DE69839373T2

DE69839373T2 - Auf die Verwendung von nukleaseresistenten Fragmenten basierende Verfahren und Kits, die für Nukleinsäuretests mit hohem Durchsatz geeignet sind

Info

Publication number: DE69839373T2
Application number: DE69839373T
Authority: DE
Inventors: Stephen Tucson Felder; Richard Tucson Kris
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2018-12-22
Also published as: JP5049395B2; AU2003234756A1; ES2306484T3; EP1038033A2; JP2012090644A; WO1999032663A2; WO1999032663A3; CZ302381B6; MXPA00006058A; AU1936699A; NO20003115D0; EA200000684A1; JP2010046072A; KR20010033324A; CZ20002259A3; PL193762B1; JP2009183286A; EA006425B1; US6232066B1; IL136862A0

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft z. B. Kits und Verfahren, die für die gleichzeitige Durchführung mehrfacher biologischer oder chemischer Assays unter Verwendung wiederholter Anordnungen von Sonden geeignet sind. Mehrere Bereiche enthalten jeweils eine Anordnung generischer Ankermoleküle. Die Anker sind mit bifunktionalen Linkermolekülen verbunden, die jeweils einen Abschnitt enthalten, der spezifisch für wenigstens einen der Anker ist, und einen Abschnitt, der eine spezifische Sonde für ein Target von Interesse ist. Die resultierende Anordnung von Sonden wird verwendet, um das Vorliegen eines oder mehrerer Targetmoleküle zu analysieren, die spezifisch mit den Sonden Wechselwirken. Die Erfindung betrifft verschiedene Gebiete, die sich in der Natur der molekularen Wechselwirkung unterscheiden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, die Entdeckung pharmazeutischer Wirkstoffe, Molekularbiologie, Biochemie, Pharmakologie und medizinische Diagnosetechnologie.
Auf Oberflächen oder „Chips" angeordnete Vielzahlen molekularer Sonden wurden in einer Vielfalt biologischer und chemischer Assays verwendet. Assays werden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Targetmoleküle von Interesse mit irgendwelchen der Sonden Wechselwirken. Nachdem die Sonden Targetmolekülen unter ausgewählten Testbedingungen ausgesetzt wurden, bestimmten Detektionsvorrichtungen, ob ein Targetmolekül mit einer bestimmten Sonde eine Wechselwirkung eingegangen ist.
Diese Systeme sind in einer Vielfalt von Screeningverfahren verwendbar, um entweder über die Sonden oder über die Targetmoleküle Informationen zu erhalten. Beispielsweise wurden sie verwendet, um nach Peptiden oder möglichen Wirkstoffen zu screenen, die an einen Rezeptor von Interesse binden, u. a.; um Proben auf das Vorhandensein von beispielsweise genetischen Mutationen, allelischen Varianten in einer Population oder auf ein bestimmtes Pathogen oder einen Stamm von Pathogenen zu durchmustern, und viele mehr; um die Genexpression zu untersuchen, beispielsweise um die mRNA zu identifizieren, deren Expression mit einem bestimmten physiologischen Zustand, Entwicklungsstadium oder Erkrankungszustand etc. korreliert ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt Kits und Verfahren für die gleichzeitige Durchführung mehrfacher biologischer oder chemischer Assays bereit und ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse mehrfacher Proben; beispielsweise mehrfacher Patientenproben, die in einem diagnostischen Assay gescreent werden sollen, oder mehrfache mögliche Wirkstoffe oder therapeutische Mittel, die in einem Verfahren der Wirkstoffermittlung getestet werden sollen. Es wird eine Kombination bereitgestellt, die verwendbar ist für die Detektion eines oder mehrerer Targets in einer Probe. Diese Kombination umfasst eine Oberfläche, die eine Vielzahl von räumlich getrennten Bereichen umfasst, die als Testbereiche bezeichnet werden können und bei denen es sich um Wells handeln kann, von denen wenigstens zwei im Wesentlichen identisch sind. Jede Oberfläche umfasst wenigstens zwei, vorzugsweise wenigstens zwanzig oder mehr, z. B. wenigstens etwa 25, 50, 96, 864 oder 1536 etc. solcher im Wesentlichen identischer Bereiche. Jeder Testbereich definiert einen Raum für die Einbringung einer Probe, die ein oder mehrere Targets enthält (oder möglicherweise enthält) und enthält eine biologische oder chemische Anordnung. (Formulierungen wie etwa „Target-enthaltende Probe" oder „Detektion eines Targets in einer Probe" sollen nicht solche Proben oder Bestimmungen (Nachweisversuche) ausschließen, bei denen kein Target enthalten ist oder nachgewiesen wird. Im allgemeinen Sinn betrifft diese Erfindung Anordnungen für die Bestimmung, ob ein Target in einer Probe enthalten ist, unabhängig davon, ob dieses detektiert wird oder nicht.) Diese Anordnung umfasst generische „Anker", jeweils in Verbindung mit einem bifunktionalen Linkermolekül, das einen ersten Abschnitt aufweist, der spezifisch für den Anker ist, und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde umfasst, die spezifisch für wenigstens eines der Targets ist. Die Kombination wird mit einer Probe in Kontakt gebracht, die ein oder mehrere Targets enthält, die ggf. mit einem Detektormolekül reagieren, und sie wird dann in einer Detektionsvorrichtung ausgelesen, welche Reaktionen zwischen Targetmolekülen und Sonden in den Testbereichen detektiert, so dass die Ergebnisse des Assays erzeugt werden.
Die Erfindung stellt Verfahren und Kits bereit, die besonders zur Verwendung in biologischen Hochdurchsatzassays geeignet sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann die Erfindung für das Hochdurchsatzscreening bei der Wirkstoffentdeckung verwendet werden. Beispielsweise kann ein Hochdurchsatzassay in vielen (zum Beispiel 100) 96-Well-Mikroplatten gleichzeitig durchgeführt werden. Jedes Well einer Platte kann z. B. 36 unterschiedliche Tests aufweisen, die darin durchgeführt werden, indem eine Anordnung von etwa 36 Anker- und Linkerpaaren verwendet wird. Das heißt, 100 Platten mit 96 Wells pro Platte und jeweils mit 36 Tests pro Well ermöglichen insgesamt 345.000 Tests; beispielsweise kann jeder von 9.600 unterschiedlichen Wirkstoffkandidaten gleichzeitig auf 36 verschiedene Parameter oder Assays getestet werden. Hochdurchsatzassays stellen viel mehr Informationen für jeden Wirkstoffkandidaten bereit als Assays, die nur einen Parameter gleichzeitig untersuchen. Beispielsweise ist es möglich, in einem einzelnen anfänglichen Hochdurchsatzscreening-Assay zu bestimmen, ob ein Wirkstoffkandidat selektiv, spezifisch und/oder ungiftig ist. Nicht-Hochdurchsatzverfahren erfordern ausgedehnte Nachfolgeassays, um solche Parameter für jeden Wirkstoffkandidaten von Interesse zu testen. Verschiedene Typen von Hochdurchsatzscreening-Assays sind z. B. in den Beispielen 15–17 beschrieben. Die Möglichkeit, simultan eine breite Vielfalt biologischer Assays durchzuführen und sehr viele Assays gleichzeitig durchzuführen (d. h. mit sehr hohem Durchsatz) sind zwei bedeutende Vorteile der Erfindung.
In einer Ausführungsform kann beispielsweise unter Verwendung von 96-Well-DNA-Bindungsplatten (Corning Costar) aus Polystyrol mit einer derivatisierten Oberfläche für die Anbindung primärer Amine wie etwa Aminosäuren oder modifizierter Oligonukleotide, eine Sammlung von 36 verschiedenen Oligonukleotiden auf die Oberfläche jedes Wells jeder Platte aufgebracht werden, sodass diese als Anker fungieren. Die Anker können kovalent an das derivatisierte Polystyrol angebunden werden und dieselben 36 Anker können für alle Screeningassays verwendet werden. Für einen beliebigen bestimmten Assay kann eine gegebene Gruppe von Linkem verwendet werden, um die Oberfläche jedes Wells so zu programmieren, dass sie spezifisch für etwa 36 verschiedene Targets oder Assaytypen von Interesse ist und es können verschiedene Testproben auf jedes der 96 Wells in jeder Platte aufgebracht werden. Dieselbe Gruppe von Ankern kann mehrfach verwendet werden, um die Oberfläche der Wells für andere Targets und Assays von Interesse umzuprogrammieren oder sie kann mehrfach erneut mit derselben Gruppe von Linkern verwendet werden. Diese Flexibilität und Wiederverwendbarkeit stellen weitere Vorteile der Erfindung dar.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis wenigstens eines Targets, wie in Anspruch 1 und 2 definiert.
Beispielhaft veranschaulichen die 1 und 2 eine erfindungsgemäße Kombination und ein Verfahren für deren Verwendung zum Nachweis eines mRNA-Targets. Die in 2 gezeigte Oberfläche enthält 15 identische Testbereiche; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist jeder dieser Testbereiche ein Well in einer Mikrotiterplatte. Jeder der Testbereiche enthält sechs verschiedene Anker, hier mit den Nummern 1–6 bezeichnet. 1 veranschaulicht schematisch einen dieser Anker, Anker 1, der in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Oligonukleotid ist. An Anker 1 ist ein Linkermolekül, Linker 1, angebunden, welches zwei Abschnitte umfasst. Der erste Abschnitt, der spezifisch für den Anker ist, ist in dieser Illustration ein Oligonukleotid, das spezifisch an den Anker hybridisieren kann. Der zweite Abschnitt, der eine für das Target von Interesse spezifische Sonde ist – hier Target-mRNA 1 – ist in dieser Illustration ein Oligonukleotid, das an das Target hybridisieren kann. Obwohl in dieser Figur nicht veranschaulicht, kann jeder der verbleibenden fünf Anker an seinen eigenen Linker über den Anker-spezifischen Abschnitt hybridisieren; jeder Linker kann einen Sondenabschnitt enthalten, der spezifisch ist für z. B. eine andere mRNA als mRNA 1 (oder für dieselbe). Diese veranschaulichte Kombination kann verwendet werden, um etwa 15 verschiedene Proben gleichzeitig auf das Vorhandensein von mRNA 1 zu testen (oder gleichzeitig auf mRNA-Targets, die durch die anderen fünf Sonden in der Anordnung spezifiziert (programmiert) sind). Um den Assay durchzuführen, wird jede Probe, die in diesem Beispiel ein RNA-Extrakt aus etwa einer von 15 unabhängigen Zelllinien sein kann, in einem kleinen Volumen zu einem der Bereiche oder Wells zugegeben und unter Bedingungen inkubiert, die effektiv sind für die Hybridisierung der Sonde und des Targets. Um zu bestimmen, ob mRNA 1 in einer Probe vorhanden ist, wird eine Detektionsvorrichtung verwendet, die Muster erkennen kann und/oder die spezifische Orte innerhalb jedes Bereichs auf das Vorhandensein eines Signals abfragen kann. Wenn die Zelllinien unter Bedingungen inkubiert werden, unter denen ihre mRNAs in vivo mit einem Tag markiert werden und wenn mRNA 1 in einer Probe vorhanden ist, so wird der Detektor ein Signal nachweisen, das von der markierten mRNA an dem durch den Anker/Sonde-Komplex definierten Ort ausgeht. Alternativ kann die mRNA direkt in vitro markiert werden, vor oder nachdem sie zu den Bereichen (Wells) hinzugefügt worden ist. Alternativ kann mRNA, wie in 1 veranschaulicht, indirekt markiert werden, bevor oder nachdem sie an eine Sonde hybridisiert hat, z. B. indem die RNA mit einem markierten „Detektor"-Oligonukleotid (Target-spezifischen Reporteroligonukleotid) inkubiert wurde, die komplementär zu einer anderen Sequenz als derjenigen, die von der Sonde erkannt wird, ist. In dem veranschaulichten Beispiel können 15 Proben gleichzeitig analysiert werden. Da mit dieser Erfindung wenigstens 20 oder mehr, z. B. etwa 1536 oder mehr Proben, gleichzeitig analysiert werden können, handelt es sich um ein Assaysystem mit sehr hohem Durchsatz.
Im Zusammenhang dieser Erfindung kann. eine beliebige kompatible Oberfläche verwendet werden. Die Oberfläche (üblicherweise ein Feststoff) kann aus einem beliebigen einer Vielfalt organischer oder anorganischer Materialien oder Kombinationen davon sein, einschließlich lediglich beispielhaft Kunststoffen wie etwa Polypropylen oder Polystyrol; Keramik; Silicium; (Quartz)Glas, Quartz oder Glas, wobei die Dicke beispielsweise die eines Glasmikroskopträgers oder eines Deckglases sein kann; Papier wie etwa Filterpapier; diazotierte Cellulose; Nitrocellulosefilter; Nylonmembran oder Polyacrylamidgelpad. Substrate, die für Licht transparent sind, sind nützlich, wenn das Verfahren zur Durchführung eines Assays einen optischen Nachweis einschließt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche die Kunststoffoberfläche eines Multiwells, z. B. einer Gewebekulturschale, beispielsweise einer 24-, 96-, 256-, 384-, 864- oder 1536-Wellplatte (z. B. einer modifizierten Platte, wie etwa einer Coming Costar DNA-BindPlate). Anker können direkt mit einer Oberfläche assoziiert, z. B. an diese gebunden sein, oder sie können mit einer Art von Oberfläche assoziiert sein, z. B. Glas, die wiederum in Kontakt mit einer zweiten Oberfläche steht, z. B. innerhalb eines Kunststoff-"Wells" in einer Mikrotiterschale. Die Form der Oberfläche ist nicht entscheidend. Es kann sich beispielsweise um eine flache Oberfläche wie etwa ein Quadrat, Rechteck oder einen Kreis handeln; eine gekrümmte Oberfläche oder um eine dreidimensionale Oberfläche, wie etwa eine Kugel, ein Partikel, einen Faden, ein Präzipitat, eine Röhre, eine Kugel etc.
Die Oberfläche umfasst Bereiche, die räumlich abgrenzt und adressierbar oder identifizierbar sind. Jeder Bereich umfasst eine Gruppe von Ankern. Wie die Bereiche abgetrennt sind, ihre physikalischen Eigenschaften und ihre relative Orientierung zueinander, ist nicht entscheidend. In einer Ausführungsform können die Bereiche durch eine beliebige physikalische Barriere getrennt sein, die gegenüber dem Durchtritt von Flüssigkeiten resistent ist. Beispielsweise können die Bereiche in einer bevorzugten Ausführungsform Wells einer Multiwell(z. B. Gewebekultur)-Schale sein, z. B. einer 24-, 96-, 256-, 384-, 864- oder 1536-Wellplatte. Alternativ kann eine Oberfläche, wie etwa eine Glasoberfläche, ausgeätzt sein, so dass sie beispielsweise 864 oder 1536 gesonderte flache Wells aufweist. Alternativ kann eine Oberfläche Bereiche ohne Abtrennungen oder Wells umfassen, beispielsweise eine flache Oberfläche, z. B. ein Stück Kunststoff, Glas oder Papier, und einzelne Bereiche können auch durch Überlagerung einer Struktur definiert sein (z. B. eines Stücks Kunststoff oder Glas), welches die separaten Bereiche abgrenzt. Optional kann eine Oberfläche bereits eine oder mehrere Anordnungen von Ankern oder mit Linkern assoziierten Ankern umfassen, bevor die einzelnen Bereiche abgegrenzt werden. In einer anderen Ausführungsform können Anordnungen von Ankern innerhalb jedes Bereichs durch Leerräume auf der Oberfläche getrennt sein, in denen sich keine Anker befinden, oder durch chemische Grenzen, wie etwa Wachs oder Silikone, um eine Ausbreitung von Tröpfchen zu verhindern. In noch einer weiteren Ausführungsform können die Bereiche als Röhren oder Flüssigkeitskontrollkanäle definiert sein, z. B. entworfen für Durchflussassays wie zum Beispiel in Beattie et al (1995). Clin. Chem. 4, 700–706, offenbart. Bereiche innerhalb oder auf etc. einer Oberfläche können auch durch Modifikation der Oberfläche selbst definiert sein. Beispielsweise kann eine Kunststoffoberfläche Abschnitte aus modifiziertem oder derivatisiertem Kunststoff aufweisen, die z. B. als Stellen für die Zugabe spezifischer Arten von Polymeren dienen können (z. B. kann PEG an eine Polystyrol-Oberfläche angebunden sein und dann mit Carboxyl- oder Aminogruppen, Doppelbindungen, Aldehyden und dergleichen derivatisiert werden). Alternativ kann eine Kunststoffoberfläche eingeformte Strukturen wie etwa Vorsprünge oder Buckel aufweisen, die als Plattformen für die Zugabe von Ankern dienen können. Die relative Orientierung der Testbereiche kann eine beliebige einer Vielfalt von Formen annehmen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, parallele oder senkrechte Anordnungen innerhalb eines Quadrats oder Rechtecks oder einer anderen Oberfläche, radial ausgedehnte Anordnungen innerhalb einer kreisförmigen oder einer anderen Oberfläche oder lineare Anordnungen etc.
Die räumlich getrennten Bereiche der Erfindung liegen in mehrfachen Kopien vor. Das heißt, es gibt wenigstens zwei, vorzugsweise wenigstens zwanzig oder wenigstens etwa 24, 50, 96, 256, 384, 864, 1536, 2025 oder mehr etc., im Wesentlichen identische räumlich gesonderte (getrennte) Bereiche. Höhere Anzahlen wiederholter Bereiche können Assays mit zunehmend höherem Durchsatz ermöglichen. Im Wesentlichen identische Bereiche sind wie hierin verwendet Bereiche, die identische oder im Wesentlichen identische Anordnungen von Ankern und/oder Anker/Linker-Komplexen enthalten.
Im Wesentlichen identisch bedeutet wie hierin verwendet, dass eine Anordnung oder ein Bereich im Wesentlichen dieselbe Funktion wie eine andere Anordnung oder ein anderer Bereich erfüllen soll, bei der Analyse eines Targets gemäß dieser Erfindung. Unterschiede, welche die Funktion, d. h. die Nachweisbarkeit von Zielen, nicht wesentlich beeinflussen, gehen einher mit der Unvollkommenheit kleiner Nukleotide (Auslassungen/Einfügungen/Substitutionen) oder mit Unvollkommenheiten von Oligos (schlechte Oberflächenanbindung) etc., wodurch innerhalb der Assaygenauigkeit die Ergebnisse der Targetbestimmung nicht signifikant beeinträchtigt werden.
Ein Fachmann wird selbstverständlich erkennen, dass nicht alle Bereiche auf einer Oberfläche im Wesentlichen identisch zueinander sein müssen. Wenn beispielsweise zwei verschiedene Gruppen von Anordnungen parallel untersucht werden sollen, so kann es von Vorteil sein, beide Gruppen von Anordnungen auf einer einzelnen Oberfläche anzuordnen. Beispielsweise können die beiden verschiedenen Gruppen von Anordnungen in Form abwechselnder Streifen angeordnet sein, um einen Vergleich zu erleichtern. In einer anderen Ausführungsform möchte ein Fachmann möglicherweise ein oder mehrere Bereiche einbauen, die unterscheidbar von den anderen Bereichen auf der Oberfläche detektiert werden können und die dabei als „Registrierungsbereich(e)" verwendet werden können. Beispielsweise kann ein Registrierungsbereich Oligonukleotide oder Peptide umfassen, die ein charakteristisches Muster von Fluoreszenzmolekülen zeigen, die durch eine Scannachweisvorrichtung erkannt werden können, als „Ausgangspunkt" für die Ausrichtung der Positionen der Bereiche auf einer Oberfläche.
Die Größe und der physikalische Abstand der Testbereiche ist nicht begrenzt. Typische Bereiche weisen eine Fläche von etwa 1 bis etwa 700 mm², vorzugsweise 1 bis etwa 40 mm², auf und sind etwa 0,5 bis etwa 5 mm voneinander beabstandet und routinemäßig abhängig von den beteiligten Flächen gewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bereiche etwa 5 mm voneinander beabstandet. Beispielsweise könnte jeder Bereich ein rechteckiges Gitter umfassen, mit beispielsweise 8 Reihen und 6 Spalten, von grob kreisförmigen Punkten von Ankern mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern und einem Abstand von 500 Mikrometern; ein solcher Bereich würde etwa eine Fläche von 20 Quadratmillimeter bedecken. Größere und kleinere Flächen und Abstände der Bereiche sind möglich.
Die Bereiche können außerdem weiter unterteilt sein, so dass einige oder alle Anker innerhalb eines Bereichs physikalisch von benachbarten Ankern mittels z. B. einer Einbuchtung oder Vertiefung getrennt sind. Beispielsweise kann die Zahl der Unterteilungen (Unterbereiche) in einem Bereich von etwa 10 bis zu etwa 100 oder mehr oder weniger variieren: In einer Ausführungsform kann ein Bereich, bei dem es sich um ein Well einer 1536-Well-Schale handelt, weiter in kleinere Wells, z. B. in etwa 4 bis etwa 900, vorzugsweise etwa 16 bis etwa 36 Wells unterteilt sein, so dass eine Anordnung von Wells innerhalb von Wells gebildet wird. Siehe 4. Eine solche mit Vertiefungen versehene Oberfläche verringert die benötigte Toleranz für die physikalische Anordnung eines einzelnen Ankers (oder einer Gruppe von Ankern) in jedem bestimmten Raum (Lokus) und die Größe der Flächen, welche Anker enthalten, ist einheitlicher, so dass die Detektion von Targets, die an die Sonde binden, erleichtert wird.
Der Begriff „Anker" betrifft wie hierin verwendet Nukleinsäuremoleküle (siehe zum Beispiel 7), die mit der Oberfläche assoziiert sind (z. B. darauf immobilisiert oder entweder kovalent oder nicht-kovalent daran angebunden) oder die ein Abschnitt einer solchen Oberfläche sind (z. B. ein derivatisierter Abschnitt einer Kunststoffoberfläche) und die eine spezifische Wechselwirkung oder Assoziation mit einem Linker oder einer anderen Substanz wie hierin beschrieben eingehen können. Der Anker ist eine Nukleinsäure mit beliebiger Länge (z. B. Oligonukleotid) oder Art (z. B. DNA, RNA, PNA oder ein PCR-Produkt eines RNA- oder DNA-Moleküls). Die Nukleinsäure kann modifiziert oder substituiert sein (z. B. nicht-natürlich auftretende Nukleotide umfassen wie etwa z. B. Inosin; über verschiedene bekannte Verknüpfungen wie etwa Sulfamat, Sulfamid, Phosphorthionat, Methylphosphonat, Carbamat etc. verbunden sein oder ein halbsynthetisches Molekül wie etwa ein DNA-Streptavidin-Konjugat etc.). Einzelsträngige Nukleinsäuren sind bevorzugt.
Die Zahl der Anker in einem Testbereich kann wenigstens zwei betragen, vorzugsweise zwischen etwa 8 und 900 (wobei mehr oder weniger inbegriffen ist), weiter bevorzugt zwischen etwa 8 und etwa 300 und am meisten bevorzugt zwischen etwa 30 und etwa 100 (z. B. etwa 64). In einigen bevorzugten Ausführungsformen gibt es etwa 16, 36, 45 oder 100 Anker pro Testbereich für eine Oberfläche mit 96 Testbereichen (z. B. Wells) oder etwa 9, 16 oder 25 Anker pro Testbereich für eine Oberfläche mit 384 Testbereichen (z. B. Wells). In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform weist jeder Anker in einem Testbereich eine andere Spezifität im Vergleich zu anderen Ankern in der Anordnung auf. Zwei oder mehr der Anker können jedoch dieselbe Spezifität aufweisen und alle Anker können identisch sein. In einer Ausführungsform, bei der eine erfindungsgemäße Kombination eine sehr große Zahl von Testbereichen umfasst (z. B. etwa 864, 1536 oder mehr), so dass eine große Zahl von Testproben gleichzeitig bearbeitet werden kann, kann es von Interesse sein, diese Proben auf nur eine begrenzte Zahl von Parametern (z. B. etwa 2, 4, 6 oder 9) zu untersuchen. In anderen Worten kann es für Kombinationen, die eine sehr große Zahl von Bereichen umfassen, vorteilhaft sein, nur etwa 2 bis 9 Anker pro Bereich zu haben.
Die physikalische Beabstandung und die relative Orientierung der Anker in einem Testbereich oder auf diesem ist nicht begrenzt. Typischerweise beträgt der Abstand zwischen den Ankern etwa 0,003 bis etwa 5 mm oder weniger, vorzugsweise zwischen etwa 0,03 und etwa 1. Größere und kleinere Ankerabstände (und Flächen) sind inbegriffen. Die Anker können in einer beliebigen Orientierung relativ zueinander und zu den Grenzen des Bereichs angeordnet sein. Beispielsweise können sie in einer zweidimensionalen Orientierung angeordnet sein, wie etwa als Quadrat, Rechteck, Sechseck oder andere Anordnungen, oder als kreisförmige Anordnung, wobei die Anker von dem Zentrum in radialen Linien oder konzentrischen Kreisen ausgehen. Die Anker können auch eindimensional in einer linearen Anordnung angeordnet sein. Beispielsweise können Oligonukleotide an spezifische Positionen entlang einer DNA- oder RNA-Sequenz hybridisiert sein, um eine supramolekulare Anordnung zu bilden. Alternativ können die Anker in einer „Barcode"-ähnlichen Formation gelegt werden (siehe 6). Beispielsweise können Anker als parallel zueinander angeordnete Linien abgelegt werden. Der Abstand zwischen den Linien oder die Breite jeder langen Linie kann auf regelmäßige Weise variieren, um ein einfaches erkennbares Muster wie etwa einen Barcode zu bilden, z. B. können die erste und die dritte Linie zweimal so groß sein wie der Rest, es können Linien weggelassen werden etc. Eine zusätzliche freie Linie kann nach der letzten Linie angeordnet werden, um einen Testbereich abzugrenzen und das Barcode-Muster kann in darauffolgenden Testbereichen wiederholt werden.
Das Muster der Anker muss nicht strikt mit den Positionen der getrennten Assaywells (Testbereiche) oder separater Assaytröpfchen festgelegt sein. Der Begriff „Assaypositionen" wird verwendet, um die Positionen der Assayoberfläche zu bezeichnen, an denen Assayproben aufgebracht werden. (Diese können durch die Position separater Tröpfchen der Assayprobe oder durch die Position von Wänden oder Separatoren, die einzelne Assaywells, beispielsweise auf einer Multiwellplatte, definieren, definiert sein. Das Ankermuster selbst (z. B. ein „Barcode"-ähnliches Muster von Oligonukleotidankern) wird verwendet, um mittels Mustererkennung zu definieren, wo genau jeder separate Anker positioniert ist – ebenso wie jede Linie eines Barcodes über ihre Position relativ zu den übrigen Linien erkannt wird. Daher braucht der erste Anker nicht an einer Kante oder einer Ecke jeder Assayposition zu liegen. Der erste Anker wird eher durch Mustererkennung aufgefunden als durch seine Position relativ zu der Assayposition. Solange der von jeder Assayposition eingenommene Bereich (die Fläche des Tröpfchens oder die Fläche z. B. des Wells) groß genug ist, dass sichergestellt ist, dass er wenigstens eine vollständige Einheit des sich wiederholenden Musters von Ankern enthält, wird jeder Assaypunkt die Probe für diese Assayposition auf alle durch das (Barcode)-Muster spezifizierten Targets testen, woimmer das Muster innerhalb des Bereichs der Assayposition liegt.
Die Anker müssen nicht in einem strengen oder sogar festen Muster innerhalb dieses Testbereichs angeordnet sein. Beispielsweise kann jeder Anker an ein Partikel, an eine Kugel oder dergleichen angebunden sein, welches eine zufällige Position innerhalb eines Testbereichs einnimmt. Die Position jedes Ankers kann unter Verwendung von z. B. einem nachweisbaren Tag bestimmt werden. Beispielsweise können die für eine jeweilige Art von Anker spezifischen Linkermoleküle mit verschiedenen fluoreszenten, lumineszenten etc. Tags markiert sein und die Position eines Partikels, welches ein bestimmtes Linker/Anker-Paar umfasst, kann über die Art des von dem Linker ausgehenden Signals, z. B. das Anregungs- oder Emissionsspektrum, identifiziert werden. Ein Fachmann kann eine Gruppe von Linkern mit einer Vielfalt solcher angebundener Tags, jeweils mit einem unterscheidbaren Spektrum, herstellen. Alternativ können die Anker direkt markiert werden. Beispielsweise kann jede Art von Anker mit einem Tag markiert werden, das mit einem anderen Spektrum als die Tags an anderen Arten von Ankern fluoresziert.
Alternativ können die Partikel, Kugeln oder dergleichen sich voneinander in ihrer Größe oder Form unterscheiden. Beliebige der hierin beschriebenen Markierungs- und Detektionsverfahren können eingesetzt werden. Beispielsweise kann Fluoreszenz mittels eines CCD-basierten Imaging-Systems, durch ein Rasterfluoreszenzmikroskop oder einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) gemessen werden.
