JPH08512323A

JPH08512323A - タンパク精製方法

Info

Publication number: JPH08512323A
Application number: JP7504131A
Authority: JP
Inventors: スミス，トーマス・エム; ワッサーマン−フォレナ，ゲイル
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-06
Publication date: 1996-12-24
Also published as: DE69430016D1; NZ269375A; EP0812200A4; AU7322994A; AU688778B2; US5840858A; CA2166805A1; CN1130353A; WO1995001797A1; EP0812200B1; ATE213639T1; ZA944950B; EP0812200A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、補体レセプタータンパクの精製への固定化金属親和性クロマトグラフィーの適用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク精製方法発明の分野本発明は、タンパク精製方法の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、補体レセプタータンパクの精製方法への固定化金属親和性クロマトグラフィーの適用に関する。発明の背景歴史上、タンパク精製スキームは、精製されるべきタンパクと望まれていないタンパク汚染物との間のサイズ、荷電および溶解度の分子特性の差異に基づいていた。これらのパラメーターに基づくプロトコールとしては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、差動沈殿法（differential pre cipitation）などが挙げられる。ゲル濾過またはゲル透過クロマトグラフィーとして知られているサイズ排除クロマトグラフィーは、移動相における巨大分子の、定常相粒子の孔中への浸透に依存する。差動浸透は、粒子の流体力学的体積の関数である。したがって、理想条件下、大きな分子は、粒子の内部から排除され、一方、小さな分子は、この体積に影響を受けやすく、溶出体積と分子量の対数との間に一次的関係が存在するので、溶出の順序は、タンパクのサイズによって予想することができる。セファウプサラのファルマシア・アクチボラゲット（Ｐharmacia ＡＢ）から商業的にのバイオラッド・ラボラトリーズ（ＢioＲad Ｌaboratories）から商業的に入手可能］などの架橋結合ポリアクリルアミド、または、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）ＨＷ６５Ｓ［日本国東京のトーヨーソーダ・カンパニー（ＴoyoＳoda Ｃo.）から商業的に入手可能］に基づくサイズ排除クロマトグラフィー支持体は、本発明の実施において有用である。沈殿法は、タンパクの粗製混合物において、個々のタンパクの溶解度が幅広く変化すると思われる事実に基づいている。水性媒質中のタンパクの溶解度は、種々の因子に依存するが、これを検討するためには、一般的に、溶媒との相互作用が同一または類似の種類のタンパク分子との相互作用よりも強いならばタンパクは溶解するであろうと言うことができる。それにもかかわらず、沈殿現象を述べている特定の機械論によって結び付けられることを望むことなく、タンパクと水分子との間の相互作用は、いくつかのタイプの非荷電基と水素結合によって、および、荷電基と双極子として静電気的に生じ、一価の陽イオンの塩（例えば、硫酸アンモニウム）などの沈殿剤は、水分子に対してタンパクと競争し、かくして、高い塩濃度では、タンパクが「脱水」状態となり、水性環境との相互作用を低下させ、類似のタンパクとの凝集を増大させて、培地からの沈殿を生じさせると思われる。イオン交換クロマトグラフィーは、試料中の荷電官能基の、吸着剤表面上の反対の電荷を有するイオン性官能基との相互作用を含む。２つの一般的なタイプの相互作用が知られている。陰イオン交換クロマトグラフィーは、正に荷電した表面と相互作用する負に荷電されたアミノ酸側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）によって媒介され、陽イオン交換クロマトグラフィーは、負に荷電された表面と相互作用する正に荷電されたアミノ酸残基（例えば、リシンおよびアルギニン）によって媒介された。さらに最近、より慣用的なサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィープロトコールを補足するために、親和性クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーが開発された。親和性クロマトグラフィーは、タンパクと固定化リガンドとの相互作用に依存する。該リガンドは、関心のある特定のタンパクに対して特異的であってよく、この場合、リガンドは、基質、基質類似体、阻害剤または抗体である。別に、リガンドは、多くのタンパクと反応することができる。アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、ニコチンアデノシンジヌクレオチドまたはある種の染料などの一般的なリガンドは、特定のクラスのタンパクを回収するために使用される。親和性クロマトグラフィー法の最小バイオスペシフィックの１つは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、金属キレートクロマトグラフィーとも称される。ポラス（Ｐorath）ら［ネイチャー（Ｎature）２５８：５９８−９９(１９７５)］によって紹介されたＩＭＡＣは、金属を固体支持体にキレート化し、次いで、分離されるべきタンパクの表面上で電子供与体アミノ酸残基と錯体を形成することを含む。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、最初に、タンパクが、炭化水素スペーサーアームからなるが親和性リガンドを欠いている親和性ゲル上に保持されていることの観察に続いて開発された。この技術分野では、疎水性クロマトグラフィーなる用語がしばしば使用されるが、クロマトグラフィー法では疎水性である溶質とゲルとの間の相互作用であるので、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）なる用語が好ましい。疎水性相互作用は、高いイオン強度で最も強く、したがって、この形態の分離は、塩沈殿法またはイオン交換法に続いて行われるのが好都合である。ＨＩＣ支持体からの溶出は、溶媒、ｐＨ、イオン強度の変更によって、または、カオトロピック剤（chaotropi cagent）またはエチレングリコールなどの有機改質剤の添加によって行うことができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーの一般的な原理の説明は、Ｕ.