JP2007518107A - ポリマーを使用する溶液中の分析物の検出および定量化 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料中の分析物を検出するための方法であって、試料と分析物特異的結合パートナーへ結合しているポリマーとを接触させる工程、この分析物特異的結合パートナーに対する分析物の結合を検出する工程、および該ポリマーの標識パターンを決定する工程を包含し、ここで、該ポリマーの該標識パターンは、該分析物の同一性を示す、方法を提供する。この分析物は、天然の有機物であっても無機物であってもよく、ウイルスのような病原体が挙げられるが、これに限定されない。

Description

（発明の分野）
本発明は、特に、試料からの分析物の検出および定量化に関する。

（発明の背景）
多重化とは、１つより多くの物質、そして好ましくは多くの異なる物質を同時に分析（例えば、検出）する能力をいう。多重化分析を行う能力は、多くの応用（例えば、プロテオミクス、体液の化学的分析、生物兵器防衛など）について有利である。限られた量の試料または検出されるべき物質の低濃度に関する応用は、特に多重化性能からの恩恵を受ける。有用であるために、多重化システムは、高感度、幅広いダイナミックレンジ、および顕著な多重化性能を実証するべきである。

報告によると、液体アレイ中のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズを使用するアッセイは、１００の多重化を提供し、そして１０ｐＭもの低濃度のタンパク質を検出する（非特許文献１）。報告によると、このビーズに基づくシステムはまた、病原体（例えば、細菌およびウイルス）を検出する。このシステムは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ＬＸ−１００フローサイトメーター（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、１秒間あたり数千個のビーズを検索し得る。報告によると、約１００種類の異なる型のビーズ上の十分な情報を収集する工程は、約１５秒間掛かると推定される（非特許文献１）。しかし、分析時間全体は、ビーズに固定された抗体とそれらのそれぞれの抗原との相互作用（すなわち、結合時間）によって制限される。この結合時間は、少なくとも３０分間と推定され、そしてより高い感度が必要とされる場合、さらに長くなり得る。
ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｇａｍｍｏｎ，Ｓ．，Ｐｉｔｅｓｋｙ，Ｍ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊ．，Ｌａｎｇｌｏｉｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｏｌｓｔｏｎ，Ｂ．およびＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎ，Ｋ．Ｓ．、「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第７５巻、１９２４−１９３０ページ

感度、ダイナミックレンジおよび多重化性能に妥協することなく、より速い分析を提供するシステムに対する必要性が存在する。

（発明の要旨）
一般的に、本発明は、ポリマーに基づく方法および組成物を使用する、試料中の分析物の分析に関する。本発明は、試料中の分析物を、検出し、定量化し、そしてまた回収し、そしてさらに分析し得る。この方法および組成物は、分析物特異的結合パートナーのための足場および各分析物を探索するための固有の同定因子の両方として機能するポリマーの使用に関する。高度の多重化は、利用可能なポリマーおよび分析物特異的結合パートナーの多様性を与え得る。

したがって、１つの局面において、本発明は、試料と分析物特異的結合パートナーに結合しているポリマーを接触させる工程、分析物特異的結合パートナーに対する分析物の結合を検出する工程、およびポリマーの標識パターンを決定する工程を包含する、試料中の分析物を検出するための方法を提供し、ここで、このポリマーの標識パターンは、その分析物の同一性を示す。

１つの実施形態において、上記分析物は、複数個の分析物であり、上記ポリマーは、複数個のポリマーであり、そして上記分析物特異的なパートナーは、複数個の分析物特異的なパートナーである。そのポリマーは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。これは、天然に存在しても天然に存在しなくてもよい。

一次分析物特異的結合パートナーは、核酸またはペプチドもしくはタンパク質であるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、その分析物特異的結合パートナーは、抗体、または抗原に結合する抗体フラグメントである。

１つの実施形態において、上記分析物および／または（一次）分析物特異的結合パートナーに対するこの分析物の結合は、二次分析物特異的結合パートナーを使用して検出される。二次分析物特異的結合パートナーは、核酸またはペプチドもしくはタンパク質であるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、二次分析物特的結合パートナーは、抗体、または抗原に結合する抗体フラグメントである。１つの実施形態において、二次分析物特異的結合パートナーは、一次分析物特異的結合パートナーと同一であり得る。二次分析物特異的結合パートナーは、検出可能な標識に結合体化され得る。

１つの実施形態において、上記（一次）分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーは、ＦＲＥＴフルオロフォア対のメンバーによってそれぞれ標識される（すなわち、一方は、ＦＲＥＴドナーのフルオロフォアによって標識され、そして他方は、ＦＲＥＴアクセプターのフルオロフォアによって標識される）。

別の実施形態において、上記分析物は、直接的に検出可能であり、そして上記分析物特異的結合パートナーに対するこの分析物の結合は、直接検出される。

１つの実施形態において、上記ポリマーの標識パターンは、このポリマーに対する１つ以上の配列特異的プローブの結合パターンである。この１つ以上の配列特異的プローブは、検出可能な標識に結合体化され得る。別の実施形態において、そのポリマーの標識パターンは、このポリマーに組み込まれた検出可能な標識のパターンである。その標識パターンは、代替的に、そのポリマーもしくはそのポリマーに結合したプローブに組み込まれた固有の検出可能な標識またはプローブに結合体化した標識であり得る。

１つの実施形態において、上記方法は、分析物特異的結合パートナーに結合される分析物の量を決定することおよび検量線と比較することによって試料中の分析物濃度を定量化する、工程をさらに包含する。

別の実施形態において、本方法は、分析物に結合したポリマーを回収する工程および／または、必要に応じて、分析物特異的結合パターンを介して、そのポリマーに結合された分析物を分析する工程をさらに包含する。

上記分析物は、核酸、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、毒素、細胞、胞子、細胞のフラグメント、または胞子のフラグメントであるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、上記ポリマーは、このポリマーの標識パターンを決定する前か、または決定する際に伸長される。

別の実施形態において、上記ポリマーの標識パターンは、このポリマーに結合された（一次）分析物特異的結合パートナーの空間的なパターン（または配置）である。

１つの実施形態において、上記ポリマーの標識パターンは、電場を通る集中した流れを使用して決定される。この電場を通る集中した流れはまた、分析物それ自体からであろうと二次分析物特異的結合パートナーからであろうと、分析物特異的なシグナルを検出するのに使用され得る。

別の局面において、本発明は、１つ以上の分析物特異的結合パートナーに結合され、かつ固有の標識を有するポリマーを含有する組成物を提供し、この固有の標識は、１つ以上の組み込まれた検出可能な標識、１つ以上の結合された検出可能な配列特異的プローブ、または１つ以上の結合された検出可能な分析物特異的結合パートナーからなる。上記される実施形態の多くは、当業者に理解されるように、本発明のこの局面に等しく適用する。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書中に、より詳細に記載される。

本発明のそれぞれの限定は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。それゆえ、いずれか１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明のそれぞれの限定は、本発明の各局面に含まれ得ることが予想される。本発明は、以下の説明もしくは図面によって示される構成要素の構造および／または配置の詳細に対するその適用に限定されない。本発明は、他の実施形態およびを許容し、そして種々の手段で実施されても実行されてもよい。

本明細書中で使用される語法および専門用語は、説明の目的のためであり、限定と見なされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、および本明細書におけるそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を含むことを意味する。

図面は、単なる例示であり、本発明の実施可能要件ではない。

（発明の詳細な説明）
本発明は、最も広い意味において、試料から１つ以上の分析物を検出するためのシステムを提供する。本発明は、分析物特異的結合パートナーに結合体化されるポリマーを利用する。検出されるべき各分析物は、固有のバーコードによって同定される、対応するポリマーを有する。そのポリマーの固有のバーコードは、そこに結合される結合パートナーの分析物特異性を示し、したがって分析物の同一性を示す。

本方法は、希少であるかまたは分析物濃度が低い試料中の分析物含量を決定するのに、特に適する。本発明は、１つより多くの物質、そして好ましくは複数の異なる物質が、同時に検出されることを可能し、それによって試料を保全する。換言すれば、本方法は、高度の多重化が可能である。多重化の程度は、特定の適用および検出されるべき分析物の数に依存する。例えば、多重化の程度は、２（すなわち、１回の分析で２つの分析物が検出され得る）、３、４、５、６、７、８、９、１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、またはそれ以上であり得る。

多重化の程度はまた、使用される特定の検出／検索システムのスループット率によって制限されるようである。この検出／検索システムは、単一分子検出システムであり得、そしてより詳しくは、単一分子線形検出システムである。実施例に記載されるシステム（すなわち、ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭ）は、１００の多重化において本明細書中で議論されたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムより１０００倍以上敏感であるようである。この実施例は、このシステムのパラメーターとＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）液体アレイプラットフォームのパラメーターとの詳細な比較を提供する。

本明細書中で使用される場合、ポリマーは、伸長され、結合パートナーに結合体化され、そして固有に標識され得る任意の分子である。したがって、このポリマーは、天然の核酸、アミノ酸、炭水化物、または脂質であり得るが、これらに限定されない。１つの重要な実施形態において、このポリマーは、天然に存在するか否かにかかわらず核酸である。この核酸は、本明細書中に記載される場合、天然に存在しても天然に存在しなくてもよいＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＰＮＡもしくはＬＮＡ、またはそれらの組み合わせ）であり得る。天然に存在しないポリマー（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ））もまた、使用され得る。好ましくは、天然に存在しないポリマー（例えば、合成ＤＮＡ）は、マッピングおよび分析物特異的結合パターンに対する結合体化を制御するために使用される。核酸の回収および単離は、当該分野において習慣的に実施され、そして適切な方法は、標準的な分子生物学の教科書に見出され得る。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ’Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。

上記ポリマーが、この標識が特定の分析物を同定するのに使用されることに起因して、固有に標識されることが重要である。そのポリマーのこの固有の標識パターンは、本明細書中でバーコードと称される。この標識パターンまたはバーコードは、ポリマー上またはポリマー中に存在する１つ以上の検出可能な（そしていくつかの場合においては、固有な）標識であり、この標識は、そのポリマー（ならびに分析物特異的結合パートナーを介して同一の分析物を結合するポリマーと同じ他のポリマー）を固有に同定する。各標識パターンまたは各バーコードは、１つの分析物に関連する。その標識パターンまたはバーコードは、合成の間に、そのポリマーに組み込まれた検出可能な標識の空間的なパターンであり得る。あるいは、それは、１つ以上の配列特異的プローブまたは構造特異的プローブの結合パターンであり得る。そのプローブは、元より検出可能であるか、または検出可能な標識との結合体化によって検出できる。なお別の実施形態において、そのバーコードは、分析物特異的結合パートナーの結合パターンから構成される。これらの結合パートナーは、目的の分析物を検出するのに使用されるパートナーであり得るか、またはそれらは、偏在性の分析物に対して特異的であり得る。この後者の場合において、その偏在性の分析物は、そのそれぞれの結合パートナーに結合し、そして直接的または間接的のいずれかで検出される。いずれの場合においても、そのシグナルは、同じポリマー上の他の分析物特異的結合パートナーのシグナルと区別可能である必要がある。好ましくは、しかし、このコンホメーションが使用される場合、その結合パターンは、二重の機能性を有する：それらは、分析物のセンサーおよびポリマーに対する固有の標識の両方として機能する。このようなコンホメーションは、さらなるポリマーの標識が必要ないので、分析物を検出するのに必要な工程を減少させる。

バーコードを決定する工程が、ポリマーとプローブとを接触させる工程を必要とする場合、このようなプローブは、試料へのポリマーの添加前、添加の際、または添加後に加えられ得る。すなわち、そのポリマーが、それらのそれぞれの分析物に対する分析物特異的結合パートナーの結合前、結合の間、結合後に標識され得る（但し、これらの対のいずれかの結合についての条件は、任意の他の結合相互作用を妨害しない）。