Ein Anker kann spezifisch mit einem Abschnitt – dem Anker-spezifischen Abschnitt – eines Linkermoleküls Wechselwirken oder mit diesem assoziiert werden. Mit den Begriffen „Wechselwirken" oder „assoziieren" ist hier gemeint, dass zwei Substanzen oder Verbindungen (z. B. der Anker und der Anker-spezifische Abschnitt eines Linkers, eine Sonde und ihr Target, oder ein Target und ein Target-spezifischer Rezeptor) ausreichend aneinander gebunden werden (z. B. angebracht, gebunden, hybridisiert, verbunden, anneliert, kovalent verknüpft oder auf andere Weise assoziiert), dass der beabsichtigte Assay durchgeführt werden kann. Mit dem Begriff „spezifisch" ist hier gemeint, dass zwei Komponenten (z. B. Anker und Anker-spezifischer Bereich eines Linkers, eine Sonde und deren Target, oder ein Target und ein Target-spezifischer Reporter) selektiv aneinander binden und in Abwesenheit jeglicher Schutztechniken im Allgemeinen nicht an andere, nicht für die Bindung an die vorliegenden Komponenten gedachten Komponenten binden. Die benötigten Parameter um spezifische Wechselwirkungen zu erzielen, können routinemäßig ermittelt werden, z. B. unter Verwendung herkömmlicher Verfahren des Fachbereichs.
Ein Fachmann kann experimentell diejenigen Merkmale (wie etwa Länge, Basenzusammensetzung und Grad der Komplementarität) bestimmen, die eine Nukleinsäure (z. B. einen Oligonukleotidanker) dazu befähigen, an eine andere Nukleinsäure (z. B. den Anker-spezifischen Abschnitt eines Linkers) unter Bedingungen ausgewählter Stringenz zu hybridisieren, während die nicht-spezifische Hybridisierung an andere Substanzen oder Moleküle (z. B. andere Oligonukleotidlinker) minimiert wird. Typischerweise besitzt die DNA oder die andere Nukleinsäuresequenz eines Ankers, eines Abschnitts eines Linkers oder eines Detektoroligonukleotids eine ausreichende Komplementarität zu ihrem Bindungspartner, dass eine Hybridisierung unter ausgewählten stringenten Hybridisierungsbedingungen ermöglicht wird und T_m wird etwa 10°C bis 20°C oberhalb Raumtemperatur liegen (z. B. etwa 37°C). Im Allgemeinen kann die Länge eines Oligonukleotids im Bereich von etwa 8 bis etwa 50 Nukleotiden liegen, vorzugsweise bei etwa 15, 20, 25 oder 30 Nukleotiden. Wie hierin verwendet, bedeutet „hochstringente Hybridisierungsbedingungen" beliebige Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung erfolgt, wenn zumindest 95%, vorzugsweise etwa 97 bis 100% Nukleotidkomplementarität (Identität) zwischen den Nukleinsäuren vorliegt. Abhängig von dem gewünschten Zweck können jedoch Hybridisierungsbedingungen gewählt werden, die eine geringere Komplementarität erfordern, z. B. etwa 90%, 85%, 75%, 50% etc. Unter den Parametern der Hybridisierungsreaktion, die variiert werden können, sind die Salzkonzentration, Puffer, pH, Temperatur, Inkubationsdauer, Menge und Art des Denaturierungsmittels wie etwa Formamid etc. (siehe z. B. Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe) Band 1–3, Cold Spring Harbor Press, New York; Hames et al. (1985). Nucleic Acid Hybridization, IL Press; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sciences Publishing, Inc., New York). Beispielsweise kann eine Nukleinsäure (z. B. Linkeroligonukleotide) zu einem Testbereich hinzugefügt werden (z. B. zu einem Well einer Multiwellplatte – in einer bevorzugten Ausführungsform einer 96 oder 384 oder größeren Wellplatte) in einem Volumen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 oder mehr μl (in einer bevorzugten Ausführungsform etwa 1 bis etwa 50 μl, am meisten bevorzugt etwa 40 μl) mit einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 5 μM (in einer bevorzugten Ausführungsform etwa 0,01 μM) in einem Puffer, wie etwa 6X SSPE-T (0,9 M NaCl, 60 mM NaH₂PO₄, 6 mM EDTA und 0,05% Triton X-100) und an einen Bindungspartner (z. B. einen Oligonukleotidanker auf der Oberfläche) für zwischen etwa 10 Minuten und etwa wenigstens 3 Stunden (in einer bevorzugten Ausführungsform wenigstens etwa 15 Minuten) hybridisiert werden bei einer Temperatur im Bereich von etwa 4°C bis etwa 37°C (in einer bevorzugten Ausführungsform bei etwa Raumtemperatur). Die Bedingungen können so gewählt werden, dass ein Hochdurchsatz ermöglicht wird. In einer Ausführungsform der Erfindung können die Reaktionsbedingungen physiologischen Bedingungen gleichen.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann jeder Anker in einer Anordnung mit dem Anker-spezifischen Abschnitt seines korrespondierenden Linkers in im Wesentlichen demselben Maß Wechselwirken wie die anderen Anker in der Anordnung, unter ausgewählten Reaktionsbedingungen. Dies kann gewährleisten, dass die Anker eine im Wesentlichen einheitliche Anordnung von Linkern und daher Sonden spezifizieren.
Die Anker innerhalb eines Testbereichs können ein „generischer" Satz sein, wobei jeder Anker mit einem oder mehreren einer Vielfalt unterschiedlicher Linker Wechselwirken kann, die jeweils einen spezifischen Abschnitt für einen solchen Anker aufweisen, jedoch mit unterschiedlichen „Sonden"-Abschnitten; eine einzelne Anordnung generischer Anker kann somit verwendet werden, um eine variierte Gruppe von Sonden zu programmieren oder zu definieren. Die Flexibilität eines solchen generischen Assays von Ankern kann unter Bezugnahme auf die 1 und 2 veranschaulicht werden. 2 veranschaulicht eine Oberfläche, die 15 Testbereiche umfasst, von denen jeder eine Anordnung von 6 verschiedenen Ankern enthält, welche in diesem Beispiel Oligonukleotide sein können. 1 veranschaulicht schematisch einen dieser (Oligonukleotid)Anker, Anker 1, der in Kontakt mit Linker 1 ist, der einen Abschnitt umfasst, der spezifisch für Anker 1 ist, und einen zweiten Abschnitt, der spezifisch für Target-mRNA 1 ist. Alternativ wäre es möglich, z. B. einen Linker 2, der wie Linker 1 einen Abschnitt, der spezifisch für Anker 1 ist, der aber einen zweiten Abschnitt, der spezifisch für Target-mRNA 2 anstelle von Target-mRNA 1 ist, auszutauschen. Somit kann Anker 1 verwendet werden, um Sonden für jeden von zwei oder mehreren verschiedenen Target-mRNAs zu spezifizieren (oder zu programmieren, oder definieren oder bestimmen). Das Verfahren zur Erzeugung und Anbindung eines hochaufgelösten Musters (Anordnung) von Oligonukleotiden oder Peptiden kann teuer, zeitaufwändig und/oder physikalisch schwierig sein. Die Möglichkeit, eine vorgeformte Anordnung von Ankern zu verwenden, um eine breite Vielfalt von Sondenanordnungen zu programmieren, ist ein Vorteil dieser Erfindung.
Obwohl die generischen Anker, die in 2 veranschaulicht sind, ein Muster von Oligonukleotidsonden definieren, könnte die identische Ankeranordnung auch verwendet werden, um eine Anordnung anderer Sonden, beispielsweise Rezeptorproteine, zu programmieren (siehe z. B. 3) (nicht Gegenstand der Erfindung).
In einer Ausführungsform der Erfindung können Anker reversibel mit Linkern Wechselwirken; somit kann eine generische Gruppe von Ankern erneut verwendet werden, um eine veränderte Gruppe von Sonden zu programmieren. Beispielsweise kann ein Oligonukleotidanker von dem Oligonukleotidabschnitt eines Linkers getrennt werden, z. B. durch einen Erwärmungsschritt, der eine Dissoziation der beiden Oligonukleotide bewirkt, und er kann dann wieder an einen zweiten Linker gebunden werden. Die Möglichkeit der Wiederverwendung von Ankeranordnungen, die teuer, zeitaufwändig und/oder physikalisch schwierig herzustellen sein können, ist ein weiterer Vorteil der Erfindung.
Ein Anker muss nicht notwendigerweise mit einem Linker Wechselwirken. Beispielsweise kann ein Anker (direkt oder indirekt) an ein nachweisbares Molekül gekoppelt werden, wie etwa an einen Fluorochrom, und er kann dabei dazu dienen, einen Punkt innerhalb eines Gitters zu lokalisieren, z. B. zum Zweck der Registrierung zwischen der Testoberfläche und dem Detektor. Alternativ kann ein Anker mit einer bekannten Menge eines nachweisbaren Moleküls markiert werden, so dass er als innerer quantitativer Marker fungiert, z. B. für den Zweck der Kalibrierung.
Der Begriff „Linker" bezieht sich wie hierin verwendet auf eine bifunktionale Substanz, die einen ersten Abschnitt (oder Gruppe oder Teil) umfasst, der spezifisch ist für einen ausgewählten (bestimmten) Anker oder eine Untergruppe der Anker („Anker-spezifisch") und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde ist, die spezifisch für ein Target von Interesse ist („Target-spezifisch").
Der Anker ist ein Oligonukleotid und der Abschnitt des Linkers, welcher damit wechselwirkt, ist eine Nukleinsäure, die effizient und spezifisch unter ausgewählten stringenten Hybridisierungsbedingungen daran hybridisieren kann: Die Nukleinsäure kann z. B. ein Oligonukleotid, DNA, RNA, PNA, PCR-Produkt oder eine substituierte oder modifizierte Nukleinsäure sein (z. B. nicht-natürlich auftretende Nukleotide umfassen, wie etwa z. B. Inosin; über verschiedene bekannte Verknüpfungen wie etwa Sulfamat, Sulfamid, Phosphorthioat, Methylphosphonat, Carbamat verknüpft sein oder ein halbsynthetisches Molekül wie etwa ein DNA-Streptavidin-Konjugat etc.). Einzelsträngige Gruppen sind bevorzugt. Der Abschnitt eines Linkers, der spezifisch für einen Oligonukleotidanker ist, kann eine Länge im Bereich von etwa 8 bis etwa 50 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 15, 20, 25 oder 30 Nukleotiden aufweisen.
Die chemische Beschaffenheit des Target-spezifischen Abschnitts des Linkers ist selbstverständlich abhängig von dem Target, für das er als Sonde dient und mit der er wechselwirkt. Wenn beispielsweise das Target eine bestimmte mRNA ist, so kann der Target-spezifische Abschnitt des Linkers z. B. ein Oligonukleotid sein, welches unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen spezifisch an das Target bindet, aber nicht an störende RNAs oder DNAs. Ein Fachmann kann unter Verwendung von anerkannten Verfahren experimentell die Merkmale eines Oligonukleotids bestimmen, das optimal an das Target hybridisieren wird, mit minimaler Hybridisierung an unspezifische störende DNA oder RNA (z. B. siehe oben). Im Allgemeinen kann die Länge einer Oligonukleotidsonde, die verwendet wird, um eine Target-mRNA, die vor dem Hintergrund eines großen Überschusses von Nicht-Target-RNAs vorliegt, zu unterscheiden, im Bereich von etwa 8 bis etwa 50 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 18, 20, 22 oder 25 Nukleotiden liegen. Eine Oligonukleotidsonde für die Verwendung in einem biochemischen Assay, in dem kein großer Hintergrund kompetitiver Targets vorliegt, kann kürzer sein. Unter Verwendung von im Fachbereich anerkannten Vorgehensweisen (z. B. des Computerprogramms BLAST) können die Sequenzen von Oligonukleotidsonden so gewählt werden, dass sie nicht miteinander verwandt sind und unähnlich zu möglicherweise störenden Sequenzen in bekannten Gendatenbanken sind. Die Auswahl der Hybridisierungsbedingungen, die eine spezifische Hybridisierung einer Oligonukleotidsonde an eine RNA ermöglichen; kann routinemäßig bestimmt werden unter Verwendung von im Fachbereich anerkannten Verfahren (z. B. siehe oben). Beispielsweise kann Target-RNA [z. B. Gesamt-RNA oder aus Geweben oder gezüchteten Zellen extrahierte mRNA (und ggf. behandelt mit einem Mittel von Interesse) in einem beliebigen Behälter wie etwa dem Well einer Multiwellmikrotiterplatte (z. B. 96 oder 384 oder mehr Wells)] zu einem Testbereich zugegeben werden, welcher eine Anordnung von Oligonukleotidsonden enthält (siehe oben) in einem Puffer wie etwa 6 X SSPE-T oder anderen, der ggf. ein Mittel für die Verringerung nicht-spezifischer Bindung enthält, z. B. etwa 0,5 mg/ml zersetzte Herings- oder Lachssperma-DNA oder Hefe-RNA) und bei einer empirisch bestimmten Temperatur für einen Zeitraum im Bereich von etwa 10 Minuten und wenigstens 18 Stunden (in einer bevorzugten Ausführungsform etwa 3 Stunden) inkubiert werden. Die Stringenz der Hybridisierung kann gleich sein oder geringer als die Stringenz, die verwendet wird, um den Anker mit dem Anker-spezifischen Abschnitt der Linker zu assoziieren. Das Design und die Verwendung anderer Arten von Sonden sind im Fachbereich ebenfalls Routine, wie z. B. vorstehend diskutiert.
Nachdem zwei Substanzen assoziiert sind (z. B. durch Inkubation von zwei Nukleinsäuren, zwei Proteinen, einem Protein und einer Nukleinsäure oder anderen) unter Bildung eines Komplexes (wie etwa z. B. eines Anker/Linker-Komplexes) kann der resultierende Komplex optional behandelt werden (z. B. gewaschen), um ungebundene Substanzen (z. B. Linker) zu entfernen, wobei Bedingungen angewendet werden, die empirisch bestimmt werden, so dass spezifische Wechselwirkungen intakt bleiben, aber unspezifisch gebundenes Material entfernt wird. Beispielsweise können Reaktionsgemische zwischen etwa einmal und zehnmal oder mehr unter denselben oder etwas höheren Stringenzbedingungen als denjenigen, die verwendet werden, um den Komplex zu erhalten (z. B. den Anker/Linker-Komplex), gewaschen werden.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen können routinemäßig unter Verwendung herkömmlicher Techniken hergestellt werden.
Einige der Oberflächen, die in der Erfindung verwendet werden können, sind leicht von kommerziellen Herstellern erhältlich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche eine 96-, 384- oder 1536-Wellmikrotiterplatte, wie etwa die modifizierten Platten, die von Corning Costar vertrieben werden. Alternativ kann eine Oberfläche, die Wells umfasst, die wiederum Beulen oder andere „Vertiefungen" umfasst, durch Mikrobearbeitung einer Substanz wie etwa Aluminium oder Stahl zur Herstellung einer Form und anschließende Mikroinjektion von Kunststoff oder einem ähnlichen Material in die Form zur Bildung einer Struktur, wie etwa in 4 veranschaulicht, geformt werden. Alternativ kann eine Struktur, wie etwa in 4 gezeigt, die aus Glas, Kunststoff, Keramik oder dergleichen besteht, zusammengesetzt werden, z. B. aus drei Stücken, wie etwa aus denen, die in 5 veranschaulicht sind: einem ersten Abschnitt, als Wellseparator bezeichnet (5a), der die Trennungen zwischen den Probenwells bilden wird; einem zweiten Abschnitt, der als Unterteiler bezeichnet wird (5b), der die Unterteilungen oder Vertiefungen innerhalb jedes Testwells bilden wird; und einem dritten Abschnitt, der als Basis bezeichnet wird (5c), der die Basis der Platte und die untere Oberfläche der Testwells bilden wird. Der Separator kann beispielsweise ein Stück Material, z. B. Silicium, mit beabstandeten Löchern, sein, so dass jedes Loch die Wände eines Testwells bildet, wenn die drei Stücke vereint werden. Der Unterteiler kann beispielsweise ein dünnes Stück Material sein, z. B. Silicium in Form einer Folie oder eines feinen Netzwerks. Die Basis kann ein flaches Stück Material sein, z. B. Glas, beispielsweise in der Form des unteren Abschnitts einer typischen Mikroplatte, die für einen biochemischen Assay verwendet wird. Die obere Oberfläche der Basis kann flach sein, wie in 5c veranschaulicht, oder sie kann mit Einbuchtungen ausgeformt sein, die sich mit der Unterteilerform ausrichten, um vollständige Unterteilungen oder Wells innerhalb jedes Probenwells bereitzustellen. Die drei Stücke können durch Standardvorgänge verbunden werden, beispielsweise durch die bei der Anordnung von Siliciumwafern verwendeten Verfahren.
Oligonukleotidanker, Linkergruppen oder Detektoren können durch herkömmliche Techniken synthetisiert werden, z. B. mit einem kommerziellen Oligonukleotid-Synthesegerät und/oder durch aneinander Ligieren von Unterfragmenten, die so synthetisiert wurden. In einer Ausführungsform der Erfindung können vorgeformte Nukleinsäureanker, wie etwa Oligonukleotidanker, auf oder in der Oberfläche eines Testbereichs durch beliebige einer Vielfalt von herkömmlichen Techniken, einschließlich Photolithographie oder chemischer Siebdruckanbindung, Ablagerung durch Tintenstrahltechnologie, Kapillar-, Screen- oder Fluidkanalchip, elektrochemische Musterung unter Verwendung von Elektrodenanordnungen, Inkontaktbringen mit einer Nadel oder Feder oder Denaturierung und anschließendes Brennen oder UV-Bestrahlung auf Filtern positioniert werden (siehe z. B. Rava et al (1996). U.S.-Patent Nr. 5,545,531 ; Fodor et al (1996). U.S.-Patent Nr. 5,510,270 ; Zanzucchi et al (1997). U.S.-Patent Nr. 5,643,738 ; Brennan (1995). U.S.-Patent Nr. 5,474,796 ; PCT WO 92/10092 ; PCT WO 90/15070 ). Anker können auf die Oberseite der Oberfläche eines Testbereichs platziert werden oder beispielsweise bei einem Polyacrylamidgelpad in die Oberfläche derart eingebettet werden, dass ein Teil des Ankers von der Oberfläche weg steht und für Wechselwirkungen mit dem Linker verfügbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vorgeformte Oligonukleotidanker an dem 5'-Ende mit einer freien Aminogruppe derivatisiert; in einer Konzentration, die routinemäßig empirisch bestimmt wird (z. B. etwa 1 μM) in einem Puffer wie etwa 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5 und 1 mM EDTA gelöst; und mit einem Pixus-Nanojet-Spender (Cartesian Technologies) in Tröpfchen von etwa 10,4 Nanoliter auf spezifischen Positionen innerhalb eines Testfelds verteilt, dessen obere Oberfläche diejenige einer frischen, trockenen DNA-Bind Platte (Corning Costar) ist. Abhängig von der relativen Rate der Oligonukleotidanbindung und -verdampfung kann es erforderlich sein, die Feuchtigkeit in den Wells während der Herstellung zu kontrollieren. In einer anderen Ausführungsform können Oligonukleotidanker direkt auf der Oberfläche eines Testbereichs synthetisiert werden, wobei herkömmliche Verfahren verwendet werden, wie etwa z. B. Licht-aktiviertes Entschützen wachsender Oligonukleotidketten (z. B. in Verbindung mit der Verwendung einer ortsdirigierenden „Maske") oder mittels einer gemusterten Verteilung von Nanolitertröpfchen einer deaktivierenden Verbindung unter Verwendung eines Nanojet-Spenders. Das Entschützen aller wachsenden Sequenzen, die ein einzelnes Nukleotid erhalten sollen, kann beispielsweise durchgeführt werden und das Nukleotid kann dann über die Oberfläche hinzugefügt werden.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden die offenbarten Kombinationen in einer Vielfalt von Screeningverfahren verwendet und/oder um Informationen über das Ausmaß, die Aktivität oder die Struktur der Sonden oder Targetmoleküle zu erhalten. Solche Assays werden als Multi Array Plate Screen (MAPS)-Verfahren oder -Assays bezeichnet und die Oberflächen, welche Anordnungen von Ankern oder Ankern mit Sonden umfassen, die für die Assays verwendet werden, werden als MAPS-Anordnungen oder MAPS-Platten bezeichnet.
Jedes der nachstehend beschriebenen Assays oder Verfahren kann im Hochdurchsatz durchgeführt werden, wobei eine große Zahl von Proben (z. B. etwa ungefähr 864, 1036, 1536, 2025 oder mehr, abhängig von der Anzahl der Bereiche in der Kombination) auf jeder Platte oder Oberfläche schnell und gleichzeitig untersucht wird. Ferner können viele Platten oder Oberflächen gleichzeitig verarbeitet werden. In Verfahren zur Wirkstoffentdeckung kann beispielsweise eine große Zahl von Proben jeweils einen Wirkstoffkandidaten umfassen (z. B. ein Mitglied einer kombinatorischen Chemiebibliothek, wie etwa Varianten kleiner Moleküle, Peptide, Oligonukleotide oder anderer Substanzen), zu separaten Bereichen einer Kombination wie beschrieben hinzugefügt werden oder zu biologischen oder biochemischen Proben hinzugefügt werden, die dann zu separaten Bereichen einer Kombination hinzugefügt werden und mit Sondenanordnungen, die in den Bereichen angeordnet sind, inkubiert werden; und Assays können an jeder der Proben durchgeführt werden. In Verbindung mit der vor kurzem begonnenen und andauernden Entwicklung hochdichter Mikroplatten, DNA-Spottingwerkzeugen und Verfahren wie etwa der Lasertechnologie zur Erzeugung und Sammlung von Daten aus noch dichteren Mikroplatten, Robotertechnik, verbesserter Spender, fortgeschrittener Detektionssysteme und Datenverwaltungssoftware, können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um tausende oder zehntausende oder mehr von Verbindungen pro Tag zu screenen oder zu analysieren.
Der Assay kann ein diagnostisches Nukleinsäure- oder Polynukleotidscreening (z. B. ein Bindungsassay oder ein anderer Assay) einer großen Zahl von Proben auf das Vorhandensein genetischer Variationen oder Defekte (z. B. Polymorphismen oder spezifischer Mutationen in Verbindung mit Erkrankungen wie etwa zystischer Fibrose. Siehe z. B. litia et al (1992). Molecular and Cellular Probes 6, 505–512)); pathogener Organismen (wie etwa Bakterien, Viren und Protozoen, deren Wirte Tiere einschließlich Menschen oder Pflanzen sind) oder mRNA-Transkriptionsmuster, die diagnostisch für bestimmte physiologische Zustände oder Erkrankungen sind, sein. Nukleinsäuresonden-Anordnungen, die Abschnitte von ESTs umfassen (einschließlich Volllängenkopien), können verwendet werden, um Transkriptionsmuster von Zellen, von denen die ESTs gewonnen wurden (oder anderen), zu beurteilen.
Selbstverständlich können MAPS-Assays verwendet werden, um die Menge an aktivem Target in einer Probe quantitativ zu bestimmen (zu messen, zu quantifizieren), unter der Voraussetzung, dass die Sonde nicht vollständig besetzt ist, das heißt, dass nicht mehr als etwa 90% der verfügbaren Sondenstellen mit Target verbunden (oder reagiert oder hybridisiert) sind. Unter diesen Bedingungen kann das Target quantitativ bestimmt werden, da das Vorhandensein von mehr Target dazu führt, dass mehr Sonde gebunden ist. Andererseits würde unter Bedingungen, bei denen mehr als 90% der verfügbaren Sondenstellen gebunden sind, die Menge des an Sonde gebundenen Targets nicht wesentlich zunehmen wenn mehr Target vorhanden ist. Beliebige der vorstehend erwähnten Arten von Targets können auf diese Weise quantitativ bestimmt werden. Beispielsweise beschreibt Beispiel 6 die quantitative Bestimmung von Oligonukleotidtargets. Außerdem wird dort gezeigt, dass selbst wenn ein Target in großem Überschuss vorhanden ist (z. B. wenn es in so großen Mengen vorhanden ist, dass es die Menge der verfügbaren Sonden in einer MAPS-Sondenanordnung sättigt), durch Zugabe bekannter Mengen an nicht-markiertem Target zu dem Bindungsgemisch eine „Sensitivitätsverschiebung" der Reaktion erreicht werden kann, um eine quantitative Bestimmung selbst so großer Mengen an Target zu ermöglichen.
In einer anderen Ausführungsform können die Verfahren der Erfindung verwendet werden, um nach Mitteln zu screenen, welche ein Muster der Genexpression modulieren. Anordnungen von Oligonukleotiden können beispielsweise verwendet werden, um mRNA-Spezies zu identifizieren, deren Expressionsmuster aus einer Gruppe von Genen mit einem bestimmten physiologischen Zustand oder Entwicklungsstadium oder mit einem Erkrankungszustand korreliert ist („korrelative” Gene, RNAs oder Expressionsmuster). Mit den Begriffen „korreliert" oder „korrelativ" ist gemeint, dass das Synthesemuster der RNA mit dem physiologischen Zustand einer Zelle assoziiert ist, aber dass nicht notwendigerweise die Expression einer bestimmten RNA für einen bestimmten physiologischen Zustand verantwortlich oder ursächlich ist. Beispielsweise kann eine kleine Untergruppe von mRNAs identifiziert werden, die in Zellen exprimiert, aufreguliert und/oder abreguliert sind, die als Modell für einen bestimmten Erkrankungszustand dienen; dieses veränderte Muster der Expression im Vergleich zu demjenigen in einer normalen Zelle, die einen pathologischen Phänotyp nicht aufweist, kann als Indikator für den Erkrankungszustand dienen („Indikator”-Gene, -RNAs oder -Expressionsmuster). Die Begriffe „korrelativ" und „Indikator" können austauschbar verwendet werden. Beispielsweise weisen Zellen, die mit einem Tumorpromotor wie etwa Phorbolmyristat behandelt wurden, möglicherweise ein Muster der Genexpression auf, welches dasjenige imitiert, das in den frühen Stadien des Tumorwachstums zu beobachten ist. In einem anderen Krebsmodell zeigen Mäuse-Insulinom-Zellen (z. B. Zelllinie TGP61) bei der Infektion mit Adenovirus eine Zunahme der Expression von z. B. c-Jun und MIP-2, während die Expression von Haushaltsgenen wie etwa GAPDH und 132 im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt.
Mittel, die nach Inkontaktbringen einer Zelle eines Erkrankungsmodells entweder direkt oder indirekt und entweder in vivo oder in vitro (z. B. in Gewebekultur) das Indikator-Expressionsmuster modulieren, könnten als therapeutische Mittel oder Wirkstoffe für Organismen dienen (z. B. Menschen oder andere tierische Patienten oder Pflanzen), die an der Erkrankung leiden: Mittel können außerdem Expressionsmuster modulieren, indem die Nukleinsäure direkt, z. B. in einem in vitro-Expressionssystem (Teströhrchen) in Kontakt gebracht wird. Wie hierin verwendet, bedeutet „modulieren", dass eine Zunahme oder Verringerung der Menge und/oder der Aktivität eines Moleküls oder dergleichen, das an einer messbaren Reaktion beteiligt ist, hervorgerufen wird. Die erfindungsgemäßen Kombinationen können für das Screening nach solchen Mitteln verwendet werden. Beispielsweise kann eine Reihe von Zellen (z. B. aus einem Erkrankungsmodell) mit einer Reihe von Mitteln in Kontakt gebracht werden (z. B. für einen Zeitraum im Bereich von etwa 10 Minuten bis zu etwa 48 Stunden oder mehr) und unter Verwendung von routinemäßigen im Fachbereich anerkannten Verfahren (z. B. kommerziell erhältlichen Kits) können Gesamt-RNA oder mRNA-Extrakte erhalten werden. Wenn es erforderlich ist, die Menge der RNA zu amplifizieren, so können Standardverfahren, wie etwa die RT-PCR-Amplifikation verwendet werden (siehe z. B. Innis et al Hrsg. (1996) PCR Protocols: A Guide to Methods in Amplification, Academic Press, New York). Die Extrakte (oder die daraus amplifizierten Produkte) können in Kontakt gebracht werden (z. B. inkubiert) mit einer Vielfalt von im Wesentlichen identischen Anordnungen, die Sonden für entsprechende Indikator-RNAs umfassen, und diejenigen Mittel, die mit einer Veränderung des Indikator-Expressionsmusters im Zusammenhang stehen, können identifiziert werden. Beispiel 15 beschreibt einen Hochdurchsatzassay zum Screenen nach Verbindungen, welche die Expression von Genen verändern können, die korrelativ mit einem Erkrankungszustand sind.
Ähnlich können Mittel identifiziert werden, welche Expressionsmuster modulieren, die im Zusammenhang mit bestimmten physiologischen Zuständen oder Entwicklungsstadien stehen. Solche Mittel können künstlich hergestellte oder natürlich auftretende Substanzen sein, einschließlich Umgebungsfaktoren wie etwa Substanzen, die an der embryonalen Entwicklung oder an regulatorischen physiologischen Reaktionen beteiligt sind, oder Substanzen, die in der Landwirtschaft von Bedeutung sind, wie etwa Pestizide oder Herbizide. Außerdem können solche Mittel in unverändertem Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies verwendet werden und sie können kovalent oder nicht kovalent an ein Bindungsglied angebunden werden, entweder direkt oder über eine spezifische Bindungssubstanz.
In einem Kit, der für den Nachweis von wenigstens einem Target in einer Probe geeignet ist, ist umfasst:

a) eine Oberfläche, umfassend mehrfache räumlich getrennte Bereiche, von denen wenigstens zwei im Wesentlichen identisch sind, wobei jeder Bereich wenigstens acht verschiedene Anker umfasst (Oligonukleotide oder eine der anderen beschriebenen Arten),
b) einen Behälter, umfassend wenigstens ein bifunktionales Linkermolekül, das einen ersten Abschnitt aufweist, der spezifisch ist für wenigstens einen der Anker, und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde umfasst, die spezifisch ist für das wenigstens eine Target

Wie an anderer Stelle in dieser Anmeldung diskutiert, kann ein Fachmann an eine erfindungsgemäße Oberfläche, die eine bestimmte Anordnung (oder Anordnungen) von Ankern umfasst, eine breite Vielfalt von Linkertypen anbinden und dabei beliebige einer breiten Vielfalt von Sondenaanordnungen programmieren. Außerdem kann ein Fachmann eine gegebene Gruppe von Linkern von einer erfindungsgemäßen Oberfläche entfernen und dazu eine andere Gruppe von Linkern hinzufügen (entweder dieselben oder andere als die erste Gruppe), wodurch ermöglicht wird, dass eine gegebene Oberfläche mehrmals wiederverwendet werden kann. Diese Flexibilität und Wiederverwendbarkeit stellen weitere Vorteile der Erfindung dar.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Kombinationen verwendet werden, um ESTs (Expressed Sequence Tags) zu kartieren. Dies bedeutet, MAPS-Assays können verwendet werden, um zu bestimmen, welche, falls überhaupt, einer Gruppe von ESTs aus verschiedenen (oder teilweise überlappenden) Abschnitten desselben Gens erzeugt wurden und welche, falls überhaupt, einzigartig sind. Die 18, 19, 20 und 21 veranschaulichen einen solchen Assay, in diesem Beispiel einen Assay für die Bestimmung, welche, falls überhaupt, von 16 ESTs mit einem gemeinsamen Gen „verknüpft" sind. Ein erster Schritt des Assays (siehe 18) ist die Assemblierung von Anordnungen, in denen jedes der zu kartierenden ESTs durch wenigstens eine Oligonukleotidsonde, welche diesem entspricht, repräsentiert wird. Eine Zahl von Anordnungen, die gleich (oder größer) der Anzahl der zu kartierenden ESTs ist, wird in separaten Bereichen (z. B. Wells) einer Oberfläche verteilt; in dem veranschaulichten Beispiel umfasst die Oberfläche der Kombination 16 Wells, die jeweils eine Anordnung von 16 unterschiedlichen EST-spezifischen Oligonukleotiden enthalten, die mit 1–16 bezeichnet sind. Ein Oligonukleotid, welches einem EST „entspricht" (EST-spezifisch ist), ist eines, das ausreichend komplementär zu einem EST ist, so dass unter ausgewählten stringenten Hybridisierungsbedingungen das Oligonukleotid spezifisch an den EST, aber nicht an andere, unverwandte ESTs hybridisiert. Ein EST-entsprechendes Oligonukleotid dieser Art kann spezifisch (unter optimalen Bedingungen) an den kodierenden oder nicht kodierenden Strang einer cDNA, die aus dem Gen, von dem der EST ursprünglich erzeugt wurde, oder an eine mRNA, die aus dem Gen, von dem der EST ursprünglich erzeugt wurde, synthetisiert ist, binden. Faktoren, die bei dem Design von Oligonukleotiden zu berücksichtigen sind und Hybridisierungsparameter, die optimiert werden sollten, um eine spezifische Hybridisierung zu erzielen, werden an anderer Stelle in dieser Anmeldung diskutiert. Um die Anordnungen zu assemblieren, werden Linkermoleküle hergestellt, die jeweils eine Gruppe umfassen, die spezifisch ist für einen der Anker einer generischen Anordnung, und eine Gruppe, die eine Oligonukleotidsonde umfasst, die einem der zu kartierenden ESTs entspricht; und die Linker werden an Anker angebunden, wie an anderer Stelle in dieser Anmeldung beschrieben. In einem anschließenden Schritt wird ein Aliquot einer Probe, die ein Gemisch von Nukleinsäuren (z. B. mRNA oder einzelsträngige oder denaturierte cDNA), welche Sequenzen enthalten können, die komplementär zu einer oder mehreren der Oligonukleotidsonden sind, zu jedem der Bereiche (Wells), die eine Sondenanordnung umfassen, hinzugefügt; das Gemisch wird dann unter routinemäßig bestimmten optimalen Bedingungen inkubiert, wobei eine Anbindung der Nukleinsäure an komplementäre Sonden ermöglicht wird. Wenn verschiedene der EST-spezifischen Sonden komplementär zu unterschiedlichen Abschnitten einer einzelnen Nukleinsäure sind, so wird diese Nukleinsäure an jede der Stellen in der Anordnung binden, an denen eine dieser Sonden lokalisiert ist.
In einem anschließendem Schritt wird ein anderes Detektoroligonukleotid (in dem veranschaulichten Beispiel Detektoren #1 bis 16) zu jedem Bereich (Well) hinzugefügt (siehe 19). Für jeden der zu kartierenden ESTs wird ein Detektoroligonukleotid konzipiert. Jeder EST-spezifische Detektor entspricht einem anderen (zumindest teilweise nicht überlappenden) Abschnitt des EST als das Sondenoligonukleotid, so dass die Sonde und die Detektoroligonukleotide einander nicht stören. Man beachte beispielsweise die in 21 abgebildeten ESTs, die den ESTs 1, 2 und 6 der 18–20 entsprechen. 21 zeigt, dass die ESTs #1 und #2 beide aus Gen X erhalten wurden (sie sind „verknüpft"), wohingegen EST #6 aus einem anderen, nicht verwandten Gen erhalten wurde. Wenn Aliquote einer Probe, die ein Gemisch von mRNAs einschließlich einer aus Gen X erzeugten mRNA, enthält, mit den in den 18–20 gezeigten Sondenanordnungen inkubiert werden, so wird die Gen X mRNA unter optimalen Bedingungen an den Positionen (Loki) mit den Sonden 1 und 2 hybridisieren, aber nicht an denen mit Sonde 3. (Selbstverständlich muss jede mRNA in molarem Überschuss gegenüber der Summe der Sonden, an die sie hybridisieren kann, hinzugefügt werden.) Wenn Detektoroligonukleotid 1 zu Bereich (Well) 1 hinzugefügt wird, so wird es an die Gen X-mRNA hybridisieren, die an die Positionen 1 und 2 der Sondenanordnung gebunden ist, aber nicht an Position 6. Ähnlich wird, wenn Detektoroligonukleotid 2 zu einem anderen Well, etwa Well #2, hinzugefügt wird, dieses ebenfalls an die Positionen 1 und 2, aber nicht 6, binden. Auf diese Weise kann im Hochdurchsatzverfahren bestimmt werden, welche der ESTs verknüpft sind, d. h. für Abschnitte desselben Gens kodieren, und welche ESTs einzigartig sind. Für das in 20 gezeigte hypothetische Beispiel kodieren die ersten 3 ESTs Abschnitte desselben Gens, die letzten 5 ESTs kodieren Abschnitte eines anderen Gens und die verbleibenden ESTs scheinen nicht verknüpft zu sein. Die Bedingungen der Hybridisierung, optionale Waschschritte, Detektionsverfahren und dergleichen, werden in dieser Anmeldung an anderer Stelle im Hinblick auf andere MAPS-Assays diskutiert. Um die durch den MAPS-Assay erhaltenen Verknüpfungsdaten zu bestätigen, könnten PCR-Reaktionen unter Verwendung von Paaren von EST-spezifischen Oligonukleotidsonden als Sense- und Antisense-Primer durchgeführt werden. Jedes Paar von verknüpften ESTs sollte ein PCR-Produkt ergeben. Man bemerke, dass dieser paarweise PCR-Test durchgeführt werden könnte, um eine Verknüpfung direkt ohne Verwendung des Verknüpfungs-MAPS-Assays zu bestimmen; es wären jedoch viele Reaktionen erforderlich und jeder EST-Primer müsste sowohl als Sense- als auch als Antisensestrang synthetisiert werden. Für das illustrierte Beispiel wären 180 solcher Reaktionen erforderlich.
Ein Verfahren zur Bestimmung, welche einer Vielzahl von ESTs komplementär zu einer bestimmten Nukleinsäure sind, ist vorgesehen, umfassend

a) Inkubieren einer immobilisierten Anordnung von Oligonukleotidsonden, von denen wenigstens eine zu jedem der ESTs korrespondiert, mit einer Testprobe, die die bestimmte Nukleinsäure enthalten kann, um ein Hybridisierungsprodukt zwischen den Oligonukleotidsonden und der Nukleinsäure zu erhalten,
b) Inkubieren des Hybridisierungsproduktes mit einem Detektoroligonukleotid, welches einem EST entspricht, dem eine der Oligonukleotidsonden entspricht, welches aber spezifisch für einen anderen Abschnitt des ESTs ist als die Oligonukleotidsonde, und
c) Bestimmen, welche Oligonukleotidsonden der Anordnung durch das Detektoroligonukleotid markiert sind,

1) eine Oberfläche umfassend eine Anzahl räumlich getrennter, im Wesentlich identischer Bereiche, die gleich der Anzahl an zu untersuchenden ESTs ist, wobei jeder Bereich umfasst
2) eine Anzahl verschiedener Anker, die gleich der Anzahl zu untersuchender ESTs ist, wobei jeder Anker in Verbindung ist mit
3) einem bifunktionalen Linker, der einen ersten Abschnitt aufweist, der spezifisch ist für den Anker, und einen zweiten Abschnitt, der eine Oligonukleotidsonde umfasst, die wenigstens einem der ESTs entspricht.