Ｓ.Ｐ３,９１７,５２７およびＵ.Ｓ .Ｐ４,０００,０９８に見ることができる。特異的なタンパクの精製へのＨＩＣの適用は、以下の文献によって例示されている：ヒト成長ホルモン(Ｕ.Ｓ.Ｐ４ ,３３２，７１７)、毒素コンジュゲート(Ｕ.Ｓ.Ｐ４,７７１,１２８)、抗溶血性因子(Ｕ.Ｓ.Ｐ４,７４３,６８０)、腫瘍壊死因子(Ｕ.Ｓ.Ｐ４,８９４,４３９)、インターロイキン−２(Ｕ.Ｓ.Ｐ４,９０８,４３４)、ヒトリンホトキシン（Ｕ.Ｓ.Ｐ４,９２０,１９６）およびリゾチーム種（ファウスナッフ，ジェイ・エル（Ｆausnaugh,Ｊ.Ｌ.）およびエフ・イー・リニヤー(Ｆ.Ｅ.Ｇegnier)、Ｊ.Ｃhromatog.、３５９：１３１−１４６（１９８６）。本発明は、補体レセプター分子および補体レセプター様分子の精製へのイオン交換、ＩＭＡＣ、ＨＩＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせの適用に関する。発明の簡単な説明本発明は、連続的に、補体レセプタータンパクを含有する混合物を、陽イオンクロマトグラフィー支持体、金属親和性クロマトグラフィー支持体、サイズ排除クロマトグラフィー支持体と接触させ、各支持体から該タンパクを選択的に溶離させることからなることを特徴とする、補体レセプタータンパクを含有する混合物からの補体レセプタータンパクの精製方法に関する。別の態様では、本発明は、連続的に、補体レセプタータンパクを含有する調整細胞培養培地を、（ａ）第１の陽イオン交換クロマトグラフィー、（ｂ）固定化金属親和性クロマトグラフィー、（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｅ）サイズ排除クロマトグラフィーに付すことからなることを特徴とする、補体レセプタータンパクを含有する調整細胞培養培地からの補体レセプタータンパクの精製方法を提供するものである。別の態様では、本発明は、（ａ）調整細胞培地を濃縮し、（ｂ）陽イオンクロマトグラフィー支持体に補体レセプタータンパクを吸着させ、（ｃ）吸着したタンパクを少なくとも１種類の緩衝液で洗浄し、（ｄ）洗浄したタンパクを固定化金属親和性クロマトグラフィー支持体に溶出させ、（ｅ）工程からの溶出したタンパクを吸着させ、（ｆ）吸着したタンパクを少なくとも１つの緩衝液で洗浄し、（ｇ）洗浄したタンパクを溶離し、（ｈ）工程（ｇ）からの溶出したタンパクを疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体に吸着させ、（ｉ）該タンパクを選択的に溶出させ、（ｊ）工程（ｈ）からの溶出液を陰イオン交換支持体に吸着させ、（ｋ）吸着したタンパクを溶出させ、（ｌ）工程（ｋ）からの溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに付し、次いで、（ｍ）それらからタンパクを回収することからなることを特徴とする、調整細胞培地からの補体レセプタータンパクの精製方法を提供するものである。発明の詳細な説明本発明は、大規模な補体レセプタータンパク精製への適用を有するタンパク精製方法に関する。本発明は、タンパク純度＞９５％のレセプタータンパクの回収を可能にするので特に有用である。本発明は、多量の補体レセプタータンパクおよび補体レセプター様タンパクの精製に適用される。補体は、制限されたタンパク分解によって連続的に活性化される血清タンパクのグループであり、体液性免疫の重要なエフェクターである。補体の活性化は、初期に作用する補体成分と抗原／抗体複合体との相互作用によって生じる。この活性化により得られるタンパク分解フラグメントは、単独でまたは他のタンパクと一緒に、別の補体タンパクを活性化して、血液凝固因子の官能化を暗示するタンパク分解性カスケードを生じる。別法としては、補体は、細菌細胞壁成分、タンパク分解酵素（例えば、プラスミン）または複合炭水化物（例えば、インスリン）によって活性することができる。多くの生物活性は、補体系の成分によって媒介される(例えば、免疫細胞溶解、アナフィラトキシン産生、溶菌作用、化学走性、溶血反応、オプソニン作用、および食菌作用)。４つのクラスの補体レセプター（ＣＲ）が知られている（ＣＲ１〜ＣＲ４）。補体レセプター１（ＣＲ１）は、補体成分Ｃ３ｂおよびＣ４ｂについてのレセプターである。補体レセプター２（ＣＲ２）は、成分Ｃ３ｄｇまたはＣ３ｄについてのレセプターである。補体レセプター３（ＣＲ３）は、Ｃ３ｂｉについてのレセプターである。補体レセプター４（ＣＲ４）は、Ｃ３ｄｇについてのレセプターである。補体レセプター１（ＣＲ１）は、赤血球、単球／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、いくつかのＴ細胞、脾濾胞性樹状細胞、および糸球体有足細胞の膜上にある。ＣＲ１は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂを結合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプターと称される。その主な配列は、決定されている［クリックシュタイン（Ｋlickstein）ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１６５：１０９５−１１１２(１９８７)、クリックシュタインら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１６８：１６９９−１７１７(１９８８)；アウアケード（Ｈourcade）ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１６８：１２５５−１２７０(１９８８)] 。６０〜７０個のアミノ酸を含有する３０個の短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）からなり、ＳＣＲ当たり平均６５個のアミノ酸のうち２９個が保存されている。各ＳＣＲが、ジスルフィド連結基を介して、ジスルフィド結合において第３と第１および第４と第２の半分のシスチンと三次元の三重ループ構造を形成することが提案されている。ＳＣＲは、さらに、７個のＳＣＲの４個の長い相同性リピート（ＬＨＲ）中に組織化される。リーダー配列に続いて、該分子は、Ｃ４ｂ結合ドメインからなる最もＮ−末端のＬＨＲ−Ａ、Ｃ３ｂ結合ドメインからなる次の２つのリピート、ＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−Ｃ、ならびに、最もＣ末端のＬＨＲ−Ｄ、次いで、２つのさらなるＳＣＲ、２５残基推定膜内外領域および４３残基細胞質テールからなる。ＣＲ１は、ＳＣＲホモロジーによって特徴付けられた上科（superfamily）の一員である。