DE102005011349A1

DE102005011349A1 - Mikroarray mit Temperatur-spezifischen Kontrollen

Info

Publication number: DE102005011349A1
Application number: DE102005011349A
Authority: DE
Inventors: Sven Bülow; Günther Mohr
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2006-09-21
Also published as: US20090215634A1; EP1856284A1; DE602006007958D1; ATE437240T1; EP1856284B1; WO2006094794A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Mikroarrays und insbesondere Mikroarrays bei denen die optimale Hybridisierungstemperatur und Stringenz der Sonden einfach bestimmt werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines gestalteten Satzes von Nukleinsäuren in einem Mikroarray, um die optimale Hybridisierungstemperatur der Nukleinsäuren zu bestimmen, die den Mikroarray bilden und einen Kit, der die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays ermöglicht.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Mikroarrays und insbesondere Mikroarrays bei denen die optimale Hybridisierungstemperatur und Stringenz der Sonden einfach bestimmt werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines gestalteten bzw. ausgelegten Satzes von Nukleinsäuren in einem Mikroarray, um die optimale Hybridisierungstemperatur der Nukleinsäuren zu bestimmen, die den Mikroarray bilden und einen Kit, der die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays ermöglicht.
Mikroarrays haben es Biologieforschern ermöglicht, quantitative Versuche in großen Maßstäben durchzuführen. Diese Technik bzw. dieses Verfahren wird gleichfalls als Hybridisierungsarray, Genarray oder Genchip bezeichnet, bei der Nukleinsäure-Moleküle an feste Träger an bestimmten Stellen in vergleichsweise kleinen Gebieten und einer hohen Dichte angebracht werden, die zusammen mit Hybridisierungsereignissen zur Identifizierung und Unterscheidung von Nukleinsäure-Sequenzen eingesetzt werden. Sofern auf das Genom selbst gerichtet, wurden Mikroarrays zur Identifizierung neuer Gene, Bindestellen von Transkriptionsfaktoren, Änderungen bei der DNA Kopienzahl und Abweichungen von einer Grundlagensequenz eingesetzt, wie beispielsweise bei sich entwickelnden pathogenen Stämmen oder komplexen Mutationen bei krankheitsverursachenden menschlichen Genen. Mikroarrays ermöglichen die Erlangung wichtiger Daten bei beispielsweise dem Nachweis von Polymorphismen, dem Nachweis einer klinischen Mutation, Expressionsüberwachung, Fingerprinting und Sequenzierung in einem hohen Durchsatz.

Gegenwärtig verfügbare Verfahren zur Erstellung von Arrays von biologischen Molekülen sind beispielsweise das dot-blot oder slot-blot Verfahren (Maniatis et al.: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (New York, USA) 1989). Verfahren zur Herstellung mehrerer Oligonukleotidsequenzen und deren Anbringung an feste Träger in einer hohen Dichte sind ebenso dem Fachmann bekannt. Die US 4,562,157 beschreibt beispielsweise ein Verfahren bei dem photoaktivierbare vernetzende Gruppen zur Immobilisierung vorsynthetisierter Liganden auf der Oberfläche eines Trägers verwendet wurden.

In der US 5,143,854 wird die lichtgerichtete chemische Synthese zur Erzeugung von Liganden einschließlich Oligonukleotiden unmittelbar auf der Oberfläche des Trägers an der gewünschten Stelle beschrieben. Die US 5,700,637 beschreibt Verfahren für die Synthese von Oligonukleotiden auf Oberflächen von festen Trägern in situ. Derartige Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays können einfach automatisiert werden. Techniken zum Aufbringen der Oligonukleotide auf den Array in hohen Dichten von beispielsweise mehreren Tausend Nukleotiden pro Quadratzentimeter sind vorhanden, um Automatisierungstechniken zu verbessern.

Mikroarrays bestehen aus Nukleinsäuren (beispielsweise 10mers bis 100mers), die über ihr 3'-terminales Ende an einen festen Träger, wie beispielsweise Glass oder ein anderes geeignetes Material, gebunden sind. Diese Arrays wurden als Werkzeuge zur Bestimmung von Mutationen oder für die Sequenzierung von Genen (siehe Chee et. al., Science, 1996, Vol. 274, pp 610–614; Drobyshev et al., Gene, 1997, vol.188, pp 45–52) vorgeschlagen.

Durch die Verwendung von Mikroarrays ist die gleichzeitige Expressionsstudie von mehreren Tausend Genen in einem einzigen Versuch möglich. Differentielle Expressionsprofile von beispielsweise gewöhnlichen gegenüber erkrankten Geweben oder induzierten gegenüber nicht-induzierten Geweben können durch eine Hybridisierung des Produkts exprimierter mRNA an eine komplementäre Nukleinsäure an bestimmten Stellen auf dem Array erhalten werden. Der zeitliche Verlauf der Expression Tausender von Genen über mehrere Versuche von einer einzigen Probe kann alternativ durchgeführt werden. Eine Analyse von Genexpressionsprofilen in menschlichem Gewebe unterstützt die Diagnose und Prognose von Krankheiten und die Bewertung von Krankheitsrisiken. Ein Vergleich der Expressionsniveaus mehrerer Gene von Patienten mit bestimmten pathologischen Krankheitszuständen mit gewöhnlichen Patienten ermöglicht die Erzeugung eines für eine bestimmte Krankheit charakteristischen Expressionsprofils. Gegenwärtig sind zwei Ansätze für eine Analyse der Genexpression unter Verwendung von Mikroarrays verfügbar. Erstens können cDNA Fragmente für jedes der zu analysierenden Gene an einen Array angebracht werden. Eine von den Testproben isolierte mRNA wird typischerweise in cDNA mit der optionalen Aufnahme eines fluoreszierenden Labels oder Markermoleküls revers transkribiert. Die cDNA wird geschert und an den Array hybridisiert. Die andere TestprobenmRNA kann revers transkribiert werden, um einen unmittelbaren Vergleich des Exrpressionsniveaus jedes Testgens auf dem gleichen Array zu ermöglichen (beispielsweise die WO 95/35505). Der zweite Ansatz ist zu dem ersten ähnlich, mit Ausnahme dass ein Oligo- oder Polynukleotidarray verwendet wird. Aufgrund von Unterschieden bei Hybridisierungseigenschaften zwischen kurzen Nukleotidsonden sollte jedes Gen durch mehrere Nukleotide auf dem Mikroarray repräsentiert werden. Ein zu jedem Oligonukleotid mit Ausnahme für eines der zentralen Nukleotide identisches Partner-Kontroll-Oligonukleotid wird in den Array aufgenommen, um als eine interne Kontrolle für eine Hybridisierungssensitivität und Stringenz der Hybridisierungsbedingungen zu dienen. Daher muss bei Oligonukleotid Arrays jedes Gen durch näherungsweise 40 verschiedene Oligonukleotide repräsentiert werden, die verschiedene Positionen auf dem Array innehaben, wohingegen bei cDNA Arrays jedes Gen durch einen einzelnen Hybridisierungspartner auf dem Array repräsentiert werden muss. Der Vorteil von Oligonukleotid Arrays gegenüber cDNA Arrays liegt allerdings in einer längeren Lagerstabilität der Proben auf dem Array. Im Allgemeinen kann eine auf einem Array vorbereitete cDNA Bibliothek für Wochen verwendet werden, wohingegen vorbereitete Oligonukleotid Arrays für deutlich längere Zeiträume gelagert werden können.