Ein oder mehrere der ESTs können komplementär zu der Nukleinsäure sein und jeder der ESTs umfasst zwei verschiedene Oligonukleotidsequenzen, von denen die erste eine Oligonukleotidsonde definiert, die dem EST entspricht, und die zweite ein Detektoroligonukleotid definiert, welches dem EST entspricht, umfassend

a) Inkontaktbringen einer Probe, welche Moleküle der Nukleinsäure umfasst, mit wenigstens einem Bereich einer Kombination, wobei der Bereich eine Anordnung von Oligonukleotidsonden umfasst, von denen wenigstens eine jedem der ESTs entspricht,
b) Inkubieren der Probe mit dem Bereich und dadurch eine Bindung der Moleküle der Nukleinsäure an die EST-entsprechenden Oligonukleotidsonden, die komplementär zu Abschnitten der Nukleinsäure sind, ermöglichen,
c) Inkubieren des Bereichs, welcher Moleküle der Nukleinsäure gebunden an ein oder mehrere der EST-entsprechenden Oligonukleotidsonden umfasst, mit einem Detektoroligonukleotid, welches einem EST entspricht, dem eine bestimmte der Oligonukleotidsonden der Anordnung entspricht und dadurch Binden von Detektoroligonukleotiden an Nukleinsäuremoleküle, die an die bestimmte Oligonukleotidsonde oder an andere Oligonukleotidsonden, die komplementär zu der Nukleinsäure sind, gebunden haben,
d) Nachweisen des Vorhandenseins der Detektoroligonukleotide und dadurch Identifizieren, welche EST-entsprechenden Oligonukleotidsonden der Anordnung komplementär zu Abschnitten einer Nukleinsäure sind, die an die bestimmte Oligonukleotid-EST-entsprechende Sonde binden, dadurch Identifizieren, welche ESTs komplementär zu der bestimmten Nukleinsäure sind, worin die Anordnung von Nukleotidsonden an einem Bereich einer Kombination immobilisiert ist, worin die Kombination umfasst 1) eine Oberfläche, die eine Anzahl von räumlich getrennten, im Wesentlichen identischen Bereichen umfasst, die gleich ist der Anzahl der zu untersuchenden ESTs, wobei jeder Bereich umfasst 2) eine Anzahl verschiedener Anker, die gleich ist der Anzahl der zu untersuchenden ESTs, wobei jeder Anker in Verbindung ist mit 3) einem bifunktionalen Linker, der einen ersten Abschnitt aufweist, der für den Anker spezifisch ist, und einen zweiten Abschnitt, der eine Oligonukleotidsonde umfasst, die wenigstens einem der ESTs entspricht.

Die Bestandteile eines EST-Kartierungsassays können in beliebiger Reihenfolge angeordnet werden. Beispielsweise können die Anker, Linker und ESTs nacheinander angeordnet werden oder Linker und ESTs können in Gegenwart oder Abwesenheit von Reportern in Lösung angeordnet und dann zu den Ankern hinzugefügt werden.
Außerdem ist ein Verfahren vorgesehen, um zu bestimmen, welche von einer Vielzahl von ESTs komplementär zu einer bestimmten Nukleinsäure sind, umfassend

a) Inkubieren einer Sammlung von bifunktionellen Oligonukleotidlinkermolekülen, von denen jedes einen ersten Abschnitt umfasst, der eine Sonde ist, die wenigstens einem der ESTs entspricht, und einen zweiten Abschnitt, der spezifisch ist für ein Ankeroligonukleotid, mit einer Testprobe, die die bestimmte Nukleinsäure enthalten kann, um ein erstes Hybridisierungsprodukt zwischen den Oligonukleotidsonden und der Nukleinsäure zu erhalten,
b) Inkubieren des ersten Hybridisierungsproduktes mit einer immobilisierten Anordnung von Ankeroligonukleotiden, wobei jedes Ankeroligonukleotid dem Anker-spezifischen Abschnitt wenigstens eines der Linkermoleküle entspricht, um ein zweites Hybridisierungsprodukt zu bilden, welches die Anker, die Oligonukleotidsonden und die Nukleinsäure umfasst, und
c) Inkubieren entweder des ersten oder des zweiten Hybridisierungsproduktes mit einem Detektoroligonukleotid, welches einem EST entspricht, welches einer der Oligonukleotidsonden entspricht, welches aber spezifisch für einen anderen Abschnitt des EST ist als die Oligonukleotidsonde, und
d) Nachweisen, welche Oligonukleotidsonden der Anordnung durch das Detektoroligonukleotid markiert werden,

1) eine Oberfläche, umfassend eine Anzahl von räumlich getrennten, im Wesentlichen identischen Bereichen, die gleich ist der Anzahl der zu untersuchenden ESTs, wobei jeder Bereich umfasst
2) eine Anzahl verschiedener Anker, die gleich ist der Anzahl der zu untersuchenden ESTs.

Selbstverständlich können die vorstehenden Verfahren zur Kartierung von ESTs verwendet werden, um Testsequenzen (z. B. Polynukleotide) an einer beliebigen Nukleinsäure von Interesse zu kartieren. Beispielsweise kann bestimmt werden, ob zwei oder mehr klonierte DNA-Fragmente oder cDNAs zu derselben genomischen DNA kartieren. Eine solche Vorgehensweise könnte beispielsweise bei der strukturellen Aufklärung langer komplexer Gene helfen. Auf ähnliche Weise kann bestimmt werden, ob ein oder mehrere ausgesplicete Sequenzen oder kodierende Sequenzen zu der selben genomischen DNA kartieren. Eine solche Bestimmung könnte beispielsweise verwendet werden in einem diagnostischen Test, um zwischen einem normalen und einem Erkrankungszustand zu unterscheiden, die durch unterschiedliche Splicingmuster gekennzeichnet sind. Zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten des Kartierungsverfahrens werden für einen Fachmann offensichtlich sein.
Außerdem ist ein Verfahren vorgesehen, um zu bestimmen, welche einer Vielzahl von Polynukleotiden komplementär zu einer bestimmten Nukleinsäure sind, worin ein oder mehrere der Polynukleotide komplementär zu der Nukleinsäure sein können und worin jedes der Polynukleotide zwei unterschiedliche Oligonukleotidsequenzen umfasst, von denen die erste eine Oligonukleotidsonde definiert, die dem Polynukleotid entspricht, und die zweite ein Detektoroligonukleotid definiert, welches dem Polynukleotid entspricht, umfassend

a) Inkontaktbringen einer Probe, welche Moleküle der Nukleinsäure umfasst, mit wenigstens einem Bereich einer Kombination, wobei der Bereich eine Anordnung von Oligonukleotidsonden umfasst, von denen wenigstens eine jedem der Polynukleotide entspricht,
b) Inkubieren der Probe mit dem Bereich und dadurch Ermöglichen einer Bindung der Moleküle der Nukleinsäure an die Polynukleotid-entsprechenden Oligonukleotidsonden, die komplementär zu Abschnitten der Nukleinsäure sind,
c) Inkubieren des Bereichs, welcher Moleküle der Nukleinsäure gebunden an ein oder mehrere der Polynukleotid-entsprechenden Oligonukleotidsonden umfasst, mit einem Detektoroligonukleotid, welches einem Polynukleotid entspricht, dem eine bestimmte der Oligonukleotidsonden der Anordnung entspricht, und dadurch Anbinden von Detektoroligonukleotiden an Nukleinsäuremoleküle, die an die bestimmte Oligonukleotidsonde oder an andere Oligonukleotidsonden gebunden haben, die komplementär zu der Nukleinsäure sind,
d) Nachweisen des Vorhandenseins der Detektoroligonukleotide und dadurch Identifizieren, welche Polynukleotid-entsprechenden Oligonukleotidsonden der Anordnung komplementär zu Abschnitten einer Nukleinsäure sind, die an die bestimmte Oligonukleotid-Polynukleotid-entsprechende Sonde bindet, dadurch Identifizieren, welche Polynukleotide komplementär zu der bestimmten Nukleinsäure sind,

1) eine Oberfläche, umfassend eine Anzahl von räumlich getrennten, im Wesentlichen identischen Bereichen, die gleich ist der Anzahl von zu untersuchenden Polynukleotiden, wobei jeder Bereich umfasst
2) eine Anzahl unterschiedlicher Anker, die gleich ist der Anzahl von zu untersuchenden Polynukleotiden, wobei jeder Anker in Verbindung ist mit
3) einem bifunktionalen Linker, der einen ersten Abschnitt aufweist, der spezifisch ist für den Anker, und einen zweiten Abschnitt, der eine Oligonukleotidsonde umfasst, die wenigstens einem der Polynukleotide entspricht.