この上科は、ＣＲ２、Ｃ４ｂｐ、Ｈ因子、Ｂ因子、およびＣ２などのＣ３／Ｃ４結合機能も有するメンバー、ならびに、インターロイキン−２レセプター、ｂ２−糖タンパクＩ、Ｃ１ｒ、ハプトグロビンａ鎖およびＸＩＩＩｂ因子などのこの機能を有しないタンパクをも含む。ＣＲ１は、糖タンパクであることが知られており、その論理的に推論されたアミノ酸配列は、細胞外領域においてＮ−結合オリゴ糖についての２４個の有効な部位を有する。しかしながら、ツニカミシン（tunicamycin）の存在下でのＣＲ１の合成［ラブリン（Ｌublin）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、２６１：５７３６(１９８６)］およびグルコサミン含量の分析［シム(Ｓim)、バイオケミカル・ジャーナル(Ｂiochem.Ｊ.)、２３２：８８３(１９８５)］は、利用可能な部位の６〜８個だけが実際にオリゴ糖に結合することを示した。糖タンパクのＮ−末端は、ブロックされていると思われる。３０〜５０kＤ増加によってサイズが異なる４種類のＣＲ１アロタイプが存在する。これらの対立遺伝子多型性（アロタイプ）の遺伝子頻度は、ヒトの個体群において異なる[ホラー（Ｈoler）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc i.，ＵＳＡ)８４：２４５９−２４６３（１９８７）]。Ｆ（またはＡ）アロタイプは、４つのＬＨＲからなり、約２５０kＤである；大きなＳ（またはＢ）アロタイプは、ＬＨＲ−Ｂの５'半分およびＬＨＲ−Ａの３'半分のキメラである第５ＬＨＲを含有し、第３のＣ３ｂ結合部位を有すると予想され[ワン（Ｗong）ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１６９：８４７（１９８９）]、約２９０kＤである。最小のＦ'（またはＣ）アロタイプは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者において増加した発病率を有し[ヴァン・ダイン（Ｖan Ｄyne）ら、Ｃlin.Ｅxp.Ｉmmunol. ６８：５７０（１９８７）およびディックマン（Ｄykman）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ８０：１６９８（１９８３）]、ＬＨＲ−Ｂおよび１つのＣ３ｂ結合部位の欠失によりよく発生する。ＣＲ１の天然可溶性形は、正常な個体およびＳＬＥを有する個体の血漿中で検出された[ユーン・アンド・ファーロン（Ｙoon ＆Ｆearon）ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ．Ｉmmunol.)１３４：３３３２−３３３８（１９８５）]。その特徴は、構造的にも機能的にも赤血球（細胞−表面）ＣＲ１のものと類似している。アウアケード（Ｈourcade）ら［Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１６８：１２５５−１２７０（１９８８）］は、ＣＲ１の分泌された形を産生することが予想されたヒトＣＲ１転写ユニットにおける別のポリアデニル化部位をも観察した。この平滑末端化配列から生じるｍＲＮＡは、ＣＲ１の第１の８.５ＳＣＲ；例えば、Ｃ４ｂ結合ドメインからなり、約８０kＤのタンパクをコードすることができた。この平滑末端化配列に対応するｃＤＮＡがＣＯＳ細胞中にトランスフェクトされ、発現されると、予想されたＣ４ｂ結合活性を示すが、Ｃ３ｂ結合活性を示さない［キルシュ（Ｋyrch）ら、Ｆ.Ａ.Ｓ.Ｅ.ＢＪ.３：Ａ３６８（１９８９）］。キルシュらは、いくつかのヒト細胞系において予想されたものと類似のｍＲＮＡをも観察し、Ｃ４ｂを結合することができるＣＲ１の平滑末端可溶性形がヒトにおいて合成されると仮定した。ＣＲ１のいくつかの可溶性フラグメントは、発現されるＤＮＡから膜内外領域を除去することによる組換えＤＮＡ法を介しても得られた［ファーロン（Ｆearo n）ら、１９８９年１０月５日に公開された国際出願公開ＷＯ８９／０９２２０およびファーロンら、１９９１年４月１８日に公開された国際出願公開ＷＯ９１／０５０４７］。可溶性ＣＲ１フラグメントは、それらがＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂを結合することができるので機能的に活性であり、それらが含有した領域に依存してＩ因子補助因子活性を示す。さらに、それらは、好中球酸化バースト、補体媒介溶血反応およびＣ３ａおよびＣ５ａ産生などのイン・ビトロＣＲ１機能の阻害剤として作用することができる。プラスミドｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃによってコードされる可溶性ＣＲ１構築物は、逆受身アルサス反応［ファーロンら、１９８９および１９９１ならびにイェー（Ｙeh）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー(１９９１)］、抑制した虚血後心筋炎症（suppressed post-ischemic myocardial inflammation）および壊死［ファーロンら、１９８９および１９９０ならびにワイズマン（Ｗeisman）ら、サイエンス（Ｓcience）２４９：１４６ −１５１(１９９０)］においてイン・ビトロ活性を示した。さらにまた、ｓＣＲ１／ｐＢＳＣＲ１ｃ産生物の、ｐ−アニソイル化ヒトプラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ−活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）とのコフォーミュレーションの結果、ＡＰＳＡＣ単独と同様の抗溶血活性が生じ、補体阻害剤ｓＣＲ１と血栓崩壊剤との組み合わせが有用な組合せ治療であることを示す［ファーロンら、１９９１年４月１８日に公開された国際出願公開ＷＯ９１／０５０４７］。補体レセプター様タンパクは、本明細書に記載されるプロトコールによって精製され得るタンパクであり、かかるプロトコールは、所望により、過度の実験を必要としない慣用の非発明的修正によって変更される。かかるタンパクは、ＣＲのアロタイプおよび対立遺伝子、平滑末端化形、ＰＥＧ処理などにより化学的に修飾された形およびＣＲ部分を含有する融合タンパクを含む。これらのタンパクは、それらが本発明の方法による精製を許すのに充分なＣＲタンパク特性を有するかまたは維持するので、補体レセプター様と称される。特別に定義しない限り、補体レセプタータンパクなる用語は、補体レセプター様タンパクも含む。ＣＲ −１様タンパクは、対立遺伝子、平滑末端形、化学的に修飾された形およびＣＲ −１アロタイプから誘導された融合タンパクを含むＣＲ−様タンパクのサブセットを表す。３０個の細胞外ＳＣＲドメイン全部を含有する、本明細書中でヒトＣＲ１の可溶性形として定義された可溶性補体レセプター１（ｓＣＲ１）は、ＣＲ −１−様タンパクの特異的な例である。