DE602004004758T2

DE602004004758T2 - Personalisierte Mikroarrays und ihre Verwendung zum Nachweis von Zielmolekülen

Info

Publication number: DE602004004758T2
Application number: DE602004004758T
Authority: DE
Inventors: Jose Remacle; Konrad Beyreuther; Lars-Erik Lafayette Peters
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2004-05-04
Filing date: 2004-05-04
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2024-05-05
Also published as: CN1693481A; DE602004004758D1; EP1593745B1; ATE353978T1; EP1593745A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Bausatz zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder zur Mengenbestimmung mehrerer Zielmoleküle, welche möglicherweise gleichzeitig in einer Probe vorliegen.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Identifizierung mehrerer exprimierter Gene von Organismen oder Mikroorganismen kann auf dem Vorliegen spezifischer Sequenzen in deren genetischem Material basieren. Die Identifizierung und Mengenbestimmung exprimierter Gene wird gewöhnlich nach dem umgekehrten Transkribieren von mRNA in ihre entsprechende cDNA und dem Nachweis der cDNA über spezifische Einfangmoleküle durchgeführt, welche auf Mikroarrays vorliegen oder daran befestigt sind. Der Nachweis spezifischer Organismen kann einfach durchgeführt werden, indem eine bestimmte Sequenz ihrer genomischen DNA amplifiziert wird und diese amplifizierten Sequenzen dann nachgewiesen und/oder identifiziert werden. Die Mengenbestimmung der Zielsequenzen, welche an ihren spezifischen Einfangmolekülen gebunden sind, ermöglicht eine Abschätzung der Menge der Zielmoleküle, welche in der ursprünglichen Probe vorlagen. Vorzugsweise sind geeignete Kontrollmittel enthalten und werden die notwendigen Korrekturen vorgenommen, um die Effizienz der verschiedenen Schritte zu berücksichtigen, wie z.B. das Kopieren oder die Amplifikation der Zielsequenzen und ihres Einfangs über Hybridisierung auf einem Mikroarray.
Mikroarrays, welche Arrays von Nucleotidsequenzen tragen, werden hauptsächlich nach zwei Methoden erzeugt. Die erste Methode, welche in den US-Patentschriften 5,510,270 und 5,700,637 beschrieben ist, basiert auf der photolithographischen In-situ-Synthese von Einfangmolekülen oder Sequenzen auf einem festen Träger. Bei der photolitho graphischen DNA-Synthese wird die schnelle Phosphoramidit-Festphasenchemie angewendet. Eine Positions- und Sequenzkontrolle wird erreicht durch eine Kombination von 5'-lichtgeschützten Phosphoramiditen, welche durch Bestrahlung mit Licht aktiviert werden können, und einer Gruppe von Masken, welche an geeigneten Positionen Öffnungen enthalten, durch welche Licht hindurchgelangen kann. Nach der Anregung werden die Lichtschutzgruppen, welche auf Oligonucleotid-Teilsequenzen vorliegen, welche während des Verfahrens vorher synthetisiert wurden, entfernt, und die Oligomere werden nach der Zugabe des entsprechenden Monomers um ein anderes Nucleotid erweitert. Die derzeitigen Verknüpfungseffizienzen begrenzen die tatsächliche Größe dieser Chips auf etwa 25 Basen. Jenseits dieser Grenze häufen sich unvollständige Produkte.
Die photolithographische Methode führt zu dem Vorliegen kurzer Oligonucleotide auf einem Träger. Bei Anwendung dieser Methodik wird ein Gen oder eine Gensequenz durch eine Reihe von Einfangsequenzen derselben Art identifiziert, anstatt durch eine einzigartige Sequenz. Um die spezifische Hybridisierung einer bestimmten Zielsequenz kontrollieren zu können, ist es erforderlich, für jede Sequenz eine Kontrolle durchzuführen, wobei die Kontrollsequenz mit der ursprünglichen Sequenz bis auf eine Base identisch ist. Der Hauptvorteil der Methode ist die Möglichkeit, die so erhaltenen Arrays oder Chips zu miniaturisieren und Arrays hoher Dichte zu erzeugen, welche mehrere Tausend Einfangsequenzen enthalten.
Die zweite Methode basiert auf der chemischen oder enzymatischen Synthese von Einfangsequenzen vor der mechanischen Abscheidung auf bekannten spezifischen Positionen des Array-Substrats. Bei dieser Methode gibt es keine Beschränkung der Größe der Sequenzen, welche getüpfelt, abgeschieden oder befestigt werden sollen. Ein großer Vorteil der Abscheidungstechnologie, verglichen mit dem Ansatz der In-situ-Synthese, ist ihre große Vielseitigkeit. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Mikroaarrays oder Chips für im Prinzip jedes Molekül von Interesse, z.B., aber nicht darauf beschränkt, Nukleinsäuresequenzen jeder Länge, Antikörper, Lipide, Kohlenhydrate, kleine chemische Verbindungen usw. Ferner kann die Synthese von Sequenzen optimiert werden, Sequenzen können gereinigt werden, ihre Qualität kann vor der Verwendung überprüft werden, und/oder ihre Konzentration kann eingestellt werden, bevor sie mit der festen Oberfläche verknüpft werden. Ein Nachteil der Methode ist es jedoch, dass das Verfahren zeitaufwändig ist, da jede Sequenz getrennt behandelt werden muss, bevor sie auf den Mikroarray oder Chip getüpfelt wird, wodurch die Größe der Arrays begrenzt wird.
Die Chemie eines Mikroarrays der Hybridisierung zum Oligonucleotid unterscheidet sich deutlich von der eines Arrays, welcher mit langen DNA-Einfangsequenzen oder – molekülen hergestellt wird. Es wurde beobachtet, dass lange spezifische Einfangsequenzen eine viel bessere Bindung einer in einer Lösung oder Probe vorhandenen komplementären Zielsequenz ergeben als ihre entsprechenden kurzen Fragmente. In der Praxis werden lange Polynucleotid-Einfangsequenzen zur direkten Bindung langer Polynucleotid-Zielmoleküle oder -sequenzen verwendet. In einem typischen Genexpressionsexperiment enthalten die Einfangsequenzen für die cDNA-Bindung 50 Basen oder mehr, zum Beispiel 70 Basen, oder können sogar 600 Basen oder Nucleotide enthalten.
Wenn kurze Oligonucleotide von nur 15 bis 20 Basen als Einfangsequenzen verwendet werden (siehe z.B. US-Patentschrift 5,510,270) ist unter der Voraussetzung einiger Modifikationen des Nachweisprotokolls ein ausreichender Nachweis, eine Identifizierung und/oder eine Mengenbestimmung langer cDNAs möglich. Die RNA wird zunächst unter Verwendung eines Startermoleküls, welches eine Transskriptions-Startstelle für T7-RNA-Polymerase enthält, umgekehrt in ihre entsprechende cDNA transkribiert. Diese cDNA wird dann in vitro in verschiedene RNA-Kopien retranskribiert, welche dann in kleine Stücke zerschnitten werden. Diese kleinen RNA-Fragmente werden dann für die Hybridisierung auf Arrays verwendet, welche eine Reihe von Einfangsequenzen für jedes dieser RNA-Fragmente tragen. Die Fragmentierung ist notwendig, um einen ausreichenden Zugriff der Ziel-RNA-Sequenzen auf die sehr kurzen Einfangsequenzen sicherzustellen. Es sind spezielle Algorithmen erforderlich, um das Hybridisierungsmuster dieser verschiedenen Einfangmoleküle mit der(den) ursprünglichen Sequenz(en) der Ziel-DNA oder mRNA zu korrelieren.
Eine ähnlicher Umbau wird für den Nachweis einer Doppelstrang-DNA (dsDNA) vorgenommen, welche sich vorzugsweise in Lösung reassoziiert, anstatt auf Einfangsequenzen hybridisiert zu werden, welche auf einem festen Substrat vorliegen oder daran befestigt sind. Wiederum müssen die Amplicone unter Anwendung eines doppelten Amplifikationsverfahrens, welches mit (einem) Startermolekül(en), das(die) T3- oder T7-Sequenzen trägt(tragen), und dann einer Retrotranskripition mit einer RNA-Polymerase, in RNA retranskribiert werden. Diese RNAs werden in Stücke von etwa 40 Basen zerschnitten, bevor sie auf einem Array nachgewiesen werden (siehe z.B. Beispiel 1 der Internationalen Patentanmeldung WO 97/29212). Die obige Technik wurde hier für die Identifizierung des Mycobacteriurn-tubercolosis-rpoB-Gens unter Verwendung von Einfang-Nucleotidsequenzen von weniger als 30 Nucleotiden angewendet. Das beschriebene Verfahren ist in der Hinsicht kompliziert, dass es nicht den direkten Nachweis von Ampliconen ermöglicht, die aus genetischen Veratärkungsreaktionen (wie z.B. PCR) resultieren, sondern einen anderen Zyklus von Reaktionen und Kopien von Zielsequenzen erforderlich macht, welche alle zusätzliche Fehler in die Mengenbestimmung der Zielsequenzen einführen.
Trotz einiger Nachteile ist die Erzeugung von Mikroarrays über chemische Synthese und Abscheidung von Oligonucleotiden oder kurzen Polynucleotidsequenzen zweckmäßig, weil es ein schnelles und preiswertes Verfahren ist. Außerdem kann die Konstruktion der Einfangmoleküle oder – sequenzen einfach den Erfordernissen der zu analysierenden oder zu unterscheidenden Sequenzen angepasst werden.
Einfangmoleküle müssen nicht notwendigerweise aus Nucleotidsequenzen bestehen. Bei den Zielmolekülen kann es sich ebenso um Antikörper, Antigene, Rezeptoren oder Liganden handeln, welche durch Bindung an ihre entsprechenden Gegenstücke (Antikörper, Antigen, Ligand, Rezeptor, ...) nachgewiesen oder eingefangen werden sollen. Die obige Liste der Beispiele ist nicht abschließend.
Ein Kunde wird nicht immer mit Standard-Mikroarrays bedient, obwohl diese den Nachweis einer großen Menge verschiedener Zielmoleküle ermöglichen. Er möchte vielleicht ungewöhnliche Zielmoleküle nachweisen, oder er möchte das Unterscheidungsniveau verfeinern. Es besteht daher ein ständig wachsender Bedarf an individuell zugeschnittenen oder teilweise individuell zugeschnittenen Mikroarrays, welchen der Kunde nach seinem Wunsch einige zusätzliche Nachweismoleküle hinzufügen kann. Der Basis- oder Standard-Mikroarray, welcher nach Bedarf weiter gestaltet werden kann, enthält möglicherweise bereits viele verschiedene Einfangmoleküle zum wohldefinierten Gennachweis.
Standard-Mikroarrays können konstruiert und an viele Benutzer geliefert werden, welche sie dann für den Nachweis einiger wohldefinierter Zielgene neben anderen Zielgenen verwenden können, welche sich von einer Anwendung zur anderen oder von einem Benutzer zum anderen ändern.
Die US-Patentanmeldung 2003/003495 offenbart ein Nachweis- und/oder Mengenbestimmungsverfahren für Zielmoleküle biologischer Proben durch Verwendung von Mikroarrays, welche eine Gruppe immobilisierter Einfangmoleküle ebenso wie Adaptermoleküle umfassen, welche die Zielmoleküle an den Einfangmolekülen befestigen können.
Aufgabenstellungen der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Nachweis-, Identifizierungs- und Mengenbestimmungsverfahren und einen Bausatz dafür mit Standard-Mikroarrays bereitzustellen, welche einfach dem speziellen Bedarf eines oder mehrerer bestimmter Kunden angepasst werden können, mehrere Zielmoleküle nachzuweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einem Kunden zu ermöglichen, in einem bestimmten Experiment eine Gruppe von neuen Zielmolekülen, welche sich möglicherweise von einem Experiment zum anderen verändern, neben einer Gruppe von Zielmolekülen nachzuweisen, welche mit den Einfangmolekülen kompatibel sind, die bereits gemäß einem Mikroarray an die Oberfläche des festen Trägers gebunden sind, wobei der Nachweis der Zielmoleküle in beiden Gruppen quantitativ und auf ihr Vorliegen in der Probe bezogen ist.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis oder zur Mengenbestimmung verschiedener Gruppen von Zielmolekülen (einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe von Zielmolekülen), welche möglicherweise gleichzeitig in einer biologischen Probe vorliegen; dieses Verfahren umfasst den Schritt des Kontaktierens dieser Gruppen von Zielmolekülen mit einem (Mikro-)Array, welches auf einer festen Trägerfläche vorliegt; wobei der (Mikro-) Array eine erste und eine zweite Gruppe von Einfangmolekülen umfasst, welche an verschiedenen Orten der festen Trägerfläche vorliegen.
In dem Verfahren der Erfindung umfasst die erste Gruppe von Einfangmolekülen mindestens 3 Einfangmoleküle, welche für die erste Gruppe von Zielmolekülen spezifisch sind und welche die erste Gruppe von Zielmolekülen durch spezifische molekulare Erkennung (vorzugsweise durch Hybridisierung) direkt binden, und die zweite Gruppe von Einfangmolekülen umfasst mindestens 3 Einfangmoleküle, welche keine Beziehung und keine direkte Bindungsaffinität zu der zweiten Gruppe von Zielmolekülen (und zu der ersten Gruppe von Zielmolekülen) aufweisen; wobei die zweite Gruppe von Einfangmolekülen die zweite Gruppe von Zielmolekülen über ein Adaptermolekül binden kann, welches eine komplementäre Bindung zwischen Einfangmolekülen und Zielmolekülen ermöglicht.
Ferner wird in dem Verfahren der Erfindung eine relative Bestimmung der Menge einer Gruppe von Zielmolekülen im Vergleich zu der anderen Gruppe von Zielmolekülen vorteilhaft durch einen Korrekturfaktor erreicht, welcher durch die Verwendung zumindest eines zusätzlichen identischen Zielmoleküls (welches die erste Gruppe von Einfangmolekülen und über ein Adaptermolekül die zweite Gruppe binden kann) berechnet wird, dessen Menge gleichzeitig in beiden Gruppen von Einfangmolekülen bestimmt wird.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Korrekturfaktor kann vom Fachmann erhalten werden, indem er ein Zielmolekül mit einer unbekannten Konzentration verwendet, welches die beiden Gruppen von Einfangmolekülen binden kann, oder indem er einen inneren Standard mit einer bekannten Konzentration verwendet, welcher der Probe zugegeben wird und denselben Vorbehandlungsschritten (Reinigung, Amplifikation, Kopie) und dem Kontaktierungsschritt mit den nachzuweisenden und/oder in ihrer Menge zu bestimmenden Zielmolekülen unterzogen wird. Der internationale Standard bekannter Konzentration kann auch an die beiden Gruppen von Einfangmolekülen binden.
Deswegen kann der Fachmann, um eine geeignete Mengenbestimmung des Zielmoleküls zu ermöglichen, welches in einer der beiden Gruppen von Zielmolekülen vorliegt, das Verhältnis zwischen den beiden Signalen ermitteln, die in den beiden Gruppen aus der Bindung an den Einfangmolekülen resultieren, wobei das Signal erhalten wird, um dem Fachmann zu ermöglichen, einen Korrekturfaktor bereitzustellen, der für die Mengenbestimmung der anderen nachzuweisenden und in der Menge zu bestimmenden Zielmoleküle verwendet wird.
Eine andere Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Nachweis- und Mengenbestimmungs-Bausatz, welcher das Folgende umfasst:

