方为：RNase‑Free H2O，NP‑40，RNasin，其中NP‑40的质量浓度为0.2％‑5％，RNasin的浓度为1‑10U；所述的碱裂解试剂配方为：RNase‑Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.00001‑0.01M；所述的逆转录方法首先通过裂解试剂对样本进行裂解，再通过逆转录试剂对裂解后的样本直接进行逆转录。本发明的方法是一种全新的从样本获得cDNA的方法，大大简化了操作流程、降低了操作难度，大幅缩短了实验时间，节约了成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种逆转录方法、逆转录试剂盒及其应用。
背景技术
逆转录又称为反转录，是以RNA为模板，通过逆转录酶，合成cDNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式，由逆转录酶进行催化。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了逆转录酶，并因此获得了1975年的诺贝尔生理学医学奖。逆转录的发现对分子生物学、基因工程技术的发展起到了巨大的推动作用，是构建、表达真核或者原核生物目的基因，构建cDNA文库，检测基因序列等分子细胞生物学实验中不可或缺的工具，与Taq酶等共同构成了现代生物技术的的基础工具。
基于逆转录的基础性作用，在逆转录的实验操作中，国内外已经有许多公司和个人尝试对其中的材料和步骤进行改良，并且申请专利。例如美国专利US6,436,677公开了一种改良的逆转录酶，这个酶参与的逆转录需要锰参与，反应温度大于50℃，该温度利于打开RNA的二级结构，从而利于逆转录的顺利进行。美国专利US8,993,240采用的是另外一个思路，它采用特殊设计的引物来增加逆转录的特异性和针对性。又如株式会社百奥尼专利CN103348004B，它采用基因突变的方法改变逆转录酶M-MLV的热稳定性，从而也能提高cDNA的转换效率。目前，虽然在逆转录酶和材料上已经进行了诸多改良，然而具体的操作方法改进很少，仍有很大的改进空间。
经典的方法进行逆转录，先通过Trizol试剂对细胞进行裂解，接着通过氯仿将DNA、RNA和蛋白质进行分层，进一步通过异丙醇、乙醇等对RNA进行分离和纯化，检测鉴定之后进行逆转录操作，整个操作过程流程较长，用时很多，而且由于RNA容易降解，长流程的操作极大的增加了RNA的降解风险。为了获得较好的RNA，操作时需谨慎小心，并且需要较为专业的人员进行。综合以上因素，经典的方法总体成本较高，具有一定的技术门槛，不便于在基层医院和小公司中普及。
由此可见，有必要探索和发明一种方法，尝试从样本(如组织、细胞或血液等)获得cDNA，在保证较好的效果的基础上简化操作步骤。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种全新的逆转录试剂盒、逆转录方法及应用。
本发明提供了一种逆转录方法，包括以下步骤：
(1)通过裂解试剂对样本进行裂解，
(2)通过逆转录试剂对裂解后的样本直接进行逆转录。
作为本发明的一个优选例，所述的裂解试剂为NP-40(乙基苯基聚乙二醇)裂解液，所述的NP-40裂解液配方为：RNase-Free H2O，NP-40，RNasin，其中NP-40的质量浓度为0.2％-5％，RNasin的浓度为1-10U。
在该优选例中，RNasin为一种特异的RNA酶抑制剂，是一种酸性糖蛋白，可以从人的胎盘中提取获得，也可以商业购买。
在该优选例中，优选的步骤1)的裂解操作具体为：裂解操作在冰上进行，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解10-30min，最优为20min。
作为本发明的另一优选例，所述的裂解试剂为碱裂解试剂，所述的碱裂解试剂配方为：RNase-Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.00001-0.01M。
在该优选例中，优选的步骤1)的裂解操作具体为：裂解操作在冰上进行，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解5-20min，优选10min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U的RNasin，最优浓度为2U/μl。
作为一种具体实施方式，所述的样本可以为细胞、组织或血液等。
所述的样本可来自微生物(如病毒、细菌、衣原体和真菌等)、人或动植物。
本发明还提供了一种逆转录试剂盒，其包含裂解试剂，所述的裂解试剂为NP-40裂解液或碱裂解试剂；所述的NP-40裂解液配方为：RNase-Free H2O，NP-40，RNasin，其中NP-40的质量浓度为0.2％-5％，最优浓度为2％，RNasin的浓度为1-10U，最优浓度为2U/μl；所述的碱裂解试剂配方为：RNase-Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.00001-0.01M，最优浓度为0.001M。
优选地，所述的逆转录试剂盒还包含逆转录试剂。
更优选地，所述的逆转录试剂包含逆转录酶，所述的逆转录酶是MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
