JP2001526904A

JP2001526904A - ハイスループットアッセイシステム

Info

Publication number: JP2001526904A
Application number: JP2000525580A
Authority: JP
Inventors: スティーブン・フェルダー; リチャード・クリス
Original assignee: スティーブン・フェルダー; リチャード・クリス
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2001-12-25
Also published as: PL193762B1; DK1038033T3; MXPA00006058A; CZ302381B6; JP2011135884A; KR100708782B1; AU1936699A; DE69839373T2; IL136862A0; EA006425B1; NO329977B1; NO20003115D0; CA2315776A1; JP5049395B2; ATE392485T1; WO1999032663A2; EA200000684A1; NO20003115L; CZ20002259A3; IL136862A

Abstract

(57)【要約】本発明は、組成物、装置および方法に関係し、プローブの繰り返しアレイを用いる多種の、ハイスループット、生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用である。本発明の組合せには、多数の試験領域、少なくとも2つ、そして、好ましい実施態様では、少なくとも20の実質的に同一の試験領域を含む表面であり、各試験領域には包括的アンカー分子のアレイが含まれる。そのアンカーは、二官能性リンカー分子に結合し、それぞれに、少なくとも1つのアンカーに特異的な部分および目的の標的に特異的なプローブである部分が含まれる。作成したプローブのアレイを用い、プローブと特異的に相互作用する1つまたはそれ以上の標的分子の存在を分析するか、または活性を試験する。本発明のある実施態様では、試験領域(ウェルであり得る)を、より小さい小区域(へこみ、またはくぼみ)に更に再分割する。本発明のある実施態様では、ESTをマップする。他の実施態様では、標的核酸の存在が、ヌクレアーゼ消化に対し標的をポリヌクレオチドフラグメントで保護することにより、そしてマススペクトロメトリーで保護ポリヌクレオチドを分析することにより検出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、1997年12月19日付け先の出願60/068,291および1998年7月2日付け米
国出願番号09/109,076の優先権を主張するものである。それらの開示は何れも引
用によりこの文書に加える。

【０００２】本発明の背景技術本発明は、例えば、組成物、装置および方法に関係し、プローブの繰り返しア
レイを用いる多種の生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用である。多
数の領域には、それぞれ遺伝的アンカー分子のアレイが含まれる。アンカーは二
官能性リンカー分子を伴い、それぞれ少なくとも1つのアンカーに特異的な部分および目的の標的に特異的なプローブである部分を含む。生成したプローブのア
レイを用い、プローブに特異的に相互作用する1つまたはそれ以上の標的分子の存在を分析する。本発明は、分子相互作用の性質により識別し得る多種分野に関
連し、それには医薬探索、分子生物学、生物化学、生理学および医学診断技術が
含まれるが、これらに限らない。

【０００３】表面または“チップ”上に配置する多数の分子プローブを、多種の生物学的お
よび化学的アッセイに使用する。アッセイを行い、目的の標的分子が任意のプロ
ーブと相互作用するかどうか測定する。選択した試験条件下プローブを標的分子
にさらした後、検出装置により、標的分子が、所定のプローブと相互作用するか
どうか決定する。

【０００４】これらシステムは、様々なスクリーニング法に有用であり、プローブまたは標
的分子の何れかについての情報を得ることができる。例えば、それらを用い、他
のものに混じる目的のレセプターに結合するペプチドまたは可能性ある薬物をス
クリーニングする；多くの他のものに混じる、例えば、遺伝的変異、固体群の中
の突然変異体(allelic variant in a population)、または特定の病原体もしくは病原株の存在する、サンプルをスクリーニングする；遺伝子発現の研究をする
ため、例えば、特定の生理状態、発生段階または疾病状態などに発現が関連する
mRNA群を同定し得る。

【０００５】本発明の要旨本発明は、多種の生物学的または化学的アッセイを同時に行う組成物、装置お
よび方法を提供し、多数のサンプルをハイスループット分析し得、そのサンプル
には、例えば、診断アッセイにおいてスクリーニングされる多数の患者サンプル
、または薬物探索の方法において試験される多数の可能性ある薬物もしくは治療
薬がある。サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せを提供する。この組合せには、多数の空間的に分離された領域を含む表面が含まれ、そ
の領域は試験領域と名付けられ、少なくとも2つの実質的に同一のウェルであり得る。各表面には、少なくとも、2つ、好ましくは20またはそれ以上含まれ、例えば、少なくとも約25、50、96、864または1536などであり、実質的に同一な領域である。各試験領域は、1つまたはそれ以上の標的を含む(または部分的に含む
)サンプルを導入する空間であると定義され、生物学的または化学的アレイを含む。(“標的を含むサンプル”または“サンプル中の標的を検出する”という語句は、標的を含まないかまたは検出されないサンプルまたは測定(検出の試み)を
除外することを意味するものではない。通常の意味において、本発明は、標的が
サンプル中に含まれるかどうかを、それが検出されるかされないかにかかわらず
測定するアレイを含む。)このアレイは、包括的アンカーを含み、それぞれが、アンカーに特異的な第1の部分および少なくとも1つの標的に特異的なプローブを
含む第2の部分を有する二官能性リンカー分子に結合する。本発明の組合せは、1
つまたはそれ以上の標的を含むサンプルとの接触にあり、所望により、ディテク
ター分子と反応し、次いで、試験領域中における標的分子とプローブとの間の反
応を検出する検出装置により応答指令信号が送られ、それによりアッセイの結果
を得る。

【０００６】本発明は、特にハイスループット生物学的アッセイに有用な方法および組成物
を提供する。特に好ましい実施態様では、本発明を用い、ハイスループットな薬
物探索のスクリーニングができる。例えば、ハイスループットアッセイは、1度に多くの(例えば100)96ウェルマイクロプレートに実施することができる。プレートの各ウェルには、例えば36種の試験物が含まれ、その中で、約36のアンカー
およびリンカーの対のアレイを用いることにより実施される。すなわち、プレー
トあたり96ウェルを有する100プレートであり、ウェルあたり36の試験物をそれぞれ有し、合計345,000試験物となり得る；例えば、9,600種の薬物候補のそれぞ
れに、36種のパラメーターまたはアッセイを同時に試験し得る。ハイスループッ
トアッセイにより、1度で1パラメーターのみを試験するアッセイよりも多くの各
薬物候補についての情報が提供される。例えば、単一の最初のハイスループット
スクリーニングアッセイが可能であり、薬物候補が選択的であるか、特異的であ
るか、および/または非毒性であるかどうか決定する。非ハイスループット方法は、広範囲の追加アッセイを必要とし、目的の各薬物候補のパラメーターを試験
する。幾つかの型のハイスループットスクリーニングアッセイを実施例15-17に記載する。多様な生物学的アッセイを同時に実施する能力および1度に多くのアッセイを行う能力(すなわち、超ハイスループットにおいて)は、本発明の重要な
2つの利点である。

【０００７】ある実施態様では、例えば、アミノ酸または修飾オリゴヌクレオチドのような
一級アミンの結合を誘導した表面を有するポリスチレンで作成した96ウェルDNA
Bindプレート(Corning Costar)を用い、36種のオリゴヌクレオチドの回収物をア
ンカーとしての役割をする各プレートの各ウェルの表面上にスポットし得る。ア
ンカーを誘導ポリスチレンに共有結合し、同じ36のアンカーをすべてのスクリー
ニングアッセイ使用し得る。任意の特定のアッセイの場合、所定の一群のリンカ
ーを用い、36種ぐらいの目的の標的またはアッセイ型に特異的な各ウェルの表面
にプログラムし得、種々の試験サンプルを各プレート中の各96のウェルに適用し
得る。同じ一群のアンカーを複数時間用い、目的の他の標的およびアッセイのウ
ェルの表面に再度プログラムするか、または同じ一群のリンカーを複数時間、再
度使用し得る。この順応性および再利用性により、更に本発明の利点が示される
。

【０００８】本発明のある態様は、サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、 a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカーを含み、それぞれが結合するのが、 c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー、を含む組合せである。

【０００９】本発明の他の対応は、サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、 a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも8種のアンカー、それぞれが結合するのが、 c)アンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2
の部分を有する二官能性リンカー、を含む組合せである。

【００１０】本発明の他の実施態様は、少なくとも1つの標的を検出する方法であり、それには、当該標的が当該組合せと効率よく結合する条件下、上記のような当該組合
せと共に標的を含むサンプルと接触することを含む。他の態様は、RNA発現パターンを決定する方法であって、それには、上記の組合せと共に少なくとも2つのR
NA分子を標的として含むサンプルをインキュベーションすることを含む(少なくとも1つの組合せのプローブが、RNA標的によるプローブへの特異的なハイブリダ
イゼーションが効率的となる条件下、少なくとも1つのRNA標的に特異的となる( すなわち、選択的)核酸(例えばオリゴヌクレオチド)である)。他の態様は、RNA 発現パターンを修飾する試薬(または条件)を同定する方法であって、それは、上
記RNA発現パターンを決定する方法であり、更に、当該試薬(または条件)の存在下作成するRNA発現パターンを多種の一群の条件下作成するRNA発現パターンに比
較することを含む。

【００１１】実施例の方法により、図1および2は、本発明の組合せおよびmRNA標的の検出に
それを使用する方法を示す。図2に示す本発明の表面は、15の同一試験領域を含む；本発明の特に好ましい実施態様では、これら各試験領域はマイクロタイター
プレート中のウェルである。各試験領域は、6種のアンカーを含み、ここでは番号1-6で示す。図1で概要を示しているのは、当該アンカーの1つ、アンカー1であ
り、本発明の最も好ましい態様では、オリゴヌクレオチドである。アンカー1に、2つの部分を含むリンカー分子、リンカー1を結合させる。第1の部分はアンカーに特異的であり、この図中ではアンカーに特異的に結合し得るオリゴヌクレオ
チドである。第2の部分は、目的の標的、ここでは標的mRNA1、に特異的なプロー
ブであり、この図中では当該標的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドで
ある。この図中では示していないが、残りの5つのアンカーはそれぞれ、自身のリンカーとアンカー特異的部分を介してハイブリダイズし得る；各リンカーは、
例えばmRNA1と異なる(またはmRNA1と同一の)mRNAに特異的なプローブ部分を含み
得る。この示した組合せを用い、15種ぐらいのサンプルをmRNA1の存在のため同時(または、アレイ中の他の5つのプローブにより特定(プログラム)されるmRNA標
的の場合、同時に)にアッセイし得る。アッセイを行うため、この例において、1
5の独立したセルラインの1つsayのRNA抽出物となり得る各サンプルを、少量の体
積で1つの領域、ウェルに加え、プローブおよび標的のハイブリダイゼーションが効率的となる条件下インキュベーションする。mRNA1がサンプル中に存在するかどうか決定するため、パターンを認識し得、および/またはシグナルの存在のため各領域内の特定位置に応答指令信号を送り得る検出装置を用いる。セルライ
ンを、mRNAがインビボでタグで標識される条件下インキュベーションするならば
、そして、mRNA1がサンプル中に存在するならば、ディテクターは、アンカー/プ
ローブ複合体1により決まる位置でタグをつけたmRNAから放射するシグナルを検出する。他に、領域(ウェル)に添加する前または後に、mRNAを直接インビトロで
標識し得る。他に、図1に示したように、プローブにハイブリダイズさせる前または後に、例えば、プローブにより認識される以外の配列に相補的であるタグを
つけた“ディテクター”オリゴヌクレオチド(標的−特異的レポーターオリゴヌクレオチド)と共にRNAをインキュベーションすることにより、mRNAに間接的にタ
グをつけることができる。図示した例では、15のサンプルを同時に分析し得る。
少なくとも20またはそれ以上、例えば1536ぐらいか、それ以上のサンプルが本発
明により同時に分析され得るため、それは超ハイスループットアッセイシステム
であるといえる。

【００１２】本明細書中で使用するとき、“標的”とは、存在、活性および/または量が望ましくは決定され、所定のプローブに親和性を有する物質について言及する。標
的は、人工的か、または自然に生ずる物質であり得る。また、それらは、不変化
の状態か、または他の種類との集合体として用い得る。標的を、共有結合的か、
または非共有結合的に、結合膜に、直接かまたは特定結合物質を介して結合し得
る。本発明で用い得る標的の例には、レセプター(小胞、脂質、細胞膜または様々な他のレセプターにおける)、リガンド、レセプターに特異的なアゴニストまたはアンタゴニスト、抗原決定基に特異的に反応するポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体および抗血清(ウイルス、細胞または他の物質のような)、薬剤、
核酸またはポリヌクレオチド(mRNA、tRNA、rRNA、オリゴヌクレオチド、DNA、ウ
イルス性RNAまたはDNA、EST、cDNA、RNAまたはDNAから誘導するPCR増幅産物、な
らびに変異、変異体またはそれらの修飾)、タンパク質(神経伝達物質の切断に応
答するようなもの、プロテイナーゼ、キナーゼなどの酵素を含む)、酵素の基質、ペプチド、補因子、レクチン、糖、ポリサッカライド、細胞、細胞膜、オルガ
ネラなど、ならびに複合、共有結合架橋などの型で存在する分子または他の物質
を含むが、これらに限らない。本明細書中で使用するとき、核酸、ポリヌクレオ
チド、ポリ核酸およびオリゴヌクレオチドは取り換えることができる。標的はま
た抗-プローブとして言及し得る。

【００１３】本明細書中で使用するときは、“プローブ”は、物質であり、例えば、特定の
標的により特異的に認識され得る分子である。可能性あるプローブ/標的または標的/プローブ結合パートナーの型には、レセプター/リガンド、リガンド/アンチリガンド、DNA/DNA、DNA/RNA、PNA(ペプチド核酸)/核酸を含む核酸(ポリヌクレオチド)相互作用、酵素、他の触媒、または基質、小分子またはエフェクター分子を含む他の物質などを含むが、これらに限らない。本発明が目的とするプロ
ーブの例は、有機または無機物質または金属を含むポリマー、キレート化剤、ま
たは金属、プラスチック、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト
、トキシンおよびベナム(venom)、ウイルス性エピトープ、ホルモン(例えば、オ
ピオイドペプチド、ステロイドなど)、ホルモンレセプター、脂質(リン脂質を含
む)、ペプチド、酵素(プロテーゼまたはキナーゼのような)、酵素基質、補因子、薬剤、レクチン、糖、核酸(オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、PNAもしくは修飾
もしくは置換核酸を含む)、オリゴサッカロイド、タンパク質、酵素、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、一本鎖抗体もしくはそのフラグメントと特異
的に相互作用する他の化合物を含むが、これらに限らない。プローブポリマーは
、直線状か、環状であり得る。プローブは、特異活性または特異結合の何れかの
効力により、リン酸化および非リン酸化タンパク質を識別し得る。レクチンのよ
うなプローブはグリコシル化タンパク質を識別し得る。本明細書中で使用すると
き、核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸およびオリゴヌクレオチドという語は置
き換えることができる。“プローブ”として上記した任意の物質はまた“標的”
およびその逆としての働きをし得る。

【００１４】任意の互換性のある表面を本発明のと共に用い得る。表面(通常固体)は任意の
多種の有機または無機物質またはそれらの組合せであり、ポロプロピレンまたは
ポリスチレン、セラミック、シリコン、例えばガラス顕微鏡スライドまたはガラ
スカバースリップの厚さを有する(融合)シリカ、石英またはガラス、フィルター
ペーパーのような紙、ジアゾ化セルロース、ニトロセルロースフィルター、ナイ
ロン膜、またはポリアクリルアミドゲルパッドが単に例として含まれる。光に透
明である基体は、アッセイを実施する方法に光学的検出が含まれる際に、有用と
なる。好ましい態様では、表面は、マルチウェルのプラスチック表面であり、例
えば、組織培養ディッシュ、例えば24-、96-、256-、384-、864-または1536-ウェルプレート(例えば、Corning Costar DNA Bind plateのような修飾プレート) である。アンカーは、例えば表面と直接結合し得るか、または1つの型の表面、例えばガラスと結合し得、次いで、例えば、二次表面、例えばマイクロタイター
ディッシュ中のプラスチック“ウェル”内の表面と接触して位置する。表面の形
は重要ではない。例えば、四角、矩形もしくは丸形のような平坦表面、曲線表面
、またはビーズ、粒子、繊維、沈殿、チューブ、球のような3次元表面であり得る。

【００１５】表面は、空間的に分離され、アドレサブル(addressable)または同定可能な領域を含む。各領域は、一群のアンカーを含む。どのように領域が分離されるか、
それらはどのような物理的性質であるか、そして、どのように相互に相対的に方
向付けられるかは、重要ではない。ある実施態様では、領域は、液体の通過を妨
げる任意の物理的バリアーにより相互に分離され得る。例えば、好ましい実施態
様では、領域は、マルチウェル(例えば、組織培養)ディッシュのウェルとなり得
、例えば、24-、96-、256-、384-、864-または1536-ウェルプレートである。他に、ガラス表面のような表面をエッチングすると、例えば、864または1536の分離された浅いウェルとなり得る。他に、表面は、仕切りまたはウェルのない領域
を含み得、例えば、平坦表面であり、例えば、プラスチック、ガラスまたは紙の
切片であり、そして、個々の領域は、分離領域を形作る構造(例えばプラスチックまたはガラス片)を覆うことにより更に決定され得る。所望により、表面は、個々の領域が形作られる前に、アンカーまたはリンカーと結合するアンカーの1 つまたはそれ以上のアレイを既に含み得る。他の実施態様では、各領域の内のア
ンカーのアレイは相互に分離され得、それは、アンカーのない表面上のブランク
スペース(blank space)によるか、または小滴の分散を防止するワックスまたはシリコンのような化学的境界(chemical boundary)による。また他の実施態様では、領域は、チューブまたは液体調節チャンネルとして決定され得、例えば、Be
attie et al (1995) Clin. Chem. 4, 700-706に開示するようなフロースルーアッセイとして設計され得る。表面内または表面上などの領域もまたそれ自身の表
面の修飾により決まり得る。例えば、プラスチック表面はまた、修飾または誘導
プラスチックで作成した部分を含み、それは、例えば、特定の型のポリマーを加
える部位としての働きをし得る(例えば、PEGをポリスチレン表面に結合し得、次
いで、カルボキシルまたはアミノ基で、二重結合、アルデヒドなどを誘導する。
)。他に、プラスチック表面は突出(protrusion or bump)のようなモールドした構造を含み得、それは、アンカーの添加のためのプラットフォームとしての役割
をし得る。試験領域の相対的な方向付けは、任意の多様な型となり、それらには
、四角または矩形または他の表面内の平行または垂直なアレイを含むがこれらに
限らず、それらは、丸または他の表面、または直線状アレイなどのアレイに容易
に拡張される。

