JP5249582B2 - インプリントポリマーおよびその利用 - Google Patents
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Description
本発明に係るインプリントポリマーは、標的タンパク質に可逆的に結合する認識部位を有し、上記認識部位は、金属錯体および基質阻害剤の少なくとも一方を有する。なお、本明細書における文言「可逆的に結合する」は、共有結合以外の結合を意味する。また、金属錯体および基質阻害剤は、標的タンパク質によって適宜変更することができ、特に限定されるものではない。
インプリントポリマーの組成は特に限定されるものではないが、例えばいわゆる機能性モノマーが重合してなるポリマーを主成分として含むものが挙げられる。
本発明のインプリントポリマーは、タンパク質の検出のため、色素修飾モノマーを含んでもよい。具体的な機能性色素としては、メチルオレンジ、メチルレッドなどのアゾベンゼン系、ナフトキノン、アントラキノンなどのキノン系、フェノキサジン、マラカイトグリーンなどのジアリールメタン系およびトリアリールメタン系、フルオレセイン、ローダミンBなどのフルオラン系、インドシアニン、ヘミシアニンなどのシアニン系、テトラフェニルポルフィリン、フタロシアニンなどのポルフィリン・フタロシアニン系、オキサゾリルエチリデンイソプロピリデン無水コハク酸、アリールフルギン酸無水物などのフルギド系、インジゴ、チオインジゴなどのインジゴ系、アントラセン、ピレンなどの縮合環系、テトラチアフルバレン−テトラシアノキノジメタンなどの電荷移動分子系、メタルジチオレン、キノリノール金属錯体などの金属錯体系、スチルベン、スチルバゾールなどのスチリル系、スピロベンゾピラン、スピロオキサジンなどのスピロピラン系、ジフリルエテン、ジチエニルエテンなどのジアリールエテン系、スクアリリウム、クロコニウムなどのスクアリリウム系、ケルセチン、アントシアニンなどのフラボノイド系の機能性色素などがある。
タンパク質を構成するアミノ酸には、金属配位しやすい残基がいくつか含まれている。ヒスチジン、トリプトファン、システインといった残基は非共有電子対をもつアミノ酸残基であり、銅・ニッケルなどの遷移金属などに対して効率的な配位結合を形成する。本発明のインプリントポリマーは、その認識部位に、これら金属原子を含む金属錯体を有する。金属錯体は、金属と、その金属に配位する配位子とからなる。本発明に係るインプリントポリマーの認識部位は、この金属錯体を有するので、金属原子を介してこれらアミノ酸残基を認識し、標的タンパク質を認識することができる。なお、金属錯体とは、配位子と、当該配位子に配位結合する金属とからなるが、本実施の形態においては、「金属錯体」なる文言が、配位子単独である状態(すなわち金属と配位結合していない状態)、および金属を配位した状態の、両方を指すことがある。
本発明において、基質阻害剤とは、標的タンパク質である酵素の基質と同様に、少なくともその一部が標的タンパク質の基質結合部位に特異的に結合可能な構造を有する化合物である。ただし、基質阻害剤は、基質とは異なり酵素の触媒作用を受けないか、または触媒作用を受けてもその反応速度が非常に遅いことが必要である。このような物質としては、標的タンパク質の基質と類似の構造を有する競合阻害剤、および擬基質等が含まれる。これら基質阻害剤は、標的タンパク質との結合の特異性が高い。そのため、インプリントポリマーに、高い標的認識特性を付与することができる。また、触媒作用を受けないか、反応速度が非常に遅いので、標的タンパク質の基質認識部位との結合が安定である。
本発明に係るインプリントポリマーは、上記(1−1)および(1−2)に記載した金属錯体および基質阻害剤の少なくとも一方を機能性モノマーとして含むと共に、これら機能性モノマーと共重合するコモノマーを含んでいてもよい。機能性モノマーとともに共重合させるコモノマーには、上記(1−1)で述べた機能性モノマーを利用することができる。MPC([2-(methacryloyloxy)ethyl]phosphorylcholine)、又はGEMA(Glycosyloxyethyl methacrylate)を添加することにより、非特異的相互作用を低減させる。
本発明に係るインプリントポリマーの製造方法は、標的タンパク質と機能性モノマーとの複合体を形成する複合体形成工程と、上記複合体中の機能性モノマーを重合させる重合工程とを含む。
複合体形成工程は、標的タンパク質と機能性ポリマーとを混合すればよく、その他の条件は、従来のインプリントポリマーの製造方法を好適に利用可能である。
重合反応は、重合開始剤(単に開始剤と称する場合もある)を添加することによって、上記(2−1)の複合体形成工程で形成された複合体中の機能性モノマーを重合する工程である。
