DE602004001861T2

DE602004001861T2 - Herstellungsverfahren und Verwendung von Mikro-Array-Trägern zur Detektion mehrfacher Polynukleotidsequenzen mit hoher Empfindlichkeit

Info

Publication number: DE602004001861T2
Application number: DE602004001861T
Authority: DE
Inventors: Jose Remacle; Konrad Beyreuther
Original assignee: Eppendorf Array Technologies SA
Current assignee: Eppendorf Array Technologies SA
Priority date: 2004-05-04
Filing date: 2004-05-04
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2024-05-05
Also published as: JP2005321389A; DE602004001861D1; EP1593425A1; CN1702177A; EP1593425B1; ATE335540T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Herstellungsverfahren für Mikro-Arrays, die erhaltenen Mikro-Array-Träger, die Kits, die diese umfassen, und deren Verwendung für die Detektion mit hoher Effizienz mehrerer Ziel-Polynukleotide (oder Nukleotidsequenzen), die in einer biologischen Probe oder in einer Testlösung vorhanden sind. Die erhaltenen Mikro-Array-Träger sind besonders in der molekularen Diagnose und der Gen-Expressionsanalyse nützlich.
Die Mikro-Array-Träger der vorliegenden Erfindung ermöglichen auch die Identifizierung, Detektion und/oder Quantifizierung einer großen Zahl von Genen oder Genprodukten (Amplikonen), die durch genetische Amplifizierung erhalten werden, wobei diese Gene oder Genprodukte in einer Probe vorhanden sind und von (Mikro-) Organismen erhalten werden, die die Gene umfassen, die zu verschiedenen genetischen taxonomischen Gruppen (Klasse, Familie, Gattung, Spezies, Individuen) gehören.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Identifizierung mehrfacher exprimierter Gene und die Identifizierung von (Mikro-) Organismen kann durch Detektion spezifischer Sequenzen aus einem genetischen Material erfolgen. Die Identifizierung und Quantifizierung exprimierter Gene (die in einer Probe vorhanden sind) wird gewöhnlich nach der reversen Transkription von mRNA in ihre entsprechende cDNA und Detektion dieser cDNA durchgeführt. Die Detektion spezifischer (Mikro-) Organismen wird leicht durch Amplifizieren (oder Kopieren) einer bestimmten Sequenz einer genomischen DNA (die in einer Probe vorhanden ist) und anschließendes Detektieren und/oder Identifizieren der amplifizierten Sequenzen durchgeführt. In beiden Fällen können die amplifizierten oder kopierten Sequenzen (Ziel sequenzen) durch spezifische Hybridisierung an entsprechende Fängermoleküle detektiert werden, die an einem festen Träger gemäß Mikro-Arrays vorhanden oder angeheftet sind. Die Quantifizierung der Zielsequenzen, die an ihre spezifischen Fängermoleküle gebunden sind, ermöglicht eine Schätzung der Menge an mRNA oder genomischer DNA, die in der Probe vorhanden ist. Vorzugsweise sind geeignete Steuermittel enthalten und die notwendigen Korrekturen werden durchgeführt, um die Effizienz der verschiedenen Schritte zu berücksichtigen, wie der Kopier- oder Amplifizierungsschritte von Zielsequenzen und deren Bindung mittels Hybridisierung an Fängermoleküle, die einen Mikro-Array bilden.
Mikro-Arrays sind feste Träger, die vorwiegend nach zwei Methoden hergestellt werden. Die erste Methode, die in US Patent 5,510,270 und 5,700,637 beschrieben ist, basiert auf einer photolithographischen in situ Synthese von Fängersequenzen auf einer Oberfläche eines festen Trägers. Die photolithographische DNA-Synthese verwendet eine rasche Festphasen-Phosphoramiditchemie. Eine Positions- und Sequenzsteuerung wird durch eine Kombination aus 5'-photogeschützten Phosphoramiditen, die durch Bestrahlung mit Licht aktiviert werden können, und einem Satz von Masken, die an richtigen Positionen Löcher enthalten, durch die Licht hindurchgehen kann, erreicht. Bei Erregung werden die photoschützenden Gruppen, die auf Teil-Oligonukleotidsequenzen vorhanden sind, die früher in dem Prozess synthetisiert wurden, entfernt und die Oligomere werden um ein weiteres Nukleotid verlängert, nachdem das relevante Monomer hinzugefügt wurde. Gegenwärtige Kopplungseffizienzen setzen eine tatsächliche Größengrenze bei etwa 25 Basen für diese Mikro-Arrays. Über diese Grenze hinaus sammeln sich unvollständige Produkte an, die die Spezifität des Assays beeinträchtigen.
Die Einschränkung hinsichtlich Größe oder Länge der Fänger-Oligonukleotide gemäß dieser Methode ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Effizienz der Synthese, die Schritt für Schritt ausgeführt wird, nicht 100% beträgt, so dass eine Ansammlung abgestumpfter Oligonukleotide innerhalb desselben Spots auftritt. Die photolithographische Methode führt zum Vorhandensein kurzer Oligonukleotide auf einem Träger. Der wesentliche Vorteil der Methode ist die Möglichkeit, die derart erhaltenen Fänger-Nukleotidsequenzen zu miniaturisieren und hochdichte Arrays zu erzeugen, die mehrere tausend Fänger-Nukleotidsequenzen enthalten.
Die zweite Methode beruht auf der chemischen oder enzymatischen Synthese von Fängersequenzen vor der mechanischen Abscheidung auf bekannte spezifische Stellen (entsprechend einer festen Trägeroberfläche). Bei dieser Methode gibt es keine Einschränkung hinsichtlich der Größe der Sequenzen, die in Spots aufgebracht, abgeschieden oder angeheftet sind, da sie nach jeder chemischen oder enzymatischen Methode synthetisiert werden können und ihre Sequenzen durch eine analytische Methode (gewöhnlich eine Sequenziermethode) bestätigt werden können. Ein wesentlicher Vorteil der Abscheidungstechnik, im Vergleich zu der in situ Synthesemethode, ist deren große Vielseitigkeit. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Mikro-Arrays mit im Prinzip jedem Fängermolekül von Interesse, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Nukleinsäuresequenzen beliebiger Länge, Antikörper, Lipide, Kohlenstoffhydrate, kleine chemische Verbindungen usw.. Ferner kann die Synthese von Sequenzen optimiert werden, Sequenzen können gereinigt werden, ihre Qualität kann vor der Verwendung geprüft und/oder ihre Konzentration kann vor der Kopplung an die feste Oberfläche eingestellt werden. Ein Nachteil der Methode ist jedoch, dass der Prozess zeitaufwändig ist, da jede Fängermolekülsequenz separat gehandhabt werden muss, bevor sie an der Oberfläche des festen Trägers in einem Array angebracht wird, wodurch die Größe der erhaltenen Mikro-Arrays begrenzt ist.
Die Chemie eines Hybridisierung-an-Oligonukleotid-Mikro-Arrays ist eindeutig anders als jene eines Arrays, das mit langen DNA-Fängersequenzen oder -Molekülen konstruiert ist. Es wurde beobachtet, dass lange spezifische Fängersequenzen für eine viel bessere Bindung einer komplementären Zielsequenz sorgen, die in einer Lösung oder Probe vorhanden ist, als ihre entsprechenden kurzen Fragmente. In der Praxis werden lange Polynukleotid- Fängersequenzen für eine direkte Bindung langer Polynukleotid-Zielsequenzen verwendet. In einem typischen Gen-Expressionsexperiment enthalten die Fänger-Nukleotidsequenzen für die cDNA-Bindung 50 Basen oder mehr, zum Beispiel 70 Basen, oder können sogar 600 Basen oder Nukleotide enthalten.
Wenn kurze Oligonukleotide von nur 15 bis 20 Basen als Fängersequenzen verwendet werden (siehe z.B. US 5,510,270 ), ist die Bindung langer cDNA gering und eventuell nicht detektierbar. Für eine adäquate Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung langer cDNAs müssen die folgenden zusätzliche Schritte ausgeführt werden. Die RNA-Sequenzen werden zuerst in entsprechende cDNA durch Verwendung eines Primers, der eine Transkriptionsstartstelle für T7 RNA-Polymerase trägt, revers transkribiert. Diese cDNA-Sequenzen werden dann in vitro in mehrere RNA-Kopien retranskribiert, die dann in kleine Stücke geschnitten werden. Diese kleinen RNA-Fragmente werden dann zur Hybridisierung auf Arrays verwendet, die eine Reihe von Fängersequenzen für jedes dieser RNA-Fragmente tragen. Es ist eine Fragmentierung notwendig, um einen ausreichenden Zugang der Ziel-RNA-Sequenzen zu den sehr kurzen Fängersequenzen sicherzustellen. Spezifische Algorithmen sind erforderlich, um das Hybridisierungsmuster dieser verschiedenen Fängermoleküle mit der oder den ur sprünglichen Sequenzen der Ziel-DNA oder -RNA angemessen zu korrelieren, Damit eine spezifische Hybridisierung einer bestimmten Zielsequenz gesteuert werden kann, ist es auch notwendig, für jede Fänger-Nukleotidsequenz eine Steuerung auszuführen, die zusätzlich aus einer Steuer-Fänger-Nukleotidsequenz besteht, die mit der Fänger-Nukleotidsequenz bis auf eine Base identisch ist.