【００１６】本発明の空間的に分離された領域は、マルチプルコピー(multiple copy)内に存在する。すなわち、少なくとも2つ、好ましく少なくとも20、または少なくとも約24、50、96、256、384、864、1536、2025、またはそれ以上などであり、実質的にそれらは同一であり、空間的に分離(分断された)領域である。繰り返し領
域の数の増加により、ますます、より高いスループットのアッセイをし得る。本
明細書中で使用するとき、実質的に同一の領域とは、同一または実質的に同一の
アンカーのアレイおよび/またはアンカー/リンカー複合体を含む領域について言
及する。本明細書中で使用するとき、実質的に同一とは、本発明に従い標的を分
析する前後関係において、アレイまたは領域が、他のアレイまたは領域と本質的
に同一の機能として働くことを意味する。機能に実質的に影響しない相違、すな
わち、標的の検出可能性は、小ヌクレオチド不完全性(脱落/挿入/置換)またはオ
リゴ不完全性(弱い表面結合)などの系に沿い、それらは、アッセイの正確性にお
いて、標的決定結果に重要な影響を与えない。

【００１７】もちろん、当業者ならば、表面上のすべての領域が相互に実質的に同一である
必要はないことを認識し得る。例えば、2種の一群のアレイが平行に試験され得るならば、単一表面上の一群のアレイを両方含むことが利点となり得る。例えば
、2種の一群のアレイを、互い違いにストリッピングしたパターンに配置し、それらの間での比較を促進し得る。他の実施態様では、従事者は、表面上の他の領
域と識別し得る方法で検出し得る1つまたはそれ以上の領域を含み、それによって、“登録領域”として使用し得ることを希望する。例えば、登録領域は、オリ
ゴヌクレオチドまたはペプチドを含み、それにより、表面上の領域の位置に配置
される“開始点”としてスキャンニング検出装置が認識し得る蛍光分子の明瞭な
パターンが示される。

【００１８】試験領域の大きさおよび物理的空間は制限されない。典型的な領域は、面積が
約1ないし約700mm²、好ましくは1ないし40mm²であり、そして約0.5ないし約5mm 離れており、含まれる面積に応じて通常選択され得る。好ましい実施態様では、
領域は約5mm離れている。例えば、各領域は、矩形グリッドを有し、それは、例えば、8列および6段からなり、直径約100マイクロメーターであるアンカーの粗い環状スポットで500マイクロメーター離れている；その領域は、面積20平方ミリメーターである。より大きな領域およびより小さな領域ならびに空間が含まれ
る。

【００１９】領域はまた、領域内の幾つかまたはすべてのアンカーは、例えば、へこみ(ind
entation)および小さなくぼみ(dimple)によって、隣接するアンカーから物理的に分離されるように、更に再分割される。例えば、多くの領域内の再分割(小区域)は、約10ないし約100またはそれ以上もしくはそれ未満の範囲となり得る。あ
る実施態様では、1536-ウェルディッシュのウェルである領域を、より小さいウェルに更に再分割し、例えば、約4ないし約900、好ましくは約16ないし約36ウェ
ルとし、それにより、ウェル内のウェルにアレイに形成し得る。図4参照。そのくぼんだ表面により、各設計した空間(位置)に単一のアンカー(またはアンカーの群)を物理的に位置させるのに必要な強度が弱くなり、そして、アンカーを含む領域の大きさが、より均一となり、それにより、ブローブへ結合する標的の検
出が促進される。

【００２０】本明細書中で使用するとき、“アンカー”という語は、任意の存在物または物
質について言及し、例えば、その分子(またはその物質と実質的に同一の“グループ”(図7参照))は、表面と結合するか(例えば、表面において固定化されるか、または共有結合的もしくは非共有結合的の何れかで結合する)、またはその表面の部分であり(例えば、プラスチック表面の誘導部分)、そして、本明細書に記
載のようにリンカーまたは他の物質と特異的に相互作用するか、もしくは結合し
得る。本明細書中で使用する場合、アンカーおよびリンカーが特定の方法で分子
会合を介して組合される際、“アンカー/リンカー複合体”が存在する。リンカーとの相互作用は、ある共有結合のように不可逆的か、または核酸ハイブリダイ
ゼーションのように可逆的であり得る。好ましい実施態様では、アンカーは核酸
であり、それは、任意の長さ(例えば、オリゴヌクレオチド)または型(例えば、D
NA、RNA、またはRNAもしくはDNA分子のPCR産物)となり得る。核酸は、修飾または置換され得る(例えば、イノシンのような天然には生じないヌクレオチド；スルファメート、スルファミド、ホスホチオネート、メチルホスホネート、カルバ
メートなどのような様々な既知連結を介する結合；またはDNAストレプトアビジン結合のような半合成分子を含む)。一本鎖核酸が好ましい。アンカーはまたペプチドまたはタンパク質である。例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体分子またはそのフラグメント、または一本鎖抗体またはそのフラグメントで
あり得、それらは、抗原または抗-抗体分子であるリンカーの部分に特異的に結合する；表面では、アンカーはペプチドであり得、そして、それれに結合するリ
ンカー部分は抗体などである。他の実施態様では、アンカーはレクチン(カブトガニ、ピーナッツ、ヤエナリ、Phaseolus、小麦麦芽などのような生物由来のコンカナバリンAまたは凝集素)であり、特定の炭水化物に特異的である。他の実施
態様では、アンカーは、修飾または誘導プラスチックポリマーのような有機分子
であり得、それらは、例えば、オリゴヌクレオチドの特定の固体相化学合成の段
階としての働きをし得る。この場合、誘導プラスチックは、製造過程の組合せの
プラスチック表面に完全に形成される、分離した、誘導された位置のアレイとし
て分配され得る。他の実施態様では、アンカーは、金属イオン、例えば、Ni、Zn
、Ca、Mgなどと特定のタンパク質もしくはキレート剤との間で特異的または選択
的な結合に有利となり得る。例えば、アンカーはポリヒスチジンであり得、リン
カーのアンカー特異的部分はニッケルであり得、それは、ニッケルキレート化剤
を介して標的特異的プローブに結合する。他に、キレート化剤は、アンカーおよ
びポリヒスチジンプローブ関連部分であり得る。他に、アンカーは無機物質であ
り得る。例えば、カルシウムおよびマグネシウムのような金属であり得、リンカ
ーのアンカー特異的部分は、それぞれ、EDTAまたはEGTAのような選択的キレート
化剤であり、それは標的特異的プローブに結合する。当業者ならば、広範囲の他
の型の分子もまた、プローブおよび標的に関連して考察される一般的な型のよう
なアンカーとしての働きをし得る。

【００２１】試験領域中のアンカーの数は、少なくとも2つ、好ましくは約8から約900の間(
それよりも多い場合および少ない場合を含む)、より好ましくは約8から約300の間、そして最も好ましくは約30から約100の間(例えば約64)であり得る。幾つかの好ましい実施態様では、96試験領域(例えば、ウェル)を有する表面の場合約16
、36、45または100のアンカー/試験領域または384試験領域(例えば、ウェル)を有する表面の場合、約9、16または25のアンカー/試験領域がある。最も好ましい
実施態様では、試験領域中の各アンカーは、アレイ中、他の何れのアンカーとも
異なる特異性を有する。しかし、2つまたはそれ以上のアンカーは同じ特異性を有し、すべてのアンカーは同一となり得る。本発明の組合せが非常に多くの試験
領域を含み(例えば、約864、1536またはそれ以上)、そのため多数の試験サンプルが同時に処理され得る、ある実施態様では、限られた数(例えば、約2、4、6ま
たは9)のパラメーターのみに関し当該サンプルを試験することが目的とされる。
換言すれば、非常に多数の領域を含む組合せの場合、領域あたり約2ないし9アン
カーのみを有することが利点となる。

【００２２】試験領域内または試験領域上のアンカーの物理的空間および相対的方向付けは
限定されない。典型的に、アンカー同士の距離は、約0.003ないし約5mmまたはそ
れ未満、好ましくは約0.03と約1との間である。より長いおよびより短いアンカー空間(および面積)が含まれる。アンカーが、相互および領域の境界に相対的な
任意の方向付けで配置され得る。例えば、それらは、四角、矩形、六辺形または
他のアレイ、または放射線または同心円の中心から放射するアンカーを有する環
状アレイのような二次元的方向付けで配置され得る。アンカーはまた、一次元の
直線アレイで配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNA配列に
従って特異的位置にハイブリダイズし得、超分子アレイを形成し得る。他に、ア
ンカーは“バーコード”様型となり得る(図6参照)。例えば、アンカーは相互に平行なロングラインとなり得る。各ロングラインの間またはその幅の距離は、調
節された方法で変化し得、バーコードのような単なる認識パターンが生じ、例え
ば、第1のおよび3番目のラインは残りの広さの2倍となり得、ラインは取り除かれるなどされ得る。エクストラエンプティーラインは、1つの試験領域をはっきりと区別する最後のラインの後に位置され得、バーコードパターンは連続的な試
験領域で繰り返され得る。

【００２３】アンカーのパターンは、分離したアッセイウェル(試験領域)または分離アッセ
イ小滴の位置を明確に登録する必要はない。“アッセイ位置”という語は、アッ
セイサンプルが適用されるアッセイ表面の位置の言及に使用される(これらは、アッセイサンプルの分離した小滴の位置により、または例えばマルチウェルプレ
ート上の個々のアッセイウェルを決める壁または仕切りの位置により決められる
)。アンカーパターン自体(例えばオリゴヌクレオチドアンカーの“バーコード”
様パターン)を用い、各分離アンカーがパターン認識により正確に決められ、ちょうど各バーコードのラインが残りのラインに相対する位置により認識される。
このため、第1のアンカーは、各アッセイ位置の1つの端または1つの角を必要としない。第1のアンカーは、アッセイ位置に相対する位置よりもむしろパターン認識により発見される。各アッセイ位置(例えば、小滴の面積またはウェルの面積)で使用される面積が、アンカーの繰り返しパターンの少なくとも1つの全体の
単位を含むのに十分広い限り、次の各アッセイ点は、パターンラインがアッセイ
位置の面積内にあるところはどこでも(バーコード)パターンにより特定されるす
べての標的のアッセイ位置のサンプルを試験する。

【００２４】アンカーは、各試験領域内の明確または固定されたパターンで配置される必要
はない。例えば、各アンカーは、粒子、ビーズなどに結合し得、それらは試験領
域内のランダムな位置と仮定される。各アンカーの位置は、例えば検出可能なタ
グの使用により決定され得る。例えば、各型のアンカーに特異的なリンカー分子
は、種々の蛍光、ルミネセンスなど、タグで標識され得、特定リンカー/アンカー対を含む粒子の位置は、リンカーから放射するシグナル、例えば、励起または
放射スペクトルの性質により同定され得る。当業者ならば、種々の結合したタグ
であって、それぞれ認識し得るスペクトルを有する一群のリンカーを調製し得る
。他に、アンカーは直接標識され得る。例えば、各型のアンカーをタグで標識し
得、そのタグは様々なスペクトルを有する蛍光を他の型のアンカーにおいて発す
る。他に、粒子、ビーズなどは、大きさまたは形について相互に異なっている。
本明細書中で記載する任意の標識および検出方法を用い得る。例えば、蛍光は、
CCDを基にするイメージングシステムにより、スキャンニング蛍光顕微鏡またはF
luorescence Activated Cell Sorter(FACS)により測定され得る。

【００２５】アンカーは、リンカー分子のある部分-アンカー特異的部分-と特異的に相互作
用するか、または結合し得る。“相互作用”または“結合”という語は、本明細
書中では、2つの物質または化合物(例えば、アンカーおよびリンカーのアンカー
特異的部分、プローブおよびその標的、または標的および標的特異的レポーター
)が相互に結合し(例えば、結合(attached, bound)、ハイブリダイズ、結合(join
ed)、アニール、共有結合(covalently linked)、または他の結合)、十分に目的のアッセイを行い得ることを意味する。“特異的”または“特異的に”という語
は、本明細書では、2つの化合物(例えば、アンカーおよびリンカーのアンカー特
異的領域、プローブおよびその標的、または標的および標的特異的レポーター) が相互に選択的に結合し、任意の保護技術のない場合、当該成分に結合すること
を目的としない他の成分には通常結合しない。特異的相互作用を達成する必要の
あるパラメーターを、例えば当分野の通常の技術を用い、通常決定することがで
きる。

【００２６】例えば、核酸の場合、当業者ならば、他の物質または分子(例えば、他のオリゴヌクレオチドリンカー)への非特異的ハイブリダイゼーションを最小化する一方、選択したストリンジェンシー条件下、他の核酸にハイブリダイズさせ得る核
酸(例えば、オリゴヌクレオチドアンカー)の特徴(長さ、塩基組成物および相補性の程度のような)を実験的に決定することができる。典型的に、アンカーのDNA
または他のアミノ酸配列、リンカーの部分、ディテクターオリゴヌクレオチドは
、その結合対と十分相補性があり、選択したストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下ハイブリダイズでき、Tmは室温よりも約10から20℃高くなり得る( 例えば約37℃)。通常、オリゴヌクレオチドアンカーは、長さ約8ないし約50ヌク
レオチド範囲となり得、好ましくは15、20、25または30ヌクレオチドとなり得る
。本明細書中で使用するとき、“高いストリンジェントハイブリダイゼーション
条件”とは、核酸同士で少なくとも95％、好ましくは約97％から100％のヌクレオチド相補性(同一性)があるときにハイブリダイゼーションが生じる任意の条件
を意味する。しかし、望ましい目的に応じて、ハイブリダイゼーション条件は選
択され得、低い相補性、例えば、約90％、85％、75％、50％などを必要とする。
変わり得るハイブリダイゼーション反応パラメーターでは、塩濃度、緩衝液、pH
、温度、インキュベーション時間、ホルムアミドのような変性剤の量および型な
どがある(例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2d ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, New York; Hames et
al.(1985). Nucleic Acids Hybridaization, IL Press; Davis et al. (1986),
Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., N
ew York)。例えば、核酸(例えば、リンカーオリゴヌクレオチド)を、試験領域( 例えば、マルチウェルプレートのウェル-好ましい実施態様では、96または384ま
たはそれ以上のウェルプレート)に、体積約0.1ないし約100またはそれ以上のμl
(好ましい実施態様では、約1ないし約50μl、最も好ましくは約40μl)で、例えば6XSSPE-T(0.9 M NaCl、60mM NaH₂PO₄、6mM EDTAおよび0.05% TritonX-100)のような緩衝液中、濃度約0.01ないし約5μM(好ましい実施態様では約0.1μM)で、
加えることができ、約10分ないし少なくとも3時間(好ましい実施態様では、少な
くとも約15分間)、温度約4℃ないし約37℃(好ましい実施態様では、おおよそ室温)の範囲で結合対(例えば、表面上のオリゴヌクレオチドアンカー)にハイブリダイズすることができる。条件を選択し、ハイスループットとすることができる
。本発明の1つの実施態様では、反応条件はおおよそ生理条件である。

【００２７】例えば、アンカーまたはリンカーの部分としての働きをし得る他の型の物質ま
たは分子(例えば、ポリペプチド、レクチンなど)の設計、および結合対との特異
的相互作用に必要な反応条件は当分野には通常であり、一般的である(例えば、N
iemeyer et al (1994) Nucleic Acids Res. 22, 5530-5539; Fodor et al (1996
)米国特許番号5,510,270; Pirrung et al (1992)、米国特許番号5,143,854に記載の通り)。インキュベーションパラメーターには、緩衝液、塩濃度、pH、温度、インキュベーション時間、担体および/または試薬または非特異的相互作用を減少する条件がある。例えば、アンカーとして抗体を含む試験領域(例えば、マルチウェルプレートのウェル-好ましい実施態様では96または384またはそれより
多いウェルプレート)に、抗-抗体(例えば、抗原または抗体特異的二次抗体)を、
体積約0.1ないし約100またはそれよりも多いμl(好ましい実施態様では、約1ないし約50μl、最も好ましくは約40μl)で、例えば、6XSSPE-T、PBSまたは生理食
塩水のような緩衝液中、濃度約10pMないし約10nM(好ましい実施態様では、約1nM
)で加えることができ、表面上のアンカーと共に、約10分ないし少なくとも約3時
間(好ましい実施態様では、少なくとも15分間)、温度約4℃ないし45℃の範囲(好
ましい実施態様では、約4℃)でインキュベーションし得る。ペプチドアンカーの
場合、約5ないし約20の長さのアミノ酸が好ましい。

【００２８】本発明の幾つかの実施態様では、アレイ中の各アンカーは、選択した反応条件
下、アレイ中の他のアンカーと実質的に同程度に、相当するリンカーのアンカー
特異的部分と相互作用し得る。これにより確実となるのは、アンカーによるリン
カーおよびそのプローブの実質的に均一のアレイに対する特異性である。

【００２９】試験領域内のアンカーは、“包括的な”群であり得、1つまたはそれ以上の様々なリンカーと相互作用し得る各アンカーであり、それぞれ、異なる“プローブ
”部分以外のアンカーに特異的な部分がある；そのため、包括的アンカーの単一
のアレイを用い、様々な一群のプローブをプログラムまたは決定する。アンカー
のその包括的アッセイの順応性を図1および2に引用して示す。図2は15の試験領域を含む表面を示し、それぞれ、6種のアンカーのアレイを含み、実施例中ではオリゴヌクレオチドである。図1は、これらアンカーの1つ(オリゴヌクレオチド)
、アンカー1を概略し、それらは、アンカー1に特異的である1つの部分および標的mRNA1に特異的な第2の部分を含む、リンカー1と接触する。他に、あるものは、例えば、リンカー2と置換され、リンカー1のように、アンカー1に特異的な部分を含むが、標的mRNA1の代わりに標的mRNA2に特異的な第2の部分を含む。そのため、アンカー1を用い、2つまたはそれ以上の種々の標的mRNAの何れか用のプロ
ーブを明記(またはプログラム、または定義、または決定)し得る。オリゴヌクレ
オチドまたはペプチドのハイレゾリューションパターン(アレイ)を作成し、結び
つける方法は、高価であり、時間がかかり、および/または物理的に困難となり得る。アンカーの前形成アレイを用い、多種のプローブアレイをプログラムする
能力は、本発明の1つの利点である。

【００３０】図2に示す包括的アンカーにより、オリゴヌクレオチドプローブのパターンが決定されるけれども、同一アンカーアレイもまた使用され、他のタンパク質、例
えば、レセプタータンパク質(図3参照)のアレイをプログラムし得る。明らかに、多くの入れ替えが可能であり、アンカー/リンカー相互作用の型の所定の範囲、例えば、タンパク質/抗体の組合せのような“サンドイッチ”または“ピギーバック”プローブの多数の複合層が得られる。そのため、この発明のアンカーの
表面自身、新規な利点を提供する。

【００３１】本発明のある実施態様では、アンカーは、可逆的にリンカーと相互作用し得る
；そのため、包括的一群のアンカーは再利用され、種々の一群のプローブをプロ
グラムし得る。例えば、オリゴヌクレオチドアンカーは、例えば、2つのオリゴヌクレオチドが解離する過熱段階により、リンカーのオリゴヌクレオチド部分か
ら分離され得、次いで、二次リンカーと再結合する。高価であり、時間がかかり
、および/または作成に物理的困難を有する、アンカーアレイを再利用する能力は、本発明の他の利点である。