优选地，当采用所述的两种裂解液裂解细胞时，每1ml的裂解液可以裂解1×104到1×106个细胞。当细胞增多时，可以适当增加裂解液的含量。逆转录的试剂可以采用常规的逆转录方法和试剂，如商业在售的逆转录试剂。逆转录的试剂包含：逆转录缓冲液，逆转录酶，RNasin，逆转录引物以及dNTPs等。
优选地，逆转录体系包括：
5×逆转录缓冲液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl2；50mM DTT；
10mM dNTPs；
逆转录酶5U/μl；
20μM逆转录引物(如oligodT primer或者Random primer)；
RNasin；
总量20μl时，加入样本裂解液0.5μl-4μl，最佳为2μl。
本发明还提供了所述的逆转录试剂盒在从样本中获得cDNA的过程中的应用。
本发明提供了一种全新的从样本获得cDNA的方法，并提供了相应的试剂盒，其具备以下优点：
1、仅包括裂解和逆转录两个步骤，裂解之后可以直接进行逆转录操作，省去了繁琐的RNA抽提和分离的环节，因此大大降低了操作难度，普通的技术人员和医生也能操作，有利于基因检测等技术在基层的研究单位和医院推广；
2、大大缩短了实验时间，之前抽提RNA、逆转录以及定量PCR等过程需要一天时间才能完成，本发明的方法可以在半天之内完成；
3、由于省去了繁琐的RNA抽提过程，因此实验的成功率和可重复性也大大提高，实验证实其效果良好；
4、仅需要裂解试剂和逆转录试剂，大大节省了成本；
5、本发明方法中各参数设置合理恰当，取得了良好的实验效果。
由此可见，本发明的方法在基础研究与临床检测等领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：定量PCR溶解峰显示两种逆转录方法之间的比较。
图2：DNA琼脂糖凝胶电泳显示两种逆转录方法之间的比较。
图3：定量PCR溶解峰显示两种裂解试剂之间的比较。
图4：DNA琼脂糖凝胶电泳显示两种裂解试剂之间的比较。
图5：定量PCR溶解峰显示两种逆转录酶试剂之间的比较。
图6：DNA琼脂糖凝胶电泳显示两种逆转录酶之间的比较。
图7：定量PCR溶解峰显示人和鼠基因之间的比较。
图8：DNA琼脂糖凝胶电泳显示人和鼠基因之间的比较。
图9：DNA琼脂糖凝胶电泳显示人血液细胞组织和口腔细胞之间的比较。
图10：DNA琼脂糖凝胶电泳显示两种逆转录方法在扩增全长基因方面的比较。
图11：DNA琼脂糖凝胶电泳显示肿瘤组织和正常组织之间的比较。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
在以下各实施例中：
NP-40裂解液的具体配方为：RNase-Free H2O，NP-40，RNasin，其中NP-40的质量浓度为为2％，RNasin的浓度为2U/μl。采用NP-40裂解液的具体裂解方法为：于1×105个细胞中加入1ml的裂解液，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解20min，所有操作在冰上进行。
碱裂解试剂的具体配方为：RNase-Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.001M。采用碱裂解试剂的具体裂解方法为：于1×105个细胞中加入1ml的裂解液，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解10min，之后加入等量的HCl中和，再加入2U/μl的RNasin，所有操作在冰上进行。
逆转录体系如下：
5×逆转录缓冲液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl2；50mM DTT；
10mM dNTPs；
逆转录酶5U/μl；
20μM逆转录引物；
RNasin；
总量20μl时，样本裂解液2μl。
逆转录操作步骤为：冰上操作，配制20μl总逆转录体系，RNase-free EP管中依次加入4μl 5×逆转录缓冲液，2μl样本裂解液，1μl 10mM dNTPs，1μl20μM逆转录引物，1μl逆转录酶(5U/μl)，1μl 40U/μl RNasin。倘若逆转录酶为MMLV，则37℃恒温15-60分钟，85℃5秒，4℃保存。倘若逆转录酶为ALV，则42℃恒温15-60分钟，85℃5分钟，4℃保存。
实施例1采用的是NP-40裂解液；实施例2采用的是NP-40裂解液和碱裂解试剂；实施例3采用的是碱裂解试剂；实施例4采用的是NP-40裂解液；实施例5采用的是碱裂解试剂；实施例6采用的是NP-40裂解液实施例7采用的是NP-40裂解液。
实施例1 传统RNA抽提方法与本发明方法的比较
采用293T细胞，分别使用传统的Trizol裂解抽提RNA的方法和本发明的方法提取RNA，再采用MMLV逆转录酶逆转录成cDNA，之后通过定量PCR对内参基因Gapdh和Tp53基因定量检测，且为了进一步验证这一结果，采用普通PCR方法扩增上述两个基因片段，然后进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测是否成功扩增上述基因片段。引物序列见表1。
表1引物序列
定量PCR检测结果见图1，DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。结果表明，采用本发明的裂解细胞后直接逆转录的方法和传统的抽提RNA之后再逆转录的方法其效果是相当的。
实施例2 两种细胞裂解试剂之间的比较