– eine feste Trägerfläche einer (Mikro-)Array-Einheit, welche eine erste und eine zweite Gruppe von Einfangmolekülen umfasst, die an verschiedenen Orten der Trägerfläche vorliegen, wobei die erste Gruppe von Einfangmolekülen mindestens drei verschiedene Einfangmoleküle umfasst, welche für die Zielmoleküle, welche in einer Probe nachzuweisen und mengenmäßig zu bestimmen sind, spezifisch sind, wobei die Einfangmoleküle der ersten Gruppe eine erste Gruppe von Zielmolekülen direkt binden können;
– und wobei die feste Trägerfläche des (Mikro-)Arrays ferner an anderen Orten der festen Trägerfläche eine zweite Gruppe von Einfangmolekülen umfasst, welche mindestens drei Einfangmoleküle umfasst, welche keine Beziehung und keine direkte Bindungsaffinität zu einer zweiten Gruppe von Zielmolekülen aufweisen (und auch zu der ersten Gruppe von Zielmolekülen), welche nachzuweisen und mengenmäßig zu bestimmen sind und möglicherweise gleichzeitig mit der ersten Gruppe von Zielmolekülen in der Probe vorliegen;
– ein oder mehrere Adaptermolekül(e), welche eine spezifische Bindung der Zielmoleküle der zweiten Gruppe an den Einfangmolekülen der zweiten Gruppe ermöglichen,
– einen Korrekturfaktor für eine Gruppe von Zielmolekülen, welcher es ermöglicht, die in der Probe vorliegende Menge der Zielmoleküle der ersten Gruppe mit den Zielmolekülen der zweiten Gruppe zu vergleichen.

Vorzugsweise sind in dem erfindungsgemäßen Verfahren und Bausatz die Einfangmoleküle der zweiten Gruppe totipotente Einfangmoleküle (der Teil des „universellen Mikroarrays"). Deswegen weisen sie selbst keine Beziehung und keine direkte Bindungsaffinität zu den komplementären Zielmolekülen auf, die Bindung wird nur über Adaptermoleküle ermöglicht.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis und die Mengenbestimmung auf dem (Mikro-)Array durchgeführt, welcher in mindestens zwei verschiedene Arrays unterteilt ist und auf derselben Fläche des festen Trägers vorgelegt wird. Jeder Array umfasst eine erste und zweite Gruppe von Einfangmolekülen, welche an verschiedenen Stellen der Trägerfläche vorliegen. Diese mindestens zwei verschiedenen Arrays umfassen Einfangmoleküle der ersten Gruppe für den Nachweis derselben Zielmoleküle, und die verschiedenen Arrays umfassen verschiedene zweite Gruppen von Einfangmolekülen für den Nachweis anderer Zielmoleküle, welche von einem Array zum anderen verschieden sind. Dies bedeutet, dass es möglich ist, einen spezifischen ähnlichen Nachweis von Zielmolekü len an einem ersten Ort und unterschiedliche Nachweismuster anderer Arten von Zielmolekülen nach der Bindung der Zielmoleküle an Einfangmolekülen verschiedener Arrays über spezifische Adaptermoleküle zu erhalten. Die Adaptermoleküle können von einem Array zum anderen verschieden sein.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Bindung der Zielmoleküle an der zweiten Gruppe von Einfangmolekülen durch eine Zugabe von Adaptermolekülen auf den festen Träger durch einen Benutzer durchgeführt. Dies bedeutet, dass die erfindungsgemäßen Arrays „teilweise individuell zugeschnittene" Arrays sind, welche gemäß den Anforderungen des Benutzers nach spezifischen Identifizierungen von Zielmolekülen an spezifischen Stellen der Mikroarrayfläche zur Erlangung einer spezifischen Bindung verwendet werden können.
Gemäß einer ersten Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung sind oder umfassen die Ziel-, Einfang- oder Adaptermoleküle Nucleotidsequenzen. In dieser Ausführungsform erhält man deswegen die Bindung der Zielmoleküle an der zweiten Gruppe von Einfangmolekülen durch eine Sandwich-Hybridisierung zwischen den Einfangmolekülen und den Zielmolekülen über Adaptermoleküle, welche ebenfalls komplementäre Nucleotidsequenzen sind oder umfassen.
Vorzugsweise wird die Sandwich-Hybridisierung durch Adaptermoleküle erlangt, welche einen ersten Abschnitt umfassen, welcher eine Hybridisierung durch Komplementärbasenpaarung mit einem spezifischen Endabschnitt der Einfangmoleküle ermöglicht, und einen zweiten Abschnitt, welcher für mindestens einen Abschnitt einer oder mehrerer Zielmoleküle spezifisch ist.
Mit dem spezifischen Endabschnitt eines Einfangmoleküls, bei welchem es sich um eine Nucleotidsequenz handelt, ist der 5'- oder 3'-Endabschnitt gemeint, welcher nicht an die Fläche des festen Trägers gebunden ist.
Gemäß einer anderen Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung sind die Ziel- und Einfangmoleküle Proteine, und die Adaptermoleküle sind chimäre Proteine oder hybride Antikörper, was eine spezifische indirekte Bindung zwischen Einfang- und Zielmolekülen ermöglicht. Gemäß einem bevorzugten Beispiel sind die Ziel- und Einfangmoleküle jeweils entsprechend

– entweder Antigene und Antikörper (oder hypervariable Abschnitte der Antikörper)
– oder Antikörper (oder Abschnitte) und Antigene.