鋳型タンパク質の除去は水・緩衝液により行う。これらの溶液により数時間程度洗浄することにより鋳型分子は洗い流される。それでも除去されない場合は、100mMのNaClで5分間洗浄することにより除去される。それでも完全に洗い流されない場合は、EDTAなどのキレート剤を添加し、一度金属を洗い流し、これにより強制的にタンパク質を除去する。この後再度金属を添加し、認識部位を再構築する。
(3−1)アレイチップの構成
本発明に係るアレイチップは、上記<1>欄のインプリントポリマーを異なるタンパク質を鋳型にして製造し、多数備えればよく、他の構成、基板等は特に限定されない。また、基板上への固定方法も特に限定されるものではなく、従来の薄膜形成技術やプロテインアレイにおける技術を適用することができる。
本発明に係るタンパク質の同定方法および精製方法は、上記<1>欄のインプリントポリマーへの吸着特性の違いを利用したものであればよい。この際に異なった錯体、鋳型タンパク質、金属、架橋比で調製したインプリントポリマーのアレイを作製することにより、パターン解析を行うことができる。
タンパク質の認識をリフォールディングに利用することも可能である。すなわち、特定のタンパク質のうち、ある3次構造の状態をとっているタンパク質だけを認識することが可能である。タンパク質は変性状態の時は通常のびた状態をとっており、天然状態では折りたたまれている。この天然状態をインプリントすることにより、天然状態のタンパク質のみを結合することができ、タンパク質の折りたたみを促進することとなる。
再生緩衝液とは、上記で調製したインプリントポリマーを含む緩衝溶液である。例えば、10mg/mLのインプリントポリマー、および50mMのNaClを含みpH7.4のトリス緩衝液等を用いることができる。
変性タンパク質とインプリントポリマーとを接触させる方法としては、インプリントポリマーを固定しない状態で用いるバッチ法、および、インプリントポリマーをカラム等の形状に固定して用いるflow法がある。接触方法としては、標的タンパク質やその他条件に合わせて適宜設定可能である。バッチ法では、タンパク質―ポリマー複合体となるので、数時間のリフォールディングの後、塩やpHなどにより解離させればターゲットタンパク質を回収できる。Flow法においては、天然状態にフォールディングしたタンパク質のみが強く結合するため、折りたたまれずに早く溶出してきたものは再度、変性―リフォールディングを行えばよい。
タンパク質の認識能を落とさずに非共有結合的に固定化する方法として、本発明のインプリントポリマーの製造方法が利用できる。
〔I〕金属錯体を有するインプリントポリマーとその利用
[1]サイクレン修飾スチレンの合成(図6)
金属錯体機能性モノマーの合成を以下の工程で行った。
サイクレン4塩酸塩 500 mgを塩化メチレンに溶解し、トリエチルアミン 5当量存在下、0℃に冷却した後、塩化メチレンに溶解した(Boc)2O 3.0当量をゆっくり添加した。一昼夜室温で攪拌した後、飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで有機相を洗浄した後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hexane:AcOEt = 2:1 → 1:2)で精製した。1H-NMRにより同定を行った。
上記[1−1]で得られたBoc3-cyclen 260mgをアセトニトリル中において、4-vinylbenzyl chloride 1.5当量、炭酸カリウム2当量を添加し、ヨウ化カリウム1当量存在下、65℃で3時間攪拌した。TLCにて原料の消失を確認し、反応終了後そのまま飽和食塩水で3回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒留去の後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hexane:AcOEt = 3 : 2 → 1 : 1)により精製を行った。320 mg、96 %。1H-NMR(CDCl3): δ 7.49 (d, 2H, J = 9.4 Hz, ArH), 7.36 (d, 2H, J = 9.4 Hz, ArH), 6.67 (dd, 1H, J = 12.2, 19.5 Hz, ArCH=CH2), 5.9 (br, 1H, NHCOO), 5.68 (d, 1H, J = 19.5 Hz, ArCH=CH2), , 5.2 (s, 1H, NHCOO), 5.19 (d, 1H, J = 12.2 Hz, ArCH=CH2), 4.30 (br, 1H, NHCH(CO)CH2), 3.6 (m, 2H, CHCH2NH), 1.48 (s, 9H, C(CH3)3), 1.45 (s, 9H, C(CH3)3).
