CN111139532B - 一种dna和rna同时构建测序文库的方法及试剂盒 - Google Patents

一种dna和rna同时构建测序文库的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法及试剂盒，所述方法包括以下步骤：(1)将反应底物中的RNA逆转录形成RNA/cDNA复合双链；(2)在逆转录产物cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物中直接加入Tn5转座酶及打断缓冲液进行片段化，打断的同时在双链的5’端加上部分接头序列；(3)链置换和文库扩增：所得产物中加入扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物，进行PCR扩增；(4)磁珠纯化即可得到原始DNA/RNA的可测序文库。本发明所述方法大大减少了建库步骤，缩短了建库时间，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多真实信息。

Description

一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法及试剂盒。
背景技术
高通量测序技术又称为第二代测序技术，可简写为NGS，是指一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，其测定序列长度一般较短。
高通量测序主要包括以下流程：样本的收集和核酸提取，靶向序列富集和测序文库构建，测序和结果分析。其中文库构建包含对DNA的建库和对RNA的建库。
DNA建库一般是将DNA随机打断，末端修复后加A连接头，连接接头后的DNA片段进行PCR扩增及质控。然后可以根据接头序列来进行测序。
RNA建库常规流程包括：1)mRNA的分离和纯化，包括poly(A)法富集mRNA和去除核糖RNA(rRNA)；2)富集后的RNA进行打断；3)第一链cDNA反转录；4)第二链cDNA合成；5)纯化；6)双链cDNA片段末端补平；7)双链cDNA片段3’端加A尾；8)双链cDNA片段加接头；9)连接产物纯化和片段大小分选；10)PCR扩增；11)纯化；12)检测转录组文库的质量；13)上机测序。
目前对于DNA和RNA同时建库，一般是将RNA先经过逆转录和二链合成后，与DNA混合，然后经过正常的DNA建库流程进行建库具体如图1所示(耗时8小时)，即传统的DNA建库和RNA建库都是对特定核酸进行建库，无法做到真正的DNA和RNA共同建库，该方法操作流程长，步骤繁琐，耗时很长。
DNA和RNA同时建库的关键步骤是转座酶打断步骤，Tn5转座酶对cDNA杂合链的打断效率较低，终止反应时转座酶失活不彻底，转座酶粘在DNA上，影响后续的扩增，都会对建库的质量和速度产生较大的影响。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速简便的DNA/RNA共建库方案及试剂盒，可以将原先耗时8个小时、需要10个步骤的DNA/RNA共建库，缩短至仅需4-5个步骤，仅需2-2.5个小时，大大减少了建库步骤，缩短了建库时间，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多真实信息。
本发明目的之一在于提供一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法，包括以下步骤：
(1)将反应底物中的RNA逆转录形成RNA/cDNA复合双链；
(2)在逆转录产物cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物中直接加入突变型Tn5转座酶及打断缓冲液进行片段化，片段化结束后用终止反应液5×TS-plus进行终止反应，使突变型Tn5转座酶失活；
(3)链置换和文库扩增：步骤(2)所得产物中加入扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物，进行PCR扩增；
(4)磁珠纯化即可得到原始DNA/RNA的可测序文库。
本发明步骤(1)将反应底物中的RNA逆转录形成RNA/cDNA复合双链可以采用本领域的常规逆转录方法进行逆转录。
在本发明的一种实施例中，本发明步骤(2)中突变型Tn5转座酶的突变位点是：D24E、D97E、K160R和E326D同时突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因序列如SEQID NO.2所示。本发明所述的突变型Tn5转座酶cDNA杂合链打断效率较高。
本发明步骤(2)突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度可为1-50ng/ul，优选的，为1-20ng/ul，进一步优选的，为1-10ng/ul，在一种具体的实施方式中，突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度为5ng/ul。
本发明步骤(2)突变型Tn5转座酶打断的同时可以在双链的5’端按照常规加上部分接头序列。
本发明步骤(2)中所用的终止反应液5×TS-plus，包含：0.1％-5％BSA，0.05％-2％Tween-20，0.1-1％SDS，1mM-50mM DTT；优选的，包含：2％-3％BSA，0.05％-1.5％Tween-20，0.1-1％SDS，20mM-30mM DTT；在一种具体的实施方式中，包含2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT。
本发明步骤(2)使突变型Tn5转座酶失活之后可进行磁珠纯化，也可以不进行纯化直接进入下一步的反应，由于本发明步骤(2)中所用的终止反应液5×TS-plus，可以使Tn5转座酶很好的失活，且不会粘在DNA上，对后续实验影响较小，因此即使不进行纯化也可以进行后续步骤。
本发明所述方法步骤(1)中的反应底物可以为DNA和RNA的混合物，也可以是单独的RNA，反应底物可以按照常规方法获得。
在一些实施例中，本发明步骤(2)中的cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物为0.1ng-1μg。发明人发现在进行建库过程中，在本范围的混合物，可以很好的实现本发明所述的共建库的方案。
本发明步骤(2)中的突变型Tn5转座酶可以按照常规方法预先和部分测序接头形成复合物，所包埋的接头可适用于Illumina测序平台、Ion Torrent测序平台和华大智造MGI测序平台。
本发明步骤(2)中的突变型Tn5转座酶可以结合于链霉亲和素磁珠上。
本发明步骤(2)所用的打断缓冲液、步骤(3)所用的扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物可以为本领域常规的打断缓冲液、扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物。