为了检测不同的裂解液是否能获得相同的效果，普通的RNA抽提采用的Trizol裂解液虽然能最大限度地裂解细胞，然而也会破坏蛋白的结构，影响后续的实验，因此我们不断研究尝试新的裂解方法和裂解试剂。经过摸索，找出了两种细胞裂解试剂：NP-40裂解试剂和碱裂解试剂。采用293T细胞，将碱裂解液KOH，NP-40裂解液和Trizol抽提的RNA进行对比，用MMLV逆转录酶进行逆转录，采用定量PCR方法对Tp53的基因定量检测，且为了进一步验证这一结果，再采用普通PCR和DNA琼脂糖凝胶电泳进行检测。
定量PCR检测结果见图3，DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图4。结果表明，采用本发明的NP-40裂解试剂和碱裂解试剂进行逆转录的方法其效果是相当的，且研究过程中表明其效果均显著优于其他裂解试剂。
实施例3 MMLV逆转录酶以及AMV逆转录酶的比较
采用293T细胞，使用MMLV逆转录酶以及AMV逆转录酶，检测内参基因Gapdh，分别进行试验，产物进行定量PCR检测，同时经普通PCR之后再采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
定量PCR检测结果见图5，DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图6。结果表明，使用MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶其效果相当。
实施例4 人和小鼠细胞的比较
采用人乳腺癌MDA-MB-231细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞分别进行试验，检测内参基因Gapdh，产物进行定量PCR检测，同时经普通PCR之后再采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
定量PCR检测结果见图7，DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图8。结果表明，样本为人或小鼠细胞其效果是相当的。
实施例5 人血液组织和人口腔上皮细胞的比较
采用人血液组织和口腔上皮细胞分别进行试验，产物经普通PCR之后再采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图9。结果表明，样本为人血液组织和人口腔上皮细胞其效果是相当的。
实施例6 扩增全长基因比较
扩增Kras基因(扩增后595bp)以及Tp53基因(扩增后1410bp)。通过在293T细胞以及人口腔上皮细胞进行裂解之后采用Trizol方法和本发明方法进行检测。引物序列见表2。
表2引物序列
DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图10。结果表明，采用本发明的方法和传统的抽提RNA之后再逆转录的方法相比，在扩增全长基因方面其效果是相当的。
实施例7 肿瘤组织和正常组织(距离肿瘤组织6cm)的比较
取肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织分别进行试验，产物进行Gapdh和Tp53基因的检测，即经普通PCR之后再采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图11。结果表明，样本为肿瘤组织和正常组织其效果是相当的。
实施例8 本发明的逆转录试剂盒(一)
所述的逆转录试剂盒包含裂解试剂，所述的裂解试剂为NP-40裂解试剂，配方为：RNase-Free H2O，NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，RNasin，其中NP-40的质量浓度为0.2％-5％，最适浓度为2％；RNasin的浓度为1-10U/μl，最适浓度为2U/μl。
所述的逆转录试剂盒还包含说明书，且说明书记载以下内容：裂解操作在冰上进行，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解10-30min，最优20min，裂解后的样本即可直接逆转录，逆转录的试剂可以采用常规的逆转录方法和试剂，如商业在售的逆转录试剂。
实施例9 本发明的逆转录试剂盒(二)
所述的逆转录试剂盒包含裂解试剂，所述的裂解试剂为碱裂解试剂，配方为：RNase-Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.00001-0.01M，最适浓度为0.001M。
所述的逆转录试剂盒还包含说明书，且说明书记载以下内容：裂解操作在冰上进行，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解5-20min，最优10min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U/μl的RNasin，最佳浓度为2U/μl，裂解后的样本即可直接逆转录。
针对上述两种试剂盒，当采用上述两种裂解液裂解细胞时，每1ml的裂解液可以裂解1×104到1×106个细胞。当细胞增多时，可以适当增加裂解液的含量。逆转录的试剂可以采用常规的逆转录方法和试剂，如商业在售的逆转录试剂。
逆转录的试剂包含：逆转录缓冲液，逆转录酶，RNasin，逆转录引物以及dNTPs等。
逆转录体系包括：
