DE10033091A1

DE10033091A1 - Polymer-Chip

Info

Publication number: DE10033091A1
Application number: DE10033091A
Authority: DE
Inventors: Mark Achtmann; Roland Kirchner; Wolfgang Mann; Giovanna Morelli; Hans-Hilger Ropers
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2002-01-31
Also published as: WO2002004111A2; AU2001283928A1; WO2002004111A3

Abstract

Vorgeschlagen wird ein Polymer-Chip, enthaltend eine Vielzahl von Sonden, wobei unterschiedliche Sonden jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet sind und jede Sonde eine Oligomer-Sequenz aufweist und die Oligomer-Sequenz aus einer bekannten Anzahl Monomeren zusammengesetzt ist und an jedem Sondenpunkt mehrere Oligomer-Sequenzen angeordnet sind, die jeweils aus einer Sonden-Sequenz und einer Wobbel-Sequenz zusammengesetzt sind, wobei die Sonden-Sequenz eines Sondenpunktes identisch zueinander sind und die Sonde darstellen und die Wobbel-Sequenzen eines Sondenpunktes jeweils Permutationen der Monomere aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft einen Polymer-Chip.

Polymer-Chips sind im wesentlichen DNA-Chips und Protein-Chips.

Mit der DNA-Chip Technologie werden Sequenzinformationen analysiert, um z. B. zel luläre Funktionen und deren Regulation zu verstehen. Auf DNA-Chips sind Sensormo leküle in geordneten Rastern auf Oberflächen angeordnet. Die Art wie diese Raster erstellt werden, und die verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten variieren jedoch so stark, dass von einer Vielzahl verschiedener Techniken gesprochen werden kann. Übli cherweise wird das zu untersuchende Material aus der Probe, zumeist Zellen, isoliert. Danach erfolgt meist eine Nukleinsäureisolation mit daran anschließender Amplifikati on, zum Beispiel in Form einer PCR (Polymerase Chain Reaction) oder einer selektiven Anreicherung zum Beispiel über eine mRNA Isolation. In der Regel wird die mRNA mittels einer reversen Transkriptase in eine cDNA umgeschrieben. Dieser Schritt bein haltet herkömmlicherweise eine Markierung der späteren Hybridisierungsprobe, so dass nach der Hybridisierung werden kann. Daran schließt sich die Datenanalyse an, die bei Mikroarray-Hybridisierungen in Abhängigkeit von der Integrationsdichte häufig den zeitaufwendigsten Schritt darstellt. Diese Chip Technologien haben den Vorteil, dass sie die Verfahren der Probenaufbereitung über die Hybridisierung und Detektion bis hin zur Datenanalyse integrieren. Durch die weitest gehende Parallelisierung von Analysenschritten kann der Probendurchsatz erhöht werden (Medizinische Genetik Nr. 1 März 1999 Jahrgang 11 S. 1-32).

Ein DNA-Chip besteht aus einem Träger und den für das jeweilige Experiment notwen digen, darauf fixierten Molekülen. Bei der Herstellung werden diese Moleküle entweder in situ mittels photolithographischer Techniken unter Verwendung physikalischer Mas ken auf der Matrix synthetisiert, oder durch verschiedene Verfahren aufgedruckt, wie beispielsweise das Kontaktverfahren mit Hilfe von Kapillarnadeln oder die Nichtkontakt verfahren auf Basis von piezoelektronischen Tintenstrahldüsen. Die Herstellung von aufgedruckten DNA-Mikro-Arrays gliedert sich in die Aktivierung bzw. die Beschichtung der festen Chipmatrix, an die Biomoleküle über eine geeignete Kopplungschemie fixiert werden. Grundlegende Patentanmeldungen zu DNA-Chips sind z. B. EP 0 619 321 A, EP 0 373 203 A, EP 0 476 014 A und EP 0 386 229 A.

Kovalente Kopplungen lassen Mehrfachhybridisierungen von Biochips zu. Die Hybridi sierung von DNA-Mikroarrays gelingt bis jetzt nur bei geringer Komplexität. Dies be deutet, dass nur bei einer geringen Sondendichte eine vernünftige einfache Hybridisie rung ermöglicht wird. Oligonukleotid-Chips werden mit wachsender Komplexität des Chips teurer, die besonders bei hohen Integrationsdichten zum Tragen kommt. Im all gemeinen werden für Nukleinsäure- oder DNA-Untersuchungen verschiedene Fluores zenzfarbstoffe als Markierungsagenzien verwendet. Eine andere Variante ist die Detek tion mit der MALDI-TOF-Analyse (Mass Absorption Laser Desorption Ionization-Time of Flight Spektrometrie) auf Basis der Massenspektrometrie, bei der auf Markierungszu sätze verzichtet werden kann.

Aus der EP 0 923 050 A ist ein Computer-System zur Auswertung von DNA-Chips be kannt.

Bekannt ist z. B. das Pentamere und Octamere auf Polyacrylamid-Gelpads hergestellt und immobilisiert werden (DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotid microchips A. A. Stomakhin, Richard J. Cotter et al. Nucleic Acids Research, 2000, Vol.