Die vorstehenden Verfahren für die Kartierung von ESTs oder anderen Polynukleotiden kann ferner das Entfernen ungebundener Anteile der Probe zwischen einem oder mehreren der Schritte umfassen.
Ein oder mehrere RNA-Targets von Interesse (z. B. mRNA oder andere Arten von RNA) können durch reverse Transkriptase in cDNAs umgewandelt werden und diese cDNAs werden dann an eine Sondenanordnung hybridisiert. Diese Art eines Assays ist schematisch in 8 veranschaulicht. RNA-Extrakte (oder gereinigte mRNA) werden aus Zellen oder Geweben wie hierin beschrieben hergestellt. Reverse Transkriptase- und Oligonukleotidprimer, die spezifisch für die RNAs von Interesse sind, werden dann zu der RNA-Probe hinzugefügt und unter Verwendung von im Fachbereich anerkannten Bedingungen und Vorgehensweisen, die routinemäßig bestimmt und optimiert werden können, werden die ersten Stränge von cDNAs erzeugt. Der Begriff „spezifischer" Primer bezeichnet einen Primer, der ausreichend komplementär zu einer mRNA von Interesse ist, um daran unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen zu binden und um durch reverse Transkriptase erkannt zu werden, der aber nicht an ungewünschte Nukleinsäure bindet (siehe oben für eine Diskussion entsprechender Reaktionsbedingungen, um eine spezifische Hybridisierung zu erzielen). Restliche RNA – mRNAs, die nicht von den spezifischen Primern erkannt werden und/oder Arten kontaminierender RNAs in einem RNA-Extrakt wie etwa tRNA oder rRNA – können durch beliebige einer Vielfalt von Ribonukleasen oder durch chemische Verfahren, wie etwa die Behandlung mit Alkali, entfernt werden, wobei die einzelsträngige cDNA zurückbleibt, die anschließend in Kontakt mit einer MAPS-Sondenanordnung gebracht wird. Die Verwendung von reverser Transkriptase in diesem Verfahren minimiert das Erfordernis einer ausgiebigen Handhabung von RNA, die empfindlich gegenüber einer Zersetzung durch Nukleasen sein kann und somit in der Handhabung problematisch ist. Außerdem verleiht die durch die spezifischen reversen Transkriptaseprimer erzeugte zusätzliche Spezifität dem Assay ein zusätzliches Maß an Spezifität.
Wahlweise können die vorstehend beschriebenen cDNAs vor der Hybridisierung an die Sondenanordnung amplifiziert werden, um die Signalstärke zu erhöhen. Die Oligonukleotid-reversen Transkriptaseprimer, die vorstehend beschrieben wurden, können an ihren 5'-Enden Sequenzen umfassen (die etwa 22–27 Nukleotide lang sein können), die Initiierungsstellen für eine RNA-Polymerase spezifizieren (z. B. T7, T3 oder SP2-Polymerase oder dergleichen). In dem in 8 gezeigten Beispiel wurde eine T7-Promotorsequenz an den reversen Transkriptaseprimer hinzugefügt. Die Polymeraseerkennungsstelle wird in die cDNA eingefügt und kann dann als Erkennungsstelle für mehrfache Runden der Transkription mittels der entsprechenden RNA-Polymerase dienen (in vitro-Transkription oder IVT). Wahlweise können die so erzeugten mRNAs unter Verwendung von PCR und entsprechenden Primern weiter amplifiziert werden oder die cDNA selbst kann so amplifiziert werden. Verfahren zur Transkription und PCR sind Routine und im Fachbereich gut bekannt.
Das vorstehend beschriebene Verfahren, bei dem mRNA-Targets mittels reverser Transkriptase in cDNA umgewandelt werden, bevor ein Test auf MAPS-Platten erfolgt, kann anstelle des Standard-MAPS-Assayverfahrens für beliebige der vorstehend beschriebenen RNA-basierten Assays verwendet werden.
Gemäß der Erfindung werden ein oder mehrere Nukleinsäuretargets von Interesse an spezifische Polynukleotidschutzfragmente hybridisiert und einem Nukleaseschutzverfahren unterzogen, und diejenigen Schutzfragmente, die an die Targets von Interesse hybridisiert haben, werden auf MAPS-Platten getestet. Wenn das Target von Interesse eine RNA ist und das Schutzfragment DNA ist, so kann durch einen Nukleaseschutz/MAPS-Assay (NPA-MAPS) das Erfordernis einer ausgiebigen Handhabung von RNA, die empfindlich gegenüber einer Zersetzung durch verunreinigende Nukleasen und daher schwierig handzuhaben sein kann, verringert werden. In einem solchen NPA-MAPS-Assay sind die Sonden in der Sondenanordnung Oligonukleotide derselben Strängigkeit wie die Nukleinsäuretargets von Interesse und nicht komplementär zu diesen, wie in einem Standard-MAPS-Assay. Ein Beispiel eines NPA-MAPS-Assays ist schematisch in 9 wiedergegeben.
In einem NPA-MAPS-Assay kann das Target von Interesse eine beliebige Nukleinsäure sein, z. B. genomische DNA, cDNA, virale DNA oder RNA, rRNA, tRNA, mRNA, Oligonukleotide, Nukleinsäurefragmente, modifizierte Nukleinsäuren, synthetische Nukleinsäuren oder dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren verwendet, um auf ein oder mehrere mRNA-Targets zu testen, die in einem Gewebe oder Zell-RNA-Extrakt vorhanden sind. Eine Probe, welche das Target/die Targets von Interesse erhält, wird zunächst unter ausgewählten Stringenzbedingungen hybridisiert (siehe oben für eine Diskussion geeigneter Reaktionsbedingungen, um eine spezifische Hybridisierung zu erzielen) an ein oder mehrere spezifische Schutzfragmente. Ein Schutzfragment ist ein Polynukleotid, welches beispielsweise RNA, DNA (einschließlich eines PCR-Produkts), PNA oder eine modifizierte oder substituierte Nukleinsäure sein kann, die spezifisch für einen Abschnitt eines Nukleinsäuretargets von Interesse ist. Mit einem „spezifischen" Schutzfragment ist ein Polynukleotid gemeint, das ausreichend komplementär zu seinem angedachten Bindungspartner ist, um an diesen unter ausgewählten stringenten Bedingungen zu binden, welches aber nicht an andere, unbeabsichtigte Nukleinsäuren bindet. Ein Schutzfragment kann eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden, vorzugsweise 50 bis etwa 100, oder etwa die Länge einer Volllängen-cDNA aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Schutzfragmente einzelsträngige DNA-Oligonukleotide. Schutzfragmente, die spezifisch sind für etwa 100 Targets oder mehr können in einer einzelnen Hybridisierungsreaktion umfasst sein. Nach Hybridisierung wird die Probe mit einem Cocktail einer oder mehrerer Nukleasen behandelt, um so im Wesentlichen alle Nukleinsäuren mit Ausnahme des Schutzfragments/der Schutzfragmente, die an die Nukleinsäuren) von Interesse hybridisiert haben und (ggf.) die Abschnitte von Nukleinsäuretarget, die hybridisiert haben und vor Nukleaseverdau bei dem Nukleaseschutzverfahren geschützt worden sind (in einem Duplexhybrid) zu zerstören. Wenn beispielsweise die Probe ein Zellextrakt umfasst, so können unerwünschte Nukleinsäuren, wie etwa genomische DNA, tRNA, rRNA und mRNA, abgesehen von denjenigen von Interesse, im Wesentlichen in diesem Schritt zerstört werden. Es können beliebige einer Vielfalt von Nukleasen verwendet werden, einschließlich z. B. pankreatische RNAse, Mungobohnennuklease, S1-Nuklease, RNAse A, Ribonuklease T1, Exonuklease III oder dergleichen, abhängig von der Beschaffenheit der hybridisierten Komplexe und von den unerwünschten Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind. RNAse H kann besonders geeignet sein für den Verdau restlicher RNA, die an ein DNA-Schutzfragment gebunden ist. Die Reaktionsbedingungen für diese Enzyme sind im Fachbereich gut bekannt und können empirisch optimiert werden. Außerdem können chemische Verfahren verwendet werden, z. B. Alkalihydrolyse von RNA. Je nach Bedarf können die Proben weiter durch gut bekannte Vorgehensweisen des Standes der Technik behandelt werden, um nicht hybridisiertes Material zu entfernen und/oder um restliche Enzyme zu inaktivieren oder zu entfernen (z. B. Phenolextraktion, Präzipitation, Säulenfiltration etc.). Das Verfahren der Hybridisierung gefolgt von Nukleaseverdau und (ggf.) chemischem Abbau wird als Nukleaseschutzverfahren bezeichnet; es wurde eine Vielfalt von Nukleaseschutzverfahren beschrieben (siehe z. B. Lee et al (1987). Meth. Enzymol. 152, 633–648. Zinn et al (1983). Cell 34, 865–879.). Proben, die durch Nukleaseschutz gefolgt von einem (optionalen) Verfahren zur Inaktivierung von Nukleasen behandelt wurden, werden in Kontakt mit einer MAPS-Sondenanordnung gebracht und die üblichen Schritte eines MAPS-Assays werden durchgeführt. Gebundene Schutzfragmente können mittels Hybridisierung markierter Target-spezifischer Reporter nachgewiesen werden, wie hierin für Standard-MAPS-Tests beschrieben, oder die Schutzfragmente selbst können markiert werden, kovalent oder nicht-kovalent, mit einem nachweisbaren Molekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Schutzfragment z. B. eher direkt markiert und nicht mittels Hybridisierung an einen Target-spezifischen Rezeptor markiert. Beispielsweise ist der Rezeptor an das Schutzfragment über eine Ligand-Antiligand-Wechselwirkung angebunden, z. B. wird ein Streptavidin-Enzym-Komplex zu einem biotinylierten Schutzoligonukleotid hinzugefügt. In einem anderen Beispiel ist das Schutzfragment chemisch modifiziert (z. B. durch direkte Kopplung von Meerrettichperoxidease (HRP) oder einem Fluoreszenzfarbstoff) und diese chemische Modifikation wird nachgewiesen, entweder mit dem Nukleinsäureabschnitt des Schutzfragmentes oder ohne dieses (z. B. nach Spaltung der Modifikation, beispielsweise mittels enzymatischer oder chemischer Behandlung). In beliebigen der vorstehenden Verfahren kann ein Schutzfragment bevor oder nachdem es an ein entsprechendes Linkermolekül hybridisiert hat, markiert werden.
Um zu kontrollieren, dass das Nukleaseschutzverfahren korrekt funktioniert hat, d. h. dass nicht-hybridisierte Nukleinsäuren wie gewünscht verdaut wurden, ist es möglich, ein oder mehrere Schutzfragmente zu entwerfen, die überhängende (nicht-hybridisierende) Segmente enthalten, welche durch die Nukleasen abgespalten werden sollten, wenn das Verfahren korrekt funktioniert. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit der überhängenden Fragmente kann mittels Hybridisierung mit einer komplementären markierten Nachweissonde bestimmt werden, oder der überhängende Abschnitt des Schutzfragmentes kann selbst markiert werden, kovalent oder nicht-kovalent, mit einem nachweisbaren Molekül. Diese Kontrolle kann durchgeführt werden, bevor die Probe in Kontakt mit der Sondenanordnung gebracht wird, oder als Teil des MAPS-Assays selbst. Ein Beispiel eines solchen Kontrollassays ist in Beispiel 15 beschrieben. Selbstverständlich können, da verschiedene Markierungen leicht zu unterscheiden sind (z. B. Fluorophore mit unterschiedlichen Absorptionsspektren), mehrere unterschiedlich markierte Oligonukleotide in einem einzelnen Assay enthalten sein. Weiter wird der Standardnukleaseschutzassay gemäß Analyse durch Gelelektrophorese während der Assayentwicklung verwendet, um zu bestätigen, dass die Schutzfragmente wie erwartet verarbeitet werden.
NPA-MAPS-Assays können verwendet werden, um die Menge an Target in einer Probe quantitativ zu bestimmen. Wenn Schutzfragment in ausreichend hohem molarem Überschuss gegenüber dem Target hinzugefügt wird, um die Hybridisierungsreaktion vollständig ablaufen zu lassen, so reflektiert die Menge der nach dem Nukleaseschutzschritt verbleibenden Schutzfragmente, wieviel Target in der Probe enthalten war. Ein Beispiel einer solchen Quantifizierungsreaktion ist in den Beispielen 12 und 13 beschrieben.
NPA-MAPS-Assays können verwendet werden, um beliebige der vorstehend beschriebenen Verfahren, welche Standard-MAPS-Assays verwenden, auszuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polynukleotidschutzfragmente eher über das Massenspektrometer als an MAPS-Platten gemessen. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind keine der Polynukleotide an eine feste Oberfläche gebunden (angebracht), während der Hybridisierungs- oder Nukleaseverdauschritte. Nach Hybridisierung kann das hybridisierte Target abgebaut werden, z. B. durch Nukleasen oder durch chemische Behandlungen, wobei das Schutzfragment in direktem Verhältnis zu der Menge an Fragment, die an Target hybridisiert hatte, zurückbleibt. Alternativ kann die Probe so behandelt werden, dass der (einzelsträngige) hybridisierte Abschnitt des Targets oder die durch das hybridisierte Target und das Schutzfragment gebildete Duplex für die weitere Analyse zurückbleibt. Die zu analysierenden Proben werden von dem Rest des Hybridisierungs- und Nukleasegemischs abgetrennt (beispielsweise mittels Ethanolpräzipitation oder durch Adsorptions- oder Affinitätschromatographie etc), eluiert oder solubilisiert und in das Massenspektrometer mittels Schleifeninjektion für Hochdurchsatz injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die zu analysierenden Proben (Schutzfragmente) an einer Oberfläche adsorbiert und durch Laserdesorption unter Verwendung im Fachbereich gut bekannter Verfahren analysiert. Für höchste Empfindlichkeit kann Fourier-Transformationsmassenspektrometrie (FTMS) (oder eine ähnliche weiterentwickelte Technik) verwendet werden, so dass Femtomole oder weniger jedes Schutzfragmentes nachgewiesen werden können.
Die Schutzfragmente, die in einer (oder mehreren) Proben nachgewiesen werden sollen, können so konzipiert sein, dass ein einziges Signal für das verwendete Massenspektrometer erhalten wird. In einer Ausführungsform besitzen die Schutzfragmente jeweils ein einzigartiges Molekulargewicht nach Hybridisierung und Nukleasebehandlung und ihre Molekulargewichte und charakteristischen Ionisierungs- und Fragmentierungsmuster sind ausreichend, um ihre Konzentration zu messen. Um eine höhere Empfindlichkeit zu gewinnen oder um die Analyse komplexer Gemische zu unterstützen, können die Schutzfragmente modifiziert sein (z. B. derivatisiert) mit chemischen Gruppen, die dazu entworfen sind, klare einzigartige Signale zu erhalten. Beispielsweise kann jedes Schutzfragment mit einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure derivatisiert sein, die über eine Amidbindung an den Oligonukleotidstrang an einer oder mehreren Positionen entlang des hybridisierenden Abschnitts des Stranges angebracht sind. Mit einem Massenspektrometer entsprechender Energie tritt die Fragmentierung an den Amidbindungen auf, wobei ein charakteristischer Abschnitt der Aminosäuren freigesetzt wird. Diese Art des Ansatzes, bei dem chemische Gruppen mittlerer Größe (grob 80 bis 200 Molekulargewicht) als massenspektrometrische Tags verwendet werden, ist wünschenswert, da Moleküle dieser Größe im Allgemeinen leichter nachzuweisen sind. In einem anderen Beispiel ist die chemische Modifikation ein organisches Molekül mit einem definierten massenspektrometrischen Signal, wie etwa eine Tetraalkylammonium-Gruppe, die beispielsweise ein anderes Molekül, wie etwa z. B. eine Aminosäure derivatisieren kann. In einem anderen Beispiel werden positive oder negative ionische Signale durch Umsetzung mit beliebigen einer Vielzahl von Mitteln verstärkt. Beispielsweise ist es möglich, für die Verstärkung des Positivionennachweises ein Pyryliumsalz (wie etwa z. B. 2-4-Dithenyl, 6-Ethyl-pyryliumtetrafluorborat oder viele andere) mit einem Amin unter Bildung eines Pyridiniumsalzes umzusetzen; beliebige einer Anzahl anderer Fördermittel können verwendet werden, um andere positiv geladene funktionelle Gruppen zu bilden (siehe z. B. Quirke et al (1994). Analytical Chemistry 66, 1302–1315). Ebenso können beliebige einer Anzahl von im Fachbereich anerkannten Mitteln zur Bildung Negativionen-fördernder Spezies umgesetzt werden. Die chemische Modifikation kann selbstverständlich, entweder nachdem sie von der Nukleinsäure abgespalten wurde oder während sie in Verbindung mit der Nukleinsäure vorliegt, nachgewiesen werden. Indem es ermöglicht wird, jedes Schutzfragment auf unterscheidbare Weise zu identifizieren, ist es möglich, auch eine große Zahl unterschiedlicher Targets (z. B. 2, 6, 10, 16 oder mehr unterschiedlicher Targets) in einem einzigen Assay zu testen (z. B. zu screenen). Zahlreiche solcher Assays können rasch und einfach durchgeführt werden. Ein solcher Assay oder eine Gruppe von Assays kann daher wie hierin definiert mit hohem Durchsatz durchgeführt werden.
Ungeachtet dessen, ob Oligonukleotide direkt über ihre Masse detektiert werden oder ob einzigartige molekulare Tags verwendet werden, können die Signale für jedes nachzuweisende Molekül in reinen Zubereitungen bekannter Konzentration vollständig charakterisiert werden. Dies ermöglicht eine genaue quantitative Bestimmung (Messung, Quantifizierung) des Signals. Für ein beliebiges mittels Massenspektrometrie nachzuweisendes Molekül ist es nicht möglich, die Intensität und das Profil exakt vorherzusagen. Die Ionisierungstendenz des Moleküls, die Empfindlichkeit aller chemischen Bindungen innerhalb des Moleküls gegenüber einer Fragmentierung, das Ausmaß, in dem das Fragment mehrfach geladen oder einfach geladen wird, sind zu komplex für eine Vorhersage. Für ein gegebenes Instrument mit festgelegter Energie und Probenhandhabungseigenschaften ist die Signalintensität und das Profil des Signals jedoch sehr reproduzierbar. Daher kann das Signal für jede Probe mit reinen Standards charakterisiert werden und die experimentellen Signale können quantitativ genau interpretiert werden.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Nukleinsäuren von Interesse, umfassend das Unterwerfen einer Probe, welche die Nukleinsäure(n) von Interesse enthält, einem Nukleaseverdau mit einem oder mehreren Schutzfragmenten und dem Nachweisen der hybridisierten Duplexmoleküle oder der geschützten Nukleinsäure oder des Schutzfragmentes mittels Massenspektrometrie.
Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren mittels Massenspektrometrie sind im Fachbereich gut bekannt. Siehe z. B. Alper et al (1998). Science 279, 2044–2045 und Koster, U.S.-Patent Nr. 5,605,798 .
Zusätzlich zu der Vielfalt der vorstehend beschriebenen Hochdurchsatzassays sind zahlreiche andere für einen Fachmann ersichtlich.
Ein Vorteil der Verwendung von Mehrfachsondenassays ist die Möglichkeit, mehrere „Kontroll"-Sonden in jede Probenanordnung einzubauen, die denselben Reaktionsbedingungen wie die tatsächlichen experimentellen Sonden unterliegen. Beispielsweise kann jeder Bereich in der Anordnung positive und/oder negative Kontrollen umfassen. Der Begriff „positive Kontrollsonde" wird hier verwendet, um eine Kontrollsonde zu bezeichnen, von der bekannt ist, dass sie z. B. wesentlich mit dem Target wechselwirkt oder mit diesem auf quantitativ oder qualitativ bekannte Weise wechselwirkt, so dass sie als (innerer) Standard für die Sonden/Target-Wechselwirkung fungiert. Eine solche Sonde kann beispielsweise die Hybridisierungseffizienz kontrollieren. Der Begriff „negative Kontrollsonde" wird hier verwendet, um eine Kontrollsonde zu bezeichnen, von der bekannt ist, dass sie nicht wesentlich mit dem Target wechselwirkt. Eine solche Sonde kann beispielsweise die Hybridisierungsspezifität kontrollieren. Als Beispiel für die verwendbaren Arten von Kontrollen ist etwa ein Assay zu erwähnen, bei dem eine Anordnung von Oligonukleotidsonden verwendet wird, um nach Mitteln zu screenen, welche die Expression einer Gruppe korrelativer Gene für eine Erkrankung modulieren. Als innere Normalisierungskontrolle für Variablen, wie etwa die Anzahl der für jede Probe lysierten Zellen, die Gewinnung von mRNA oder die Hybridisierungseffizienz, kann eine Sondenanordnung Sonden umfassen, die spezifisch für ein oder mehrere Basiswerte oder konstitutive Haushaltsgene wie etwa Strukturgene (z. B. Actin, Tubulin oder andere) oder DNA-bindende Proteine (z. B. Transkriptionsregulationsfaktoren oder andere) sind, bei denen man davon ausgeht, dass ihre Expression durch die zu untersuchenden Mittel nicht moduliert wird. Außerdem kann eine Sondenanordnung für die Bestimmung, ob die untersuchten Mittel zu unerwünschten Nebeneffekten wie etwa Zelltod oder Toxizität führen, Sonden umfassen, die spezifisch für Gene sind, für die bekannt ist, dass sie als Teil des Apoptosevorgangs (programmierten Zelltodes) induziert werden oder welche unter Bedingungen von Zelltrauma (z. B. Hitzeschockproteine) oder Zelltoxizität (z. B. p450-Gene) induziert werden.
Andere Kontrollsonden können in einer Anordnung enthalten sein, um ein „Fine-Tuning" der Empfindlichkeit eines Assays durchzuführen. Beispielsweise etwa ein Assay für ein Mittel, welches die Produktion von mRNAs, die mit einem bestimmten Erkrankungszustand verbunden sind, moduliert. Wenn vorausgehende Analysen gezeigt haben, dass eine der korrelativen mRNAs (d. h. mRNA-A) in dieser Gruppe in so hohen Mengen im Vergleich zu den anderen hergestellt wird, dass ihr Signal aus den anderen mRNAs ausbricht, so können die Linker für das „Fine-Tuning" des Assays angepasst werden, um so die Stärken der Signale auszugleichen. „Blockierte Linker", welche die Anker-spezifische Oligonukleotidsequenz umfassen, die für das mRNA-A-Target konzipiert ist, denen jedoch die probenspezifische Sequenz fehlt, können zugegeben werden, um den Vorrat Target-spezifischer Linker zu verdünnen und so die Empfindlichkeit des Assays für diese mRNAs zu verringern. Die entsprechenden Verhältnisse blockierter und nicht-blockierter Linker können routinemäßig mit herkömmlichen Verfahren von einem Fachmann bestimmt werden.
Die in einem erfindungsgemäßen Assay zu untersuchenden Proben können beliebige der vorstehend beschriebenen Targets oder andere umfassen. Flüssige Proben, die untersucht werden sollen, können ein beliebiges Volumen aufweisen, das für die Größe des Testbereiches geeignet ist, im Bereich von etwa 100 Nanolitern bis zu etwa 100 Mikrolitern. In einer bevorzugten Ausführungsform werden flüssige Tropfen mit etwa 1 Mikroliter auf jedes Well einer 1536-Well-Mikrotiterschale aufgebracht. Die Proben können mit den Sondenanordnungen über beliebige einer Vielfalt von Verfahren in Kontakt gebracht werden, die für die Hochdurchsatzanalyse geeignet sind, z. B. mittels Pipettieren, Tintenstrahl-basierter Abgabe oder mittels Verwendung eines replizierenden Nadelwerkzeugs. Die Proben werden unter Bedingungen inkubiert (z. B. Salzkonzentration, pH, Temperatur, Dauer der Inkubation etc, siehe oben), die effektiv sind, um eine Anbindung oder eine andere stabile Wechselwirkung der Sonde und des Targets zu erreichen. Diese Bedingungen sind routinemäßig bestimmbar. Nach Inkubation können die Proben optional behandelt werden (z. B. gewaschen), um ungebundenes Target zu entfernen, wobei Bedingungen verwendet werden, die empirisch bestimmt werden, so dass spezifische Wechselwirkungen intakt bleiben, aber nicht-spezifisch gebundenes Material entfernt wird. Beispielsweise können Proben zwischen einmal und zehnmal oder mehr unter denselben oder etwas stringenteren Bedingungen gewaschen werden als denjenigen, die verwendet werden, um die Bindung Probe/Target zu erzielen.