本発明の補体レセプタータンパクは、種々の方法によって製造することができる。全長天然鎖が必要な場合、天然分子は、前記定義の細胞供給源から抽出することができる。可溶性形が望まれる場合、天然全長分子のフラグメントが好ましい。したがって、所望の鎖フラグメントをコードするＤＮＡは、組換えにより産生されたタンパクフラグメントとして発現される。本発明は、種々のｓＣＲ１産生性組換え細胞系を有する調整細胞培養培地からのｓＣＲ１の精製に特に有用である。細胞系から細胞系までおよび種々の補体レセプター産生物の間でのいくかつのバリエーションが予想されるが、本明細書の記載に基づいて、補体レセプタータンパクと産生性細胞系との特別な組み合わせに本発明を適応させることは、当該技術分野における熟練した技術の１つの範囲である。一般に、補体レセプターなどの遺伝子コード化タンパクは、ポリペプチドの所望の領域をコードするＤＮＡフラグメントを組換えＤＮＡビヒクル（例えば、ベクター）中に取込み、好適な原核または真核宿主を形質転換またはトランスフェクトすることによってクローン化される。好適な原核宿主は、限定されないが、エシェリキア(Ｅscherichia)、ストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)、バシラス（Ｂacillus）などが挙げられる。好適な真核宿主は、限定されないが、サッカロマイセス（Ｓaccharomyces）などの酵母およびＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウスＣ１２７、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、ＷＩ−３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫなどの培養物中の動物細胞ならびに昆虫細胞系が挙げられる。特に好ましい宿主は、ＡＴＣＣＣＲＬ１７９３、ＣＲＬ９０９６などのジヒドロホレート（dihydrofolate）レダクターゼ中で欠失するＣＨＯ細胞系および以下に記載する他の細胞系である。かかる組換え法は、よく知られるようになり、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍethods in Ｅnzymology）（アカデミック・プレス）第６５〜６９巻（１９７９）第１００〜１０１巻（１９８３）に開示されている（出典明示により明細書の一部とする）。ほとんど一般的に使用されている組換えＤＮＡ法を具体的に示す広範囲の技術的ディスカッションは、マニアティス（Ｍaniatis）ら、モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning) 、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８２）またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Ｃurrent Ｐrotocols i n Ｍolecular Ｂiology)、グリーン・パブリッシング（１９８８、１９９１）に見ることができる。補体レセプターなどの所望のポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを得るための１つの方法は、ｃＤＮＡクローニングによるものである。この方法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、既知の、または所望のタンパクの産生を予想される細胞から単離する。一連の酵素反応を通して、細胞のｍＲＮＡ個体群は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にコピーされる。次いで、得られたｃＤＮＡは、クローニングビヒクルに挿入され、好適な原核または真核宿主を形質転換するために使用される。得られたｃＤＮＡ「ライブラリー」は、形質転換宿主細胞の個体群からなり、各々、単一の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有する。全ライブラリーは、理論的には、出発物質として使用されるｍＲＮＡ混合物中に存在するコード化情報の代表的な試料を提供する。該ライブラリーは、特異的なＤＮＡ配列を同定するために核酸または抗体プローブを使用してスクリーンすることができる。単離した後、これらのＤＮＡ配列は、修飾することができるか、完全な遺伝子に構築することができる。別法としては、本発明に記載するように、遺伝子の特異的フラグメントは、遺伝子の残部に関係なく工作することができる。これらの工作された遺伝子フラグメントによってコードされたタンパクフラグメントは、自然界にはみることができないが、それらは、望ましくない生理学的状態の治療において重要な利用性を有する。補体活性を含む障害の予防および／または治療のための可溶性補体レセプターの遺伝子工学は、１つのかかるケースである。遺伝子または遺伝子フラグメントがクローン化された後、ＤＮＡは、発現ベクターに導入され、該構築を使用して、適切な宿主細胞を形質転換する。発現ベクターは、本明細書で定義するように発現制御配列を有するとして特徴付けられ、その結果、関心のあるＤＮＡ配列が操作的に結合させられると、該ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞において関心のあるＤＮＡ配列によってコードされた産生物の産生を指向することができる。本発明は、特に、発現後、可溶性レセプタータンパクが形成されるように、単一の暗号配列のフラグメントを構築することができる。ＳＣＲ１組換え産生へのこのプロトコールの特に有効な適用は、前記のファーロンら、１９８９年１０月５日に公開された国際出願公開ＷＯ８９／０９２２０および１９９１年４月１８日に公開された国際出願公開ＷＯ９１／０５０４７に見られる。組換え産生物が産生された後、該産生物を回収するのが好ましい。該産生物がそれを産生する細胞によって運び出されると、該産生物は、細胞培養培地から直接回収することができる。該産生物が細胞内に保持されると、該細胞は、細胞内産生物を得るために、機械的、化学的または生物学的手段によって物理的に粉砕されなければならない。タンパク産生物の場合、精製プロトコールは、調製物中の全タンパクに対して平均少なくとも８０％、好ましくは、９５％以上の純度である他のタンパクを実質的に含まないタンパク産生物を提供するだけでなく、他の宿主細胞汚染、ＤＮＡ、ＲＮＡ、潜在的パイロジェンなどを除去するかまたは許容されるレベルに低下させる。前記のとおり、本発明のレセプターの産生のために種々の宿主細胞が使用される。特定の宿主細胞の選択は、とりわけ、レセプターの性質、その合成速度、その崩壊速度およびレセプターの発現を指向する組換えベクターの特徴を考慮して、当業者の技術範囲内である。