28 No.5 1193-1198). Es ist außerdem beschrieben, dass 10 verschiedene immobili sierte Octamere mit einem 28 Basen langen DNA-Abschnitt und im Anschluss jeweils mit einem Gemisch aus 10 unterschiedlichen Pentameren umgesetzt werden. Dies führt zu insgesamt 13 bp langen Doppelsträngen, die sich aus benachbarten 8 und 5 bp langen Hybriden zusammensetzen, wobei letztere das Markierungsagens enthalten und durch die Nachbarschaft zu ersteren stabilisiert und damit detektierbar werden. Das Pentamer, das die Hybridisierung eingegangen ist, wird vorzugsweise MALDI- spektrometrisch untersucht, da die Fluoreszenzspektrometrie in diesem Fall ver gleichsweise wenig sensitiv und aussagekräftig ist. Allerdings ist die Sensitivität und der Messbereich dieses Verfahrens so gering, dass es nicht routinemäßig verwendet wer den kann.

Eine wesentliche Grundlage der DNA-Chip Technologie ist die Hybridisierung. Einzel stränge der Desoxyribo-(DNA) oder Ribo-(RNA)nukleinsäure sind aus Basen wie A denin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G), Uracil (U) oder Inosin (I) zusammenge setzt. Sie sind in der Lage, zu Doppelsträngen zu hybridisieren. Dabei werden A mit T oder mit U, C mit G oder mit I über Wasserstoffbrücken verknüpft. Es bilden sich soge nannte Basenpaare, z. B. AT oder CG. Darüber hinaus können nicht komplementäre Basenpaare vorliegen, z. B. AG, GU.

Bringt man unter geeigneten Bedingungen zwei verschiedene Einzelstränge zusam men, die genügend benachbarte komplementäre Basenpaare enthalten, hybridisieren sie zu einer doppelsträngigen Nukleinsäure. Unter geeigneten Bedingungen erhält man so DNA/DNA-, DNA/RNA- und RNA/RNA-Hybride.

Die Hybridisierung von Nukleinsäuren findet Anwendung in der Detektion bestimmter Nukleinsäuresequenzen aus Probenmaterial, das zuvor aufbereitet werden muss. Da bei werden zur gesuchten Nukleinsäuresequenz komplementäre Oligonukleotide her gestellt, die mit der gesuchten Sequenz hybridisieren. Die Bildung eines solchen Dop pelstrangs muss dann mittels geeigneter Methoden nachgewiesen werden.

In Hybridisierungsexperimenten ist entweder die zu untersuchende Nukleinsäure-Probe oder die zur gesuchten Nukleinsäuresequenz komplementäre Oligonukleotidsequenz an einer festen Phase immobilisiert. Nach erfolgreicher Hybridisierung kann das Pro dukt gewaschen werden. Der Nachweis erfolgt i. d. R. über bei der Hybridisierung oder später eingebaute Radioisotope, Färbemittel oder andere Markierungsagenzien, die letztendlich die spätere Detektion eines Signals auf physikalischem Wege ermöglichen (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, S. 67). Auf diese Weise können viele Einzel-Untersuchungen auf sogenannten Polymer-Chips parallel ausgeführt werden, was den möglichen Probendurchsatz pro Zeiteinheit erhöht.

Die Analyse von biologischem Probenmaterial durch Reaktion mit Polymer-Chips führt zu an der Chip-Oberfläche immobilisierten Molekülen, deren Topologie und Quantitäten auf dem Polymer-Chip Aussagen über die Menge einer bestimmten Nukleinsäurese quenz, eines Gens oder eines Genprodukts in diesem Probenmaterial ermöglichen. Daraus lassen sich biologische Informationen z. B. über Genexpressionen und Mutatio nen in einem Genom ableiten. Diese haben einen potentiellen, beschleunigenden Nut zen bei der Entwicklung neuer Medikamente, in der Diagnose und anderen Bereichen der biomedizinischen und biochemischen Forschung (M. Schena, R. W. Davis, Genes, genomes and chips in DNA Microarrays, Hrsg. M. Schena, Oxford University Press 1999).

Um eine Hybridisierung fehlerfrei detektieren zu können, muss diese unter den jeweils üblichen Bedingungen hinreichend stabil und spezifisch sein.

Die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs drückt sich in seiner Schmelztemperatur aus. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der ein potentielles Hybrid zu glei chen Teilen doppelsträngig und einzelsträngig vorliegt. Sie hängt von der Art und Zu sammensetzung der Basenpaare ab, aus denen ein Doppelstrang zusammengesetzt ist, sowie der Konzentration der vorhandenen Nukleinsäurestränge und der Art und Zu sammensetzung des Mediums, in dem der Doppelstrang vorliegt.

Die Spezifität einer Hybridisierung, also der Grad an Hybriden die keine Fehlbindung im Sinne von nicht komplementären Basenpaaren enthalten, hängt eng mit der Stabilität der gebildeten Hybride zusammen. Benachbarte komplementäre Basenpaare feisten in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Art und Zusammensetzung einen Beitrag zur Gesamtstabilität eines Hybrids. Liegt innerhalb eines Hybrids eine Fehlbindung im Sinne eines nicht komplementären Basenpaares vor, so fehlt im Vergleich zu einem fehlerfrei ausgebildeten Hybrid der Beitrag eines Basenpaares sowie zweier solcher Wechselwir kungen zur Bildungsenthalpie jener fehlgebildeten Hybride. Dies drückt sich in der nied rigeren Schmelztemperatur der fehlgebildeten Hybride gegenüber den Hybriden ohne Fehlbindung aus. So weist z. B. ein vollständig komplementäres DNA/DNA-14mer ge genüber einem 14mer mit einer Fehlbindung eine um ca. 7°C erhöhte Schmelztempe ratur auf (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, Kap.3). Ein Anteil von 1% Fehlbindung in einem gegebenen Hybrid erniedrigen dessen Schmelztemperatur um ca. 1°C. Deshalb ist die für die Durchführung einer Hybridisie rung gewählte Temperatur neben der Art und Zusammensetzung des Reaktionsmedi ums ein Kontrollparameter für die Spezifität einer Hybridisierung (R. J. Britten, E. H. Da vidson, Hybridization strategy in Nucleic acid hybridization: a practical approach, Hrsg. B. D. James, S. J. Higgins, IRL Press 1985).