Die Erfindung stellt auch Mittel zum Nachweisen (zum Bestimmen) der Menge der beiden Gruppen von Zielmolekülen bereit, welche in der ursprünglichen Probe nachgewiesen wurden. Die Mengen der verschiedenen Zielmoleküle werden entweder relativ zueinander bestimmt oder werden zu absoluten Werten (pmol) korrigiert.
Der quantitative Nachweis wird durch einen Faktor korrigiert, welcher einen vergleichbaren und gleichzeitigen Nachweis aller gebundenen (an ihre Einfangmoleküle gebundenen) Zielmoleküle ermöglicht. Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren der quantitative Nachweis durch einen Nachweis mindestens einer Standardsequenz korrigiert, welche der (biologischen) Probe zugegeben und denselben Nachweisschritten wie die Zielmoleküle unterzogen wird. Das(die) Standardmolekül(e) wird(werden) auf beiden Gruppen von Einfangmolekülen nachgewiesen, welche an den beiden Orten der festen Trägerfläche vorliegen.
In einer anderen Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung wird die Bindungseffizienz der Zielmoleküle an den beiden Gruppen von Einfangmolekülen durch einen quantitativen Nachweis mindestens eines gemeinsamen Zielobjekts in beiden Gruppen korrigiert. In einer spezielleren Ausführungsform ist das gemeinsame Zielmolekül ein Haushaltsgen.
Vorzugsweise werden in beiden Gruppen von Einfangmolekülen 3 Standards oder 3 Zielmoleküle nachgewiesen oder in der Menge bestimmt, wobei jedes der Zielmoleküle eine um einen Faktor von mindestens 3 verschiedene Konzentration aufweist.
Um über Adaptermoleküle eine spezifische Bindung zwischen Einfangmolekülen und Zielmolekülen zu ermöglichen, umfassen die Einfangmoleküle der zweiten Gruppe eine oder mehrere endständige reaktive chemische Funktionalität(en), welche spezifisch an die Adaptermoleküle binden können. Vorzugsweise ist die endständige reaktive chemische Funktionalität ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aldehydgruppen, Epoxygruppen, Acrylatgruppen oder einer Mischung daraus.
Vorzugsweise sind alle Einfangmoleküle durch eine kovalente Bindung oder eine Verknüpfung an der festen Trägerfläche befestigt, um auf der festen Trägerfläche ein Mikroarray zu bilden. In einer ersten Ausführungsform der Erfindung enthält der zweite Ort der Fläche Einfangmoleküle, welche mit einer chemische Funktionalität (wie z.B. einer Aldehydgruppe, einer Epoxidgruppe oder einer Acrylatgruppe) enden, die mit einer NH₂-Gruppe des Adaptermoleküls reagieren kann.
Um eine sterische Hinderung zu vermeiden, sind die Einfangmoleküle über einen Abstandhalter (oder eine Verbindung) einer bestimmten Länge an die Oberfläche des festen Trägers gebunden. Bei Diesem Abstandhalterelement oder -molekül kann es sich um eine Polymerkette von mindestens 10 Atomen handeln, welche möglicherweise verzweigt ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Polyaminosäuren, Polyacrylamiden, Polyaminosacchariden, Polygluciden, Polyamiden, Polyacrylaten, Polycarbonaten, Polyepoxiden, Polyestermolekülen oder -ketten oder einer Mischung davon. Alternativ kann ein Teil des Einfangmoleküls als Abstandhaltermolekül fungieren. Vorzugsweise ist das Abstandhaltermolekül mindestens 6,8 nm lang. Möglicherweise handelt es sich bei dem Abstandhaltermolekül um eine Nucleotidsequenz von zwischen etwa 15 und etwa 1000 Basen, vorzugsweise zwischen etwa 30 und etwa 120 Basen.
Das Verfahren und der Bausatz der Erfindung sind insbesondere geeignet für den gleichzeitigen Nachweis, die Identifizierung und/oder Mengenbestimmung biologischer Moleküle von Interesse, wie z.B. Ziel-Polynucleotide oder Nucleotidsequenzen (möglicherweise homologe Sequenzen, welche gleichzeitig in einer biologischen Probe oder Testlösung vorliegen), wobei ein Multi-Parameter-Basis-Mikroarray dem Bedarf eines Kunden angepasst wird. Vorzugsweise werden die Zielmoleküle, wie z.B. Ziel-Polynucleotide oder Nucleotidsequenzen (z.B. genomische DNA- oder RNA-Sequenzen oder Amplicone), vor dem Nachweis mit Techniken, die auf dem Fachgebiet zum Standard gehören, vervielfältigt (Kopie) und/oder amplifiziert (genetische Amplifikation). Alternativ kann das Nachweissignal mit Techniken verstärkt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist die Bedeutung der Begriffe „Nukleinsäure", „Oligonucleotid", „Array" oder „Mikroarray", „Nucleotidsequenz", „Ziel-Nukleinsäure", „Ziel-Nucleotidsequenzen", „im Wesentlichen binden", „spezifische Hybridisierung zu", „Hintergrund", „Mengenbestimmung" und Ähnliches dieselbe, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO 97/27317 beschrieben.
Die Bedeutung des Begriffs „homologe Sequenz(en)" ist dieselbe, wie in der Europäischen Patentschrift EP-1 266 034 beschrieben, welche durch Bezugnahme hierin einbezogen wird.
Der Begriff „fester Träger" für die Herstellung von Mikroarrays im vorliegenden Zusammenhang soll jede Art von festem Material umfassen, welches physisch bearbeitet werden kann, um erforderlichen Reaktionen durchzuführen, wie z.B. die Inkubation einer Testlösung oder Probe, welche möglicherweise Zielmoleküle oder Kopien einer Zielsequenz enthält. Dieser feste Träger kann einzigartig sein oder kann ein Verbundstoff sein, welcher aus mehreren Materialien hergestellt ist, wobei es sich bei einem von ihnen um eine Substratfläche handelt, auf welcher Einfangmoleküle oder Nucleotidsequenzen befestigt oder gebunden werden können, um ein Mikroarray zu ergeben. Typische Beispiele für Substrate, welche auf dem Fachgebiet verwendet werden, sind Polymere, welche funktionalisiert sein können (zum Beispiel der Addition eines Verbindungsgliedes an ihre Oberfläche unterzogen sein können), um die Einfangmoleküle besser zu befestigen. Bei den Substraten oder Trägerflächen, auf welchen die Einfangmoleküle befestigt oder gebunden sind, kann es sich um einen porösen oder nichtporösen Träger handeln, sie können glatt oder rau sein und können abgeschieden oder oben auf einem anderen festen Träger angeordnet sein, wobei sie zum Beispiel aus Glas oder aus Kunststoff hergestellt sind.
Die Begriffe „Probe", „biologische Probe" oder „Testlösung" sollen jede (biologische) Probe oder Lösung umfassen, welche möglicherweise ein Zielmolekül enthält. Das Zielmolekül kann ein (Mikro-)Organismus sein oder aus einem (Mikro-)Organismus oder einer Komponente davon (z.B. Chloroplasten, Mitochondrien, Gene, Genprodukte, Proteine, Peptide, Toxine, Antigene, Lipide, Saccharide) erhalten worden sein.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden insbesondere Polynucleotide oder Nucleotidsequenzen, welche für einen (Mikro-)Organismus oder eine Komponente (Fleisch, Knochen) davon spezifisch sind, durch die zweite Gruppe von Einfangmolekülen nachgewiesen, wobei die Zielmoleküle von einem spezifischen Adaptermolekül eingefangen werden. Eine Testlösung kann eine Lösung sein, welche PCR-Produkte (Amplicon) eines (Mikro-)Organismus oder einer Komponente davon enthält.
Im vorliegenden Zusammenhang kann sich der Begriff „Zielmolekül" auf eine Nucleotidsequenz oder ein Polynucleotid beziehen, aber ebenso auf ein Protein, ein Lipid, ein Saccharid usw., welches in einer Probe nachgewiesen werden soll.
Im vorliegenden Zusammenhang kann ein „Einfangmolekül" eine Nucleotidsequenz umfassen, kann aber ebenso einen Antikörper oder einen hypervariablen Teil davon (Fab, Fab2 usw.), ein Antigen oder Epitop davon, einen Rezeptar, einen Liganden eines Rezeptors, ... umfassen, welche für ein Zielmolekül und/oder für ein Adaptermolekül spezifisch sind.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann sich der Begriff „Adapter" auf eine Polynucleotidsequenz oder Polypeptidsequenz (wie z.B. einen Antikörper, ein chimäres Molekül usw.) beziehen, welche die Verbindung zwischen einem Einfangmolekül und einem Zielmolekül herstellt.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen und speziellen Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen in weiteren Einzelheiten beschrieben. Die Beispiele, Ausführungsformen und Zeichnungen sollen in keiner Weise den Umfang der beanspruchten Erfindung beschränken, ebenso wenig wie die benutzten Bezugsziffern.
Kurze Beschreibung der Figuren
In 1 ist die Fläche des festen Trägers (6) in Form eines Arrays (7) dargestellt, welcher aus zwei Gruppen von Einfangmolekülen (A, B) hergestellt ist, die an verschiedenen Orten (8, 9) der festen Trägerfläche vorliegen. Die erste Gruppe (A) besteht aus Einfangmolekülen (2), welche für die Zielmoleküle (1) spezifisch sind, während die zweite Gruppe (B) aus Einfangmolekülen (4) besteht, die keine Beziehung zu den Zielmolekülen (3) aufweisen. Die Menge eines identischen Moleküls (x) wird gleichzeitig auf beiden Gruppen von Einfangmolekülen (A, B) bestimmt.