宿主細胞発現系の選択は、使用されるべき細胞培養方法の性質を広範囲に指示する。バッチまたは連続式、スピナーまたはエアーリフト方式、液体または固定化である産生の特定の形態の選択は、発現系が選択された後に行うことができる。したがって、流動層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養液、または撹拌タンクバイオリアクターは、細胞マイクロキャリヤーを伴ってまたは伴わずに、様々に使用される。かかる選択のための基準は、細胞培養技術分野では認識されている。それらは、本発明の範囲外であるので、本明細書には詳述しない。本発明は、調整細胞培養培地中に補体レセプターが存在すると仮定した場合の補体レセプターの精製に関する。本発明は前記したとおり、とりわけ、補体レセプタータンパクの精製への固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の適用に関する。ＩＭＡＣの原理は、一般的に明らかである。吸着は、吸着剤マトリックス上でのキレート形成によって固定化された金属イオンと結合されるべきタンパクの表面上の利用しやすい電子供与体アミノ酸との間の金属配位錯体の形成を予想させると思われる。限定されないが、マトリックス、スペーサーアーム、キレート形成リガンド、金属イオン、周囲の液体媒質の特性および溶解した溶質種を含む金属イオン微小環境は、望ましい分別を行うために当業者によって操作することができる。メカニズムについて特定の理論によって結び付けられることを望まないが、結合に関して重要なアミノ酸は、ヒスチジン、トリプトファンおよびシステインであると思われる。これらの残基の１つ以上は、一般にタンパク中に見られるので、ＩＭＡＣカラムに結合されるべき全てのタンパクが予想される。しかしながら、該残基は、存在することが必要なだけではなく、有効な結合が生じるように利用可能であることも必要である（たとえば、タンパクの表面に配向する）。本発明は、関心のある補体レセプタータンパクへの適切な残基の付加を予想する。残基、例えば、該タンパクのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加したポリ−ヒスチジンテールを本明細書に記載の組換え発現系中に工作し、次いで、Ｕ.Ｓ.Ｐ４,５６９,７９４に開示されているプロトコールを行うことができる。金属の性質およびそれをカラムに配位させる方法は、結合反応の強度および選択性に影響を及ぼすことができる。シリカゲル、アガロースおよびポリビニル− メタクリレートコポリマーなどの合成有機分子のマトリックスを使用することができる。該マトリックスは、好ましくは、キレート形成を促進するための置換基を含有する。イミノニ酢酸（ＩＤＡ）またはそのトリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン（ＴＥＤ）などの置換基を使用することができる。ＩＤＡが好ましい。特に有用なＩＭＡＣ物質は、Ｔoyopearl ＡＦ−Ｃhelate ６５０Ｍ、ＩＤＡで置換されたポリビニルメタクリレートコポリマーである。金属は、好ましくは、亜鉛までの第１遷移シリーズの二価のメンバーである。Ｃo⁺⁺、Ｎi⁺⁺、Ｃd⁺⁺ およびＦe⁺⁺⁺を使用することもできる。もちろん、重要な選択パラメーターは、金属に対する、精製されるべきタンパクの親和性である。Ｃu⁺⁺が好ましい。これらの金属イオンの周囲の４つの配位位置のうち少なくとも１つは、わずかにアルカリ性のｐＨでヒスチジン残基などの強い電子供与体によって容易に置換される水分子によって占められている。実際、ＩＭＡＣカラムは、濃縮した金属塩溶液、次いで、水または緩衝液でパルスすることによって金属で「充填」される。該カラムは、しばしば、金属イオン（亜鉛を除く）の色を得る。しばしば、金属の量は、カラムのほぼ半分が充填されるように選択される。これは、溶離液中に出現させずに非充填領域中に金属イオンをゆっくりと漏れさせる。一般に、所定の溶出緩衝液による予備洗浄が行われる。試料緩衝液は、非特異的イオン交換効果を最小にするために１Ｍ以上の塩を含有する。タンパクの吸着は、高いｐＨで最大である。溶出は、通常、吸着したタンパク上の供与体基をプロトン化するためにｐＨを低下させること、または、イミダゾールなどの強い錯形成剤またはｐＨ９のグリシン緩衝液の使用による。これらの後者の場合、金属は、カラムから置換される。線形勾配溶出法は、有益に使用することができる。前記のとおり、ＩＭＡＣは、他のタンパク精製方法と組み合わせて使用する場合に特に有用である。すなわち、他のタンパク精製方法によって部分的に精製される物質にＩＭＡＣを適用するのが好ましい。「部分的に精製された」なる用語は、関心のあるタンパクが少なくとも５重量％、好ましくは、少なくとも１０重量％、最も好ましくは、少なくとも４５重量％存在するタンパク調製物を意味する。したがって、ＩＭＡＣの適用は、補体レセプタータンパクについての全体的な精製プロトコールに関して最も認識されている。特に有用な組み合わせクロマトグラフィープロトコールは、１９９２年３月２４日に出願された米国特許出願８５７,００２に開示されている[出典明示により本明細書の一部とする]。例えば、調整細胞培養培地の試料をＩＭＡＣの適用前に部分的精製に付すことが有用であることが判明した。「調整細胞培養培地」なる用語は、細胞増殖および／または細胞維持を支持する細胞培養培地を意味し、分泌された産生物を含有する。かかる培地の濃縮試料は、ＩＭＡＣ工程の適用前に１つ以上のタンパク精製工程に付される。該試料は、第１工程としてイオン交換クロマトグラフィーに付される。前記のとおり、種々の陰イオンまたは陽イオン置換基は、クロマトグラフィーのための陽イオンまたは陰イオン支持体を形成するためにマトリックスに付着される。陰イオン交換置換基としては、ジエチルアミノエチル(ＤＥＡＥ)、第四アミノエチル（ＱＡＥ）および第四アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン交換置換基としては、カルボキシメチル(ＣＭ)、スルホエチル(ＳＥ)、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２などのセルロースイオン交換樹脂は、イギリス国、ケント州、メイドストンのワットベースのおよび架橋結合したイオン交換樹脂も知られている。例えば、ＤＥＡＥラゲット（Ｐharmacia ＡＢ）から入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ−６５０ＳおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ−６５０ＳなどのＤＥＡＥおよびＣＭ誘導エチレングリコール−メタクリレートコポリマーは、ペンシルベニア州、フィラデルフィアのトーソー・ハース・カンパニー（Ｔoso Ｈaas Ｃ o.）から入手可能である。