Ferner hängt die Spezifität einer Hybridisierung von der Länge der in das Hybrid einge henden Basenfragmente ab. Je mehr benachbarte Basenpaare hybridisieren, desto schneller verläuft die eigentliche Hybridisierung. Eine Fehlbindung hingegen verlang samt die Bildung eines Hybrids. Dieser Geschwindigkeitsunterschied wächst mit der Anzahl der ein Hybrid bildenden Basenpaare. 10% Fehlbindung in einem gegebenen Hybrid verlangsamen die Reaktionsgeschwindigkeit i. d. R. um die Hälfte (R. J. Britten, E. H. Davidson, Hybridization strategy in Nucleic acid hybridization: a practical approach, Hrsg. B. D. James, S. J. Higgins, IRL Press 1985).

Können zwei DNA-Einzelstränge acht oder mehr Basenpaare bilden, gilt wegen der realisierbaren Spezifität und der Bindungsstärke der einzelnen Basenpaare die Bildung fehlerfreier Doppelstränge in der überwiegenden Zahl der Hybridisierungen als sicher (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, S. 11).

Will man eine kurze Nukleotidsequenz in einer Probe mit Hilfe eines einzelnen DNA- Chips detektieren (z. B. eine Punktmutation eines Gens oder ein Allel), so ist dies aus den o. a. Gründen nur möglich, wenn die letztendlich zu detektierenden Hybride eine bestimmte Mindestlänge aufweisen.

Anwendungsbeispiele für Hybridisierungsexperimente sind z. B. der Nachweis von My coplasma Pneumoniae (EP 0 173 920 A2), die Detektion des Proteins human telome rase reverse transkriptase (hTRT) (EP 0 841 396 A1), die Detektion von bestimmten Polymorphismen (z. B. EP 0812 922 A2).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Polymer-Chip zu schaf fen, der zur Analyse von kurzen Sequenzen geeignet ist.

Die Aufgabe wird durch einen Polymer-Chip mit den Merkmalen des Anspruchs 1 ge löst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Der erfindungsgemäße Polymer-Chip enthält eine Vielzahl von Sonden. Unterschiedli che Sonden sind jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet und jede Sonde weist eine Oligomer-Sequenz auf. Die Oligomer-Sequenz ist aus einer bekannten Anzahl von Monomeren zusammengesetzt.

Der erfindungsgemäße Polymer-Chip zeichnet sich dadurch aus, dass an jedem Son denpunkt mehrere Oligomer-Sequenzen angeordnet sind, die jeweils aus einer Son den-Sequenz und einer Wobbel-Sequenz zusammengesetzt sind, wobei die Sonden- Sequenz eines Sondenpunktes identisch zu einander sind und die Sonde darstellen und die Wobbel-Sequenzen eines Sondenpunktes jeweils Permutationen der Monome re umfassen.

Durch das Vorsehen der Wobbel-Sequenzen, die Permutationen der Monomere um fassen, weist eine einzelne Oligomer-Sequenz deutlich mehr Monomere auf, als wenn lediglich eine Sonden-Sequenz vorhanden wäre. Durch die Erhöhung der Anzahl der Monomere in den Oligomer-Sequenen mittels der Wobbel-Sequenzen können die Oli gomer-Sequenzen mit einer für eine stabile Hybridisierung ausreichende Länge ausge bildet sein. Da die Wobbel-Sequenz eines Sondenpunktes Permutationen der Mono mere umfassen, ist lediglich die Sonden-Sequenz für ein bestimmtes Probenmaterial, mit dem es hybridisiert spezifisch, da eine beliebige, für die jeweilige Probensequenz geeignete Wobbel-Sequenz mit dieser hybridisieren kann.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polymer-Chips ist in An spruch 2 angegeben, bei dem die Wobbel-Sequenzen eines jeden Sondenpunktes die gleiche Anzahl Monomere aufweisen und alle Permutationen der Monomere umfassen. Hierdurch wird bei Komplementarität der Sonden-Sequenz mit einem Abschnitt der Proben-Sequenz eine Oligomer-Sequenz vorgegeben, die in allen Monomeren kom plementär zu dem korrespondierenden Abschnitt der Probensequenz ist.