In 2 ist die Fläche eines Objektglases dargestellt, welches mit zwei erfindungsgemäßen „teilweise individuell zugeschnittenen" Arrays (7', 7'') bedeckt ist. An den ersten Orten (8', 8'') ist die erste Gruppe von Einfangmolekülen (A) auf beiden Arrays die gleiche und ermöglicht den Nachweis von Zielmolekülen der ersten Gruppe (1). An den zweiten Orten (9', 9'') sind jedoch die zweiten Gruppen von Einfangmolekülen auf den beiden Arrays verschieden und ermöglichen den Nachweis verschiedener Zielmoleküle der zweiten Gruppe. Die Menge eines identischen Moleküls (x) wird gleichzeitig auf beiden Gruppen (A, B-B') von Einfangmolekülen bestimmt.
In 3 ist eine erfindungsgemäße feste Trägerfläche (6) dargestellt, welche mit zwei Gruppen von Einfangmolekülen (2, 4) bedeckt ist, die an verschiedenen Orten der festen Trägerfläche (8, 9) vorliegen. Die erste Gruppe von Einfangmolekülen (2) ist für eine erste Gruppe von Zielmolekülen (1) spezifisch, während die zweite Gruppe von Einfangmolekülen keine Beziehung zu einer zweiten Gruppe von Zielmolekülen (3) aufweist, sie aber über die Verwendung eines zielspezifischen Adapters (5) nachweisen kann.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Bausatz, welche einen Nachweis und eine Mengenbestimmung mehrerer Zielmoleküle (1, 3) welche möglicherweise gleichzeitig in einer Probe vorliegen, nach der Bindung an komplementäre Einfangmoleküle ermöglichen, welche gemäß einem Array (7) auf einer festen Trägerfläche (6) vorliegen.
Die Fläche (6) umfasst mindestens zwei Gruppen von Einfangmolekülen (2, 4), welche an verschiedenen Orten (8, 9) der festen Trägerfläche (6) vorgelegt werden, wobei eine erste Gruppe A mindestens 3 verschiedene Einfangmoleküle (2) umfasst, welche für die Zielmoleküle (1) spezifisch sind, die nachgewiesen, identifiziert und/oder in der Menge zu bestimmt werden sollen, wobei die Einfangmoleküle direkt an dem Zielmolekül 1 binden können; und wobei die zweite Gruppe B mindestens 3 Einfangmoleküle (4) umfasst, welche keine Beziehung zu anderen Zielmolekülen (3) aufweisen, die nachgewiesen und in der Menge bestimmt werden sollen, und keine andere Affinität aufweisen, diese Zielmoleküle (3) zu binden, wobei die zweite Gruppe von Einfangmolekülen (4) die Zielmoleküle (3) über Adaptermoleküle (5) bindet. Die Menge mindestens eines identischen Moleküls (x) wird gleichzeitig auf beiden Gruppen von Einfangmolekülen bestimmt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche in 1 und 3 dargestellt ist, werden die Einfangmoleküle auf der festen Trägerfläche (6) in Form eines Arrays (7, 7', 7'') vorgelegt. Wie in 2 dargestellt, kann der Nachweis durch Verwendung einer festen Trägerfläche durchgeführt werden, welche mindestens zwei verschiedene Mikroarrays (7', 7'') umfasst, die auf der Fläche (6) des festen Trägers vorliegen.
Die mindestens zwei Arrays (7', 7'') umfassen an dem ersten Ort (8', 8'') Einfangmoleküle (2) der Gruppe A zum Nachweis derselben Zielmoleküle (1).
Ferner umfasst jeder Array (7', 7'') ebenso verschiedene Gruppen (B, B') von Einfangmolekülen (4, 4') zum Nachweis von Zielmolekülen (3, 3'), welche von einem Array (7') zum anderen (7'') verschieden sind, wobei die zweite Gruppe (B, B') von Einfangmolekülen (4, 4') an Orten (9', 9'') vorliegen, die sich von den Orten (8', 8'') der ersten Gruppe A unterscheiden.
Erfindungsgemäß lässt sich dieser Standard(Mikro)Array dafür einrichten, ungewöhnlichere (andere) Zielmoleküle (3) nachzuweisen, zu identifizieren oder in der Menge zu bestimmen, indem der Standard-Trägerfläche (6), welche bereits Einfangmoleküle (2) für mindestens eine erste Gruppe von Zielmolekülen (1) enthält, Adaptermoleküle (5) zugegeben werden, welche an totipotente Einfangmoleküle (4) binden können, welche nicht direkt an eines der Zielmoleküle (3) binden können, die möglicherweise in einer Probe oder Testlösung vorliegen. Die totipotenten Einfangmoleküle (4) liegen bereits (an die Fläche (6) gebunden) auf dem Standard-Mikroarray (7) vor, welches individuell zugeschnitten werden soll. Vorzugsweise handelt es sich bei den (totipotenten) Einfangmolekülen (4) um Nucleotidsequenzen wie DNA- oder RNA-Sequenzen, möglicherweise mit modifizierter Hauptkette.
Am besten führt die Befestigung (Bindung) der Einfangmoleküle (4) aus der zweiten Gruppe (B) an der Trägerfläche (6) nicht zur vollständigen Lösung und/oder Inaktivierung der ersten Gruppe (A) von Einfangmolekülen (2). Vorzugsweise wird die Lösung und/oder Inaktivierung so gering wie möglich gehalten.
Der Standard-Mikroarray oder Array (7) der Erfindung enthält somit vor dem individuellen Zuschnitt zwei Arten von Einfangmolekülen (2, 4). Die erste Art von Einfangmolekülen (2) ist für eine erste Gruppe von Zielmolekülen (1) spezifisch, während die zweite Art von Einfangmolekülen (4) ist für keine Zielsequenzen (1 oder 3) spezifisch ist. Sie sind totipotent, können aber über die Bindung von zielspezifischen Adaptermolekülen (5) spezifisch gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den totipotenten Einfangmolekülen (4), den Adaptermolekülen (5) und den Zielmolekülen (3) um Nucleotidsequenzen. Vorteilhafterweise sind die Adaptermoleküle für mindestens einen Teil der Ziel-Polynucleotide (3) oder ihre Kopien spezifisch, um ihre spezifische Hybridisierung, ihren Nachweis, ihre Identifizierung und/oder ihre Mengenbestimmung durch indirekte Bindung an den Einfangmolekülen (4) zu ermöglichen.
Die vorgefertigten Standardarrays, die individuell zugeschnitten werden sollen, welche auch als Standardprodukte bezeichnet werden (z.B. allgemeine Chips, Mikroarrays zum Krebsnachweis, Maus-Mikroarrays usw.), sind Mikroarrays mit Einfangmolekülen zum Nachweis einer vorgegebenen Anzahl von wohldefinierten Zielmolekülen. Die Dichte der Einfang-Nucleotidsequenzen, die an einem spezifischen Ort an der festen Trägerfläche gebunden sind, ist größer als etwa 10 fmol, vorzugsweise etwa 100 fmol je cm² der festen Trägerfläche. Die Standardprodukte können Arrays geringer Dichte oder hoher Dichte sein. Arrays geringer Dichte machen Gebrauch von einem Standardprodukt mit einer begrenzten Anzahl von Einfangmolekülen für eine begrenzte und ausgewählte Anzahl von Zielmolekülen. Die Mikroarrays und das Standardprodukt der Erfindung enthalten mindestens 5, 10, 50, 100, 1.000 oder 10.000 Flecken von Einfangmolekülen je cm².
Die Mikroarrays der Erfindung können nach Anforderung des Benutzers für den Nachweis weiterer Zielmoleküle in Verbindung mit Zielmolekülen, welche von der ersten Gruppe von Einfangmolekülen nachgewiesen werden, angepasst werden. Derselbe erfindungsgemäße Array kann also für den Nachweis einer großen Anzahl verschiedener Zielmoleküle benutzt werden, wobei die Anzahl möglicher nachzuweisender Zielmoleküle mindestens 10, 20, 50, 100 oder sogar 500 Mal größer ist als die Anzahl vorliegender Einfangmoleküle.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf Werkzeuge und Reagenzien, welche benötigt werden, um das Standardprodukt individuell zuzuschneiden, und welche für den folgenden Nachweis, die Identifizierung und/oder Mengenbestimmung benötigt werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich zum Beispiel auch auf die oben beschriebenen Adaptermoleküle (5), welche verwendet werden, um die Erkennung und die spezifische Bindung von Zielmolekülen (3) (welche möglicherweise in einer biologischen Probe oder Testlösung vorliegen) an die zweite Gruppe (B) von Einfangmolekülen (4) sicherzustellen, welche nicht direkt an den Zielmolekülen (3) binden können, die in der Probe vorliegen.
Die zweite Gruppe (B) von Einfangmolekülen (4) weist keine Nucleotidsequenz auf, welche komplementär zu einer Nucleotidstrecke eines nachzuweisenden Zielmoleküls (3) oder seinem Komplement ist.