イオン支持体からの溶出は、通常、塩の添加を含み、前記のとおり、ＩＭＡＣは、増加した塩濃度下で増強されるので、イオン交換クロマトグラフィー工程または他の塩媒介精製工程に続くＩＭＡＣ工程の導入が特に好ましい。さらなる精製プロトコールが付加されてよく、限定されないが、ＨＩＣ、さらなるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、濃縮および凍結乾燥が挙げられる。水性溶媒中の疎水性分子は、自己会合するであろう。この会合は、疎水性相互作用による。タンパクなどの巨大分子は、予想される疎水性基に加えて広い疎水性パッチをそれらの表面に有すると思われる。ＨＩＣは、一部、クロマトグラフィー支持体に付着した疎水性リガンドとこれらのパッチとの相互作用を予想する。マトリックスに結合した疎水性リガンドは、本明細書ではＨＩＣ支持体、ＨＩＣゲルまたはＨＩＣカラムと様々に称される。さらに、タンパクとＨＩＣ支持体との間の相互作用の強度は、タンパクの極性表面に対する非極性表面の割合の関数だけではなく、非極性表面の分布にもよると思われる。多くのマトリックスは、ＨＩＣカラムの調製に使用され、アガロースが最も幅広く使用される。シリカおよび有機ポリマー樹脂も使用される。有用な疎水性リガンドとしては、限定されないが、ブチル、プロピルまたはオクチルなどの炭素原子約２〜約１０個を有するアルキル基；またはフェニルなどのアリール基が挙げられる。ゲルおよびカラムについての慣用のＨＩＣ製品は、供給社から、例えアクチボラゲット（Ｐharmacia ＬＫＢＡＢ）から、製品名ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＢutyl ６５０、Ｅther−６５０、またはＰhenyl−６５０（フラクトゲル（Ｆr actogel）ＴＳＫＢutyl−６５０）またはＴＳＫ−ＧＥＬＰhenyl-５ＰＷの下に日本国東京のトーソー・コーポレイション（Ｔosoh Ｃorporation）から、製品名アルキル−アガロース（ここで、アルキル基は、炭素原子２〜１０個を含有する）の下にイスラエル国、リホボットのマイルズ−イエダ（Ｍiles−Ｙeda）から、および製品名ベーカーボンド（Ｂakerbond）ＷＰ−ＨＩ−プロピルの下にニュージャージー州、フィリップスバーグのジェイ・ティ・ベーカー（Ｊ.Ｔ.Ｂ aker）から商業的に入手することができる。リガンド密度は、相互作用の強度だけでなくカラムの許容量にも影響を及ぼすという点で重要なパラメーターである。市販のフェニルまたはオクチルフェニルゲルのリガンド密度は、ゲルベッド１ml当たり４０μmolのオーダーである。ゲル許容量は、問題の特定のタンパク、ｐＨ、温度および塩濃度の関数であるが、一般に、ゲル１ml当たり３〜２０mgの範囲になると予想することができる。特定のゲルの選択は、当業者によって決定することができる。一般に、タンパクとＨＩＣリガンドの相互作用の強度は、アルキルリガンドの鎖の長さとともに増大するが、約４〜約８個の炭素原子を有するリガンドは、ほとんどの分離のために好適である。フェニル基は、ペンチル基とほぼ同一の疎水性を有するが、選択性は、タンパクの芳香族基とのpi−pi相互作用の可能性のために全く異なることができる。タンパクのＨＩＣカラムへの吸着は、高い塩濃度により好ましくなるが、実際の濃度は、タンパクの性質および選択された特定のＨＩＣリガンドに依存して広範囲に変化することができる。種々のイオンは、それらが疎水性相互作用を促進するか（塩析効果）または水の構造を分解し（カオトロピック効果）、疎水性相互作用を微弱化させるかに依存していわゆるソルホビック（soluphobic）シリーズ中でアレンジすることができる。陽イオンは、Ｂa⁺⁺＜Ｃa⁺⁺＜Ｍg⁺⁺＜Ｌi⁺＜Ｃs⁺＜Ｎa⁺＜Ｋ⁺＜Ｒb⁺＜ＮＨ₄ ⁺のように増加する塩析効果によってランク付けされる。一方、陰イオンは、ＰＯ₄ ^---＜ＳＯ₄ ^--＜ＣＨ₃ＣＯＯ^-＜Ｃl^-＜Ｂr^-＜ＮＯ₃ ^-＜ＣlＯ₄ ^-＜Ｉ^-＜ＳＣＮ^-のように増加するカオトロピック効果によってランク付けされる。したがって、以下の関係によって示されるような相互作用強度に影響を及ぼす塩が形成される：ＮaＳＯ₄＞ＮaＣl＞(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄＞ＮＨ₄Ｃl＞ＮaＢr＞ＮaＳＣＮ一般に、約０.７５〜約２Ｍの硫酸アンモニウムまたは約１〜４ＭＮaＣlの塩濃度が有用である。ＨＩＣ分離に対する温度の影響は、単純なものではないが、一般に、温度の低下は、相互作用を減少させる。しかしながら、温度を増加させることによって生じる利益は、かかる増加が有するタンパクの活性に対する逆の効果に不利に働くにちがいない。滴下または勾配液のいずれかの形態の溶出は、種々の方法で：（ａ）塩濃度の変化、（ｂ）溶媒の極性の変化または（ｃ）洗剤の添加によって行うことができる。塩濃度の低下によって、吸着したタンパクは、増大する疎水性のために溶出される。極性の変化は、エチレングリコールまたは(イソ)プロパノールなどの溶媒を添加し、それによって、疎水性相互作用の強度を低下させることによって行われる。洗剤は、タンパクの置換剤として機能し、主に、膜タンパクの精製に関して使用された。ＨＩＣにより得られた溶出液を別のイオン交換クロマトグラフィーに付した後、陰イオンおよび陽イオン方法の両方が使用される。前記のとおり、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、分子の大きさに基づく分離が行われる。実質的には、分子ふるいの形態である。マトリックスおよび溶質の間の相互作用が起こらないのが望ましく、したがって、全体的に不活性なマトリックス物質が好ましい。マトリックスは、堅くかつ非常に多孔性であるのが望ましい。大規模なプロセスのために、堅さは、パラメーターが全体的な流速を確るが、これらのゲルは、比較的に軟らかく、特に、大規模な精製にあまり適していなかった。最近、増加した堅さを有するゲルが開発された（例えば、ＳＥＰＨさな粒径において利用可能であり、その結果、高流速でさえ分離が維持される。ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷシリーズマトリックス［トーソー・ハース（Ｔoso Ｈa as)］が好ましい。単なる説明のためだけに、本発明は、可溶性タイプの補体レセプターの精製に適用された。さらに詳細には、リーダー、ＬＨＲ−Ａ、ＬＨＲ−Ｂ、ＬＨＲ−Ｃ、ＬＨＲ−Ｄ、ＳＣＲ２９、ＳＣＲ３０領域を含有し、膜内外領域の第１のアラニン残基を含み、プラスミドpＢＳＣＲ１ｃ［ファーロンら、１９８９年１０月５日に公開された国際出願公開ＷＯ８９／０９２２０におけるＣＲ１コード化配列に対応する可溶性ＣＲ１構築物（以下、「ＴＰ１０ＨＤ」）に適用された。ＴＰ１０ＨＤの産生のための組換え系の構築は、前記ＰＣＴ出願に詳述されており、以下に概略説明する。