Ein weiteres Problem entsteht bei doppelsträngiger DNA (dSDNA). Wenn dsDNA auf einem Mikro-Array analysiert werden soll, wird sie eher in Lösung reassoziieren, als an entsprechende Fänger-Nukleotidsequenzen hybridisieren, die an einer festen Substratoberfläche vorhanden oder an diese angeheftet sind. Die Verwendung kurzer Oligonukleotide für eine direkte Identifizierung und/oder Quantifizierung großer doppelsträngiger Amplikone (die nach der genetischen Amplifizierung erhalten werden), führt zu einer sehr geringen oder überhaupt keiner Empfindlichkeit und ist daher nicht von praktischem Nutzen. Auch hier müssen Amplikone unter Verwendung eines doppelten Amplifizierungsprozesses, der mit einem oder mehreren Primern mit T3- oder T7-Sequenzen durchgeführt wird, und einer anschließenden Retrotranskription mit einer RNA-Polymerase in RNA retranskribiert werden. Diese RNAs werden in Stücke von etwa 40 Basen geschnitten, bevor sie auf einem Array detektiert werden (siehe z.B. Beispiel 1 der Internationalen Patentanmeldung WO97/29212). Die obengenannte Technik wurde hier für die Identifizierung des Mycobacterium tuberculosis rpoB Gens angewendet, wobei Fänger-Nukleotidsequenzen von weniger als 30 Nukleotiden verwendet wurden. Die beschriebene Methode ist in dem Sinn kompliziert, dass sie keine direkte Detektion von Amplikonen ermöglicht, die sich aus genetischen Amplifizierungsreaktionen (wie PCR) ergeben, sondern einen weiteren Zyklus von Reaktionen und ein Kopieren von Zielsequenzen erfordert, die jeweils zusätzliche Abweichungen in der Quantifizierung der Zielsequenzen einführen.
Die Konstruktion von Mikro-Arrays durch chemische Synthese und Abscheidung kurzer Polynukleotidsequenzen ist jedoch nützlich, da sie ein rascher und kostengünstiger Prozess ist. Zusätzlich kann die Konstruktion von Fängermolekülen oder -sequenzen leicht den Anforderungen der zu analysierenden oder zu unterscheidenden Sequenzen angepasst werden. Wie zuvor erklärt, führt jedoch die Verwendung kurzer Nukleotidfängersonden zu einer starken Einschränkung in der Detektion langer Ziel-Nukleotidfragmente. WO 02/04111 offenbart einen festen Träger, der Nukleotidhaken und -linien umfasst, wobei die Nukleotidlinie ein nicht zufälliges Poly-T-Decamer ist.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung hat zur Aufgabe, ein neuartiges Herstellungsverfahren zum Erhalten von Mikro-Array-Trägern bereitzustellen, die nicht die Nachteile nach dem Stand der Technik aufweisen.
Die vorliegende Erfindung hat insbesondere zur Aufgabe, ein neuartiges Verfahren für die schnelle Konstruktion von Mikro-Array-Trägern bereitzustellen, die Sequenzen tragen, die in vorteilhafter Weise in einer Detektionsmethode (1) die hohe Spezifität kurzer Nukleotidsequenzen, die für zu detektierende, identifizierende und/oder quantifizierende Ziel-Nukleotidsequenzen spezifisch sind, mit (2) der hohen Spezifität langer Nukleotidsequenzen (mit derselben Bindungsempfindlichkeit wie lange Nukleotidsequenzen von mehr als 150 Basen) kombinieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger (Mikro-) Array-Träger, die besonders für eine direkte Detektion von cDNAs oder langen doppelsträngigen DNA-Sequenzen geeignet sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger Kosntruktionsmethoden, um feste Standard-(Mikro-)Array-Träger zu erhalten, die besonders zur weiteren Anpassung und Konstruktion von kundenspezifischen (Mikro-) Arrays geeignet sind, die an die Bedürfnisse verschiedener Kunden angepasst werden können.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine neue Methode zum Erhalten von (Mikro-)Arrays von Nukleotidsätzen auf einer Oberfläche eines festen Trägers, die für die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung von mindestens zwei, vorzugsweise mindestens vier, verschiedenen Ziel-Polynukleotiden oder -Nukleotidsequenzen verwendet werden, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind.
Vorzugsweise umfasst die Methode folgende Schritte:

– Fixieren von Nukleotidliniensequenzen auf einer Oberfläche eines festen Trägers, wobei die Nukleotidlinien mindestens 20 Nukleotide lang sind und eine (zufällige) Nukleotidsequenz haben, die nicht mit den Ziel-Nukleotidsequenzen, die detektiert und/oder quantifiziert werden sollen, verwandt ist (was bedeutet, dass die Sequenzen nicht imstande sind, komplementär mit den Ziel-Nukleotidsequenzen zu hybridisieren);
– Abscheiden an mindestens 4 spezifischen Stellen auf der Oberfläche des festen Trägers, die mit den Nukleotidlinien bedeckt ist, von Nukleotidhaken mit einer Sequenz, die für eine Ziel-Polynukleotidsequenz, die detektiert und/oder quantifiziert werden soll, spezifisch ist; und
– kovalente Bindung an den spezifischen Oberflächenstellen der Nukleotidhaken an die Nukleotidlinien, um Polynukleotidsätze zu bilden, die für die Bindung der Ziel-Polynukleotide oder -Nukleotidsequenzen an die spezifischen Stellen der festen Trägeroberfläche spezifisch sind.

Die Nukleotidlinien sind Sequenzen, die durch eine kovalente Bindung an der Oberfläche des festen Trägers durch eines ihrer Enden (5' oder 3') fixiert sind, und die Nukleotidhaken mit dem anderen ungebundenen Ende fixieren können.
Der erhaltene Array mit einem langen Nukleotidsätze-Konstrukt in einer solch einfachen und kostengünstigen Methode bietet sowohl (1) die hohe Spezifität der kurzen spezifischen Sequenz der Nukleotidhaken, wobei jeder Nukleotidhaken für eine Zielsequenz von den mindestens vier verschiedenen Polynukleotiden oder Nukleotidsequenzen spezifisch ist, wie auch (2) eine hohe Empfindlichkeit, die die vorteilhafte Empfindlichkeit langer Polynukleotidsequenzen von mehr als 150 Basen, eventuell mehr als 350 Basen, erreicht.
Ferner hat eine bevorzugte Methode zur Aufgabe, eine gleichförmige und effiziente Bedeckung der Oberfläche des festen Trägers durch Abscheidung der Nukleotidlinien an einer spezifischen Stelle auf der Oberfläche des festen Trägers zu erreichen, so dass eine weitere kovalente Bindung der Nukleotidhaken an diesen Nukleotidlinien möglich ist. Nicht die gesamte Oberfläche des festen Trägers führt zu einer Bildung von Polynukleotidsätzen, da einige Stellen der Oberfläche des festen Trägers nur von Nukleotidlinien bedeckt bleiben.
Eventuell sind die Linien-Nukleotidsequenzen an der Oberfläche des festen Trägers durch ein Adaptermolekül fixiert, das zum Beispiel Streptavidin, Antigen oder Antiköper ist (die sich mit einem komplementären Molekül (Biotin, Antikörper, Antigen), das bereits auf der Oberfläche des festen Trägers fixiert ist, vereinen). Als solches ist es auch möglich, durch die Methode gemäß der Erfindung nur spezifische Stellen auf der Oberfläche des festen Trägers zu wählen, die ähnliche oder unterschiedliche (an die Linien) gebundene Nukleotidhaken umfassen, die an dieselben oder unterschiedliche zu detektierende, identifizierende und/oder quantifizierende Ziel-Polynukleotide oder -Nukleotidsequenzen binden.
Die Oberfläche des festen Trägers der Erfindung umfasst vorzugsweise einen Mikro-Array von mindestens vier Spots von Polynukleotidsätzen pro cm².
Die Nukleotidliniensequenzen eines solchen Arrays können eine zufällige (dieselbe zufällige) Sequenz sein oder können mehrere zufällige (verschiedene zufällige) Sequenzen sein. Vorzugsweise umfassen die Nukleotidlinien keine Sequenzen, oder sind nicht aus solchen hergestellt, die unter den verwendeten Bedingungen mit einem der zu detektierenden, identifizierenden und/oder quantifizierenden Ziel-Polynukleotide oder -Nukleotidsequenzen, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind, hybridisieren können.
Die Hybridisierung von zwei Nukleotidsträngen, wie dem Fachmann bekannt, ist durch den Prozentsatz an Identität oder Ähnlichkeit von zwei Sequenzen definiert und ist durch die verwendeten Hybridisierungsbedingungen definiert (z.B. stringente, weniger stringente oder nicht stringente Bedingungen).