Die Vorteile des Mikroarray Konzept liegen in seiner Möglichkeit eine Vielzahl von auf Hybridisierung beruhenden Analysen zeitgleich durchzuführen. Da die an den Träger angebrachten Fangsequenzen allerdings komplementär zur Zielsequenz sein müssen, wird die Kenntnis der Zielsequenz benötigt. Jeder Mikroarray muss basierend auf dieser bekannten Sequenz speziell angefertigt werden. Der Bedarf für jeden neuen Test einen neuen Mikroarray zu entwickeln macht die Technologie teuer und komplex. Andere Ansätze schließen die Hybridisierungsbedingungen ein, die für jeden Test genau angepasst werden müssen. Eine Bildung von Sekundär- und Tertiär-Strukturen kann eine Hybridisierung der Fänger- und Zielmoleküle beeinträchtigen. Zusätzlich führt die Duplexbildung zwischen verschiedenen einzelnen Paaren von Zielsequenz und Fängersequenz zu verschiedenen Stabilitäten (Schmelztemperaturen) aufgrund von beispielsweise einem verschiedenen GC Gehalt.

Neue Ansätze, die einige dieser Hybridisierungsproblematiken lösen, beinhalten eine Anwendung paralleler Hybridisierung über den Array, Ändern der Konzentration der Fänger-Nukleinsäure an einer bestimmten Stelle, Ändern der Länge des Oligonukleotids an einer bestimmten Stelle, um so die Duplexstabilität zu ändern, und Verwenden von abgestimmten elektrischen Feldern, wie es von Edman et al. offenbart wurde (Nucleic Acids Research. 25 (24): 4907–4914, 1997).

Um die Problematik einer unspezifischen Hybridisierung zu umgehen, offenbart die WO 0179548 ein Verfahren zur Gestaltung von mehreren Fänger-Oligonukleotidsonden zur Verwendung auf einem Träger an den komplementäre Oligonukleotidsonden mit geringer Fehlanpassung bzw. Nichtübereinstimmung hybridisieren, wobei die meisten der Oligonukleotidsonden Schmelztemperaturen in einem engen Temperaturbereich aufweisen. Die WO 0047767 löst die Problematik ähnlich und offenbart einen Mikroarray, der aus mehreren verschiedenen Oligonukleotiden einer vorbestimmten Sequenz besteht, die auf eine feste Oberfläche an vorbestimmten, positional verschiedenen Stellen angebracht und dadurch charakterisiert sind, dass die Oligonukleotide im Wesentlichen die gleiche Schmelztemperatur aufweisen.

Die am meisten verbreiteten Ansätze um einen Überblick über das Auftreten spezifischer und nichtspezifischer Hybridisierungsereignisse zu erhalten, beinhalten eine begrenzte Anzahl von Positiv- und Negativ-Kontrollen, die auf dem Träger des Mikroarrays angebracht sind. Die Kontrollen sollen das Auftreten des Hybridisierungsereignisses unter den gewählten Bedingungen anzeigen. Da positiv und negativ Kontrollen kaum das verschiedene Auftreten des Hybridisierungsereignisses und ähnlich dazu seine Abwesenheit anzeigen, können Schlussfolgerungen über die Stringenz der gewählten Bedingungen nicht gezogen werden.

Andere Ansätze betreffen die ungefähren Schmelztemperaturen T_m der Sonden und ihre jeweiligen Hybridisierungstemperaturen, die vorab durch Verwendung verschiedener Formeln abgeschätzt werden können. Die üblichste Gleichung beschreibt die Beziehung zwischen der Schmelztemperatur und dem GC Gehalt und lautet T_m = (Anzahl von A + T) × 2°C + (Anzahl von G + C) × 4°C. Da diese (grundlegende) Gleichung zu äußerst ungenauen Schmelztemperaturen führt, wurden andere Gleichungen entwickelt, die genauere Algorithmen (beispielsweise durch Einschließen von Konzentrationen und der Länge der Oligo- und/oder Polynukleotide) verwenden. Ihnen fehlt ebenso die benötigte Genauigkeit, um Hybridisierungstemperaturen genau zu bestimmen. Diese empirischen Verfahren können lediglich die optimalen Hybridisierungsbedingungen anzeugen, leisten aber keinen Beitrag bei einer Beweisführung für das Auftreten des Hybridisierungsereignisses selbst und den Grad an Stringenz. Die Reaktionsbedingungen – Temperatur, Salz und pH legen das Anlagern von einzelsträngigen DNA/DNA, DNA/RNA, und RNA/RNA Hybriden fest. Bei einer hohen Stringenz bilden sich Duplexe ausschließlich zwischen Strängen mit einer idealen eins zu eins Komplementarität, eine geringere Stringenz ermöglicht ein Anlagern von Strängen mit einem gewissen Grad an Fehlanpassung zwischen den Nukleotiden. Daher werden Hybridisierungsreaktionen für gewöhnlich unter stringenten Bedingungen durchgeführt, um ein spezifisches Anlagern zu erhalten. Verfahren zur Kontrolle der Stringenz schleißen in erster Linie die Optimierung der Temperatur, Ionenstärke und denaturierenden Verbindungen bei einer Hybridisierung und anschließenden Waschverfahren ein.