Unter normalen Arbeitsbedingungen binden diese Zielmoleküle (3), bei denen es sich um Polynucleotide oder Nucleotidsequenzen handelt, nicht an den Einfangmolekülen (4), wenn vorzugsweise weniger als 10 aufeinander folgende Komplementärbasen vorliegen oder normalerweise weniger als 15 Komplementärbasen vorliegen. Vorzugsweise sind weniger als 5, insbesondere weniger als 3, Komplementärbasenpaare zwischen dem Zielmolekül und dem totipotenten Einfangmolekül möglich. Am besten sollte überhaupt keine Komplementärbasenpaarbindung zwischen einem Ziel-Polynucleotid oder einer Nucleotidsequenz und diesem totipotenten Einfangmolekül möglich sein. Wie es dem Fachmann bekannt ist, ist die Hybridisierung definiert durch den Prozentsatz der Identität oder Ähnlichkeit zweier Sequenzen und ist ferner definiert durch die angewendeten Hybridisierungsbedingungen (z.B. stringente, weniger stringente oder nichtstringente Bedingungen), welche hauptsächlich von der Temperatur und der Salzkonzentration abhängen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft individuell zuschneidbare Mikroarrays und ihre Herstellung, beginnend mit ein und demselben Standardprodukt, welche für den Nachweis von einerseits identischen und identifizierten Zielmolekülen und andererseits nichtidentifizierten und variablen Zielmolekülen benutzt werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die oben beschriebenen Adaptermoleküle (5) eine Sequenz (10) von mindestens 30 aufeinanderfolgenden Nucleotiden, welche zu dem identifizierenden Zielmolekül (3) oder seinem Komplement komplementär sind, auch als der zielspezifische Teil des Adaptermoleküls bezeichnet, und eine Sequenz (11) von mindestens 30 aufeinanderfolgenden Nucleotiden, welche für die totipotenten Einfangmoleküle (4) spezifisch sind, auf welchen die Zielmoleküle indirekt nachgewiesen und/oder in ihrer Menge bestimmt werden, auch als nicht zielspezifischer oder nicht zielbezogener Teil des Adaptermoleküls bezeichnet.
In einer anderen Ausführungsform bestehen die zielspezifischen Teile (10) des Adaptermoleküls aus Nucleotidsequenzen von mehr als 50 oder 70 Basen und sogar mehr als 100 oder 150 Basen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt der Abschnitt der Einfangmoleküle (4), welcher von dem Adaptermolekül (5) erkannt wird, am Ende (an dem Glied, welches nicht an der Fläche (6) des festen Trägers gebunden ist) des Einfangmoleküls (4) oder befindet sich zumindest in der Nähe dieses Endes. Er befindet sich vorzugsweise nicht zu nah an dem anderen Teil oder dem Glied des Einfangmoleküls (4), über welchen/-s das Einfangmolekül (4) an der festen Trägerfläche (6) befestigt ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält das totipotente Einfangmolekül (4) eine Sequenz, welche vom Adaptermolekül (5) erkannt wird, und eine Sequenz, welche vom Adaptermolekül (5) nicht erkannt wird und von einem Zielmolekül (3) nicht erkannt wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem letzteren um eine Abstandhaltersequenz von mindestens etwa 20 oder 30 Basen, vorzugsweise mindestens etwa 50 oder 70 Basen, insbesondere mindestens etwa 100 oder 150 Basen lang, oder um eine Sequenz zwischen diesen Parametern.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die indirekte Bindung von Zielmolekülen über spezifische Adaptermoleküle (5), welche an totipotente Einfangmoleküle (4) gebunden sind, dieselbe Effizienz auf wie die direkte Bindung auf den spezifischen Einfangmolekülen (2) der ersten Gruppe (A), welche auf dem Standard-Mikroarray-Produkt (7) vorliegen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Menge an Adaptermolekülen (5), welche der Probelösung zugegeben werden, angepasst, um eine Effizienz der Bindung der Zielmoleküle (1, 3) bereitzustellen, welche dann für beide Gruppen (A, B) identisch oder ähnlich ist, z.B. für die direkte und für die indirekte Bindung der Zielmoleküle (1, 3).
In einer anderen Ausführungsform wird die Mengenbestimmung eines Zielmoleküls (1, 3), welches in einer Probe vorliegt, mit einer Korrektur durch Verwendung bestimmter bekannter innerer Standardsequenzen durchgeführt, welche der Probe in einer bestimmten bekannten Menge zugegeben werden. Einige dieser Sequenzmoleküle werden durch direkte Bindung auf der ersten Gruppe (A) von Einfangmolekülen (2) nachgewiesen, während andere Sequenzen indirekt über die Verwendung der oben beschriebenen Adaptermoleküle (5) nachgewiesen werden, wobei beide Bindungstypen möglicherweise durch einen Koeffizienten korrigiert werden, welcher für die beiden Gruppen (A, B) verschieden ist.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird derselbe innere Standard sowohl in der ersten Gruppe (A) von Einfangmolekülen durch direkte Hybridisierung als auch in der zweiten Gruppe von totipotenten Einfangmolekülen durch Verwendung von Adaptermolekülen (5) eingefangen.
In einer anderen Ausführungsform wird der Korrekturkoeffizient für die Effizienz der Hybridisierung für beide Gruppen von Zielmolekülen durch Verwendung mindestens eines und vorzugsweise mindestens dreier gemeinsamer Zielmoleküle erhalten, welche in beiden Gruppen von Einfangmolekülen nachgewiesen werden. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die 3 gemeinsamen Zielmoleküle aus der hohen, mittleren und niedrigen Anzahl von Genen, welche in der Probe vorliegen, ausgewählt. Der Unterschied der relativen Menge solcher Gene weist mindestens einen Faktor von 3 und vorzugsweise von 10 oder mehr auf.
In einer Ausführungsform ist der Korrekturfaktor von einem Molekül zum anderen derselben Gruppe verschieden. Der Korrekturfaktor ist für eine Untergruppe von Molekülen der gleiche und ist für eine andere Untergruppe von Molekülen derselben Gruppe ein anderer. In einer besonderen Ausführungsform sind die Moleküle nach ihrer Konzentration in verschiedene Untergruppen eingeordnet, und der angewendete Korrekturfaktor ist verschieden.
Die Mengenbestimmung von Zielmolekülen wie Genen oder deren Produkt (mRNA oder Protein), welche in einer Probe vorliegen, wird am besten unter Verwendung von 3 verschiedenen Abtasteinstellungen im Array-Abtaster durchgeführt (beim Packard-Array-Abtaster werden z.B. für den photoelektronischen Vervielfacher Einstellungen von 50, 70 und 100 benutzt). Die Benutzung von 3 Einstellungen und 3 Zielen oder 3 inneren Standards, welche in verschiedenen Mengen vorliegen, ermöglicht eine Korrektur für die Effizienz der Bindung beider Gruppen von Zielmolekülen in den 3 verschiedenen Abtasteinstellungen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Effizienz der indirekten Bindung von Zielmolekülen (3) auf Einfangmolekülen (4) über Adaptermoleküle (5) der direkten Bindung von Zielmolekülen (1) auf Einfangmolekülen (2) einer Länge von mindestens etwa 100 oder 150, vorzugsweise mindestens etwa 200 oder 300 und insbesondere mindestens etwa 400 oder 500 Basen, ähnlich oder identisch.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthält der Mikroarray Einfangmoleküle (2) einer Länge von mindestens etwa 100 oder 150 Basen, insbesondere mindestens etwa 200 oder 300 Basen und am besten mindestens etwa 400 oder 500 Basen für den direkten Einfang von Zielmolekülen (1), welche in einer biologischen Probe oder Testlösung nachgewiesen werden sollen.
In einer anderen Ausführungsform sind die Einfangmoleküle beider Gruppen (A, B) aus einer nichtspezifischen Sequenz oder Sequenz ohne Beziehung (Abstandhalter), welche eine Länge von mindestens etwa 20 oder 30 Basen, vorzugsweise mindestens etwa 50 oder 70 Basen und insbesondere etwa 100 oder 150 Basen, aufweist und an der Trägerfläche befestigt ist, und ferner an ihrem Ende aus einer Sequenz zusammengesetzt, welche entweder (im Fall der direkten Bindung) für das Zielmolekül (1) oder die nachzuweisende Zielsequenz oder (im Fall der indirekten Bindung) für das Adaptermolekül (5) spezifisch ist. Der spezifische oder adapterspezifische Teil (11) der Einfangmoleküle weist eine Länge von mindestens 10 oder 15 Basen, vorzugsweise mehr als etwa 20 oder 30 Basen und insbesondere mehr als etwa 40 oder 50 Basen auf. Die Länge der spezifischen Sequenz der Einfang-Nucleotidsequenzen (2), welche mit den entsprechenden Ziel-Nucleotidsequenzen hybridisieren können, kann zwischen etwa 10 und etwa 60 Basen liegen, vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 30 Basen. „Etwa" in diesem Zusammenhang bedeutet, dass es möglich ist, dass die Sequenzen 1, 2, 3 bis 5 Nucleotide mehr oder weniger als erwähnt aufweisen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die Einfangmoleküle der zweiten Gruppe (B) durch PCR synthetisiert, wobei als Matrize eine gemeinsame Sequenz verwendet wird. Ein Starter weist eine freie Sequenz auf, welche sich von einer Einfangsequenz zur anderen unterscheidet und für die Erkennung des Adaptermoleküls (5) verwendet wird.
Die Arrays oder Mikroarrays (7, 7', 7'') der Erfindung sind sehr gut geeignet für den Nachweis und/oder die Mengenbestimmung von Genen, welche von Zellen exprimiert werden, möglicherweise nach dem zumindest teilweisen Kopieren der Ziel-Gensequenzen in einen cDNA-Strang und der Hybridisierung der cDNA auf spezifischen Einfangmolekülen, welche erfindungsgemäß bereitgestellt werden.