在本发明一种实施例中，本发明的DNA和RNA同时构建测序文库的方法将DNA和RNA同时作为反应底物，在同一管中进行逆转录反应。随后将含有逆转录产物cDNA/RNA杂合链和原始DNA双链的混合物中直接加入突变型Tn5转座酶及打断缓冲液进行片段化。Tn5转座酶(cDNA杂合链打断效率较高的Tn5转座酶)可以根据常规技术进行处理，结合有二代测序需要的部分接头序列，该部分接头序列可以直接连接到cDNA/RNA杂合链的5’端，用终止反应液5×TS-plus进行终止反应。随后对片段化产物进行纯化回收或者不进行纯化，所得产物中加入文库扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物，进行PCR扩增，所用引物为含有测序所需index的接头引物。文库扩增完成后，使用磁珠进行纯化，即可得到原始DNA/RNA的可测序文库。
本发明所述的DNA和RNA同时构建测序文库的方法，流程图可以如图2所示，耗时约2-2.5小时，相比于图1所示的耗时8小时的传统的DNA/RNA共建库流程大大缩短了建库时间。
本发明目的之二在于提供一种DNA/RNA同时构建测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含以下成分：
(1)逆转录反应组分：包含逆转录酶、逆转录反应缓冲液、逆转录引物；
(2)突变型Tn5转座酶片段化组分：包含突变型Tn5转座酶、打断缓冲液、终止反应液5×TS-plus；
(3)链置换和文库扩增组分：包含链置换和扩增酶混合物、扩增缓冲液。
本发明所述试剂盒中的突变型Tn5转座酶和终止反应液5×TS-plus如前所述。
本发明所述试剂盒还可以包含纯化组分，所述纯化组分包含RNA纯化磁珠、DNA纯化磁珠、无核酸酶水。
本发明所述试剂盒中的(3)链置换和文库扩增组分中，还可以包含扩增引物。
本发明的逆转录酶可以为本领域常用的商业化逆转录酶，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript Reverse Transcriptase或HiScript II Reverse Transcriptase或HiScript III Reverse Transcriptase(货号R101或R201或R302)。
本发明的逆转录反应缓冲液可以为本领域常用的逆转录反应缓冲液，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript Reverse Transcriptase或HiScript II ReverseTranscriptase或HiScript III Reverse Transcriptase所附带缓冲溶液，主要成分包括：100-500mM Tris-HCl(pH8.3),100-500mM KCl,1-50mM MgCl2,1-500mM DTT。
本发明的逆转录引物为Oligo(dT)和随机引物的混合物，或Oligo(dT)，或随机引物。
本发明的打断缓冲液可以为本领域常用的商品化Tn5转座酶配套缓冲液，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TTBL组分，即TruePrep Tagment Buffer L。
本发明的RNA纯化磁珠可以为本领域常用的商品化RNA纯化磁珠，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司RNA纯化磁珠VAHTS RNA clean beads。
本发明的DNA纯化磁珠可以为本领域常用的商品化DNA纯化磁珠，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNA clean beads。
本发明的无核酸酶水为经过DEPC处理后灭菌的双蒸水。
本发明的链置换和扩增酶混合物为有链置换活性的酶和DNA聚合酶的混合物，其中有链置换活性的酶，可以如大肠杆菌DNA聚合酶I、klenow片段、Bst DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、逆转录酶、Tth DNA聚合酶等；DNA聚合酶可以如Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶(如南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P505)或VAHTS HiFi DNA聚合酶(如南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N616)或TruePrepAmplify Enzyme(如南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2for Illumina试剂盒中的TAE组分)，或其他等效产品的混合物。
本发明的扩增缓冲液为大肠杆菌DNA聚合酶I、klenow片段、Bst DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、逆转录酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P505)或VAHTS HiFi DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N616)所适配的缓冲溶液，或TruePrepAmplify Enzyme南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2forIllumina试剂盒中的5×TAB组分，即TruePrep Amplify Buffer。主要成分包括10-500mMTris-HCl，10-500mM KCl，0.1-100mM醋酸钾、0.1-100mM硫酸铵的混合物，另外包含BSA、Triton X-100等成分，pH在7.5-9.0之间。
本发明的扩增引物可以为本领常规的扩增引物，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep Index Kit for Illumina试剂盒。
本发明所述试剂盒中的逆转录酶、逆转录缓冲溶液、逆转录引物可以混合为一个或2个混合物。
本发明所述试剂盒中的链置换和扩增酶混合物、扩增缓冲液、扩增引物可以混合为一个或2个混合物。
本发明还提供一种突变型Tn5转座酶，相对于野生型的突变位点是：D24E、D97E、K160R和E326D同时突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的突变型Tn5转座酶cDNA杂合链打断效率较高。
本发明还提供编码所述突变型Tn5转座酶的基因，在一种实施例中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供所述的突变型Tn5转座酶在构建测序文库中的应用。