Aus dem vorstehenden folgt, dass die Bestimmung eines genauen Hybridisierungsereignisses von Sonden an die immobilisierten Nukleotid-Sequenzen einen entscheidenden Schritt für ein Erhalten von optimalen Ergebnissen bei einer Durchführung eines Mikroarrays ist. Bis jetzt wurde in dem Stand der Technik ein Versuchs- und Irrtumsansatz unter Verwendung von lediglich Positiv- und Negativ-Kontrollen offenbart, um das Auftreten des genauen Hybridsierungsereignisses für Mikroarrays abzuschätzen.

Aufgabe der Erfindung

Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in einer Bereitstellung eines Mikroarrays, der die Schwierigkeiten des Standes der Technik, nämlich das Auftreten von ungenauen Hybridisierungsereignissen, löst, die zu schlechten Ergebnissen bei einer Durchmusterung führen.

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verbessern der Stringenz der Sonden, die für mit Mikroarrays durchgeführte Durchmusterungsversuche ausgewählt wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Um die vorstehende Aufgabe zu lösen wird in einer ersten Ausführungsform ein Mikroarray bereitgestellt, der einen festen Träger und darauf immobilisierte Nukleinsäuren in Form eines Musters umfasst. Der erfindungsgemäße Mikroarray umfasst einen gestalteten Satz von Nukleinsäuren, der die Bestimmung des optimalen Hybridisierungsereignisses bei der Bedingung mit der höchst möglichsten Stringenz ermöglichen. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren umfasst eine Volllängen-Nukleinsäure einer vorbestimmten Sequenz und mindestens eine Nukleinsäure, die um mindestens ein Nukleotid im Vergleich zu der Volllängensequenz gekürzt ist und die gleiche vorbestimmte Sequenz aufweist.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann zweckmäßigerweise einen ähnlichen GC Gehalt wie die Fänger-Nukleinsäuren aufweisen. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren umfasst weiter einen Satz von mindestens zwei, vorzugsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder am meisten bevorzugt 10 Nukleinsäuren, worin eine von denen als Volllängennukleinsäure bezeichnet wird. Eine der verbleibenden Nukleinsäuren ist dann im Vergleich zu der Volllängennukleinsäure für eine bestimmte Anzahl von Nukleotiden, beispielsweise 1, vorzugsweise 2, ebenso vorzugsweise 3, 4, 5 oder 6 Nukleotide, gekürzt. Die anderen verbleibenden Nukleinsäuren sind im Vergleich zu den vorstehenden Nukleinsäuren wiederum für die gleich bestimmte Anzahl an Nukleotiden gekürzt. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann beispielsweise 6 Oligonukleotide umfassten, worin alle davon die gleiche vorbestimmte Zusammensetzung von Nukleotiden aufweisen, wobei das erste davon, die Volllängennukleinsäure, 20 Nukleotide, das zweite 18, das dritte 16, etc. umfasst.
Der erfindungsgemäße Mikroarray kann beispielsweise für die Bestimmung von Polymorphismen, klinisch relevanten Mutationen, Expressionsmonitoring, Fingerprinting und Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet werden. Der Mikroarray besteht vorzugsweise aus Stellen (spots) von Fängermolekülen, die auf einer bestimmten Stelle auf der Oberfläche oder in dem Träger oder auf dem den Träger bedeckenden Substrat abgeschieden sind. Vorzugsweise handelt es sich bei Mikroarrays um feste Träger, die auf ihrer Oberfläche eine Reihe einzelner Bereiche enthalten, die Fänger-Nukleotidsequenzen tragen, die (über Hybridisierung) an (eine) entsprechende Ziel-Nukleotidsequenz(en) binden können, die möglicherweise in einer zu analysierenden Probe vorhanden ist und ein Muster auf dem Mikroarray ergibt. Falls die Zielsequenz geeignet markiert ist, kann ein Signal unmittelbar an der Bindestelle erfasst, identifiziert und gemessen werden. Die Intensität des jeweiligen Signals ermöglicht eine Abschätzung der Menge an in der Probe vorliegenden Zielsequenzen. Die zu identifizierende Nukleotidsequenz wird zweckmäßigerweise vor ihrer Hybridisierung mit den einzelsträngigen Fänger-Nukleotidsequenzen markiert. Das Markieren, ein dem Fachmann bekanntes Verfahren, wird vorzugsweise während des Amplifikationsschrittes durch Einbau markierter Nukleotide oder nach Vervollständigung davon durch Anbringen eines Markers an die Hybride (Amplikons) durchgeführt. Im Fall eines Einbaus markierter Nukleotide während der Amplifikationsreaktion, wird der Assay sensitiver je länger die amplifizierte Sequenz ist und je mehr Marker in dem hybridisierten Ziel vorliegt.
Die Fänger-Nukleinsäuren können auf dem festen Träger an bestimmten Stellen unter Verwendung von Masken bei jedem Verfahrensschritt unmittelbar synthetisiert oder als ganzes befestigt/angebracht werden. Die Synthese umfasst das Hinzufügen eines neuen Nukleotids an eine verlängernde Nukleinsäure, um eine erwünschte Sequenz an einer bestimmten Stelle zu erhalten. Dieses Verfahren ist aus dem photolitographischen Verfahren abgeleitet und verwendet Photo-Schutzgruppen, die vor einem Hinzufügen eines neuen Nukleotids entfernt werden müssen (beispielsweise die EP 0476014 , US 5,445,934 , US 5,143,854 und US 5,510,270 ). Allerdings liegen nur kleine Oligonukleotide auf der Oberfläche vor und das Verfahren wird hauptsächlich zur Sequenzierung oder Identifizierung einer Sequenz über ein Muster positiver Stellen verwendet, die verschiedenen auf dem Array gebundenen Oligonukleotiden entsprechen, wobei jede der Sequenzen aus kleinen Oligonukleotidsequenzen besteht und an verschiedene Teile der Zielsequenz binden kann. Die Charakterisierung eine Zielsequenz wird durch Vergleich eines bestimmten Musters mit einer Referenzsequenz erhalten.