Das Verfahren der Erfindung ist insbesondere geeignet für den Nachweis von Sequenzen, welche zueinander homolog sind. Eine Unterscheidung zwischen homologen oder nahezu identischen Sequenzen ist über die Verwendung kleiner oder kurzer spezifischer Sequenzen möglich. Zum Beispiel kann der zielspezifische Teil der Einfangmoleküle der ersten Gruppe (A) oder des Adaptermoleküls (5), welcher verwendet wird, um homologe Ziel-Nucleotidsequenzen (1) zu unterscheiden, eine Länge zwischen etwa 15 und etwa 50 Basen aufweisen. Der Prozentsatz der Homologie ist vorzugsweise höher als etwa 40% oder 50%, insbesondere höher als etwa 60%, 65% oder 70%, am besten höher als etwa 75%, 80 %, 85% oder 90%.
Das Verfahren der Erfindung kann sogar eine Unterscheidung zwischen Zielsequenzen ermöglichen, welche sich nur in einem oder wenigen Nucleotiden unterscheiden, und welche somit einen oder wenige SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms; Einzelnucleotid-Polymorphismen) enthalten.
Vorteilhafterweise können das Verfahren und die Arrays der Erfindung für die Identifizierung und/oder Mengenbestimmung von DNA-Sequenzen, Einzel- oder doppelsträngigen Sequenzen verwendet werden, welche entweder direkt aus einem Organismus oder einem Teil davon erhalten werden, also ohne jeden vorherigen Amplifikationsschritt, oder alternativ nach der Amplifikation eines Teils seiner genomischen DNA oder RNA. Die Amplifikation von Zielsequenzen kann über irgendein auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren erreicht werden, z.B., aber nicht darauf beschränkt, PCR, LCR, NASBA, rollender Kreis oder irgendein anderes Verfahren, welches die Herstellung einer zuverlässigen Kopie der gegebenen Sequenz ermöglicht. In dem genetischen Amplifikationsverfahren können ein oder mehrere (PCR-)Starter oder Startergruppen verwendet werden. Bei den Startern kann es sich um universelle Starter, Consensus-Starter und/oder typenspezifische Starter handeln. Ein erfindungsgemäßer Bausatz kann möglicherweise Kammern enthalten, wobei der Nachweis des Vorliegens irgendwelcher amplifizierter Sequenzen von (Mikro-)Organismen und die genetische Amplifikation in ein und derselben Kammer durchgeführt werden. Die Mittel für eine genetische Amplifikation von Ziel-Nucleotidsequenzen, welche aus den (Mikro-)Organismen erhalten werden, können mit dem Bausatz der Erfindung geliefert werden.
Bei der amplifizierten Nucleotidsequenz kann es sich um mRNA handeln, welche zuerst in cDNA retrotranskribiert wird, möglicherweise unter Verwendung desselben Starterpaars für die Retrotranskription und die Amplifikation.
Möglicherweise wird das Vorliegen irgendeiner amplifizierten Sequenz zuerst während der genetischen Amplifikationszyklen nachgewiesen und diese danach auf dem Array identifiziert.
Der Nachweis der Zielmoleküle, welche auf dem Mikroarray eingefangen sind, kann über irgendein auf dem Fachgebiet bekanntes physikalisches oder chemisches Nachweisverfahren vorgenommen werden, z.B., aber nicht darauf beschränkt, die Anwendung von Fluoreszenzmarkierung, Kolorimetrie, Biolumineszenz, Chemilumineszenz, elektrischer Oberflächenplasmonresonanz, elektromagnetischen Signalen, ... . Die Erfassung und Interpretation des Einfang- oder Hybridisierungssignals wird durch die Tatsache verbessert, dass die Einfangmoleküle an wohldefinierte Orte des festen Trägers gebunden sind.
Der (unlösliche) feste Träger oder das Substrat für die Herstellung des erfindungsgemäßen Mikroarrays ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glasen, elektronischen Elementen, Siliciumträgern, Siliciumdioxid, Metallen, oder Mischungen davon, hergestellt in einem Format, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Objektträgern, Scheiben, Gelschichten und/oder Kügelchen. Kügelchen werden als Arrays angesehen, solange sie Eigenschaften aufweisen, welche es ermöglichen, sie voneinander zu unterscheiden, so dass eine Identifizierung der Kügelchen mit der Identifizierung eines gegebenen Einfangmoleküls und somit der Zielsequenz korreliert ist. Die obigen Beispiele sind nicht abschließend.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis, die Identifizierung und/oder die Mengenbestimmung eingefangener Zielsequenzen durch die Verwendung einer Vorrichtung erleichtert, welche mindestens eine Nachweis- und/oder Mengenbestimmungseinheit umfasst, um ein Signal nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, welches an dem Ort gebildet wird, wo ein Zielmolekül oder eine Komponente aus einem (Mikro-)Organismus auf dem Array eingefangen wird, möglicherweise eine Leseeinheit für Daten, welche auf einer Fläche des festen Trägers aufgezeichnet werden, ein Computerprogramm zur Erkennung der unterschiedlichen Regionen, welche die auf ihren entsprechenden Einfangmolekülen gebundenen Zielmoleküle und deren Orte beinhalten, möglicherweise ein Quantifizierungsprogramm für das Signal, welches an den Orten vorliegt, und ein Programm zum Korrelieren des Vorliegens des Signals an diesem Ort mit der Diagnose und/oder der Mengenbestimmung des (Mikro-)Organismus oder der Komponente. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf eine Vorrichtung, welche für diese Zwecke geeignet ist und den Mikroarray der Erfindung ablesen und dessen Ergebnisse interpretieren kann.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf die Verwendung eines individuell zugeschnittenen Arrays in einem Bausatz oder einem Nachweisverfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und/oder zur Mengenbestimmung eines Gemisches biologischer Moleküle aus einer ersten und zweiten Gruppe von Zielmolekülen. Diese Zielmoleküle können zu verschiedenen Gruppen, Untergruppen oder Unter-Untergruppen von Komponenten oder (Mikro-)Organismen gehören. In einer Ausführungsform der Erfindung kann die erste Gruppe von Einfangmolekülen für einzelne Zielkomponenten oder deren Untergruppen spezifisch sein, während die zweite Gruppe dann für alle Komponenten der Gruppe spezifisch ist, oder andersherum.
Das Verfahren und der Bausatz der Erfindung können für den Nachweis jeder Art von (Mikro-)Organismus oder jeder Komponente davon verwendet werden. Beispiele für (Mikro)Organismen und Komponenten davon sind, allerdings nicht darauf beschränkt, Staphylococci-Spezies, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis und/oder S. haemolyticus, Proben, welche zur Gattung Mycobacteria gehören, Sequenzen, welche zur MAGE-Familie oder der HLA-A-Familie gehören, G-gekoppelte Rezeptoren, Dopaminrezeptoren, Cholinrezeptoren, Histaminrezeptoren, Mitglieder der Cytochrom-P450-Familie, Bakterien der grampositiven oder gramnegativen Familie.
Man kann auf Gruppen, Untergruppen oder einzelne Zielmoleküle oder Zielsequenzen abzielen, welche Familien, Gattungen, Spezies, Subtypen oder einzelnen Organismen entsprechen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Familien, Gattungen, Spezies, Subtypen oder Individuen um Bakterien wie jene ausgewählten aus der Gruppe, bestehend aus Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Haemolyticus, Pseudomonas, Campylobacter, Enterobacter, Neisseria, Proteus, Salmonella, Simonsiella, Riemerella, Escherichia, Meningococcus, Moraxella, Kingella, Chromobacterium und Branhamella. Die obige Liste ist nicht abschließend.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung eines Mikroarray mit zielspezifischen Einfangmolekülen und nicht zielspezifischen Einfangmolekülen und Nachweis von Zielmolekülen über die Verwendung eines spezifischen Adaptermoleküls aus 60 Basen
Funktionalisierung des Glasträgers
Die Objektgläser werden gemäß dem Verfahren, welches in der Europäischen Patentanmeldung EP-1 184 349 beschrieben ist, für die Gegenwart von Aldehyden funktionalisiert.
Bindung der zielspezifischen (Gruppe A) und nicht zielspezifischen (Gruppe B) Einfangmoleküle auf dem Träger
Die spezifischen Einfangmoleküle sind gegen 59 Gene gerichtet, wie 2002 von Delongueville u.a. (Biochem. Pharmacol. 64, 137 bis 149) beschrieben. Sie zielen auf 59 toxikologisch relevante Gene im Ratten-Hepatochip-Doppelchip (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) ab. Drei nicht zielbezogene Einfangmoleküle werden synthetisiert und auf den Array getüpfelt. Diese 3 Einfangmoleküle werden durch PCR-Amplifikation aus einer klonierten Pflanzensequenz, welche in ein Plasmid insertiert wird, synthetisiert. Die 3 Zielmoleküle, welche über einen Adapter auf diesen nicht zielbezogenen Einfangmolekülen gebunden werden, werden gleichzeitig auf 3 zielspezifischen Einfangmolekülen gebunden. Da die Menge dreier Zielmoleküle gleichzeitig auf beiden Einfangmolekülgruppen bestimmt wird, ermöglichen sie eine Korrektur der Mengenbestimmung der Zielmoleküle.
Die verwendeten PCR-Sense-Starter sind die folgenden:

PALFAS1 (SEQ ID NO: 1) für Sequenz 1: 5'-gcatggatgttgctctcgcgtagacgactggatggctagttactgctctg-3'
PALUCP21 (SEQ ID NO: 2) für Sequenz 2: 5'-agtacgtcgacagacttagtcctgaagctcgatggctagttactgctctg-3'
PALL191 (SEQ ID NO: 3) für Sequenz 3: 5'-ggctgatcatgtactccaaggtttgttatcgatggctagttactgctctg-3'

Die Sense-Starter umfassen 30 freie Basen am 5'-Ende (fett), gefolgt von 20 Basen, welche für das Insert spezifisch sind.
Der Antisense-Starter war für die 3 PCR-Reaktionen der gleiche. Er ist am 5'-Ende aminiert und ist für das Insert spezifisch.

PAL2 (SEQ ID NO: 4): 5'-Amin-atgagtttcaagatttcaacag-3'

Die Sequenzen der 3 Einfangmoleküle sind die folgenden:
Eine negative Kontrolle besteht aus einem Einfangmolekül identischer Länge, welches eine statistische Sequenz aus 30 Basen umfasst und von einem Adapter, der in der Lösung vorliegt, nicht erkannt wird.
Die Einfangmoleküle werden in der Tüpfellösung (EAT, Namur, Belgien) verdünnt. Die beiden Gruppen von Einfangmolekülen werden mit einem Arrayer unter Verwendung einfacher Nadeln auf räumlich getrennte Positionen des Trägers getüpfelt. Die Objektträger werden 1 h bei Raumtemperatur getrocknet. Die Objektträger werden zweimal 2 min mit Waschpuffer und dreimal mit Wasser gewaschen. Die Objektträger werden vor der Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Nachweis von Ziel-cDNA auf einem individuell zugeschnittenen Mikroarray der Erfindung
Die Trägerfläche, welche die Einfangmoleküle der ersten und zweiten Gruppe enthält, ist von einem Hybridisierungsrahmen umgeben, welcher die Trägerfläche begrenzt, die sich in Kontakt mit der Lösung befindet, welche die Zielmoleküle enthält. Der Array wird zuerst für 30 min bei 55°C mit 3 verschiedenen synthetischen Adaptermolekülen inkubiert. Die Adaptermoleküle sind Polynucleotide aus etwa 60 Basen. Sie enthalten 30 Basen, welche zu den Einfangmolekülen komplementär sind, und 30 Basen, welche zu den Ziel-cDNA-Sequenzen komplementär sind. Die 3 Ziel-DNA sind FAS (Akzessions-Nr. U03470), UCP2 (Akzessions-Nr. AB010743) und L19 (Akzessions-Nr. J02650).
Die Sequenzen der 3 Adaptermoleküle sind die folgenden:

AFAS30 (SEQ ID NO: 8): 5'-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcgcatggatgttgctctcgcgtagacgactg-3'
AUCP230 (SEQ ID NO: 9): 5'-atgccattgtcaactgtactgagctggtgaagtacgtcgacagacttagtcctgaagctc-3'
AL1930 (SEQ ID NO: 10): 5'-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtgggctgatcatgtactccaaggtttgttatc-3'

Die Sequenzen, welche zu den Einfangmolekülen komplementär sind, sind fett dargestellt.
Die Adaptermoleküle werden durch chemische Synthese erhalten (Eurogentec, Liege, Belgien). Nach der Inkubation wird der Array mit SSC2X-Lösung gewaschen. Der Array wird dann mit biotinylierter cDNA aus Rattenleber inkubiert, wie oben bereits erläutert (Delongueville u.a., 2002). Nach der Hybridisierung mit der biotinylierten Ziel-cDNA werden die Arrays mit Anti-Cyanin-Antikörpern (Jackson ImmunoResearch, Cy3: ref.-200.162.096, Cy5: ref.-200.172.096), 1:1000-verdünnt in B1-Puffer, welcher 0,01% Blocker enthält, inkubiert. Die Biochips werden dann viermal während 2 min mit B1-Puffer gewaschen. Die Biochips werden bei Raumtemperatur getrocknet und mit dem GMS418 ScanArray (generelles Abtasten) abgetastet. Nach der Digitalisierung des Bildes wird die Imagene-Software (Biodiscovery, Marina Del Rey, USA) benutzt, um die Tüpfelfläche abzugrenzen, das Signal für jeden Tüpfel zu integrieren, den lokalen Hintergrund um jeden Tüpfel herum zu subtrahieren, den Ort der Tüpfel zu identifizieren und den Ort mit der Identität des Zielobjekts zu korrelieren. Die Bestimmung der Menge des Zielobjekts in der Probe wird im Wesentlichen wie oben beschrieben erreicht (Delongueville u.a., 2002). Die Bestimmung der Menge der Zielmoleküle aus beiden Gruppen wird korrigiert, um deren Menge in der ursprünglichen Probe, welche für die Analyse benutzt wurde, zu ermitteln. Die Korrektur wird durch die Verwendung der 3 gemeinsamen Ziel-cDNA (der oben beschriebenen FAS, UCP2 und L19) erhalten, deren Menge gleichzeitig auf beiden Gruppen von Einfangmolekülen bestimmt wurde.
Beispiel 2: Herstellung eines Mikroarray mit zielspezifischen Einfangmolekülen und nicht zielspezifischen Einfangmolekülen und Nachweis von Zielmolekülen über die Verwendung eines spezifischen Adaptermoleküls aus 80 Basen
Das Experiment wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die für den Nachweis der 3 Ziel-cDNA verwendeten Adaptermoleküle sind Polynucleotide aus 80 Basen. Sie enthalten 30 Basen, welche zu den Einfangmolekülen komplementär sind (fett), und 50 Basen, welche zu den Ziel-cDNA-Sequenzen komplementär sind.
Die Sequenzen der 3 Adaptermoleküle sind die folgenden:

AFAS50 (SEQ ID NO: 11): 5'-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcagaggcaaagagaaggaactgcatggatgttgctctcgcgtagacgactg-3'
AUCP250 (SEQ ID NO: 12): 5'-atgccattgtcaactgtactgagctggtgacctatgacctcatcaaagatagtacgtcgcagacttagtcctgaagctc-3'
AL1950 (SEQ ID NO: 13): 5'-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtggttggaccccaatgaaaccaggctgatcatgtactccaaggtttgttatc-3'

Beispiel 3: Herstellung eines Mikroarray mit zielspezifischen Einfangmolekülen und nicht zielspezifischen Einfangmolekülen und Nachweis von Zielmolekülen und inneren Standards über die Verwendung eines spezifischen Adaptermoleküls aus 60 Basen
Das Experiment wird wie in Beispiel 1 beim Nachweis dreier gemeinsamer Zielmoleküle auf beiden Gruppen von Einfangmolekülen durchgeführt. Der Mikroarray enthält auch 3 für innere Standards spezifische Einfangmoleküle in der Gruppe A (RBCL, CAB10B, Rubisco-Aktivase). Drei weitere nicht zielbezogene Einfangmoleküle werden für die Korrektur der Hybridisierungseffizienz verwendet. Sie werden verwendet, um Adaptermoleküle einzufangen, welche teilweise komplementär zu der cDNA des inneren Standards sind.
Diese 3 neuen nicht zielbezogenen Einfangmoleküle werden durch PCR-Amplifikation aus einer klonierten Pflanzensequenz, welche in ein Plasmid insertiert wird, synthetisiert. Die freien Sequenzen aus 30 Basen am 5'-Ende der Starter unterscheiden sich von Beispiel 1.
Es wurden die folgenden Sense-Starter benutzt:

PALRBCL1 (SEQ ID NO: 14) für Sequenz 1: 5'-tctgttcccttacgactcgataagagctctgatggctagttactgctctg-3'
PALCAB1 (SEQ ID NO: 15) für Sequenz 2: 5'-actcttgctgaggctattcaaggcggcatcgatggctagttactgctctg-3'
PALRUBI1 (SEQ ID NO: 16) für Sequenz 3: 5'-atacagttcaatcgccgagtctacgcggtagatggctagttactgctctg-3'

Wiederum umfassen die Sense-Starter 30 freie Basen am 5'-Ende (fett), gefolgt von 20 Basen, welche für das Insert spezifisch sind.
Der Antisense-Starter ist derselbe wie in Beispiel 1 (SEQ ID NO: 4).
Die Sequenzen der 3 Einfangmoleküle, welche für die 3 inneren Standards benutzt werden, sind die folgenden:
Die 3 cDNA der inneren Standards sind RBCL (Akzessions-Nr. L14403, durch Bezugnahme hierin einbezogen), CAB10B (Akzessions-Nr. M32606, durch Bezugnahme hierin einbezogen) und Lycopersicon-pennelli-Rubisco-Aktivase (Akzessions-Nr. AF037361, durch Bezugnahme hierin einbezogen).
Die Sequenzen der 3 Adaptermoleküle für die 3 inneren Standards sind die folgenden:

ARBCL30 (SEQ ID NO: 20): 5'- gtagcttaccctttagacctttttgaagaatctgttcccttacgactcgataagagctct-3'
ACAB30 (SEQ ID NO: 21): 5'-ccaccacatctgctactgcagtgctgaatgactcttgctgaggctattcaaggcggcatc-3'
ARUBI30 (SEQ ID NO: 22): 5'-gacggcttctacattgcccctgctttcatgatacagttcaatcgccgagtctacgcggta-3'