【００３２】アンカーが、リンカーと相互作用する必要はない。例えば、アンカーは、蛍光
色素のような検出可能な分子と結合し得(直接的または間接的)、それによって、
例えば、試験表面およびディテクターとの間の登録の目的で、グリッド内のスポ
ットを位置付け得る。他に、アンカーを既知量の検出分子で標識し得る。例えば
、較正の目的で内部定量マーカーとして用いるためである。

【００３３】本明細書中で使用する“リンカー”という語は、選択した(設計した)アンカー
またはアンカーのサブセット(“アンカー-特異的”)に特異的である第1の部分( 成分または部分)および目的の標的(“標的-特異的”)に特異的なプローブである
第2の部分を含む二官能性物質として言及する。リンカーの2つの部分は、共有結
合的または非共有結合的連結を介して結合し得、中間体に直接または中間体を介
して結合し得る。

【００３４】リンカーのアンカー特異的部分の化学的性質は、もちろん、アンカーまたは相
互作用するアンカーの機能である。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドなら
ば、相互作用するリンカーの部分は、例えば、オリゴヌクレオチドに特異的に結
合するペプチドであり、選択したストリンジェント条件下で効率的および特異的
にハイブリダイズし得る。核酸は、例えば、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、PN
A、PCR産物、または置換もしくは修飾核酸(例えば、イノシンのような天然には生じないヌクレオチド；スルファメート、スルファミド、ホスホチオネート、メ
チルホスホネート、カルバメートなどのような様々な既知連結を介する結合；ま
たはDNAストレプトアビジン結合のような半合成分子を含む)であり得る。一本鎖
成分が好ましい。オリゴヌクレオチドアンカーに特異的なリンカー部分は、長さ
約8ないし50ヌクレオチドの範囲、好ましくは約15、20、25または30ヌクレオチドである。アンカーが抗体ならば、相互作用するリンカーの部分は、例えば、抗
-抗体、抗原、またはアンカーと特異的に相互作用し得る分子の1つの小フラグメ
ントであり得る。上記他のタイプのアンカーと特異的に相互作用し、そして、ア
ンカー-特異的なリンカー部分としての働きをする物質または分子もまた、当分野に既知であり、通常の方法を用い設計し得る(例えば上記参照)。

【００３５】標的-特異的なリンカーの部分の化学的性質は、もちろん、プローブであり、相互作用する標的の機能である。例えば、標的が、特にmRNAならば、標的-特異的なリンカーの部分は、例えば、標的に特異的に結合するオリゴヌクレオチドで
あるが、選択したハイブリダイゼーション条件下、RNAまたはDNAを阻害する。当
業者ならば、当分野に既知の方法を用い、標的に所望によりハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドの特徴を実験的に決定し、非側異的な阻害DNAまたはRNAへの
ハイブリダイズを最小とする(例えば、上記参照)。通常、非標的RNAの過剰のバックグラウンドに存在する標的mRNAの識別に使用するオリゴヌクレオチドプロー
ブの長さは、約8ないし約50ヌクレオチドの範囲、好ましくは約18、20、22または25ヌクレオチドである。拮抗標的のあまりない生化学的アッセイで使用するオ
リゴヌクレオチドプローブはより短くなり得る。当分野に既知の方法(例えば、コンピュータープログラムBLAST)を用い、オリゴヌクレオチドプローブの配列を
、既知の遺伝的データベースにおいて可能性のある阻害配列と相互に関係せず、
類似しないように、選択し得る。オリゴヌクレオチドプローブによるRNAへの特異的なハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーション条件の選択が、
当分野に認識される方法を用い、決定することができる(例えば、上記参照)。例
えば、標的RNA[例えば、マルチウェルマイクロタイタープレート(例えば、96または384またはそれ以上のウェル)のウェルのような任意の容器において、組織ま
たは増殖細胞から抽出した全RNAまたはmRNA(および所望により目的の試薬で処理
した)]を、6XSSPE-Tまたは他の緩衝液中、オリゴヌクレオチドプローブアレイを
含む試験領域に添加し得(上記参照)、所望により、非特異的結合(例えば、破砕したニシンまたはサケ精子DNA、または酵母RNA、約0.5mg/ml)を減少させる試薬を含み、約10分ないし少なくとも18時間(好ましい実施態様では、約3時間)の範囲の時間、経験的に決めた温度でインキュベーションする。ハイブリダイゼーシ
ョンするストリンジェンシーは、アンカー-特異的なリンカー部分にアンカーを結合させるのに用いるストリンジェンシーと同一か、またはそれよりも弱い。他
の型のプローブの設計および使用はまた、例えば、上記考察したように当分野に
通常である。

【００３６】アンカー-特異的および標的-特異的なリンカーの部分を、任意の様々の共有的
または非共有的結合により、結合(join, attach, link)し得、その性質は本発明
の本質ではない。2つの部分を直接、または中間分子を介して連結し得る。リンカーの両方の部分がオリゴヌクレオチドである、ある実施態様では、ホスホジエ
ステル結合のように共有結合し得、単一の、同一線上の核酸を形成する。アンカ
ー-特異的な部分がオリゴヌクレオチドであり、標的-特異的な部分がレセプター
、例えばレセプタータンパク質である他の実施態様では、2つの部分はビオチンおよびストレプトアビジン分子の相互作用を介して結合し得、その例を図3に示す。多種のその連結は既知である(例えば、Niemeyer et al (1994). NAR 22, 55
30-5539)。他に、2つの部分が直接結合し得、例えばオリゴヌクレオチドがアミド化され、次いでアミド結合を介してペプチドまたはタンパク質に直接結合(例えば架橋)するか、またはアミド結合または脂質結合を介して膜成分に結合し得る。その共有結合または非共有結合を形成する方法は通常であり、当業者により
容易に最適化される。

【００３７】 2つの物質が結合(例えば、2つの核酸、2つのタンパク質、タンパク質プラス核
酸または他のもののインキュベーションにより)し、複合体(例えばアンカー/リンカー複合体のような)を形成した後、生成した複合体を所望により処理(例えば
、洗浄)し、特異的相互作用未処理物を残すが、非特異的結合物質を取り除くように実験的に決定した条件を用い、非結合物質(例えば、リンカー)を取り除く。
例えば、反応混合物を、1回ないし約10回またはそれ以上、複合体(例えば、アン
カー/リンカー複合体)の達成に使用する条件と同じか、それより幾らか高ストリ
ンジェンシーである条件下で洗浄し得る。

【００３８】本発明の組合せは、通常の技術を用い通常通り製造され得る。

【００３９】本発明に使用し得る幾つかの表面は、商業上の提供者より容易に利用できる。
好ましい実施態様では、表面は、Corning Costerにより販売されている修飾プレ
ートのような96-、384-または1536-ウェルマイクロタイタープレートである。他
に、表面はウェルを含み、次いで、へこみまたは“くぼみ”を含み、アルミニウ
ムまたはスチールのようなミクロ機械加工物質により形成され、モールドを調製
し、次いで、プラスチックまたは同様の物質をモールドにミクロ注入し、図4に示すような構造を形成する。他に、図4に示すような構造には、ガラス、プラスチック、セラミックなどが含まれ、例えば、図5に示されるような3つの切片から
アセンブリされ得る；ウェル仕切り(図5a)と呼ぶ第1の部分はサンプルウェル間の分離を形成する；サブディバイダー(subdivider)(図5b)と呼ぶ第2の部分は各試験ウェル内に再分割またはくぼみを形成する；そして、基盤(図5c)と呼ぶ3つ目の部分はプレートの基盤および試験ウェルの下側表面を形成する。例えば、仕
切りは、金属、例えばシリコンの切片であり、それを通る穴があり、それぞれの
穴は、3つの切片が結合するとき試験ウェルの壁を形成する。サブディバイダーは、例えば、薄い金属片、例えば、シリコンであり、スクリーンまたは良好な網
の形をしている。基盤は、金属、例えばガラスの平坦切片であり、例えば、生物
化学アッセイに用いる典型的なマイクロプレートの下側部分の形となる。基盤の
上側表面は、図5cに示すように平坦であるか、またはサブディバイダー型で配置
されるへこみを形成し得、各サンプルウェル内に完全な再分割、またはウェルを
提供する。3つの切片は標準的な方法、例えばシリコンウェハーのアセンブリを用いる方法により結合され得る。

【００４０】オリゴヌクレオチドアンカー、リンカー部分、またはディテクターは、通常の
技術、例えば、商業上のオリゴヌクレオチド合成機により、および/または合成されるサブフラグメントに連結することにより、合成され得る。本発明のある実
施態様では、オリゴヌクレオチドアンカーのような実施する核酸アンカーの位置
を定め得、それは、試験領域の表面上または表面内であり、ホトリトグラフまた
はシルクスクリーン化学結合、インクジェット技術による配置、キャピラリー、
スクリーンまたは液体チャンネルチップ、電極アレイを用いる電気化学的パター
ニング、ピンまたはクウィルとの接触、またはフィルターの加熱またはUV照射後
の変性を含む、任意の様々な通常の技術による(例えば、Rava et al (1996) 米国特許番号5,545,531;Fodor et al (1996) 米国特許番号5,510,270;Zanzucchi e
t al (1997) 米国特許番号5,643,738;Brennan (1995) 米国特許番号5,474,796;P
CT WO 92/10092; PCT WO 90/15070参照)。アンカーを試験領域の表面の上部に置
くか、または例えば、表面から幾つかのアンカーを突き出す形態の表面内にはめ
込まれたポリアクリルアミドゲルパッドの場合であり、リンカーとの相互作用が
可能となる。好ましい実施態様では、実施したオリゴヌクレオチドアンカーは、
遊離アミノ基を有する5'末端で誘導される；50mM リン酸緩衝液 pH8.5および1mM
EDTAのような緩衝液中、経験的に決定された濃度で溶解する；そして、Pixus n
anojet dispenser(Cartesian Technologies)で、約10.4ナノリッターの小滴で、
上側表面が新しい乾燥DNA Bind plate(Corning Costar)である試験ウェル内の特
定位置に分配する。オリゴヌクレオチド結合および蒸発の相対的な速さに応じて
、調製の際にウェルの湿度を調整する必要がある。他の実施態様では、オリゴヌ
クレオチドアンカーは、試験領域の表面上に、例えば、伸張するオリゴヌクレオ
チド鎖の光活性化脱保護のような通常の方法を用い、直接合成され得るか、また
は、ナノジェットディスペンサーを用い、不活性化化合物のナノリッター小滴の
パターン化した分配により、合成され得る。例えば、単一ヌクレオチドを受ける
すべての伸張配列の脱保護が行われ得、次いで、ヌクレオチドを表面に加える。

【００４１】ペプチド、タンパク質、レクチン、キレート化実施態様、プラスチックおよび
他の型のアンカーまたはリンカー部分もまた通常通り作成され得、アンカーは、
適当に利用できる技術(例えば、Fondor et al (1996) 米国特許番号5,510,270;P
irrung et al (1992)米国特許番号5,143,854;Zanzucchi et al (1997)米国特許番号5,643,738;Lowe et al (1985) 米国特許番号4,562,157;Niemeyer et al (19
94) NAR 22, 5530-5539参照)を用い、表面上または表面内に位置が定められ得る
。

【００４２】本発明の幾つかの実施態様では、開示の組合せを、様々なスクリーニング法に
用い、および/またはレベル、活性またはプローブもしくは標的分子構造についての情報を得る。そのアッセイはMulti Array Plate Screen(MAPS)法またはアッ
セイと名付けられ、その表面は、アッセイに使用するアンカーまたはアンカープ
ラスアッセイのアレイを含み、MAPSまたはMAPSプレートと名付けられる。

【００４３】反応混合物、アッセイ、またはスクリーニング方法の内容は、任意の順序で集
められる。例えば、アンカー、リンカーおよび標的は連続して集められる；また
は、レポーターの存在または非存在下、標的およびリンカーを溶液中に集合させ
、次いで、アンカーと接触させる。本発明のある実施態様は、少なくとも1つの標的を検出する方法に関係し、 a)当該標的を含むサンプルを、当該標的と当該リンカーとの間の第1のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、オリゴヌクレオチドアンカーに特異
的な第1の部分および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を含む二官能
性リンカーと接触させること、 b)当該第1のハイブリダイゼーション産物と当該組合せ[当該組合せには、当該第
1のハイブリダイゼーション産物の添加前に、 1)少なくとも2つは実質的に同一な多数の空間的に分離された領域を含む表面、それぞれの領域に含まれるのが、 2)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカーが含まれる]との間の第2のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、
当該第1のハイブリダイゼ−ション産物を組合せと接触させること、 c)当該第1のハイブリダイゼーション産物または当該第2のハイブリダイゼーショ
ン産物を標識したディテクタープローブと接触させること、 d)当該検出プローブを検出することを含む。

【００４４】以下に記載するアッセイまたは方法のそれぞれを、ハイスループット法で実施
でき、それは、多数のサンプル(例えば、およそ約864、1036、1536、2025または
それ以上であり、組合せの領域数に依存する)を各プレートまたは表面上で素早く同時にアッセイする。更に、多くのプレートまたは表面を同時に処理し得る。
例えば、薬物探索の方法では、それぞれは薬物候補(例えば、様々な小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の物質のような多くのコンビナトリ化学ラ
イブラリー)を含む多くのサンプルを添加し得、既述のように組合せの領域を分離するか、または生物学的または生化学的サンプルに加え、次いで、組合せの領
域に分けて加え、そして、領域内に位置するプローブアレイと共にインキュベー
ションする；ならびにアッセイを各サンプルで行い得る。最近の高密度マイクロ
プレートの出現と連続的な発達と共に、デンサーマイクロプレート、ロボット、
改善ディスペンサー、精巧な検出システムおよびデータ処理ソフトウェアから作
成しデータを回収する、レーザー技術のようなDNAスポッティングツールおよびその方法を用い、1日あたり数千または数万またはそれ以上の化合物をスクリーニングまたは分析する。

【００４５】例えば、プローブがオリゴヌクレオチドである実施態様では、アッセイは、遺
伝的変異または欠損の存在する、多数のサンプルの診断核酸またはポリヌクレオ
チドスクリーン(screen)(例えば、結合または他のアッセイ)(例えば、嚢胞性繊維症のような疾患に付随する多形または特異的変異、例えばIitia et al (1992)
Molecular and Cellular Probes 6, 505-512)；病原体(細菌、ウイルスおよび原生動物であり、それらの宿主は動物であり、ヒトまたは植物を含む)、または特定の生理学的状態または疾患を診断するmRNA転写パターンであり得る。ESTの部分を含む核酸プローブ(全長コピーを含む)を用い、ESTが誘導される細胞により生じさせる転写パターン(または他のもの)を評価し得る。核酸プローブはまた
、ペプチド、タンパク質、または特定の核酸配列に特異的に結合するタンパク質
ドメインを検出し得る(およびその逆)。

【００４６】他の実施態様では、本発明の組合せを用い、例えばタンパク質、核酸、小分子
などのような生化学的反応をモニターし得る。例えば、抗原および抗体；レセプ
ター(精製レセプターまたは細胞膜に結合するレセプターのような)およびそれら
のリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト；または酵素(プロテアーゼまたはキナーゼのような)およびそれらの基質の相互作用の効率または特異性、または産物に変換する基質量の増加または減少；ならびに他のものである。その生化
学アッセイを用い、またはスクリーニングアッセイに基づき、プローブまたは標
的の特性解析する。例えば、特定のプロテアーゼの存在するサンプルをスクリー
ニングするため(例えば、血液凝固中に含まれるプロテアーゼXaおよびVIIaのようなプロテアーゼ)、サンプルを組合せにおいてアッセイし、そのプローブは、目的の各プロテアーゼに特異的な蛍光発生物質である。標的プロテアーゼが基質
に結合し、切断するならば、その基質は、通常、切断および2つのエネルギー転位対間の分離の結果として蛍光を発生し、シグナルを検出し得る。他の例では、
特定のキナーゼの存在するサンプルをスクリーニングするため(例えば、Src、チ
ロシンキナーゼ、ZAP70)、目的の1つまたはそれ以上のキナーゼを含むサンプルを組合せにおいてアッセイし、そのプローブは目的の1つのキナーゼにより選択的にリン酸化し得るペプチドである。当分野において認識される、通常に決定し
得る条件を用い、サンプルを基質のアレイと共に、適当な緩衝液中、および必要
な補因子と共に、実験的に決定された時間、インキュベーションし得る(幾つかのアッセイでは、例えば、目的のキナーゼの活性を調節する因子の生化学的研究
の場合、各キナーゼの濃度を、各基質が同様の割合でリン酸化されるように調整
し得る)。キナーゼおよび望ましくない反応成分を(所望により)取り除くための実験的に決定した条件下、各反応を処理(例えば、洗浄)した後、リン酸化基質は
、例えば、蛍光標識抗ホスホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体(例えば、約10n
M濃度、またはそれ以上、またはそれ未満)のような検出可能試薬と共にインキュ
ベーションすることにより検出し得、そのシグナルを検出し得る。他の例では、
結合アッセイを行い得る。例えば、GRB2 SH2またはZAP70 SH2のようなSH2ドメイ
ンを、適当なリン酸化ペプチドのプローブアレイ上でアッセイし得る；または血
清を、免疫欠損の特定レセプターのプローブアレイ上でスクリーニングし得る。
また、酵素連結アッセイをアレイ型で実施し得る。本発明の組合せもまた用い得
、野生型対照物よりも活性が高いかまたは低い変異酵素を検出し得るか、または
除草剤または農薬を含む様々な試薬をスクリーニングし得る。

【００４７】もちろん、MAPSアッセイを用い、サンプル中の活性標的の量を定量(測定、量の測定)する。ただし、プローブは十分に占有されず、すなわち、利用可能なプローブ部位の約90％以上が標的と結合(または反応またはハイブリダイズ)しない
。これら条件下、より多い標的の保有により、より多いプローブの結合を保有す
る結果となるため、標的を定量し得る。他方で、約90％以上の利用可能なプロー
ブ部位が結合する条件下、より多い標的の保有の存在により、プローブに結合す
る標的の量は実質的には増加しない。任意の前記の型の標的をこの方法により定
量し得る。例えば、実施例6はオリゴヌクレオチド標的の定量について記載する。更に、標的が過剰に存在する場合(例えば、それが多量に存在し、MAPSプローブアレイ中の利用可能なプローブの量が飽和となる場合)、結合混合物に標識していない標的を既知量加えることにより、その多量の標的を定量するため、反応
の“感度がシフト”し得る。