Der feste Träger beziehungsweise Carrier kann in irgendeiner Form (beispielsweise als Kügelchen) vorliegen, weist allerdings vorzugsweise eine ebene Form auf und kann aus verschiedenen Materialien bzw. Werkstoffen bestehen, die insbesondere verschiedene Metalle, Glas und Kunststoffe umfassen. Bevorzugte feste Träger sind Nylonmembranen, Epoxidglas und Borfluoratglas. Der Vorteil der Verwendung von Glas und Kunststoffen kann in der Durchsichtigkeit der Materialien liegen, die die Herstellung von Trägern in der Art von Objektträgern oder Mikroplatten für den parallelen Hochdurchsatz von Proben und einer daraus herrührenden Kostenverringerung ermöglicht. Die Mikroarrays können in Form eines Objektträgers oder einer Mikroplatte (ebenfalls als Mikrotiterplatte bezeichnet) vorliegen. Bei der Mikroplatte handelt es sich um einen geschüsselten (dished) Behälter mit mehreren (mindestens zwei) Vertiefungen. Bei auf Mikroplatten basierenden Mikroarrays handelt es sich um eine Mikroplatte mit mehreren Vertiefungen, in deren Böden in den Mikroarray-Biochip platziert ist. Ein Beispiel der Mikroplatte ist eine gut bekannte ELISA Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen.
Weiterhin sind auf selbst-anordnenden Schichtsystemen basierende feste Träger ebenso für die Implementierung der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Anwendung kann unter Verwendung automatischer Verfahren erfolgen.
Um die Zuordnung jeder Nukleinsäure an eine bestimmte Stelle auf dem festen Träger zu ermöglichen, ist der weiterhin in verschiedene symmetrische, beispielsweise rechteckige, Bereich der gleichen Größe unterteilt, um das Muster zu erhalten, in dem die Nukleinsäuren auf dem festen Träger immobilisiert sind. Das Muster ermöglicht die Analyse der Ergebnisse auf eine vereinfachte Art, da eine einfache und spezifische Zuordnung der jeweiligen Hybridisierungsereignisse möglich ist.
Im Zusammenhang mit dieser Anwendung, beinhaltet der Begriff Nukleotid DNA und RNA, wobei sie Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil als Basen und Desoxyribose und Ribose als die strukturgebenden Elemente enthalten. Ein Nukleotid kann allerdings weiterhin irgendeine modifizierte (künstliche) der momentanen Technologie bekannte Base umfassen, die unter Verwendung von mindestens einer der vorstehend genanten Basen (beispielsweise Inosin) zur Basenpaarung befähigt ist. Weiterhin sind in dem Begriff Nukleotid die Derivate der vorstehend genannten Verbindungen, insbesondere Derivate mit Farbstoffen von fluoreszierenden Markeren, enthalten.
Irgendein Verfahren des Stands der Technik kann zum Anbringen von einzelnen Nukleotiden oder der Nukleinsäuren als ganzes auf den Träger verwendet werden, das eine zeitweilige oder permanente Immobilisierung, Fixierung oder Adhäsion des Sondennukleotids auf eine Stelle oder einen Bereich des Trägers, durch beispielsweise die Bildung von kovalenten, metallorganischen oder ionischen Bindungen, Bindungen basierend auf van der Waal's Kräften oder irgendwelchen Arten von Enzym Substrat Wechselwirkungen oder dem so genannten Affinitätsbinden bewirkt.
Irgendeine Zahl von Spacer bzw. Abstandshalter-Molekülen kann zwischen dem Träger und den auf den Träger aufgebrachten Nukleotiden angeordnet sein. Der Spacer kann beispielsweise ein Polymer-basierender Spacer sein und kann allerdings ebenso aus einer Alkankette oder irgendwelchen Derivaten davon mit einer geeigneten Länge bestehen, die an jedem Ende jeweils funktionelle Gruppen zum Anbringen an den festen Träger und die Nukleinsäure umfasst. Vorzugsweise wurden 15-Thymidine Spacer mit einem Ende auf den festen Träger und mit dem anderen Ende auf das 3'-terminale Ende des/der jeweiligen zu immobilisierenden Nukleotids/Nukleinsäure immobilisiert.
Bei der Nukleinsäure kann es sich sowohl um Oligo- als auch Polynukleotide im Fall von DNA Arrays genauso wie um Ribonukleinsäuren im Fall von RNA Arrays handeln. Die Nukleinsäuren des Arrays sind entweder über eine chemische, kovalente Bindung oder durch Adhäsion immobilisiert. Die Länge der immobilisierten Nukleinsäuren umfasst zumindest den Bereich von 10 bis 100 Nukleinsäuren (10mers bis 100mers), vorzugsweise beträgt die Länge zumindest 20 bis 80 Nukleinsäuren, mehr bevorzugt mindestens 20 bis 50 Nukleinsäuren genauso wie mindestens 20 bis 40 Nukleinsäuren und am meisten bevorzugt mindestens 20 bis 30 Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren können entweder unmittelbar aus Versuchproben von Säugetieren oder auf eine dem Fachmann gut bekannte Art synthetisiert werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroarray dadurch charakterisiert, dass mindestens 100 Nukleinsäuren pro Quadratzentimeter auf dem festen Träger angebracht sind. Diese Dichte kann allerdings höher sein und an den Verwendungszweck des Mikroarrays angepasst werden. Beispielsweise beträgt die Dichte der pro Quadratzentimeter festen Trägers angebrachten Nukleinsäuren vorzugsweise 1.000, bevorzugter 5.000 und am meisten bevorzugt 10.000 Nukleotide pro Quadratzentimeter.
Der hierin verwendete Begriff gestalteter Satz von Nukleinsäuren beschreibt bestimmungsgemäß eine bestimmte vorgeformte Gruppe von Nukleinsäuren mit besonderen (bekannten) Eigenschaften hinsichtlich der Länge, Abfolge der einzelnen Nukleotide, die die Nukleinsäure (einschließlich der bestimmten Basen und Zuckerreste) bilden, und daraus folgend die Kenntnis der physikalischen/chemischen Eigenschaften, insbesondere der genauen Schmelztemperatur bei bestimmten Bedingungen. Eine vorbestimmte Sequenz wie vorstehend beschrieben bedeutet eine Nukleotidsequenz in der die Abfolge der jeweiligen Nukleotide über die gesamte Länge bekannt ist.
Der Ausdruck Hybridisierungsereignis betrifft das nachweisbare Auftreten der Hybridisierung von Proben-Nukleinsäuremolekülen mit den auf dem festen Träger immobilisierten Nukleinsäuren. Das Hybridisierungsereignis kann über Chemolumineszenz, konfokale laserinduzierte Fluoreszenz, Colorimetrie, Elektrochemie, Radioaktivität und Oberflächenresonanz nachgewiesen werden. Gegenwärtige Entwicklungen betreffen zunehmend Verfahren, die keine zusätzlichen Substanzen, wie fluoreszierende Farbestoffe, neben den immobilisierten Nukleinsäuren und Sonden, benötigen. Die Oberflächen-Plasmonresonanz kann beispielsweise die Wechselwirkung zwischen der Probe und den immobilisierten Molekülen ohne die Hilfe eines anderen Moleküls unmittelbar nachweisen.