Die Weiterbildung nach Anspruch 3 betrifft einen Polymer-Chip, bei dem die Sonden alle Permutationen der Sonden-Sequenzen umfassen. Für jede Permutation ist ein Sondenpunkt auf dem Polymer-Chip vorgesehen. Ein solcher Chip kann als Universal- Chip bezeichnet werden, denn mit diesem Chip können beliebige Probensequenzen untersucht werden, da alle theoretisch möglichen Sonden einer bestimmten Länge auf dem Chip vorhanden sind.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Sonde aus ei nem Hexamer und die Wobbel-Sequenz besteht aus 3 bis 8 Monomeren, noch bevor zugter ist eine Hexamer-Sonde mit einer Wobbel-Sequenz mit 4 bis 7 Monomeren.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung mehr im Detail mit Bezug auf das in den Zeichnungen gezeigte Beispiel beschrieben, das jedoch nicht angegeben sein soll, um den Bereich der vorliegenden Erfindung zu beschränken.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 einen mittels Fluoreszenzspektrometrie ausgewerteten DNA-Chip,

Fig. 2 eine Tabelle, die die Intensitäten der Proben des DNA-Chips aus Fig. 1 enthält,

Fig. 3 einen schematischen Ausschnitt des erfindungsgemäßen Chips, und

Fig. 4a)-e) jeweils schematisch die Abfolge der auf dem erfindungsgemäßen Chip ausgeführten Reaktionsschritte,

Fig. 5a)-e) Auflistung von im Ausführungsbeispiel untersuchten Sequenzen.

Das Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Polymerchips ist ein DNA-Chip, wie in Fig. 3 ausschnittweise dargestellt. Der Chip weist eine Trägerplatte 1 auf, die im Ausführungsbeispiel aus Glas ausgebildet ist. Die Trägerplatte 1 weist Sondenpunkte 2 auf, an denen Oligonukleotide 3 angebracht sind. Diese setzen sich aus drei Abschnit ten zusammen, nämlich einem Spacer 4, einer Wobbel-Sequenz 5 und einer Sonden- Sequenz 6. Die Gesamtheit der Wobbel-Sequenzen 5 und der Sonden-Sequenzen 6 eines Sondenpunktes 2 stellen jeweils eine Sonde 8 dar.

Alle Sonden-Sequenzen 6 eines jeden Sondenpunktes 2 sind identisch. Die Sonden- Sequenzen 6 bestehen aus jeweils einem Hexamer XXXXXX, in dem X für je eine der vier Basen A, T, G und C steht, und das eine spezifische Sequenz bestehend aus die sen Basen besitzt.

Im vorliegenden Ausführungsbeispiel bestehen die Spacer 4 aus Thymidin-Decameren, die über das 5'-Ende mittels NH₂-Bindung auf der Trägerplatte 1 angebracht sind.

Die Wobbel-Sequenzen 5 bestehen aus Polymeren N_i , in denen N für je eine der vier Basen A, T, G und C steht. Die Wobbel-Sequenzen 5 der Oligonukleotide 3 eines jeden Sondenpunktes umfassen sämtliche 4ⁱ Permutationen, wobei i die Anzahl der Basen der Wobbel-Sequenzen 5 ist. Bei aus sechs Monomeren (i = 6) bestehenden Wobbel- Sequenzen 5 ergeben sich somit 4⁶ = 4096 Permutationen, weshalb entsprechend viele Oligonukleotide 3 auf jedem Sondenpunkt 2 angebracht sind.

Ferner weist jeder Sondenpunkt 2 mindestens ein Streptavidinmolekül 7 auf. Dabei sind die Streptavidinmoleküle 7 derart auf der Trägerplatte 1 angebracht, dass mit Biotin versehene DNA-Probe an diese gebunden und somit in räumlich unmittelbarer Nähe zu den Oligonukleotiden 3 selektiv an einem jeden Sondenpunkt 2 immobilisiert werden kann. Außerhalb der Bereiche der Sondenpunkte 2 sind keine Streptavidinmoleküle 7 auf der Trägerplatte 1 vorgesehen.

Die Fig. 4a bis 4e zeigen schematisch an einem einzelnen Oligonukleotid 3 die im fol genden durchgeführten Reaktionsschritte.

Aus dem zu untersuchenden biologischen Material wird ein zu untersuchender Nuklein säureabschnitt mittels PCR amplifiziert und z. B. an QIAquick-Säulen (von QIAgen) ge reinigt. Dabei wird für einen der entstehenden Stränge ein Primer verwendet, der am 5'- Ende mit Biotin 12 versehen ist. Dieser Primer wird so gewählt, dass er um die zu un tersuchende Sequenz verlängert wird.

Das PCR-Produkt 9 enthält zwei komplementäre Stränge 10 und 11, von denen einer am 5'-Ende mit einem Biotin 12 versehen ist. Das PCR-Produkt 9 wird auf dem Chip inkubiert (Fig. 4a) und mittels einer Biotin-Streptavidin-Kopplung an den Sondenpunk ten 2 immobilisiert (Fig. 4b). Das immobilisierte PCR-Produkt 9 wird durch Spülen mit Denaturierungslösung denaturiert und anschließend mit Bindepuffer gewaschen. Hier durch werden die nicht biotinylierten und deshalb nicht immobilisierten Stränge 11 ent fernt. Zurück bleiben einzelne an den Sondenpunkten 2 angebrachte immobilisierte DNA-Stränge 10, die derart immobilisiert jeweils eine Probe 13 darstellen (Fig. 4c). Enthält die Probe 13 einen zur Sonden-Sequenz 6 komplementären Bereich DNA, so lassen sich Oligonukleotid 3 und Probe 13 hybridisieren.

Wie oben angeführt, sind in einem jedem Sondenpunkt 2 4096 verschiedene Oligo nukleotide 3 angebracht, die sich untereinander lediglich in ihrer Wobbel-Sequenz 5 unterscheiden, und diese Wobbel-Sequenz 5 beinhaltet alle möglichen Permutationen der 4 Basen A, T, C und G.