本发明还提供一种终止反应液5×TS-plus，包含：0.1％-5％BSA，0.05％-2％Tween-20，0.1-1％SDS，1mM-50mM DTT；优选的，包含：2％-3％BSA，0.05％-1.5％Tween-20，0.1-1％SDS，20mM-30mM DTT；在一种具体的实施方式中，包含2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT。
本发明还提供所述的终止反应液5×TS-plus在构建测序文库中的应用。
本发明相对于现有技术的优势：
(1)本发明中运用的突变型Tn5转座酶(D24E、D97E、K160R和E326D同时突变)具有较高的cDNA杂合链打断效率，打断终止缓冲液5×TS-plus可以让转座酶彻底失活，有效防止转座酶粘在DNA上，有利于文库扩增，得到高产量的文库。
(2)所用的终止反应液5×TS-plus，可以使Tn5转座酶很好的失活，且不会粘在DNA上，对后续实验影响较小，因此即使不进行纯化也可以进行后续步骤，因此可以在突变型Tn5转座酶失活之后可进行磁珠纯化，也可以不进行纯化直接进入下一步的反应，本发明实施例可见，无论是否纯化都能实现很好的建库效果。
(3)本发明将图1所示的传统的耗时8个小时、需要10个步骤的DNA/RNA共建库，缩短至仅需4-5个步骤，仅需2-2.5个小时，建库步骤减少一半，建库时间缩短了70％，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多真实信息。
本发明中的部分定义：
高通量测序技术：又称为第二代测序技术、下一代测序技术，可简写为NGS。是指一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，其测定序列长度一般较短。
转座酶：执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。Tn5转座酶是转座酶中的一种，具有随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点，是应用于分子遗传和基因测序的高效工具。
附图说明
图1为传统的DNA/RNA共建库流程；
图2为本发明所述的DNA/RNA共建库流程；
图3为实施例2用TS-plus进行终止反应(实验组二)的Agilent 2100文库峰型；
图4为实施例2用TS组分进行终止反应(对照组二)的Agilent 2100文库峰型；
图5为实施例2TTE-plus Tn5转座酶打断(实验组一)和TTE Tn5转座酶打断(对照组一)的文库电泳图；
图6为实施例3用TS-plus进行终止反应(实验组三)的Agilent 2100文库峰型；
图7为实施例3用TS组分进行终止反应(对照组三)的Agilent 2100文库峰型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：突变型Tn5转座酶的获取
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的突变型Tn5转座酶的制备方法，包括如下步骤：利用基因合成的方法，合成包含了需要突变的位点和替换过的碱基的引物序列如下：
D24-f：CGGCGCTGGGTGAGCCTCGCCGTA
D24-r：TACGGCGAGGCTCACCCAGCGCCG
A97-f：GCCATTGAGGAAACCACCT；
A97-r：AGGTGGTTTCCTCAATGGC；
K160-f：TGCGGATGAAAGGGAGAGTGGCAA
K160-r：TTGCCACTCTCCCTTTCATCCGC
C326-f：CGGATCGACGAGTTCCATA；
C326-r：TATGGAACTCGTCGATCCG；
以Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme，货号P505)为DNA聚合酶。扩增条件为95℃30s；95℃15s；60℃15s；72℃30s-3min；72℃5min；共30个循环。扩增结束后，在50μl反应体系中直接加入1μl DpnI，37℃恒温孵育2小时，消化原始质粒模板。以1％-1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳，得到目的条带后切胶回收。将回收产物利用Mut
Figure BDA0002390253170000071
MultiS Fast Mutagenesis Kit V2(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme，货号C215)进行重组反应，37℃恒温孵育0.5小时。
取20μl冷却反应液，加入到100μl Bl21感受态细胞(Vazyme)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入500μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，测序验证。测序结果表明：本发明合成的突变型Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ NO.2所示，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
实施例2：基于突变型Tn5转座酶的DNA/RNA快速共同建库
本发明的核心在于DNA/RNA的快速共同建库，本实施例中使用的逆转录酶为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III Reverse Transcriptase(货号R302)；使用的逆转录反应缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III Reverse Transcriptase所附带缓冲溶液；使用的逆转录引物为Oligo(dT)20VN和随机引物的混合物；Tn5转座酶为D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变体，即：TTE-plus。打断缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TTBL组分，即TruePrep Tagment Buffer L；打断终止缓冲液5×TS-plus，包含：2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT；RNA纯化磁珠为南京诺唯赞生物科技有限公司RNA纯化磁珠VAHTSRNA clean beads；DNA纯化磁珠为南京诺唯赞生物科技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNAclean beads；无核酸酶水为经过DEPC处理后灭菌的双蒸水；链置换和扩增酶混合物为BstDNA聚合酶和Phanta高保真DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P505)的混合物；扩增缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 forIllumina试剂盒中的5×TAB组分，即TruePrep Amplify Buffer。扩增引物为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep Index Kit for Illumina试剂盒，货号TD202。本实施例以100ng人源HEK293细胞所提取的DNA和RNA混合物作为反应模板，具体建库流程如下：