[1−3]Cyclen-Stの合成
上記[1−2]で得られたBoc3-Cyclen-St 300 mgを塩化メチレン 10 mLに溶解した。これにTFA 2 mLを添加し、室温で3時間撹拌した。TLCで反応終了を確認し、溶媒を減圧留去後、エタノール/ジエチルエーテルで再結晶を行った。一次晶 120 mgを減圧乾燥し、目的物Cyclen-St・2TFA塩を得た。1H-NMR(CD3OD): δ 2.8-3.1(m, 8H, CH2of cyclen), d 3.2-3.4 (m, 8H, CH2 of cyclen), 3.83 (s, 2H, AeCH2), 5.25 (d, 1H, J = 12.2 Hz, ArCH=CH2), 5.79 (d, 1H, J = 19.5 Hz, ArCH=CH2), 6.73 (dd, 1H, J = 12.2, 19.5 Hz, ArCH=CH2), 7.33 (d, 2H, J = 8.9 Hz, ArH), 7.46 (d, 1H, J = 8.8 Hz, ArH)
[1−4]Cu[cyclen-St]Cl2の合成
上記[1−3]で得られた1次晶Cyclen-St・2TFA 63.3 mgを水20mLに加えた。さらにこれにNaOHを加え、塩化メチレンで抽出(x2)することにより、TFAの脱塩を行った。有機相を硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒減圧留去、乾燥を行った。得られた油状化合物をエタノール 5 mLに溶解し、これに2mL(水/EtOH = 1/1)に溶解した1当量の塩化銅(II)を滴下した。60℃で1時間撹拌した後、エタノールを減圧留去した。さらに水 5 mLを添加し、凍結乾燥し、深紫色の結晶を得た(収量 35.2 mg)。同様の方法により、Mn・Ni・Co・Zn等の遷移金属においても同様にして錯体を得ることができた。
[2−1]TFA-DAP(TFA)OHの合成
DAP塩酸塩 0.8 gをはかりとり、MeOH 10 mLを添加した。これにトリエチルアミンを5等量添加し、さらにTFA-OEtを5当量添加して一昼夜撹拌した。数時間は白濁したままであったが、その後透明となった。反応終了後、溶媒留去した後に酢酸エチルに溶解し、飽和食塩水・クエン酸水溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒留去し、目的の白色固体(フレーク状化合物)TFA-DAP(TFA)-OHを得た。1.7g, 収率100 %。 1H-NMR(CD3OD): δ4.68-4.73(m, 1H, -CHCH2-), 3.59-3.74, (m, 2H, CHCH2).
[2−2]TFA-DAP(TFA)-Stの合成
上記[2−1]で合成したTFA-DAP(TFA)-OH 150 mg、クロロメチルスチレン1.2当量、ヒドロキシスクシイミド1.5当量を塩化メチレン10 mLに溶解し、これにWSC 1.5当量を加えた。さらにこれにDIEA 3当量を添加し、10時間撹拌した。反応終了後、EtOAcに溶解し、重曹、クエン酸、飽和食塩水により洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルクロマトグラフィー(Hexane:AcOEt = 2 : 1 → 1.5 : 1)により精製を行った。150 mg, 収率73%。1H-NMR(CDCl3): δ 7.19-7.40 (m, 4H, ArH), 6.71 (q, 1H, ArCH), 5.76 (q, 1H, ArCH=CH2), 5.22 (q, 1H, ArCH=CH2), 4.72 (t, 6.8Hz, 1H, CHCH2), 4.40(m, 2H, ArCH2), 3.71 (d, 6.8 Hz, 2H, CHCH2).