Im vorliegenden Fall legt die Bedeutung des Begriffs "nicht hybridisieren" nahe, dass weniger als 1% des Ziels an den Fänger-Polynukleotiden hybridisiert sind, und vorzugsweise weniger als 0,1% und insbesondere weniger als 0,01. Zur Vermeidung einer Hybridisierung sind nicht mehr als etwa 15 konsekutive komplementäre Basenpaarbindungen zwischen einer Ziel-Polynukleotid- (oder Nukleotid-) Sequenz und ihrer spezifischen oder entsprechenden Nukleotidliniensequenz vorhanden, und vorzugsweise sind weniger als zehn solche Paarungen möglich, insbesondere weniger als fünf. Als solches enthalten die Sequenzen der Nukleotidlinien vorzugsweise weniger als fünfzehn Basen und insbesondere weniger als zehn und ganz besonders weniger als fünf angrenzende Basen, die zu den zu detektierenden Zielsequenzen komplementär sind. Die Bestimmung möglicher konsekutiver Sequenzen erfolgt einfach durch einen Vergleich der Sequenzen mit einer molekularen Datenbank, wie sie durch Genbank bereitgestellt wird, und unter Verwendung einer Software, wie Nucleotide-Nucleotide BLAST (blastn) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Nukleotidlinien durch eine in situ Synthese von Nukleotidsequenzen auf dem Träger erhalten.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die Nukleotidlinien eine Sequenz, die etwa 20 bis etwa 1000 Nukleotide umfasst, bevorzugter etwa 50 bis etwa 200 Nukleotide, und ganz besonders etwa 60 bis etwa 100 Nukleotide.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Nukleotidlinien, die an die Nukleotidhaken gekoppelt sind, Sequenzen mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten und an verschiedenen festen Trägern angeheftet, wobei jeder dieser festen Träger durch einen bestimmten chemischen oder physikalischen Zustand oder ein solches Merkmal gekennzeichnet ist, wie eine spezifische chemische oder physikalische Bindungsaffinität (d.h., verschiedene Kügelchen unterschiedlicher chemischer oder physikalischer Eigenschaft, einschließlich (ohne aber darauf beschränkt zu sein) unterschiedlicher Größe, Fluoreszenz, Farbe, Magnetismus, usw.). Dieses technische Merkmal ermöglicht eine Unterscheidung der Sequenzen durch eine Analyse der chemischen oder physikalischen Eigenschaft des festen Trägers, an den sie gebunden sind.
Gemäß der Erfindung sind die zu detektierenden, identifizierenden und/oder quantifizierenden Ziel-Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen DNA- oder RNA- Sequenzen, wie genomische DNA oder Amplikone, die eventuell vor ihrer Bindung an die Nukleotidhaken amplifiziert oder kopiert wurden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Mikro-Arrays, die durch das Verfahren gemäß der Erfindung für die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung von mindestens 2, mindestens 4, vorzugsweise mindestens 10, insbesondere mindestens 30 verschiedener Ziel-Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen erhältlich sind, die eventuell gleichzeitig in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen festen Träger, der Nukleotidlinien mit einer zufälligen Sequenz einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden aufweist, die gleichförmig kovalent durch ein erstes Ende ihrer Sequenzen an der Oberfläche des festen Trägers fixiert sind, wobei die Oberfläche für die Herstellung eines Mikro-Arrays gemäß der Erfindung verwendet wird. Dieser "behandelte" feste Träger kann direkt von Kunden als Zwischenprodukt verwendet werden, das für die Herstellung von festen Trägern für Detektions-Mikro-Arrays geeignet ist; der Kunde kann Polynukleotidsätze nach dem Hinzufügen von Nukleotidhaken (die an die Nukleotidlinien gebunden werden) an spezifischen Stellen der "behandelten" Oberfläche des festen Trägers bilden.
Dieser feste Träger ist hier in der Folge als "Mikro-Array nach Kundenwunsch" definiert.
Vorzugsweise umfasst das andere (freie) Ende (das nicht an die Oberfläche fixiert ist) der Nukleotidliniensequenzen eine reaktive Gruppe oder Funktion, die danach kovalent (zur Bildung einer Bindung) mit (eventuell funktionalisierten) Nukleotidhakensequenzen reagieren kann.
Vorzugsweise sind die Nukleotidhaken auch Sequenzen, die in einer oder mehreren reaktiven chemischen Gruppen oder Funktionen enden, die mit den (funktionalisierten oder nicht funktionalisierten) Nukleotidlinien (zur Bildung einer Bindung) reagieren können. Vorzugsweise bestehen diese reaktiven chemischen Funktionen oder Gruppen des Nukleotidlinienendes aus Aldehyd-, Epoxid- oder Acrylatfunktionen, die direkt mit der NH₂-Funktion eines Nukleotidhakenendes reagieren können. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Nukleotidlinien, die an dem Träger fixiert sind, an (oder nahe an (was einen Abstand bedeutet, der eine Bindung mit dem Ende eines anderen Nukleotidsequenz (Hakensequenz) ermöglicht)) ihrem freien Ende eine Nukleotidribose. Die Ribose wird für die anschließende Fixierung einer NH₂-Funktion eines Nukleotidhakenendes weiter zu Aldehyden oxidiert.
Vorzugsweise ist die Dichte der Polynukleotidlinien und/oder der Polynukleotidsätze auf der Oberfläche des festen Trägers höher als 10 fmol, vorzugsweise 100 fmol/cm² der Oberfläche des festen Trägers.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die kovalente Bindung zwischen den Liniensequenzen und den Hakensequenzen keine Phosphodiesterbindung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den festen Träger, wobei die fixierten Nukleotidlinien mit einem funktionalisierten Sequenzende, das durch eine kovalente Bindung an Nukleotidhaken gebunden ist, Polynukleotidsätze bilden, wobei die Oberfläche des festen Trägers nur an spezifischen Stellen dieser Oberfläche des festen Trägers an Nukleotidlinien gebundene Nukleotidhaken umfasst, und wobei andere Stellen weiterhin nur von den Nukleotidlinien bedeckt sind.
Dies bedeutet, dass die Oberfläche des festen Trägers zwei Arten fixierter Nukleotidsequenzen umfasst; Polynukleotidsätze an spezifischen Stellen des festen Trägers und Nukleotidlinien, die vorzugsweise mit reaktivierten chemischen Gruppen oder Funktionen an anderen Stellen der Oberfläche des festen Trägers funktionalisiert sind. Andere Stellen sind jene, die für eine weitere Fixierung von Haken verfügbar sind. Diese Art von festem Träger ist hierin als "Mikro-Array nach Kundenwunsch" oder "Mikro-Array teilweise nach Kundenwunsch" definiert.
Dies bedeutet, dass diese Art von "Mikro-Array nach Kundenwunsch" spezifische Stellen an der Oberfläche des festen Trägers umfasst, die vom Kunden modifiziert werden können, um nach dem Hinzufügen spezifischer Nukleotidhaken (die vom Kunden gewählt werden) andere Polynukleotidsätze auf den Nukleotidlinien an spezifischen Stellen der Oberfläche des festen Trägers zu bilden, wobei die Nukleotidhaken imstande sind, kovalent mit dem funktionalisierten Ende der Nukleotidlinien zu reagieren.
In einem anderen Aspekt enthält der "Mikro-Array teilweise nach Kundenwunsch" auch eine Oberfläche des festen Trägers, die zwei Arten fixierter Nukleotidsequenzen umfasst; Standard-Polynukleotide an spezifische Stellen des festen Trägers, die nicht von Nukleotidlinien (gemäß einem Array nach dem Stand der Technik) bedeckt sind, und Nukleotidlinien an anderen Stellen des festen Trägers. Dies bedeutet, dass diese Art von Mikro-Array nach Kundenwunsch herkömmliche Polynukleotide umfasst, die an spezifischen Stellen des festen Trägers im Voraus als Spots angebracht werden, und Nukleotidlinien an anderen Stellen des festen Trägers, die vom Kunden derart modifiziert werden können, dass nach dem Hinzufügen spezifischer Nukleotidhaken an spezifischen Stellen der Oberfläche des festen Träger, die von Nukleotidlinien bedeckt sind, Polynukleotidsätze gebildet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit von Komponenten, die den festen Träger gemäß der Erfindung (Mikro-Array nach Kundenwunsch oder Mikro-Array teilweise nach Kundenwunsch), sowie Mittel und Medien umfassen, die gewählt werden, um einen für den Kunden angepassten Mikro-Array zu erhalten. Solche Mittel und Medien sind vorzugsweise chemische Gruppen oder Funktionen, die mit dem Ende von Nukleotidlinien oder Nukleotidhaken reagieren können, Nukleotidhaken (vorzugsweise funktionalisiert), die mit funktionalisierten Nukleotidlinien reagieren können, wie auch Medien (Puffer), die zum Waschen der Oberfläche des festen Trägers verwendet werden können, um ungebundene Nukleotidhakensequenzen zu entfernen.
Die Nukleotidhaken (vorzugsweise funktionalisierten Nukleotidhaken), die in dem Kit von Komponenten gemäß der Erfindung vorhanden sind, werden nach dem Anwendungsbedarf des Kunden gewählt. Daher ist dieser Kit von Komponenten flexibel und auf eine erforderliche Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung mehrfacher Zielmoleküle in einer Probe einstellbar. Dies bedeutet, dass der "Mikro-Array nach Kundenwunsch" gemäß der Erfindung bereits Polynukleotidsätze mit spezifischen Nukleotidhaken an spezifischen Stellen der Oberfläche des festen Trägers umfassen kann, wobei die Polynukleotidsätze an den spezifischen Stellen gemäß einem Array vorhanden sind, und ihre Stelleninformationen dem Kunden bereitgestellt werden, so dass er die Herstellung des "Mikro-Arrays nach Kundenwunsch" mit zusätzlichen Sequenzen an anderen spezifischen Stellen zur Verbesserung der erforderlichen Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung mehrfacher Zielmoleküle vervollständigen kann.
Die Mittel und Medien, die in dem Kit von Komponenten vorhanden sind, werden auch zur Ausführung eines oder mehrerer genetischer Amplifizierungs- oder Kopierschritte und zum Erhalten einer spezifischen Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung mehrfacher Nukleotidsequenzen von Interesse gewählt. Solche Mittel und Medien, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, enthalten Primer, Cycler, Polymerase oder andere Medien, wie Fluoreszenz-, kolorimetrische und/oder radioaktive Marker, die zum Erhalten eines Signals verwendet werden, das aus der Bindung von Ziel-Nukleotidsequenzen an ihre entsprechenden Nukleotidsätze resultiert.