1、逆转录反应
(1)RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下表1混合液：
【表1】
组分 体积
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O To 8μl
DNA/RNA混合物 100ng
65℃加热5min打开RNA的二级结构，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
(2)配制逆转录反应体系如表2：
【表2】
组分 体积
上一步混合液 8μl
10×RT Mix 2μl
HiScript III Enzyme Mix 2μl
Oligo(dT)<sub>20</sub>VN 0.5μl
Random Primer 0.5μl
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O 7μl
用移液器轻轻吹打混匀。
(3)逆转录反应条件如表3：
【表3】
25℃ 5min
37℃ 15min
85℃ 5sec
2.Tn5转座酶片段化反应
(1)配制片段化反应体系如表4-1和表4-2所示：
【表4-1】实验组一混样体系
组分 体积
5×TTBL 10μl
上一步反应产物 20μl
TTE-plus 5μl
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O 15μl
【表4-2】对照组一混样体系
组分 体积
5×TTBL 10μl
上一步反应产物 20μl
TTE 5μl
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O 15μl
注：TTE-plus是D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变型Tn5转座酶，在反应体系中的终浓度为5ng/ul；
TTE是D97E和E326D同时突变的突变型Tn5转座酶，在反应体系中的终浓度为5ng/ul，取自专利“一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用”，申请号：201611196754.4。
本步骤中实验组一用TTE-plus打断，对照组一用TTE打断，进行平行实验，比较打断效率。
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
(2)片段化反应条件如表5
【表5】
55℃ 15min
10℃ Hold
实验组二：反应完成后立即向实验组一(TTE-plus打断)的产物中加入5μl 5×TS-plus(2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT)，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
对照组二：反应完成后立即向实验组一(TTE-plus打断)的产物中加入普通的打断终止缓冲液，如南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 forIllumina试剂盒中的TS组分，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
3.产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS RNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(1.2×)加入到上一步打断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入25μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取23μl上清至新的灭菌PCR管中。
4、链置换和文库扩增
(1)配制链置换和文库扩增反应体系如表6
【表6】
Figure BDA0002390253170000101
Figure BDA0002390253170000111
使用移液器轻轻吹打混匀。
(2)链置换和文库扩增反应条件
在PCR仪中运行如下表7程序，热盖设置为105℃。
【表7】
Figure BDA0002390253170000112
5.扩增产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(1.2×)加入到上一步打断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中。
6.Qubit检测文库浓度
使用Qubit对所得文库进行浓度测定，计算文库产出表8为TS-plus终止和TS终止所得出的文库产量，可见TS-plus终止效果更好，得到的产量更多。
【表8】
Figure BDA0002390253170000121
7、实验组一TTE-plus Tn5转座酶打断和对照组一TTE Tn5转座酶打断的文库用2％的电泳胶跑胶，得到图5所示结果，图中4m是实验组一TTE-plus Tn5转座酶打断的文库，2m是对照组一TTE Tn5转座酶打断的文库，可见，TTE-plus Tn5转座酶(D24E、D97E、K160R和E326D同时突变)比TTE Tn5转座酶(D97E和E326D同时突变)片段打断的更小，对cDNA杂合链打断效果更好。
8、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行分析，得到下图3、图4所示结果，图3是用TS-plus进行终止反应(实验组二)的文库Agilent2100文库峰型，图4是TS组分进行终止反应(对照组二)的Agilent 2100文库峰型。根据2100图和所得文库产量(表8)可见，使用本方案进行DNA和RNA的共同建库，所得文库产量较高，2100峰型与传统建库所得文库一致。9、Illumina平台上机测序，并进行数据分析，得到下表9数据。
【表9】具体的测序数据情况
Figure BDA0002390253170000122
Figure BDA0002390253170000131
由表9中数据可知，从Reads数、GC含量、Q20、Q30、Clean Rate、Mapping Rate、Duplication Rate、Average sequencing depth、Coverage、表达基因数等信息来看，DNA/RNA共建库流程得到的文库质量高，数据均一度好。
实施例3：基于无需中间纯化的突变型Tn5转座酶的DNA/RNA快速共同建库