したがって、上記ポリマーはまた、二重の機能性を有する。第１に、ポリマーは、検出される分析物に対する代理マーカーとして機能する。第２に、ポリマーは、分析物特異的結合パートナーのための足場である。各ポリマーは、特定の分析物結合特異性に関連する。したがって、そのバーコードを「読み取る」ことによって、ポリマーの分析物結合性能を決定することが可能である。その後、分析物の存在は、分析物特異的シグナル（例えば、二次分析物特異的結合パートナーに結合体化される検出可能な標識）および固有のポリマーのバーコードの存在に基づいて決定される。本明細書中で議論されるように、二次分析物特異的結合パートナーが、分析物を検出するのに使用される場合において、全ての二次結合パートナーが、同じ検出可能な標識に結合体化されることが可能である。このことは、このような標識が単に、その分析物が、ポリマーのバーコードによって示されることに起因する。この分析物の正確な同一性を示す。このことは、異なる分析物に対して各々が特異的な種々の標識に対する必要性を排除する。

いくつかの実施形態において、上記ポリマーが、柔軟であることが好ましい。これは、ランダムコイルとして通常は存在し、そして検索の間にのみ伸展される核酸（例えば、ＤＮＡ）の場合である。各ポリマーが、プローブまたは検出可能な標識の相対的な空間的配置に基づいて区別され得ることに起因して、検索の間にＤＮＡを伸展する工程は、より高度の多重化を可能にする。しかし、伸展する工程は、プローブまたは分析物特異的結合パートナーのインキュベーションの間に必要とされない。なぜならば、このランダムコイルの小さい大きさが、より速い拡散速度を促し、したがってインキュベーション時間を減少させるからである。このことは、実施例において、より詳細に記載される。

本発明は、コンパクトな非伸長形態にあるポリマーの分析をさらに意図する。このことは、各ポリマーの標識パターンが、プローブまたは検出可能な標識の空間的配置とは関係なく固有に検出される場合に有用であり得る。例えば、それぞれの分析物特異的ポリマーは、固有の標識によって標識されることが可能であり、そしてポリマーの長さにしたがう位置に関係なくその標識の存在が、このポリマー(および結果的に、そこに結合される分析物)を同定するのに使用される。このアプローチは、大規模な多重化を必要としない適用に最も適している。したがって、このアプローチが、線形分析システムも、検索前または検索中のポリマーの伸長も必要としないことが、理解されるべきである。

本明細書中で使用される場合、結合パートナーは、所望のレベルの特異性で分析物に結合する化合物である。一般的に、この特異性は、結合パートナーが、他の化合物よりむしろ、目的の分析物に対して優先的に結合するレベルである。目的の分析物に対するその親和性は、別の化合物に対する親和性の、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上であり得る。最も差異の大きい親和性を有する結合パターンが、ほとんどの実施形態において好まれる。その結合パートナーは、任意の天然物（核酸 (例えば、アプタマー)、ペプチド、炭水化物、脂質などが挙げられるが、これらに限定されない）の結合パートナーであり得る。結合パートナーの一般的な形態は、抗体または抗原に結合する抗体フラグメントである。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよび抗体改変体（例えば、単鎖抗体）が挙げられる。抗体フラグメントは、抗原結合部位を含み、したがってこれとしては、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。核酸ベースの結合パートナー（例えば、オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡベースの分析物またはＲＮＡベースの分析物を認識し、そしてこれに結合するために使用され得る。その核酸ベースの結合パートナーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡまたはＰＮＡであり得るが、これらに限定されない。核酸ベースの結合パートナーは、１つ以上のこれらの要素の組み合わせであり得、そして／または他の核酸模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）を含み得る。

結合パートナーは、一次または二次であり得る。一次結合パートナーは、上記ポリマーに結合される結合パートナーである。二次結合パートナーは、一次結合パートナーに既に結合されている分析物に結合する結合パートナーである。好ましくは、その一次結合パートナーおよび二次結合パートナーは、このような部位がその分析物上に繰り返し存在する限り、分析物上の異なる領域に結合する。換言すると、この一次結合パートナーまたは二次結合パートナーのどちらか一方の結合は、その分析物に対する他方の結合と、有効に競合または妨害するべきではない。使用される場合、両方の結合パートナーが標識され得るが、一般的に、二次分析物特異的結合パートナーのみが、検出可能に標識されることを必要とする。好ましくは、全ての標識された結合パートナーは、シグナルを上昇させるために、そこに結合体化された複数の標識を有する。

いくつかの実施形態おいて、上記分析物が、それ自体検出可能であり、したがって二次結合パートナーを必要としないことが理解されるべきである。

上記試料に上記二次結合パートナーを添加するタイミングは、変動し得る。例えば、二次結合パートナーは、上記ポリマーの添加前、添加の際、または添加後に加えられ得る。

本明細書中で使用される場合、分析物は、本発明にしたがって検出、定量化、または分析される分子または化合物である分析物は、それに対して結合パートナーが利用できる任意の分子であり得る。その最も広範な意味において、その分析物は、任意の分子認識システム（例えば、抗体、アプタマー、炭水化物などであるが、これらに限定されない）を、実質的に使用して検出され得る。その分析物は、天然の有機物であっても無機物であってもよく、そして重要な実施形態において、それらはとしては、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、微生物の毒素）、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）、病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、マイコバクテリアなど）が挙げられる。検出されるべき分析物は、サイズに制限はないが、いくつかの実施形態においては、５００ｎｍ以下の分析物が好ましい。

本発明は、任意の分析物の検出、および必要に応じて同定および／または定量化に適用され得るが、最も好ましくは、この分析物は、他では検出するのにはコストが大きい稀な分析物である。１つのこのような分析物の１つの例は、生物災害的（ｂｉｏｈａｚａｒｄｏｕｓ）な因子または生物戦争の因子である。これらの因子は、天然の生物学的因子であっても天然の化学的因子であってもよい。生物学的な生物戦争の因子は、病原体（その胞子を含む）または毒素として幅広く分類され得る。本明細書中で使用される場合、病原体（その胞子を含む）は、被験体（例えば、ヒト）に侵入し、そして被験体に感染し得る因子である。病原体の例としては、感染因子（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、マイコバクテリアなど）が挙げられる。プリオンもまた、それらがＣＪＤおよび類似の疾患に関する伝染因子と考えられる範囲について、病原体と見なされる。本明細書中で使用される場合、毒素は、被験体において、感染を生じずに、疾患およびしばしば死をもたらす、病原体に由来する因子である。毒素は、病原体に由来し、そしてそれゆえ、このような病原体から回収され得る。あるいは、毒素は、病原体の供給源とは別に合成され得る。生物学的製剤は、最大限に拡散させるために兵器化され得る（すなわち、エアロゾル化）。生物戦争の因子の例としては、ＣＤＣによって列挙されかつ分類された因子が挙げられる。

ＣＤＣ分類Ａの因子としては、炭疽菌（そうでなければ、炭疽として公知である）、ボツリヌス菌およびその毒素（ボツリヌスの原因である因子）、ペスト菌（ペストの原因である因子）、大痘瘡（痘瘡の原因である因子）、野兎病菌（野兎病の原因である因子）、およびウイルス性出血熱を引き起こす因子（例えば、フィロウイルス（エボラウイルスおよびマーブルグウイルス）およびアレナウイルス（例えば、ラッサ熱ウイルス、マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ）ウイルスおよびフニン（Ｊｕｎｉｎ）ウイルス）が挙げられる。

ＣＤＣ分類Ｂの因子としては、ブルセラ症（ブルセラ属）、ウェルシュ菌のε毒素、食品安全性を脅かす因子（例えば、サルモネラ種、Ｅ．ｃｏｌｉおよび赤痢菌属）、鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽（類鼻疽菌）、オウム病（オウム病クラミジア）、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、リシン毒素（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ−トウゴマ由来）、ブドウ球菌のエンテロトキシンＢ、発疹チフス（発疹チフスリケッチア）、ウイルス性脳炎（アルファウイルス、（例えば、ベネズエラウマ脳脊髄炎、東部ウマ脳脊髄炎、西部ウマ脳脊髄炎））、および（水の安全性を脅かす因子例えば、コレラ菌、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。

ＣＤＣ分類Ｃの因子としては、新興感染症（例えば、ニパーウイルスおよびハンタウイルス）が挙げられる。

本発明の方法を使用して検出され得る他の病原体としては、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば、肺炎連鎖球菌）、梅毒；ＳＡＲＳウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、西ナイル熱ウイルス、インフルエンザＡウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルスのようなウイルス；ならびにジアルジア属のような寄生虫が挙げられる。

毒素の例としては、アブリン、リシンおよびストリキニンが挙げられる。毒素のさらなる例としては、ジフテリア菌（ジフテリア）によって産生される毒素、百日咳菌（百日咳）、コレラ菌（コレラ）、炭疽菌（炭疽）、ボツリヌス菌（ボツリヌス中毒症）、破傷風菌（破傷風）、腸出血性大腸菌（出血性下痢および溶血性尿毒症症候群）、黄色ブドウ球菌のα毒素、志賀毒素（ＳＴ）、細胞障害性壊死因子１型（ＣＮＦ１）、Ｅ．ｃｏｌｉの熱安定毒素（ＳＴ）、ボツリヌス毒素、破傷風神経毒素、黄色ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａのアエロリジン、ウェルシュ菌のパーフリンゴリジン（ｐｅｒｆｒｉｎｇｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、Ｅ．ｃｏｌｉのヘモリシン、リステリア菌のリステリオリシンＯ、肺炎連鎖球菌のニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）、化膿連鎖球菌のストレプトリジンＯ、緑膿菌の菌体外毒素Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＬＤＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＡＳＴ、炭疽菌の水腫因子、百日咳菌の皮膚壊死毒素、ボツリヌス菌のＣ２毒素、ボツリヌス菌のＣ３毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ｂが挙げられる。

生物災害因子として使用され得る細菌のさらなる例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐｐ．、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．およびＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｓｐｐ．が挙げられる。

生物災害因子として使用され得るウイルスのさらなる例としては、単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型（脳炎型、新生児型および生殖器型が挙げられる），ヒトパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡およびサル瘡が挙げられる．
生物災害因子として使用され得る真菌のさらなる例としては、カンジダ症、白癬、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、パラコクシジオイドミコーシス、クリプトコッカス症（ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、アスペルギルス症、クロモミコーシス、足菌腫、シュードアレシェリア症、および癜風が挙げられる。

生物災害因子として使用され得る寄生虫のさらなる例としては、原生動物および線虫（例えば、アメーバ症）の両方、クルーズトリパノソーマ、肝蛭症（例えば、Ｆａｃｉｏｌｏａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、リーシュマニア症、マラリア原虫（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、オンコセルカ症、肺吸虫症、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、ニューモシスティス（例えば、ニューモシスティスカリニ）、膣トリコモナス、テニア属、膜様条虫症（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｓｉｓ）（例えば、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｓｉｓ ｎａｎａ）、エキノコックス属、住血吸虫症（例えば、マンソン住血吸虫）、神経嚢虫症、アメリカ鉤虫属、およびＴｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｕｒｉａが挙げられる。

生物災害因子として使用され得る病原体のさらなる例としては、以下が挙げられる：クラミジア属、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｌｅｐｒｏｓｙならびにリケッチア属。

検出され得る化学物質の例としては、ヒ素、ヒ化水素、ベンゼン、びらん剤／発泡剤、血液性物質（ｂｌｏｏｄ ａｇｅｎｔ）、臭素、ブロムベンジルシアニド、塩素、窒息／肺／肺性因子、シアン化物、精製マスタード、フェンタニルおよび他のオピオイド、水銀、マスタードガス、神経性物質（ｎｅｒｖｅ ａｇｅｎｔ）、ナイトロジェンマスタード、有機溶媒、パラコート、ホスゲン、ホスフィン、サリン、セスキマスタード、スチビン、サルファマスタード、ワルファリン、タブンなどが挙げられる。