Die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung mehrfacher Zielmoleküle kann mit dem unbewaffneten Auge erfolgen, wird aber vorzugsweise in speziellen Apparaten, wie automatischen Lesergeräten, ausgeführt, die vorzugsweise mit der notwendigen Software für die Detektion und/oder Interpretation von Signalen ausgestattet sind, die aus der Bindung von Zielmolekülen an ihre entsprechenden Fängermoleküle (Hakenende von Polynukleotidsätzen) resultieren. Solche Apparate können voll automatisiert sein.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen der Begriffe "Nukleinsäure", "Oligo nukleotid", "Ziel- oder Nukleotidsequenzen", "Array", "Nukleotidsequenz", "Zielnukleinsäure", "im Wesentlichen binden", "hybridisieren spezifisch an", "Hintergrund", "Quantifizieren" und dergleichen, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO97/27317 beschrieben. Der Begriff "Polynukleotid" im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich auf Nukleotidsequenzen oder Nukleotid-artige Sequenzen von mindestens 2 Nukleotiden oder Nukleotidanalogen. Der Begriff "Oligonukleotid" oder "kurzes Polynukleotid" bezieht sich insbesondere auf Nukleotid- oder Nukleotid-artige Sequenzen von weniger als 100 und vorzugsweise weniger als 50 Nukleotiden oder Nukleotidanalogen. Der Begriff "langes Polynukleotid" bezieht sich auf Nukleotid- oder Nukleotid-artige Sequenzen von mehr als 100 Nukleotiden. Verweise auf Nukleotid(e), Oligonukleotid(e) und dergleichen beinhalten analoge Spezies, wobei die Zuckerphosphat-Hauptkette modifiziert und/oder ersetzt ist, vorausgesetzt, ihre Hybridisierungseigenschaften sind nicht beeinträchtigt. Als Beispiel kann die Hauptkette durch ein äquivalentes synthetisches Peptid, das als Peptide Nucleic Acid (PNA) bezeichnet wird, oder durch Intercalating Nucleic Acid (INA) ersetzt sein.
Die Bedeutung der Begriffe "homologe Sequenz(en)" und "homolog" ist wie in dem Europäischen Patent EP 1266034 beschrieben.
Der Begriff "fester Träger" zum Bilden von Mikro-Arrays bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, dass jede Art von festem Material enthalten ist, das physisch gehandhabt werden kann, um die notwendigen Reaktionen, wie Inkubation einer Testlösung oder Probe, die eventuell Ziel-Nukleotidsequenzen oder Kopien einer Ziel-Nukleotidsequenz enthält, auszuführen. Dieser feste Träger kann nur aus einer Art bestehen oder eine Zusammensetzung aus mehreren Materialien sein, von welchen eines ein Substrat ist, auf dem Sequenzen fixiert sind, um einen Mikro-Array zu erhalten. Typische Beispiele von Substraten, die in dem Gebiet verwendet werden, sind Polymere, die funktionalisiert sein können, um die Fängermoleküle besser zu fixieren. Diese Substrate und Träger, auf welchen die Nukleotidlinien fixiert sind, können ein poröser oder nicht poröser Träger sein, können glatt oder rau sein und können auf die Oberseite eines anderen festen Trägers aufgebracht oder gelegt werden, der zum Beispiel aus Glas oder Kunststoff besteht.
Die Begriffe "Probe", "biologische Probe" oder "Testlösung" sollen jede Probe oder Lösung umfassen, die vermutlich eine Ziel-Nukleotidsequenz enthält. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden insbesondere Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen, die für einen (Mikro-) Organismus oder eine Komponente desselben spezifisch sind, detektiert. Eine Testlösung kann eine Lösung sein, die amplifizierte Produkte, ein Amplikon eines (Mikro-) Organismus oder eine Komponente davon enthält.
Der Begriff "gleichförmig" soll eine homogene Schicht von Nukleotidlinien bedeuten, die auf der Oberfläche des festen Trägers fixiert sind. In diesem Zusammenhang ist die Dichte von Nukleotidlinien pro cm² der Oberfläche gleichförmig und unterscheidet sich um weniger als 30% und vorzugsweise weniger als 10% in verschiedenen Teilen der Oberfläche des festen Trägers. Die Fixierung der Nukleotidhaken hat quantitativ und an den verschiedenen Spots des Arrays ähnlich zu sein, da Nukleotidhaken die Fängermoleküle für die mehrfachen Ziel-Nukleotide sind, die in der Probe vorhanden sind und für die die Menge quantifiziert und untereinander verglichen werden soll.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen und spezifischen Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen ausführlicher beschrieben. Die Beispiele, Ausführungsformen und Zeichnungen, wie auch die verwendeten Bezugszeichen, sollen in keiner weise den Umfang der beanspruchten Erfindung einschränken.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt einen Array gemäß der Erfindung mit Nukleotidlinien (1), Nukleotidhaken (2) und Polynukleotidsätzen (3) für die spezifische Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung mehrfacher Ziel-Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen (4) in einer Probe an spezifischen Stellen (6) auf einer Oberfläche (5) eines festen Trägers, die mit Nukleotidlinien (1) bedeckt ist.
2 zeigt die Oberfläche eines Arrays (5) gemäß der Erfindung, die mit Linien (1) oder (Linie-Haken) Polynukleotid-spezifischen Sätze (3) bedeckt ist, die an spezifischen Stellen (6) vorhanden sind. Die Oberfläche des festen Trägers, der für die Konstruktion des (Mikro-) Arrays verwendet wird, ist gleichförmig mit Nukleotidlinien (1) bedeckt.
3 zeigt die Oberfläche eines "Arrays teilweise nach Kundenwunsch" gemäß der Erfindung, die auf einem Teil (7) mit Polynukleotidsätzen bedeckt ist, die für gewisse Zielsequenzen spezifisch sind, die an spezifischen Stellen des Trägers (6) vorhanden sind, und auf einem anderen Teil (8) der Oberfläche (5) mit Nukleotidlinien (1) für eine weitere Nukleotidhaken- (2) Bindung bedeckt ist, um spezifische Polynukleotidsätze (3) für eine weitere Ziel-Detektion bereitzustellen.
4 zeigt die Oberfläche eines "Arrays teilweise nach Kundenwunsch" gemäß der Erfindung, die auf einem Teil (7) mit Polynukleotiden bedeckt ist, die für gewisse Zielsequenzen spezifisch sind, die an spezifischen Stellen des Trägers (9) vorhanden sind, die nicht von Nukleotidlinien (1) bedeckt sind, und auf einem anderen Teil (8) der Ober fläche (5) mit Nukleotidlinien (1) für eine weitere Nukleotidhaken- (2) Bindung bedeckt ist, um spezifische Polynukleotidsätze (3) für eine weitere Ziel-Detektion bereitzustellen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Konstruktionsverfahren, das neuartige (Mikro-) Arrays ergibt, die besonders für die Detektion mehrfacher Ziel-Nukleotidsequenzen geeignet sind, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind, insbesondere cDNA-Sequenzen oder lange doppelsträngige DNA-Sequenzen. In einer Ausführungsform gemäß der Erfindung ist mindestens ein Teil der Oberfläche (5) des festen Trägers des erhaltenen Arrays als solches, eventuell zufällig, mit Nukleotidsequenzen bedeckt, die als Nukleotidlinien (1) dienen, an welchen dann an spezifischen Stellen (6) spezifische Nukleotidhaken (3) abgeschieden werden, um Polynukleotidsätze (3) zu erhalten, die eine spezifische Bindung entsprechender Ziel-Nukleotidsequenzen ermöglichen. Die endgültige gebundene Sequenz (auch als Polynukleotidsatz (3) bezeichnet), ist eine lange Nukleotidsequenz oder ein Polynukleotid mit einerseits einer nicht spezifischen Sequenz, die an den Träger gebunden ist, und andererseits einer Sequenz, die spezifisch die zu detektierende Zielsequenz (4) erkennt oder bindet (siehe 1 und 2). Die Polynukleotidsätze (3) werden auch als Fängersequenzen, spezifische Fängersequenzen oder entsprechende Fängersequenzen bezeichnet, was bedeutet, dass sie eine Ziel-Nukleotidsequenz mit einem Teil ihrer Sequenz erkennen, das zu der Ziel-Nukleotidsequenz komplementär ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nukleotidlinien (1) auf der gesamten Oberfläche (5) des Substrats oder Mikro-Array-Trägers vorhanden, die mit der Probe in Kontakt steht. Diese Ober fläche wird dann teilweise oder vollständig mit spezifischen Nukleotidhaken (2) bedeckt.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können alle Nukleotidlinien (1) aus derselben zufälligen Sequenz bestehen, die nicht zu dem Zielorganismusgenom bei mehr als 10 konsekutiven Basen komplementär ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Linien-Nukleotidsequenzen (1) nicht identisch, d.h., die Nukleotidlinien haben alle nicht dieselbe Sequenz, sondern umspannen eine Mehrzahl verschiedener Sequenzen. Die Sequenzen der Nukleotidlinien können bekannt oder unbekannt sein.