本发明的核心在于DNA/RNA的快速共同建库，本实施例中使用的逆转录酶为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III Reverse Transcriptase(货号R302)；使用的逆转录反应缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III Reverse Transcriptase所附带缓冲溶液；使用的逆转录引物为Oligo(dT)20VN；Tn5转座酶为D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变体，即：TTE-plus。打断缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrepDNAlibrary Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TTBL组分，即TruePrep TagmentBuffer L；打断终止缓冲液5×TS-plus，包含：2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mMDTT。DNA纯化磁珠为南京诺唯赞生物科技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNA clean beads；无核酸酶水为经过DEPC处理后灭菌的双蒸水；链置换和扩增酶混合物为Bst DNA聚合酶和VAHTS HiFi高保真DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N616)的混合物。扩增引物为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep Index Kit for Illumina试剂盒，货号TD203。
本实施例以10ng人源HEK293细胞所提取的DNA和RNA混合物作为反应模板，具体建库流程如下：
1、逆转录反应
(1)RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下表10混合液：
【表10】
组分 体积
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O To 8μl
DNA/RNA混合物 10ng
65℃加热5min打开RNA的二级结构，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
(2)配制逆转录反应体系如表11：
【表11】
组分 体积
上一步混合液 8μl
10×RT Mix 2μl
HiScript III Enzyme Mix 2μl
Oligo(dT)<sub>20</sub>VN 1μl
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O 7μl
用移液器轻轻吹打混匀。
(3)逆转录反应条件如表12：
【表12】
25℃ 5min
37℃ 15min
85℃ 5sec
2.Tn5转座酶片段化反应
(1)配制片段化反应体系如表13：
【表13】
组分 体积
5×TTBL 10μl
上一步反应产物 20μl
TTE-plus 5μl
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O 15μl
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
(2)片段化反应条件如表14：
【表14】
55℃ 15min
10℃ Hold
实验组三：反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS-plus(2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT)，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
对照组三：反应完成后立即向产物中加入普通的打断终止缓冲液，如南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TS组分，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
3、链置换和文库扩增
(1)配制链置换和文库扩增反应体系如表15：
【表15】
组分 体积
上一步反应产物 50μl
4×VAHTS HiFi Amplification Mix 25μl
N5XX 10μl
N7XX 10μl
链置换和扩增酶混合物 2μl
Rnase-free ddH<sub>2</sub>O 3μl
使用移液器轻轻吹打混匀。
(2)链置换和文库扩增反应条件
在PCR仪中运行如下表16程序，热盖设置为105℃。
【表16】
Figure BDA0002390253170000151
4.扩增产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取120μl(1.2×)加入到上一步打断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中。
5.Qubit检测文库浓度
使用Qubit对所得文库进行浓度测定，计算文库产出，表17为实验组三TS-plus终止和对照组三TS终止所得出的文库产量，可见TS-plus终止效果更好，大概是对照组的2倍产量。
【表17】
Figure BDA0002390253170000161
6、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行分析，得到下图6和图7所示结果，图6为TS-plus打断终止反应(实验组三)的文库Agilent2100文库峰型，图7为TS组分进行终止反应(对照组三)的Agilent 2100文库峰型。根据2100图和所得文库产量(表17)可见，使用本方案进行DNA和RNA的共同建库，所得文库产量较高，2100峰型与传统建库所得文库一致(3个重复)。
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技有限公司
<120> 一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Thr Ser Ala Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val
1 5 10 15
Phe Ser Ser Ala Ala Leu Gly Glu Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val
20 25 30
Asn Val Ala Ala Gln Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile
35 40 45