5×逆转录缓冲液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl2；50mM DTT；
10mM dNTPs；
逆转录酶(5U/μl)；
20μM逆转录引物(如oligodT primer或者Random primer)；
RNasin；
本发明方法中，20μl总逆转录体系中，样本裂解液的适宜范围是0.5μl-4μl，最佳的含量为2μl。
逆转录操作步骤示例如下：
冰上操作，配制20μl总逆转录体系，RNase-free EP管中依次加入4μl 5×逆转录缓冲液，2μl样本裂解液，1μl 10mM dNTPs，1μl 20μM逆转录引物，1μl逆转录酶(5U/μl)，1μl40U/μl RNasin，13μl RNase-fre H2O。倘若逆转录酶为MMLV，则37℃恒温15-60分钟(具体时间由逆转录cDNA长度决定)，85℃5秒，4℃保存。倘若逆转录酶为ALV，则42℃恒温15-60分钟(具体时间由逆转录cDNA长度决定)，85℃5分钟，4℃保存。获得的cDNA可以用于PCR等下一步实验或者检测。
本技术技术人员应当认识到，以上实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 唐旌生物科技（上海）有限公司
<120> 一种逆转录方法、逆转录试剂盒及其应用
<130> /
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggttggct ctgactgtac c 21
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<400> 4
tccgtcccag tagattacca c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggtcggtgt gaacggattt g 21
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<212> DNA
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<400> 6
ggggtcgttg atggcaaca 19
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<212> DNA
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<400> 8
acaaattgta tttacataat ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gactgccttc cgggtcactg c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaacaagaag tggagaatgt ca 22
Claims (10)
1.一种逆转录方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过裂解试剂对样本进行裂解，
(2)通过逆转录试剂对裂解后的样本直接进行逆转录。
2.根据权利要求1所述的逆转录方法，其特征在于，所述的裂解试剂为NP-40裂解液，所述的NP-40裂解液配方为：RNase-Free H2O，NP-40，RNasin，其中NP-40的质量浓度为0.2％-5％，RNasin的浓度为1-10U。
3.根据权利要求2所述的逆转录方法，其特征在于，步骤1)的裂解操作具体为：裂解操作在冰上进行，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解10-30min。
4.根据权利要求1所述的逆转录方法，其特征在于，所述的裂解试剂为碱裂解试剂，所述的碱裂解试剂配方为：RNase-Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.00001-0.01M。
5.根据权利要求4所述的逆转录方法，其特征在于，步骤1)的裂解操作具体为：裂解操作在冰上进行，采用RNase-free枪头轻轻吹打，裂解5-20min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U的RNasin。
6.根据权利要求1所述的逆转录方法，其特征在于，所述的样本为细胞、组织或血液。
7.一种逆转录试剂盒，其特征在于，包含裂解试剂，所述的裂解试剂为NP-40裂解液或碱裂解试剂；所述的NP-40裂解液配方为：RNase-Free H2O，NP-40，RNasin，其中NP-40的质量浓度为0.2％-5％，RNasin的浓度为1-10U；所述的碱裂解试剂配方为：RNase-Free H2O，KOH，其中KOH的浓度为0.00001-0.01M。
8.根据权利要求7所述的逆转录试剂盒，其特征在于，还包含逆转录试剂。
9.根据权利要求8所述的逆转录试剂盒，其特征在于，所述的逆转录试剂包含逆转录酶，所述的逆转录酶是MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
10.权利要求7-9任一项权利要求所述的逆转录试剂盒在从样本中获得cDNA的过程中的应用。
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