Hybridisiert eine Probe 13 mit einem Oligonukleotid 3, so lagern sich jeweils bis zu 12 Basen des Oligonukleotids 3 an bis zu zwölf komplementäre Basen dieser Probe 13 an. Die Probe 13 weist sechs Basen auf, die zur Sonden-Sequenz 6, und dazu benachbart bis zu sechs Basen, die zur Wobbel-Sequenz 5 komplementär sind. Da an einem Son denpunkt 2 Wobbel-Sequenzen 5 mit allen 4096 Permutationen von sechs Basen vor handen sind, kann der Abschnitt der Probe 13, der mit der Wobbel-Sequenz 5 hybridi siert eine beliebige Sequenz aus bis zu sechs Basen umfassen. Der Abschnitt der Pro be 13, der mit der Sonden-Sequenz 6 hybridisiert, soll komplementär zu der Sonden- Sequenz 6 des jeweiligen Sondenpunktes 2 sein. Deshalb kann an einem Sondenpunkt 2 nur eine Probe 13 vollständig mit einem Oligonukleotid 3 hybridisieren, die einen zur Sonden-Sequenz 6 komplementären Abschnitt aufweist. Die Wobbel-Sequenzen 5 und die Sonden-Sequenzen 6 der Oligonukleotide 3 eines jeden Sondenpunktes 2 bilden somit für jeweils ein Hexamer spezifische Sonden 8, obwohl diese über eine Länge von bis zu zwölf Basen mit der Probe hybridisieren. Da die Sonde 8 lediglich für sechs Ba sen spezifisch ist, genügen 4096 Sondenpunkte 2, um alle möglichen Permutationen von Sonden 8 auf einem Chip vorzusehen. Dies ist ein Universalchip, mit dem jede be liebige Probe in Hexamere untergliedert analysiert werden kann.

Zur Darstellung eines Universalchips wäre es prinzipiell auch möglich an jedem Son denpunkt lediglich ein einzelnes Oligonukleotid mit sechs Basen vorzusehen, das die jeweilige Sonde darstellt. Derart kurze Oligonukleotide können jedoch nicht ausrei chend stabil mit einer Probe hybridisieren (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, Wiley- Interscience, New York 1999, S. 11).

Es hat sich gezeigt, dass der Beitrag des Basenpaares G-C zur Schmelztemperatur einer doppelsträngigen DNA etwa 4°C und eines Basenpaares A-T etwa 2°C beträgt. Für eine Sequenz von sechs Basenpaaren ergibt sich somit eine Schmelztemperatur von 12-24°C. Dies zeigt, dass bei den üblichen Reaktionsbedingungen mit Temperatu ren von zumindest 30°C Hexamere keine stabilen Hybridisierungsprodukte bilden kön nen.

Ferner wird die Stabilität und Spezifität der aus zueinander passenden Proben 13 und Sonden 8 entstehenden Hybride 14 durch die Immobilisierung der Proben 13 in den Sondenpunkten erhöht.

Durch das Vorsehen der Wobbel-Sequenz 5 wird eine stabile Hybridisierung möglich, obwohl die Sonde 8 lediglich für eine Sequenz von wenigen Basen (4-8 Basen) spezi fisch ist.

In einem weiteren Schritt wird ein PCR Reaktionsansatz aufgetragen, der Polymerase, dGTP, dATP, dCTP und cy3-dUTP enthält (Fig. 4d)-e)). Man versiegelt den Chip und unterwirft ihn einem für die PCR typischen Temperaturprofil. Hierbei wird z. B. eine Temperatur von 94°C (Denaturierung der gebildeten Doppelstränge) für eine Dauer von 30 s, eine Temperatur von 30°C (Hybridisierung der Proben 13 mit Sonden 8) für eine Dauer von 30 s und eine Temperatur von 50°C (Elongation der hybridisierten Sonden) für eine Dauer von einer Minute eingestellt. Dieser Zyklus wird beispielsweise dreißig mal wiederholt. Die PCR wird beendet, indem man die Probe auf eine Temperatur ab kühlt, bei der die Polymerase nicht mehr aktiv ist, z. B. 4°C.

In stabilen Hybridisierungsprodukten 14, die über die gesamte Länge der Sonden- Sequenz 6 korrespondierende komplementäre Basen beinhalten, wird die Sonden- Sequenz 6 von der Polymerase in jedem Zyklusschritt elongiert.

In stabilen Hybridisierungsprodukten 14, bei denen zur 3'-endigen Base der Sonden- Sequenz 6 keine passende komplementäre Base auf der Probe 13 vorliegt, erfolgt kei ne Elongation der Sonden-Sequenz 6, da das 3'-Ende der Base nicht mit der Sonde hybridisieren kann.

Wenn nicht komplementäre Basenpaare (als komplementär gelten Watson-Crick- Basenpaare GC und AT) innerhalb des Doppelstrangs vorliegen, und das 3'-Ende der Sonde 8 komplementär an eine Base der Probe 13 gebunden ist, und das Hybridisie rungsprodukt 14 dennoch ausreichend stabil ist, wird die Sonden-Sequenz 6 elongiert.