Ser Ser Glu Gly Ser Glu Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Tyr
50 55 60
Arg Asn Pro Asn Val Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met
65 70 75 80
Gln Thr Val Lys Leu Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu
85 90 95
Glu Thr Thr Ser Leu Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly
100 105 110
Lys Leu Gly Ser Ile Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser
115 120 125
Val Leu Leu Leu Glu Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His
130 135 140
Gln Glu Trp Trp Met Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Arg
145 150 155 160
Glu Ser Gly Lys Trp Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met
165 170 175
Gly Ser Met Met Ser Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp
180 185 190
Ile His Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val
195 200 205
Val Arg Ser Lys His Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu
210 215 220
Ile Asp His Leu Lys Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser
225 230 235 240
Ile Pro Gln Lys Gly Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg
245 250 255
Pro Ala Arg Lys Ala Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu
260 265 270
Lys Gln Gly Asn Ile Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn
275 280 285
Pro Pro Lys Gly Glu Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Gly Glu
290 295 300
Pro Val Glu Ser Leu Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr
305 310 315 320
His Arg Trp Arg Ile Asp Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Glu Arg Gln Arg Met Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met
340 345 350
Val Ser Ile Leu Ser Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu
355 360 365
Ser Phe Thr Pro Pro Gln Ala Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu
370 375 380
Ala Glu His Val Glu Ser Gln Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp
385 390 395 400
Glu Cys Gln Leu Leu Gly Tyr Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys
405 410 415
Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gln Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu
420 425 430
Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala
435 440 445
Leu Trp Gly Trp Glu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala
450 455 460
Ala Lys Asp Leu Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
465 470 475
<210> 2
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgataactt ctgctcttca tcgtgcggcc gactgggcta aatctgtgtt ctcttcggcg 60
gcgctgggtg agcctcgccg tactgcccgc ttggttaacg tcgccgccca attggcaaaa 120
tattctggta aatcaataac catctcatca gagggtagtg aagccatgca ggaaggcgct 180
taccgatttt accgcaatcc caacgtttct gccgaggcga tcagaaaggc tggcgccatg 240
caaacagtca agttggctca ggagtttccc gaactgctgg ccattgagga aaccacctct 300
ttgagttatc gccaccaggt cgccgaagag cttggcaagc tgggctctat tcaggataaa 360
tcccgcggat ggtgggttca ctccgttctc ttgctcgagg ccaccacatt ccgcaccgta 420
ggattactgc atcaggagtg gtggatgcgc ccggatgacc ctgccgatgc ggatgaaagg 480
gagagtggca aatggctggc agcggccgca actagccggt tacgcatggg cagcatgatg 540
agcaacgtga ttgcggtctg tgaccgcgaa gccgatattc atgcttatct gcaggacagg 600