Proben, welche Target-RNA enthalten, z. B. mRNA, rRNA, tRNA, virale RNA oder Gesamt-RNA, können durch beliebige einer Vielfalt von Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können in vitro-Zellkulturen, aus denen mRNA extrahiert werden soll, auf die Bereiche einer Oberfläche plattiert werden, wie etwa in einzelne Wells einer Mikrotiterplatte. Optional können diese Zellen nach Erreichen einer gewünschten Zelldichte mit einem Mittel von Interesse behandelt werden, wie etwa mit einem stimulierenden Mittel oder einem potenziellen therapeutischen Mittel, welches zu den Zellen über beliebige einer Vielfalt von Mitteln hinzugefügt werden kann, z. B. mit einem replizierenden Nadelwerkzeug (wie etwa den von Beckman erhältlichen 96- oder 384-Nadelwerkzeugen), durch Pipettieren oder durch Tintenstrahlabgabe, und mit den Zellen für einen geeigneten Zeitraum inkubiert werden, z. B. zwischen etwa 15 Minuten und etwa 48 Stunden, abhängig von dem Assay. Gesamt-RNA-, mRNA- etc. Extrakte aus Geweben oder Zellen einer in vitro- oder in vivo-Quelle können unter Verwendung von Routineverfahren, die im Fachbereich anerkannt sind, hergestellt werden (z. B. über kommerziell erhältliche Kits).
Wahlweise kann eine Nukleinsäure, die mit einer RNA von Interesse um die Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde im Wettbewerb stehen könnte (das heißt genomische DNA, rRNA, tRNA oder mRNA, welche eine zumindest teilweise Sequenzhomologie mit der RNA von Interesse teilt) zumindest teilweise aus einer RNA-Probe entfernt werden, indem die Probe mit einem Nukleaseschutz(NP)-Verfahren vorbehandelt wird, bevor diese Hybridisierung unterzogen wird. Eine Nukleinsäure (ein „Schutzfragment", das z. B. RNA, DNA oder PNA sein kann), die komplementär zu wenigstens einem Abschnitt der RNA von Interesse ist und deren Sequenz teilweise oder vollständig mit derjenigen der Sonde überlappt, die spezifisch für die RNA von Interesse ist, wird im Überschuss in die Probe eingebracht und mit dieser unter ausgewählten stringenten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, unter denen das Schutzfragment spezifisch an die RNA von Interesse hybridisiert (siehe oben für eine Diskussion geeigneter Reaktionsbedingungen). In diesem Schritt können Schutzfragmente, die spezifisch sind für beliebige oder alle der RNAs von Interesse in der Probe, hinzugefügt werden (z. B. etwa 100 oder mehr). Nach Hybridisierung wird die Probe mit einem Cocktail einer oder mehrerer Nukleasen behandelt, um so im Wesentlichen alle Nukleinsäuren zu zerstören, mit Ausnahme der Abschnitte jeder RNA von Interesse, die komplementär zu dem Schutzfragment/den Schutzfragmenten sind oder mit Ausnahme der zwischen dem/den Schutzfragment(en) und der geschützten RNA gebildeten Duplexen. In einem anschließenden Schritt kann das Schutzfragment/können die Schutzfragmente von solchen Duplexen entfernt werden, indem die Duplexe denaturiert und mit einem entsprechenden Enzym verdaut werden, welches Schutzfragmente verdaut und die geschützte RNA im Wesentlichen intakt belässt. Beliebige einer Vielfalt von Nukleasen können für die vorstehend diskutierten Verdauschritte verwendet werden, einschließlich z. B: pankreatische RNAse, Mungobohnennuklease, RNAse H, S1-Nuklease (unter Verdaubedingungen) mit entweder hohem oder niedrigem Salzgehalt, RNAse A, Ribonuklease T1, Exonuklease III, Exonuklease von Interesse, RNAse CL3, RNAse PhyM, RNAse U2 und dergleichen, abhängig von der Beschaffenheit der hybridisierten Komplexe und von den unerwünschten Nukleinsäuren, die in der Probe vorliegen. Die Reaktionsbedingungen für diese Enzyme sind im Fachbereich gut bekannt und können empirisch optimiert werden. Je nach Bedarf können die Proben über im Fachbereich gut bekannte Verfahren behandelt werden, um nicht hybridisiertes Material zu entfernen und/oder um restliche Enzyme zu inaktivieren oder zu entfernen (z. B. Phenolextraktion, Präzipitation, Säulenfiltration etc.). Die behandelten Proben werden dann in Kontakt mit der Sondenanordnung gebracht. Um zu kontrollieren, dass die spezifische Hybridisierung und der anschließende Nukleaseschutz korrekt erfolgt ist, können in dem Reaktionsgemisch markierte Schutzfragmente enthalten sein. Um zu kontrollieren, dass das Nukleaseschutzverfahren korrekt funktioniert hat, d. h. dass nicht-hybridisierte Nukleinsäuren wie gewünscht verdaut wurden, ist es möglich, ein oder mehrere Schutzfragmente zu entwerfen, die überhängende (nicht-hybridisierende) Segmente enthalten, die von den Nukleasen gespalten werden sollten, wenn der Assay richtig funktioniert. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit der überhängenden Fragmente kann mittels Hybridisierung mit einer komplementären markierten Sonde bestimmt werden oder der überhängende Abschnitt des Schutzfragmentes kann selbst mit einem nachweisbaren Molekül markiert sein.
Für beliebige der Verfahren dieser Erfindung können Targets markiert (tagged) werden, mittels beliebiger einer Vielzahl von Verfahren, die im Fachbereich gut bekannt sind und/oder die hierin an anderer Stelle beschrieben werden (z. B. für die Detektion von Nukleaseschutzfragmenten). Beispielsweise können die Targetmoleküle direkt oder indirekt mit chemischen Gruppen gekoppelt werden, welche ein Signal für die Detektion bereitstellen, wie etwa chemilumineszente Moleküle oder Enzyme, welche die Herstellung chemilumineszenter Moleküle katalysieren oder fluoreszente Moleküle, wie Fluorescein oder cy5, oder ein zeitaufgelöst fluoreszierendes Molekül, wie eines der chelatisierten Lanthanidenmetalle oder eine radioaktive Verbindung. Alternativ können die Targets markiert werden, nachdem sie mit der Sonde reagiert haben, mit einem oder mehreren Target-spezifischen Reportern (z. B. Antikörpern, Oligonukleotiden wie in 1 gezeigt oder beliebigen der allgemeinen Typen von Molekülen, die vorstehend in Verbindung mit Sonden und Targets diskutiert wurden). Eine Vielfalt komplexerer Sandwich-artiger Schutzverfahren kann ebenfalls eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Target an ein bifunktionales Molekül hybridisiert werden, welches eine erste Gruppe enthält, die spezifisch für das Target ist und eine zweite Gruppe, die von einem gemeinsamen (d. h. demselben) Reporterreagenz erkannt werden kann, z. B. ein markiertes Polynukleotid, ein Antikörper oder dergleichen. Die bifunktionalen Moleküle können so konzipiert sein, dass eine beliebige gewünschte Zahl gemeinsamer Reporter in jedem Assay verwendet werden kann.
Verfahren, durch welche Targets mit einem Target-spezifischen Rezeptor/Rezeptoren unter Bedingungen inkubiert werden können, die effektiv sind, um eine Bindung oder eine andere stabile Wechselwirkung zu erzielen, können routinemäßig bestimmt werden (siehe oben). Beispielsweise können fluoreszente Oligonukleotidreporter (in einer Konzentration von etwa 10 nM bis zu etwa 1 μM oder mehr, vorzugsweise etwa 30 nM, in einen Puffer wie etwa 6 × SSPE-T oder anderen) mit den gebundenen Targets für zwischen etwa 15 Minuten bis 2 Stunden oder mehr (vorzugsweise etwa 30 bis 60 Minuten) bei einer Temperatur zwischen etwa 15°C und etwa 45°C (vorzugsweise etwa Raumtemperatur) inkubiert werden. Nach der Inkubation können die Proben wahlweise behandelt werden (z. B. gewaschen), um ungebundene Target-spezifische Reporter zu entfernen, wobei Bedingungen eingesetzt werden, die empirisch bestimmt werden, so dass spezifische Wechselwirkungen intakt bleiben, aber nicht spezifisch gebundenes Material entfernt wird. Beispielsweise können Proben zwischen etwa einmal und zehnmal oder mehr unter denselben oder etwas stringenteren Bedingungen gewaschen werden als denjenigen, die verwendet werden, um die Target/Reporter-Bindung zu erzielen.
Das Markieren mit einem Target-spezifischen Reporter/Reportern kann der ursprünglichen Hybridisierungsreaktion ein zusätzliches Maß an Spezifität verleihen, z. B. in dem Fall, wenn ein Target-spezifischer Oligonukleotidreporter auf einen anderen Abschnitt der Sequenz einer Zielnukleinsäure gerichtet ist als das Sondenoligonukleotid oder wenn Sonde und Reporter Antikörper anderer Epitope eines Targetantigens erkennen. Außerdem kann die Markierung mit Target-spezifischen Reportern das „Tuning" der Sensitivität der Reaktion ermöglichen. Wenn beispielsweise Target-mRNA, die ein Teil eines korrelativen Expressionsmusters ist, in sehr geringem Maß exprimiert wird, kann das Ausmaß des Signals verstärkt werden (Signalamplifikation), indem das gebundene Target an mehrere (z. B. etwa zwei bis etwa fünf oder mehr) Target-spezifische Oligonukleotidreporter gebunden wird, von denen jeder spezifisch an einen anderen Abschnitt der Target-mRNA hybridisiert.
Die Möglichkeit, zwei Arten von Labels unabhängig nachzuweisen, ermöglicht ein zusätzliches Maß der Kontrolle in MAPS-Assays. Einige (z. B. etwa 10 bis etwa 100%) der für eine bestimmte Ankerstelle konzipierten Linker (7 zeigt 3 typische Ankerstellen, die jeweils eine Vielfalt im Wesentlichen identischer Anker (A, B oder C) umfassen), kann eine Markierung aufweisen (z. B. einen Fluorophor), die am Ende angebunden ist. Beispielsweise kann ein Rhodamin oder Cy5-Fluorophor an das 5'-Ende des Linkers angebunden sein. Solche modifizierten Linker werden als „Kontrolllinker" bezeichnet. Nachdem ein Gemisch von Linkern und Kontrolllinkern mit Ankern assoziiert wurde und eine Probe, welche ein Target enthält, mit der resultierenden Sondenanordnung inkubiert wurde, kann ein Target-spezifischer Reporter verwendet werden, der einen anderen Fluorophor trägt (Fluorescein oder ein anderes Detektionslabel wie etwa ein chemilumineszentes) (oder das Target kann direkt mit einem Fluorophor oder einem anderen Detektionslabel markiert werden); und das Verhältnis der beiden Signale kann bestimmt werden. Das Vorhandensein von Kontrolllinkern erlaubt die Kalibrierung der Zahl der funktionellen Anker (d. h. derjenigen, die zur Wechselwirkung mit Linkern in der Lage sind) innerhalb und zwischen den Testbereichen (d. h. die Kapazität jeder Stelle der Anordnung zur Bindung von Target wird zum Zweck der Normalisierung der Signale getestet), dient als Grundlage für die quantitative Bestimmung der Menge an gebundenem Target, unterstützt die Lokalisierung der Ankerstellen und/oder stellt eine positive Kontrolle bereit, z. B. in den Fällen, in denen kein Signal infolge der Abwesenheit von Target in einer Probe vorliegt. In einer Ausführungsform der Erfindung können zwei verschiedene Markierungen (z. B. Fluorophore) verwendet werden, um zwei unterschiedliche Populationen von Zielmolekülen nachzuweisen; die Möglichkeit, das Vorhandensein von Targets durch eine räumliche Auflösung der Signale zu erkennen, ermöglicht jedoch die Verwendung einer einzigen Art von Markierung für verschiedene Targetmoleküle.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können „Anker", die spezifisch für ein Target/Targets von Interesse sind, die nicht mit Linkern assoziiert sind, sondern die direkt mit dem Target/den Targets assoziiert sind, wiederum wahlweise mit einem Target-spezifischen Reporter/Reportern Wechselwirken.
Targets, ob markiert oder unmarkiert, können durch beliebige einer Vielfalt von Verfahren nachgewiesen werden, die im Fachbereich Routine und üblich sind (siehe z. B. Fodor et al (1996). U.S.-Patent Nr. 5,510,270 ; Pirrung et al (1992). U.S.-Patent Nr. 5,143,854 ; Koster (1997). U.S.-Patent Nr. 5,605,798 ; Hollis et al (1997) U.S.-Patent Nr. 5,653,939 ; Heiler (1996). U.S.-Patent Nr. 5,565,322 ; Eggers et al (1997). U.S.-Patent Nr. 5,670,322 ; Lipshutz et al (1995). BioTechniques 19, 442–447; Southern (1996). Trends in Genetics 12, 110–115). Detektionsverfahren umfassen Enzym-basierten Nachweis, kolorimetrische Verfahren, SPA, Autoradiographie, Massenspektrometrie, elektrische Verfahren, Detektion der Absorption oder Lumineszenz (einschließlich Chemilumineszenz oder Elektrolumineszenz) und die Detektion der Lichtstreuung, beispielsweise von mikroskopischen Partikeln, die als Tags verwendet werden. Außerdem können fluoreszente Markierungen beispielsweise nachgewiesen werden durch Bildgebung mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) oder Fluoreszenzmikroskopie (z. B. Raster- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie) oder durch Kopplung eines Rastersystems mit einer CCD-Anordnung oder einer Photomultiplier-Röhre oder durch Verwendung Array- basierter Technologie zum Nachweis (z. B. Oberflächenpotenzial jedes 10-Mikron-Teils eines Testbereichs kann nachgewiesen werden oder Oberflächenplasmonresonanz kann verwendet werden, wenn die Auflösung ausreichend hoch sein kann. Alternativ kann eine Anordnung eine Markierung enthalten (z. B. ein Paar von Energietransfersonden, wie etwa Fluorescein und Rhodamin), die durch Energietransfer zu der Markierung an einem Linker, Target oder Reporter (oder durch Modulation) über dieses nachgewiesen werden kann. Unter den Fluoreszenz-basierten Detektionssystemen sind Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzpolarisierung (FP), zeitaufgelöste Fluoreszenz, Fluoreszenzresonanzenergietransfer und homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF). Die Analyse wiederholter Barcode-ähnlicher Muster kann durch Mustererkennung durchgeführt werden (Auffinden des entsprechenden Spots oder der entsprechenden Linie für jedes spezifisch markierte Target über dessen Position relativ zu den anderen Spots oder Linien), gefolgt von quantitativer Bestimmung der Intensität der Markierungen. Barcode-Erkennungsvorrichtungen und Computersoftware für die Analyse ein- oder zweidimensionaler Anordnungen werden routinemäßig erzeugt und/oder sind kommerziell erhältlich (siehe z. B. Rava et al (1996). U.S.-Patent Nr. 5,545,531 ).
Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Anordnungen dieser Erfindung, einschließlich der Herstellung von Oberflächen oder Bereichen wie denjenigen, die hierin beschrieben sind, zur Synthese oder Reinigung und Anbindung oder Assemblierung von Substanzen wie etwa von Ankern, Linkern, Sonden und Detektorsonden, die hierin beschrieben sind, und zum Nachweis und zur Analyse markierter oder getaggter Substanzen wie hierin beschrieben, sind gut bekannt und übliche Technik. Zusätzlich zu den in diesen vorstehend zitierten Referenzen offenbarten Verfahren siehe z. B. die Patente von Affymax, Affymetrix, Nanogen, Protogene, Spectragen, Millipore und Beckman (von denen Produkte, die für die Erfindung geeignet sind, erhältlich sind), Standardfachbücher der Molekularbiologie und Proteinwissenschaft einschließlich der vorstehend zitierten und Cozette et al (1991). U.S.-Patent 5,063,081 ; Southern (1996), Current Opinion in Biotechnology 7, 85–88; Chee et al (1996). Science 274, 610–614 und Fodor et al (1993). Nature 364, 555–556.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht ein Designschema für Oligonukleotide, worin ein Linker 1 einen Abschnitt enthält, der spezifisch für Anker 1 ist und einen anderen Abschnitt (eine Sonde), die spezifisch für Target-mRNA 1 ist und worin eine markierte Detektionssonde 1 spezifisch für eine Sequenz von Target-mRNA 1 ist, die unterschiedlich zu der Sequenz des Target-spezifischen Abschnittes des Linkers ist.
2 veranschaulicht eine Oberfläche, die 15 Testbereiche umfasst, von denen jeder eine Anordnung von sechs Ankeroligonukleotiden umfasst.
3 veranschaulicht das Design eines Linkers für einen Rezeptorbindungsassay, worin der Anker-spezifische Abschnitt des Linkers mit dem Sondenabschnitt (dem Rezeptorprotein) über Biotin- und Streptavidin-Moleküle assoziiert ist und worin ein für den Rezeptor spezifischer Ligand mit einem Fluoreszenzmarkierungsmolekül markiert ist. B: Biotin. SA: Streptavidin. Rec: Rezeptorprotein. Ligand: ein natürlicher oder synthetischer Ligand für den Rezeptor. *: ein Fluoreszenzmarkierungsmolekül angebunden an den Ligand.
4 veranschaulicht eine Oberfläche, die 21 Testbereiche umfasst, von denen jeder in 16 Unterbereiche weiter unterteilt ist (Hügel, Vertiefungen).
5a, 5b und 5c veranschaulichen drei Stücke, aus denen einen Oberfläche, wie diejenige, die in 4 gezeigt ist, angeordnet werden kann. 5a stellt einen Wellseparator dar; 5b stellt einen Unterteiler dar; und 5c stellt eine Basis dar:
6 stellt zwei Testbereiche dar, von denen jeder eine lineare Anordnung von Sonden (oder Ankern) umfasst, die in einer „Barcode"-ähnlichen Formation vorliegen.
7 repräsentiert schematisch einen Testbereich, welcher 3 Anker (A, B und C) umfasst, die jeweils in mehrfachen Kopien vorliegen (eine „Gruppe"). Die Lokalisierung jeder Gruppe von Ankern wird als „Lokus" bezeichnet.
8 veranschaulicht einen Assay, bei dem cDNA(s), die durch spezifische reverse Transkriptase erzeugt wurden, auf MAPS-Platten getestet werden.
9 veranschaulicht einen Assay, bei dem ein Nukleaseschutzverfahren (NPA-MAPS-Assay) verwendet wird. Proben-RNA wird aus Zellen oder aus Gewebe hergestellt und ist als dünne gewellte Linien dargestellt. Zu der RNA-Probe wird eine Gruppe von Polynukleotidschutzfragmenten zugegeben, die als dicke, dunkle und helle Linien dargestellt sind. Die dunklen Sektionen der Schutzfragmente stellen Segmente dar, die komplementär zu spezifischen RNA-Targets sind und die an diese Targets hybridisieren. Die hellen Sektionen stellen überhängende Abschnitte dar: Sequenzen, die mit der komplementären Sequenz zusammenhängen, die aber nicht komplementär zu dem Target sind. Die Schutzfragmente werden im Überschuss hinzugefügt. Nach Hybridisierung aller verfügbarer Targets an die Schutzfragmente werden die Proben mit einem entsprechenden Cocktail von Nukleasen behandelt und mit chemischen Behandlungen, die unerwünschte, nicht-hybridisierte RNA und nicht-hybridisiertes Polynukleotid zerstören. Beispielsweise kann S1-Nuklease beliebige einzelsträngige DNA, die vorhanden ist, zerstören. Somit wird überschüssiges Schutzfragment sowie der überhängende nicht-hybridisierte Abschnitt von gebundenem Schutzfragment hydrolysiert. RNA kann durch Zugabe von Ribonukleasen einschließlich Ribonuklease H und/oder durch Erwärmung der Proben in Base hydrolysiert werden. Zurück bleibt eine Sammlung gespaltener Schutzfragmente, die widerspiegeln, wieviel jeder Target-RNA in der Probe vorhanden war. Die verbleibenden Schutzfragmente werden über ein MAPS-Hybridisierungsassay gemessen.
10 veranschaulicht die Hybridisierungsspezifität in einem MAPS-Assay.
11 veranschaulicht die Bindungskinetik eines Ankers an einen Linker.
12 veranschaulicht einen MAPS-Assay von zwei Oligonukleotidtargets.
13 veranschaulicht die quantitative Bestimmung eines Sensitivitätsshifts.
14 veranschaulicht Bestimmungen der Schmelztemperatur für vier Oligonukleotidlinker/Anker-Kombinationen.
15 veranschaulicht einen mRNA-Assay durch NPA-MAPS.
16 veranschaulicht eine Verdünnungskurve mit NPA-MAPS.
17 veranschaulicht einen Assay zur Bestimmung von Peptiden, welche Phosphotyrosin-Reste enthalten.
18 veranschaulicht den ersten Schritt in einem Assay zur Kartierung von ESTs: Assemblierung von Linkern, die jedem der zu kartierenden ESTs entsprechen, an Anordnungen generischer Anker auf einer MAPS-Platte. An die Oberfläche jedes der 16 Wells einer Mikrotiterplatte werden Linker angebunden, die 16 verschiedene Oligonukleotidsonden umfassen, angeordnet in einer 4×4-Matrix. Der erste Lokus weist Oligo 1 auf, welches komplementär zu einem Abschnitt der ersten EST-Sequenz ist usw. für die zu untersuchenden 16 ESTs.
cDNAs oder mRNAs, die aus den Genen, von denen die ESTs erhalten wurden, erzeugt wurden, werden zu allen 16 Wells hinzugefügt und ihre Hybridisierung unter geeigneten Bedingungen wird ermöglicht. So wird jegliche cDNA oder mRNA, welche eine der 16 EST-Sequenzen enthält, an dem Lokus assembliert, an den die komplementäre Sonde platziert wurde.
19 veranschaulicht einen anschließenden Schritt in einem Assay zur Kartierung von ESTs: Zugabe von Detektoroligonukleotiden zu der MAPS-Platte. Jedes Well der Platte erhält ein Detektoroligonukleotid, welches einem der zu kartierenden ESTs entspricht. Jedes Detektoroligonukleotid ist ein Oligonukleotid, das an ein für den Nachweis verwendbares Molekül gekoppelt ist, z. B. Fluorescein, wenn Fluoreszenzbildgebung das Verfahren zum Nachweis sein soll. Jedes Detektoroligonukleotid ist komplementär zu einem der ESTs, aber unterscheidet sich von der EST-spezifischen Sonde, so dass eine Sonde und ein Detektoroligonukleotid, die komplementär zu einem einzigen EST sind, gleichzeitig binden können.
Nach Waschen wird ein einzelnes Detektoroligonukleotid zu jedem Well hinzugefügt, wie in der Figur nummeriert. Das heißt, das Detektoroligonukleotid mit einer komplementären Sequenz zu der ersten EST wird zu dem ersten Well hinzugefügt usw.
20a und 20b veranschaulichen die Ergebnisse des Assays zur Kartierung der in den 18 und 19 gezeigten ESTs. Nach Hybridisierung von Detektoroligonukleotiden und Waschen unter entsprechenden Stringenzbedingungen werden die 16 Wells der Mikroplatte beispielsweise mit einem CCD-basierten Fluoreszenzimager abgebildet. 20a zeigt die stilisierten Ergebnisse. Es wird erwartet, dass jedes EST-spezifische Detektoroligonukleotid die mRNA oder cDNA markieren sollte, die durch die entsprechende EST-spezifische Sonde unten gehalten wird. Beispielsweise assembliert Sonde 5 die cDNA oder mRNA, welche die fünfte EST-Sequenz enthält, an dem Lokus, so dass das fünfte Detektoroligonukleotid auch an die cDNA oder mRNA an demselben Lokus hybridisieren sollte. Dies ist für diese stilisierten Daten der Fall, wobei jedes Detektionsoligonukleotid die passende Sonde markiert. Außerdem markieren die ersten drei Detektoroligonukleotide jeweils cDNA oder mRNA, die von den ersten drei Sonden unten gehalten wird, was zeigt, dass diese Sequenzen entlang desselben Gens liegen. Ähnlich scheinen auch die letzten fünf ESTs verknüpft zu sein. Die aus diesen Daten geschlossene Verknüpfung ist graphisch in 20b dargestellt.
21 veranschaulicht die Verhältnisse der Sonden, Detektoroligonukleotide und ESTs #1, 2 und 6, die in 18–20 gezeigt sind.
22 veranschaulicht einen Hochdurchsatzassay.
BEISPIELE
Beispiel 1 Hybridisierungsspezifität (siehe 10)
Eine generische MAPS-Platte wurde hergestellt unter Verwendung eines Tintenstrahlspenders, des Pixussystems (Cartesian Technologies, Inc., Irvine, CA), um ein identisches Gitter von DNA innerhalb jedes Wells einer Mikrotiterplatte zu bilden. Alle Oligonukleotide wurden von Biosource International (Camarillo, CA) bezogen. Für diese Platte wurden sieben unterschiedliche Oligonukleotidanker innerhalb jedes Wells in dem Muster verteilt, gezeigt als Schlüssel (linke Seite der Figur). Jedes Oligonukleotid wurde als 10 Nanoliter-Tröpfchen auf zwei Spots verteilt, ausgehend von einer 2 uM-Lösung, die 500 mM Natriumphosphat pH 8,5 und 1 mM EDTA enthielt, zu den Wells einer DNA-Bindplatte (Corning Costar) und man ließ es trocknen. Nach Anbindung wurden die Wells mit 50 mM Tris pH 8 blockiert und anschließend wurde Oligonukleotid, welches nicht-kovalent an die Oberfläche angebunden war, mit 0,1% SDS in 5 × SSP-Puffer abgewaschen.
Zu der gewaschenen Platte wurden fluoreszent markierte Linkeroligonukleotide hinzugefügt und man ließ diese in 6 × SSPE mit 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur für 30 Minuten hybridisieren. Dies ist eine bevorzugte Vorgehensweise für die Anbindung von Linkern. Die Linkeroligonukleotide wurden während der Synthese cy5-derivatisiert und waren in 25 Basenpaar-Segmenten vollständig komplementär zu spezifischen Ankeroligonukleotiden. Die Sequenzen der sieben Anker und Linker waren wie folgt (gezeigt jedes 5' nach 3'):