[2−3]DAP-Stの合成
上記[2−2]で得られたモノマー100 mgを5mL のMeOHに溶解し、アンモニア水5mLを添加し、室温で48時間撹拌した。反応終了後、減圧留去・真空乾燥を行った。52 mg、収率98 %。1H-NMR(CD3OD): δ 7.22-7.41 (m, 4H, ArH), 6.7-6.8 (m, 1H, ArCH), 5.78 (q, 1H, ArCH=CH2), 5.22 (q, 1H, ArCH=CH2), 4.4 (2H, ArCH2), 3.66(m, 1H, CHCH2), 3.25 (m, 1H, CHCH2), 3.00 (m, 1H, CHCH2).
[2−4]Cu[DAP-St]Cl2の合成
上記[2−3]で得られたDAP-St 30 mgを水 5 mLに溶解し、これにCuCl2水溶液1当量を滴下し、60℃で1時間撹拌することにより、金属錯化を行った。その後、凍結乾燥を行うことにより、目的の銅錯体 Cu[DAP-St]Cl2 を得た。同様の方法により、Mn・Ni・Co・Zn等の遷移金属においても同様にして錯体を得ることができた。
[3−1]3’−又は 2’−UMP の合成(図8)
(化合物2の合成)
ウリジン(図中化合物1として示す。2.7 g, 11 mmol)をギ酸トリメチル7 mlに溶解し、p-トルエンスルホン酸 80 mgを加え、窒素雰囲気下、室温で2時間攪拌した。TLC(5 % MeOH / CH2Cl2)で確認すると、目的物と思われるスポットが確認されたが、5´側へ反応したと思われるスポットも確認された。ここで反応を停止させるために、濃アンモニア水を2滴、滴下した。ここに、50 mlの塩化メチレンを加えて薄め、セライトを補助剤としてろ過した。溶媒を留去し、真空乾燥させると、無色泡状の物質を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(7 % MeOH / CH2Cl2)で精製し、溶媒を留去した後、真空乾燥させると白色粉末を得た。1H-NMR(CDCl3)にて化合物2の生成を確認した。
化合物2(500mg, 1.7 mmol)に4-DMAP 41 mg、塩化メチレン 30 mlを加え、氷冷下、メタンスルフォニルクロリド(450 mg, 3.9 mmol)をゆっくり滴下した。室温で4時間攪拌し、TLCで確認したところ、目的物と思われるスポットが確認されたので、ここで反応を終了させた。食塩水/塩化メチレンで抽出(2回)し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー(7 % MeOH/CH2Cl2)により精製した。溶媒を留去した後、真空乾燥させると白色粉末を得た。1H-NMR(CDCl3)にて化合物3の生成を確認した。生成量400mg、収率64.7%であった。
化合物3(400 mg, 1.1 mmol)を乾燥DMF 15 ml中で、アジ化ナトリウム 230 mg, 3.5 mmolを加え、45℃で22時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去した後、塩化メチレンに溶解させて、飽和食塩水により洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥を行った後、ろ過した。溶媒を留去し、真空乾燥させた後、シリカゲルクロマトグラフィー(2 % MeOH / CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去した後、真空乾燥させると無色油状物質を得た。1H-NMR(CDCl3)にて化合物4の生成を確認した。生成量300 mg, 収率87.3 %であった。
化合物4(300 mg, 0.96 mmol)をメタノール約20 mlに溶解し、パラジウム炭素 150 mgを加え、攪拌しながら水素を投入した。その後、攪拌しながら16時間反応させ、TLC(1 % MeOH / CH2Cl2+アンモニア水1滴)にて反応の終了を確認した。セライトを補助剤としてろ過し、溶媒を減圧留去して真空乾燥を行うと無色油状物質を得た。1H-NMR(CDCl3)にて化合物5の生成を確認した。生成量 220 mg, 収率 80.2 %であった。