ＣＨＯ細胞をトリプシン化し、６０mm皿につき５×１０⁵を平板培養し、５％ＣＯ₂／９５％空気の雰囲気下、湿らせたインキュベーター中、３７℃で、増殖培地［１％母液グルタミン(０４３−０５０３０)、１％母液ペン／ストレプ（０４３−０５０７０）および１０％ウシ胎児血清（０１１−６２９０）（スコットランド国ペイズリーのギブコ(Ｇibco)）を含有するヘイムズ（Ｈams）Ｆ１２栄養培地（０４１−１７６５）］中に放置した。２１時間後、ＤＮＡトランスフェクトのために、該細胞を使用した。pＢＳＣＲ１ｃからのｓＣＲ１暗号配列を含有する発現プラスミドをpＳＶ２ｄｈｆｒと一緒に、ｄｈｆｒを必要とするチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＤＵＸＢＩＩ）中にコトランスフェクトした。トランスフェクションは、増殖培地中で行い、ＤＮＡクローニング(ＤＮＡＣloning)、ディ・エム・グローバー（Ｄ.Ｍ.Ｇlover）編（第１５章、ソー・ゴーマン(Ｃ.Ｇorman)）に開示されているようにカルシウム共沈／グリセロールショック法を使用した。pＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔおよびpＳＶ２ｓｈｆｒによるトランスフェクション後、選択工程前に、該細胞を増殖培地中に４６時間維持した。選択および共増幅工程は、実質的には、アール・ジェイ・カウフマン（Ｒ.Ｊ. Ｋaufman）ら［Mol.Ｃell.Ｂiol.５：１７５０−１７５９（１９８５）］による開示に従って行った。トランスフェクションの４６時間後、該細胞を選択培地ＭＥＭＡＬＰＨＡ（０４１−０２５７１）、１％母液グルタミン、１％母液ペン／ストレプ（０４３−０５０７０）および透析したウシ胎児血清（２２０−６３００ＡＪ）［スコットランド国ペイズリーのギブコ］に充填した。該細胞を選択培地中に、ｄｈｆｒ⁺コロニーが出現するまで８〜１０日間維持した。コロニーが確立された後、該細胞をメトトレキセート［Ａ６７７０、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー(Ｓigma Ｃhem.Ｃo.)］を含有する選択培地中に移した。メトトレキセート濃度は、最初は、０.０２μＭであり、５μＭまで徐々に増加した。増殖工程の間、増殖細胞からの増殖培地のアリコットを、ＥＬＩＳＡによってＴＰ１０ＨＤ産生についてアッセイした。補体レセプター分泌組換え細胞系（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ１００５２）を使用して、本発明の精製のための調整培地を補足したが、特定の細胞系は、もちろん必要ではない。ＴＰ１０ＨＤを産生する能力を有するトランスフェクしたＣＨＯ細胞系は、種々の細胞培養技術によって培養することができる。本発明の適用のために、特定の培養方法は重大ではないが、説明のためには、使用される１つの細胞培養方法は、Ｕ.Ｓ.Ｐ４,８６１,７１４；４,８６３,８５６；４,９７８,６１６および４,９９７,７５３に具体的に記載されているベラックス（Ｖerax）流動層法について説明されているた連続灌流法(continuous perfusion process)である。したがって、前記のようなトランスフェクトした細胞は、１０％アシ胎児血清および５mMメトトレキセート（ＭＴＸ）を補足したＣＣＭ−３培地（ＤＭＥＭ、ヘイムズＦ−１２、ウシ血清アルブミンおよび他の栄養補足物の混合物）中でスケールアップする。充分な数の細胞がバイオリアクターに接種するために利用可能になるまで、細胞個体群をローラーボトル中で拡大させた。接種に、Ｓ２００バイオリアクターをクリーン−イン−プレイス（ＣＩＰ）およびスチーム−イン−プレイス（ＳＩＰ）サイクルに付した。次いで、５％ＦＢＳを含有するＣＣＭ−３培地を充填し、マイクロスフェア４５０gを充填した。マイクロスフェアは、接種前に培地で調整された。リアクターに細胞を接種し、操作パラメーターは、以下のとおりであった：ｐＨ７.２、３７℃、入口（流動層の底）１００〜４００torrの溶存Ｏ₂、出口（流動層の上部）０〜２００torr の溶存Ｏ₂。最初のバッチ相後、グルコース濃度１.０g／Ｌを維持するような速度で周期的な増加を伴って、培地灌流を開始した。Ｓ２０００バイオリアクターに接種するために充分な数の細胞がリアクター中に蓄積されるまで、これを継続した。ＣＩＰおよびＳＩＰ後、Ｓ−２０００リアクターに、５％ＦＢＳおよび５ mＭＭＴＸを補足したＣＭ−３培地を充填し、次いで、マイクロスフェア５００ gを充填した。これらのマイクロスフェアは、接種前に培地で調整した。温度、リアクター配列および溶存Ｏ₂に関する操作条件は、前記のとおりである。Ｓ− ２００リアクターからのマイクロスフェアを無菌的にＳ−２０００リアクターに移して、バッチ相を開始した。グルコース濃度が１.５g／Ｌ以下に低下した後、グルコース濃度を１.０g／Ｌに維持するのに充分な速度で培地灌流（ＣＣＭ−３、５％ＦＢＳおよび５mＭＭＴＸ）を開始することによって、増殖相を開始した。細胞増殖を、酸素摂取速度およびグルコース消費速度を測定することによって、オンラインでモニターした。充分な数の細胞がリアクター内に蓄積された後、灌流培地を、１％ＦＢＡおよび５mＭＭＴＸを補足したＣＣＭ−３トランジション培地に代えた。これに対して、１.０g／Ｌのグルコース濃度を維持するように、灌流速度をモニターした。トランジション培地におけるさらなる増殖の後、灌流培地を再度、５mＭＭＴＸを補足したＣＣＭ−３産生培地に代えた。灌流速度を増加させて、１.０g／Ｌのグルコース濃度を維持した。次いで、出口溶存Ｏ₂ またはリサイクル流速セットポイントは、リアクターに対して制御を維持するように低下させた。産生相は、典型的には、約６０日間続く。４〜８℃で貯蔵された４００〜１６００リットルのリアクターパーミエートを、ミリポア・プロスタック・マイクロフィルトレーション・ユニット（Ｍillipo re Ｐrostak Ｍicrofiltration Ｕnit）を介して処理した。この操作からの無細胞パーミエート（permeate）を限外濾過工程に供給した。該パーミエートをミリポア・スパイラル・ワウンド・システム（Ｍillipore Ｓpiral Ｗound Ｓystem ）を用いて３０−６０Ｘ濃縮した。濃縮後、リテンテートを保持タンク中に放出し、系に５〜２０Ｌの５０mＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.５を充填した。系から洗浄緩衝液を放出し、リン酸と合わせた。限外濾過濃縮物をプレフィルターおよびターミナル０.２mmフィルターを介して、予めオートクレーブ処理したナルジーン（Ｎalgene）ボトル中に濾過した。公称８００mlの濃縮物を各ボトル中に分散させ、冷凍貯蔵した。前記のとおり、特定の組換え産生系および特定の細胞培養プロトコールは、本発明の範囲外である。前記系およびプロトコールは、当業者に入手可能な多くのオプションの代表例であり、それらは、単なる説明のためだけに本明細書に記載されている。