In einer besondern Ausführungsform sind die Sequenzen der Nukleotidlinien (1) zufällige Sequenzen, zum Beispiel zufällige Sequenzen, die durch in situ Synthese unter Verwendung einer Mischung der 4 Nukleotidvorläufer erhalten werden. Wie dem Fachmann bekannt ist, hängt die Reaktion einer bestimmten Sequenz von der Stringenz der Reaktion ab. Die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzreaktion hängt vorwiegend von der Sequenzhomologie oder -identität ab. Die Wahrscheinlichkeit, eine Sequenz aus 25 identischen Nukleotiden in einer zufälligen Synthese zu erhalten ist 1/4²⁵ oder 1/1 × 10¹⁵. Angesichts dieser sehr geringen Frequenz einer identischen Sequenz ist eine zufällige Synthese von Linien (1) für den Zweck der Erfindung durchführbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleotidhaken (2) oder Haken der Erfindung vor dem Abscheiden auf dem Array und somit vor der Fixierung an den Linien (1) chemisch synthetisiert. Es ist auch eine enzymatische Synthese möglich.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Nukleotidhaken (2) Oligonukleotide oder kurze Polynukleotide mit einer Sequenz, die aus etwa 10 bis etwa 120 Nukleotiden, insbesondere etwa 15 bis etwa 60 Nukleotiden, insbesondere etwa 20 bis etwa 50 Nukleotiden, insbesondere etwa 20 bis etwa 40 Nukleotiden besteht. "Etwa" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass es möglich ist, 1, 2, 3 bis zu 5 Nukleotide mehr oder weniger als angegeben zu haben.
In einer besonderen Anwendung tragen die (Mikro-) Arrays Nukleotidhaken (2) mit einer Sequenz von weniger als 100 Nukleotiden oder Basen, ergeben aber dieselbe Bindungseffizienz wie lange Polynukleotidsequenzen mit mehr als etwa 150 Nukleotiden oder Basen. Insbesondere ergeben sie dieselbe Bindungseffizienz wie lange Polynukleotidsequenzen mit mehr als etwa 250 Nukleotide oder Basen. Dies ist durch Bindung, Kopplung oder kovalente Bindung der Nukleotidhaken (2) an Nukleotidlinien (1) mit mindestens etwa 20, etwa 40 Basen oder Nukleotiden möglich.
In einer besonderen Ausführungsform bestehen die (Mikro-) Arrays aus mindestens 4, 10, 20, 50, 100, 1000, 10000 Stellen mit sowohl Nukleotidlinien als auch spezifischen Nukleotidhaken für mindestens 4, 10, 20, 50 verschiedene Ziel-Nukleotidsequenzen, die zu detektieren und/oder quantifizieren sind. Solche Arrrays haben mindestens 4, 10, 20, 50, 100, 1000 oder 10000 Spots/cm².
In einer besonderen Ausführungsform sind die Linien- und Hakensequenzen für verschiedene Ziel-Nukleotidmoleküle, die zu detektieren sind, auf mindestens 4, 10, 20, 50, 100, 500 oder 1000 physikalisch verschiedenen Trägern (die vorzugsweise Kügelchen sind) vorhanden, wobei jeder Träger durch vorzugsweise unterschiedliche chemische oder physikalische Merkmale (Größe, Magnetismus,...) identifiziert wird.
In einer besonderen Ausführungsform sind die Nukleotidlinien (1) und/oder die Nukleotidhaken (2) DNA- oder RNA-Sequenzen, PNA (siehe z.B. die Internationale Patentanmeldung WO0075372) oder INA.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die zu detektierenden Zielsequenzen (d.h., Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen (4)) vor dem Fangen auf dem Array mittels bekannter genetischer Amplifizierungsverfahren, wie zum Beispiel einer PCR-Methode, vervielfacht, amplifiziert oder kopiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Ende (5' oder 3') der Nukleotidlinien (1) an dem festen Träger oder Substrat mit Hilfe einer chemischen Reaktion fixiert.
Vorzugsweise werden die Nukleotidlinien (1) selektiv funktionalisiert, so dass sie eine spezifische reaktive chemische Funktion oder Gruppe enthalten oder tragen, die mit dem eventuell funktionalisierten Träger oder Substrat reagiert, was zu einer kovalenten Bindung führt. Die chemische Funktion oder Gruppe kann ein Aldehyd, Amin, Epoxid, Acrylat, Thiocyanat, N-Hydroxysuccinimid, ... sein, wobei die vorangehende Liste nicht vollständig ist.
Eine bevorzugte Bindung wird zwischen einem 5'-aminierten Ende der Nukleotidsequenz und der mit Aldehyd bedeckten Oberfläche erhalten, was zu einer Iminbindung führt, die dann in Gegenwart von NaBH₄ reduziert wird.
Vorzugsweise ist die chemische Funktion oder Gruppe entweder an dem 5' oder 3' terminalen Ende angeordnet. Die Nukleotidlinie wird kovalent an dem Träger fixiert; das zweite Ende der Nukleotidlinien wird in einem zweiten Schritt durch geeignete chemische oder physikalische Mittel aktiviert, so dass chemisch reaktive Funktionen für die Fixierung der Nukleotidhaken erhalten werden. Die Nukleotidhaken enthalten eine geeignete Gruppe oder Funktion, die kovalent an Nukleotidlinien gekoppelt wird. Die reaktive Gruppe oder Funktion kann wieder, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Aldehyd, Amin, Epoxid, Acrylat, Thiocyanat, N-Hydroxysuccinimid, ... sein. Terminales Ende bedeutet, dass es sich an dem Ende der Nukleotidsequenz (letzte Base) oder nahe dem Ende, weniger als 50 Basen und vorzugsweise weniger als 10 Basen von der terminalen Base, befindet.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die Nukleotidlinien (1) an dem Array-Träger durch Bindung an einen Adapter fixiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Streptavidin an dem Träger fixiert und biotinylierte Nukleotidlinien werden mit dem beschichteten Träger inkubiert, so dass die Bindung der Linien durch Erkennen zwischen Biotin und Streptavidin eintritt. Eine andere Möglichkeit enthält die Verwendung eines geeigneten Antikörper-Antigen- oder Rezeptor-Liganden-Paares, um eine effiziente Bindung der Nukleotidlinien an dem Träger zu erhalten. Verschiedene Alternativen stehen dem Fachmann zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten Nukleotidlinien (1) eine terminale Ribose, die dann durch Periodat-Behandlung oxidiert wird, was zu der Bildung von Aldehydgruppen führt. Diese Aldehydgruppen sind für die Bindung aminierter Nukleotidhaken (2) zugänglich, wobei eine Kopplung der beiden zu einer Iminbindung führt. Dieses Imin wird dann reduziert, wodurch eine kovalente, Aminstabile Bindung erhalten wird. Terminale Ribose bezeichnet auch eine Ribose, die nahe dem nicht gebundenen Ende der Linien liegt, was weniger als 50 Basen und vorzugsweise weniger als 10 Basen von der terminalen Base bedeutet.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Festphasensynthese durch eine Phosphoramidit-Methodologie zur kovalenten Bindung der Nukleotidhaken (2) an den Nukleotidlinien (1) verwendet werden. In einem Beispiel werden die Nukleotidlinien in situ auf der Oberfläche des festen Trägers synthetisiert. Das letzte Nukleotid der Nukleotidlinie trägt ein freies 5'-OH auf der Ribose, das kovalent mit einer Phosphoramidit-Gruppe reagieren kann, die in Position 3' des letzten Nukleotids des Nukleotidhakens vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nukleotidhaken (2) in einer Dichte von mehr als 10 fmol und vorzugsweise 100 fmol pro cm² Oberfläche des festen Trägers vorhanden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist jede der spezifischen Stellen, die für die Detektion auf dem Mikro-Array verwendet wird, von einer bestimmten Nukleotidhaken-Spezies bedeckt. Eine Hakenspezies besteht vorzugsweise aus nur einem Molekül. In der Praxis ist die Synthese von Polynukleotiden jedoch ein konsekutiver Prozess, der Nukleotid für Nukleotid ausgeführt wird. Da jede anschließende Reaktion keine 100% Ausbeute liefert, kommt es zu einer Ansammlung sekundärer Produkte, die in einer heterogenen Mischung resultiert. Das Vorhandensein solcher sekundärer Produkte in dem Endprodukt ist für die Anwendungen der vorliegenden Erfindung nicht schädlich, solange der Kontaminationswert durch sekundäre Produkte nicht so hoch ist, dass er die spezifische Bindung und Erkennung oder Identifizierung der entsprechenden Zielsequenz oder des Zielmoleküls nicht stört.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft einen festen (unlöslichen) Träger, der an bestimmten Stellen (6) der festen Oberfläche (5) (an dem Ende von Nukleotidlinien) fixierte Nukleotidhaken (2) enthält, die für bestimmte Ziel-Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen (4) spezifisch sind, wobei die Nukleotidhaken (2) nach ihrer kovalenten Bindung an Polynukleotidlinien (1) mit einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden fixiert werden, wodurch zielspezifische Polynukleotidsätze (3) gebildet werden, und der Array die spezifische Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung von mehrfachen, vorzugsweise mindestens 4 verschiedenen Ziel-Polynukleotiden oder Nukleotidsequenzen (4) ermöglicht, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen festen (unlöslichen) Träger, der an (einem begrenzten Teil) seiner Oberfläche (5) von Nukleotidlinien (1) mit einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden bedeckt ist, und an bestimmten Stellen (6) dieser Oberfläche (5) mit Nukleotidhaken (2), die für bestimmte, zu detektierende Ziel-Polynukleotide oder Nukleotidsequenzen spezifisch sind, wobei die Nukleotidhaken (2) kovalent an die Nukleotidlinien (1) gebunden sind, um dadurch zielspezifische Polynukleotidsätze (3) zu bilden, wobei der Array die spezifische Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung von mehrfachen, vorzugsweise mindestens 4 verschiedenen Ziel-Polynukleotiden oder Nukleotidsequenzen (4) ermöglicht, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind.
Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen festen Träger, der auf einem ersten Teil (7) seiner Oberfläche (5) eine erste Gruppe von mindestens 3 fixierten Polynukleotidsätzen (6) umfasst, die räumlich getrennt sind, für die Detektion einer ersten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4), und auf einem zweiten Teil (8) der Oberfläche (5) des festen Trägers Nukleotidlinien (1) umfasst, die nicht an die Zielmoleküle der ersten Gruppe binden können, aber an räumlich getrennten Stellen zielspezifische Nukleotidhaken (2) fixieren, binden oder fangen können, für die Detektion einer zweiten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) (siehe 3). Vorzugsweise umfasst die zweite Gruppe mindestens 2 verschiedene Fängermoleküle, vorzugsweise mindestens 4 verschiedene Fängermoleküle.
Eine andere besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen festen Träger, der auf einem ersten Teil (7) seiner Oberfläche eine erste Gruppe von mindestens 3 fixierten Standard-Polynukleotidsequenzen umfasst, die an spezifischen Oberflächenstellen (9) fixiert sind, die nicht mit Nukleotidlinien (1) bedeckt sind und räumlich getrennt sind, für die Detektion einer ersten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4), und auf einem zweiten Teil (8) der Oberfläche des festen Trägers Nukleotidlinien (1) umfasst, die nicht an die Ziel-Polynukleotidsequenz der ersten Gruppe binden können, aber eine kovalente Bindung mit zielspezifischen Nukleotidhaken bilden können, die für die Detektion einer zweiten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) spezifisch sind (siehe 4).
Beide Gruppen von Zielmolekülen können in der Probe oder Testlösung vorhanden sein. Vorzugsweise werden beide Gruppen mit derselben Effizienz gebunden, gefangen und/oder detektiert. Nach Bedarf wird die Effizienz der Detektion der ersten und zweiten Gruppe korrigiert, damit die Zielmoleküle, die in der Probe oder Testlösung vorhanden sind, angemessen quantifiziert werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die erste Gruppe von Polynukleotidsätzen zuerst unabhängig von der Herstellung und Fixierung der zweiten Gruppe hergestellt. In einer besonderen Ausführungsform ist die erste Gruppe nur auf dem Array-Träger an Stellen vorhanden, die keine Linien oder aktivierten Linien (1) enthalten. Die zweite Gruppe von Polynukleotidsätzen wird durch die Fixierung zielspezifischer Haken (2) an den aktivierten Nukleotidlinien (1) erhalten.
Insbesondere führen die Reagenzien, die zur Befestigung von Polynukleotidsätzen der zweiten Gruppe an dem Träger verwendet werden, nicht zu der vollständigen Ablösung und/oder Inaktivierung der Polynukleotidsätze der ersten Gruppe. Vorzugsweise werden diese Ablösung und/oder Inaktivierung so gering wie möglich gehalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht die erste Gruppe von Sätzen aus langen Polynukleotiden und die zweite Gruppe von Sätzen besteht aus Linien (1) und Haken (2) gemäß der Erfindung, wobei die Haken (2) vorzugsweise kleine oder kurze zielspezifische Polynukleotide oder Oligonukleotide sind. Vorzugsweise sind die Polynukleotidsätze (3) kovalent an den Träger oder den Array über reaktive chemische Gruppen oder Funktionen gebunden, die auf dem zweiten Teil der Oberfläche des festen Trägers vorhanden sind, die vorzugsweise eine abgegrenzte Oberfläche des Trägers ist. Die chemischen Funktionen oder Gruppen können durch eine chemische Behandlung aktiviert werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Kit oder einen Kit von Komponenten für die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung eines (Mikro-) Organismus oder einer Komponente desselben, der/die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden ist, wobei der Kit einen Träger oder einen Mikro-Array wie zuvor beschrieben umfasst.
Der Kit kann des Weiteren die notwendigen Lösungen und Reagenzien für die Detektion von Zielmolekülen umfassen, wenn diese an dem Träger oder Mikro-Array gefangen sind.
Der Kit kann des Weiteren Mittel und Medien zur Durchführung der Methode der Erfindung umfassen, um einen Array der Erfindung zu erhalten, der zielspezifische Polynukleotidsätze trägt, die zielspezifische Nukleotidhaken umfassen, die an Nukleotidlinien gebunden sind, wobei die Fänger-Polynukleotidsätze vorzugsweise auf der Oberfläche des festen Trägers in Form eines Arrays angeordnet sind, mit einer Dichte von vorzugsweise mindestens 4 einzelsträngigen Fänger-Nukleotidsequenzen/cm² der Oberfläche des festen Trägers.
Die Arrays oder Träger der Erfindung sind besonders für die Detektion verschiedener Zielsequenzen geeignet, d.h., mindestens einer, vorzugsweise mindestens 4, Ziel-Nukleotidsequenzen, die eventuell in einer Testlösung oder Probe vorhanden sind. Zielsequenzen, die zu einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe gehören, können in derselben biologischen Probe vorhanden sein und gleichzeitig mit einem Array gemäß der Erfindung detektiert werden.
Die Erfindung umfasst auch den festen Träger, der auf mindestens einem Teil seiner Oberfläche Nukleotidlinien aufweist, die gleichförmig fixiert sind, mit einer Sequenz von mindestens 20 Nukleotiden, die durch ein erstes Ende an der Oberfläche der Trägers fixiert sind, und mit reaktiven chemischen Gruppen am anderen Ende, die mit Nukleotidhaken reagieren oder zur kovalenten Reaktion mit diesen aktiviert werden können. In einer besonderen Ausführungsform können die Arrays oder Träger der Erfindung für die Herstellung von Arrays teilweise nach Kundenwunsch verwendet werden. Arrays teilweise nach Kundenwunsch sind Arrays, die eine festgelegte Anzahl bestimmter Polynukleotidsätze gemäß der Erfindung oder Standard-Polynukleotidsequenz nach dem Stand der Technik tragen, die in einem anderen Teil des Trägers mit Sequenzen ergänzt werden können, die für andere Ziele der Wahl spezifisch sind. Mikro-Arrays mit Standard-Poly nukleotidsequenzen oder -sätzen auf dem ersten Teil des Arrays und mit Linien auf dem zweiten Teil, die zur Herstellung einer zweiten Gruppe von Polynukleotidsätzen der Wahl bereit sind, würden dann als Standardprodukt geliefert werden, auf dem zielspezifische Haken nach dem Bedarf der Anwendung in Spots aufgebracht werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft solche Arrays teilweise nach Kundenwunsch.
Das Verfahren der Erfindung ist besonders zur Standardproduktion von Mikro-Arrays geeignet, die an einem Teil des Trägers Standard-Polynukleotidsätze für eine bestimmte Anzahl spezifischer Zielsequenzen haben, und an der anderen Seite einen flexiblen Teil für die Detektion verschiedener Zielsequenzen, die nicht standardmäßig sind, abhängig von der Anwendung. Auf diese Weise kann ein Standard-Array zu einer unbegrenzten Zahl verschiedener Arrays entsprechend dem Bedarf des Benutzers verändert werden. Ein solcher Array ist besonders nützlich, wenn lange Polynukleotidsätze an der ersten Stelle des Arrays verwendet werden, und kleine Oligonukleotidsequenzen, die leicht synthetisiert werden, an der zweiten Stelle verwendet werden. Der Vergleich der Bindungseffizienz für die zwei Populationen von Polynukleotidsätzen ermöglicht einen Vergleich der anfänglichen Menge jedes der Zielmoleküle, die in der Testlösung oder Probe vorhanden sind. Vorzugsweise werden der Testlösung oder Probe geeignete Standards hinzugefügt, so dass ein Korrektur der Bindungseffizienz beider Gruppen von Polynukleotidsätzen möglich ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst den Array-Träger oder das Substrat, an dem an einem Teil oder an einem ersten Teil Fängermoleküle für die Detektion bestimmter Zielmoleküle gebunden sind, und an einem anderen Teil Linien, die eventuell für die Bindung von Haken aktiviert werden, die für die Detektion anderer Zielmoleküle anpassbar sind.
Die Arrays der Erfindung sind für die Detektion und/der Quantifizierung von Genen bestens geeignet, die durch Zellen exprimiert werden, eventuell nach dem Kopieren der Ziel-Gensequenzen zumindest teilweise in einen cDNA-Strang und Hybridisieren der cDNA auf spezifischen Fängermoleküle, die gemäß der Erfindung bereitgestellt sind. Das Verfahren der Erfindung ist besonders für die Detektion von cDNA-Sequenzen, die zueinander homolog sind, was ein sehr empfindliches Verfahren erfordert, geeignet. Die Unterscheidung zwischen homologen oder nahezu identischen Sequenzen ist mit Hilfe kleiner oder kurzer spezifischer Sequenzen möglich, die eine derartige Unterscheidung ermöglichen, während sie eine gute Bindungseffizienz haben. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht eine Unterscheidung zwischen Zielsequenzen, die sich nur in einem oder wenigen Nukleotiden unterscheiden und somit einen oder einige SNPs ("single nucleotide polymorphisms") enthalten.
Vorzugsweise können die Verfahren und Arrays der Erfindung für die Identifizierung und/oder Quantifizierung von DNA-Sequenzen, einzel- oder doppelsträngigen Sequenzen, verwendet werden, die entweder direkt von einem Organismus oder einem Teil davon erhalten werden – d.h. ohne vorangehenden Amplifizierungsschritt – oder als Alternative nach der Amplifizierung eines Teils ihrer genomischen DNA oder RNA. Die Amplifizierung von Zielsequenzen kann durch jedes in der Wissenschaft bekannte Verfahren erreicht werden, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, PCR, LCR, NASBA, Rollender Ring oder jedes andere Verfahren, das die Produktion einer ziemlich zuverlässigen Kopie der gegebenen Sequenz ermöglicht.