【００４８】他の実施態様では、本発明の組合せを用い、標的および所定のプローブの相互
作用を修飾する試薬をスクリーニングし得る。プローブ、標的または標的プラス
プローブにより形成される複合体の何れかと直接または間接的に相互作用するこ
とにより、試薬が標的/プローブ相互作用を修飾し得る。修飾により、様々な型が形成され、プローブに対する標的の結合親和性の増加もしくは減少、標的およ
びプローブが結合する割合の増加もしくは減少、標的に対するプローブの結合の
拮抗的または非拮抗的阻害、またはある場合にはプローブ/標的相互作用を増加もしくは減少するプローブもしくは標的の活性の増加もしくは減少が含まれるが
、これらに限らない。その試薬は人工または自然に生ずる物質であり得る。また
、その試薬を、不変化の状態で、または他の種類との集合体として用い得る；お
よびそれらを、結合要素(binding member)と共有結合的にまたは非共有結合的に
、直接かまたは特定の結合物質を介して結合し得る。例えば、可能性ある“血液
シンナー”、または血液凝固の原因となるプロテーゼの1つのカスケードと相互に作用する試薬を同定するために、目的のプロテアーゼのカクテルを、多量の候
補試薬で試験し得、次いで、上記のように活性を試験し得る。本発明により用い
られ得る試薬の他の例は非常に多様であり、除草剤および農薬を含む。実施例16
および17は、特定のキナーゼを選択的に阻害する試薬、またはSH2ドメインとリン酸化ペプチドの間の相互作用の選択的阻害剤のためのハイスループットアッセ
イについて記載する。

【００４９】他の態様において、本発明の組合わせは、遺伝子発現のパターンを調節できる
試薬のスクリーニングに使用できる。オリゴヌクレオチドのアレイは、例えば、
その一連の遺伝子からの発現のパターンが特定の生理学的状態または発育段階、
または疾病状態と相関しているmRNA種の同定に使用できる(“相関”遺伝子、RNA
、または発現パターン)。“相関的”または“相関”なる用語は、RNAの合成パタ
ーンが、細胞の生理学的状態に関連するが、所定のRNAの発現が必ずしも特定の生理学的状態を担うか、それをもたらさないことを意味する。例えば、mRNAの小
サブセットは、特定の疾病状態のモデルとして働く細胞の発現、上方制御／下方
制御により同定される；病理学的表現型を示さない、この正常細胞と比較して変
えられた発現のパターンは、これらの疾病状態の指標として働くことができる( “指標”遺伝子、RNA、または発現パターン)。“相関的”および“指標”は交換
可能に使用できる。例えば、ホルボールミリステートのような腫瘍促進剤で処理
した細胞は、腫瘍生育の初期段階に見られるものを模倣した遺伝子発現のパター
ンを発現し得る。癌の他のモデルにおいて、マウスインスリノーマ細胞(例えば、細胞系TGP61)は、アデノウイルスに感染したとき、例えば、c-JunおよびMIP-2
の発現の増加を示すが、一方GAPDHおよびL32のようなハウスキーピング遺伝子の
発現は実質的に影響されないままである。

【００５０】疾病モデルの細胞と接触した後、直接的または間接的に、そしてインビボまた
はインビトロ(例えば、組織培養において)で、指標発現パターンを変える試薬は
、疾病に罹患している生物(例えば、ヒトまたは他の動物種、または植物)の治療
薬または薬として作用し得る。薬剤は、また、核酸と接触させて、直接、例えば
、インビトロ(試験管)発現系で発現パターンを調節できる。本明細書で使用する
限り、“調節”なる用語は測定可能な反応に関与する分子などの量および／また
は活性の増加または減少をもたらすことを意味する。本発明の組合わせは、この
ような薬剤のスクリーニングに使用できる。例えば、一連の細胞(例えば、疾病モデル由来)を、一連の薬剤と(例えば、約10分から約48時間またはそれ以上の時
間)接触させ、慣用的な、当分野で既知の方法(例えば、商品として入手可能なキ
ット)を使用して、全RNAまたはmRNA抽出物を製造できる。RNAの量の増幅が望ましい場合、RT−PCR増幅のような標準法(例えば、Innis et al.編, (1996) PCR P
rotocols: A Guide to Methods in Amplification, Academic Press, New York 参照)を使用できる。抽出物(またはこれらの増幅産物)を、適当な指標RNAのプロ
ーブを含む多くの実質的に同一のアレイと接触(例えば、それとインキュベート)
させ、指標発現パターンの変化に関連するこれらの薬剤を同定できる。実施例15
は疾病状態と相関する遺伝子の発現を変え得る化合物のスクリーニングのための
ハイスループットアッセイを記載する。

【００５１】同様に、特定の生理学的状態または発育段階に関連する薬剤が同定できる。こ
のような薬剤は、人工または天然に存在する物質であり、胚発育または生理学的
反応の調節に関連する物質、または農薬または除草剤のような農業で重要な物質
のような環境因子を含む。また、このような薬剤はその非変化状態でまたは他の
種との凝集で用いることができる；そして、それらを結合メンバーに、直接また
は特異的結合物質を介して、共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。

【００５２】本発明の他の態様は a)多分離領域を含み、少なくともその二つが実質的に同一であり、各々の領域が
少なくとも8個の異なるアンカー(オリゴヌクレオチド、または本明細書に記載の
他のタイプ)を含むものである表面、そして b)該アンカーの少なくとも一部に特異的な第1部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第2部分を有する、少なくとも一つの2官能性リンカ
ー分子を含む容器を含む、サンプル中の少なくとも一つの標的の検出に有用なキットである。

【００５３】一つの態様において、上記a)のような表面および該アンカーの少なくとも一部
に特異的な第1部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第2
部分を有する2官能性リンカー分子を結合するために一連の指示書が提供される。指示書は、例えば(しかしこれに限定されない)、表面上の各々のアンカーの記
載、いくつのアンカーがあるか、そしてそれらが表面のどこに位置するか、およ
び特異的にリンカーをアンカーに結合(会合、結合等)させるプロトコールを含む
ことができる。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドである場合、指示書は各
アンカーの配列を含むことができ、そこから、実施者がアンカーと特異的に相互
作用(例えば、ハイブリダイズ)するリンカーの相補的アンカー特異的分子を設計
できる；アンカーがペプチドである場合、指示書は、例えば、ペプチドと億位的
に作用する抗体に関する情報を伝達できる。指示書は、アンカーおよびリンカー
が会合するプロトコール、例えば、インキュベーション温度および時間、非会合
分子の除去(例えば、洗浄)のための条件および試薬等のハイブリダイゼーション
(または他のタイプの会合)の条件および試薬を含み得る。更に、指示書は、本明
細書に記載の任意のタイプのコントロールリンカーの構築および使用における情
報、および組合わせで行う定量、標準化、“微調整”または較正アッセイの方法
における情報を含むことができる。指示書は、本明細書に記載のパラメーター、
条件または態様を包含でき、その全て当業者により慣用的に、慣用法で行うこと
ができる。

【００５４】本明細書の他の箇所で述べたように、アンカーの所定のアレイを含む本発明の
表面に広範な型のリンカーを付着せしめて、広範なプローブアレイのいずれかを
プログラミングできる。さらに、本発明の表面から所定の組のリンカーを離脱せ
しめ、表面に他の組のリンカーを付着せしめて、所定の表面を何回も再利用する
ことが可能となる。この柔軟性および再利用性は本発明の別の利点である。

【００５５】他の態様において、本発明の組合わせを用いて、EST(発現配列タグ)を位置付けできる。すなわち、MAPSアッセイを用いて、EST群のどれが同じ遺伝子の異なる(または部分的に重なる)部分からつくられたか、またはどれが非反復かを(これらが存在すれば)決定できる。図18、19、20、21は、このようなアッセイを示す。この例において、アッセイで16のESTのどれが共通遺伝子に“結合”しているかを(これが存在すれば)決定する。アッセイの第1工程(参照、図18)ではアレイが集合され、位置付けしようとする各ESTが、その対応する少なくとも1つのオ
リゴヌクレオチドプローブにより提示される。位置付けしようとするESTの数に等しい(または多い)数のアレイが表面の単離領域(例えば、ウェル)に分散してい
る。表示例において、組合わせの表面は16のウェルを含み、各ウェルが16種のES
T特異的オリゴヌクレオチド、番号1-16、を含有する。ESTに“対応する”(EST“
特異的”な)オリゴヌクレオチドとは、1つのESTに十分に相補的であって、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、そのESTに特異的にハイブリダイズし、他の非関連ESTとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドである。この型のEST対応オリゴヌクレオチドが特異的に(最適の条件下で)結合できるのは、ESTを本来生成した遺伝子から合成されたcDNAのコード鎖または非コード鎖、またはESTを本来生成した遺伝子から合成されたmRNAである。オリゴヌクレオチドの設計で考慮されるべき要因および特異的ハイブリダイゼーショ
ンをなすための最適化ハイブリダイゼーションパラメーターについては、本明細
書の別の箇所で述べる。

【００５６】アレイを集合するために、リンカー分子を調製する。各リンカー分子は、一般
的アレイの1アンカーに特異的な部分に加えて、位置付けしようとするESTの1つに対応するオリゴヌクレオチドプローブ含有の部分を含む。リンカーのアンカー
への付着については、本明細書の他の箇所で述べる。次の工程において、核酸混
合物(例えば、mRNA、または1本鎖または変性cDNA)を含有するサンプルのアリコートをプローブアレイを含む各領域(ウェル)に加える。核酸混合物は、1以上のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含有し得る。次いで、混合物を通
常の最適条件でインキュベートすると、核酸が相補的なプローブに結合する。い
くつかのEST特異的プローブが1本鎖核酸の異なる部分に相補的である場合、核酸
は、これらのプローブの1つが位置するアレイの各位置に結合する。

【００５７】次の工程において、別個のディテクターオリゴヌクレオチド(表示例ではディテクター＃1-16)を各領域(ウェル)に加える(参照、図19)。ディテクターオリゴヌクレオチドの設計は、位置付けしようとする各ESTについて行う。各EST特異的
ディテクターがESTの異なる(少なくとも部分的には非重複の)部分に対応するのは、プローブオリゴヌクレオチドが対応するのよりも大きいので、プローブとデ
ィテクターの各オリゴヌクレオチドは互いに干渉しない。例えば、図21に表すES
Tは、図18-20のEST1、2および6に対応する。図21に表示するように、EST＃1およ
び2の両者は遺伝子Xから得られ(両者に“結合”している)、一方、EST＃6は別の
非関連遺伝子から得られた。mRNA混合物含有のサンプルのアリコートが遺伝子X からつくられた混合物を含み、それを図18-20に示すプローブアレイとインキュベートしたとき、遺伝子XmRNAは、最適条件において、プローブ1および2を持つ位置でハイブリダイズするが、プローブ6を持つ位置ではハイブリダイズしない。(もちろん、各mRNAは、そのハイブリダイズできるプローブの量以上の分子過剰で加えねはならない)。ディテクターオリゴヌクレオチド1を領域(ウェル)1に加えた場合、このオリゴヌクレオチドは、プローブアレイの位置1および2で結合
した遺伝子XmRNAとハイブリダイズするが、位置6のものとはしない。同様に、デ
ィテクターオリゴヌクレオチド2を別のウェル、例えばウェル＃2に加えると、こ
のオリゴヌクレオチドは位置1および2で結合するが、位置6ではしない。このようにして、どのESTが結合するのか、すなわち同じ遺伝子の部分をコードするのか、どのESTが非反復であるのか、を決定できる。

【００５８】図20に示す仮定的例において、最初の3つのESTは同じ遺伝子の部分をコードし
、最後の5つのESTは他の遺伝子の部分をコードし、残りのESTは結合されないようである。ハイブリダイゼーション条件、最適洗浄工程、検出方法などについて
は、MAPSアッセイに関する本明細書の他の箇所で述べる。MAPSアッセイにより得
た結合データを確認するためには、PCR反応を行い、センスおよびアンチセンスプライマーとして対のEST特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる。各対の結合ESTがPCR産物を産生する。この対的PCR試験によって、結合MAPSアッセイを用いずに直接的に結合を調べることができる。しかし、多数の反応を必要とする
かも知れないし、また、各ESTプライマーをセンスおよびアンチ両方の鎖として合成しなければならないかも知れない。表示例では、180の反応を必要とするであろう。

【００５９】 1つの態様において、本発明は、複数のESTのどれが所定の核酸に相補的である
かを決定する方法であって、下記の事項を含む。 a)オリゴヌクレオチドプローブ(この少なくとも1つは該ESTの各々に対応する)
の固定化アレイを、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとインキュベートし
、該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸とのハイブリダイゼーション産物を得
る、 b)該ハイブリダイゼーション産物をディテクターオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの1つが対応するESTに対応するが、ESTの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、 c)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレ
オチドにより標識されたかを検出する。

【００６０】なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 1)調べようとするESTの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、 2)調べようとするESTの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アンカーが、 3)アンカーに特異的な第1部分、および少なくとも1つの該ESTに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第2部分を有する2官能的リンカーと結合している
。

【００６１】他の態様において、本発明は上記のような方法に関し、ただ、1以上の該ESTが
該核酸に相補的であり得、かつ該ESTの各々が2の異なるオリゴヌクレオチド配列
を含み、その第1は該ESTに対応するオリゴヌクレオチドプローブであり、その第
2は概ESTに対応するディテクターオリゴヌクレオチドであり、下記事項を含む。

【００６２】 a)該核酸分子を含むサンプルを組合わせの少なくとも1つの領域に接触せしめ、なお、該領域はオリゴヌクレオチドプローブ(そのうち少なくとも1つは該EST の各々に対応する)のアレイを含み、 b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を
、該核酸部分に相補的な該EST対応オリゴヌクレオチドプローブに結合せしめ、 c)1以上の該EST対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該核酸分子を含む
概領域を、該アレイの所定の1つのオリゴヌクレオチドプローブが対応するESTに
対応するディテクターオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、それによ
ってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定のオリゴヌクレオチドプローブ
または該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチドプローブに結合している核酸分
子に結合せしめ、 d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイ
のどのEST対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌクレオチドEST
対応プローブに結合する核酸の部分に相補的であるかを検出し、それによってど
のESTが該所定の核酸に相補的かを同定する。

【００６３】なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 1)調べようとするESTの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、 2)調べようとするESTの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アンカーが、 3)アンカーに特異的な第1部分、および少なくとも1つの該ESTに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第2部分を有する2官能的リンカーと結合している
。

【００６４】 EST位置付けアッセイの成分は、いかなる順序でも集合せしめ得る。例えば、アンカー、リンカーおよびESTを順次集合せしめ得る。あるいは、リンカーおよびESTをレポーターの存在または不存在で溶液中で集合せしめ、次いでアンカーに加える。

【００６５】別の態様において、本発明は、複数のどのESTが所定の核酸に相補的かを決定する方法に関し、下記の事項を含む。 a)2官能的オリゴヌクレオチドリンカー分子の総合体(その各々が、少なくとも
1つの該ESTに対応するプローブである第1部分、およびアンカーオリゴヌクレオチドに特異的な第2部分を含む)を、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとイ
ンキュベートして、該オリゴヌクレオチドと該核酸との第1ハイブリダイゼーション産物を得、 b)該第1ハイブリダイゼーション産物をアンカーオリゴヌクレオチド(各アンカ
ーオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの該リンカー分子のアンカー特異的部分に対応している)の固定化アレイとインキュベートして、該アンカー、該オリゴヌクレオチドプローブおよび該核酸を含む第2ハイブリダイゼーション産物を形成し、 c)該第1または該第2のいずれかのハイブリダイゼーション産物をディテクター
オリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの1つが対応するESTに対応するが、E
STの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、 d)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレ
オチドにより標識されたかを検出する。

【００６６】なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 1)調べようとするESTの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、 2)調べようとするESTの数に等しい数の、異なるアンカーを含む。

【００６７】勿論、ESTを位置付けするための上記方法は、試験配列(例えば、ポリヌクレオ
チド)を目的の任意の核酸中へ位置付けするのに使用できる。例えば、1以上のク
ローン化DNAフラグメントまたはcDNAが同じゲノムDNAに位置付けされるかを調べ
ることができる。このような方法が役立ち得るのは、例えば、長い複雑な遺伝子
の構造的解明おいてである。同様に、1以上の継ぎ合わせた配列またはコード配列が同じゲノムDNAに位置付けされるかを調べることができる。このような検査をなし得るのは、例えば、診断試験においてであって、分化スプライシングパタ
ーンを特徴とする正常状態と疾患状態とを識別する。位置付け方法の他の多くの
適用については、当業者に明かであろう。

【００６８】他の態様において、本発明は、複数のポリヌクレオチドのどれが所定の核酸に
相補的てあるかを決定する方法に関し、なお、1以上の該ポリヌクレオチドが該核酸に相補的であり得、かつ該ポリヌクレオチドの各々が2の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、その第1は該ポリ
ヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブであり、その第2は該ポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドであり、下記事項を含
む。 a)該核酸分子を含むサンプルを組合わせの少なくとも1つの領域に接触せしめ、なお、該領域はオリゴヌクレオチドプローブ(そのうち少なくとも1つは該ポリ
ヌクレオチドの各々に対応する)のアレイを含み、 b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を
、該核酸部分に相補的な該ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに
結合せしめ、 c)1以上の該ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該核酸分子を含む該領域を、該アレイの所定の1つのオリゴヌクレオチドプローブが対応するポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドととも
にインキュベートし、それによってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定
のオリゴヌクレオチドプローブまたは該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチド
プローブに結合している核酸分子に結合せしめ、 d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイ
のどのポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌ
クレオチドポリヌクレオチド対応プローブに結合する核酸の部分に相補的である
かを検出し、それによってどのポリヌクレオチドが該所定の核酸に相補的かを同
定する。

【００６９】なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 1)調べようとするポリヌクレオチドの数に等しい数の、空間的に分離され実質
的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、 2)調べようとするポリヌクレオチドの数に等しい数の、異なるアンカーを含み
、各アンカーが、 3)アンカーに特異的な第1部分、および少なくとも1つの該ポリヌクレオチドに
対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第2部分を有する2官能的リンカーと
結合している。

【００７０】本発明の別の態様において、ESTなどのポリヌクレオチドを位置付けする上記方法は、1以上の工程間でサンプルの非結合部分を離脱せしめることをさらに含む。本発明の別の具体的態様において、目的の1以上のRNA標的(例えば、mRNAや他の型のRNA)を逆転写酵素によってcDNAに変え、このcDNAをプローブアレイにハイ
ブリダイズする。この型のアッセイは図8に模式的に示した。RNA抽出物(または精製mRNA)を本明細書で述べるように細胞または組織から調製する。次いで、逆転写酵素および目的のRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをRNAサンプ
ルに加え、技術分野で認識の条件および手法(日常的に決定および最適化できる)
を用いて、cDNAの第1鎖をつくる。用語“特異的”プライマーは、目的のmRNAに十分相補的であって、それに選択したストリジェントなハイブリダイゼーション
条件で結合し、逆転写酵素で認識されるが、望ましくない核酸と結合しないもの
を意味する(特異的ハイブリダイゼーションが達成される適当な反応条件については、上記の記述を参照)。残りのRNA-特異的プライマーにより認識されなかったmRNA、および／またはRNA抽出物中の他の型の汚染性RNA、例えばtRNAまたはrR
NA-は、種々のリボヌクレアーゼのいずれかにより、またはアルカリ処理などの化学的方法により除去でき、1本鎖cDNAが残り、これをMAPSプローブアレイと接触せしめる。この方法で逆転写酵素を用いると、RNAを多量に取り扱う必要を最低にする。RNAはヌクレアーゼによる変性に感受性であり、したがって扱いが難しい。さらに、特異的逆転写酵素プライマーにより生じた追加の特異性がアッセ
イに対する追加層の特異性をもたらす。