Besteht zwischen der Sonden-Sequenz 6 und der Probe 13 während eines PCR-Zyklus eine Fehlbindung im Sinne eines nicht komplementären Basenpaars, so kann dennoch eine stabile Hybridisierung erreicht werden, wenn die Wobbel-Sequenz 5 weitgehend zu dem korrespondierenden Abschnitt der Probe 13 komplementär ist. Liegt eine derar tige Fehlbindung im Bereich der Sonden-Sequenz 6 vor, hat dies zur Folge, dass bei den Hybridisierungen in den einzelnen PCR-Zyklen die Wahrscheinlichkeit deutlich ge ringer ist, dass ein stabiles Hybridisierungsprodukt 14 erzielt wird. Deshalb werden bei Vorhandensein eines nicht komplementären Basenpaars im Bereich der Sonden- Sequenz 6 im Verlauf der PCR-Reakion nur wenige oder keine Elongationen der Son den-Sequenz 6 erfolgen.

Liegt ein nicht komplementäres Basenpaar nur im Bereich der Wobbel-Sequenz 5 wäh rend eines PCR-Zyklus vor, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass im nachfolgenden PCR-Zyklus wiederum eine stabile Hybridisierung erzielt wird. Die Probe 13 besitzt einen zu den Sonden-Sequenzen 6 aller Oligonukleotide 3 des Sondenpunkts 2 korres pondierenden Abschnitt, so dass sie mit einer Vielzahl von Oligonukleotiden 3 hybridi sieren kann, die entweder eine exakt passende Wobbel-Sequenz 5 oder eine nur ge ringfügig abweichende Wobbel-Sequenz 5 besitzen. Als geringfügig abweichend wer den Sequenzen beurteilt, die mit weniger als vier, vorzugsweise weniger als zwei nicht komplementären Basenpaaren hybridisieren können.

Da die Probe 13 mit unterschiedlichen Oligonukleotiden in den einzelnen PCR-Zyklen hybridisieren kann, werden in der Regel mehrere unterschiedliche Oligonukleotide 3 eines Sondenpunktes 2 durch die Polymerase elongiert, wenn eine Komplementarität bezüglich der Sonden-Sequenz 6 und einem Abschnitt der Probe 13 vorliegt. Im Verlauf dieser Elongationen werden sukzessive mit einem Fluoreszenzmarker ausgestattete dNTPs - im vorliegenden Fall cy3-dUTP - in die PCR-Produkte 15 eingebaut, die bei spielsweise mit einem Scanner detektierbar sind. Je mehr Marker in einem Sonden punkt 2 inkorporiert werden, desto stärker ist das entsprechende Signal.

Mit fortschreitender Elongation und Zyklenzahl steigt die Anzahl der eingebauten fluo reszenzmarkierten Basen. Nach einer gewählten Anzahl von Zyklen wird die PCR- Reaktion abgebrochen, überschüssige dNTPs werden durch Waschen entfernt und der Chip mittels Fluoreszenzspektrometrie ausgewertet. Dabei fluoreszieren diejenigen Sondenpunkte 2 auf dem DNA-Chip am stärksten, deren Sonde 8 spezifisch für die jeweilige Probe 13 ist, weil aus den o. a. Gründen vor allem deren Oligonukleotide 3 zu Hybridisierungsprodukten 15 elongiert werden.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Chips und dessen Einsatz bei der Detektion von Nukleinsäurematerial unterschiedlicher Länge sind in der schnellen Re aktion des Chips sowie der direkten Auswertung durch die Fluoreszenzspektroskopie und der universellen Einsetzbarkeit des Chips und seiner Kostenreduktion gegenüber den bekannten Verfahren zu sehen.

Mit einem Polymer-Chip der oben beschriebenen Art ist es möglich, Mutationsanalysen einfach, schnell und sehr effektiv durchzuführen, die zu einer schnellen Identifikation auch unbekannter Sequenzvariationen führen.

Eine Verwendung des erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Chips liegt in epidemiologi schen Bereichen der Medizin.

Anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels wird die Benutzung des erfindungsge mäßen DNA-Chip erläutert.

Beispiel

Ein erfindungsgemäßer Polymer-Chip mit 100 verschiedenen Hexamersequenzen wurde mit einem mit einem kommerziellen System (Spotting Robot, Beecher Instru ments, Silver Springs, USA) hergestellt.

Die Oligonukleotide lagen beim Spotting in einer Konzentration von 50 µmol in 0.5 M Streptavidin (von Sigma) vor. Die Bindungschemie über NH₂ modifizierte Oberflächen war hinreichend beschrieben ("Versatile derivatization of solid support media for cova lent bonding on DNA-microchips", M. Beier, J. D. Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, Nr. 9, 1970-1977). Hierzu wurden kommerziell erhältliche Glasoberflä chen (z. B. von Perkin Eimer) verwendet.

Die zu immobilisierenden Oligonukleotide 3 hatten generell folgende Struktur:

5'-T₁₀-N₆-XXXXXX

wobei XXXXXX die Sonden-Sequenz 6 darstellt und gemäß dem Ausführungsbeispiel für ein Hexamer steht.

N steht für je eine der 4 Basen G, A, T oder C, N₆ für die Wobbel-Sequenz 5 und T für Thymidin.

Homologe Genabschnitte von Neisseria Meningitis mit einer Länge von 300 bp wurden per PCR amplifiziert. Derjenige Primer, der um die zu den Sonden-Sequenzen 6 kom plementäre Sequenz verlängert wurde, trägt 5-endig einen Biotinlabel 12. Die PCR Produkte wurden nach Amplifikation an Säulen z. B. von QIAquick (von QIAGEN) gerei nigt.