Die Detektion der Zielsequenzen, die auf dem Mikro-Array gefangen werden, kann durch jede physikalische oder chemische Detektionsmethode erfolgen, die in der Wissenschaft bekannt ist, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, der Verwendung von Fluoreszenz, Kolorimetrie, Biolumineszenz, Chemilumineszenz, elektrischer, Oberflächenplasmonresonanz-, elektromagnetischer Signale,...
Der feste Träger oder das Substrat für die Konstruktion des Mikro-Arrays der Erfindung wird vorzugsweise aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Glas, elektronischen Vorrichtungen, Silikonträgern, Silika, Metallen oder einer Mischung davon, die in einem Format hergestellt sind, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Objektträgern, Scheiben, Gelschichten und/oder Kügelchen. Kügelchen werden als Arrays in Betracht gezogen, solange sie Eigenschaften haben, die ihre Unterscheidung ermöglichen, so dass eine Identifizierung der Kügelchen mit der Identifizierung einer bestimmten Hakensequenz und somit der Zielsequenzen korreliert. Die obengenannten Beispiele sind nicht umfassend.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung gefangener Zielsequenzen durch die Verwendung einer Vorrichtung erleichtert, die zumindest eine Detektions- und/oder Quantifizierungsvorrichtung zum Detektieren und/oder Quantifizieren eines Signals umfasst, das an der Stelle erzeugt wird, wo eine Zielsequenz von einem (Mikro-) Organismus auf dem Array gefangen wird, eventuell eine Lesevorrichtung für Informationen, die auf einer Oberfläche des festen Trägers aufgezeichnet sind, ein Computer-Programm zum Erkennen der einzelnen Bereiche, die die gebundenen Zielsequenzen auf ihren entsprechenden Polynukleotidsätzen tragen, und deren Positionen, eventuell ein Quantifizierungsprogramm des Signals, das an den Stellen vorhanden ist, und ein Programm zum Korrelieren der Gegenwart des Signals an diesen Stellen mit der Diagnose und/oder Quantifizierung des (Mikro-) Organismus oder der Komponente. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf eine Vorrichtung, die für diese Zwecke ausgebildet ist, und imstande ist, den Mikro-Array der Erfindung zu lesen und dessen Ergebnisse zu interpretieren.
Beispiele
Beispiel 1: Nukleotidlinien-Fixierung auf einem Träger Funktionalisierung eines Glasträgers
Die Glasobjektträger werden für die Gegenwart von Aldehyden gemäß dem Verfahren funktionalisiert, das in der Europäischen Patentanmeldung EP1184349 beschrieben ist.
Fixierung von Nukleotidlinien auf dem Träger
Die Fixierung aminierter Linien auf dem Aldehydträger wird wie folgt ausgeführt. DNA-Nukleotidlinien, die eine Aminogruppe am 5'-Ende und ein Ribonukleotid am 3'-Ende aufweisen, werden durch chemische Synthese (Eurogentec, Liege, Belgien) synthetisiert. Sie werden auf 1 mg/l in milliQ reinem Wasser verdünnt. Jeder Biochip wird bei Raumtemperatur 60 min unter Rühren (± 200 U/min) in einem silbergrünen Röhrchen, das die DNA-Lösung enthält, inkubiert. Die Objektträger werden bei Raumtemperatur wie folgt gewaschen: dreimal 2 min mit einer 0,2% SDS-Lösung in Wasser, zweimal 2 min mit reinem Wasser, einmal 5 min mit Natriumborhydridlösung (2,5 mg/ml NaBH₄ in PBS/Absolutethanol, Verhältnis 75/25) und einmal 2 min mit reinem Wasser. Die Objektträger werden dann 3 min mit reinem Wasser bei 95°C gewaschen. Die Objektträger werden bei Raumtemperatur getrocknet und dann bei 4°C gelagert.
Beispiel 2: Nukleotidhaken-Fixierung an spezifischen Stellen des Trägers
Aktivierung funktionalisierter Linien auf dem Träger
Das Ribonukleotid, das auf den DNA-Nukleotidlinien vorhanden ist, wird wie folgt zu einer Aldehydgruppe oxidiert. Die Objektträger werden mit einer frisch zubereiteten Lösung inkubiert, die 0,1M, pH 5,2, Natriumacetatlösung (CH₃COONa.3H₂O, Merck, Ref. 1.06267) und 25 μl einer 0,45M Natriumperiodatlösung (NaIO₄, Sigma, Ref. S1878) enthält. Die Lösung wird auf dem Träger bei Raumtemperatur 2 h im Dunklen inkubiert. Die Objektträger werden mit 1 ml Acetatpufferlösung gewaschen und dann bis zur Verwendung bei 4°C in der oxidierten Form gehalten.
Hakenimmobilisierung
Nukleotidhaken, die am 5'-Ende aminiert sind, werden chemisch von Eurogentec (Liege, Belgien) synthetisiert. Sie werden in einer Spotting-Lösung (EAT, Namur, Belgien) verdünnt. Die DNA-Lösungen werden mit einem Arrayer, der einfache Stifte auf dem Träger verwendet, in Spots aufgetragen. Die Objektträger werden 1 h bei Raumtemperatur getrocknet. Die Objektträger werden zweimal 2 min mit Waschpuffer und dreimal mit Wasser gewaschen. Die Objektträger werden bis zur Verwendung bei 4°C in einem immergrünen Röhrchen aufbewahrt.
Die aminierten Nukleotide sind so konstruiert, dass sie für 3 Ratten-Gene spezifisch sind und die folgenden Sequenzen haben:

SEQ ID Nr. 1 (Haken 1): Ratten Fas-Antigen-Ligand (Zugriffsnummer: U3470) 5'-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcagaggcaaagagaaggaact-3'
SEQ ID Nr. 2 (Haken 2): Ratten Entkopplungsprotein 2 (Zugriffsnummer: AB010743) 5'-atgccattgtcaactgtactgagctggtgacctatgacctcatcaaagat-3'
SEQ ID Nr. 3 (Haken 3): Ratten ribosomales Protein L19 (Zugriffsnummer: J02650) 5'-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtggttggaccccaatgaaacca-3'

Beispiel 3: Detektion von cDNA auf Biochips durch Kolorimetrie
Die Oberfläche des Trägers, die die Fängermoleküle enthält, ist mit einem Hybridisierungsrahmen umgeben, der die Oberfläche der Trägers abgrenzt, die mit der Lösung in Kontakt ist, die die Zielsequenzen enthält. Der Array wird mit biotinylierter cDNA von Rattenleber inkubiert, wie von Delongueville et al. 2002 (Biochem. Pharmacol. 64: 137–149) erklärt. Nach Hybridisierung der Ziel-DNA werden die Arrays bei Raumtemperatur gewaschen und 45 min bei Raumtemperatur in einem immergrünen Röhrchen inkubiert, das 15 ml Anti-Biotin-Antikörper enthält, der an ein 20 nm Goldpartikel gekoppelt ist (British Biocell International, Ref. BL-GAB20), 1/100 verdünnt in einem Blockierungspuffer (Eppendorf Hamburg, Deutschland). Die Biochips werden dann fünfmal 2 min mit B1-Puffer (Eppendorf Hamburg, Deutschland) gewaschen. Jeder Biochip wird in einem neuen Eppendorf-Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunklen 10 min in Silverquant-Lösung (Eppendorf Hamburg, Deutschland) inkubiert. Die Entwicklung wird durch zweimaliges Waschen mit 700 μl milliQ-Wasser gestoppt. Die Biochips werden dann in einem kolorimetrischen Scanarray (Eppendorf Hamburg, Deutschland) gescannt und quantifiziert. Nach der Digitalisierung des Bildes wird ein Software-Programm (Eppendorf Hamburg, Deutschland) verwendet, um die Spot-Oberfläche abzugrenzen, das Signal für jeden Spot zu integrieren, den örtlichen Hintergrund um jeden Spot abzuziehen, die Stelle der Spots zu identifizieren und die Stelle mit der Identität des Ziels zu korrelieren. Die Quantifizierung wird durch einen Vergleich des Signals, das mit gespikten internen Standards erhalten werden, mit den Signalen der verschiedenen Ziel-Nukleotidspots erhalten.