【００７１】選択的に、上記のcDNAをプローブアレイとのハイブリダイゼーションの前に増
幅して、シグナルの長さを増すことができる。上記のオリゴヌクレオチド逆転写
プライマーは、その5’末端に、RNAポリメラーゼ(例えば、T7、T3またはSP2ポリ
メラーゼなど)の開始部位を特定する配列(約22-27ヌクレオチド長であり得る)を
含み得る。図8に示す例においては、T7プロモーター配列が逆転写酵素プライマーに加えられている。ポリメラーゼ認識部位はcDNA中に組込まれて、適当なRNA ポリメラーゼによる多領域の転写(インビトロ転写またはIVT)についての認識部位として働き得る。選択的に、このようにつくられたmRNAを、PCRおよび適当なプライマーを用いて、増幅でき、またはcDNA自体を増幅できる。転写およびPCR の技法は、日常的に行われており、既知である。

【００７２】上記の方法においてmRNAを逆転写酵素でcDNAに転換し、MAPSプレート上のアッ
セイにかけるが、この方法は、上記のRNAに基づくすべてのアッセイについての標準MAPSアッセイ法の代わりに用いることができる。

【００７３】本発明の他の具体的態様において、目的の1以上の核酸標的を特異的ポリヌクレオチド保護フラグメントにハイブリダイズし、ヌクレアーゼ保護処置を行う。
目的の標的にハイブリダイズした保護フラグメントをMAPSプレートでアッセイし
た。目的の標的がRNAであり、保護フラグメントがDNAであると、ヌクレアーゼ保
護／MAPSアッセイ(NPA-MAPS)がRNAを多量に取り扱う必要を最低にできる。RNAは
ヌクレアーゼによる変性に感受性であり、したがって扱いが難しい。このような
NPA-MAPSアッセイにおいて、プローブアレイ中のプローブは、目的の核酸標的と
同じ鎖数のオリゴヌクレオチドであり、標準MAPSアッセイなどにおいて、むしろ
核酸標的に相補的である。NPA-MAPSアッセイの1例を図9に模式的に示す。

【００７４】 NPA-MAPSアッセイにおいて、目的の標的は、すべての核酸、例えば、ゲノムDN
A、cDNA、ウイルス性DNAまたはRNA、rRNA、tRNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、修飾核酸、合成核酸などであり得る。本発明の好ましい具体
的態様において、このアッセイが用いられるのは、組織または細胞のRNA抽出物中に存在する1以上のmRNA標的である。目的の標的を含有するサンプルは、選択されたストリジエント条件(特異的ハイブリダイゼーションを達成するのに適当な反応条件については上記参照)で1以上の特異的保護フラグメントと最初にハイ
ブリダイズせしめる。保護フラグメントは、ポリヌクレオチドであって、例えば
、RNA、DNA(PCR産物を含む)、PNA、修飾または置換の核酸であり得て、目的の核
酸標的部分に特異的である。“特異的”保護フラグメントとは、その意図する結
合相手と十分に相補的であり、選択されたストリジエント条件でそれと結合する
が、他の意図していない核酸とは結合しないポリヌクレオチドを意味する。保護
フラグメントは、長さが少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは50から約100、または完全長のcDNAと同じであり得る。

【００７５】好ましい具体的態様において、保護フラグメントは1本鎖DNAオリゴヌクレオチ
ドである。100以上の標的に特異的である保護フラグメントが1回のハイブリダイ
ゼーション反応に含まれることがある。ハイブリダイゼーション後にサンプルを
1以上のヌクレアーゼのカクテルで処理し、実質的にすべての核酸を破壊する。ただし、目的の核酸にハイブリダイズした保護フラグメント、および(選択的に)
ハイブリダイズし、ヌクレアーゼ保護処理の間にヌクレアーゼ消化から保護され
た核酸標的部分(二本鎖ハイブリッド中にある)は、別であって破壊されない。例
えば、もしサンプルが細胞抽出物を含むと、望まない核酸、例えば、ゲノムDNA 、rRNA、tRNA、mRNAなどの目的のもの以外は、この工程で実質的に破壊される。
多様なヌクレアーゼのいずれをも用いることができ、例えば、膵臓RNAse、ヤエナリヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、RNAseA、リボヌクレアーゼT1、エキソヌク
レアーゼIIIなどを含むが、ハイブリダイズされた複合体およびサンプル中の望ましくない核酸の性質に依存する。RNAseHは、DNA保護フラグメントに結合した残留RNAを消化するのに特異的に有用である。これらの酵素についての反応条件は、既存の技術でよく知られており、経験的に最適化できる。また、化学的処理
もでき、例えば、RNAのアルカリ加水分解である。

【００７６】必要に応じて、サンプルを周知技術でさらに処理して、不ハイブリダイズ材料
を除去するか、および／または残りの酵素を不活化または除去することができる
(例えば、フェノール抽出、沈降、カラム濾過など)。ハイブリダイゼーション過
程は、ヌクレアーゼ消化および(選択的に)化学的変性が続き、ヌクレアーゼ保護
法と呼ばれる。様々なヌクレアーゼ保護法が報告されている(参照、例えば、Lee
et al (1987), Meth. Enzymol. 152, 633-648. Zinn et al (1983), Cell 34,
865-879)。ヌクレアーゼ保護処理をしたサンプルは、選択的なヌクレアーゼを不
活性化処理をした後、MAPSプローブアレイと接触せしめ、MAPSアッセイの通常の
工程を行う。結合保護フラグメントを標識標的特異的レポーターとのハイブリダ
イゼーションで、標準的MAPSアッセイについて本明細書に記載のように検出でき
、または保護フラグメント自体を検出可能な分子で共有結合的または非共有結合
的に標識できる。

【００７７】好ましい具体的態様において、保護フラグメントは、標的特異的レポーターと
のハイブリダイゼーションなどで標識するよりも、直接的に標識する。例えば、
レポーターは保護フラグメントにリガンド-抗リガンド相互反応によって結合する。例えば、ストレプトアビジン酵素複合体をビオチン化保護オリゴヌクレオチ
ドに加える。他の実施例において、保護フラグメントを化学的に修飾し(例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)または蛍光染料の直接結合による)、
この化学的修飾を、保護フラグメントの核酸部分で、またはそれなしで検出する
(例えば、酵素的または化学的処理などによる修飾の開裂後)。上記方法のいずれ
においても、保護フラグメントは、対応リンカー分子とハイブリダイズする前ま
たは後に、標識できる。

【００７８】ヌクレアーゼ保護過程が適切に働くこと、すなわち非ハイブリダイズ核酸が望
むように消化されることを制御するために、1以上の保護フラグメントを設計して、過程が適切に作動すればヌクレアーゼにより開裂されるオーバーハング(非ハイブリダイズ)セグメントを含有せしめる。オーバーハングフラグメントの有無を相補的標識検出プローブとのハイブリダイゼーションで検出でき、または保
護フラグメントのオーバーハング部分自体を検出可能な分子で共有結合的または
非共有結合的に標識できる。この制御は、サンプルをプローブアッセイと接触せ
しめる前、あるいはMAPSアッセイ自体の一部として行うことができる。かかる制
御アッセイの例は実施例15に記載する。勿論、異なる標識を容易に識別できるの
で(例えば、異なる吸収スペクトルの蛍光)、いくつかの異なる標識オリゴヌクレ
オチドを単一のアッセイに含め得る。さらに、ゲル電気泳動による解析のような
標準ヌクレアーゼ保護アッセイを、保護フラグメントが期待どおりに進められて
いるかを調べるために、アッセイ中に使用できる。

【００７９】 NPA-MAPSアッセイを用いて、サンプル中の標的量を定量できる。もし、保護フ
ラグメントが標的に対し非常に分子過剰で加えられ、ハイブリダイゼーション反
応が完了すると、ヌクレアーゼ保護工程後に残る保護フラグメントの量はサンプ
ル中にどれほどの標的が存在していたかを示す。このような定量反応の1例を実施例12および13に記載する。 NPA-MAPSアッセイを用いて、標準MAPSアッセイを利用する上記の方法のいずれ
も行い得る。

【００８０】好ましい具体的態様において、ポリヌクレオチド保護フラグメントをMAPSプレ
ート上よりも質量分析計で測定する。最も好ましい具体的態様において、ポリヌ
クレオチドのいずれもハイブリダイゼーションまたはヌクレアーゼ消化工程中に
固相表面に結合(付着)される。ハイブリダイゼーション後、保護フラグメントを
残してハイブリダイズ標的をヌクレアーゼまたは化学処理などにより減成し、直
接比率で、どれほどのフラグメントが標的にハイブリダイズしていたかがわかる
。あるいは、標的の(1本鎖)ハイブリダイズ部分、またはハイブリダイズ標的および保護標的から形成された表面を残すように処理し、さらに分析する。分析す
べきサンプルをハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ混合物の残りから分
離し(例えば、エタノール沈降、または吸収またはアフィニティクロマトグラフィ-など)、溶出または固定化し、高い情報量のためにループ注入により質量分析
計に入れる。好ましい具体的態様において、分析しようとするサンプル(例えば、タンパク質フラグメント)を、よく知られた既知技術で、表面に吸着し、レーザー照射により解析する。最も高感度のためには、フーリエ変換質量分析法(FTM
S)(または他の類似の高度な技法)用いることができ、フェムトモル以下の各保護
フラグメントを検出できる。

【００８１】一つ(またはそれ以上)のサンプルで検出する保護フラグメントは、使用するマ
ススペクトロメーターに関して独得なシグナルを与えるように設計できる。一つ
の態様において、保護フラグメントは各々ハイブリダイゼーションおよびヌクレ
アーゼ処理後に独得な分子量を有し、特徴的イオン化および分裂パターンがその
濃度の測定に十分である。より感受性を得るためにまたは複合体混合物の分析を
助けるために、保護フラグメントを、明確な独得なシグナルを与えるために化学
部分で修飾(例えば、誘導体化)できる。例えば、各保護フラグメントは、鎖のハ
イブリダイズ部分に沿った1個またはそれ以上の位置でアミド結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に結合した異なる天然または非天然アミノ酸で誘導体化できる
。適当なエネルギーのマススペクトロメーターで、分裂はアミド結合で起き、ア
ミノ酸の特徴的割合を放出する。中程度のサイズ(おおまかに80から200分子量) の化学部分を質量分析的タグとして使用するこの種の試みは、このサイズの分子
が一般に検出が容易であるため、望ましい。他の例において、化学修飾は、例え
ば、アミノ酸のような他の分子を例えば誘導体化できるようなテトラアルキルア
ンモニウム基のような、定義された質量分析的シグナルを有する有機分子である
。他の例において、陽性または陰性イオンシグナルが多くの試薬との反応により
促進される。例えば、陽性イオン検出を促進するために、ピリリウム塩(例えば、2,4-ジチエニル、6-エチルピリリウムテトラフルオロボレートまたは多くの他
のもの)とアミンを反応させ、ピリジウム塩を形成できる；多くの他の促進剤が他の陽性荷電官能基の形成に使用できる(例えば、Quirke et al. (1994) Analyt
ical Chemistry 66, 1302-1315参照)。同様に、多くの当分野で既知の試薬と反応させ、陰性イオン促進種を形成できる。化学修飾は、もちろん、核酸からの開
裂後に、または核酸との会合中に検出できる。各保護フラグメントを別々の方法
で同定できるようにすることにより、多数の異なる標的(例えば、2、6、10、16 またはそれ以上の異なる標的)を1回のアッセイでアッセイ(例えばスクリーニング)可能にする。多くのこのようなアッセイが、速くそして容易に行うことができる。このようなアッセイまたは一連のアッセイは、したがって、本明細書で定
義のハイスループットで行うことができる。

【００８２】オリゴヌクレオチドがその質量により直接検出されるか、または独得な分子タ
グを使用するかどうかに関係なく、検出する各分子のシグナルは既知の濃度の純
粋調製物において十分特徴付けされる。これは、定量する(測定する、定量する)
ためのシグナルの正確性を可能にする。マススペクトロメトリーにより検出する
分子に関し、強度およびプロフィールは正確に予期できない。分子がイオン化す
る傾向、分子内の全ての化学結合の分裂への感受性、各断片が複合荷電されてい
るか、一荷電かの程度は、全て予期するには複雑すぎる。しかし、固定されたエ
ネルギーおよびサンプル取扱い特性の装置では、シグナルの強度およびプロフィ
ールは非常に再現性である。これゆえ、各プローブにおいて、シグナルは純粋な
標準により特徴付けでき、実験的シグナルは、正確に量が判断される。

【００８３】一つの態様において、本発明は目的の1個またはそれ以上の核酸を検出する方法に関し、目的の核酸を含むサンプルを1個またはそれ以上の保護フラグメントのヌクレアーゼ保護に付し、ハイブリダイズした二本鎖分子、または保護された
核酸または保護フラグメントをマススペクトロメトリーで検出することを含む。

【００８４】マススペクトロメトリーによる核酸の分析法は当分野で既知である。例えば、
Alper et al. (1998), Science 279, 2044-2045およびKoster, U.S. Pat. No. 5
,605,798号参照。種々の上記のハイスループットアッセイに加えて、多くの他のものが当業者に
明白である。

【００８５】マルチプローブアッセイを使用する利点は、各プローブアレイにおいて、実際
の実験プローブと同じ反応条件下に付す、多くの“コントロール”プローブを包
含できる能力である。例えば、アレイの各領域は、ポジティブおよび／またはネ
ガティブコントロールを含むことができる。“ポジティブコントロールプローブ
”なる用語は、本明細書で、例えば、実質的に標的と相互作用するか、または定
量的にもしくは定性的に既知の方法で相互作用し、それにより、プローブ／標的
相互作用の(内部)標準として働くことが既知のコントロールプローブを意味する
ために使用する。“ネガティブコントロールプローブ”なる用語は、本明細書で
、実質的に標的と相互作用しないことが既知のコントロールプローブを意味する
ために使用する。このようなプローブは、例えば、ハイブリダイゼージョン特異
性を統制できる。用いることができるこのタイプのコントロールの例として、オ
リゴヌクレオチドプローブのアレイを、疾病の一連の相関遺伝子の発現を調節す
る薬剤のスクリーニングに使用するアッセイが考慮される。各サンプルの融解細
胞の数、mRNAの回収、またはハイブリダイゼージョン効率の可変性の内部標準化
コントロールとして、プローブアレイは、1個またはそれ以上の基底レベルまたは、その発現が試験する薬剤により調節されることが予期されない構造遺伝子( 例えば、アクチン、チューブリンその他)またはDNA結合タンパク質(例えば、転写調節因子その他)のような構造的ハウスキーピング遺伝子に特異的なプローブを含むことができる。更に、その試験した薬剤が、細胞死または毒性のような望
ましくない副作用をもたらすかを測定するために、プローブアレイはアポトーシ
ス(計画細胞死)プロセスの一部として誘導されることが既知の遺伝子に特異的な
、または細胞外傷(例えば、ヒートショックタンパク質)または細胞毒性(例えば、p450遺伝子)の条件下に誘導されるプローブを含むことができる。

【００８６】他のコントロールプローブは、アッセイの感受性の“微調整”のためにアレイ
に包含されることができる。例えば、特定の疾病状態に関連するmRNAの産生を調
節する薬剤のためのアッセイを考慮する。分析で、ある組の相関的mRNAの一つ(m
RNA-Aと言う)が、そのシグナルが他のmRNAを圧倒するように他のものに比べて多
量に産生されることが示される場合、リンカーは、シグナルの強度を同等にする
ためにアッセイを“微調整”できる。mRNA-A標的のために設計したアンカー特異
的オリゴヌクレオチド配列を含むが、プローブ特異的配列を欠く“遮断リンカー
”は、標的特異的リンカーのプールの希釈のために添加でき、従ってmRNAに対す
る活性の感受性を減少させる。遮断および非遮断リンカーの適当な比率は、当業
者により、日常的な慣用法により決定できる。

【００８７】本発明のアッセイで試験するサンプルは、上記の標的または他のものを含み得
る。アッセイする液体サンプルは、試験領域のサイズに適当な用量であり得、約
100ナノリットルから約100マイクロリットルの範囲である。好ましい態様におい
て、約1マイクロリットルの液滴を1536ウェルマイクロタイター皿の各ウェルに適用する。サンプルを、ハイスループット分析に適した種々の方法により、例え
ば、ピペット輸送、インクジェットベースの分散または反復ピンツールにより、
プローブアレイと接触させて置くことができる。サンプルをプローブと標的の結
合または他の適当な相互作用を達成するための有効な条件下(例えば、塩濃度、p
H、温度、インキュベーション時間等、上記参照)でインキュベートする。これら
の条件は、慣用的に決定できる。インキュベーション後、サンプルを所望により
処理し(例えば、洗浄)、経験的に特異的相互作用をそのままにするが、非特異的
結合物質を除去する条件を使用して非結合標的を除去する。例えば、サンプルを
約1回から10回またはそれ以上、プローブ／標的結合の達成に使用したのと同じまたはいくぶんよりストリンジェントな条件下で洗浄する。

【００８８】標的RNA、例えば、mRNA、rRNA、tRNA、ウイルスRNAまたは全RNAを含むサンプルを種々の方法で調製できる。例えば、mRNAを抽出するインビトロ細胞培養をマ
イクロタイタープレートの個々のウェル中のような表面の領域に置く。所望によ
り、これらの細胞は、所望の細胞密度が達成された後に、刺激剤または治療剤の
可能性のある薬剤のような目的の薬剤で処理でき、それは種々の手段で、例えば
、複製ピンツール(Beckmanから入手可能な96または384ピンツールのような)で、
ピペット輸送により、またはインクジェット分散により細胞に添加でき、細胞と
適当な時間、例えば、アッセイに依存して15分から48時間の間細胞とインキュベ
ートする。インビトロまたはインビボ源由来の組織または細胞から抽出された全
RNA、mRNA等を慣用の、当分野で既知の方法(例えば、商品として入手可能なキッ
ト)を使用して調製できる。