化合物5を塩化メチレン中、スチレンカルボン酸 1当量、WSC 1当量、HOBt 1当量、DIEA 1当量を添加し、縮合反応を行った。クエン酸、重曹で洗浄した後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った。
化合物6を 10 %TFA塩化メチレン溶液にて脱保護し、化合物7を得た。
ホスホロアミダイド試薬を1当量、テトラゾール存在下、水酸基と反応させた。酸化剤添加を添加した後、HPLCで精製を行った。2’位と3’位がリン酸化されたスチレン修飾UMP(化合物8)を得た。
上記[1−4]で得られた錯体を用いてインプリントポリマーを製造した。
N, N’-bis(acryloyl)cystamineの5 mMメタノール溶液を作製し、これに金基板を浸漬させることにより重合性官能基であるアクリル酸を基板上に導入した。
リボヌクレアーゼA(0.33 mM)を鋳型タンパク質として用い、上記[1−4]の銅錯体Cu[cyclen-St]Cl2(1.6 mM)とを水中で錯形成させ、1時間放置して会合させた。その後これに、アクリルアミド(1 mM)及び架橋剤メチレンビスアクリルアミド(0.5 mM)を添加した。さらに10 mM Tris緩衝液(pH7.4) を添加し、これにTEMED 1 mLを加えた。得られた溶液に重合開始剤(2,2’-アゾビス[2-メチル-N-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)-2-ヒドロキシエチル]プロピオンアミド)(50 mM)を加えて均一化させた後、すぐにこの溶液を上記[4−1]で得られた金基板上にキャストした。スライドガラスをかぶせてUV照射下1時間重合を行った。重合後、水・MeOHで洗浄し、さらにTris緩衝液で洗浄した。
5 mM Tris緩衝液(pH7.4)を流動層とし、タンパク質濃度を500 mM, 250 mM, 125 mM, 64 mM, 32 mM, 16 mMとして、上記[4−2]のインプリントポリマーのSPRセンサーとしての機能評価を行った。リボヌクレアーゼA・インプリントポリマー(上記[4−2]のインプリントポリマー)では、1.1×105 Mほどの結合親和性が得られた。
上記[4−2]で得られる金基板について、タンパク質との複合化なしに得られるポリマー薄膜を非インプリントポリマーと呼ぶ。これについても同様に調製を行うことができる。上記[4−2]で得られたインプリントポリマーおよび、非インプリントポリマーについて、10 mM Tris緩衝液(pH7.4)を流動層とし、25℃、[リボヌクレアーゼ A] = 0.25 mM の条件で、SPRセンサーとしての機能を比較した。結果を図9に示す。その結果、インプリンティングを行った方がリボヌクレアーゼAに対しては結合能が高いことが分かった。さらに、金属を再度添加しもとの錯体に戻すことにより、結合量を再度もとの状態に戻すことも可能であった(図15)。
リボヌクレアーゼ Aをテンプレートとし、エチレンジアミンを機能性モノマーとして利用し、GEMAを添加モノマーとして合成した薄膜についての相対吸着量を検討したところ、吸着量について約2倍ほどの上昇が見られた。この機能性ポリマーについては、塩基性タンパク質に対して吸着活性の上昇が見られた。
リボヌクレアーゼ Aをテンプレートとし、エチレンジアミンを機能性モノマーとして利用し、GEMAを添加モノマーとして合成した薄膜についての相対吸着量を検討したところ、やはり上記と同様に吸着率の上昇が見られた。この機能性ポリマーについては、ターゲットに対する吸着率の選択性を有した。
リボヌクレアーゼ Aをテンプレートとし、エチレンジアミンを機能性モノマーとして利用し、GEMAを添加モノマーとして合成した薄膜についての相対吸着量を検討したところ、塩強度が上昇するに従って吸着率は低減した。また、GEMAだけではほとんどタンパク質は吸着せず、非特異的吸着の低減に有効であることが分かった。
ビアコア社製CM-5基盤に固定化したリボヌクレアーゼ Aに対するTCPP(Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphine)、及びZn(TCPP)の親和性を検討した。センサーグラムから親和性を検討したところ、pH9において、約30000M−1ほどの結合定数が得られた。