感染に関する前述の一覧は、網羅的であることは意図されないが、むしろ例示的であることを意図される。

検出可能な分析物の数は、通常異なるシグナル（または標識）の数によって限定されないが、さらに多くの場合、そのポリマー中の分解可能な部位の数によって限定されない。例えば、二次分析物特異的結合パートナーの全ては、この標識が分析物の存在を示すために単純に使用され得、そしてそのバーコードが、その分析物の同一性を決定するために使用されることに起因して、同じ検出可能な標識によって標識される（例えば、ＦＩＴＣフルオロフォアによって全て標識される）。それは、特定の分析物（例えば、分析物１）の存在を示す、特定のバーコード（例えば、バーコード１）とフルオレセインシグナルとの組み合わせである。別のバーコード（例えば、バーコード２）とフルオレセインシグナルとの組み合わせは、別の特定の分析物（例えば、分析物２）の存在を示す。二次分析物特異的結合パートナーについては異なる標識を使用することが望まれ得る一方で、例えば、分析物濃度が決定されるべき場合は、このことは必須ではない。

本方法は、複数の異なる分析物特異的結合パートナーおよび複数のポリマーを使用して、複数の分析物を検出し得る。本明細書中で使用される場合、複数とは、１より多く、そして少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、またはそれ以上であり得る。

分析物の存在および／または量について試験されるべき試料は、本質的に任意の供給源に由来し得、そして検出される分析物に主に依存する。その試料は、体液または身体組織のような被験体由来の生物学的試料であり得る。本明細書中で使用される場合、用語、組織とは局在する細胞集団および散在する細胞集団の両方を指し、これらとしては、脳、心臓、乳房、結腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、腎臓、肝臓、腸、脾臓、胸腺、骨髄、気管および肺が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的流体としては、唾液、精液、血清、血漿、血液、リンパ液および尿が挙げられるが、これらに限定されない。侵襲性の技術および非侵襲性の技術の両方が、このような試料を得るために使用され得、そしてこれらは、当業者に公知である。

あるいは、上記試料は、環境性の試料（例えば、空気の試料または水の試料）であり得る。この後者の実施形態において、その試料は、例えば、本明細書中に引用されるような化学的戦争因子または生物学的戦争因子について検査され得る。この試料が空気の試料である場合、この試料は一般的に、緩衝液のような液体基剤での溶解を必要とする。このことは通常、固体試料の場合でも同じである。

検出される分析物が、その試料が分析前にさらに操作される必要があるか否かを決定し得る。いくつかの実施形態において、それは、結合パートナーと接触する前に、より大きい分析物（例えば、病原体）を破壊することが必要であり得る。破壊は、機械的（吸音的な破壊（例えば、超音波に基づく破壊）を含む）であり得、そしてその程度を変化させて行われ得る。例えば、試料は、細胞壁および／または細胞膜を破裂させ、そして細胞壁のフラグメント、細胞内小器官、タンパク質、脂質、および／またはゲノムＤＮＡを放出させる目的で破壊され得、これらの全ては、分析物であり得る。

検出される分析物の予測される濃度に応じて、この試料は、分析前に希釈されても濃縮されてもよい。希釈は、一般的に、より大きい容量の溶液と試料とを混合する工程を包含する。濃縮は、当該分野で公知である多くの手段（遠心分離、濾過などが挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。濃縮はまた、流れで方向付けられた濃縮方法を使用して達成され得る。

本発明は、試料中の分析物の濃度または絶対量を決定するために使用され得る。この分析物の濃度または量は、ポリマーに結合される分析物に由来するシグナルの量を測定することによって決定される。このシグナルは、元から検出可能な分析物または分析可能に標識された二次分析物特異的結合パートナー由来であり得る。当業者によって理解されるように、各ポリマーは、検出されるべき分析物濃度の幅広い範囲を可能するのに十分な分析物特異的結合パートナーに結合体化される必要がある。換言すれば、分析物特異的結合パートナーの数は、飽和されないために、試料中の分析物の数より多い必要がある。この試験溶液中の分析物濃度が、非常に高い場合は、その試験溶液は、分析物濃度を正確に定量化するために希釈され得る。このシグナルレベルは、試験溶液が分析される前か、または分析と同時に調整される標準的な検量曲線と比較され得る。この標準的な検量曲線は、分析物濃度（ｘ軸）の関数としての、シグナル強度（ｙ軸）のプロットである。当業者は、このような曲線の作成に精通する。

本明細書中に記載される本発明の種々の実施形態は、ＤＮＡであるポリマー、および抗体である一次分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーを具体的に参照する。しかし、これらの記載が単なる例示として意図され、本発明の範囲の限定を意味するものではないことが、理解されるべきである。したがって、任意のポリマーは、本発明の方法に使用され得る。同様に、任意の分析物特異的結合パートナーは、一次分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーのいずれかまたは両方として使用され得る。

したがって、１つの例示的な実施形態において、そのポリマーは、ＤＮＡに対して固有の特定の配列を有するＤＮＡであり、そしてこれは、本明細書中でバーコードと称される。そのＤＮＡは、その分析物を認識し、そして結合する抗体または抗体フラグメント（すなわち、分析物特異的抗体または分析物特異的抗体フラグメント）に結合されている。そのＤＮＡは、例えば、より多い試験溶液から採られた試料（すなわち、試験溶液のアリコート）と一緒にインキュベートされる。インキュベーション時間およびインキュベーション条件は、特定の分析物およびその抗体の結合親和性によって決定される。当業者は、これらのパラメーターを決定し得る。次いで、このＤＮＡ／分析物複合体は、それ自体が、例えば、フルオロフォアまたは放射性同位体によって分析可能に標識された可溶性の二次分析物特異的抗体に曝される。使用されるかまたは利用可能な検出システムの型は、適切である検出可能な標識の型を決定する。試料中の分析物の存在（したがって、試験溶液）は、ＤＮＡ上の分析物特異的に検出可能な標識の存在によって示される。その分析物の同一性は、そのＤＮＡの配列（またはバーコード）によって決定される。

このＤＮＡは、分析物の結合前、結合の間、または結合後に標識され得る。そのＤＮＡは、合成の間に組み込まれた標識されたヌクレオチドを使用して標識されても、１つ以上の標識されたプローブに結合することによって標識されてもよいが、本明細書中で議論されるように、このような標識化はこの点に限定されない。このＤＮＡのバーコードは、１つ以上の空間的に分離した標識からなり得る。

別の例示的な実施形態において、ポリマー（例えば、ＤＮＡ）は、ＤＮＡ中の特定の配列モチーフを認識し、かつそれに結合する検出可能なプローブ（例えば、蛍光性の配列特異的プローブ）に結合される。その分子は、検索され、そしてそのプローブの結合の配置が決定される。図１は、ＤＮＡ（水平線）および特定の結合したプローブ（垂線）を示す。各ＤＮＡは、１つ以上の結合したプローブを有し得る。このＤＮＡにしたがうプローブの結合パターンは、そのＤＮＡを同定し、それゆえその分析物の結合特異性を同定するために使用され得る。

上記ポリマーはまた、分析物特異的結合パートナーによって与えられる分析物特異的結合部位を含み、この結合パートナーは、図１に円で示される。これらの部位は、そのＤＮＡの長さにしたがう任意のコンホメーションまたは配列中に配置され得る。例えば、これらの部位は、ＤＮＡ分子（図１Ａ）に沿って等しく分布されても、複数の集団として集められても（図１Ｂ）、末端に隣接する領域に集中されても（図１Ｃ）、無作為に分散されてもよい。このポリマー上の一次分析物特異的結合パートナーの配置は、ポリマー間で異なるにもかかわらず同一の分析物結合特異性を有する（但し、好ましくはこの分析物特異的結合パートナーはまた、バーコードの基礎として使用されない）ことが理解されるべきである。

分析物特異的結合部位の例は、図２に示される。この例において、モノクローナル抗体（例えば、Ｉｇ_１）は、ＤＮＡに固定される。これは、共有結合（例えば、当業者に公知である多くの可能な技術の１つを使用して）または非共有結合（例えば、ビスＰＮＡ、ビオチン−ストレプトアビジン複合体などを介して）のいずれかで行われ得る。一旦、この抗体が、その対応する抗原（Ａｇ）に遭遇すると、抗体は抗原に結合する。この分析物はまた、その構造中の異なるエピトープに対して特異的な別の抗体Ｉｇ_２を結合する（それによって、いわゆるサンドイッチ−免疫アッセイを形成する）。この二次抗体は、好ましくは検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）によって標識される。

好ましくは、異なる配列（したがって、異なるバーコード）を有するＤＮＡは、そこに結合される異なる一次抗体を有する（図３Ａおよび図３Ｂを比較のこと）。本明細書中に記載されるシステムの１つを使用する分析前に、異なる分析物を含む溶液は、そこに結合される分析物特異的抗体を有するＤＮＡと一緒にインキュベーションされる（図４、左）。その溶液はまた、二次抗体を含み得る。あるいは、それらは、その後の適切なときに添加され得る。好ましくは、この二次抗体は、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）に結合体化される。インキュベーション期間の間に、この一次分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーは、同時または連続的のいずれかでその分析物に結合する。

別の実施形態において、この分析物特異的結合パートナーは、ポリマー長にわたって無作為に分布されるよりもむしろ、特定の決まった位置に結合される（図５）。この例において、一次抗体Ｉｇは、緑色フルオロフォアと結合体化され、そしてそれらの蛍光は、そのバーコードの基礎として使用される。この実施形態において、その分析物特異的結合パートナーは、バーコードを形成し、そして分析物に結合する。

上記試料は、単一ポリマー分析システム（例えば、ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭであるが、これに限定されない）を使用して分析され得る。ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭの微量流体チャンバー中のその試料の動きは、図４に示される。移動する流体中におかれる場合、ＤＮＡは、この微量流体チップ中で伸展され、そして検索チャネル中に移される。一旦、検索チャネルに進入すると、伸展されたＤＮＡは、検索区画（例えば、励起光のスポット）を通過する。いくつかの実施形態において、このスポットの直径は、約０．５μｍであり、したがって１００ｋｂのＤＮＡにつき約３４μｍである伸展されたＤＮＡ長よりずっと小さい。

１つの実施形態において、このＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭプラットフォームは、流れを集束させる設計を伴って使用される（［３］、および例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ＬＸ−１００フローサイトメーター）。この処理は、全ポリマーの検索を提供し、ポリマーの伸展を改善し、そして、より効率的な検出のために励起ビームの中心にその試料を通過させる。したがって、この処理は、シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を増加させ、そして励起の力の分散を最小化する。

このような流動構造を使用して、目的のポリマー（例えば、そのポリマーに結合された目的の分析物を有するポリマー）を濃縮しそして／または向け直す（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）ことが可能である。流動システムにおいて、これは、流れを回収管に向け直すことによって容易に達成される。次いで、回収されたポリマーは、操作され得、そのそれぞれの結合パートナーからこの分析物を解離することができる。その後、遊離形態であろうと結合形態であろうと、この分析物は、より詳細に分析され得る。例えば、その分析物が核酸である場合、これは、ＰＣＲにより分析され得る。

別の実施形態において、１つ以上の一次抗体Ｉｇは、特異的部位に結合される（図６）。結合される抗体の数は、バーコードの形成または検出を妨害するべきではない。例えば、バーコードに寄与する個々の配列部位は、別個の部位として、検出不可能でなくなるほど、相互に接近して配置されるべきではない（すなわち、これらの部位間の距離は、その最小解像距離より大きいべきである）。最小解像距離についての参照は、公開された米国特許出願公開番号第２００３−００５９８２２ Ａｌ号および／またはＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０２５５４０号に対してなされ得る。さらに、バーコードに寄与する各部位の長さは、その検出システムの解像限界を超えるべきではない。例えば、この検索が、１キロベースの解像度（例えば、所定の分析に対する解像限界）で行われる場合、各部位の長さは、０．３４μｍ（すなわち、１ｋｂのＢ形態ＤＮＡの長さ［２］）を超えるべきではない。この配列部位の長さは、例えば、プローブによって結合されたヌクレオチド配列の長さ、または一次分析物特異的結合パートナーによって結合されたポリマー領域の長さとして定義され得る。前述の例において、１ｋｂのＢ形態ＤＮＡ分子は、十分に長い鎖上の少なくとも３０個の抗体に適応し得る。この処理において、強い蛍光シグナルが、達成され得る。