Mit einem kommerziell erhältlichen Klebstreifen (von Biozym) wurde der Array einge rahmt.

Das zu untersuchende PCR Produkt 9 wurde nach der Reinigung vermessen und ein Aliquot von 10 ng 30 min bei Raumtemperatur in Bindepuffer (5 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl) auf dem Chip inkubiert.

Die Denaturierung erfolgte durch Spülen mit 1 ml Denaturierungslösung (0.1 M NaOH). Anschließend wurde mit dem gleichen Volumen Bindepuffer gewaschen. Es wurden dann 25 µl PCR Reaktionsansatz zugegeben (200µM dGTP, dATP, dCTP, cy3-dUTP, 1 × PCR Reaktionspuffer, 1 U Red Taq Polymerase, von Sigma)

Der Reaktionsansatz wurde mit einer Folie (von Biozym) versiegelt und anschließend in einem kommerziellen Thermocycler für in situ PCR (von Biozym) folgendem Thermo profil unterworfen:

Zuerst wurde der Reaktionsansatz für 30 Sekunden auf 94°C erhitzt. Danach wurde 30 Sekunden auf 30°C gekühlt und hieran anschließend auf 50 C° für 1 Minute erhitzt. Dieser Vorgang wurde dreißig Mal wiederholt. Anschließend wurde auf 4°C abgekühlt.

Nach diesem Prozess wurden Klebestreifen und Folie entfernt und der Objektträger mit Bindepuffer gewaschen, anschließend zum Trocknen zentrifugiert.

Die Auswertung der Signale erfolgt mittels eines kommerziell erhältlichen Laser Scan ners (z. B. von MWG BIOTECH AG).

Der oben erläuterte Prototyp eines DNA-Chips mit 100 verschiedenen Hexamerse quenzen, wird nachfolgend anhand der Fig. 1, 2 und 3 näher erläutert. Zu Testzwe cken sind jedoch jeweils zwei benachbarte Sondenpunkte mit der gleichen Sonde aus gebildet, weshalb der vorliegende DNA-Chip 300 Sondenpunkte umfasst. Ein solcher Sondenpunkt 2 besitzt einen Durchmesser von ca. 200 Mikrometern.

Bei den mit dem Prototypen ausgeführten Untersuchungen ist die in Fig. 3 gezeigte Gensequenz pgm-14 als Probe auf den DNA-Chip aufgetragen worden.

Der mit der Probe versehene DNA-Chip ist mit dem oben beschriebenen PCR- Verfahren (ein PCR Reaktionsansatz: Polymerase, dGTP, dATP, dCTP und cy3-dUTP; 94°C - 30 s, 30°C - 30 s und 50°C - 1 Minute, 30 Zyklen) aufbereitet worden, wobei der Farbstoff cy3 zur späteren Detektion eingebaut worden ist.

Der derart aufbereitete DNA-Chip wurde mit einem Laser-Scanner abgetastet. Ein Aus schnitt des abgetasteten Bildes des DNA-Chips ist in Fig. 1 gezeigt.

Helle Bereiche stellen dabei stark fluoreszierende Sondenpunkte 2, graue Bereiche schwach fluoreszierende Sondenpunkte 2 und dunkle Bereiche nicht oder kaum fluo reszierende Sondenpunkte 2 sowie den Bereich außerhalb der Sondenpunkte 2 dar. Die Sondenpunkte 2 sind in Form eines Rasters angeordnet, das durch waagerechte Reihen und senkrechte Spalten aufgespannt wird. Die auf dem Chip angeordneten Sondenpunkte 2 mit identischen Sonden sind jeweils in einer Spalte benachbart. Somit bilden zwei Sondenpunkte 2, die in derselben Spalte untereinander angeordet sind, und von denen sich der obere in einer ungeraden und der untere in einer geraden Rei he befindet eine Einheit (Fig. 1), da diese beiden Sondenpunkte 2 jeweils die gleiche Sonde 8 beinhalten.

In der Tabelle (Fig. 2) sind die zu den Sonden-Sequenzen 6 der Sondenpunkte 2 kom plementären, detektierbaren Nukleotid-Sequenzen (Sequence), die Reihe (Row) und Spalte (Column), die mittels Fluoreszenzspektrommetrie ermittelte Lichtintensität des jeweiligen Sondenpunktes 2 (S#1 Mean) und die Anzahl der dabei gemessenen Pixel (S#1 Area) eingetragen. Die Pixelgröße des Scanners betrug 20 × 20 Mikrometer, es sind jedoch auch andere Pixelgrößen (z. B. 10 × 10 Mikrometer) gebräuchlich.

Im folgenden werden die einzelnen Sondenpunkte 2 mit Sr/s bezeichnet, wobei r für Reihe, und s für Spalte stehen, und diese jeden Sondenpunkt 2 (S) eindeutig zuordnen.

S1/1 und S2/1 enthalten beide die gleiche Sonde 8, deren Sonden-Sequenz 6 zur ge suchten Sequenz TTCGCG komplementär ist. Es wurden Lichtintensitäten von 4271.02 Einheiten für S1/1 und 3582.22 Einheiten für S2/1 ermittelt, also jeweils in der Größenordnung von 10³ Einheiten. Pro Pixel waren dies Intensäten von 56.95 (S1/1) bzw. 48.42 (S2/1) Einheiten.