ctggcgcata acgagcgctt cgtggtgcgc tccaagcacc cacgcaagga cgtagagtct 660
gggttgtatc tgatcgacca tctgaagaac caaccggagt tgggtggcta tcagatcagc 720
attccgcaaa agggcgtggt ggataaacgc ggtaaacgta aaaatcgacc agcccgcaag 780
gcgagcttga gcctgcgcag tgggcgcatc acgctaaaac aggggaatat cacgctcaac 840
gcggtgctgg ccgaggagat taacccgccc aagggtgaga ccccgttgaa atggttgttg 900
ctgaccggcg aaccggtcga gtcgctagcc caagccttgc gcgtcatcga catttatacc 960
catcgctggc ggatcgacga gttccataag gcatggaaaa ccggagcagg agccgagagg 1020
caacgcatgg aggagccgga taatctggag cggatggtct cgatcctctc gtttgttgcg 1080
gtcaggctgt tacagctcag agaaagcttc acgccgccgc aagcactcag ggcgcaaggg 1140
ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat 1200
gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt 1260
agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga 1320
accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg 1380
gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatct 1429

Claims (17)

1.一种DNA和RNA同时构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将反应底物中的RNA逆转录形成RNA/cDNA复合双链；
(2)在逆转录产物cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物中直接加入突变型Tn5转座酶及打断缓冲液进行片段化，片段化结束后用终止反应液5×TS-plus进行终止反应，使突变型Tn5转座酶失活；
(3)链置换和文库扩增：步骤(2)所得产物中加入扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物，进行PCR扩增；
(4)磁珠纯化即可得到原始DNA和RNA的可测序文库；
其中：
步骤(2)中突变型Tn5转座酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(2)中所用的终止反应液5×TS-plus，包含：0.1％-5％BSA、0.05％-2％Tween-20、0.1-1％SDS和1mM-50mM DTT。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度为1-50ng/μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度为1-20ng/μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度为1-10ng/μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度为5ng/μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所用的终止反应液5×TS-plus，包含：2％-3％BSA、0.05％-1.5％Tween-20、0.1-1％SDS和20mM-30mM DTT。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所用的终止反应液5×TS-plus，包含2.5％BSA、1％Tween-20、0.5％SDS和25mM DTT。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物为0.1ng-1μg。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)终止反应使突变型Tn5转座酶失活后，进行纯化或者不进行纯化直接进入下一步的反应。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)终止反应使突变型Tn5转座酶失活后，不进行纯化直接进入下一步的反应。
11.一种DNA/RNA同时构建测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含以下成分：
(1)逆转录反应组分：包含逆转录酶、逆转录反应缓冲液、逆转录引物；
(2)突变型Tn5转座酶片段化组分：包含突变型Tn5转座酶、打断缓冲液、终止反应液5×TS-plus；
(3)链置换和文库扩增组分：包含链置换和扩增酶混合物、扩增缓冲液；
其中，突变型Tn5转座酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
终止反应液5×TS-plus，包含：0.1％-5％BSA、0.05％-2％Tween-20、0.1-1％SDS和1mM-50mM DTT。
12.根据权利要求11所述的DNA/RNA同时构建测序文库的试剂盒，其特征在于，终止反应液5×TS-plus，包含：2％-3％BSA、0.05％-1.5％Tween-20、0.1-1％SDS和20mM-30mMDTT。
13.根据权利要求12所述的DNA/RNA同时构建测序文库的试剂盒，其特征在于，终止反应液5×TS-plus，包含2.5％BSA、1％Tween-20、0.5％SDS和25mM DTT。
14.一种终止反应液5×TS-plus，其特征在于，包含：0.1％-5％BSA、0.05％-2％Tween-20、0.1-1％SDS和1mM-50mM DTT。
15.根据权利要求14所述的终止反应液5×TS-plus，其特征在于，包含：2％-3％BSA、0.05％-1.5％Tween-20、0.1-1％SDS和20mM-30mM DTT。
16.根据权利要求15所述的终止反应液5×TS-plus，其特征在于，包含2.5％BSA、1％Tween-20、0.5％SDS和25mM DTT。
17.权利要求14～16任一项所述的终止反应液5×TS-plus在构建测序文库中的应用。
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