用語「核酸」とは、複合的に結合したヌクレオチド（すなわち、ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））またはプリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）のいずれかである交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含有する分子）をいう。「核酸」および「核酸分子」は、交換可能に使用され、そしてオリゴリボヌクレオチドならびにオリゴデオキシヌクレチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、１つのリン酸を除いたポリヌクレオチド）および核酸を含む任意の他の有機塩基を包含する。この有機塩基としては、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン、シトシン、およびイノシンが挙げられる。この核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、天然の供給源から得られても核酸合成機を使用して合成されてもよい。

核酸を含むポリマーの結合されたユニットに関して本明細書中で使用される場合、「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」または「連結（ｌｉｎｋａｇｅ）」は、任意の物理化学的手段によって互いに連結された２つの実体を意味する。当業者に公知であるあらゆる連結（共有結合または非共有結合）が包含される。例えば、特定の核酸の個々のユニットに対する天然の連結中に通常見出される天然の結合が、最も一般的である。例えば、天然の連結としては、アミド連結、エステル連結、およびチオエステル連結が挙げられる。しかし、本発明の方法によって分析される核酸の個々のユニットは、合成的結合または修飾型の結合によって結合され得る。ユニットが共有結合によって結合される核酸が、最も一般的であるが、水素結合されたユニットを含む核酸もまた、本発明に包含される。核酸に関するあらゆる可能性が、核酸の標的および核酸のプローブに対して等しくあてはまることが理解されるべきである。

いくつかの実施形態において、本発明は、ポリマーおよび／またはプローブのような核酸誘導体を包含する。本明細書中で使用される場合、「核酸誘導体」は、天然に存在しない核酸またはそのユニットである。核酸誘導体は、天然に存在しない要素（例えば、天然に存在しないヌクレオチドおよび天然に存在しない骨格の結合）を含み得る。これらとしては、置換プリンおよび置換ピリミジン（例えば、Ｃ−５プロピン修飾塩基、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、２−チオウラシルおよびプソイドシトシンが挙げられる。他のこのような改変は、当業者に周知である。

この核酸誘導体はまた、置換または修飾（例えば、塩基および／または糖における）を含む。例えば、それらとしては、３’位のヒドロキシル基以外および５’位のリン酸基以外の低分子量の有機基に共有結合される骨格糖を有する核酸が挙げられる。したがって、修飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、修飾された核酸は、リボースのかわりにアラビノースのような糖を含み得る。

この核酸は、骨格組成が不均一であり得、したがって、ペプチド核酸（核酸塩基と結合したアミノ酸を有し、これは本明細書中でより詳細に議論される）のような一緒に結合された核酸ユニットの任意の可能な組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、この核酸は、骨格組成が均一である。

上記ポリマーおよび上記プローブが核酸成分を含む場合、これらは、骨格修飾の使用によって一部安定化され得る。本発明は、本明細書中で議論されるペプチドおよびロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に加えて、他の骨格修飾（例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステル核酸とホスホロチオエート核酸との組み合わせ、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カーバメート、カーボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない）を包含することを意図する。

いくつかの実施形態において、上記ポリマーまたはプローブは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビスＰＮＡクランプ、偽相補的（ｐｓｅｕｄｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＰＮＡロックされた核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの共核酸（ｃｏ−ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（例えば、ＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸）である核酸である。いくつかの場合において、この核酸標的はまた、これらの要素のいずれかによって構成され得る。

ＰＮＡは、グリシンのアミノ窒素およびメチレンカルボニルリンカーを介して核酸塩基に結合される２−アミノエチルグリシン残基によって置換されるＤＮＡのリン酸骨格を有するＤＮＡアナログである。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成によってＤＮＡ標的およびＲＮＡ標的の両方に結合し得、そしてその際およびＤＮＡに基づくプローブまたはＲＮＡに基づくプローブによって可能であるハイブリッドより強いハイブリッドを形成する。

ＰＮＡは、ペプチド結合によって連結されるモノマーから合成される（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１−１９ページ（１９９９））。それらは、標準的な固相ペプチド合成技術を用いて構築され得る。ＰＮＡ化学およびＰＮＡ合成は、ＰＡＮ設計におけるアミノ酸およびポリペプチドの内包を可能にする。例えば、リジン残基は、ＰＮＡ骨格中に正の電荷を導入するのに使用され得る。アミノ酸側鎖の修飾に利用可能なあらゆる化学的アプローチは、ＰＮＡに直接適用可能である。

ＰＮＡは、中性電荷の骨格を有し、そしてこのことは、ＤＮＡに対するＰＮＡの速いハイブリダイゼーション速度を導くのに寄与していると考えられる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１−１９ページ（１９９９））。このハイブリダイゼーション速度は、ＰＮＡ構造（例えば、ＰＮＡ骨格）中に正の電荷を導入することによってか、または正に荷電した側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン）の付加によってさらに上昇され得る。ＰＮＡは、ＤＮＡ分子と安定なハイブリッドを形成し得る。このようなハイブリッドの安定性は、その環境のイオン強度から本質的に独立しており（Ｏｒｕｍ，Ｈ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９（３）：４７２−４８０（１９９５））、最も確からしくはＰＮＡの荷電されない性質に起因する。このことは、インビボまたはインビトロで使用される汎用性を有するＰＮＡを提供する。しかし、正の電荷を含むＰＮＡのハイブリダイゼーションの速度は、イオン強度に依存し、したがって、この速度は、塩の存在下でより低くなる。

ＰＮＡ設計の数種の型が存在し、そしてこれらとしては、一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）、ビスＰＮＡ、および偽相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）が挙げられる。

ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の構造は、特定のＰＮＡおよびその配列に依存する。一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）は、好ましくは逆平行の方向性（すなわち、ｓｓＰＮＡのＮ末端がｓｓＤＮＡの３’末端と整列される）で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に結合し、そしてワトソン−クリック塩基対形成によって一本鎖ＤＮＡに結合する。ＰＮＡはまた、フーグスティーン塩基対形成によってＤＮＡに結合し得、そしてそれによって二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を有する三重鎖を形成する （Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：７９７３（１９９７））。

一本鎖ＰＮＡは、ＰＮＡ分子の最も単純なものである。このＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成を介してハイブリッドの二重鎖を形成する、核酸との相互作用を生じる。この二重鎖は、異なる空間的構造およびｄｓＤＮＡより高い安定性を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１−１９ページ（１９９９））。しかし、異なる濃度比が、使用されそして／または相補的ＤＮＡ鎖の存在下にある場合、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖もまた、形成される（Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：７９７３（１９９７））。二重鎖または三重鎖の形成は、ＰＮＡの配列にさらに依存する。チミン富化のホモピリミジンｓｓＰＮＡは、ｄｓＤＮＡ標的を有するＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖を形成し、ここで一方のＰＮＡ鎖は、ワトソン−クリックの逆平行塩基対形成に関わり、そして他方のＰＮＡは、平行なフーグスティーン塩基対形成に関わる。シトシン富化のホモピリミジンｓｓＰＮＡは、好ましくはフーグスティーン塩基対形成を介してＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖を形成するｄｓＤＮＡに結合する。このｓｓＰＮＡ配列が混合される場合、それは、ｄｓＤＮＡに入り込み、ＤＮＡ鎖を置換し、ワトソン−クリック二重鎖を形成する。ポリプリンのｓｓＰＮＡもまた、逆フーグスティーン塩基対形成によって．三重鎖のＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡを形成する。

ビスＰＮＡは、柔軟性のあるリンカーによって連結された２本の鎖を含む。一方の鎖は、古典的なワトソン−クリック塩基対形成によってＤＮＡとハイブリダイズするように設計され、そして第２の鎖は、フーグスティーン塩基対形成によってハイブリダイズするように設計される。この標的配列は、短いもの（例えば、８ｂｐ）であり得るが、そのビスＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、それが２倍の多さ（例えば、１６ｂｐ）の塩基対全体とのハイブリッドを形成するように、なお安定である。このビスＰＮＡ構造は、それらの結合の特異性をさらに増加させる。例として、１塩基ミスマッチを有するプローブを伴う８ｂｐ部位に対する結合は、合計１６ｂｐよりもむしろ合計１４ｂｐをもたらす。

好ましくは、ビスＰＮＡは、ホモピリミジン配列を有し、そしてさらにより好ましくは、シトシンは、グアノシンに対してフーグスティーン塩基対を形成するように水素化される。したがって、チミンおよびシトシンを有するビスＰＮＡは、６．５を下回るｐＨでＤＮＡのみに対するハイブリダイゼーションが可能である。ホモピリミジン配列のみの第１の制限は、ビスＰＮＡ結合の様式に固有である。プソイドシトシン（Ｊ）は、幅広いｐＨ範囲を通してそのハイブリダイゼーションを可能にするために、フーグスティーン鎖中にシトシンの代わりに使用され得る（Ｋｕｈｎ，Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１３３７−１３４５ １９９９））。

ビスＰＮＡは、核酸に対する結合の複数の様式を有する（Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（１）：６７−７４（２００１））。１つのアイソマーは、１つの代わりに２つのビスＰＮＡ分子を含む。それは、より高いビスＰＮＡ濃度において形成され、そして単一ビスＰＮＡ分子を有する複合体を再構成する傾向を有する。他のアイソマーは、標的ＤＮＡ鎖周辺のリンカーの配置において異なる。全ての同定されたアイソマーは、なお同じ結合部位／標的に結合する。

偽相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）（Ｉｚｖｏｌｓｋｙ，Ｋ．Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０９０８−１０９１３（２０００））は、ｄｓＤＮＡに対して付加された２つの一本鎖ＰＮＡを含む。一方のｐｃＰＮＡ鎖は、標的配列に対して相補的であるが、他方は、置換されたＤＮＡ鎖に相補的である。ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖がより安定である場合、一般的に、置換されたＤＮＡは、ｄｓＤＮＡを復元しない。このＰＮＡ／ＰＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＰＮＡ二重鎖より安定であり、そしてこのＰＮＡ成分は、それらが相補的ＤＮＡ配列に対して設計されることに起因して自己相補的である。したがって、付加されたＰＮＡは、むしろ互いにハイブリダイズし得る。ｐｃＰＮＡユニットの自己ハイブリダイゼーションを防ぐために、修飾塩基が、アデニンの代わりに２，６−ジアミノプリン（Ｄ）およびチミンの代わりに２−チオウラシル（^ＳＵ）を含むｐｃＰＮＡユニットの合成のために使用される。Ｄおよび^ＳＵが、それぞれＴおよびＡとなおハイブリダイゼーション可能である一方で、それらの自己ハイブリダイゼーションは、立体的に障害される。

ロックされた核酸（ＬＮＡ）分子は、ＤＮＡとハイブリッドを形成し、これは、少なくともＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと同程度に安定である（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ら、Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ．８（１）：１−７（２００１））。したがって、ＬＮＡは、まさにＰＮＡ分子のように使用され得る。ＬＮＡ結合の有効性は、ＬＮＡに対して正の電荷を付加することによっていくつかの実施形態において上昇され得る。ＬＮＡは、本質的に、結合親和性を上昇させることが報告されてきた。