UVスペクトルを用いてリボヌクレアーゼ AとZn(TCPP)との親和性を検討した。滴定曲線から得られたフィッティングから親和性を検討したところ、pH9において、約25000M−1ほどの結合定数が得られた([タンパク質] = [リボヌクレアーゼ A] = 5 mM, トリス緩衝液、pH9)。この結果は[4−8]の結果と一致している。
リボヌクレアーゼ Aをテンプレートとし、ビニル修飾したZn(TCPP)を機能性モノマーとして利用して合成した薄膜についての相対吸着量を検討した。その結果、テンプレートであるリボヌクレアーゼ Aに対する親和性が著しく向上し、目的タンパク質に対するセンサーとして有用であることが分かった。
上記[3]で合成した2’−UMPスチレンを機能性モノマーとして用い、リボヌクレアーゼのインプリンティングを行った。2’−UMPスチレンをモノマーとして用いて検討した結果、固定化することにより、均一系における親和性よりも10倍ほどの結合親和性が得られた。さらに、インプリンティングを行うことにより、飽和結合量と親和性の向上が見られた。
ダンシル修飾銅エチレンジアミン錯体を機能性モノマーとして用い、メチレンビスアクリルアミドを架橋剤、アクリルアミドをコモノマーとしてラジカル重合を行った。テンプレートタンパク質の除去を行った後、蛍光プレートリーダーによる分析を行った。その結果、このインプリントポリマーでは、タンパク質の添加に伴う短波長シフトと蛍光強度の増大が見られた。このことは、本インプリントポリマーのプロテインチップへの応用が可能なことを示している。
鋳型タンパク質であるリボヌクレアーゼAに対して5等量のエチレンジアミン−銅錯体を複合化させた。これと機能性モノマーであるアクリルアミド、及びメチレンビスアクリルアミドを添加した後、複合化していない金属配位を消滅させるためにエチレンジアミンを2等量添加した。これを重合して機能性モノマーを固定化したところ、得られたポリマーはリボヌクレアーゼAに対する高い選択性を得ることができた。
上記で作製したインプリントポリマーを用いた以外は、下記〔II〕の[1−2]と同様の操作を行った。その結果、下記〔II〕の[1−3]と同様に、タンパク質の定量および同定が可能であることが分かった(データ不図示)。
上記で作製したインプリントポリマーを用いた以外は、下記〔II〕の[2]と同様の操作を行った。その結果、下記〔II〕の[2−5]と同様に、リゾチームのリフォールディングが促進された。
[1]インプリントポリマーの作製および評価
[1−1]インプリントポリマーの合成
4種の鋳型タンパク質(リゾチーム(LY)、シトクロムC(CY)、リボヌクレアーゼA(RN)、ラクトアルブミン(LA))、および2種の機能性ポリマー(銅―エチレンジアミン(Cu(en))、銅―サイクレン(Cu(cyc))を組み合わせて、8種のインプリントポリマーLY-Cu(en)IP, LY-Cu(cyc)IP, CY-Cu(en)IP, CY-Cu(cyc)IP, RN-Cu(en)IP, RN-Cu(cyc)IP, LA-Cu(en)IP, LA-Cu(cyc)IP, および2種類の非インプリントポリマー(Cu(en)-NIP, Cu(en)-NIP)を作製した。
1) 4種類のタンパク質混合物を用いた再結合実験
インプリントポリマー、非インプリントポリマーそれぞれ5 mgをバイアル瓶に量り取り、そこへタンパク質溶液(リゾチーム, リボヌクレアーゼA, ミオグロビン, アルブミン, 0.25 mg/mL, 5 mL, in TB (50 mM, pH7.4))を分注し、バイアルを密封し、ローターで攪拌させながら、16時間、15℃の条件でインキュベーションを行った。シリンジフィルター(DISMIC-25CS, ADVANTEC)を用いてポリマーをろ過し、上澄みの濃度をHPLCによって定量し、ポリマーへの鋳型タンパク質の結合量を求めた。
カラム:TSKgel Butyl-NPR 4.6 mm ID×3.5 cm (東ソー)
溶離液;A:0.1 M トリス緩衝液(pH7.0)
B:0.1 M トリスナトリウム緩衝液(pH7.0) + 2.5 M 硫酸アンモニウム
A (100 %)→B (25 %) リニアグラジエント (9 min)
2) シトクロムC、ラクトアルブミンを用いた再結合実験