Von besonderer Wichtigkeit hinsichtlich Hybridisierung und optimalen Bedingungen, sofern sie auftritt, ist die Stringenz der für die Hybridisierung gewählten Bedingungen. Die Stringenz betrifft die Temperatur, Ionenstärke-Bedingungen, pH und Vorliegen oder Abwesenheit von gewissen organischen Lösungsmitteln und/oder Detergentien während der Hybridisierung. Je höher die Stringenz ist, desto höher wird das benötigte Niveau an Komplementarität sein, das zwischen hybridisierenden Nukleotid-Sequenzen erhalten wird. Der Begriff stringente Bedingungen kennzeichnet Bedingungen bei denen nur Nukleinsäuren mit einem hohen Vorkommen an komplementären Basen hybridisieren werden. Bedingungen hoher Stringenz können durch Wahl einer hohen Temperatur und geringen Salzkonzentrationen erhalten werden, wohingegen eine geringe Temperatur, eine hohe Salzkonzentration und Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF) unspezifische Hybridisierungsreaktionen begünstigen. Hochstringente Bedingungen und mäßig stringente Bedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungen werden beispiels weise in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 1, containing supplements up through Supplement 29, 1995) aufgeführt.
Der Begriff höchstmöglichste Stringenz bedeutet daher die Bedingungen bei denen einerseits eine ausreichende Anzahl von Proben-Nukleinsäuren an die immobilisierten (Fänger) Nukleinsäuren hybridisieren und andererseits das Niveau an (Nukleotid) Abweichungen niedrig genug ist um ein verlässliches Ergebnis zu erhalten.
Das am meisten verbreitete Verfahren zum Nachweis von fluoreszierenden Farbstoffen, das vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist allerdings die konfokale laserinduzierte Fluoreszenz bei der das Hybridisierungsereignis durch Verwendung von Markermolekülen in der Form von fluoreszierenden Farbstoffen nachgewiesen wird, die mit der Proben-Nukleinsäure verbunden sind. Derartige Farbstoffe umfassen beispielsweise Cyanin-Farbstoffe, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance-Farbstoffe, vorzugsweise ROX und/oder R110, und fluoreszierende Farbstoffe, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Mikroarray einen festen Träger und darauf immobilisierte Nukleinsäuren in der Form eines Musters. Der erfindungsgemäße Mikroarray umfasst ebenso einen gestalteten Satz von Nukleinsäuren, der die Bestimmung des optimalen Hybridisierungsereignisses bei den Bedingungen mit der höchst möglichen Stringenz ermöglicht. Der Mikroarray ist dadurch charakterisiert, dass alle Nukleinsäuren in dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren die gleiche bestimmte Länge aufweisen und (voneinander) durch die einzelne Schmelztemperatur gemäß der Sequenz und dem GC Gehalt von jeder Nukleinsäure abweichen.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann zweckmäßigerweise einen ähnlichen GC Gehalt wie die Fänger-Nukleinsäuren aufweisen. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren umfasst eine Satz von mindestens zwei, vorzugsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr bevorzugt 10 Nukleinsäuren bekannter Sequenz. Die Nukleinsäuren unterscheiden sich untereinander durch ihren jeweiligen GC-Gehalt (alternativ ebenso AT-Gehalt), um verschieden Schmelztemperaturen T_m zu erhalten, die sich voneinander vorzugsweise um die gleiche Temperatur unterscheiden. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann beispielsweise 6 Nukleinsäuren mit einer jeweiligen Länge von 20 Nukleotiden umfassen, wobei die erste davon eine gewisse T_m, die zweite eine T_m –2°C, die dritte eine T_m –4°C, etc. aufweist. Dies kann über die vorstehend erwähnte Formel (T_m = (Anzahl von A + T) × 2°C + (Anzahl von G + C) × 4°C), oder alternativ dazu über andere zur Bestimmung der Schmelztemperatur geeignete Formeln oder der wirklichen, experimentell bestimmten, Schmelztemperatur erhalten werden. Dies ermöglicht das "individuelle" Einstellen von bestimmten Schmelztemperaturen.
Der vorstehend genannte Mikroarray kann gemäß zu dieser der ersten Ausführungsform einen festen Träger umfassen, der aus Kunststoff, Glas oder Metall besteht, und eine Mikroplatte oder einen Objektträger umfassen kann. Das Muster ermöglicht zusätzlich die Zuord nung von jeder Nukleinsäure zu einer bestimmten Stelle auf dem Träger, um eine Analyse der Ergebnisse auf eine vereinfachte Art zu ermöglichen. Bei den Nukleinsäuren handelt es sich vorzugsweise um Oligonukleotide und/oder Polynukleotide mit einer jeweiligen Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, die über ein geeignetes Spacer-Molekül immobilisiert sein können und bei einer Dichte von mindestens 140 pro Quadratzentimeter auf dem festen Träger immobilisiert sind. Auch bei der zweiten Ausführungsform könenn die Nukleinsäuren, insbesondere diejenigen die zu dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren gehören, mit einem geeigneten Markermolekül markiert sein, das vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance-Farbstoffen, vorzugsweise ROX und/oder R110, und fluoreszierenden Farbstoffen, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Gemäß einer dritten Ausführungsform wird der gestaltete Satz von Nukleinsäuren in einem Mikroarray zur Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur der den Mikroarray bildenden Nukleinsäuren eingesetzt, worin der gestaltete Satz von Nukleinsäuren eine Volllängen Nukleinsäure mit einer vorbestimmten Sequenz und mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die um mindestens ein Nukleotid im Vergleich zu der Volllängen Sequenz verkürzt ist und die die gleiche vorbestimmte Sequenz aufweist.