市販の核酸合成機および標準的なホスホアミデート化学は、ＬＮＡを作製するのに使用される。したがって、混成ＬＮＡ／ＤＮＡ配列の生成は、混成ＰＮＡ／ペプチド配列の生成と同程度に容易である。ＬＮＡモノマーの安定化効果は、付加的効果ではない。このモノマーは、デオキシヌクレオチド近傍の糖の環のコンホメーションに影響して、それらをより安定な構造に移行する（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１−１９ページ（１９９９））。また、この配列中のより少ない数のＬＮＡ残基は、この合成の精度を劇的に改善する。元来、核酸の結合体化についての生物化学的アプローチのほとんどは、ＬＮＡ／ＤＮＡ構築物に適用可能である。

他の骨格修飾（特にＰＮＡに関する修飾）としては、ペプチドおよびアミノ酸の改変および修飾が挙げられる。したがって、ＰＮＡの骨格構成要素は、ペプチド結合であり得るか、あるいは、それらは非ペプチド結合であり得る。例としては、アセチルキャップ、アミノスペーサー（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸（ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（本明細書中でＯ−リンカーと称される））、アミノ酸（例えば、リジン（正の電荷がＰＮＡ中に所望される場合に特に有用である）などが挙げられる。種々のＰＮＡ修飾は、公知であり、そしてこのような修飾を取り込むプローブは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．のような供給源から市販されている。

本明細書中に記載されるように、標識パターンまたはバーコードを形成する１つの方法は、１つ以上の配列特異的プローブを使用することである。核酸ポリマーに対するプローブの文脈において使用される場合、「配列特異的」は、そのプローブがヌクレオチドまたはその誘導体の特定の線形（または準線形）の配列を認識することを意味する。好ましい実施形態において、そのプローブはそれ自体、核酸要素（例えば、ＤＮＡ要素、ＲＮＡ要素、ＰＮＡ要素およびＬＮＡ要素ならびにそれらの組み合わせ）から構成される（以下に議論される通り）。好ましい実施形態において、この線形配列は、上記プローブ中の対応する相補的ヌクレオチドにそれぞれ結合する連続したヌクレオチドまたはその誘導体を含む。しかし、いくつかの実施形態において、この配列は、プローブ上の対応する相補的残基を有さない１つか、２つか、またはそれ以上のヌクレオチドが存在し得る場合、連続的であり得ない。

ポリマー（例えば、構造特異性または配列特異性を有する核酸）を認識し得る任意の分子は、配列特異的プローブとして使用され得る。ほとんどの場合、このようなプローブは、少なくとも１つの核酸ポリマーを有するワトソン−クリック結合を形成する。他の場合に、この核酸プローブは、核酸ポリマーとフーグスティーン結合を形成し得、それによって三重鎖を形成する。フーグスティーン結合によって結合する核酸プローブは、核酸ポリマーの主溝に進入し、そしてそこに位置する塩基とハイブリダイズする。これらの後者のプローブの例としては、核酸の副溝および主溝を認識し、そしてそこに結合する分子（例えば、抗生物質のいくつかの形態）が挙げられる。いくつかの実施形態において、この核酸プローブは、核酸ポリマーとワトソン−クリック結合およびフーグスティーン結合の両方を形成し得る。例えば、ビスＰＮＡプローブは、核酸に対するワトソン−クリック結合およびフーグスティーン結合の両方が可能である。

そのプローブの長さはまた、結合の特異性を決定し得る。上記プローブと上記核酸 ポリマーとの間の１ミスマッチのエネルギー的損失は、より長い配列に対してよりも、より短い配列に対して比較的高い。したがって、より小さい核酸プローブのハイブリダイゼーションは、より長い核酸プローブのハイブリダイゼーションより特異的である。なぜなら、このより長いプローブは、ミスマッチを含み、そしてさらにその条件に応じてポリマーに対して結合し続け得るからである。しかし、より短いプローブの使用に対する１つの潜在的な制限は、所定の温度および塩濃度におけるそれらの本質的なより低い安定性である。後者の制限を回避するために、ビスＰＮＡプローブは、十分なハイブリッドの安定性を伴って、より短い配列を結合するのに使用され得る。

これらの条件付けにもかかわらず、本発明のこの核酸プローブは、少なくとも４ヌクレオチドから１０００ヌクレオチドを超える範囲の任意の長さであり得る。好ましい実施形態において、このプローブは、５〜１００ヌクレオチド長であり、より好ましくは５ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長の間であり、そしてさらにより好ましくは５〜１２ヌクレオチド長である。各長さおよび全ての長さが本明細書中に明白に引用されたかのように、このプローブの長さは、ヌクレオチド間の任意の長さであり得、そして本明細書中に列挙される範囲を含む。したがって、この長さは、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、もしくは少なくとも２５ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。全てのプローブの残基が、核酸標的中の相補的残基に対してハイブリダイズする必要があるのではないことが理解されるべきである。例えば、プローブは、５０残基の長さであるにもかかわらず、核酸標的に対して２５残基しかハイブリダイズし得ない。好ましくは、ハイブリダイズする残基は、互いに連続的である。

上記プローブは、好ましくは一本鎖であるが、それらは一本鎖に限定されない。例えば、このプローブがビスＰＮＡである場合、それは、ビスＰＮＡクランプの１つの領域が、ポリマーの骨格とフーグスティーン結合を形成し、かつビスＰＮＡクランプの別の領域が、ポリマーのヌクレオチド塩基とワトソン−クリック結合を形成して、三重へリックスコンホメーションをもたらす核酸ポリマーを有する二次構造を採り得る。

この核酸プローブは、この核酸ポリマー内の相補的配列にハイブリダイズする。結合の特異性は、ハイブリダイゼーション条件に基づいて操作され得る。例えば、塩濃度および温度は、その核酸プローブによって認識される配列の範囲を変化させるために調節され得る。当業者は、所望の特異性のための最適条件を決定し得る。

本明細書中に記載されるように、上記ポリマーは、直接標識され得る。例として、ポリマーが核酸である場合、それは、ポリマー配列特異的様式においてそのポリマーに結合する配列特異的プローブの使用を介して標識され得る。この配列特異的プローブは、検出可能な標識（例えば、フルオロフォアまたは放射性同位体）によって標識される。しかし、この核酸はまた、伸長する核酸中にフルオロフォアを直接組み込む様式で合成され得る。例えば、この後者の標識は、化学的手段かまたは、核酸中への活性なアミノ基または活性なチオール基の導入によって達成され得る。（ＰｒｏｕｄｎｉｋｏｖおよびＭｉｒａｂｅｋｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４５３５−４５３２，１９９６）。核酸ポリマーにおいて実施され得る修飾手順の多くの記載は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６（これは本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。

ＤＮＡを化学的に直接標識する、数種の公知である方法が存在する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６；Ｒｏｇｅｔら、１９８９；ＰｒｏｕｄｎｉｋｏｖおよびＭｉｒａｂｅｋｏｖ，１９９６）。この方法の１つは、ＤＮＡの部分的な脱プリン化によるアルデヒド基の導入に基づく。結合したヒドラジン基による蛍光標識は、このアルデヒド基と効率的にカップリングし、そしてこのヒドラジン結合は、ナトリウムによる還元によって約６０％の標識効率で安定化される。過剰なアミンフルオロフォアの存在下における亜硫酸水素塩とシトシンとの反応は、Ｎ４位におけるアミノ基転移を生じる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６）。反応条件（例えば、ｐＨ、アミンフルオロフォア濃度、およびインキュベーション時間ならびに温度）は、生じる生成物の収率に影響する。高濃度の上記アミンフルオロフォア（３Ｍ）では、アミノ基転移は、１００％に達し得る（ＤｒａｐｅｒおよびＧｏｌｄ，１９８０）。

上記の方法に加えて、蛍光標識されたヌクレオチドを使用してデノボ（例えば、自動化核酸合成機の使用）で核酸を合成することが可能である。このようなヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのような供給業者から市販されている。

プローブまたは分析物特異的結合パートナーもまた、（例えば、検出可能な標識を使用して）標識され得る。検出可能な標識は、その存在が直接的または間接的に確認され得る部分である。一般的に、この標識の検出は、例えば、エネルギーの放出のような検出可能なシグナルの形成に関する。この標識は、天然の化学物質、ペプチドまたは核酸であり得るが、これらに限定されない。使用される標識の性質は、種々の要因に依存し、この要因としては、行われる分析の性質、使用されるエネルギー供給源および検出器の型、ならびにポリマー、分析物、プローブならびに一次分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーの型が挙げられる。この標識は、それが結合される構成要素と、立体的かつ化学的に適合し得るべきである。

上記標識は、例えば、特定の波長の電磁気照射を放出しそして／または吸収するその能力によって直接検出され得る。標識は、例えば、それ自身が特定の波長の光を放出し得るかまたは吸収し得る別の部分（例えば、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧエピトープ、酵素タグ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を結合し、補充し、そしていくつかの場合においては切断するその能力によって間接的に検出され得る。一般的に、この検出可能な標識は、直接的に検出可能な標識（例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｐｈａｒ−Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインアミン、エオシン、ダンシル、ウンベリフェロン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），６カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、ｒ−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５，ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラアニラミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ １５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート、エチジウム、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレスカミン、ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタリジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｄａｃｒｏｎ．ＲＴＭ．Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体、テトラメチルローダミン、リボフラビン、ロゾール酸、およびテルビウム錯体の誘導体）、化学発光分子、生物発光分子、色素生産性分子、放射性同位体（例えば、Ｐ^３２またはＨ^３、^１４Ｃ、^１２５Ｉおよび^１３１Ｉ）、電子スピン共鳴分子、（例えば、ニトロキシラジカルのような）、光学密度分子または電子密度分子、電荷を変換する分子または電荷を移動する分子、電磁気的分子（例えば、磁性ビーズもしくは常磁性ビーズまたは磁性粒子もしくは常磁性粒子）、半導体ナノ結晶または半導体ナノ粒子（例えば、米国特許第６，２０７，３９２号に記載され、そしてＱｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される量子ドット）、コロイド性の金属、コロイド金のナノ結晶、核磁気共鳴分子など）からなる群より選択され得る。

上記検出可能な標識はまた、間接的に検出可能な標識（例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、ホタルのルシフェラーゼおよび細菌のルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）のようなルシフェラーゼ；サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）；ＨＲＰのような色素前駆体を酸化するのに過酸化水素を使用する酵素とカップリングするウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、ラクトオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼ）、酵素基質、親和性分子、リガンド、レセプター、ビオチン分子、アビジン分子、ストレプトアビジン分子、抗原（例えば、ＦＬＡＧエピトープまたはＨＡエピトープのようなエピトープタグ）、ハプテン（例えば、ビオチン、ピリドキサール、ジゴキシゲニン、フルオレセインおよびジニトロフェノール）、抗体、抗体フラグメント、マイクロビーズなど）からなる群より選択され得る。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２，ＦｄおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントが挙げられる。

いくつかの実施形態において、一次分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーは、それぞれ、ドナーのフルオロフォアおよびアクセプターのフルオロフォアと結合され、これらはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）対を形成する。この場合において、青色レーザー光は、ドナーのフルオロフォアの蛍光を励起するのに使用される。このドナーによって吸収されるエネルギーの一部は、アクセプターのフルオロフォアがこのドナー分子に対して空間的に十分近い（すなわち、それらの間の距離がＦｏｒｓｔｅｒ半径またはエネルギー転移半径に近いか、またはそれらより小さい必要がある）場合、アクセプターのフルオロフォアに移され得る。一旦、アクセプターのフルオロフォアが、エネルギーを吸収すると、次にそれは、特徴的な発光波長で蛍光を発する。エネルギー転移は、このアクセプターおよびドナーが非常に接近して配置される場合のみ可能であるので、アクセプターの蛍光は、二次分析物特異的結合パートナーが、次に一次分析物特異的結合パートナーに結合される分析物に結合されない場合には起こり得ない。したがってアクセプターの蛍光は、分析物の存在を決定し、そして必要に応じて分析物の濃度を決定するのに使用され得る。