インプリントポリマーの鋳型として用いた2種類のタンパク質シトクロムC、ラクトアルブミンはタンパク質混合物の中に加えても、先に用いたTSKgel Butyl-NPRによる迅速分離が不可能であったため、これらのサンプルは個別にポリマーと再結合実験を行った。
カラム:TSKgel G-3000SWXL 7.8 mm×30 cm (東ソー)
溶離液;A:0.05 M トリス緩衝液(pH7.0) +0.3 M NaCl
[1−3]結果
図10に、疎水性クロマトグラフィーを用いたタンパク質分離のクロマトグラムを示す。塩濃度リニアグラジエントにより、8分間程度の短時間で4種類のタンパク質が完全に分離されていることがわかる。
[2−1]インプリントポリマーの作製
リゾチームインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーは、上記[1−1]のLY-Cu(en)IP、Cu(en)-NIPとおなじものを合成した。これら2つのポリマーを後述の変性リゾチーム再生実験で用いた。
変性用緩衝液(8M 尿素、1mM EDTA、10mM DTT、0.1mM Tris−HCL、pH8.5)中にリゾチームを10.0 mg/mLの濃度になるように溶解させ、38℃で2.5時間攪拌し、変性を行った。変性後の液を以下、変性液と称する。変性の確認は、下記[2−3]の酵素活性測定によって行い、その活性が2 %以下であることを確認した。
リゾチームの基質 (Micrococcus lysodeikticus(乾燥細胞壁))を50 mM トリス緩衝液(pH 6.2)に0.25 mg/mLになるように懸濁させ、一晩撹拌したものを基質溶液として調製した。この懸濁液3 mLを恒温セル(35℃一定)に取り、リゾチーム溶液(9 μL)を加えて混合し、可視紫外分光光度計を用いて、450 nmにおける吸光度の減少を測定した。吸光度の減少の測定開始時間における傾き(酵素反応の初速度)からリゾチームの酵素活性を求めた。測定するリゾチーム溶液は、活性が濃度に比例する範囲内の濃度になるように50 mM トリス緩衝液で希釈して用いた。なお、懸濁液3 mLとリゾチーム溶液9 μLをセル内で混合した時に1分間に1 Absの吸光度の減少を与える酵素量を1 Uと定義して、リゾチーム濃度とその酵素活性の関係をプロットした検量線を作成した(不図示)。
以下に示す1) および2) の2つの手法を用いて、ポリマーを用いた変性リゾチームの再活性化実験を行った。
変性液3 mLを再生用緩衝液(1.5 M Urea, 3 mM Glutathione reduced form, 5 mM Glutathione oxidized form, 1 mM EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH8.0)27 mLと混合し、10倍に希釈した。希釈溶液は3つの容器にそれぞれ30 mLずつ用意した。
1.5 gのLY-Cu(en)IP、またはCu(en)-NIPをそれぞれ充填した固相合成用チューブに、変性液0.3 mLを注ぎ、これらポリマーにリゾチームを吸着させた。次に、グルタチオンを含まない再生用緩衝液(1.5 M Urea, 1 mM EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH8.0)2.7 mLを3回に分けて、固定相に注いだ。その後、吸着したタンパク質を50 mMクエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で溶出させ、一回目は3 mL, その後は2 mLごとに計15 mLのフラクションを取った。各フラクションの吸光度を測定し、初期量をほぼ100 %回収したことを確認した。
1) batch型の結果 LY-Cu(en)IP、またはCu(en)-NIP
図13にインプリントポリマー添加時におけるリゾチームのリフォールディング率の経時変化を示す。なお、24, 27時間後のリフォールディング率は約90%であり、これは8時間経過の段階とほぼ同様であった。そのため、リフォールディング率は約8時間でほぼ頭打ちになると考えられる。
図14に、上記[2−4]の2) における溶出量と吸光度の関係(クロマトグラム)を示す。図14より、リゾチームの溶出に要する液量はCu(en)-NIPよりもLY- Cu(en)IPのほうが多いことが分かる。これは、インプリントポリマーのほうがリゾチームの保持能が高いためであると考えられる。