【００８９】所望により、目的のRNAと特異的プローブとのハイブリダイゼーションにおいて競合する核酸(目的のRNAと少なくとも部分的な配列相同性を共有する、例えば
、ゲノムDNA、rRNA、tRNAまたはmRNA)を、ハイブリダイゼーションに付す前に、
少なくとも部分的に、サンプルをヌクレアーゼ保護(NP)法により処理することに
よりRNAサンプルから除去できる。目的のRNAに少なくとも一部相補的であり、そ
の配列が部分的にまたは完全に目的のRNAに特異的なプローブと重ね合わさる核酸(例えば、RNA、DNAまたはPNAであり得る“保護フラグメント”)を過剰にサンプルに入れ、保護フラグメントが目的のRNAに特異的にハイブリダイズする(適当
な反応条件の上記参照)、選択したストリンジェントなハイブリダイゼージョン条件下にインキュベートする。この段階で、サンプル内の任意のまたは全ての目
的のRNAに特異的な保護フラグメントを添加できる(例えば、100倍またはそれ以上)。ハイブリダイゼーション後、サンプルを1個またはそれ以上のヌクレアーゼ
のカクテルで処理し、保護フラグメントに相補的な目的の各RNAの部分または保護フラグメントと保護RNAの間に形成された二本鎖以外、全ての核酸を実質的に破壊する。次ぎの段階で、保護フラグメントを、二本鎖を変性し、保護フラグメ
ントを減衰させ、保護RNAを実質的にそのままにする適当な酵素での消化によりこのような二本鎖から除去できる。例えば、膵臓RNAse、ヤエナリヌクレアーゼ、RNAse H、S1ヌクレアーゼ(高いまたは低い塩のいずれかの消化条件下で)、RNA
se A、リボヌクレアーゼT1、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、
RNAse CL3、RNAse PhyM、Rnase U2等を含む種々のヌクレアーゼが、サンプルに存在するハイブリダイズした複合体の性質および望ましくない核酸の性質に依存
して、上記消化段階に使用できる。これらの酵素の反応条件は、当分野で既知で
あり、経験的に最適化できる。要求に応じて、サンプルを当分野で既知の方法で
処理し、非ハイブリダイズ物質を除去するおよび／または残りの酵素を不活性化
または除去する(例えば、フェノール抽出、沈殿、カラム濾過等)。処置サンプル
を次いでプローブアレイと接触させて置く。特異的ハイブリダイゼーションおよ
び続くヌクレアーゼ保護が適当に起こるように制御するために、標識保護フラグ
メントを反応混合物に入れることができる。ヌクレアーゼ保護法が適当に働くよ
うに、即ち、非ハイブリダイズ核酸が望ましく消化されるように制御するために
、1個またはそれ以上の保護フラグメントを、アッセイが適当に働いた場合にヌクレアーゼにより開裂されるべきオーバーハンギング(非ハイブリダイズ)セグメ
ントを含むように設計できる。オーバーハンギングフラグメントの存在または非
存在は、相補的、標識プローブとのハイブリダイゼーションにより決定でき、ま
たは保護フラグメントのオーバーハンギング部分それ自体を検出可能な分子で標
識できる。

【００９０】本発明の方法に関して、標的を当分野で既知の種々の方法でおよび／または本
明細書に記載の方法(例えば、ヌクレアーゼ保護フラグメント検出に関して)で標
識(タグ付け)できる。例えば、化学ルミネッセント分子、または化学ルミネッセ
ント分子の産生を触媒する酵素、またはフルオレッセインまたはcy5のような蛍光分子、またはキレート化ランタニド金属の一つのような時間分割蛍光分子、ま
たは放射活性化合物のような、検出用シグナルを提供する化学基と、標的分子を
直接的または間接的に結合できる。あるいは、標的をそれらがプローブと反応し
た後に、1個またはそれ以上の標的特異的レポーターで標識できる(例えば、図1 に示す抗体、オリゴヌクレオチドまたはプローブおよび標的に関連して上記の一
般的タイプの分子)。種々の多くの複合サンドイッチタイプ検出法も用いることができる。例えば、標的を、標的に特異的な第1部分および共通(即ち、同じ)レポーター試薬、例えば、標識ポリヌクレオチド、抗体等により認識され得る第2 部分を含む二官能性分子とハイブリダイズできる。二官能性分子は、所望の数の
共通レポーターを各アッセイで使用できるように設計できる。

【００９１】標的を、結合または他の安定な相互作用を達成するのに有効な条件下で標的特
異的レポーターとインキュベートできる方法は、慣用的に決定できる(上記参照)
。例えば、蛍光オリゴヌクレオチドレポーター(6×SSPE-Tのようなまたは他の緩
衝液中、約10nMから約1μMまたはそれ以上の濃度、好ましくは約30nM)を、約15 分から2時間の間またはそれ以上(好ましくは約30から60分)、約15℃から約45℃ の間の温度(好ましくは室温)で、結合標的とインキュベートできる。インキュベ
ーション後、サンプルを所望により処理し(例えば、洗浄)、経験的に特異的相互
作用をそのままにするが、非特異的結合物質を除去する条件を使用して非結合標
的特異的レポーターを除去する。例えば、サンプルを約1から10回またはそれ以上、標的／レポーター結合の達成に使用したのと同じまたはいくぶんよりストリ
ンジェントな条件下で洗浄する。

【００９２】標的特異的レポーターでのタグ付けは、例えば、標的特異的オリゴヌクレオチ
ドレポーターが、プローブオリゴヌクレオチドよりも標的核酸の配列の異なる部
分を標的とする場合、または、プローブとレポーター抗体が標的抗原の別のエピ
トープを認識する場合、最初のハイブリダイゼーションの反応に特異的な更なる
層を提供できる。更に、標的特異的レポーターでのタグ付けは、反応の感受性の
“チューニング”を可能にできる。例えば、相関的発現パターンの一部である標
的mRNAが非常に低いレベルで発現する場合、そのシグナルのレベルは、各々特異
的に標的mRNAの異なる部分にハイブリダイズする数個の(例えば、約2個から約5 個またはそれ以上)標的特異的オリゴヌクレオチドレポーターに結合標的をハイブリダイズすることにより増強(シグナル増幅)できる。

【００９３】二つのタイプのラベルを個々に検出する能力は、MAPSアッセイにおける更なる
タイプのコントロールを可能にする。特定のアンカー位置(図7は3つの典型的なアンカー位置を示し、各々多くの実質的に同一のアンカー(A、BまたはC)を有する)のために設計したリンカーのいくつか(例えば、約10から約100％)は、一端に
結合した標識(例えば、蛍石)を有し得る。例えば、ローダミンまたはCy5蛍石はリンカーの5'末端に結合できる。このような修飾リンカーは“コントロールリン
カー”と名付ける。リンカーおよびコントロールリンカーの混合物がアンカーと
会合し、標的を含むサンプルを得られるプローブアレイとインキュベートした後
、異なる蛍石(例えば、フルオレッセインまたは化学ルミネッセントのような他の検出標識)を担持する標的特異的レポーターを使用できる(または標的を直接蛍
石または他の検出標識で標識できる)；そして二つのシグナルの比率を決定できる。コントロールリンカーの存在は、試験領域内および間の官能的(例えば、リンカーと相互作用できる)アンカーの数の計測を可能にし(即ち、シグナル標準化
の目的で、標的に結合するアレイの各位置の能力を試験する)、結合標的の量の定量の基本として働き、アンカー位置の局在化を助けおよび／または例えば、サ
ンプルが、標的の不存在下によりシグナルがない場合、ポジティブコントロール
を提供する。本発明の一つの態様において、二つの異なる標識(例えば、フルオロフォア)をまた使用して、標的分子の二つの異なる集団を検出する；しかし、シグナルの空間的分離による標的の存在の認識の能力は、異なる標的分子の標識
の一つのタイプの使用を可能にする。

【００９４】本発明の他の態様において、目的の標的に特異的な“アンカー”は、リンカー
と会合するが、むしろ直接標的に関連する；そして標的は所望により標的特異的
レオ-ターと相互作用できる。

【００９５】標識されていても非標識でも、標的は種々の方法で検出でき、当分野で日常的
であり慣用的である(例えば、Fodor et al (1996) U.S. Pat. No. 5,510,270; P
irrung et al (1992) U.S. Pat. No. 5,143,854; Koster (1997) U.S. Pat. No.
5,605,798; Hollis et al (1997) U.S. Pat. No. 5,653,939; Heller (1996) U
.S. Pat, No. 5,565,322; Eggers et al. (1997) U.S. Pat. No. 5,670,322; Li
pshutz et al (1995), BioTechniques 19, 442-447; Southern (1996) Trends i
n Genetics 12, 110-115参照)。検出法は、酵素ベースの検出、比色法、SPA、オ
ートラジオグラフィー、マススペクトロメトリー、電気的方法、吸光度または発
光の検出(化学ルミネッセンスまたは電気ルミネッセンスを含む)、および、例え
ば、タグとして使用した微小粒子由来の光分散形の検出を含む。また、蛍光標識
は、例えば、電荷結合素子(CCD)または蛍光顕微鏡(例えば、走査または共焦点蛍
光顕微鏡)での結像により、または走査システムとCCDアレイまたは光電子増倍管
の結合により、またはアレイベースの検出法(例えば、各10ミクロン部の試験領域の表面電位を検出でき、または解像が十分高いとき、表面プラスモン共鳴を使
用できる)の使用により検出できる。あるいは、アレイはリンカー、標的またはレポーター上の標識へのエネルギー移動(またはそれによる修飾)により検出でき
る標識(例えば、フルオレッセインおよびローダミンのような、エネルギー移動プローブの一つの対)を含むことができる。とりわけ、蛍光ベースの検出システムのホストは、蛍光強度、蛍光偏光法(FP)、時間分割蛍光、蛍光共鳴エネルギー
移動および均質徐放性蛍光(HTRF)である。反復バーコード様パターンの分析は、
パターン認識により達成できる(各特異的標識標的の、他のスポットまたは線に対するその位置による適当なスポットまたは線の発見)、標識の強度の定量に従う。1または2次元アレイのバーコード認識装置および分析のソフトウェアは、慣
用的に製造されおよび／または商品として入手可能である(例えば、Rava et al.
(1996) U.S. Patent No. 5,545,531参照)。

【００９６】本明細書に記載の表面または領域の製造、本明細書に記載のアンカー、リンカ
ー、プローブおよび検出プローブのような物質の合成または精製または結合もし
くは会合、および本明細書に記載のような標識またはタグ付け物質の検出および
分析を含む本発明のアレイの製造および使用法は、既知であり、慣用法である。
上記に記載の引用文献に加えて、例えば、Affymax, Affymetrix, Nanogen, Prot
ogene, Spectragen, MilliporeおよびBeckman(これらから、本発明に有用な製品
が入手可能である)に譲渡された特許；上記のものを含む分子生物学およびタンパク質科学の標準テキスト；およびCozette et al (1991) U.S. Pat. 5,063,081
；Southern (1996), Current Opinion in Biotechnology 1, 85-88；Chee et al
(1996) Science 274, 610-614；およびFodor et al (1993) Nature 364, 555-5
56参照。

【００９７】図面の説明図1はリンカー1がアンカー1に特異的な部分および標的mRNA1に特異的な他の部
分(プローブ)を含み、標的検出プローブ1が、リンカーの標的特異的部分の配列と異なる標的mRNA1の配列に特異的である、オリゴヌクレオチドの設計スキームを図解する。図2は15個の試験領域を含み、各々6アンカーオリゴヌクレオチドのアレイを含
む、表面を図解する。図3は、リンカーのアンカー特異的部分がプローブ部分(レセプタータンパク質
)にビオチンおよびストレプトアビジン分子を介して結合し、レセプターに特異的なリガンドが蛍光標識分子で標識されている、レセプター結合アッセイのリン
カーの設計を図解する。B：ビオチン。SA：ストレプトアビジン。Rec：レセプタ
ータンパク質。リガンド：レセプターのための天然または合成リガンド。^*：リガンドに結合する蛍光標識分子。図4は21個の試験領域を含み、その各々が更に16個の小領域に分割(へこみ、く
ぼみ)されている表面を図解する。図5a、5bおよび5cは図4に記載のような表面が凝集できる3片を図説する。図5a
はウェルセパレーターを示す；図5bはサブディバイダーを示す；そして図5cは基
盤を示す。図6は各々“バーコード”様形であるプローブ(またはアンカー)の直線アレイを含む、二つの試験領域を示す。図7は各々で多コピー(“グループ”)で存在する3アンカー(A、BおよびC)を含む試験領域を模式的に示す。アンカーの各グループの位置は、“位置”と名付け
る。図8は特異的逆転写酵素により産生されるcDNAがMAPSプレート上でアッセイさせるアッセイを図説する。図9はヌクレアーゼ保護法を使用するアッセイを図説する(NPA-MAPSアッセイ) 。サンプルRNAを細胞または組織から調製し、薄波状線として示す。RNAサンプル
にポリヌクレオチド保護フラグメントのグループを添加し、太い、濃いそして薄
い線で描く。保護フラグメントの濃い部分は特異的RNA標的に相補的であり、これらの標的にハイブリダイズするセグメントを示す。薄い部分はオーバーハンギ
ング部分を示す；配列は相補的配列と接触するが、標的と相補的ではない。保護
フラグメントを過剰に添加する。全ての利用可能な標的の保護フラグメントへの
ハイブリダイズに続いて、サンプルをヌクレアーゼの適当なカクテルおよび化学
処理で処理し、望ましくない非ハイブリダイズRNAおよび非ハイブリダイズポリヌクレオチドを破壊する。例えば、S1ヌクレアーゼは、存在する一本鎖DNAを破壊できる。これ故、過剰の保護フラグメントを結合保護フラグメントのオーバー
ハンギング非ハイブリダイズ部分として加水分解する。RNAはリボヌクレアーゼH
を含むリボヌクレアーゼの添加によりまたは塩基中でサンプルを加熱することに
より破壊できる。残りは、各RNA標的がサンプルにどの程度存在するかを反映する開裂保護フラグメントの収集物である。残りの保護フラグメントwMAPSハイブリダイゼーションアッセイで測定する。図10はMAPSアッセイにおけるハイブリダイゼーション特異性を図説する。図11はアンカーのリンカーへの結合動態を図説する。図12は二つのオリゴヌクレオチド標的のMAPSアッセイを図説する。図13は感受性シフトの定量を図説する。図14は4つのリンカー／アンカー組合わせの融点温度決定を図説する。図15はNPA-MAPSによるmRNAアッセイを図説する。図16はNPA-MAPでの希釈曲線を図説する。図17はホスホチロシン残基を含むペプチドの検出のためのアッセイを図説する
。図18はマップESTのアッセイの第1段階を図説する：MAPSプレートの一般的アン
カーのアレイにマップするESTの各々に対応する凝集リンカーの凝集。16ウェルのマイクロプレートの各表面に16個の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む
リンカーが結合し、4×4マトリックスに配置する。第1位置はオリゴ1を有し、こ
れは第1EST配列の部分に相補的であり、試験する16ESTのためにこのようにする。 ESTを得た遺伝子から産生されたcDNAまたはmRNAを全16ウェルに添加し、適当な条件下でハイブリダイズさせた。それ故、16EST配列の一つを含むcDNAまたはm
RNAが、相補的プローブが置かれる位置に凝集する。図19はマップESTの続く段階を図説する：MAPSプレートへのディテクターオリゴヌクレオチドの添加。プレートの各ウェルに、マップするESTの一つに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを入れる。各ディテクターオリゴヌクレオチ
ドは検出に使用する分子、例えば、検出の方法が蛍光イメージングである場合、
フルオレッセインに結合したオリゴヌクレオチドである。各ディテクターオリゴ
ヌクレオチドはESTの一つに相補的であるが、EST特異的プローブが異なり、一つ
のESTに相補的なプローブおよびディテクターオリゴヌクレオチドが同時に両方結合できる。洗浄後、単一ディテクターオリゴヌクレオチドを、図に番号付けするように各
ウェルに添加する。即ち、第1ESTに相補的な配列を有するディテクターオリゴヌ
クレオチドを第1ウェルになどである。図20aおよびbは図18および19に示すマップESTのアッセイの結果を示す。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび適当なストリンジ
ェンシーの条件下のでの洗浄後、例えば、マイクロプレートの16ウェルをCCDベースの蛍光イメージャーで結像する。図20aは様式化した結果を示す。各EST特異
的ディテクターオリゴヌクレオチドは、対応するEST特異的プローブにより抑制されたmRNAまたはcDNAを標識すべきであることは予期される。例えば、プローブ
5はその位置で第5EST配列を含むcDNAまたはmRNAを凝集し、第5ディテクターヌク
レオチドがまた同じ位置でcDNAまたはmRNAをハイブリダイズしなければならない
。これは、各検出オリゴヌクレオチドが適合プローブを標識する、これらの様式
化データで当て嵌まる。加えて、最初の3つのディテクターオリゴヌクレオチドは、各々最初の3個により固定されたcDNAまたはmRNAを標識を標識し、これらの配列が同じ遺伝子に並んでいることを示す。同様に、最後の5個のESTは結合して
いるように見える。これらのデーターからの結合を図20bにグラフ的に示す。図21は図18-20に示すプローブ、ディテクターオリゴヌクレオチドおよびEST番
号1、2および6の関係を図説する。図22はハイスループットアッセイを図説する。

【００９８】 (実施例) 実施例1 ハイブリダイゼーション特異性(図10) 一般的MAPSプレートをインクジェットディスペンサーであるPixusシステム(Ca
rtesian Technologies, Inc., Irvine, CA)を使用して製造し、マイクロタイタープレートの各ウェル内にDNAの同一グリッドを形成した。全てのオリゴヌクレオチドはBiosourse International (Camarillo, CA)から購入した。このプレートに、7個の異なるオリゴヌクレオチドアンカーを、キーとして示す(図の左側) 各ウェル内に分配した。各オリゴヌクレオチドを、500mMリン酸ナトリウムpH8.5
および1mM EDTAを含む2μM溶液から、DNA Bindプレート(Corning Corstar)に10 ナノリットル滴から2個のスポットで分配し、乾燥させた。結合後、ウェルを50m
M Tris pH8で遮断し、次いで、表面に共有結合しないオリゴヌクレオチドを5×S
SP緩衝液中の0.1％SDSで洗い流した。

【００９９】洗浄プレートに蛍光標識したリンカーオリゴヌクレオチドを添加し、6×SSPE 中、0.1％Triton X-100と室温で30分ハイブリダイズさせた。これは、リンカーの結合の好ましいプロトコールである。リンカーオリゴヌクレオチドは合成中に
cy5誘導体化され、特異的固定オリゴヌクレオチドに25塩基対セグメントで相補的であった。7個のアンカーおよびリンカーの配列は下記の通りである(全て3'か
ら5'で示す)：

【表１】 ^*アンカーを、5'末端でアミドを有するC12スペーサーで合成した。^** リンカーを5'末端に結合したCy5で合成した。^*** ディテクターオリゴヌクレオチドを5'末端に結合したビオチンで合成した。

【０１００】各ウェルにリンカーまたはリンカー混合物(図に示すような)を大量に添加した
。(“全て”と記したウェルに全7個のリンカーの混合物を添加した。)インキュベーションおよび5×SSPで3回の洗浄の後、図面の右側に示す蛍光画像をTundra イメージャー(IRI, St. Catherines, Ontrario)で撮った。見られるように、リンカーは、それらの相補的アンカーと特異的に会合することにより、表面に自己
凝集する。この方法を8個の異なるアンカーおよびそれらと実質的に優先的に会合するリンカーを各ウェルに分配する以外、繰り返す。方法全部を、24、96、384、864ま
たは1536ウェルプレートの各ウェルで、36、64などの異なるアンカーで繰り返す
。