いくつかの場合において、ドナーの蛍光の一部は、検出可能（すなわち、その蛍光がアクセプターのフルオロフォアに全ては転移されない）であり、したがってポリマーのバーコードの基礎として使用され得る。このことは、このバーコードを形成するために、ポリマーの標識を分ける必要性を排除し得る。しかし、本明細書中に記載されるように、これらの実施形態において、一次分析物特異的結合パートナーは、公知であり、したがって無秩序でない様式でこのポリマーに結合体化される必要がある。

一般的に、ＦＲＥＴ単独では、１つだけの励起の供給源（したがって、波長）を必要とし、そして時として１つだけの検出器を必要とする。この検出器は、ドナーのフルオロフォアまたはアクセプターのフルオロフォアの発光スペクトルのいずれかに対して設定され得る。ＦＲＥＴがドナーの蛍光をクエンチすることによって検出される場合、検出器は、ドナーのフルオロフォアの発光スペクトルに設定される。あるいは、ＦＲＥＴがアクセプターの蛍光によって検出される場合、検出器は、アクセプターのフルオロフォアの発光スペクトルに設定される。いくつかの実施形態において、ドナーのフルオロフォアおよびアクセプターのフルオロフォアの両方のＦＲＥＴ発光が検出され得る。さらに他の実施形態において、このドナーは、検出される両方の発光スペクトルの偏光された光および偏光によって励起される。

ＦＲＥＴは、ＦＲＥＴフルオロフォア対の使用を必要とする。ＦＲＥＴフルオロフォア対は、一方が他方の近くに位置される場合に、検出可能なシグナルを生成するかまたは排除するＦＲＥＴを起こし得る２つのフルオロフォアである。ドナーの例としては、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５４６、ＢＯＤＩＰＹ ４９３、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｆｌｕｏｒ（ＦＡＭ）、Ｃｙ３およびＴＭＲ（Ｔａｍｒａ）が挙げられる。アクセプターの例としては、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６４７およびＯｙｓｔｅｒ ６５６が挙げられる。Ｃｙ５は、例えば、Ｃｙ３、ＴＭＲまたはＡｌｅｘａ ５４６と共にドナーとして機能し得る。ＦＲＥＴは、双方から最大で５０〜１００ｎｍの間隔である蛍光を有する任意のフルオロフォア対で可能であるべきである。

好ましい実施形態において、直接検出されるべきである全ての分析物特異的結合パートナーは、多くの同じ検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）と結合体化される。複数の標識は、より強い蛍光シグナル、より大きいシグナル対ノイズ比を生じ、したがって良好な検出をもたらす。

上記ポリマーは、本明細書中で議論されるバーコードの標識に加えて、配列非特異的様式で標識され得る。例えば、このポリマーが核酸（例えば、ＤＮＡ）である場合、その骨格は、骨格標識によって染色され得る。配列非特異的様式で核酸を標識する骨格染色の例としては、フェナントリジンおよびアクリジンのようなインターカレーション色素（例えば、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒトロエチジウム、エチジウムホモダイマー−１およびエチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ならびにＡＣＭＡ）；副溝結合因子（例えば、インドールおよびイミダゾール（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０およびＤＡＰＩ）；および種々の核酸染色因子（例えば、アクリジンオレンジ（インターカレーション可能でもある）、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチルバミジンが挙げられる。前述の核酸染色因子の全ては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．のような供給業者から市販されている。
核酸染色因子のさらに他の例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製の以下の色素が挙げられる：シアン色素（例えば、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５（青色）、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−２５（緑色）、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５（オレンジ色）、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６３（赤色）。

上記核酸ポリマーが非特異的骨格染色によって染色される場合において、上記検出システムは、３つの異なるシグナル（すなわち、骨格に対する１つのシグナル、バーコードまたは標識パターンを形作る配列特異的部位に対する１つのシグナル、および分析物または二次分析物特異的結合パートナーに対する１つのシグナル）を検出し、そして区別し得るべきである。次いで、このようなシステムは、３色の検出および３色の励起を備えるべきである。ＦＲＥＴの構成が、本明細書中に記載されるように使用される場合、励起レーザーおよび／または検出器の数は、減少され得る。

例として、１つの実施形態において、３つの異なるレーザーは、以下の波長における励起のために使用される：４８８ｎｍ（青色）、５３２ｎｍ（緑色），および６３３ｎｍ（赤色）。これらのレーザーは、Ａｌｅｘａ ４８８の蛍光、ＴＭＲ（トリメチルローダミン），およびＴＯＴＯ−３フルオロフォアをそれぞれ励起する。これらの全てのフルオロフォアに由来する蛍光は、独立して検出され得る。蛍光ストラテジーの例として、この配列特異的プローブまたはこのＤＮＡ自体は、Ａｌｅｘａ ４８８フルオロフォアによって標識され得、この二次抗体は、ＴＭＲによって標識され得、そしてこのＤＮＡ骨格は、ＴＯＴＯ−３によって標識され得る。ＴＯＴＯ−３は、長さに比例する様式でＤＮＡを非特異的に染色するインターカレーション色素である。この構成において、Ａｌｅｘａ ４８８蛍光は、バーコードまたは標識パターンを決定するために使用され、ＤＮＡに結合されたＴＭＲ蛍光は、試験溶液中の分析物の存在（したがって、ＤＮＡに結合される）を示し、そしてＴＯＴＯ−３蛍光は、ＤＮＡポリマーの一部または全体を標識することによって、バーコードのシグナルに対する状況を提供し、したがっていくつかの場合、このバーコードの微調整を可能にする。ＴＭＲ蛍光はまた、本明細書中で議論されるように、その溶液中の分析物濃度を定量化するのに使用され得る。使用され得る別の適切な１組のフルオロフォアは、それぞれ４４２ｎｍ，５３２ｎｍおよび６３３ｎｍのレーザーによって励起される、ＰＯＰＯ−１、ＴＭＲおよびＡｌｅｘａ ６４７（またはＣｙ５）の組み合わせである。

本明細書中で使用される場合、「結合体化された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」は、任意の物理化学的手段によって他方に安定して結合される２つの実体を意味する。この接続の性質が、実体全体の有効性を実質的に損なわないものであることが重要である。これらパラメーターを維持することを考慮して、本明細書中の他所で明確に示されない限り、当業者にとって公知である任意の共有結合または非共有結合が企図される。非共有結合体化としては、疎水的相互作用、イオン的相互作用、高親和性の相互作用（例えば、ビオチン−アビジン複合体形成およびビオチン−ストレプトアビジン複合体形成）および他の親和性の相互作用が挙げられる。接続に関するこのような手段および方法は、当業者にとって公知である。結合体化は、当業者にとって一般的な標準的技術を使用して行われ得る。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号および同第３，６４５，０９０号は、抗体に対するフルオロフォアおよび酵素の結合体化を実証する。

本明細書中に記載される種々の成分は、当該分野で公知の機構のいずれかによって、互いに結合体化され得る。例えば、種々の標識と反応性である官能基としては、（官能基：発光する化合物の反応基）活性化エステル：アミンまたはアニリン；アシルアジド：アミンまたはアニリン；アセチルハライド：アミン、アニリン、アルコールまたはフェノール；アシルニトリル：アルコールまたはフェノール；アルデヒド：アミンまたはアニリン；アルキルハライド：アミン、アニリン、アルコール、フェノールまたはチオール；アルキルスルホネート：チオール、アルコールまたはフェノール；無水物：アルコール、フェノール、アミンまたはアニリン；アリールハライド：チオール；アジリジン：チオールまたはチオエーテル；カルボン酸：アミン、アニリン、アルコールまたはアルキルハライド；ジアゾアルカン：カルボン酸；エポキシド：チオール；ハロアセトアミド：チオール；ハロトリアジン：アミン、アニリンまたはフェノール；ヒドラジン：アルデヒドまたはケトン；ヒドロキシアミン：アルデヒドまたはケトン；イミドエステル：アミンまたはアニリン；イソシアネート：アミンまたはアニリン；およびイソチオシアネート：アミンまたはアニリンが挙げられるが、これらに限定されない。
上記一次分析物特異的結合パートナーは、直接的であろうと間接的であろうと、上記ポリマーに結合体化され得、そして上記検出可能な標識は、共有結合的手段または非共有結合的手段によってこのシステムの全ての適切な構成要素に結合体化され得る。リンカーおよび／またはスペーサーは、いくつかの場合において使用され得る。

リンカーは、天然に存在しようと合成であろうと、種々の分子のいずれかであり得、好ましくは不活性である（例えば、ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチド、Ｃ_１〜Ｃ_３０の直鎖状かもしくは分枝状でさえある、飽和炭素鎖または不飽和炭素鎖、リン脂質、アミノ酸および特定のグリシンなど）。さらなるリンカーとしては、アルキルおよびアルケニルのカーボネート、カーバメート、ならびにカルバミドが挙げられる。これらは全て、上記リンカー（例えば、これまで言及されたＣ_１〜Ｃ_３０）に関連し、そしてそれらに極性の官能性を付加し得る。本明細書中で使用される場合、用語リンカーおよびスペーサーは、交換可能に使用される。

広範に種々のスペーサーが使用され得、それらの多くは市販されている（例えば、Ｂｏｓｔｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（現在のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような供給源から）。スペーサは、有機的スペーサに限られず、そしてむしろ無機的でもあり得る（例えば、−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−、またはＯ−Ｐ−Ｏ−）。さらに、それらは、天然において不均一であり得る（例えば、有機元素および無機元素によって構成される）本質的に、適切な大きさの制限を有し、そして種々の成分（例えば、フルオロフォアおよびプローブ）に結合され得る任意の分子が、リンカーとして使用され得る。例としては、Ｅリンカー（可溶性向上因子としても機能する）、Ｅリンカーと類似のＸリンカー、グリコールリンカーであるＯリンカー、および一次芳香族アミノ基を含むＰリンカー（Ｂｏｓｔｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（現在のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって全て供給される）が挙げられる。他の適切なリンカーは、アセチルリンカー、リンカーを含む４−アミノ安息香酸、Ｆｍｏｃリンカー、４−アミノ安息香酸リンカー、８−アミノ−３，６−ジオキサクタン（ｄｉｏｘａｃｔａｎｏｉｃ）酸リンカー、スクシンイミジルマレイミジルメチルシクロヘキサンカルボキシレートリンカー、スクシニルリンカーなどである。適切なリンカーの別の例は、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓらの、１９９６年６月１１日に公報が発行された米国特許第５，５２５，４６５号に記載されるものである。
このスペーサーの長さは、適用および結合体化される成分の性質に応じて変わり得る（例えば、上記ポリマーおよび上記一次分析物特異的結合パートナーならびにポリマー上の標的部位間に供され得る距離）。

本明細書中に記載される結合体化または修飾は、慣習的な化学を利用し、これは、化学分野の当業者にとって公知である。モノ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの使用は、文献（例えば、Ｈｅｒｍａｎ−Ｓｏｎ，１９９６）中に記載され、そして本明細書中では再び記載しない。

上記リンカー分子は、結合体化されるべき分子の性質に依存して、ホモ二官能性架橋剤またはヘテロ二官能性架橋剤であり得る。ホモ二官能性架橋剤は、２つの同じ反応基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤は、連続的な結合体化反応を可能にする異なる反応基を有するものとして定義される。市販される架橋剤の種々の型は、以下の基の１つ以上と反応性である：一級アミン、二級アミン、スルフィドリル、カルボキシル、カルボニルおよび炭水化物。アミン特異的架橋剤の例は、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、ジメチルアジピメート ２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデート（ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）２ＨＣｌ、ジメチルスベルイミデート（ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）２ＨＣｌ、およびエチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシネート］］。スルフィドリル基と反応性の架橋剤としては、ビスマレイミドヘキサン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）］ブタン、１−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン、およびＮ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミドが挙げられる。炭水化物と優位に反応する架橋剤としては、アジドベンゾイルヒドラジンが挙げられる。カルボキシル基と優位に反応する架橋剤としては、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミンが挙げられる。アミンおよびスルフィドリルと反応するヘテロ二官能性架橋剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド］ヘキサノエート、およびスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレートが挙げられる。カルボキシル基およびアミン基と反応性のヘテロ二官能性架橋剤としては、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミドヒドロクロリドが挙げられる。炭水化物およびスルフィドリルと反応するヘテロ二官能性架橋剤としては、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド ２ＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド ２ＨＣｌ、および３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジドが挙げられる。上記架橋剤は、ビス−［β−４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィドおよびグルタルアルデヒドである。

アミン基またはチオール基は、二官能性架橋剤分子に対して結合する点を提供するために合成核酸の任意のヌクレオチドに付加され得る。この核酸は、結合体化適格（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）試薬（例えば、Ｕｎｉ−Ｌｉｎｋ ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、３’−ＤＭＴ−Ｃ６−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ ＣＰＧ、ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ ＩＩ、Ｎ−ＴＦＡ−Ｃ６−ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅおよびＣ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ＣＰＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））を取り込んで合成され得る。
結合体化の非共有結合的方法はまた、例えば、ポリマーに一次分析物特異的結合パートナーを結合するかまたはプローブ、ポリマーまたは分析物特異的結合パートナーに検出可能な標識を結合するために使用され得る。非共有結合体化としては、疎水的相互作用、イオン的相互作用、高親和性の相互作用（例えば、ビオチン−アビジン複合体形成およびビオチン−ストレプトアビジン複合体形成）および他の親和性の相互作用が挙げられる。例として、アビジンのような分子は、核酸に結合され得、そしてその結合パートナーであるビオチンは、一次分析物特異的抗体に結合され得る。

いくつかの場合において、特定の条件下で開裂可能な結合を含むリンカーまたはスペーサーを使用することが所望され得る。例えば、この結合は、通常の生理学的条件下で開裂する結合であっても刺激（例えば、光）の適用によって特異的に開裂され得る結合であってもよく、それによってこの一次分析物特異的結合パートナーは、このポリマーをインタクトなままにして放出される。容易に開裂可能な結合としては、容易に加水分解可能な結合（例えば、エステル結合、アミド結合およびＳｃｈｉｆｆ塩基型の結合）が挙げられる。光によって開裂可能な結合は、当該分野で公知である。

上記ポリマーは、単一分子分析システム（例えば、単一ポリマーの分析システム）を使用して分析され得る。単一分子検出システムは、単一の分子を他の分子から分離して分析し得る。このようなシステムは、線形様式でおよび／または全体としてのいずれかで単一の分子を分析することが可能であり得る。、検出が、主にシグナルの存在または非存在に基づく特定の実施形態において、線形分析は必要とされ得ない。しかし、試料中の分子（好ましくは核酸）を直線的に分析する能力の利益を享受する、本発明に包含される他の実施形態が存在する。これらとしては、その核酸の配列が所望される適用、またはそのポリマーが固有の検出可能な標識よりもむしろ空間的な標識パターンに基づいて区別される適用が挙げられる。

したがって、上記ポリマーは、線形ポリマー分析システムを使用して分析され得る。線形ポリマー分析システムは、ポリマー（例えば、核酸）を線形様式（すなわち、ポリマー上の１つの位置から出発し、その後そこからいずれかの方向に直線的に進行する）で分析するシステムである。ポリマーが分析される場合、ポリマーに結合した検出可能な標識は、連続的様式または同時的様式のいずれかで検出される。同時に検出される場合、このシグナルは通常、標識間の距離が決定され得るポリマーの画像を生じる。連続的に検出される場合、このシグナルは、このポリマーの速度の知識を用いて、次いで、地図に翻訳され得るヒストグラム（シグナル強度 対 時間）で表される。いくつかの実施形態において、このポリマーは、固体支持体に結合されるが、その他は自由流れであることが理解されるべきである。いずれの場合においても、例えば、相互作用ステーション（ｓｔａｔｉｏｎ）または検出器を通過するときのポリマーの速度は、互いおよびこのポリマー上に存在し得る他の検出可能なマーカーに対する標識の位置を決定するのに役立つ。

適切なシステムの例は、ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭ（Ｕ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）である。ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭシステムは、それぞれ１９９８年８月１３日および２０００年２月２４日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３５０１２および同ＷＯ００／０９７５７、および公報が発行された米国特許第６，３５５，４２０ Ｂ１号（２００２年３月１２日に公報が発行された）に記載される。これらの出願および特許の内容、ならびに本明細書中に引用される他の出願および特許、ならびに参考文献の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。このシステムは、単一分子分析システムおよび線形ポリマー分析システムの両方である。それは、例えば、単一の核酸を、線形様式で相互作用ステーションを通過させ、それによってその核酸中のヌクレオチドは、その核酸に結合体化された検出可能な標識が存在するか否かを決定するために個別に検索される。検索は、エネルギー源（例えば、設定波長の光学的照射）に対して上記核酸を曝す工程を包含する。シグナル放出および検出についての機構は、本明細書中に記載されるように、検出が求められる標識の型に依存する。

このシステムは、光学的照射を放出するための光学的供給源；光学的照射を受容し、そして検出可能なシグナルを生成するために光学的照射に曝されるポリマーを受容するための相互作用ステーション；およびこのシグナルを含む検出された放射に基づいてポリマーを分析するために構築されかつ配置されたプロセッサを包含する。

１つの実施形態において、この相互作用ステーションは、限局照射スポットを含む。さらなる実施形態において、このシステムは、限局照射スポットを通過した上記ポリマーを受容し、そして前進させるために構築されるマイクロチャネルをさらに含み、そしてこれは必要に応じて、限局照射スポットを生じ得る。別の実施形態において、このシステムは、偏光器をさらに含み、上記光学的供給源は、照射の光線を放射するように構築されるレーザーを含み、そしてこの偏光器は、光線を偏光するために配置される。レーザー光線が、本質的に偏光される一方で、特定のダイオードレーザーは、偏光器の使用の利益を享受し得る。いくつかの実施形態において、この限局照射スポットは、相互作用ステーション中に配置されるスリットを使用して形成される。このスリットは、１ｎｍ〜５００ｎｍの範囲のスリット幅、または１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲のスリット幅を有し得る。いくつかの実施形態において、この偏光器は、上記光線がこのスリットに到達する前に、その光線を偏光するように配置される。他の実施形態において、この偏光器は、上記スリットの幅と平行に光線を偏光するために配置される。

なお別の実施形態において、上記光学的供給源は、チップ上に一体化された光源である。励起光はまた、外部繊維または組み込まれた光導波路を使用して送達され得る。後者の場合において、このシステムは、上記チップに送達される外部レーザーに由来する二次光源をさらに備え得る。

上記分析はまた、限局照射スポットを形成する既知の波長の光学的照射を生じる工程；マイクロチャネルにポリマーを通過させる工程；この限局照射スポットにてこのポリマーを照射する工程；この限局照射スポットにおける光学的照射とこのポリマーとの相互作用から生じる放射を、連続的に検出する工程；および検出された放射に基づいてこのポリマーを分析する工程を包含し得る。

１つの実施形態において、本方法は、上記マイクロチャネルにポリマーを通過させるために、さらに電界を利用する。別の実施形態において、検出する工程は、ポリマーがこのマイクロチャネルを通過している間の時間にわたってシグナルを収集する工程を包含する。

本明細書中に記載されるシステムは、少なくとも１つの検出システムを含む。このような検出システムの性質は、検出可能な標識の性質に依存する。この検出システムは、当該分野で公知である多くの検出システムのいずれかから選択され得る。これらとしては、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）検出システム、電荷結合素子（ＣＣＤ）検出システム、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムが挙げられ、これらの多くは、電磁気的検出システムである。

ＤＮＡ分子の伸長を包含する他の単一分子核酸の分析方法もまた、本発明の方法において使用され得る。これらとしては、繊維−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ）（Ｂｅｎｓｉｍｏｎ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１８１）：２０９６−２０９８（１９９７））が挙げられる。ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨにおいて、核酸分子は、分子コーミングによって伸長され、そして表面上に固定される。蛍光的に標識されたプローブ配列とのハイブリダイゼーションは、その核酸分子上の配列の目印の決定を可能にする。本方法は、分子の長さおよび／または目印の間の距離が測定され得るように、伸長された分子の固定を必要とする。パルスフィールドゲル電気泳動もまた、この標識された核酸分子を分析するのに使用され得る。パルスフィールドゲル電気泳動は、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ ３７（１）：６７−７５（１９８４）によって記載される。他の核酸分析システムは、Ｏｔｏｂｅ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（２２）：Ｅ１０９（２００１）、２００１年６月１９日に公報が発行されたＢｅｎｓｉｍｏｎ，Ａ．らの米国特許第６，２４８，５３７号、Ｈｅｒｒｉｃｋ，Ｊ．ら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７（６）：４０９：４２３（１９９９），Ｓｃｈｗａｒｔｚの２０００年１１月２１日に公報が発行された米国特許第６，１５０，０８９号および２００１年９月２５日に公報が発行された米国特許第６，２９４，１３６号に記載される。線形ポリマー分析システムもまた、使用され得、そして本発明は、本明細書中に記載されるものだけに制限されることを意図されない。

光学的に検出可能なシグナルが、与えられ、検出され、そしてデータベース中に保存される。このシグナルは、核酸についての構造的情報を決定するために分析され得る。このシグナルは、核酸についての構造的な情報を決定するために、そのシグナルの強度を評価することによって分析され得る。コンピューターは、上記核酸についてのデータを収集するために使用コンピューターと同じであっても、データ解析を担うコンピューターと別個のものであってもよい。本発明の実施形態を実践するのに適切なコンピューターシステムは、代表的に、使用者に対して情報を表示する出力デバイス、出力デバイスに接続されるメインユニットおよび使用者による入力を受容する入力デバイスを備える。一般的に、このメインユニットは、相互接続機構を介して記憶システムに接続されるプロセッサを備える。上記入力デバイスおよび出力デバイスはまた、相互接続機構を介して、上記プロセッサおよび記憶システムに接続される。検出されたシグナルのデータ解析のためのコンピュータープログラムは、ＣＣＤ（電荷結合素子）製造業者から容易に入手可能である。

本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通じて引用される全ての参考文献（参考文献、公報が発行された特許、公開された特許出願、および同時継続中の特許出願）の内容は、本明細書中に参考として明確に援用される。

（実施例１：Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）液体アレイシステムとの比較）
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）液体アレイおよびフローサイトメーターに基づく病原体検出システムを、本発明のシステムと比較する。報告によると、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）は、１００の多重化因子を提供し、１０ｐＭもの低濃度のタンパク質を検出する［１］。報告によると、それは、病原生物（例えば、細菌およびウイルス）を検出するのに使用され得る。報告によると、このシステムは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ＬＸ−１００（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）フローサイトメーターを使用して、１秒間あたり数千個のビーズを検索し得るが、分析時間全体は、ビーズに固定された抗体と分析される溶液中に溶解された抗原との相互作用によって制限される。この時間は、少なくとも３０分間と推定され、そしてより高い感度が必要とされる場合、さらに長くなり得る。

本明細書中に記載されるシステムは、単一の分子ポリマー（例えば、ＤＮＡ）のマッピングを使用する複数の分析物（例えば、病原体であるが、これに限定されない）の同定および定量化のために設計される。それは、基質に対する結合パートナー（例えば、抗体）が利用可能であり得るかまたは生成し得る任意の基質を検出するのに使用され得る。それはまた、他の分子認識システム（例えば、核酸のオリゴヌクレオチドによる認識）を使用し得る。このシステムは有機的分子および生物学的分子（例えば、タンパク質、ペプチド毒素、およびオリゴヌクレオチドならびに病原体（例えば、ウイルス）であるが、これらに限定されない）に適用され得る。