Beispiel 4: Detektion von cDNA auf Biochips durch Fluoreszenz
Das Experiment wird im Wesentlichen wie in Beispiel 3 ausgeführt, aber nach der Hybridisierung mit der biotinylierten Ziel-cDNA werden die Arrays mit Anti-Cyanin-Antikörper (Jackson ImmunoResearch, Cy3: Ref. 200.162.096, Cy5: Ref 200.172.096), 1/1000 in einem Blockierungspuffer verdünnt, inkubiert. Die Biochips werden dann viermal 2 Min mit B1 Puffer gewaschen. Die Biochips werden bei Raumtemperatur getrocknet und mit GMS418 ScanArray (General Scanning) gescannt. Nach der Digitalisierung des Bildes wird die Imagene-Software (Biodiscovery, Marina Del Rey, USA) verwendet, um die Spot-Oberfläche abzugrenzen, das Signal für jeden Spot zu integrieren, den örtlichen Hintergrund um jeden Spot abzuziehen, die Stelle der Spots zu identifizieren und die Stelle mit der Identität der Zielsequenzen zu korrelieren. Die Quantifizierung der Zielsequenzen, die in der Probe vorhanden sind, wird im Wesentlichen wie in der Veröffentlichung von Delongueville et al. 2002 (Biochem. Pharmacol. 64: 137–149) beschrieben, erhalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren für die Konstruktion von Mikro-Arrays aus Polynukleotidsätzen (3) auf einer Oberfläche (5) eines festen Trägers, die für die Detektion und/oder Quantifizierung mindestens vier verschiedener Ziel-Polynukleotide oder -Nukleotidsequenzen (4) verwendet werden, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: – Fixieren von Nukleotidliniensequenzen (1) auf einer Oberfläche (5) des festen Trägers, wobei die Nukleotidlinien (1) mindestens 20 Nukleotide lang sind und eine zufällige Nukleotidsequenz haben; – Auftragen an mindestens 4 spezifischen Stellen (6) auf der Oberfläche (5) des festen Trägers von Nukleotidhaken (2) mit einer Sequenz, die für eine der mindestens vier verschiedenen Ziel-Polynukleotidsequenzen (4), die detektiert und/oder quantifiziert werden soll, spezifisch ist; und – kovalente Bindung an den spezifischen Oberflächenstellen (6) der Nukleotidhaken (2) an die Nukleotidliniensequenzen (1), um Polynukleotidsätze (3) zu bilden, die für die Bindung der Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) spezifisch sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oberfläche (5) der festen Oberfläche, die für die Konstruktion von Mikro-Arrays verwendet wird, gleichförmig mit Nukleotidlinien- (1) Sequenzen bedeckt ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei die Nukleotidlinien- (1) Sequenzen kovalent an der Oberfläche des festen Trägers durch eines ihrer Enden (5', 3') fixiert sind, und mit dem anderen Ende kovalent an den Nukleotidhaken (2) fixiert sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die feste Oberfläche einen Mikro-Array von mindestens vier Stellen von Polynukleotidsätzen (3) pro cm² umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Sequenz der Nukleotidlinien (1) weniger als 15 Basen, vorzugsweise weniger als 10 und insbesondere weniger als 5 angrenzende Basen enthält, die zu den zu detektierenden Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) komplementär sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen der Nukleotidlinien (1) mehrfache zufällige Sequenzen sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei alle Nukleotidlinien (1) aus derselben zufälligen Sequenz bestehen.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidhaken (2) eine Sequenz haben, die aus etwa 10 bis etwa 120 Nukleotiden besteht.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidhaken (2) chemisch synthetisierte Oligonukleotide sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidlinien (1) in situ auf der Oberfläche (5) des festen Trägers synthetisiert sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidlinien (1), die an Nukleotidhaken (2) gekoppelt sind, Sequenzen mit verschiedenen Bindungsaffinitäten für verschiedene Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) sind und an verschiedene feste Träger angeheftet sind, wobei jeder dieser festen Träger durch ein spezifisches chemisches oder physikalisches Merkmal gekennzeichnet ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der feste Träger verschiedene Kügelchen mit verschiedenen chemischen oder physikalischen Merkmalen umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) amplifizierte oder kopierte Nukleotidsequenzen sind.
Fester Träger, umfassend Nukleotidlinien (1), die mindestens 20 Nukleotide lang sind und eine zufällige Nukleotidsequenz haben, die durch eines ihrer Enden (3' oder 5') gleichförmig auf mindestens einer Oberfläche (5) des festen Trägers fixiert sind.
Fester Träger nach Anspruch 14, wobei alle Nukleotidlinien (1) aus derselben zufälligen Sequenz bestehen.
Fester Träger nach Anspruch 14, wobei die Sequenzen der Nukleotidlinien (1) mehrfache zufällige Sequenzen sind.
Fester Träger nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 16, wobei das Ende (5' oder 3') der Nukleotidliniensequenz (1), das nicht an die Oberfläche (5) des festen Trägers gebunden ist, eine reaktive Gruppe oder Funktion umfasst, die zur Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Ende einer anderen Nukleotidsequenz (2) imstande ist.
Fester Träger nach Anspruch 17, wobei die reaktive chemische Gruppe, die an dem Ende der Nukleotidliniensequenz vorhanden ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aldehyd-, Epoxid- und Acrylatgruppe.
Fester Träger nach den Ansprüchen 14 bis 18, wobei die Nukleotidliniensequenz mindestens eine Nukleotid-Ribose an (oder nahe) ihrem ungebundenen Ende umfasst.
Fester Träger nach den Ansprüchen 14 bis 19, wobei die Dichte der Nukleotidlinien (1), die an den festen Träger an einer spezifischen Stelle gebunden sind, höher als 10 fmol, vorzugsweise 100 fmol pro cm² der Oberfläche des festen Trägers ist.
Fester Träger nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 20, wobei Nukleotidlinien- (1) Sequenzen, die an spezifischen Stellen (6) auf der Oberfläche (5) des festen Trägers gebunden sind, eine kovalente Bindung mit Nukleotidhaken (2) aufweisen, um Polynukleotidsätze (3) an den spezifischen Stellen (6) der Oberfläche (5) des festen Trägers zu bilden, wobei Nukleotidhaken (2) eine Sequenz haben, die für eine zu detektierende und/oder quantifizierende Ziel-Polynukleotidsequenz (4) spezifisch ist, und wobei die kovalente Bindung zwischen dem Ende der Nukleotidlinien (1) und dem Ende der Nukleotidhaken (2) keine Phosphodiesterbindung ist.
Fester Träger nach Anspruch 21, der an einem ersten Teil (7) seiner Oberfläche (5) eine erste Gruppe von mindestens 3 fixierten Polynukleotidsätzen (3) umfasst, die räumlich getrennt sind, für die Detektion einer ersten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4), und an einem zweiten Teil (8) der Oberfläche (5) des festen Trägers Nukleotidlinien (1), die nicht imstande sind, die Ziel-Polynukleotidsequenzen der ersten Gruppe zu binden, sondern imstande sind, eine kovalente Bindung mit zielspezifischen Nukleotidhaken zu bilden, die für die Detektion einer zweiten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) spezifisch sind.
Fester Träger nach Anspruch 21, der an einem ersten Teil (7) seiner Oberfläche eine erste Gruppe von mindestens 3 fixierten Standard-Polynukleotidsequenzen umfasst, die an spezifischen Oberflächestellen (9) fixiert sind, die nicht von Nukleotidlinien (1) bedeckt sind und räumlich getrennt sind, für die Detektion einer ersten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4), und an einem zweiten Teil (8) der Oberfläche (5) des festen Trägers Nukleotidlinien (1), die nicht imstande sind, die Ziel-Polynukleotidsequenzen der ersten Gruppe zu binden, sondern imstande sind, eine kovalente Bindung mit zielspezifischen Nukleotidhaken zu bilden, die für die Detektion einer zweiten Gruppe von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) spezifisch sind.
Fester Träger nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 23, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas, elektronischen Vorrichtungen, Siliziumträgern, Kunststoffträgern, Silikaträgern, Metallträgern oder einer Mischung davon.
Fester Träger nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 24, wobei der feste Träger in einem Format ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Objektträgern, Scheiben, Gelschichten und Mikrokügelchen.
Fester Träger nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 21 bis 25, wobei die Dichte der Polynukleotidsätze (3), die an den festen Träger an einer spezifischen Stelle gebunden sind, höher als 10 fmol, vorzugsweise 100 fmol pro cm² der Oberfläche des festen Trägers ist.
Kit von Komponenten für die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung eines Mikroorganismus oder einer Nukleotidkomponente davon, der/die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden ist, wobei der Kit den festen Träger nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 26 umfasst, sowie Mittel und Medien für die Detektion von Ziel-Polynukleotidsequenzen (4), die von den Mikroorganismen oder der Nukleotidkomponente erhalten werden.
Kit nach Anspruch 27, der des Weiteren Nukleotidhakensequenzen (2) umfasst, die für eine oder mehrere verschiedene zu detektierende und/oder quantifizierende Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) spezifisch sind, und eventuell Reagenzien, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Ende der Nukleotidhaken- (2) Sequenz und dem Ende der Nukleotidlinien- (1) Sequenz ermöglichen.
Gerät für die Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung von Mikroorganismen oder einer Nukleotidkomponente davon, die eventuell in einer biologischen Probe oder Testlösung vorhanden sind, das den festen Träger nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 26 umfasst, der eventuell in einem Kit von Komponenten nach Anspruch 27 oder 28 vorhanden ist, wobei das Gerät des Weiteren eine Detektions- und/oder Quantifizierungsvorrichtung umfasst, die imstande ist, ein Signal zu detektieren und/oder zu quantifizieren, das an einer Stelle gebildet wird, wo eine Ziel- Nukleotidsequenz (4) an einen Polynukleotidsatz (3) der Oberfläche (5) des festen Trägers gebunden ist, sowie eventuell eine Lesevorrichtung zum Lesen der Informationen, die auf der Oberfläche (5) des festen Trägers aufgezeichnet sind, und ein Computer-Programm zum Detektieren der einzelnen Bereiche, die Ziel-Polynukleotidsequenzen (4) tragen, die an ihre entsprechenden Polynukleotidsätze (3) gebunden sind, und deren Stellen zum Korrelieren der Gegenwart eines an diesen Stellen detektierten Signals mit der Diagnose und/oder der Quantifizierung der Mikroorganismen oder deren Nukleotidkomponente.
Verwendung des Kits oder Geräts nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 27 bis 29 zur Diagnose und Genexpressionsanalyse.
Verwendung nach Anspruch 30 für die Identifizierung, Detektion und/oder Quantifizierung mehrfacher verschiedener Ziele von Polynukleotiden, die eventuell durch Genamplifizierung von Kopierschritten erhalten werden, und von genetischen Sequenzen erhalten werden, die zu verschiedenen genetischen taxonomischen Gruppen, wie Klasse, Familie, Gattung, Spezies oder Individuen, gehören.