【０１０１】実施例2 結合動態(図11参照) Cy5誘導体化リンカー番号1のその相補的結合アンカーへのハイブリダイゼーシ
ョンの速度を、異なる濃度のリンカーに関して示す。一般的MAPSプレートを、ア
ンカー1がウェル当り4スポットで結合している以外、図1のように調製する。インキュベーションを、室温で0.1％Tween-20含有5×SSPと室温で行い、ウェルを3
回5×SSPで洗浄し、結合蛍光を測定した。プレートの蛍光画像をTundraで撮り、
背景を引いて各ウェル内の各スポットでの結合強度をTundraソフトウェアで計算
した。プロットしたのは、二つのデュプリケートウェルの4点の結合強度の平均と標準分散である。

【０１０２】実施例3 蛍光リンカー一般的MAPSプレートを、ウェルあたり1スポット(上の二つの列)、ウェル当り4
スポット(次ぎの4列)またはウェル当り16スポット(下の2列)にスポットした一つ
の固定オリゴヌクレオチドを含むように、上記の方法に従って製造する。各ウェ
ルに、相補的、蛍光標識リンカーを実施例1に記載の好ましいプロトコールで結合する。洗浄に続いて、プレートの蛍光画像をTundraで撮る。各スポットでの蛍
光の量は、どの程度官能的リンカーが標的へのハイブリダイズに利用可能である
かを報告する。反復スポットで検出したシグナルの量は非常に再現性である。

【０１０３】実施例4 結合曲線実施例3のように調製したプレートに、異なる濃度の標的オリゴヌクレオチドを添加する。会合しているリンカーは標的の部分に相補的な25量体配列を含む。
標的を、全量30または100マイクロリットルの0.05％SDS含有5×SSC中に添加し、
プレートを覆い、50℃で一晩インキュベートする。標的の結合リンカーへのハイ
ブリダイゼーションに続き、標的を化学ルミネッセンスを使用した好ましいプロ
トコールにより可視化する。標的の別々の部分に相補的な(リンカーに相補的な部分と同じではない)25量体配列を含むビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを30nMで添加する。ビオチニル化ディテクターは、過剰の非結合標的を洗
い流した後30分添加できるか、または一晩のハイブリダイゼージョンの長さの標
的と一緒に添加できる。ディテクターの添加に続いて、表面を2回5×SSC、1回0.
1％Tween-20および1％PEG含有1×SSP(SSPTP)で洗浄し、250μg／mlのストレプト
アビジンに接合したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP：SA、Pierce, Ro
ckford, IIlから)の1：50,000希釈を、SSPTP中5時間室温で添加する。ウェルを4
回SSPTPで洗浄し、1回洗浄し、次いでSuper Signal Ultra試薬(Pierce)とインキ
ュベートする。数分後、蛍光の画像をTundraイメージャーで集め、例えば、画像
を5分CCDアレイ内に蓄積できる。低レベルの標的を、標的の濃度が〜5×10^-13M ほど少なくてもあるウェルでは可視化できる；シグナルの量は、一般に〜10^-10M
の濃度の標的で飽和される。反復スポットで検出されるシグナルの量は、非常に
再現性である。実施例5 二つのオリゴヌクレオチドのアッセイ(図12参照) 上記の好ましいプロトコールを使用した二つの異なる標的オリゴヌクレオチド
のMAPSDアッセイを証明する結合曲線を示す。一般的MAPSプレートを、各々4回各
ウェル内にスポットされた4つの異なる固定オリゴヌクレオチドで調製する。第2
および第4のアンカーに関して、相補的リンカーオリゴヌクレオチドは、記載のように自己凝集した。二つの標的を40マイクロリットル中に示す濃度で、記載の
ように各ウェルに添加し、50℃で一晩インキュベートする。各標的の結合量は、
記載のように、HRP：SAおよび化学ルミネッセンス結像後に、各標的に特異的なビオチニル化検出オリゴヌクレオチドの結合により可視化された。下部パネルに
おいて、イメージの強度を定量する。Tundra Imagaerパッケージの一部であるソ
フトウェアを使用して上部パネルに示す矢印の間の線に沿って画像の強度をスキ
ャンした。標的の最低濃度である1.1pMで、スキャンしたイメージは十分に定義されたガウスピークを各スポットで示し、一方、標的の0濃度では、最も左のサンプルで検出可能な背景ピークはなかった。

【０１０４】実施例6 感受性変化(図13参照) MAPSハイブリダイゼーションアッセイは、一連のオリゴヌクレオチドの濃度の
測定に、それらを表面に結合させ、それらを標識することにより使用できる。こ
れは、中程度のまたは低い濃度であるこれらのオリゴヌクレオチドで十分に働く
。二つのサンプルを、一つのサンプルがよりオリゴヌクレオチドを含み、より結
合する場合、区別できる。他方、標的オリゴヌクレオチドの濃度が表面を飽和し
ている場合(即ち、全ての結合部位を占領するのに十分高い場合)、そして濃度が
上がってもより結合できない場合、量は測定できない。しかし、標的の結合曲線
は、非標識競合リガンドの添加により変化できる。

【０１０５】結合データは、4つの異なるオリゴヌクレオチド標的に関して得られ、その全てがおおまかに3nMで表面を飽和している(即ち、最大結合に到達)。非標識競合標的を全てのウェルに添加することにより、標的オリゴヌクレオチドの結合は移
動し、低い濃度で結合は少なく、飽和が起こるレベルが上に移動する。競合オリ
ゴヌクレオチドを、例えば標的1および3に添加できるが、2および4にはできない
。アッセイの感受性のこの変化は、標的1および3のみにである。この方法で、予
期されるオリゴヌクレオチドの相対的量が既知であるなら、大きく異なる濃度の
オリゴヌクレオチド標的を一つのアッセイで十分測定できる。データは一つのオリゴヌクレオチド標的への結合に関して上記に例示のように
定量できる。図13は、高い濃度のこの標的のアッセイに使用する結合曲線のアッ
セイシフトにおける競合オリゴヌクレオチドの包含を定量的に示す。

【０１０６】実施例7 4つのプローブの融点(図14参照) MAPSアッセイでアンカーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする4 つの異なる蛍光標識リンカーオリゴヌクレオチドの量を、温度の上昇にしたがっ
てプロットする。4つのオリゴヌクレオチドは最初に50℃で1時間、300nM中でハイブリダイズさせた。次いで、ウェルをプローブなしのSSCで洗浄し、結合した量を上記のように蛍光(50℃点)で測定する。次いで、表面を55℃で30分インキュ
ベートし、結合した蛍光を測定するなど、全ての示した温度で行う。

【０１０７】実施例8 検出法二つの検出法を直接比較する。各々ウェル当り4スポットで、4つのオリゴヌク
レオチドアンカーが結合したMAPSプレートに、二つのオリゴヌクレオチドを各ウ
ェルに添加し、両方とも共有結合したcy5部分を含むか、両方ともビオチン基を含む。落射蛍光測定を、記載のように可視化および蛍光リンカーの測定に関して
行う。化学ルミネッセンス測定をMASPアッセイに記載のように、HRP：SAの続く添加および化学ルミネッセンス基質を使用して行う。産生したシグナルは大まか
に同じ強度である。しかし、各ウェルを離す壁があるマイクロプレートの外形、
および液体の泡または流体のミニスカス(miniscus)のために、落射蛍光画像の反
射がデータ解析に影響し得る。

【０１０８】実施例9 化学ルミネッセンス産物ホースラディッシュペルオキシダーゼの化学ルミネッセンス基質として利用可
能な二つの生産物を、MAPSアッセイの検出法で比較できる。MAPSプレートを実施
例8のように調製し、ビオチニル化リンカーオリゴヌクレオチドとインキュベートする。次いで、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼ(AlkPh
os:SA)またはHRP：SAのいずれかを添加し、続いて、洗浄し、AlkPhos:SAのプレートにはCDP-Star(Tropix)またはHRP:SAのウェルにはELC-Plusを添加する。SA誘
導酵素および基質での標識は、ウェスタンブロットの標識における使用に関して
製造者が指示する通りである。これらの二つ(および他の利用可能な基質)は、両
方ともMAPSプレートへのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼージョンの評価に使
用できる。

【０１０９】実施例10 0.6mmでの解析 MAPSアッセイの現在のシステムの解析は、各々ウェルあたり4回、0.6mmのピッ
チ(中心から中心の空間)でスポットしたMAPSプレートをウェル当り4つの異なるオリゴヌクレオチドアンカーで調製して試験する。次いで、cy5誘導体化リンカーまたはビオチニル化リンカーをハイブリダイズし、検出し、上記のようにスキ
ャンする。落射蛍光測定に関して、解析は高い(そしてピッチは減少できるようである)。化学ルミネッセンス検出法に関して、隣のスポットと完全に離れておらず、この空間で、まだ個々のピークはコンピューターデコンヴォルーションに
より明白に解析し得る。

【０１１０】実施例11 試験ヌクレアーゼ保護プロトコールヌクレアーゼ保護プロトコールのハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ
処理の最適条件の試験のアッセイにおいて、Ambion(Austin, Texas)のNuclease
Protection Assay Kitを使用して条件、緩衝液および酵素を提供する。8個のサンプルを3つの緩衝液の一つに調製する。Hyb Buff 1は100％Hybridization Buff
er(Ambion)；Hyb Buff 2は75％Hybridization Bufferおよび25％Hybridization
Dilution Buffer(Ambion)およびHyb Buff 3は各々50％である。試験mRNAに相補的な60残基を含む70量体オリゴヌクレオチドを合成し(Biosource International
, Camarillo, CA)、Ambionによりソラレン-ビオチンの標識について示されるプロトコールにしたがって、ソラレン-フルオレッセイン(Schleicher and Schuell
, Keene, NH)で標識する。簡単に、保護フラグメントを20μlのTE緩衝液(10mM T
ris、1mM EDTA、pH8)中50μg／mlに希釈し、10分間沸騰させ、急速に氷水で冷や
す。DMF中の4μlの130μg／mlソラレン-フルオレッセインを添加し、サンプルを
45分、40℃で手に持てる波長のUV源で照射する。遊離ソラレンフルオレッセイン
を飽和ブタノールでの抽出により除去する。使用したmRNAは、アンチセンスプラ
スミド(AmbionのpTRI-GAPDF-MouseアンチセンスControl Template)から、T7プロ
モーターおよびMaxiScriptキット(Ambion)を使用して製造したGAPDHアンチセンスmRNAである。短保護フラグメントは、別々に合成し、同様に標識した60量体相
補的部分である。保護フラグメントの配列は下記の通りである：

【表２】

【０１１１】ハイブリダイゼーションを、保護フラグメントを20nMでGAPDH mRNAを60nMで10
μlの最終容量に2時間、22℃または37℃で混合することにより行う。ハイブリダ
イゼーションに続いてヌクレアーゼの混合物200μlを、製造者(Ambion Nuclease
Protection Kit, ヌクレアーゼ混合物の1:200希釈)の指示にしたがって添加し、再び同じ温度で30分インキュベートする。加水分解をHybridization Inhibiti
on Buffer (Ambion)で停止させ、オリゴヌクレオチドをペレット化し、エタノー
ルで洗浄する。10μlの1×Gel Loading Buffer (Ambion)を添加し、オリゴヌクレオチドを15％TBE-尿素ゲルで分離する。ゲルを30分、流出緩衝液で渦を巻かせ
、プラスチックプレート上におき、励起および放出波長の選択のためのフルオレ
ッセインフィルターを使用してTundraで結像させる。画像をCCDアレイに2分蓄積
する。最良の条件は、Hyb Buff 2で37℃またはHyb Buff 3で22℃でインキュベートしたサンプルである。これらのサンプルにおいて、検出可能な完全長保護フ
ラグメントは残っておらず、あきらかに短保護フラグメントと同じサイズの有意
な量の完全長保護フラグメントの部分が見られる。

【０１１２】実施例12 NPA-MAPSによるmRNAアッセイ(図15参照) 完全NPA-MAPSプロトコールを、実施例11に記載のものと同じハイブリダイゼー
ションおよびヌクレアーゼ処理の条件で使用した。10個のサンプルをアッセイで
流した。全て、同じ量の70量体オリゴヌクレオチド保護フラグメントおよび異な
る量のGAPDA mRNAを含んだ。0.08mg／ml Yeast RNA(Ambion)含有50％Hybridizat
ion Bufferおよび50％Dilution Bufferの10μlの中のハイブリダイゼーションサ
ンプルを90℃で6分加熱し、70℃で5分加熱して短く遠心し、19℃に冷やして19時
間インキュベーションした。200μlのヌクレアーゼ混合物を次いで各サンプルに
30分、19℃で添加した。各サンプルを、MAPSアッセイのために60μlに等分した。2μlの10N NaOHおよび2μlの0.5M EDTAを添加し、サンプルを90℃に15分、37 ℃に15分加熱し、20分室温で放置した。次いで、サンプルを2μlの10M HClで中和し、2M HEPES pH7.5および200nMの保護フラグメントに特異的なビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを含む12μlの20×SSCを、1μlの10％SDSと共に添加した。サンプルを混合し、80℃で5分加熱し、各サンプルの2個の35μl量をMAPSプレートの二つのウェルにピペット輸送した(各サンプルを二つにわけ、M
APSプレートでデュプリケートで流す)。プレートは標準MAPSプロトコールのため
に調製されており、保護フラグメントに特異的な自己凝集CY5誘導体化リンカーが既に結合している。MAPSプレートを覆い、50℃で一晩インキュベートし、発光
の検出を記載のように行った。最後のサンプルにおいて、保護フラグメント単独
ではMAPSでどのように検出されるかの可視化のコントロールとして、ヌクレアー
ゼをアッセイ中に添加しない。図の下部において、ウェルの上の列の強度スキャ
ン(イメージャーの分析として)を示す。サンプルに存在するGAPDH mRNAの量(即ち、MAPSプレートに等分した後の各デュプリケートにおける量)を図に列記する。

【０１１３】 MAPSプレートに使用したオリゴヌクレオチドは下記の通りである：

【表３】 ^*アンカーを5'末端でC12スペーサーにより合成した。^** リンカーを5'末端に結合したCy5で合成した。^*** ディテクターオリゴヌクレオチドを5'末端に結合したビオチンで合成した。

【０１１４】実施例13 希釈曲線、NPA-MAPS(図16参照) 実施例12に記載のおよび図15に示すデータを定量し、希釈曲線としてプロット
した。二つのデュプリケートウェルの全8スポットの平均および標準分散をmRNA の各濃度に対してプロットした。結合曲線は、式：フラクション結合＝最大結合^*1／(1＋IC₅₀／L) 〔式中、最大結合は飽和時の最大結合、フラクション結合はリガンド濃度Lで結合する量、およびIC₅₀はフラクション結合が最大結合の半分であるリガンドの濃
度〕に入れた。曲線は図上に点で示し、図で標識するように、IC₅₀＝4.2フェムトモルの値で最も適合した。

【０１１５】実施例14 全マウス肝臓RNA抽出物におけるGAPDH mRNAのNPA-MAPSアッセイ全マウスRNA抽出物を、NPA-MAPSアッセイでGAPDH mRNAについてアッセイし、希釈曲線を作る。マウス肝臓由来の全RNAは、Quiagenキットを使用して調製する
。RNAを0.5mM Mg-アセテート含有70％EtOHに沈殿させ、10μlの0.8nM保護フラグ
メント含有0.05％SDS含有5×SSC中に再懸濁した。添加した保護フラグメントはオリゴヌクレオチド70塩基長であり、その60塩基がマウスGAPDHに相補的である。マウスGAPDH mRNAに相補的なフラグメントを使用する(“保護フラグメント”)
か、これらの配列の相補物をネガティブコントロールとして使用する(“アンチセンスフラグメント”)。

【０１１６】保護フラグメント含有RNAサンプルを90℃で5分加熱し、ハイブリダイゼーショ
ンを、サンプルを70℃にし、それらをゆっくり一晩で室温に冷却することにより
行う。1：10希釈のS1ヌクレアーゼ(Promega)を、30分、19℃で30μlの1×S1 Nu
clease Buffer(Promega)に添加し、1.6μlの10N NaOHおよび2.7μlの0.5M EDTA で停止させる。サンプルを90℃で15分、次いで37℃で15分加熱し、変性させてRN
Aを破壊し、1.6μlの10M HClで中和し、MAPSプレート上で一晩、200mM HEPES pH
7.5添加5×SSCと一晩インキュベートし、それに30nMビオチニル化検出オリゴヌクレオチドを添加する。洗浄およびSA-HRPでの可視化を記載のように行う。シグ
ナルの量は、マウスRNAの量の減少(サンプルは500、170、50、5または0.5μgのマウスRNAを含む)と並行して減少する。二つのコントロールサンプルは、S1ヌク
レアーゼが添加されていないものを含む。シグナルは、相補的保護フラグメント
にのみ見られる。

【０１１７】使用したオリゴヌクレオチド：

【表４】 ^*アンカーを、5'末端でアミドを有するC12スペーサーで合成した。^** リンカーを5'末端に結合したCy5で合成した。^*** プローブを5'末端に結合したビオチンで合成した。

【０１１８】実施例15 コントロールを含むヌクレアーゼ保護MAPSアッセイ mRNAはマウス肝臓から抽出され、ヌクレアーゼ保護は、GADPH特異的保護フラグメントがマウスGAPDHに相補的な60ヌクレオチドを含み、標的に相補的ではないフラグメントの3'で15“オーバーハンギング”ヌクレオチドが続く以外、本質
的に実施例14に記載のように行う。ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ
消化後、残りの保護フラグメントを、二つの異なるオリゴヌクレオチド検出フラ
グメントを固定化保護フラグメントの検出に使用する以外、本質的に実施例14に
示すようにMAPSプレートとハイブリダイズさせる。一つの検出フラグメントは保
護フラグメントのGAPDH特異的部分に相補的であり、他方、コントロールは保護フラグメントの15塩基オーバーハング部分に相補的である。各検出フラグメント
は異なる複製サンプル(即ち、異なるウェル)で使用し、両方の検出フラグメント
が同じ検出分子で標識できるようにする。本実施例においては、両フラグメント
をHRPで標識する。ヌクレアーゼの添加なしに、両方の検出フラグメントのからのシグナルが見られる；一方、ヌクレアーゼ消化が行われたときは、GAPDH配列に対応するシグナルのみが検出できる。GAPDH特異的シグナルの量は、保護フラグメントを存在するGAPDH mRNAの量に対し対して過剰に添加したため、ヌクレア
ーゼ消化の不存在下で見られるものに相対して減少する。これは、GAPDH mRNAの
量が保護ハイブリダイゼーションを限定し、形成された二本鎖の量(したがって、ヌクレアーゼから保護された保護フラグメントの量)がmRNAを反映するするようにする。mRNAが反応混合物に含まれないとき、ヌクレアーゼを検出したときシ
グナルは検出できない。上記の発見は、アッセイのハイブリダイゼーションおよ
び消化段階が所望により起こっていることを証明する。

【０１１９】種々の標的に対応する保護フラグメントがアッセイに包含される場合、各保護
フラグメントは同じオーバーハング部分の15塩基を含むことができる。これは、
全てのサンプルの残りのオーバーハングのテストに使用するためのフラグメント
の検出を可能にする。