Gemäß der ersten Ausführungsform, kann der gestaltete Satz von Nukleinsäuren einen Satz von mindestens zwei, vorzugsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder am meisten bevorzugt 10 Nukleinsäuren umfassen, worin eine von denen als Volllängennukleinsäure bezeichnet wird. Eine der verbleibenden Nukleinsäuren ist dann im Vergleich zu der Volllängennukleinsäure für eine bestimmte Anzahl von Nukleotiden, beispielsweise 1, vorzugsweise 2, ebenso vorzugsweise 3, 4, 5 oder 6 Nukleotide, gekürzt. Die anderen verbleibenden Nukleinsäuren sind im Vergleich zu den vorstehenden Nukleinsäuren wiederum für die gleiche bestimmte Anzahl an Nukleotiden gekürzt. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann beispielsweise 6 Oligonukleotide umfassen, worin alle davon die gleiche vorbestimmte Zusammensetzung von Nukleotiden aufweisen, wobei das erste davon, die Volllängennukleinsäure, 20 Nukleotide, das zweite 18, das dritte 16, etc. umfasst. Zweckmäßigerweise weist der gestaltete Satz von Nukleinsäuren einen ähnlichen GC Gehalt wie die Fänger-Nukleinsäuren auf.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann entsprechend mit einem geeigneten Markermolekül markiert werden, das vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance-Farbstoffen, vorzugsweise ROX und/oder R110, und fluoreszierenden Farbstoffen, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Gemäß einer vierten Ausführungsform wird der gestaltete Satz von Nukleinsäuren in einem Mikroarray zur Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur der den Mikroarray bildenden Nukleinsäuren verwendet, worin der gestaltete Satz von Nukleinsäuren die gleiche bestimmte Länge aufweisen und (voneinander) durch die einzelne Schmelztemperatur gemäß der Sequenz und dem GC Gehalt von jeder Nukleinsäure abweichen.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann einen Satz von mindestens zwei, vorzugsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr bevorzugt 10 Nukleinsäuren bekannter Sequenz umfassen. Die Nukleinsäuren unterscheiden sich untereinander durch ihren jeweiligen GC-Gehalt und/oder AT-Gehalt, um verschiedene Schmelztemperaturen T_m zu erhalten, die sich voneinander vorzugsweise um die gleiche Temperatur unterscheiden. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann beispielsweise 6 Nukleinsäuren mit einer jeweiligen Länge von 20 Nukleotiden umfassen, wobei die erste davon eine gewisse T_m, die zweite eine T_m –2°C, die dritte eine T_m –4°C, etc. aufweist. Zweckmäßigerweise weist der gestaltete Satz von Nukleinsäuren einen ähnlichen GC Gehalt wie die Fänger-Nukleinsäuren auf.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren gemäß der vierten Ausführungsform kann mit einem geeigneten Markermolekül markiert werden, das vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance-Farbstoffen, vorzugsweise ROX und/oder R110, und fluoreszierenden Farbstoffen, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit für die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays bereitgestellt, wobei der Kit einen gestalteten Satz von Nukleinsäuren umfasst, worin er gestaltete Satz von Nukleinsäuren eine Volllängen-Nukleinsäure mit einer vorbestimmten Sequenz und mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die um mindestens ein Nukleotid im Vergleich zu der Volllängen-Sequenz gekürzt ist und die die gleiche vorbestimmte Sequenz aufweist.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren in dem Kit kann einen Satz von mindestens zwei, vorzugsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder am meisten bevorzugt 10 Nukleinsäuren umfassen, worin eine von denen als Volllängennukleinsäure bezeichnet wird. Eine der verbleibenden Nukleinsäuren ist dann im Vergleich zu der Volllängennukleinsäure für eine bestimmte Anzahl von Nukleotiden, beispielsweise 1, vorzugsweise 2, ebenso vorzugsweise 3, 4, 5 oder 6 Nukleotide, gekürzt. Die anderen verbleibenden Nukleinsäuren sind im Vergleich zu den vorstehenden Nukleinsäuren wiederum für die gleiche bestimmte Anzahl an Nukleotiden gekürzt. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann beispielsweise 6 Oligonukleotide umfassen, worin alle davon die gleiche vorbestimmte Zusammensetzung von Nukleotiden aufweisen, wobei das erste davon, die Volllängennukleinsäure, 20 Nukleotide, das zweite 18, das dritte 16, etc. umfasst. Der Kit umfasst weiterhin die jeweiligen Mittel (beispielsweise Chemikalien, Anleitung) um die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays durchzuführen. Zweckmäßigerweise weist der gestaltete Satz von Nukleinsäuren einen ähnlichen GC Gehalt wie die Fänger-Nukleinsäuren auf.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit für die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays bereitgestellt, wobei der Kit einen gestalteten Satz von Nukleinsäuren umfasst, worin der gestaltete Satz von Nukleinsäuren, worin alle Nukleinsäuren in dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren die gleich bestimmte Länge aufweisen und durch die einzelne Schmelztemperatur gemäß der Sequenz und dem GC Gehalt von jeder Nukleinsäure abweichen.
Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann einen Satz von mindestens zwei, vorzugsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr bevorzugt 10 Nukleinsäuren bekannter Sequenz umfassen. Die Nukleinsäuren unterscheiden sich untereinander durch ihren jeweiligen GC-Gehalt und/oder AT-Gehalt, um verschiedene Schmelztemperaturen T_m zu erhalten, die sich voneinander vorzugsweise um die gleiche Temperatur unterscheiden. Der gestaltete Satz von Nukleinsäuren kann beispielsweise 6 Nukleinsäuren mit einer jeweiligen Länge von 20 Nukleotiden umfassen, wobei die erste davon eine gewisse T_m, die zweite eine T_m –2°C, die dritte eine T_m –4°C, etc. aufweist. Der Kit umfasst weiterhin die jeweiligen Mittel (beispielsweise Chemikalien, Anleitung) um die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays durchzuführen. Zweckmäßigerweis weist der gestaltete Satz von Nukleinsäuren einen ähnlichen GC Gehalt wie die Fänger-Nukleinsäuren auf.
Ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen gestalteten Satzes von Nukleinsäuren liegt darin, dass die anderen Hybridisierungsbedingungen (Ionenstärke, pH und organische Lösungsmittel und/oder Detergentien) konstant beibehalten werden können. Dadurch verbleibt als einzige Variable die Schmelztemperatur, was einerseits die Analyse der Ergebnisse und weiterer Verbesserungsschritte erleichtert. Die vorliegende Erfindung stellt mit dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren einen "Gradienten" bereit, von dem die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen abgelesen werden können.