多重化。この提案されるシステムは、無制限の多重化性能を有する。同定可能な分析物の数は、使用される検索システムのスループット速度によってのみ制限される。

多重化の範囲を、解明され得るポリマーの数によって決定する。例えば、１０ｋＨｚの検索周波数および単一のフルオロフォア感受性を有するＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭプラットフォームを使用して、５ｋｂの解像度を達成し得る。特定の配列（および／またはプローブの長さ）、ならびにプローブの検出を単純化するギャップを含むために、その距離の２倍を１つの部位（１つ部位あたり１０ｋｂ）あたりに割り当てると仮定する。伸長された核酸ポリマーは、２００ｋｂ長であると、さらに仮定する。このＤＮＡは、検出に適したＮ＝２０の配列部位を含み得る。したがって、このＤＮＡに対する可能な組み合わせの総数（すなわち、多重化の程度）は、Ｂ＝２^Ｎ＝２^２０＝１０^６である。検出されたＤＮＡ分子の方向性は、解明され得ないと、さらに仮定する（すなわち、所定の読み出しが頭部の最初の構造または尾部の最初の構造を表す場合、それは、わからない）。これは、使用できるような検出されたバーコードの半分のみを与え得る。しかし、このバーコードが、対称性を有する場合、それらは、ＤＮＡの方向性にかかわらず固有に同定可能である。偶数Ｎ（Ｎ＝２Ｍ）に対して２^Ｍ＝２^Ｎ／２の対称的バーコードが存在するかまたは２^Ｍ＋１の奇数Ｎ（Ｎ＝２Ｍ＋１）に対して対称的バーコードが存在する。したがって、偶数Ｎ（Ｎ＝２０）に対して使用可能なバーコードの総数は、

であり、これは、任意の所望される適用に十分であるより総数より多い。
多重化の範囲は、よりよい解像度によってさらに大きくなり得る。ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭプラットフォームはまた、いくつかの場合３ｋｂのレベルの解像度を達成するために使用され得る。上記と同じ分析の後、これは、６ｋｂ長である配列特異的部位を形成し、したがって２００ｋｂのＤＮＡは、３３の部位を含み、そしてバーコードの総数は、Ｂ＝２^３２＝４＊１０^９である。

１０ｋｂの部位を使用し、１００［１］であるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）に基づくシステムと同様の多重化のために、８０ｋｂ長のＤＮＡが、十分である（Ｎ＝８，Ｂ＝１２８）。この長さ（８０ｋｂ）のＤＮＡは、輪郭長Ｌｃ＝８０ｋｂ＊０．３４μｍ／ｋｂ＝２７．２μｍを有する。

実行時間。実行時間は、特に抗原の濃度が低い場合、分析される溶液とプローブとのインキュベーションの時間によって制限される。いくつかの実施形態において、このシステムは、数百ナノメートルのサイズかまたはそれより小さい分析物を検出し、そして定量化するために使用される。これらの後者の場合において、このハイブリダイゼーション速度は、分析物の拡散によって決定される。ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ^ＴＭプラットフォームの検索速度は、このサイズのＤＮＡ分子に対して１秒間あたり約１００であり、そして検索に必要な合計時間は、数分間である。線形性。分析物の高濃度において、ビーズに固定化された抗体とのそれらの相互作用の動力学的速度は、固定支持体上に固定化された一次抗体の顕著な接近に起因して２桁減少し得る［４］。したがって、決められたインキュベーション時間によるプロトコルを使用して、分析物の濃度はその濃度範囲の上限において、低く見積られ得る。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムに存在する一方で、この結果は、そのＤＮＡポリマーの柔軟性に起因して、本明細書中に記載されるシステムには存在しない。

感度。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムは、５．５μｍの直径を有するビーズを使用する。（例えば、回折の限界にて，スポットの大きさが約０．５μｍである）それらが極度に集束した励起光によって検索される場合、結合された二次抗体のほとんどは照らされず、したがってこの分析に含まれない。励起体積が全てのビーズを網羅するために増加される場合、次いで（ａ）より強力なレーザーが、同じ励起強度を確保するために必要とされ、そして（ｂ）そのノイズが、その体積に比例して増加する［５］。さらに、（そのビーズの存在に起因する）このレーザーに完全に曝されないフルオロフォアは、より小さい強度に励起され、そしてそれらの蛍光は、このビーズによる光散乱に起因して、より低い効率で収集される。

本発明のシステムにおいて、このＤＮＡ−分析物複合体は、検索の間に伸展され、そしてその断面は、最も大きい分析物の大きさを超えない。したがって、この検索は、集束したレーザービームによって実行され得、０．５μｍの直径を有する体積を示す。より薄い濃度において、このシグナルは、単一のフルオロフォアによって与えられる。このシグナルが、より小さい強度であるが、それにもかかわらずそれは、後者のシステムにおいて減衰を誘導するビーズに起因して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムの強度より大きいことが予測される。さらに、バックグラウンドノイズＮは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムにおいて、（５．５／０．５）^３＝１．３＊１０^３倍より大きい。したがって、本発明のシステムは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムより少なくとも１０００倍良好な感度、またはＳ／Ｎ比を有する。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムにおけるこれらの不利益は、ビーズの同様の大きさを使用することによって克服できない。

スケーリング：コロイド形態 対 伸展されたコンホメーション。本発明のシステムの重要な特徴は、柔軟なポリマー（すなわち、それは、インキュベーションの間は、小型（例えば、ランダムコイル）形態であり、そして検索の間は、伸展（例えば、直鎖状）形態である）の使用である。多重化は、ポリマーの長さを増加させることによって増加され得る。しかし、この増加の速度は、多重化が、検定力関数、約２^Ｌのように増加する点に起因して制御されるべきである。このポリマーが、２倍長く（例えば、１６０ｋｂおよびＮ＝１６）作製される場合、その後、多重化の程度は、１２８〜１３１，０７２（または１，０２４倍）増加する。ＤＮＡポリマーの長さを倍加する工程は、伸展されたＤＮＡポリマーの断面が、その長さに関して同一であるので、微量流体チップまたは検索システムのパラメーターを変化させない。さらに重要なことには、上記照らされた体積ならびに、それによるノイズおよび感度は、同じままである。同時に、上記コイルの大きさは、（２）^１／２＝１．４倍だけ増加し、そしてこれは、このインキュベーションシステムのパラメーターに特に影響しない。対照的に、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムにおける多重化は、ビーズの体積に比例する。ビーズの直径を１．４倍増加させる（すなわち、ＤＮＡポリマーの長さを倍加する工程に類似する）工程は、この多重化を（１．４）^３＝２．７倍だけ増加し得る。さらに、このことはまた、同時に、同じ要因によってその感度を減少させる。

（参考文献）
１．ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｇａｍｍｏｎ，Ｓ．，Ｐｉｔｅｓｋｙ，Ｍ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊ．，Ｌａｎｇｌｏｉｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｏｌｓｔｏｎ，Ｂ．およびＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎ，Ｋ．Ｓ．、「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第７５巻、１９２４−１９３０ページ
２．Ｓｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．（１９９４）ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）
３．Ｄｉｔｔｒｉｃｈ，Ｐ．およびＰｅｔｒａ，Ｓ．（２００２）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８２，４３ａ
４．ｖａｎ Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１０，２０３−２１８
５．Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．およびＲｉｇｌｅｒ，Ｒ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，５７４０−５７４７

（等価物）
これまでの記載は、特定の実施形態の単なる詳細な記載であることが理解されるべきである。したがって、種々の改変および等価物は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、そして日常的な実験のみによってなされ得ることが、当業者にとって明らかであるべきである。

図１は、バーコード（垂線）、ならびにそこに結合される一次分析物特異的結合パートナーおよび必要に応じて二次分析物特異的結合パートナー（円）を有するポリマー（水平線）を示す。 図２は、核酸であるポリマーに対する、抗体である一次分析物特異的結合パートナーの結合体を示す。この分析物は、抗原（Ａｇ）を指す。この分析物は、また抗体である二次分析物特異的結合パートナーによって、さらに認識される。一次分析物特異的結合パートナーおよび二次分析物特異的結合パートナーは、両方とも標識されるが、大部分の実施形態は、後者の標識をほとんど必要としない。あるいは、分析物がそれ自体、直接的に検出可能（例えば、それが、本質的に蛍光性である）である場合、二次分析物特異的結合パートナーについての必要性は存在しない。 図３は、異なる分析物（パネルＡおよびパネルＢ中の異なる形の物体によって示される）に対する、２つの異なるポリマー（すなわち、垂線によって示される異なるバーコードを有するポリマー）の結合を示す。一次分析物特異的結合パートナーの配置は、同じ分析物を認識するポリマー間で異なり得る。 図４は、小型形態（検索区画に進入するする前）および伸長（または伸展）形態（検索区画にある間）の両方にあるポリマーを示す。 図５は、バーコードの基礎である１つ以上の一次分析物特異的結合パートナーの使用を示す。 図６は、ポリマー上の特定のマッピング部位に結合される一次抗体Ｉｇの形態である、１つ以上の一次分析物特異的結合パートナーを示す。

Claims (19)

1. 試料中の分析物を検出するための方法であって、以下：
   試料と分析物特異的結合パートナーへ結合しているポリマーとを接触させる工程；
   該分析物特異的結合パートナーに対する分析物の結合を検出する工程；および
   該ポリマーの標識パターンを決定する工程；
   を包含し、
   ここで、該ポリマーの該標識パターンは、該分析物の同一性を示す、方法。
2. 前記分析物は、複数個の分析物であり、前記ポリマーは、複数個のポリマーであり、そして前記分析物特異的なパートナーは、複数個の分析物特異的なパートナーである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリマーは、核酸である、請求項１に記載の方法。
4. 前記分析物特異的結合パートナーは、抗体である、請求項１に記載の方法。
5. 前記分析物特異的結合パートナーに対する前記分析物の結合は、二次分析物特異的結合パートナーを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
6. 前記二次分析物特異的結合パートナーは、検出可能な標識に結合体化される、請求項５に記載の方法。
7. 前記分析物特異的結合パートナーおよび前記二次分析物特異的結合パートナーは、ＦＲＥＴ対のメンバーによってそれぞれ標識される、請求項５に記載の方法。
8. 前記分析物は、直接的に検出可能であり、そして前記分析物特異的結合パートナーに対する該分析物の結合は、直接検出される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ポリマーの前記標識パターンは、該ポリマーに対する１つ以上の配列特異的プローブの結合パターンである、請求項１に記載の方法。
10. 前記１つ以上の配列特異的プローブは、検出可能な標識に結合体化される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ポリマーの前記標識パターンは、該ポリマー中に組み込まれる検出可能な標識のパターンである、請求項１に記載の方法。
12. 請求項１に記載の方法であって、分析物特異的結合パートナーに結合される分析物の量を決定することおよび検量線と比較することによって試料中の分析物濃度を定量化する工程をさらに包含する、方法。
13. 請求項１に記載の方法であって、分析物に結合したポリマーを回収する工程をさらに包含する、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記ポリマーに結合された前記分析物を分析する工程をさらに包含する、方法。
15. 前記分析物は、核酸、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、毒素、細胞、胞子、細胞のフラグメント、または胞子のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
16. 前記ポリマーは、該ポリマーの前記標識パターンを決定する前か、または該ポリマーの該標識パターンを決定する際に伸長される、請求項１に記載の方法。
17. 前記ポリマーの前記標識パターンは、分析物特異的結合パートナーのパターンである、請求項１に記載の方法。
18. 前記ポリマーの前記標識パターンは、電場を通る集中した流れを使用して決定される、請求項１に記載の方法。
19. 組成物であって、以下：
    １つ以上の分析物特異的結合パートナーに結合され、かつ固有の標識を有するポリマー；
    を含有する、組成物であって、
    該固有の標識は、１つ以上の組み込まれた検出可能な標識、１つ以上の結合された検出可能な配列特異的プローブ、または１つ以上の結合された検出可能な分析物特異的結合パートナーからなる、組成物。

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