JP5264421B2 - 被験物測定用担体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、これらの免疫化学的方法では、抗体の結合およびその後の洗浄などの煩雑な作業が必要である。
また、バイオセンサーとして用いる際に、製造コストの観点から汎用性の高い製造法が望まれていた。
また本発明は、このような被験物測定用担体を汎用性が高く、リンカー設計することなく効率よく製造することができる製造方法を提供することも目的とするものである。
前記ポリマー層は多糖類であることが好ましい。
前記被験物測定用担体は、バイオセンサーまたはバイオリアクターに用いられる担体として好適である。
前記被験物の除去が、被験物の結合を低下させる条件下で行われることが好ましい。
本発明の担体は、一般的にはBK7等の光学ガラスや、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、インジウムスズ酸化物(ITO)等の金属酸化物、窒化ケイ素、窒化ガリウム、窒化アルミニウム、窒化インジウム等の金属窒化物、インジウムスズ酸化物(ITO)等の金属酸化物、あるいは合成樹脂、具体的にはセファロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリメチル(メタ)クリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーに官能基が付与されたものが望ましい。特にガラスやITO、ポリメチル(メタ)クリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどの光源に対して透明な材料からなるものがより望ましい。官能基としては例えば、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、アルデヒド基、スクシンイミド基、チオール基、ヒドラジン基、イソシアネ−ト基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビニル基、シアン基などを挙げることができる。
これらの官能基を付与する方法は、プラズマ処理、オゾン処理、酸・アルカリによるエッチング処理や自己組織化膜などを用いた公知の表面処理方法を採用することができるが、製造適性の観点からは自己組織化膜を使用することがより好ましい。
担体上には、ポリマー層が結合される。ポリマー層は、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、またはその組み合わせから構成することができるが、親水性ポリマーのみを使用することが好ましい。ポリマー層は担体上に直接結合されても、間接的に結合されていてもよい。直接結合する場合は、例えば、担体からグラフト重合を介してポリマーを結合する方法が挙げられ、間接的に結合する方法としては、担体上に疎水性ポリマーを塗布後、親水性ポリマーを結合させたり、担体、およびポリマーと結合可能な化合物(以下、リンカーと称する)を担体表面に付与した後、ポリマー層を結合させたりしてもよい。特に好ましい態様によれば、リンカーとして自己組織化膜を使用し、ガラス担体上に、自己組織化膜を介して親水性ポリマーを結合させる態様をとることができる。以下、この態様について説明する。
自己組織化膜としては、(1)シランカップリング剤を使用する方法、(2)アルカンチオールを使用する方法、などが挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。
シリカ、窒化ケイ素などの金属酸化物や窒化物あるいはその薄膜を有する基材に対しては、シランカップリング剤により形成されたシランカップリング層を介して結合することもできる。シランカップリング剤として一般式A-1(一般式A-1において、Xaは官能基を示し、Laは直鎖、分岐鎖、環状鎖の炭素鎖を含むリンカー部位を示し、Raは水素、もしくは炭素数1〜6のアルキル基を示し、Yaは加水分解基を示す。また、m,nはそれぞれ0〜3の整数を示しm+n=3とする。)に示すケイ素含有化合物を利用することにより、担体表面に担体(ケイ素)−酸素−ケイ素−炭素といった共有結合を形成させることにより、基材表面を官能基で被覆することができる。
アルカンチオールを使用する方法では、上述した担体に、金属膜が配置され、その後、アルカンチオールが付与される。ここで、担体上に配置されるとは、金属膜が担体上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が担体に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。金属膜を構成する金属としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独または組み合わせて使用することができる。また、上記担体への付着性を考慮して、担体と金属からなる層との間にはクロム等からなる介在層を設けてもよい。
このようなリンカーを使用することで、官能基(Xa)、または官能基(Xb)を表面に有する担体を製造することができる。ここで、リンカーとしては、担体表面に官能基(Xa)、または官能基(Xb)を付与することができる化合物であれば、自己組織化膜でなくともよい。
本発明で用いることができるポリマーとしては、親水性ポリマーを好ましく使用することができ、具体的にはゼラチン、アガロース、キトサン、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、またはこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、または水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはこれらの誘導体などを挙げることができる。
ポリマーとしてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、カルボキシル基を活性化することによって、担体表面に結合することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide(EDC)とN-Hydroxysuccinimide(NHS)により活性化する方法、またはEDC単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する担体と反応させることで、担体上に親水性ポリマーを結合させることが可能となる。
また、好ましくは下記に示される含窒素化合物を用いることもできる。
本発明において、ポリマーとして、カルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、溶液として担体と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて担体上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
本発明において、第1反応体および第2反応体は、被験物と特異的に結合する反応部位を有しており、具体的には、抗体または被験物結合性断片である。本発明で用いる抗体またはその抗原結合性断片は、抗体分子そのものおよび対応する抗原との結合性を有した、Fab断片やF(ab')2断片、また、抗体のL鎖およびH鎖それぞれの可変領域をつないで構築したScFV (single chain Fragment of variable region)等の人工的な一本鎖抗体を含まれる。一本鎖抗体は、大腸菌などの原核細胞や植物細胞などの哺乳動物以外の細胞中でも発現でき、体積が小さいため、蛍光共鳴エネルギー転移が起こりやすくなるため好ましい。また、抗体のL鎖とH鎖をそれぞれ第1反応体もしくは第2反応体の組み合わせとして用いることもできる。なお、ScFVのような一本鎖抗体の作製方法自体は周知である。本発明に用いる抗体またはその抗原結合性断片は、後述する被験物(抗原)との抗原抗体反応による結合性を保持したものであればよく、必ずしも抗原を免疫原として得られる抗体やその抗原結合性断片に限定されるものではない。なお、本発明において用いる抗体は、被検物と抗原抗体反応するものである。
本発明の被験物とは、反応体と特異的に結合するため、抗原であることが好ましい。なお、抗原の種類には、抗体等と相互作用可能なものであれば特に制限はなく、検出物質としての目的に応じて適宜選択することができる。ただし、2つの反応体と結合する必要があるため、反応体との結合部位が2つ以上あることが必要である。
本発明の被験物測定用担体は、バイオセンサーバイオリアクター(例えば「バイオリアクター技術」、1988年、(株)シーエムシー、「バイオチップとバイオセンサー」、2006年、共立出版(株))に適用することができる。バイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化または化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素/基質、酵素/補酵素、抗原/抗体、ホルモン/レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を担体に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
以下に本発明の被験物測定用担体の実施例を示す。
<アミノ基を有する担体の作製>
(担体の洗浄)
UV照射した松浪硝子工業社製のスライドグラスをアセトンに浸漬し、5分間超音波洗浄した。その後、アセトンからスライドグラスを取り出し、純水で洗浄した。
100mlのガラスバイアルにエタノール72mlと純水8mlを混合し、60℃で15分間程度恒温層(アズワン社製)で加温し、エタノールと純水の混合溶液を温めた。温めたエタノールと純水の混合溶液に、APS(γ-アミノプロピルトリエトキシシラン、東京化成工業製)を80μl混合し(0.1% v/v)溶解した。この溶液に、洗浄したスライドグラスを浸漬し、恒温層(アズワン社製)内で60℃ 15分間反応させることで、APS基が付与されたスライドグラスを得た。反応終了後のスライドグラスを取り出し、エタノール:純水=9:1の溶液に浸漬し、取り出す、という工程により洗浄を行った。この洗浄工程を3度行った。洗浄後のスライドグラスを窒素ブローし、120℃で1時間 でベーキングした。ベーキング後のスライドグラスは、エタノール、純水の順に、浸漬洗浄を行った。
超純水に0.5重量%となるようにCMD(カルボキシメチルデキストラン、名糖産業製:分子量100万)を溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の2%が活性化される計算量の0.4MのEDC(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide)および0.1MのNHS(N-Hydroxysuccinimide)混合溶液を加え、室温で5分間攪拌した。
上記アミノ基を形成した金膜上に、活性エステル化したCMD溶液を滴下し30秒後に除去することで、アミノ基を有する担体上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで1回、超純水で1回洗浄した。
Myoglobin 1次抗体1 mg(10-M50c Fitzgerald Industries International社製)をAlexa Fluor(登録商標)555(Molecular Probes社製)を用いて、メーカー推奨処方により標識して1次標識Myoglobin抗体を作製し、抗体Myoglobin2次抗体1mg(10-M50d Fitzgerald Industries International社製)をAlexa Fluor(登録商標)647(Molecular Probes社製)を用いてメーカー推奨処方により標識して2次標識Myoglobin抗体を作製した。