Zur Implementierung eines typischen Mikroarrays gemäß der ersten und zweiten bevorzugten Ausführungsform werden drei Komponenten benötigt. Zuerst den Mikroarray oder beziehungsweise den Träger, zweitens eine Leseeinheit und drittens Mittel zur Bewertung der Ergebnisse, beispielsweise eine geeignete Computersoftware. Die Leseeinheit umfasst im Allgemeinen einen beweglichen Boden (tray), Fokusierlinse(n), Spiegel und einen geeigneten Detektor, beispielsweise eine CCD Kamera. Der bewegliche Boden trägen den Mikroarray und kann bewegt werden, um den Mikroarray in dem Lichtweg einer oder mehrerer geeigneter Lichtquellen, beispielsweise ein Laser mit einer geeigneten Wellenlänge zur Anregung einer fluoreszierenden Verbindung, zu platzieren. Das Auswertungsprogramm oder Software kann beispielsweise zum Erkennen spezifischer Muster auf dem Array dienen oder zur Analyse von verschiednen Expressionsprofilen von Genen. In diesem Fall sucht die Software farbige Punkte auf dem Array und vergleicht die Intensität verschiedener Farbspektren des gleichen Punktes. Das Ergebnis kann von einer Analyseeinheit interpretiert und danach in einem geeigneten Dateiformat zur Weiterverarbeitung gespeichert werden.
Die Sonden sind im Allgemeinen an zwei oder mehr fluoreszierende Farbstoffe kovalent gebunden und die Intensität der Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen eines jeden Punkts wird mit dem Hintergrund verglichen. Der Detektor, beispielsweise ein Photomultiplier oder CCD Array, wandelt geringe Lichtintensitäten in ein elektrisches Signal um, das verstärkt werden kann. Andere Verfahren verwenden verschiedene Enzyme, die an das Nukleotid mit einem Linkermolekül kovalent gebunden sind. Die enzymatische Colorimetrie verwendet beispielsweise alkalische Phosphatase und Meerrettich Peroxidase als Marker. Durch Kontaktieren mit einem geeigneten Molekül kann ein nachweisbarer Farbstoff erhalten werden. Andere chemolumineszierende oder fluoreszierende Marker umfassen Proteine, die ein Chemolumineszenz- oder Fluoreszenz-Signal ausstrahlen können, wenn sie mit Licht einer bestimmten, spezifischen Wellenlänge, beispielsweise 488 nm für das Grüne Fluoreszenzprotein, bestrahlt werden. Radioaktive Marker werden im Fall verwendet, dass niedrige Nachweisgrenzen erforderlich sind, sind allerdings aufgrund ihrer gesundheitsschädlichen Eigenschaften nicht weit verbreitet. Eine Fluoreszenzmarkierung wird mit Nukleotiden vorgenommen, die an ein fluoreszierendes Chromophor gebunden sind. Kombinationen von Nukleotiden und fluoreszierendem Chromophor umfassen im Allgemeinen Cy3 (Cyanin 3)/Cy5 (Cyanin 5) markiertes dUTP as Farbstoff, da sie leicht aufgenommen werden können, der Elektronenübergang für die Fluoreszenz durch gewöhnliche Laser angeregt werden kann und sie ebenso bestimmte Emmisionsspektren aufweisen.
Die Hybridisierung von Mikroarrays folgt im Wesentlichen den herkömmlichen Bedingungen von Southern oder Northern Hybridisierungen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Schritte umfassen eine Vor-Hybridisierung, die eigentliche Hybridisierung und einen Waschschritt nach dem Eintreten der Hybridisierung. Die Bedingungen müssen derart gewählt werden, dass Hintergrundsignale klein gehalten werden, dass eine minimale Kreuzhybridisierung (im Allgemeinen eine verringerte Anzahl von Abweichungen) auftritt und dass die Signalstärke ausreichend ist, die für manche Anwendungen zur Konzentration des Zielmoleküls proportional sein muss.
Das Hybrdisierungsereignis kann im Allgemeinen durch zwei verschiedene Arten von Array-Scannern nachgewiesen werden. Ein Verfahren bedient sich des Prinzips der konfokalen Lasermikroskopie, das zumindest einen Laser zur Durchmusterung des Arrays auf eine Punkt-zu-Punkt Art verwendet. Eine Fluoreszenz wird anschließend durch Photomultiplier nachgewiesen, die das ausgestrahlte Licht verstärken. Die kostengünstigeren GGD basierenden Leseeinheiten verwenden für gewöhnlich gefiltertes weißes Licht zur Anregung.
Die Oberfläche des Arrays wird mit diesem Verfahren in Abschnitten durchmustert, was den schnelleren Erhalt von Ergebnissen einer niedrigen Aussagekraft ermöglicht.
Von Wichtigkeit ist ebenso das so genannte Gridding zur Analyse der Ergebnissen bei dem ein idealisiertes Modell des Mikroarraylayouts mit den durchmusterten Daten verglichen wird, um die Punkt (spot) Bestimmung zu erleichtern. Bildpunkte werden als Punkt (Vordergrund) oder Hintergrund eingestuft (segmentiert), um die Punkt-Maske zu erzeugen. Segmentierungsverfahren können in feste Segmentierungskreise, anpassende Kreissegmentierung, anpassende Formsegmentierung und Histogrammsegmentierung unterteilt werden. Die Verwendung dieser Verfahren hängt von der Form der Punkte (regelmäßig, unregelmäßig) und der Qualität der Nahanordnung der Punkte ab.
Ein anderer wichter Punkt für die Auswertung der Ergebnisse liegt in der Intensität der verschiedenen Punkte, da die Konzentration der hybridisierten Nukleotide in einem Punkt zu der Gesamtfluoreszenz dieses Punktes proportional ist. Die gesamte Bildpunktintensität und das Verhältnis der verwendeten verschieden fluoreszierenden Chromophore (im Fall con Cy3 und Cy5, grün und rot) sind insbesondere für die Berechnung der Punktintensität von Wichtigkeit. Neben der Punktintensität muss ebenso die Hintergrundintensität berücksichtigt werden, da verschiedene Effekte die Fluoreszenz der Punkte stören können, beispielsweise die Fluoreszenz des Trägers und der für die Hybridisierung verwendeten Chemikalien. Dies kann durch die so genannte Normalisierung durchgeführt werden, die die vorstehend genannten Effekte und andere beinhaltet, wie Fluktuationen der Lichtquelle, die geringere Verfügbarkeit/Aufnahme der verschiednen Markermoleküle (Cy5 schlechter als Cy3) und deren Unterschiede bei Emmisionsintensitäten. Von Wichtigkeit für die Normalisierung ist weiterhin die Referenz gegen die normalisiert werden soll. Im Allgemeinen kann es ein bestimmter Satz von Genen oder eine Gruppe von Kotrollmolekülen sein, die auf dem Mikroarray vorliegen.
Die Ergebnisse können weiterhin durch verfügbare Softwarewerkzeuge und gemäß dem Wissenstand der Bioinformatik weiterverarbeitet werden