2’-CMPをpH5.5の酢酸緩衝液中でリボヌクレアーゼA 300μMに対して1当量添加し、複合化させた。これに銅−サイクレン錯体を5等量添加し、会合させた。これにアクリルアミド3等量、メチレンビスアクリルアミド1.5当量を添加し、ラジカル開始剤過硫酸カリウム、TEMEDを添加し、ラジカル重合を行った。その後pHを7.4として2’−CMPを洗浄により除去し、基質結合部位がブロックされていない固定化リボヌクレアーゼを得た。得られた固定化タンパク質は、2’−CMPを添加せずに固定化したタンパク質と比較すると、もとの活性を失うことなく固定化されていることが分かった。
Claims (13)
- 標的タンパク質に可逆的に結合する認識部位を有したインプリントポリマーであって、
(i)上記標的タンパク質の基質阻害剤を有している機能性モノマーか、
もしくは、
(ii)上記標的タンパク質の基質阻害剤自体が機能性モノマーであって、且つ、上記認識部位とは異なる位置に重合官能基が導入されている機能性モノマーが、
上記機能性モノマーと共重合する2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)又はグリコシルオキシエチルメタクリレート(GEMA)とともに重合してなる重合体であることを特徴とするインプリントポリマー。 - 上記認識部位は、さらに、上記標的タンパク質に結合可能な金属を有する金属錯体を有することを特徴とする請求項1に記載のインプリントポリマー。
- 上記金属錯体は、上記標的タンパク質と結合することによって結合シグナルを発することを特徴とする請求項2に記載のインプリントポリマー。
- 請求項1から3の何れか1項に記載のインプリントポリマーを備えるアレイチップ。
- 請求項1から3の何れか1項に記載のインプリントポリマーに対する結合特性の違いからタンパク質を同定する方法。
- 請求項1から3の何れか1項に記載のインプリントポリマーに対する結合特性の違いからタンパク質を精製する方法。
- 請求項1から3の何れか1項に記載のインプリントポリマーによってタンパク質をリフォールディングする方法。
- 請求項1から3の何れか1項に記載のインプリントポリマーによってタンパク質の折りたたみ状態を判別する方法。
- 標的タンパク質と機能性モノマーとを会合により複合体とする複合体形成工程と、
上記複合体中の機能性モノマーを重合させる重合工程とを含み、
上記機能性モノマーは、
(i)上記標的タンパク質の基質阻害剤を有している機能性モノマーであるか、
もしくは、
(ii)上記標的タンパク質の基質阻害剤自体であって、当該基質阻害剤の上記標的タンパク質に可逆的に結合する認識部位とは異なる位置に重合官能基が導入されている機能性モノマーであり、
上記複合体形成工程および上記重合工程は、上記機能性モノマーと共重合する2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)又はグリコシルオキシエチルメタクリレート(GEMA)の存在下でおこなうことを特徴とするインプリントポリマーの製造方法。 - 上記機能性モノマーは、さらに、標的タンパク質と結合可能な金属に配位する配位子を含むことを特徴とする請求項9に記載のインプリントポリマーの製造方法。
- 上記複合体形成工程によって形成された複合体を単離する単離工程を含み、当該単離工程後に重合工程を行うことを特徴とする請求項10に記載のインプリントポリマーの製造方法。
- 上記複合体形成工程および重合工程の少なくとも一方を行った後に、上記金属に配位可能な配位子によって、タンパク質と相補的な位置から外れた金属をブロックすることを特徴とする請求10または11に記載のインプリントポリマーの製造方法。
- 上記重合工程を行った後、
キレート剤を添加すること、又はpHを変化させることによって上記配位子から金属を脱離させ、その後、上記金属とは異なる金属を配位させることによって、上記インプリントポリマーの機能改変を行う工程を含むことを特徴とする請求項10〜12のいずれか1項に記載のインプリントポリマーの方法。
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