Die drei inneren Standards werden hinzugegeben. Die relative Effizienz der Bindung beider Gruppen von Einfangmolekülen wird bei den 3 Abtastereinstellungen berechnet und für die Korrektur des Nachweises des Zielobjekts in beiden Gruppen von Einfangmolekülen verwendet. Die Korrektur wird bei jeder Abtastereinstellung für ein Gen durchgeführt, dessen Mengenbestimmung linear ist.
Der Teil des Adaptermoleküls, welcher komplementär zum Einfangmolekül ist, ist fett dargestellt.
Die Adaptermoleküle werden durch chemische Synthese erhalten. Im Übrigen wird das Experiment wie in Beispiel 1 durchgeführt, und die Signale, die man auf den Einfangmolekülen für den inneren Standard erhält, werden für die Korrektur der Hybridisierungseffizienz zwischen den zielspezifischen und nicht zielspezifischen Einfangmolekülen verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nachweis- und Mengenbestimmungsverfahren für eine erste Gruppe und eine zweite Gruppe von Zielmolekülen (1, 3), welche in einer biologischen Probe möglicherweise gleichzeitig auf einer festen Trägerfläche (6) eines (Mikro-)Arrays vorliegen, wobei der (Mikro-)Array (7) eine erste Gruppe (A) und eine zweite Gruppe (B) von Einfangmolekülen (2, 4) umfasst, welche an verschiedenen Orten (8, 9) der festen Trägerfläche (6) vorliegen, wobei die erste Gruppe von Einfangmolekülen (A) aus mindestens 3 Einfangmolekülen (2) aufgebaut ist, welche für die erste Gruppe von Zielmolekülen (1) spezifisch sind und die erste Gruppe von Zielmolekülen (1) durch spezifische molekulare Erkennung direkt binden, und wobei die zweite Gruppe von Einfangmolekülen (B) aus mindestens 3 Einfangmolekülen (4) aufgebaut ist, welche keine Beziehung und keine direkte Bindungsaffinität zu der zweiten Gruppe von Zielmolekülen (3) aufweisen, wobei die zweite Gruppe von Einfangmolekülen (B) die zweite Gruppe von Zielmolekülen (3) über Adaptermoleküle (5) binden kann, und wobei eine relative Bestimmung der Menge der ersten Gruppe von Zielmolekülen (1) im Vergleich zu der zweiten Gruppe von Zielmolekülen (3) durch einen Korrekturfaktor erreicht werden kann, welcher durch die Verwendung zumindest eines identischen Moleküls (x) berechnet wird, dessen Menge gleichzeitig in beiden Gruppen (A, B) von Einfangmolekülen (2, 4) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die relative Bestimmung der Menge der Zielmoleküle, welche zu einer Gruppe gehören, in mindestens 2 Untergruppen von Zielmolekülen klassifiziert wird und mit verschiedenen Korrekturfaktoren berichtigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielmoleküle, welche zu einer Gruppe gehören, in mindestens 2 Untergruppen von Zielmolekülen klassifiziert werden, deren Mengen durch verschiedene Einstellungen eines Messstellenabtasters für den Nachweis bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Untergruppen der Zielmoleküle verschiedenen Konzentrationen der Zielmoleküle entsprechen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis der Zielmoleküle (1, 3), welche zu der ersten Gruppe oder der zweiten Gruppe von Zielmolekülen gehören, quantitativ ist, und wobei der quantitative Nachweis durch einen Korrekturfaktor berichtigt wird, welcher eine vergleichbare und gleichzeitige Bestimmung der Menge aller Zielmoleküle ermöglicht, die anfänglich in der Probe vorliegen und an ihren entsprechenden Einfangmolekülen gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der quantitative Nachweis durch einen Nachweis mindestens eines Standardmoleküls bekannter Konzentration berichtigt wird, welches der Probe zugegeben und demselben Nachweisschritt wie die Zielmoleküle unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei mindestens ein Zielmolekül in beiden Gruppen (A, B) der Einfangmoleküle (2, 4) nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Effizienz der Bindung der Zielmoleküle (1, 3) an den beiden Gruppen (A, B) der Einfangmoleküle (2, 4) durch einen quantitativen Nachweis von Ziel- und/oder Standardmolekülen in beiden Gruppen (A, B) berichtigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Einfangmoleküle (4) der zweiten Gruppe (B) totipotente Einfangmoleküle sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis auf mindestens zwei Arrays (7', 7'') durchgeführt wird, welche auf der Fläche (6) des festen Trägers vorliegen; wobei die mindestens zwei Arrays (7', 7'') Einfangmoleküle (2) einer ersten Gruppe (A) für den Nachweis derselben Zielmoleküle (1) umfassen; und jeder Array verschiedene Untergruppen (B, B') von Einfangmolekülen (4, 4') für den Nachweis von Zielmolekülen (3, 3') umfasst, welche sich von einem Array (7') zu einem anderen Array (7'') unterscheiden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei den Ziel-, Einfang- und Adaptermolekülen um Nukleotidsequenzen handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bindung der Zielmoleküle (3) an der/den zweiten Untergruppe(n) (B) der Einfangmoleküle (4) durch eine Sandwich-Hybridisierung zwischen den Einfangmolekülen (4), den Zielmolekülen (3) durch die Adaptermoleküle (5) erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Adaptermolekül (5) einen ersten Abschnitt (11) umfasst, welcher eine Hybridisierung durch Komplementärbasenpaarung mit einem spezifischen Endabschnitt des Einfangmoleküls (4) ermöglicht, und wobei das Adaptermolekül (5) einen zweiten Abschnitt (10) umfasst, welcher für mindestens einen Abschnitt eines oder mehrerer Zielmoleküle (3) spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zielmoleküle und die Einfangmoleküle Proteine sind, und wobei die Adaptermoleküle chimäre Proteine oder hybride Antikörper sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zielmoleküle und die Einfangmoleküle jeweils entsprechend – Antigene und Antikörper (oder hypervariable Abschnitte der Antikörper) oder – Antikörper (oder hypervariable Abschnitte der Antikörper) und Antigene sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Einfangmoleküle (4) der zweiten Gruppe (B) eine endständige reaktive chemische Funktionalität umfassen, welche spezifisch an den Adaptermolekülen (5) binden kann.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die endständige reaktive chemische Funktionalität ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aldehydgruppen, Epoxygruppen, Acrylatgruppen oder einem Gemisch davon.
Nachweis- und Mengenbestimmungs-Bausatz, welcher das Folgende umfasst: – einen festen Träger mit einer Fläche (6), welche mindestens zwei Gruppen (A, B) von Einfangmolekülen (2, 4) umfasst, die an verschiedenen Orten (8, 9) der festen Trägerfläche (6) vorliegen, – wobei die erste Gruppe (A) von Einfangmolekülen an einem ersten Ort (8) mindestens drei verschiedene Einfangmoleküle (2) umfasst, welche für eine erste Gruppe von Zielmolekülen (1), welche in einer Probe nachzuweisen und mengenmäßig zu bestimmen sind, spezifisch sind, wobei die Einfangmoleküle die Zielmoleküle (1) direkt binden können, – wobei die zweite Gruppe (B) von Einfangmolekülen an einem zweiten Ort (9) mindestens drei Einfangmoleküle (4) aufweist, welche keine Beziehung zu einer zweiten Gruppe von Zielmolekülen (3) aufweisen, welche nachzuweisen und mengenmäßig zu bestimmen sind, und keine direkte Bindungsaffinität zu den Zielmolekülen (3) aufweisen, und – ein oder mehrere Adaptermoleküle (5), welche die Bindung der Zielmoleküle (3) der zweiten Gruppe an den Einfangmolekülen (4) der zweiten Gruppe (B) ermöglichen, – gegebenenfalls Mittel und Daten zum Erreichen einer relativen Bestimmung der Menge der ersten Gruppe von Zielmolekülen (1) im Vergleich zu der zweiten Gruppe von Zielmolekülen (3), und – wobei es sich bei den Einfangmoleküle (4) der zweiten Gruppe (B) um totipotente Einfangmoleküle handelt.
Nachweis- und Mengenbestimmungs-Bausatz nach Anspruch 18, wobei das Mittel zum Erreichen der relativen Mengenbestimmung ein Standardmolekül ist, welches der Probe mit den Zielmolekülen (1, 3) zuzugeben demselben Nachweisschritt zu unterziehen ist.
Bausatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 oder 19, wobei die feste Trägerfläche (6) mindestens zwei Arrays (7', 7'') umfasst, welche Einfangmoleküle (2) der ersten Gruppe (A) für den Nachweis derselben Zielmoleküle (1) umfassen, und jeder Array (7', 7'') verschiedene Gruppen (B, B') von Einfangmolekülen (4, 4') für den Nachweis von Zielmolekülen (3, 3') umfasst, welche sich von einem Array (7') zu einem anderen Array (7'') unterscheiden.
Bausatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 20, wobei es sich bei den Ziel-, Einfang- und Adaptermolekülen um Nukleotidsequenzen handelt.
Bausatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 20, wobei die Zielmoleküle und die Einfangmoleküle Proteine sind, und wobei die Adaptermoleküle chimäre Proteine oder hybride Antikörper sind.
Bausatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 20, wobei die Zielmoleküle und die Einfangmoleküle jeweils entsprechend – Antigene und Antikörper (oder hypervariable Abschnitte der Antikörper) oder – Antikörper (oder hypervariable Abschnitte der Antikörper) und Antigene sind.
Bausatz nach Anspruch 21, wobei die Bindung der Einfangmoleküle (4) an den Zielmolekülen (3) durch eine Sandwich-Hybridisierung zwischen Einfangmolekülen (4), Zielmolekülen (3) und Adaptermolekülen (5) erreicht wird.
Bausatz nach Anspruch 24, wobei das Adaptermolekül (5) einen ersten Abschnitt (11) umfasst, welcher eine Hybridisierung durch Komplementärbasenpaarung mit einem spezifischen Endabschnitt der Einfangmoleküle (4) ermöglicht, und wobei das Adaptermolekül einen zweiten Abschnitt (10) umfasst, welcher für mindestens einen Abschnitt eines oder mehrerer Zielmoleküle (3) spezifisch ist.
Bausatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 25, wobei die Einfangmoleküle (4) der zweiten Gruppe (B) eine endständige reaktive chemische Funktionalität umfassen, welche spezifisch an den Adaptermolekülen (5) binden kann.
Bausatz nach Anspruch 26, wobei die endständige reaktive chemische Funktionalität ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Aldehydgruppe, einer Epoxygruppe, einer Acrylatgruppe oder einem Gemisch davon.