Claims

Mikroarray umfassend einen festen Träger und darauf immobilisierte Nukleinsäuren in Form eines Musters, worin ein gestalteter Satz von Nukleinsäuren die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur ermöglicht und worin der gestaltete Satz von Nukleinsäuren eine Volllängen-Nukleinsäure einer vorbestimmten Sequenz und mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die um mindestens ein Nukleotid im Vergleich zu der Volllängen-Sequenz gekürzt ist und die die gleiche vorbestimmte Sequenz aufweist.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass der feste Träger auf Kunststoff, Glas oder Metall besteht.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass das Muster die Zuordnung von jeder Nukleinsäure zu einer bestimmten Stelle auf dem Träger ermöglicht.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren Oligonukleotide und/oder Polynukleotide mit jeweils einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren auf dem Träger durch ein Spacer-Molekül immobilisiert sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass der feste Träger in der Form einer Mikroplatte oder eines Objektträgers vorliegt.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass mindestens 100 Nukleinsäuren pro Quadratzentimeter auf dem festen Träger angebracht sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren mit Ausnahme des Satzes von Nukleinsäuren mit einem Markermolekül markiert sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 8, charakterisiert dadurch, dass das Markermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance Farbstoffe, vorzugsweise ROX und/oder R110, und Fluoreszenz Farbstoffe, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Mikroarray umfassend einen festen Träger und darauf immobilisierte Nukleinsäuren in Form eines Musters, worin ein gestalteter Satz von Nukleinsäuren die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur ermöglicht, worin alle Nukleinsäuren in dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren die gleiche bestimmte Länge aufweisen und sich durch die einzelne Schmelztemperatur gemäß der Sequenz und des GC Gehalts unterscheiden.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass der feste Träger auf Kunststoff, Glas oder Metall besteht.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass das Muster die Zuordnung von jeder Nukleinsäure zu einer bestimmten Stelle auf dem Träger ermöglicht.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren Oligonukleotide und/oder Polynukleotide mit jeweils einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren auf dem Träger durch ein Spacer-Molekül immobilisiert sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass der feste Träger in der Form einer Mikroplatte oder eines Objektträgers vorliegt.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass mindestens 100 Nukleinsäuren pro Quadratzentimeter auf dem festen Träger angebracht sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren mit Ausnahme des Satzes von Nukleinsäuren mit einem Markermolekül markiert sind.
Mikroarray gemäß Anspruch 17, charakterisiert dadurch, dass das Markermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance Farbstoffe, vorzugsweise ROX und/oder R110, und Fluoreszenz Farbstoffe, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Verwendung eines gestalteten Satzes von Nukleinsäuren in einem Mikroarray, um die optimale Hybridisierungstemperatur der Nukleinsäuren, die den Mikroarray bilden, zu bestimmen, worin der gestaltet Satz von Nukleinsäuren eine Volllängen-Nukleinsäure einer vorbestimmten Sequenz und mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die um mindestens ein Nukleotid im Vergleich zu der Volllängen-Sequenz gekürzt ist und die die gleiche vorbestimmte Sequenz aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 19, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren mit einem Markermolekül markiert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 20, charakterisiert dadurch, dass das Markermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance Farbstoffe, vorzugsweise ROX und/oder R110, und Fluoreszenz Farbstoffe, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Verwendung eines gestalteten Satzes von Nukleinsäuren in einem Mikroarray, um die optimale Hybridisierungstemperatur der Nukleinsäuren, die den Mikroarray bilden, zu bestimmen, worin alle Nukleinsäuren in dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren die gleiche bestimmte Länge aufweisen und sich durch die einzelne Schmelztemperatur gemäß der Sequenz und des GC Gehalts unterscheiden.
Verwendung gemäß Anspruch 22, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren mit einem Markermolekül markiert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 23, charakterisiert dadurch, dass das Markermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyanin-Farbstoffen, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance Farbstoffe, vorzugsweise ROX und/oder R110, und Fluoreszenz Farbstoffe, vorzugsweise FAM und/oder FITC.
Kit für die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur in einem Mikroarray, wobei der Kit einen gestalteten Satz von Nukleinsäuren umfasst, worin er gestaltete Satz von Nukleinsäuren eine Volllängen-Nukleinsäure mit einer vorbestimmten Sequenz und mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die um mindestens ein Nukleotid im Vergleich zu der Volllängen-Sequenz gekürzt ist und die die gleiche vorbestimmte Sequenz aufweist.
Kit für die Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur eines Mikroarrays, wobei der Kit einen gestalteten Satz von Nukleinsäuren umfasst, worin alle Nukleinsäuren in dem gestalteten Satz von Nukleinsäuren die gleich bestimmte Länge aufweisen und sich durch die einzelne Schmelztemperatur gemäß der Sequenz und dem GC Gehalt unterscheiden.