作製した1次標識Myoglobin抗体、2次標識Myoglobin抗体およびMyoglobin(10-M50 Fitzgerald Industries International社製)をモル比 1:1:1で混合し、pH4.5のアセテートバッファー(Biacore社製)で0.1mg/mlに調製した。上記CMD膜にBiacore3000(GEヘルスケア社製)のオプションであるBiacore surface prep unit(μ流路)を用いて、混合物10μlを固定化した。このとき、0.2 M EDC/ 0.04 M NHS:GEヘルスケア製)混合活性化液を70μl用いて、7分間活性化した。その後、PBS(リン酸緩衝生理食塩水:invtrogen社製)、10mM NaOH(和光純薬社製)、pH2.0グリシンバッファー(GEヘルスケア社製)により5回繰り返して洗浄した。
実施例1において、蛍光測定後、さらにpH2.0グリシンバッファー、10mM NaOHで交互に5回繰り返し洗浄した。その後、実施例1と同様に0.1mg/mlのMyoglobin(in PBSバッファー)を添加し、添加前後での発光強度比変化率を求めた。
実施例1の<抗体の固定>において、1次標識Myoglobin抗体、2次標識Myoglobin抗体およびMyoglobinの混合溶液を、1次標識Myoglobin抗体と2次標識Myoglobin抗体のみ(Myoglobinなし)で固定した以外は実施例1と同様にして固定化を行い、実施例1と同様に0.1mg/mlのMyoglobin(in PBSバッファー)を添加し、添加前後での発光強度比変化率を求めた。
さらに、実施例2より、被験物洗浄後も担体に固定化することが可能であることがわかり、繰り返し測定が可能であることがわかる。従って本発明の被験物測定用担体によれば、短時間で高感度かつ簡便に、汎用性の高い固定化担体を提供することができる。
2 反応部位
3 蛍光標識部位
4 第1反応体
5 反応部位
6 認識部位
7 第2反応体
10 結合物
11 担体
12 シランカップリング層
13 ヒドロゲル
Claims (14)
- 被験物と特異的に結合する反応部位および蛍光標識部位を有する第1反応体と、
前記被験物と特異的に結合する反応部位および前記第1反応体の蛍光標識部位から発せられる蛍光を認識する認識部位を有する第2反応体とを有し、
前記第1反応体および前記第2反応体が、前記被験物が存在しないときには前記蛍光が認識されないように前記蛍光標識部位および前記認識部位が離れ、前記第1反応体および前記第2反応体が1つの前記被験物に結合したときに、前記蛍光が認識できるように前記蛍光標識部位および前記認識部位が近接するような位置関係で担体上に固定されていることを特徴とする被験物測定用担体。 - 前記担体上にポリマー層を有し、該ポリマー層を介して前記第1反応体と前記第2反応体とが前記担体上に固定されていることを特徴とする請求項1記載の被験物測定用担体。
- 前記ポリマー層の層厚が1nm以上0.5mm以下であることを特徴とする請求項2記載の被験物測定用担体。
- 前記ポリマー層が自己組織化膜を介して前記担体上に固定されていることを特徴とする請求項2または3記載の被験物測定用担体。
- 前記自己組織化膜の膜厚が0.2nm以上10μm以下であることを特徴とする請求項4記載の被験物測定用担体。
- 前記ポリマー層が多糖類であることを特徴とする請求項3、4または5記載の被験物測定用担体。
- 前記第1反応体および前記第2反応体が抗体または被験物結合性断片であることを特徴とする請求項1〜6いずれか1項記載の被験物測定用担体。
- 前記第1反応体が有する蛍光標識部位が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項1〜7いずれか1項記載の被験物測定用担体。
- 前記第1反応体の蛍光標識部位と前記第2反応体が有する認識部位との間の反応が、蛍光共鳴エネルギー転移であることを特徴とする請求項1〜8いずれか1項記載の被験物測定用担体。
- 前記被験物が抗原であることを特徴とする請求項1〜9いずれか1項記載の被験物測定用担体。
- 前記被験物測定用担体が、バイオセンサーまたはバイオリアクターに用いられる担体であることを特徴とする請求項1〜10いずれか1項記載の被験物測定用担体。
- 被験物と、該被験物と特異的に結合する反応部位および蛍光標識部位を有する第1反応体と、前記被験物と特異的に結合する反応部位および前記第1反応体の蛍光標識部位から発せられる蛍光を認識する認識部位を有する第2反応体とを反応させて、第1反応体と被験物と第2反応体との結合物を得、
該結合物を担体表面に付与して、前記第1反応体および前記第2反応体が、前記被験物が存在しないときには前記蛍光が認識されないように前記蛍光標識部位および前記認識部位が離れ、前記第1反応体および前記第2反応体が1つの前記被験物に結合したときに、前記蛍光が認識できるように前記蛍光標識部位および前記認識部位が近接するような位置関係になるように、前記第1の反応体と前記第2の反応体をそれぞれ前記担体表面に固定化することを特徴とする被験物測定用担体の製造方法。 - 前記第1の反応体と前記第2の反応体をそれぞれ前記担体表面に固定化後、前記結合物から前記被験物を除去することを特徴とする請求項12記載の被験物測定用担体の製造方法。
- 前記被験物の除去が、被験物の結合を低下させる条件下で行われることを特徴とする請求項12または13記載の被験物測定用担体の製造方法。
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