Auf S3/1 und S4/1, die die zu dem Hexamer TTCGCC komplementäre Sonde enthal ten, ergaben Lichtintensitäten von 839.09 (S3/1) und 983.77 (S4/1) Einheiten. Das ist eine Zehnerpotenz niedriger als im vorgenannten Detektionsbeispiel. Bezogen auf die Anzahl der Pixel betragen die Werte 10.48 (S3/1) und 18.22 (S4/2) Einheiten, also deutlich weniger als die Hälfte im Vergleich zu S1/1 (56.95, s. o.) und 52/1 (48.42, s. o.).

Die Erfindung ist oben anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert worden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses konkrete Ausführungsbeispiel beschränkt. Im Rahmen der Erfindung ist es z. B. möglich, anstelle einer fluoreszierenden Markierung eine radioaktive Markierung oder eine MALDI-TOF-Analyse zur Selektion der Elongati onen der Sonden zu verwenden. Weiterhin können anstelle der Streptavidin-Biotin- Kopplung andere kovalente Kopplungen verwendet werden. Das in obigem Ausfüh rungsbeispiel verwendete Trägermaterial ist ein Glasplättchen. Im Rahmen der Erfin dung ist es selbstverständlich auch möglich, andere Trägermaterialien wie z. B. Kera mikplättchen oder dergleichen zu verwenden. Im Rahmen der Erfindung kann es z. B. auch zweckmäßig sein, nicht alle Permutationen einer Wobbel-Sequenz an einem Sondenpunkt vorzusehen, insbesondere wenn gewisse Sequenzen im Probenmaterial bevorzugt auftreten.

Die vorliegende Erfindung umfasst selbstverständlich auch einen Polymer-Typ, der ei nen Träger aufweist, der beispielsweise auf zwei, drei oder vier Trägerplättchen ausge bildet ist. Die entsprechenden Sondenpunkte sind dann auf die einzelnen Trägerplätt chen verteilt angeordnet.

Claims

1. Polymer-Chip enthaltend eine Vielzahl von Sonden, wobei unterschiedliche Son den jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet sind und jede Sonde eine Oligomer-Sequenz aufweist und die Oligomer-Sequenz aus einer bekannten Anzahl Monomeren zusammengesetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass an jedem Sondenpunkt mehrere Oligomer-Sequenzen angeordnet sind, die jeweils aus einer Sonden-Sequenz und einer Wobbel-Sequenz zusammengesetzt sind, wobei die Sonden-Sequenzen eines Sondenpunktes identisch zueinander sind und die Sonde darstellen und die Wobbel-Sequenzen eines Sondenpunktes jeweils Permutationen der Monomere aufweist.

2. Polymer-Chip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wobbel-Sequenzen eines jeden Sondenpunktes jeweils die gleiche An zahl Monomere aufweisen und alle Permutationen der Monomere umfassen.

3. Polymer-Chip nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden alle Permutationen der Sonden-Sequenz umfassen.

4. Polymer-Chip nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligomer-Sequenzen die folgende Struktur aufweisen:
-(N)_m-(X)_n
worin
X eine der vier Basen G, A, T oder C in der Sonden-Sequenz und
N eine der vier Basen G, A, T oder C in der Wobbel-Sequenz ist,
n eine ganze Zahl im Bereich von 4 bis 10 und
m eine ganze Zahl, die größer als 3 ist,
bedeuten.

5. Polymer-Chip nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligomer-Sequenz folgende Struktur hat:
-sp-(N)_m-(X)_n,
wobei sp ein Spacer ist.

6. Polymer-Chip nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer sp folgende Struktur aufweist:
-NH-T₁₀-.

7. Polymer-Chip, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend eine Vielzahl von Sonden, wobei unterschiedliche Sonden jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet sind und jede Sonde eine Oligomer- Sequenz aufweist und die Oligomer-Sequenz aus einer bekannten Anzahl Mono meren zusammengesetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Sondenpunkt zumindest ein Bindungselement zum Immobilisieren von Probenmaterial enthält.

8. Polymer-Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungselemente jeweils durch ein Streptavidinmolekül dargestellt sind.

9. Verfahren zur Detektion von Nukleinsäurematerial unter Verwendung eines Poly mer-Chips, insbesondere nach einem der Ansprüche 1-7, umfassend folgende Schritte:
Aufbringen des Nukleinsäurematerials auf den als Oligonukleotid-Chip ausgebil deten Polymer-Chip,
Hybridisieren des Nukleinsäurematerials mit Sonden des Oligonukleotid-Chips, Durchführen eines PCR-Verfahrens, wobei die Sonde durch dNTP und modifizierte dNTP, wobei die modifizierten dNTP Marker beinhalten, verlängert wird, und Detektion der Marker.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die dNTP durch zumindest eines der Gruppe aus dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dUTP und dITP dargestellt sind.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Fluoreszenzmarker ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker cy3 ist.

13. Verfahren nach Anspruch 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurematerial mit einem Bindungselement ausgestattet ist, das eine Immobilisierung des Nukleinsäurematerials in den Sondenpunkten eines nach Anspruch 7 oder 8 ausgebildeten Polymer-Chips ermöglicht.

14. Verfahren nach Anspruch 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungselement am Nukleinsäurematerial Biotin ist.

15. Verfahren nach Anspruch 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Marker durch Ermittlung der Fluoreszenz mittels eines Scanners erfolgt.