【０１２０】実施例16 疾病状態と相関する遺伝子の発現を変え得る化合物のスクリーニング
の転写アッセイヒト腫瘍由来の細胞系を使用する。正常細胞よりも高いレベルで30遺伝子が発
現されることが判明している。(即ち、これらの30遺伝子は正常細胞でよりも使用されおり、mRNAを造り、続いて遺伝子が指示するタンパク質を製造する。転写
アッセイは、各遺伝子のmRNAがどの程度存在するかにより、どの程度遺伝子が使
用されているかを測定する。)MAPSプレートでのヌクレアーゼ保護アッセイ(NPA-
MAPS)を使用して、8800個の化学化合物を試験して、化合物存在下での細胞の成長が、5個の正常(構造的、“ハウスキーピング”)遺伝子の発現に影響することなく30個の相関的遺伝子のいくつかの発現を減少できるかを見るために試験する
。効果を有する化合物は、この種の腫瘍の処置の医薬の開発に将来的に有用であ
るかも知れない。

【０１２１】約10,000から100,000細胞を、100個の96ウェルポリスチレンプレートの各ウェ
ルに添加し、それらが各ウェルの表面を覆うまで2日間生育させる。各プレートの8ウェルに関して、細胞を添加なしで生育させる。残りの各プレートの88ウェルに、異なる量の化学化合物を添加し、その効果単独を試験できるようにする。
同時に100プレートを使用することにより、8800個の化合物が同時に試験またはスクリーニングできる。細胞を24時間、化合物の存在下で生育させ、次いで細胞
をアッセイのために回収する。各プレートの細胞を96ウェルプレートのサンプル
中のRNAの調製に関する指示にしたがって(例えば、Quiagen RNeasy 96キットにしたがって)処理する。RNAを調製した後、30個の相関的遺伝子および6個の正常 “ハウスキーピング”遺伝子を含む36個の異なるmRNA種の量をNPA-MAPS試験によ
り定量する。各々目的の遺伝子の一つに対応する36DNAオリゴヌクレオチド保護フラグメントを各ウェルに添加し、その標的mRNA配列に、選択したストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズさせる。次いで、S1ヌクレアーゼを添加して過剰
の非ハイブリダイズDNAを破壊させ、サンプルを化学的に処理して同様にRNAを破
壊する。左は、どの程度のmRNAが各サンプルの処理細胞に含まれているかに比例
する、各36遺伝子のオリゴヌクレオチド保護フラグメントである。

【０１２２】各々36個の異なるアンカーオリゴヌクレオチドの複数のアレイを各ウェルに含
む100個の96ウェルプレートを各ウェルに36個の異なるリンカーオリゴヌクレオチドを添加することにより調製する。リンカーは各ウェルに表面に自己凝集し、
一般的プレートを36個のオリゴヌクレオチド保護フラグメントの各々に特異的な
プローブを含むMAPSプレートに変える。各リンカーは36個のアンカーの一つに特
異的な部分および36個の保護オリゴヌクレオチドのセグメントの一つに特異的な
部分を含む。100個のサンプルプレートの各ウェルからのオリゴヌクレオチドサンプルを100個のMAPSプレートの対応するウェルに添加する。選択したストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション後、結合した化学ルミネッセント
酵素を有する各標的のための検出オリゴヌクレオチドを添加し、各ウェルの各特
異的スポットが、サンプル中にどの程度mRNAが存在するかに依存して照らされる
。6個のハウスキーピング遺伝子への作用無しに相関的遺伝子の量が減少したウェルは、興味深い。これらのサンプルの細胞に添加した化合物は、抗腫瘍剤の開
発の出発点の可能性がある。

【０１２３】実施例17 誘導および構造的遺伝子発現 RNAを、本質的に実施例14に記載のように、アデノウイルスに感染していない(
“コントロール”)または感染1時間後(“感染”)のマウスの肝臓から調製した。
肝臓RNAの60μgを各サンプルに使用し、サンプルをデュプリケートで調製した。
各アッセイウェルはデュプリケート位置を3組含み、上記の3つの遺伝子に対応す
る。各位置はアンカーを含み、3つの遺伝子の一つの対応する保護フラグメントに相補的なプローブを含むリンカーに結合する。ヌクレアーゼ保護MAPSアッセイ
を、本質的に図12に記載のように行い、記載のように画像を集めてスキャンした
。3個のmRNA標的の各々に関してデュプリケートのウェルの回収した生データおよびスキャンした強度を示す。スキャン線上の数は、統合強度値および各条件の
標準偏差(n＝4)である。変化が予期されないハウスキーピング遺伝子、GAPDHは、統計的に有意ではない1.3倍の僅かな増加を感染サンプルで示した。MIP-2およ
びc-junの転写は各々4および6倍に増加した。これらの発見は、二つの遺伝子、M
IP-2およびc-junが、コントロールの構造的発現遺伝子GAPDHと比較して、アデノ
ウイルス感染に反応して促進された反応を示すことを証明する。

【０１２４】実施例18 チロシンまたはセリンキナーゼを選択的に阻害する化合物のスクリー
ニングの酵素アッセイキナーゼはタンパク質にリン酸を結合させる酵素である。多くは正常および新
生物形成的細胞生育を刺激することが示されている。これ故、特異的キナーゼ( しかし、全てのキナーゼではない)を阻害する化合物は、どのキナーゼが病因に関与するかの試験に使用でき、そしてもしそうなら医薬開発の出発点として働く
。例えば、細胞生育の刺激または炎症性反応の調節に関与する5個のチロシンキナーゼはsrc、lck、fyn、Zap70およびyesである。各キナーゼは、チロシンを含む短いペプチドとして、基質が部分的に同定される。キナーゼ種のいくつかは重
複し、異なるキナーゼがあるペプチドを、同等に、しかし、他のものが優性にリ
ン酸化し得る。5個のキナーゼに関して、36個のペプチド基質は、特異的および重複特性を示すものを選択する。

【０１２５】 100個の96ウェルプレートを使用する；各ウェルは36個の一般的オリゴヌクレオチドアンカーを含む。36個のリンカーを調製し、一般的オリゴヌクレオチドア
レイ(アンカーのみ)からペプチド基質を含むアレイに変換する。36個のペプチド
基質を合成し、各々アミド結合を介して、例えば、5'アミノ基を含むオリゴヌク
レオチドに共有結合的に結合させる。オリゴヌクレオチドは、アンカーに特異的
にハイブリダイズする配列を含む。ペプチド／オリゴリンカーは、それらをMAPS
プレートの全てのウェルに添加することにより表面に自己凝集させる。

【０１２６】スクリーニングのために、適当な濃度(基質のリン酸化の速度ができるだけ平衡している)の5個のキナーゼを各ウェルに、8800個の異なる試験する化合物と共
に添加する。化合物を、単離酵素を直接阻害する能力に関して試験する。各アレ
イ化ペプチドのリン酸化の量を、チロシンがリン酸化されたペプチドのみに結合
する標識抗体の添加により検出する。ホスホチロシンスポットのいくつかで減少
を示すが、全てのスポットではないウェルが興味深い。これらのウェルに添加し
た化合物は、更に、試験したキナーゼのいくつかの選択的阻害剤の可能性につい
て試験できる。

【０１２７】アッセイのスキームを図17の上部パネルに示す。25個の塩基対オリゴヌクレオ
チドがアンカーの一つに相補的なキメラリンカー分子をチロシンホスホキナーゼ
酵素のペプチド基質に架橋する。キメラオリゴペプチド基質はオリゴヌクレオチ
ドアンカーのアレイに自己凝集し、キナーゼ酵素をキメラのペプチド部分のリン
酸化に使用し、酵素反応を進行させた後、ペプチドのリン酸化の量を抗ホスホチ
ロシンまたは抗ホスホセリン抗体により、結合検出蛍光または酵素で検出する。

【０１２８】アッセイの結果を下部パネルに示す。同一2官能性架橋剤であるDSS(Pierce)を
使用して、オリゴヌクレオチドリンカーの5'アミノ基をリン酸化チロシンで合成
したペプチドのN末端に結合させた。一文字標記のペプチドの配列はTSEPQpYQPGE
NL(配列番号32)であり、pYはホスホチロシンを意味する。キメラは直接使用した
か、または最初に60分pH14にし、チロシンのホスフェート基を部分的に加水分解
させて使用した。リン酸化または部分的脱リン酸化キメラ分子はMAPSプレート内
の相補的アンカー分子に、示す濃度で1時間自己凝集する。洗浄およびウェルをS
SPTP中の0.3％BSAで遮断後、HRPに架橋した抗ホスホチロシン抗体(Upstate Biot
echnology, Lake Placid, NYからの抗体4G10)をSSPTP中1：3000希釈で1時間添加
し、結合した抗体の量を化学ルミネッセンス基質であるSuper Signal Blazeで検
出した。示す画像は1分、CCDアレイに蓄積させた。予期されるように、オリゴペ
プチドに結合したリン酸の量に差異が見られた。この差異は、一連のキナーゼが
、阻害剤の可能性のある異なる薬剤で処理したときにどのように作用するかを測
定するアッセイの基本である。

【０１２９】実施例19 SH2ドメインとリン酸化ペプチドの間の相互作用の選択的阻害剤の検出のための結合アッセイ SH2ドメインはある成長調節タンパク質で結合サブユニットとして働く。ドメインはリン酸化ホスホチロシン含有タンパク質またはペプチドに不完全な特異性
で結合する。即ち、あるホスホチロシンペプチドは1個または数個のSH2タンパク
質に特異的に結合するが、他方は多くのSH2タンパク質に広く結合する。

【０１３０】このアッセイに関して、リンカーはオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合す
るリン酸化ペプチドである。ペプチド部分は、選択SH2タンパク質の基に結合する能力に関して選択する。リンカーは、一般的MAPSプレートをSH2タンパク質の基に特異的なリガンドを有するプレートに変える。リガンドを担持する100個の9
6ウェルMAPSプレートを造る。タンパク質を単離し、例えば、cy5蛍光分子で標識
する。

【０１３１】 SH2ドメイン／ホスホペプチド相互作用のスクリーニングのために、標識SH2タ
ンパク質の基を100個の96ウェルMAPSプレートの各ウェルに添加し、各ウェルに異なる試験化合物を添加する。これゆえ、各化合物の個々のSH2タンパク質とそのホスホペプチドリガンドへの相互作用の効果が、試験される。アッセイは、各
表面結合ペプチドリンカーに付随した結合SH2タンパク質の蛍光の測定のためである。減少した蛍光をあるスポットで示すが、全てのスポットでは示さないウェ
ルについて、添加した化合物を更にSH2ドッキングの推定選択的阻害剤として試験できる。

【０１３２】実施例20 ハイスループットスクリーニング(図22参照) 一つの実験における96ウェルからのシグナルの検出を証明するハイスループッ
トMAPSプレートを示す。同じオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを
80ウェルの16個の複製で測定した。示されるように、1280個のハイブリダイゼー
ションアッセイの再現性は非常に高かった。最も左および最も右のカラムは、異
なる濃度のオリゴヌクレオチドのシグナルの標準化のためのコントロールとして
働く。

【０１３３】同じ形態で、16個の異なるオリゴヌクレオチドを各ウェルで試験でき、試験を
プレートの80個の異なるウェルで繰り返す。もちろん、もっと多い数の異なるオ
リゴヌクレオチドまたは他のプローブ(例えば、100ヌクレオチドプローブ)も各ウェルで試験でき、多くのプレートを同時に試験できる(例えば、96ウェルマイクロタイタープレート、100プレート)。各サンプルに関して行うことができるア
ッセイの多い数(例えば、後者の場合、約100個の異なるアッセイ)および同時にアッセイできるサンプルの多い数(例えば、後者の場合、約96×100または9600の
異なるサンプル)は超ハイスループットを提供する。

【０１３４】前記から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認でき、その精神および範
囲から逸脱することなく、本発明を種々の使用および条件に適応するように変化
および修飾できる。更に努力することなく、当業者は、前記を使用して、本発明をその完全な範囲
で利用できると考えられる。前記は好ましい具体的態様を記載し、したがって、
単に説明的であり、如何なる方法でも明細書の残りの記載を限定しない。上記および図面で引用した全ての出願、特許および刊行物は、本明細書に引用
して包含させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リチャード・クリスアメリカ合衆国85718アリゾナ州ツーソン、イースト・アベニーダ・デ・ポサダ2602番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 CA04 CA09 CA11 FA02 HA12 HA19 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QR62 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、 a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカー、それぞれが結合するのが、 c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を有する二官能性リンカー、を含む組合せ。
【請求項２】各領域が少なくとも約64種のオリゴヌクレオチドアンカーを
含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】少なくとも約96ないし約1536の実質的に同一な領域を含む、
請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】各領域が約30ないし約100プローブを含み、それぞれが様々な標的に特異的である、請求項1の組合せ。
【請求項５】約96の実質的に同一の領域を有し、各領域は、約16、36、46
または100種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項６】約384の実質的に同一の領域を有し、各領域は、約9、16、ま
たは25種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項７】約1536の実質的に同一の領域を有し、各領域は、約4または9
種のオリゴヌクレオチドアンカーを含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項８】当該領域を、より小さな小領域に、更に再分割する、請求項
1に記載の組合せ。
【請求項９】領域が、ハイブリダイゼーション効率または特異性の調節を
更に含む、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１０】領域が、標的に結合する配置の能力の調節を更に含む、請
求項1に記載の組合せ。
【請求項１１】当該プローブが核酸である、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１２】当該プローブがペプチドまたはタンパク質分子である、請
求項1に記載の組合せ。
【請求項１３】当該ペプチドまたはタンパク質分子を、当該リンカー分子
の第1の部分に、結合分子により結合する、請求項12に記載の組合せ。
【請求項１４】当該結合分子が、ビオチンまたはストレプトアビジンであ
る、請求項13に記載の組合せ。
【請求項１５】当該プローブが酵素の基質またはレセプターのリガンドで
ある、請求項1に記載の組合せ。
【請求項１６】サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、 a)少なくとも2つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも8種のアンカー、それぞれが結合するのが、 c)アンカーに特異的な第1の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第2
の部分を有する二官能性リンカー、を含む組合せ。
【請求項１７】当該標的による当該組合せへの結合を効率的とする条件下
、当該標的を含むサンプルを請求項1の組合せに接触させることを含む、少なくとも1つの標的検出する方法。
【請求項１８】 a)当該標的による当該組合せへの結合を効率的とする条件
下、当該標的を含むサンプルを請求項1の組合せと接触させること、 b)当該組合せおよび任意の結合標的を標識検出プローブと接触させること、 c)当該検出プローブを検出することを含む、少なくとも1つの標的を検出する方法。
【請求項１９】当該標識検出プローブにより、化学ルミネセンスシグナル
を生じさせる、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】標的を測定する、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】当該サンプルにヌクレアーゼ保護法を実施することを更に
含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】 RNA発現パターンを決定する方法であって、当該標的が少なくとも2つのRNA分子であり、当該組合せの当該プローブのそれぞれが、少なく
とも1つの当該RNA標的に特異的であるオリゴヌクレオチドであり、当該RNA標的による当該プローブへの特異的なハイブリダイゼーションを効率的とする条件下
、当該サンプルを当該組合せと共にインキュベーションする方法。
【請求項２３】 RNA発現パターンを修飾する試薬を同定する方法であって、当該試薬の存在下作成するRNA発現パターンを多種の一群の条件下作成するRNA
発現パターンに比較することを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】当該標的が保護フラグメントである、請求項17に記載の方
法。
【請求項２５】 a)RNA抽出物中、当該保護フラグメントによる目的のRNAへ
のハイブリダイゼーションを効率的とする条件下、RNA抽出物を1つまたはそれ以
上の保護フラグメントとインキュベーションすること、 b)目的のRNAにハイブリダイゼーションする保護フラグメント以外に実質的にすべての核酸、および、所望により、ハイブリダイズする当該RNA部分を効率的に消化する1つまたはそれ以上のヌクレアーゼで当該抽出物を処理すること、 c)目的の当該RNAにハイブリダイズし、標的として保護フラグメントを含むサンプルを提供する当該保護フラグメント以外のすべての核酸物質を実質的に取り除
くこと、を更に含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２６】当該組合せが多数の当該領域を含み、その方法がハイスル
ープット法である、請求項17に記載の方法。
【請求項２７】多数のサンプルを素早くアッセイし、請求項1の組合せの別の領域に各サンプルを置くこと、および当該標的の存在を決定することを含む
方法。
【請求項２８】 a)当該標的を含むサンプルを、当該標的と当該リンカーと
の間の第1のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分および当該標的に特異的なプローブを含む第2の部分を含む二官能性リンカーと接触させること、 b)当該第1のハイブリダイゼーション産物と当該組合せ[当該組合せには、当該第
1のハイブリダイゼーション産物の添加前に、 1)少なくとも2つは実質的に同一な多数の空間的に分離された領域を含む表面、それぞれの領域に含まれるのが、 2)少なくとも8種のオリゴヌクレオチドアンカーが含まれる]との間の第2のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下、
当該第1のハイブリダイゼ−ション産物を組合せと接触させること、 c)当該第1のハイブリダイゼーション産物または当該第2のハイブリダイゼーショ
ン産物を標識したディテクタープローブと接触させること、 d)当該検出プローブを検出すること、を含む少なくとも1つの標的を検出する方法。
【請求項２９】 a)多分離領域を含み、少なくともその二つが実質的に同一
であり、各々の領域が少なくとも8個の異なるアンカー(オリゴヌクレオチド、ま
たは本明細書に記載の他のタイプ)を含むものである表面、そして b)該アンカーの少なくとも一部に特異的な第1部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第2部分を有する、少なくとも一つの2官能性リンカ
ー分子を含む容器を含む、サンプル中の少なくとも一つの標的の検出に有用なキット。
【請求項３０】 c)少なくとも1つの当該オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第1の部分、および少なくとも1つの当該標的に特異的なプローブを含む２
番目の部分を有する容器を更に含む請求項29に記載のキット。
【請求項３１】 1つまたはそれ以上の目的の核酸を検出する方法であって、当該核酸を含むサンプルを、1つまたはそれ以上の保護フラグメントでヌクレアーゼ保護し、そして、ハイブリダイズした二重鎖分子、または一本鎖保護核酸
、または保護フラグメントをマススペクトロメトリーで検出すること、を含む方法。
【請求項３２】方法がハイスループット法である、請求項31に記載の方法
。
【請求項３３】検出される核酸が保護フラグメントである、請求項32の方
法。
【請求項３４】少なくとも2種の保護フラグメントが検出される、請求項3
3に記載の方法。
【請求項３５】少なくとも16種の保護フラグメントが検出される、請求項
33に記載の方法。
【請求項３６】検出される核酸がハイブリダイズした二重鎖分子である、
請求項32に記載の方法。
【請求項３７】検出される核酸が保護された核酸である、請求項32に記載
の方法。
【請求項３８】当該目的の核酸を測定する、請求項32に記載の方法。
【請求項３９】測定される核酸が保護フラグメントである、請求項38に記
載の方法。
【請求項４０】当該保護フラグメントが、化学的に修飾されており、保護
フラグメントの核酸部分を有するか、または有さない当該化学修飾である、請求
項32に記載の方法。