* Anker wurden synthetisiert mit C12-Spacer mit Amid am 5'-Ende
** Linker wurden synthetisiert mit Cy5 angebunden am 5'-Ende
*** Detektoroligonukleotide wurden synthetisiert mit Biotin angebunden am 5'-Ende

Zu jedem Well wurde entweder ein Linker oder ein Gemisch von Linkern (wie in der Figur angegeben) im Bulk zugegeben. (Zu dem mit „alle" markierten Well wurde ein Gemisch aller sieben Linker zugegeben). Nach Inkubation und 3-maligem Waschen in 5 × SSP wurde das im rechten Teil der Figur gezeigte Fluoreszenzbild mit einem Tundra-Imager (IRI, St. Catherines, Ontario) aufgenommen. Wie erkennbar ist, selbst-assemblierten sich die Linker an der Oberfläche, indem sie spezifisch mit ihren komplementären Ankern assoziierten.
Dieses Verfahren wurde wiederholt, außer dass acht verschiedene Anker in jedes Well verteilt wurden und die Linker anschließend bevorzugt damit assoziierten. Das gesamte Verfahren wurde mit 36, 64 etc. unterschiedlichen Ankern in jedem Well einer 24-, 96-, 384-, 864- oder 1536-Wellplatte wiederholt.
Beispiel 2 Bindungskinetik (siehe 11)
Die Rate der Hybridisierung des Cy5-derivatisierten Linkers Nummer 1 an seinen komplementären angebunden Anker ist für verschiedene Konzentrationen an Linker gezeigt. Die generische MAPS-Platte wurde wie für 1 hergestellt, außer dass Anker 1 an vier Spots pro Well angebunden wurde. Die Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur in 5 × SSP mit 0,1% Tween-20, die Wells wurden 3-mal mit 5 × SSP gewaschen und die gebundene Fluoreszenz wurde gemessen. Ein Fluoreszenzbild der Platte wurde mit dem Tundra aufgenommen und der Hintergrund wurde abgezogen und die integrierte Intensität jedes Spots innerhalb jedes Wells wurde mit Tundra-Software berechnet. Aufgetragen ist der Mittelwert und die Standardabweichung für die integrierte Intensität der vier Spots innerhalb jedes von zwei zweifachen Wells.
Beispiel 3 Fluoreszenzlinker.
Es wurde eine generische MAPS-Platte mit einem Ankeroligonukleotid hergestellt, das entweder auf 1 Spot pro Well (obere beide Reihen), 4 Spots pro Well (nächste vier Reihen) oder 16 Spots pro Well (untere zwei Reihen) getüpfelt wurde, entsprechend der vorstehend diskutierten Verfahren. Zu jedem Well wurde ein komplementärer fluoreszent markierter Linker durch das in Beispiel 1 beschriebene bevorzugte Protokoll angebunden. Nach Waschen wurde das Fluoreszenzbild der Platte mit dem Tundra aufgenommen. Die Menge der Fluoreszenz an jedem Spot gibt wieder, wieviel funktioneller Linker für die Hybridisierung an Target verfügbar ist. Die detektierte Menge des Signals ist an wiederholten Spots gut reproduzierbar.
Beispiel 4 Bindungskurven.
Zu der in Beispiel 3 hergestellten Platte wurden verschiedene Konzentrationen eines Target-Oligonukleotids hinzugefügt. Der Linker, der assoziiert worden ist, enthält eine 25-mer-Sequenz, die komplementär ist zu einem Abschnitt des Targets. Das Target wurde in 5 × SSC mit 0,05% SDS in einem Gesamtvolumen von entweder 30 oder 100 Mikrolitern hinzugefügt und die Platte wurde abgedeckt und bei 50°C über Nacht inkubiert. Nach Hybridisierung des Targets an den angebundenen Linker wurde das Target durch ein bevorzugtes Protokoll unter Verwendung von Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Ein biotinyliertes Detektoroligonukleotid, welches eine 25-mer-Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem anderen Abschnitt des Targets (nicht demselben Abschnitt, der komplementär zu dem Linker ist), wurde mit 30 nM zugefügt. Biotinylierter Detektor kann für 30 Minuten nach dem Abwaschen von überschüssigem unangebundenem Target hinzugefügt werden oder er kann zusammen mit dem Target für die Dauer der Hybridisierung über Nacht hinzugegeben werden. Nach Anbindung des Detektors wurde die Oberfläche zweimal mit 5 × SSC, einmal mit 1 × SSP, welches 0,1% Tween-20 und 1% PEG (SSPTP) enthält, gewaschen, und eine 1:50.000-Verdünnung von 250 ug/ml Meerrettichperoxidase konjugiert an Streptavidin (HRP:SA, von Pierce, Rockford, III.) wurde für 5 Stunden in SSPTP bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Wells wurden viermal mit SSPTP gewaschen, und einmal gewaschen und dann mit Super Signal Ultra-Reagenz (Pierce) inkubiert. Nach wenigen Minuten wurden Lumineszenzbilder mit dem Tundra-Imager gesammelt, z. B. kann das Bild innerhalb der CCD-Anordnung für fünf Minuten akkumuliert werden. Geringe Mengen an Target können in einigen Wells in einer Targetkonzentration von nur ~5 × 10^–13 M sichtbar gemacht werden; die Menge des Signals ist im Allgemeinen bei einer Targetkonzentration von ~10^–10 M gesättigt. Die Menge des nachgewiesenen Signals ist an wiederholten Spots gut reproduzierbar.
Beispiel 5 Assay von zwei Oligonukleotiden (siehe 12)
Eine Bindungskurve, welche ein MAPS-Hybridisierungsassay unter Verwendung des bevorzugten Protokolls wie vorstehend diskutiert für zwei verschiedene Targetoligonukleotide veranschaulicht, ist gezeigt. Eine generische MAPS-Platte wurde mit vier verschiedenen Ankeroligonukleotiden hergestellt, die jemals viermal innerhalb jedes Wells aufgetupft wurden. Für den zweiten und vierten Anker assemblierten sich komplementäre Linkeroligonukleotide selbst auf der Oberfläche, wie beschrieben. Zwei Targets wurden in den gezeigten Konzentrationen in 40 Mikrolitern, wie beschrieben, zu jedem Well hinzugefügt und bei 50°C über Nacht inkubiert. Die Menge jedes angebundenen Targets wurde sichtbar gemacht, indem biotinyliertes Nachweisoligonukleotid, welches spezifisch für jedes Target ist, angebunden wurde, gefolgt von HRP:SA und Chemilumineszenz-Imaging, wie beschrieben. In dem unteren Feld ist die Intensität des Bildes quantifiziert. Software, die Teil des Tundra-(mager-Pakets ist, wurde verwendet, um die Intensität der Bilder entlang der Linien zwischen den in dem oberen Feld gezeigten Pfeilen zu scannen. Bei den niedrigsten Target-Konzentrationen, 1,1 pM, zeigen die gescannten Bilder gut definierte Gauss-Peaks bei jedem Spot, während in der Probe am weitesten links bei einer Konzentration von 0 Target keine unterscheidbaren Hintergrundpeaks erkennbar sind.
Beispiel 6 Sensitivitätsverschiebung (siehe 13)
Ein MAPS-Hybridisierungsassay kann verwendet werden, um die Konzentration einer Gruppe von Oligonukleotiden zu messen, indem diese an eine Oberfläche gebunden und markiert werden. Dies funktioniert gut für diejenigen Oligonukleotide, die in mittlerer oder geringer Konzentration vorliegen. Zwei Proben können in einem solchen Fall unterschieden werden, da mehr Bindung erfolgt, wenn eine Probe mehr Oligonukleotide enthält. Andererseits wird dann, wenn die Konzentration an Targetoligonukleotid für die Oberfläche sättigend ist (d. h. wenn sie hoch genug ist, um alle Bindungsstellen zu besetzen), bei einer Erhöhung der Konzentration nicht mehr Bindung erfolgen, so dass die Menge nicht gemessen werden kann. Die Bindungskurve eines Targets kann jedoch verschoben werden, indem unmarkierter kompetitiver Ligand hinzugefügt wird.
Bindungsdaten wurden für vier verschiedene Oligonukleotid-Targets erhalten, die jeweils die Oberfläche sättigen (d. h. eine maximale Bindung erreichen), bei grob 3 nM. Durch Zugabe unmarkierter kompetitiver Targets zu allen Wells wird die Bindung von markiertem Oligonukleotid verschoben, so dass eine geringere Bindung bei der niedrigeren Konzentration erfolgt und das Maß, bei dem Sättigung auftritt, nach oben verschoben wird. Es ist möglich, kompetitive Oligonukleotide für etwa die Targets 1 und 3, aber nicht 2 und 4, hinzuzufügen. Dadurch wird die Sensitivität des Assays nur für die Targets 1 und 3 verschoben. Auf diese Weise können innerhalb eines Assaywells Oligonukleotid-Targets mit weit unterschiedlichen Konzentrationen gemessen werden, wenn die erwartete relative Menge an Oligonukleotid bekannt ist.
Die Daten können wie vorstehend erläutert für die Bindung eines der Oligonukleotid-Targets quantifiziert werden. 13 zeigt quantitativ, dass durch Aufnahme kompetitiver Oligonukleotide in dem Assay die zur Untersuchung dieses Targets verwendete Bindungskurve zu höheren Konzentrationen verschoben wird.
Beispiel 7 Schmelztemperatur für vier Sonden (siehe 14)
Die Menge von vier verschiedenen fluoreszent markierten Linkeroligonukleotiden, die spezifisch an Ankernukleotide mittels des MAPS-Assays hybridisiert sind, wird gegen die Erhöhung der Temperatur aufgetragen. Die vier Oligonukleotide ließ man zunächst bei 50°C für 1 Stunde bei 300 nM hybridisieren. Anschließend wurden die Wells mit SSC ohne Sonden gewaschen und die gebundene Menge wurde wie vorstehend durch Fluoreszenz gemessen (50°C). Anschließend wurde die Oberfläche bei 55°C für 30 Minuten inkubiert und die gebundene Fluoreszenz wurde gemessen, usw. für alle dargestellten Temperaturen.
Beispiel 8 Detektionsverfahren
Zwei Detektionsverfahren können direkt verglichen werden. Zu einer MAPS-Platte mit vier angebundenen Oligonukleotidankern, jeweils mit vier Spots pro Well, wurden zwei Oligonukleotide zu jedem Well hinzugefügt, wobei beide eine kovalent angebundene cy5-Gruppe enthielten oder beide eine Biotingruppe enthielten. Die epi-Fluoreszenzmessung wurde wie beschrieben durchgeführt, um den Fluoreszenzlinker zu erkennen und zu messen. Die Chemilumineszenzmessungen wurden wie für den MAPS-Assay beschrieben durchgeführt, unter Verwendung einer anschließenden Zugabe von HRP:SA und eines Chemilumineszenz-Substrats. Die erzeugten Signale sind in etwa in derselben Größenordnung. Bei der Geometrie der Mikrotiterplatten, die Wände zur Abtrennung jedes Wells enthalten und möglicherweise Flüssigkeitsblasen oder einen Fluid-Miniskus, können Reflektionen in den epi-Fluoreszenzbildern jedoch eine Interferenz bei der Datenauswertung hervorrufen.
Beispiel 9 Chemilumineszenzprodukte
Zwei als Chemilumineszenz-Substrate für Meerrettichperoxidase erhältliche Produkte können als Detektionsverfahren für den MAPS-Assay verglichen werden. Eine MAPS-Platte wurde wie in Beispiel 8 hergestellt und mit biotinylierten Linkeroligonukleotiden inkubiert. Anschließend wurde entweder alkalische Phosphatase gekoppelt an Streptavidin (AlkPhos:SA) oder HRP:SA hinzugefügt und anschließend erfolgte Waschen und Zugabe von entweder CDP-Star (Tropix) zu den Wells mit AlkPhos:SA oder von ECL-Plus zu den Wells mit HRP:SA. Die Markierung mit SA-derivatisierten Enzymen und Substraten erfolgte wie vom Hersteller für die Verwendung zur Markierung in Western Blots empfohlen. Diese beiden (sowie andere verfügbare Substrate) können verwendet werden, um die Oligonukleotid-Hybridisierung an MAPS-Platten zu bewerten.
Beispiel 10 Auflösung bei 0.6 mm.
Die Auflösung des gegenwärtigen Systems für einen MAPS-Assay wurde untersucht, indem eine MAPS-Platte mit vier verschiedenen Oligonukleotid-Ankern pro Well hergestellt wurde, die jeweils viermal pro Well getüpfelt wurden, mit einem Pitch (Mitte-zu-Mitte-Abstand) von 0,6 mm. Dann wurden entweder cy5-derivatisierte Linker oder biotinylierte Linker hybridisiert und nachgewiesen und wie vorstehend gescannt. Für die epi-Fuoreszenzmessung ist die Auflösung höher (und der Pitch könnte verringert werden). Für den Chemilumineszenz-Nachweisvorgang sind benachbarte Spots nicht völlig getrennt, bei diesem Abstand können einzelne Peaks aber dennoch durch Computerdekonvolution zweifelsfrei aufgelöst werden.
Beispiel 11 Test des Nukleaseschutzprotokolls.
In einem Assay zur Untersuchung der optimalen Bedingungen für die Hybridisierung und Nukleasebehandlung in dem Nukleaseschutzprotokoll wurde der Nuclease Protection Assay-Kit von Ambion (Austin, Texas) verwendet, um Bedingungen, Puffer und Enzyme bereitzustellen. Acht Proben wurden in einem von drei Puffern hergestellt. Hyb Buff 1 ist 100% Hybridisierungspuffer (Ambion); Hyb Buff 2 ist 75% Hybridisierungspuffer und 25% Hybridisierungsverdünnungspuffer (Ambion); und Hyb Buff 3 ist jeweils 50%. Ein 70-mer Oligonukleotid, welches 60 Reste enthält, die komplementär sind zu einer Test-RNA wurde synthetisiert (Biosource International, Camarillo, CA) und mit Psoralen-Fluorescein markiert (Schleicher und Schuell, Keene, NH) gemäß dem Protokoll, welches von Ambion für die Markierung von Psoralen-Biotin vorgeschlagen wird. Kurz zusammengefasst wurde das Schutzfragment in 20 μl TE-Puffer auf 50 ug/ml verdünnt (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8), für 10 Minuten gekocht und rasch in Eiswasser gekühlt. Vier μl an 130 ug/ml Psoralen-Fluorescein in DMF wurden hinzugefügt und die Probe wurde für 45 Minuten bei 40°C mit einer tragbaren UV-Quelle mit langer Wellenlänge bestrahlt. Freies Psoralen-Fluorescein wurde durch Extraktion mit gesättigtem Butanol entfernt. Die verwendete mRNA ist GAPDH-Antisense-mRNA; hergestellt aus Antisenseplasmid (pTRI-GAPDH-Maus-Antisense-Control Template von Ambion) unter Verwendung von T7-Promotor und dem MaxiScript-Kit (Ambion). Das kurze Schutzfragment ist der 60-mer-komplementäre Abschnitt, der separat synthetisiert wird und gleich markiert wurde. Die Sequenzen der Schutzfragmente sind wie folgt:
Die Hybridisierungen wurden durchgeführt, indem Schutzfragmente mit 20 nM für zwei Stunden bei 22°C oder 37°C mit GAPDH-mRNA mit 60 nM in 10 μl Endvolumen vermischt wurden. Nach Hybridisierung wurden 200 μl eines Nukleasegemischs gemäß den Angaben des Herstellers hinzugefügt (Ambion Nuclease Protection-Kit, 1:200-Verdünnung an Nukleasegemisch) und erneut bei derselben Temperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Hydrolyse wurde mit Hybridisation Inhibition-Puffer (Ambion) gestoppt und die Oligonukleotide wurden pelletiert und mit Ethanol gewaschen. 10 μl an 1 × Gelbeladungspuffer (Ambion) wurden hinzugefügt und die Oligonukleotide wurden an 15%-igem TBE-Harnstoffgel aufgetrennt. Das Gel wurde für 30 Minuten in Laufpuffer verwirbelt, auf eine Kunststoffplatte gegeben und mit dem Tundra sichtbar gemacht, wobei Fluoresceinfilter zur Auswahl von Anregungs- und Emissionswellenlängen verwendet wurden. Das Bild wurde an der CCD-Anordnung für 2 Minuten akkumuliert. Die besten Bedingungen liegen für die Proben vor, die in Hyb Buff 2 bei 37°C oder in Hyb Buff 3 bei 22°C inkubiert wurden. In diesen Proben verbleibt kein nachweisbares Volllängenschutzfragment und es sind signifikante Mengen eines Teils des Volllängenschutzfragments mit einer Größe von etwa derselben wie derjenigen des kurzen Schutzfragmentes erkennbar.
Beispiel 12 mRNA-Assay durch NPA-MAPS (siehe 15)
Das vollständige NPA-MAPS-Protokoll wurde verwendet, bei Bedingungen zur Hybridisierung und Nukleasebehandlung, die gleich zu denen sind, die in Beispiel 11 beschrieben sind. Zehn Proben wurden für den Test durchgeführt. Alle enthielten dieselbe Menge des 70-mer-Oligonukleotidschutzfragmentes und unterschiedliche Mengen an GAPDH-mRNA: Hybridisierungsproben in 10 μl in 50% Hybridisierungspuffer und 50% Verdünnungspuffer, welche 0,08 mg/ml Hefe-RNA (Ambion) enthielten, wurden für 6 Minuten auf 90°C erhitzt, kurz zentrifugiert, für 5 Minuten auf 70°C erhitzt und man ließ sie auf 19°C abkühlen und sie wurden für 19 Stunden inkubiert. 200 μl Nukleasegemisch wurden dann zu jeder Probe für 30 Minuten bei 19°C hinzugefügt. 60 μl Aliquote wurden aus jeder Probe für den MAPS-Assay entnommen. 2 μl an 10 N NaOH und 2 μl an 0,5 M EDTA wurden hinzugefügt und die Probe wurde für 15 Minuten auf 90°C, für 15 Minuten auf 37°C erhitzt, und man ließ sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten absitzen. Die Proben wurden mit 2 μl an 10 M HCl neutralisiert und 12 μl an 20 × SSC, welches 2 M HEPES pH 7,5 und 200 nM biotinyliertes Detektoroligonukleotid enthielt, das spezifisch für das Schutzfragment war, wurden zusammen mit 1 μl an 10% SDS hinzugefügt. Die Proben wurden gemischt, für 5 Minuten auf 80°C erhitzt und zwei 35 μl Aliquote jeder Probe wurden auf zwei Wells einer MAPS-Platte pipettiert (jede Probe wurde zweigeteilt und zweifach auf der MAPS-Platte durchgeführt). Die Platte war wie für ein Standard-MAPS-Protokoll hergestellt worden, wobei selbst-assemblierter CY5-derivatisierter Linker, der spezifisch für das Schutzfragment ist, bereits angebunden war. Die MAPS-Platte wurde abgedeckt und über Nacht bei 50°C inkubiert und Detektion und Lumineszenz wurden wie beschrieben durchgeführt. In der letzten Probe wurden zur Kontrolle bei dem Assay keine Nukleasen hinzugegeben, um sichtbar zu machen, wie das Schutzfragment alleine mittels MAPS detektiert wirde. In dem unteren Abschnitt der Figuren ist der Intensitätsscan (wie mittels (mager analysiert) für die oberste Reihe der Wells dargestellt. Die Menge an GAPDH-mRNA, die in der Probe vorliegt (das heißt, die Menge in jedem zweifachen Well nach Auftragung von Aliquoten auf die MAPS-Platte) ist in der Figur angegeben.
Die für die MAPS-Platten verwendeten Oligonukleotide waren wie folgt:

Beispiel 13 Verdünnungskurve, NPA-MAPS (siehe 16)
Die in Beispiel 12 diskutierten und in 15 gezeigten Daten wurden quantifiziert und als Verdünnungskurve aufgetragen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen für alle acht Spots auf den zwei doppelten Wells wurden für jede Konzentration an mRNA aufgetragen. Eine Verbindungskurve wurde überlagert, in der Form: Gebundener Anteil = Maximale Bindung·1/(1 + IC50/L)wobei Maximale Bindung die maximale Bindung bei Sättigung ist, Gebundener Anteil die gebundene Menge bei Ligandenkonzentration L ist und IC₅₀ die Ligandenkonzentration ist, bei der der gebundene Anteil die Hälfte der maximalen Bindung beträgt. Die Kurve ist in der Figur als rote Punkte gezeigt, gezogen mit einem Best Fit-Value von IC₅₀ = 4,2 Femtomol, wie in der Figur markiert.
Beispiel 14 NPA-MAPS-Assay von GAPDH-mRNA in einem Mäuseleber-RNA-Gesamtextrakt
Ein Gesamt-Mäuse-RNA-Extrakt wurde mit einem NPA-MAPS-Assay auf GAPDH-mRNA untersucht und eine Verdünnungskurve wurde hergestellt. Gesamt-RNA aus Mäuseleber wurde unter Verwendung eines Qiagen-Kits hergestellt. RNA wurde in 70% Ethanol mit 0,5 M Mg-Acetat präzipitiert und in 10 μl an 5 × SSC mit 0,05% SDS mit 1,8 nM Schutzfragment resuspendiert. Das zugegebene Schutzfragment ist ein 70 Basenpaar langes Oligonukleotid, von denen 60 Basenpaare komplementär zu Mäuse-GAPDH sind. Es wurde entweder ein komplementäres Fragment zu Mäuse-GAPDH-mRNA verwendet („Schutzfragment") oder es das Komplement der Sequenz als Negativkontrolle verwendet („Antisensefragment").
RNA-Proben mit Schutzfragmenten wurden für 5 Minuten auf 90°C erhitzt und Hybridisierungen wurden durchgeführt, indem die Proben auf 70°C gebracht wurden und man sie langsam über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen ließ. S1-Nuklease (Promega) mit einer 1:10-Verdünnung wurde in 30 μl an 1×S1-Nukleasepuffer (Promega) für 30 Minuten bei 19°C hinzugefügt und es wurde mit 1,6 μl an 10 N NaOH und 2,7 μl an 0,5 M EDTA gestoppt. Die Proben wurden für 15 Minuten auf 90°C und dann für 15 Minuten auf 37°C erhitzt, um RNA zu denaturieren und zu zerstören, Neutralisierung erfolgte mit 1,6 μl an 10 M HCl und inkubiert wurde über Nacht auf MAPS-Platten in 5 × SSC mit 0,05% SDS ergänzt mit 200 mM HEPES pH 7,5, wozu 30 nM biotinyliertes Detektionsoligonukleotid hinzugefügt wurden. Waschen und Sichtbarmachen mit SA-HRP erfolgte wie beschrieben. Die Menge des Signals verringerte sich parallel zu den abnehmenden Mengen an Mäuse-RNA (Probe enthalten 500, 170, 50, 5 oder 0,5 μg Gesamt-Mäuse-RNA). Zwei Kontrollproben waren enthalten, zu denen keine S1-Nuklease zugegeben wurde. Ein Signal ist nur bei dem komplementären Schutzfragment erkennbar.
Verwendete Oligonukleotide:
Zur Antisensekontrolle (gleiche Oligonukleotide wie für Beispiel 12):

* Anker wurden synthetisiert mit C12-Spacer mit Amid am 5'-Ende
** Linker wurden synthetisiert mit Cy5 angebunden am 5'-Ende
*** Sonden wurden synthetisiert mit Biotin angebunden am 5'-Ende

Beispiel 15 Ein Nukleaseschutz-MAPS-Assay mit Kontrollen.
mRNA wurde aus Mäuseleber extrahiert und der Nukleaseschutz wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt, außer dass das GAPDH-spezifische Schutzfragment 60 Nukleotide umfasste, die komplementär zu Mäuse-GAPDH sind, gefolgt von 15 „überhängenden" Nukleotiden am 3'-Ende des Fragments, die nicht komplementär zu dem Target sind. Nach Hybridisierung und Nukleaseverdau wurde das verbleibende Schutzfragment an eine MAPS-Platte hybridisiert, wie in Beispiel 14 angegeben, außer dass zwei verschiedene Oligonukleotiddetektionsfragmente verwendet wurden, um das immobilisierte Schutzfragment nachzuweisen. Ein Detektionsfragment ist komplementär zu dem GAPDH-spezifischen Anteil des Schutzfragmentes und das andere, eine Kontrolle, ist komplementär zu dem 15 Basen-Überhangabschnitt des Schutzfragmentes. Jedes Schutzfragment wurde an verschiedenen wiederholten Proben (d. h. in unterschiedlichen Wells) verwendet, so dass beide Detektionsfragmente mit demselben der Detektionsmoleküle markiert werden können. In dem vorliegenden Beispiel wurden beide Fragmente mit HRP markiert. Ohne Zugabe von Nuklease sind Signale von beiden der Detektionsfragmente erkennbar, wohingegen bei Durchführung des Nukleaseverdaus nur ein Signal detektiert werden kann, welches den GAPDH-Sequenzen entspricht. Die Menge des GAPDH-spezifischen Signals verringert sich im Vergleich zu derjenigen, die ohne Nukleaseverdau beobachtet wird, da das Schutzfragment im Überschuss im Verhältnis zu der vorhandenen Menge an GAPDH-RNA zugegeben wurde. Dies ermöglicht, dass die Menge an GAPDH-mRNA limitierend ist für die Schutzhybridisierung, so dass die Menge an gebildetem doppelsträngigem Hybrid (und daher die Menge an Schutzfragment, welches vor der Nuklease geschützt wird) die Menge an mRNA widerspiegelt. Wenn in dem Reaktionsgemisch keine mRNA enthalten ist, kann kein Signal nachgewiesen werden, wenn Nukleasen hinzugefügt werden. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Hybridisierungs- und Verdauschritte des Assays wie gewünscht abliefen.
Wenn Schutzfragmente, die einer Vielfalt von Targets entsprechen, in einem gegebenen Assay enthalten sind, so kann jedes der Schutzfragmente denselben 15 Basen-Überhangabschnitt umfassen. Dies ermöglicht, dass ein Detektionsfragment verwendet wird, um für alle Proben den verbleibenden Überhang zu untersuchen.
Beispiel 16 Ein Transkriptionsassay zum Screening nach Verbindungen, welche die Expression von Genen verändern können, die mit einem Erkrankungszustand in Verbindung stehen.
Eine von einem humanen Tumor abgeleitete Zelllinie wurde verwendet. Es wurde gefunden, dass diese 30 Gene in höherem Maß exprimiert sind als in normale Zellen (das bedeutet, diese 30 Gene werden stärker als in normalen Fällen verwendet, für die Herstellung von mRNA und dann zur Herstellung des Proteins, für welches die Gene Anweisungen enthalten. Ein Transkriptionsassay misst, wieviel der Gene verwendet werden, indem gemessen wird, wieviel mRNA für jedes Gen vorliegt.) Unter Verwendung eines Nukleaseschutzassays an MAPS-Platten (NPA-MAPS) wurden 8800 chemische Verbindungen untersucht, um festzustellen, ob ein Wachstum der Zellen in Gegenwart der Verbindungen die Expression einiger der 30 korrelativen Gene verringern kann, ohne die Expression von sechs normalen Genen (konstitutiven, „Haushalts"-Genen) zu beeinträchtigen. Jegliche Verbindungen, welche diese Wirkung besitzen, könnten in der zukünftigen Wirkstoffentwicklung zur Behandlung dieser Art von Tumor geeignet sein.
Etwa 10.000 bis 100.000 Zellen wurden zu jedem Well von 100 96-Well-Polystyrol-Platten hinzugefügt und die Zellen wurden für 2 Tage gezüchtet, bis sie die Oberfläche jedes Wells bedeckten. Für 8 Wells dieser Platte ließ man die Zellen ohne Zugabe wachsen. Zu den verbleibenden 88 Wells jeder Platte wurde eine andere chemische Verbindung hinzugefügt, so dass die Wirkung dieser Verbindung alleine untersucht werden kann. Bei 100 gleichzeitig verwendeten Platten können 8800 Verbindungen untersucht oder gescreent werden. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Gegenwart der Verbindungen gezüchtet und anschließend wurden die Zellen für den Assay geerntet. Die Zellen in jeder Platte wurden gemäß der Angaben zur Herstellung von RNA in Proben aus 96-Well-Platten behandelt (beispielsweise gemäß dem Qiagen RNeasy 96-Kit). Nach Herstellung der RNA wurde die Menge jeder der 36 unterschiedlichen mRNA-Spezies über den NPA-MAPS-Ansatz quantifiziert, wobei 30 korrelative Gene und 6 normale „Haushalts"-Gene eingeschlossen wurden. 36 DNA-Oligonukleotidschutzfragmente, jeweils entsprechend einem der Gene von Interesse, wurden zu jedem Well hinzugegeben und man ließ diese unter ausgewählten Stringenzbedingungen an ihre Target-mRNA-Sequenzen hybridisieren. Anschließend wurde S1-Nuklease hinzugefügt, um überschüssige nicht-hybridisierte DNA zu zerstören und die Proben wurden chemisch behandelt, um auch die RNA zu zerstören. Übrig bleibt das Oligonukleotidschutzfragment für jedes der 36 Gene im Verhältnis dazu, wieviel mRNA in den behandelten Zellen für jede Probe vorhanden war.
Einhundert 96-Well-Platten, von denen jede eine Anordnung einer Vielzahl von 36 unterschiedlichen Ankernukleotiden in jedem Well umfasste, wurden hergestellt, indem zu jedem Well 36 unterschiedliche Linkeroligonukleotide hinzugefügt wurden. Die Linker assemblierten sich selbst auf der Oberfläche jedes Wells, so dass die generischen Platten in MAPS-Platten umgewandelt wurden, welche spezifische Sonden für jedes der 36 Oligonukleotidschutzfragmente umfassten. Jeder Linker wies einen Abschnitt auf, der spezifisch ist für einen der 36 Anker, und einen Abschnitt, der spezifisch ist für ein Segment eines der 36 Schutzoligonukleotide. Die Oligonukleotidprobe aus jedem Well der 100 Probenplatten wurde zu einem entsprechenden Well der 100 MAPS-Platten hinzugefügt. Nach Hybridisierung unter ausgewählter Stringenzbedingungen wurde ein Detektionsoligonukleotid für jedes Target mit einem angebundenen Chemilumineszenzenzym hinzugegeben, so dass jeder spezifische Spot jedes Wells im Verhältnis dazu aufleuchtete, wieviel mRNA in der Probe enthalten war. Alle Wells, welche geringere Mengen an korrelativen Genen ohne Auswirkungen auf die 6 Haushaltsgene zeigen, sind von Interesse. Die zu den Zellen hinzugegeben Verbindungen für diese Proben sind nützliche Ausgangspunkte für die Entwicklung von Antitumormitteln.
Beispiel 17 Induzierte und konstitutive Genexpression.
RNA wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt, aus der Leber von Mäusen, die entweder nicht infiziert waren („Kontrolle") oder eine Stunde nach Infektion („infiziert”) durch Adenovirus. 60 μg Leber-RNA wurde für jede Probe verwendet und die Proben wurden zweifach hergestellt. Jedes Assaywell enthielt drei Sätze doppelter Loki, entsprechend den drei vorstehend beschriebenen Genen. Jeder Lokus enthielt einen Anker, gebunden an einen Linker, welcher eine Gruppe umfasst, die komplementär zu einem Schutzfragment entsprechend einem der drei Gene ist. Ein Nukleaseschutz-MAPS-Assay wurde im Wesentlichen wie in 12 beschrieben durchgeführt und die Bilder wurden gesammelt und wie beschrieben gescannt. Gezeigt sind die rohen Bilddaten, die gesammelt wurden und die Intensitätsscans für zweifache Wells für jedes der drei mRNA-Targets. Die Zahlen über den Scanlinien sind die integrierten Intensitätswerte und die Standardabweichungen für jede Bedingung (n = 4). Das Haushaltsgen, GAPDH, von dem keine Veränderung erwartet wurde, zeigte eine mäßige Zunahme um das 1,3-fache in der infizierten Probe, die nicht statistisch signifikant war. Die Transkription von MIP-2 und c-jun erhöhte sich um das 4- bzw. 6-fache. Diese Ergebnisse zeigen, dass zwei Gene, MIP-2 und c-jun, eine verstärkte Expression in Antwort auf eine Adenovirusinfektion zeigten, im Vergleich zu einer Kontrolle, dem konstitutiv exprimierten Gen – GAPDH –.
Beispiel 18 Ein Enyzmassay zum Screening nach Verbindungen, die selektiv Tyrosin- oder Serinkinasen inhibieren (siehe 17).
Kinasen sind Enzyme, welche Phosphat an Proteine anbinden. Für viele wurde gezeigt, dass sie normales und neoplastisches Zellwachstum stimulieren. Daher können Verbindungen, welche spezifische Kinasen (aber nicht alle Kinasen) inhibieren, verwendet werden, um zu untersuchen, ob die Kinasen an einer Pathologie beteiligt sind und, falls ja, ob diese als Ausgangspunkte für die Arzneimittelentwicklung dienen können. Fünf Tyrosinkinasen, die an der Stimulation von Zellwachstum oder an der Regulierung der inflammatorischen Antwort beteiligt sind, sind beispielsweise src, lck, fyn, Zap70 und yes. Jede Kinase besitzt Substrate, die zum Teil identifiziert sind, als kurze Peptide, die ein Tyrosin enthalten. Ein Teil der Kinasespezifitäten überlappt, so dass verschiedene Kinasen einige Peptide gleich phosphorylieren, aber andere bevorzugt. Für die fünf Kinasen wurden 36 Peptidsubstrate ausgebildet, die ein Spektrum spezifischer und überlappender Spezifitäten zeigen.
Einhundert 96-Well-Platten wurden verwendet; jedes Well umfasste 36 generische Oligonukleotidanker. 36 Linker wurden hergestellt, um die generische Oligonukleotidanordnung (nur mit Ankern) in Anordnungen umzuwandeln, welche Peptidsubstrate umfassen. Die 36 Peptidsubstrate wurden synthetisiert und jedes wurde über eine Amidbindung kovalent angebunden, beispielsweise an ein Oligonukleotid mit einer 5'-Aminogruppe. Die Oligonukleotide enthielten Sequenzen, die spezifisch an die Anker hybridisieren. Die Peptide/Oligo-Linker wurden auf der Oberfläche selbstassembliert, indem sie zu allen Wells der MAPS-Platten hinzugefügt wurden.
Für das Screening wurden die fünf Kinasen in entsprechenden Konzentrationen (so dass die Phosphorylierungsraten der Substanzen soweit wie möglich ausgeglichen sind) zu jedem Well zusammen mit einer von 8800 verschiedenen zu untersuchenden Verbindungen hinzugefügt. Die Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit, direkt die isolierten Enzyme zu inhibieren, untersucht. Das Maß der Phosphorylierung für jedes angeordnete Peptid wurde detektiert, indem markierte Antikörper, die nur an Peptide binden, die am Tyrosin phosphoryliert sind, hinzugefügt wurden. Jegliche Wells, die eine Verringerung in einigen der Phospho-Tyrosin-Spots, aber nicht in allen der Spots zeigen, sind von Interesse. Verbindungen, die zu den Wells hinzugegeben worden waren, können als mögliche selektive Inhibitoren einiger der untersuchten Kinasen weiter getestet werden.
Das Schema des Assays ist im oberen Feld von 17 gezeigt. Ein chimäres Linkermolekül wurde hergestellt, indem ein 25 Basenpaar-Oligonukleotid, das komplementär zu einem der Anker ist, mit einem Peptidsubstrat eines Tyrosinphosphokinaseenzyms, vernetzt wurde. Das chimäre Oligo-Peptid-Substrat selbst-assembliert auf einer Anordnung von Oligonukleotidankern, das Kinaseenzym wurde verwendet, um den Peptidabschnitt des chimären Moleküls zu phosphorylieren und nachdem ein Ablauf der enzymatischen Reaktion ermöglicht wurde, wurde das Maß der Phosphorylierung des Peptids über Antiphosphotyrosin- oder Antiphosphoserin-Antikörper mit angebundenem Detektionsfluorophor oder -enzym bestimmt.
Die Ergebnisse des Assays sind in dem unteren Feld gezeigt. Der homobifunktionale Vernetzer, DSS (Pierce) wurde verwendet, um die 5'-Aminogruppe eines Oligonukleotidlinkers an den N-Terminus eines Peptids anzubinden, das mit einem phosphorylierten Tyrosin synthetisiert wurde. Die Sequenz des Peptids war im Ein-Buchstaben-Code: TSEPQpYQPGENL (SEQ ID: 32), wobei pY Phosphotyrosin darstellt. Die Chimäre wurde entweder direkt verwendet oder zunächst für 60 Minuten auf pH 14 gebracht, um die Phosphatgruppe des Tyrosins teilweise zu hydrolysieren. Die phosphorylierten oder teilweise dephosphorylierten chimären Moleküle wurden an komplementären Ankermolekülen in einer MAPS-Platte selbst-assembliert, bei den für eine Stunde gezeigten Konzentrationen. Nach Waschen und Blockieren der Wells mit 0,3% BSA in SSPTP wurde Antiphosphotyrosin-Antikörper, der an HRP (Antikörper 4G10 von Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) vernetzt war, in einer 1:3000-Verdünnung in SSPTP für eine Stunde hinzugefügt, und die Menge des angebundenen Antikörpers wurde mittels Chemilumineszenzsubstrat, Super Signal Blaze, detektiert. Das gezeigte Bild wurde an der CCD-Anordnung für 1 Minute akkumuliert. Wie erwartet war ein Unterschied in der Menge des an das Oligopeptid angebundenen Phosphats erkennbar. Dieser Unterschied ist die Grundlage für einen Assay zur Messung, wie aktiv eine Reihe von Kinasen bei der Behandlung mit verschiedenen möglichen Inhibitoren ist.
Beispiel 19 Ein Bindungsassay für den Nachweis selektiver Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen SH2-Domänen und phosphorylierten Peptiden.
SH2-Domänen dienen als Andock-Untereinheiten einiger wachstumsregulatorischer Proteine. Die Domänen binden an Phosphotyrosin-enthaltende Proteine oder Peptide mit mangelhafter Spezifität. Das heißt, einige Phosphotyrosinpeptide binden spezifisch an eines oder an wenige SH2-Proteine, während andere weitgehend an viele SH2-Proteine binden.
Für diesen Assay waren die Linker phosphorylierte Peptide, die kovalent an Oligonukleotide angebunden sind. Die Peptidgruppen wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, an eine Gruppe von ausgewählten SH2-Proteinen zu binden, ausgewählt. Die Linker wandeln generische MAPS-Platten in Platten mit spezifischen Liganden für die Gruppe der SH2-Proteine um. 100 96-Well-MAPS-Platten, welche die Liganden tragen, wurden erzeugt. Die Proteine wurden isoliert und beispielsweise mit einem cy5-Fluoreszenzmolekül markiert.
Um nach Inhibitoren der SH2-Domäne/Phosphopeptid-Wechselwirkung zu screenen, wurde die Gruppe markierter SH2-Proteine zu jedem Well der 100 96-Well-MAPS-Platten hinzugefügt und in jedes Well wurde eine andere Testverbindung zugegeben. So wurde die Wirkung jeder einzelnen Verbindung auf die Wechselwirkung der SH2-Proteine mit ihren Phosphopeptid-Liganden untersucht. Der Assay dient zur Messung der Fluoreszenz von gebundenem SH2-Protein, welches mit jedem Oberflächen-gebundenen Peptidlinker assoziiert ist. Für alle Wells, die eine verringerte Fluoreszenz bei einzelnen Punkten, aber nicht bei allen Punkten zeigen, kann die zugegebene Verbindung als möglicher selektiver Inhibitor des SH2-Andockens weiter untersucht werden.
Beispiel 20 Hochdurchsatzscreening (siehe 22)
Gezeigt ist eine Hochdurchsatz-MAPS-Platte, um den Signalnachweis von 96 Wells in einem einzelnen Experiment zu demonstrieren. Die Hybridisierung desselben Oligonukleotids wurde mit 16 Wiederholungen in 80 Wells gemessen. Wie gezeigt, war die Reproduzierbarkeit der 1280 Hybridisierungsassays sehr hoch. Die ganz linken und ganz rechten Spalten dienten als Kontrollen, um das Signal für verschiedene Oligonukleotidkonzentrationen zu standardisieren.
Auf ähnliche Weise können 16 verschiedene Oligonukleotide in jedem Well untersucht werden, und der Test kann in den 80 verschiedenen Wells der Platte wiederholt werden. Selbstverständlich kann eine noch größere Zahl unterschiedlicher Oligonukleotide oder anderer Sonden (z. B. 100 Nukleotidsonden) in jedem Well untersucht werden und es können viele Platten gleichzeitig untersucht werden (z. B. 100 Platten, wie etwa 96-Well-Mikrotiterplatten). Die große Zahl der Assays, die an jeder Probe durchgeführt werden kann (z. B. im letzteren Fall etwa 100 verschiedene Assays) und die große Zahl an Proben, (z. B. im letzteren Fall etwa 96 × 100 oder 9600 verschiedene Porben) stellt einen sehr hohen Durchsatz bereit.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis wenigstens eines Nukleinsäure-Targets, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, welche das/die Nukleinsäure-Target(s) umfassen kann, mit einem Nukleaseschutzfragment/Nukleaseschutzfragmenten, das/die spezifisch für das/die Nukleinsäure-Target(s) ist/sind und an diese(s) bindet/binden, unter Bedingungen, die für die Bindung des Nukleaseschutzfragments/der Nukleaseschutzfragmente an das/die Nukleinsäure-Target(s) effektiv sind, (b) Behandeln der resultierenden Probe mit einer Nuklease, die zum Verdauen verbleibender einzelsträngiger Nukleinsäuren effektiv ist, (c) Inkontaktbringen der resultierenden Probe mit einer Kombination, die vor der Zugabe der Probe umfasst (i) eine Oberfläche, die mehrere räumlich getrennte Bereiche umfasst, von denen wenigstens zwei im wesentlichen identisch sind, wobei jeder Bereich (ii) wenigstens zwei verschiedene Anker aufweist, jeweils in Verbindung mit (iii) einem bifunktionalen Linker, der einen ersten Abschnitt aufweist, der für den Anker spezifisch ist, und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde umfasst, die für das/die Nukleaseschutzfragment(e) spezifisch ist, unter Bedingungen, die zur Bindung des Nukleaseschutzfragments/der Nukleaseschutzfragmente an die Kombination effektiv sind, (d) Nachweisen des gebundenen Nukleaseschutzfragments/der gebundenen Nukleaseschutzfragmente, worin die Nukleaseschutzfragmente, Anker und bifunktionalen Linker Oligonukleotide sind.
Verfahren zum Nachweis wenigstens eines Nukleinsäure-Targets, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, welche das/die Nukleinsäure-Target(s) umfassen kann, mit einem Nukleaseschutzfragment/Nukleaseschutzfragmenten, das/die spezifisch für das/die Nukleinsäure-Target(s) ist/sind und an diese(s) bindet/binden, wodurch ein Nukleaseschutzfragment/Nukleinsäure-Target Doppelstrang gebildet wird, (b) Behandeln der resultierenden Probe mit einer Nuklease, die zum Verdauen verbleibender einzelsträngiger Nukleinsäuren effektiv ist, (c) Inkontaktbringen der resultierenden Probe mit einer Kombination, die vor der Zugabe der Probe umfasst (i) eine Oberfläche, die mehrere räumlich getrennte Bereiche umfasst, von denen wenigstens zwei im Wesentlichen identisch sind, wobei jeder Bereich (ii) wenigstens zwei verschiedene Anker umfasst, jeweils in Verbindung mit (iii) einem bifunktionalen Linker, der einen ersten Abschnitt aufweist, der für den Anker spezifisch ist, und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde umfasst, die für das Nukleinsäure-Target spezifisch ist, unter Bedingungen, die zur Hybridisierung effektiv sind, (d) Nachweisen des gebundenen Doppelstrangs, worin die Nukleaseschutzfragmente, Anker und bifunktionalen Linker Oligonukleotide sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend nach Schritt (c) (a) Inkontaktbringen der Kombination und jeglicher gebundener Nukleaseschutzfragmente oder jeglicher gebundener Doppelstränge mit wenigstens einem Molekül, das eine erste Gruppe umfasst, die für eines der gebundenen Nukleasefragmente oder Doppelstränge spezifisch ist, und eine zweite Gruppe, die für ein gemeinsames Reporterreagens spezifisch ist, (b) Inkontaktbringen des/der Molekül(e) mit dem gemeinsamen Reporterreagens/den gemeinsamen Reporterreagenzien, und (c) Nachweisen des gebundenen Nukleaseschutzfragments/der gebundenen Nukleaseschutzfragmente oder Doppelstränge durch Nachweis des gemeinsamen Reporterreagens/der gemeinsamen Reporterreagenzien.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Reporterreagens markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Reporterreagens ein markiertes Polynukleotid oder ein markierter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin das Reporterreagens ein Chemilumineszenz- oder Fluoreszenssignal erzeugt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin jeder Bereich wenigstens vier verschiedene Oligonukleotid-Anker umfasst, vorzugsweise wenigstens acht verschiedene Oligonukleotid-Anker und weiter bevorzugt wenigstens 64 verschiedene Oligonukleotid-Anker.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Oberfläche wenigstens 96 bis 1536 im Wesentlichen identische, räumlich getrennte Bereiche umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Oberfläche bis zu 1536 im Wesentlichen identische, räumlich getrennte Bereiche umfasst, und worin jeder Bereich 8 bis 100 verschiedene Oligonukleotid-Anker umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Oberfläche 8, 96 oder 384 im Wesentlichen identische, räumlich getrennte Bereiche umfasst, und worin jeder Bereich 8 bis 100 verschiedene Oligonukleotid-Anker umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin jede Sonde für ein anderes Nukleaseschutzfragment oder für einen anderen Doppelstrang spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Bereiche weiter in kleinere Unterbereiche unterteilt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin jeder der Bereiche ein Loch einer Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Anker Oligonukleotide mit einer Länge von 30 bis 50 Nukleinsäuren sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin ein oder mehrere Bereiche weiterhin Kontrollen für die Hybridisierungseffizienz oder -spezifität oder Kontrollen für die Kapazität eines Lokus zur Bindung an Targets umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, weiterhin umfassend (a) Behandeln der Probe, die an Nukleaseschutzfragment(e) gebundene Nukleinsäure-Target(s) umfasst, mit einer oder mehreren Nukleasen, um so im Wesentlichen alle Nukleinsäuren zu zerstören, mit Ausnahme des Nukleaseschutzfragments/der Nukleaseschutzfragmente, die an die Nukleinsäure(n) von Interesse hybridisiert haben und (b) Entfernen von anderem Nukleinsäurematerial als dem/den Nukleaseschutzfragment(en), das/die an die Nukleinsäure(n) von Interesse hybridisiert hat/haben, um eine Probe bereitzustellen, welche das/die Nukleaseschutzfragment(e) enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, welches ein RNA-Expressionsmuster identifiziert, worin wenigstens zwei der Nukleaseschutzfragmente spezifisch für verschiedene RNA-Moleküle sind.
Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 17, zur Identifizierung eines Mittels, das ein RNA-Expressionsmuster moduliert, welche weiterhin das Vergleichen des in Gegenwart des Mittels erzeugten RNA-Expressionsmusters mit dem unter anderen Bedingungen erzeugten RNA-Expressionsmuster umfasst.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16, zur Identifizierung eines Mittels, das die Wechselwirkung des Nukleaseschutzfragments/der Nukleaseschutzfragmente oder des Doppelstranges mit der Sonde/den Sonden moduliert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Nukleaseschutzfragment DNA ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 20, worin die DNA amplifiziert wird, bevor die Probe, welche das/die Nukleaseschutzfragment(e) umfasst, mit der Kombination in Kontakt gebracht wird, vorzugsweise durch PCR-Amplifikation.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Nukleinsäure-Target einen Polymorphismus umfasst.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin das Verfahren ein Hochdurchsatzverfahren ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, weiterhin umfassend Entfernen der bifunktionalen Linker von den Oligonukleotid-Ankern und Ersetzen durch im Wesentlichen identische Linker oder durch andere bifunktionale Linker, wodurch die Oberflächen umprogrammiert werden und Wiederholen des Verfahrens zum Nachweis eines Nukleinsäure-Targets.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin die Probe durch Inkubieren oder Züchten von Zellen, welche das/die Nukleinsäure-Target(s) enthalten können und Extrahieren von Nukleinsäuren aus den Zellen erzeugt wird.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder 20 bis 25, zur Identifizierung eines Mittels, das ein Genexpressionsmuster moduliert, welches mit einem bestimmten physiologischen Zustand oder Entwicklungsstadium im Zusammenhang steht.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder 20 bis 25 in einem diagnostischen Test, um zwischen einem normalen und einem Erkrankungszustand, der durch eine unterschiedliche Splicing-Variante gekennzeichnet ist, zu unterscheiden.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, worin wenigstens eines der Nukleinsäure-Targets ein DNA-Molekül oder ein RNA-Molekül ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 28, worin wenigstens eines der Nukleaseschutzfragmente spezifisch für ein DNA-Molekül ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, worin die Nukleinsäure-Targets DNA-Moleküle sind.
Kit, der für den Nachweis wenigstens eines Nukleinsäure-Targets in einer Probe geeignet ist, umfassend (a) wenigstens ein Nukleaseschutzfragment, das spezifisch für die Nukleinsäure(n) aber für keinen der Oligonukleotid-Anker in dem Kit ist; (b) eine Oberfläche, die mehrere räumlich getrennte Bereiche umfasst, von denen Wenigstens zwei im Wesentlichen identisch sind, wobei jeder Bereich wenigstens zwei verschiedene Oligonukleotid-Anker umfasst und (c) einen Behälter, der wenigstens ein bifunktionales Linkermolekül umfasst, das einen ersten Abschnitt aufweist, der für wenigstens einen der Oligonukleotid-Anker spezifisch ist, und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde umfasst, die spezifisch für wenigstens eines der Nukleaseschutzfragmente ist und bei dem Nachweis an dieses bindet.
Kit nach Anspruch 31, weiterhin umfassend eine oder mehrere Nukleasen, die effektiv sind für den Verdau einzelsträngiger Nukleinsäuren und/oder des RNA-Strangs eines DNA/RNA-Doppelstrangs.
Kit, der für den Nachweis wenigstens eines Nukleinsäure-Targets in einer Probe geeignet ist, umfassend (a) eine Oberfläche, die mehrere räumlich getrennte Bereiche umfasst, von denen wenigstens zwei im Wesentlichen identisch sind, wobei jeder Bereich wenigstens zwei verschiedene Oligonukleotid-Anker umfasst, (b) einen Behälter, der wenigstens ein bifunktionales Linkermolekül umfasst, das einen ersten Abschnitt aufweist, der für einen der Oligonukleotid-Anker spezifisch ist, und einen zweiten Abschnitt, der eine Sonde umfasst, die spezifisch für ein Nukleaseschutzfragment ist, das spezifisch für eine der Nukleinsäuren ist, und (c) ein oder mehrere Nukleasen, die zum Verdauen einzelsträngiger Nukleinsäuren und/oder des RNA-Strangs eines DNA-RNA-Doppelstrangs effektiv sind.