例えば、撹拌タンクバイオリアクターから得られた培地は、本発明と一緒に用いるための調整培地の供給源として同等に適してする。本発明の課題である精製プロトコールは、単なる慣用の変更と共に、それらが産生または培養される方法に関係無く、種々の組換え補体レセプターおよび補体レセプター様タンパクに適用される。本発明の方法を実施することによって得られた精製された補体レセプタータンパクは、以下の特性を有する：１）９５重量％を超えるＣＲタンパク；２）少なくとも３カ月間、４℃でのタンパク分解性分解に対する安定性；３）低い（＜１Ｅ.Ｕ.／mgタンパク）エンドトキシン；４）低い（＜１pg／mgタンパク）ＤＮＡ；５）非ＣＲタンパク＜５重量％；および６）ウイルス不活性。以下の実施例は、本発明を説明するものであり、請求の範囲を限定するものではない。実施例１イントロダクション以下に概略記載する方法は、調整細胞培養培地濃縮物からの可溶性補体レセプター−１（ｓＣＲ１）の単離および精製について研究された。このプロセスは、宿主細胞、細胞培養培地、または他の原料から誘導された不純物を除去しつつ、タンパク純度＞９５％のｓＣＲ１を調製するように設計される。該回収方法は、陽イオンおよび陰イオン交換、固定化金属親和性、疎水性相互作用およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む９つの工程、および、２つのウイルス不活性化処理からなる。各工程は、物質、方法および予想される結果と共に以下に詳述する。工程１〜３は、２〜８℃で行い、工程６〜９は、１８〜２５℃で行う。全ての緩衝液は、ＷＦＩを用いて調製し、使用前に１０,０００ＭＷＣＯフィルターを介して濾過する。全てのカラムは、示した場合は、２８０nmでのＵＶ吸光度および導電率によってモニターした。カラムは、使用前に清浄化し、平衡化させ、各使用後、清浄化し、ＮaＯＨ中に貯蔵する。該プロセスは、粗製ｓＣＲ１１００gを含有する培地約１０００Ｌを適応させるようにスケール化し、操作のスケールに依存して、完了までに７〜１４日間を要する。工程１：培地前処理撹拌しつつ、無細胞調整培地１０００ＬのｐＨを、１Ｍ酢酸を１〜３Ｌ／分の速度で添加することによって、ｐＨ５.２に低下させる。必要とする酢酸の体積は、培地の体積の約３％であり、１５〜３０分間添加する必要があった。次いで、ｐＨを連続的にモニターする。ｐＨ調整により、重い沈殿物が生じる。直列に連結された２つのミリポア（Ｍilipore）３０インチポリガード（Ｐolygard） −ＣＲフィルター（０.５ミクロン）のシリーズを介してマイクロフィルトレーションに付して、浄化を行う。ｓＣＲ１は、濾液中に回収され、濾液５０〜１００Ｌが蓄積された後、工程２を開始する。これにより、濾過および充填操作が同時に生じる。培地濃縮物の酸性化および濾過は、非−ｓＣＲ１タンパクおよび非タンパク様物質の両方を除去し、ｓＣＲ１含有濾液を後のＳセファロース（Ｓepharose）クロマトグラフィーのために適正なｐＨに調整する。工程２：ファルマシア（Ｐharmacia）ＳＳＥＰＨＡＲＯＳＥ高速流動クロマグラフイー（Ｆast Ｆlow Ｃhromatography）ｐＨ５.２の濾液を、緩衝液Ａで予め平衡化させたファルマシアＳセファロース高速流動ゲルのカラムに１５０cm／時の流速で充填する。該カラムを、３〜５ベッド容量の緩衝液Ａで、次いで、５〜１０ベッド容量の緩衝液Ｂで１５０cm／時で洗浄する。ｓＣＲ−１を、３〜５ベッド容量の緩衝液Ｃで溶離する。吸光度が、観察された最大吸光度の５％に減少するまで、全溶出ピークを回収する。ｓＣＲ１は、約１.５〜２ベッド容量溶出する。該カラムを清浄化し、０.５ＮＮaＯＨで少なくとも１時間処理し、ＷＦＩで洗浄し、緩衝液Ａで平衡化することによってリサイクルする。使用しない場合、該カラムは、０.０１ＮＮaＯＨ中に貯蔵する。Ｓセファロースクロマトグラフィーは、大部分の細胞および培地誘導不純物（特に、タンパク）を除去し、さらなる工程のために緩衝液Ｃカラム溶出液中でｓＣＲ１を濃縮する。工程３：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−ＣＨＥＬＡＴＥ６５０Ｍを使用するＩＭＡＣパート１：ＩＭＡＣカラムへの銅の充填および充填したカラムの平衡化該カラムに以下のとおり銅を充填する：３カラム容量のＷＦＩによるフラッシング後、６〜８カラム容量の０.２％硫酸銅を該カラムに通す。該カラムは、青色がベッド全体にわたって明らかになるまで充填され、過剰の銅は、溶離液流において検出される。次いで、カラムを１〜２ベッド容量のＷＦＩ、次いで、３〜５ベッド容量の緩衝液Ｃでフラッシュする。パート２：ＩＭＡＣカラムの充填、洗浄、溶出、および再生Ｓセファロース溶離液を１５０cm／時の流速で充填および平衡化後のＩＭＡＣカラムに充填する（工程３パート１を参照）。該カラムを３〜５ベッド容量の緩衝液Ｃ、次いで、５〜１０ベッド容量の緩衝液Ｄで１５０cm／時で洗浄する。緩衝液Ｄによるフラッシングが完了した後、該カラムを３〜５容量の緩衝液Ｃでフラッシュして、ｐＨを８に戻し、緩衝液Ｅの適用により有意な銅の浸出が生じることは避けられない。ｓＣＲ１を３〜５ベッド容量の緩衝液Ｅで溶離する。吸光度が観察された最大吸光度の約５％に減少するまで、全溶離ピークを回収する。ｓＣＲ−１は、約２ベッド容量溶出する。銅は、０.５ＭＮaＯＨ消毒と両立しないので、５ベッド容量の５０mＭＥＤＴＡでフラッシュすることによって銅を除去する。濃縮された銅流出液は、地方の規約に従った適正な廃棄のために回収しなければならない。該カラムを清浄化し、０.５ＮＮaＯＨで少なくとも１時間処理し、ＷＦＩで洗浄し、緩衝液Ｃで平衡化することによってリサイクルする。使用しない場合、該カラムは、０.０１ＮＮaＯＨ中で貯蔵する。ＩＭＡＣは、細胞および培地誘導不純物（特に、タンパクおよびＤＮＡ）を除去する。工程４：グアニジンによるウイルス不活性化および硫酸アンモニウムの添加パート１：グアニジンの添加（２〜８℃で行った）冷たいＩＭＡＣ溶離液を、１０〜１５分間かけて、一定に撹拌しつつ、半分の容量の冷たい緩衝液Ｆを添加することによって、グアニジンで処理する。緩衝液Ｆの添加が完了した後、該溶液を、水面下移動（subsurface transfer）によって第２容器に移し、６分間保持する。パート２：硫酸アンモニウムの添加（２〜８℃で行った）工程１のパート４において処理した溶液をすぐに等量の冷たい緩衝液Ｇで１０〜１５分間かけて一定に撹拌しつつ希釈する。得られた溶液は、グアニジン中１ .０Ｍおよび硫酸アンモニウム中０.９Ｍであり、工程５を行う前に２〜８℃にすべきである。グアニジン処理は、レトロウイルス不活性化を提供し、硫酸アンモニウムの添加は、Ｔoyopearl ＢＵＴＹＬクロマトグラフィーのための溶液を調製する。工程５：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＢＵＴＹＬ−６５０Ｍクロマトグラフィー（２〜８℃）工程４からの溶液を、緩衝液Ｈで予め平衡化させたＴoyopearl Ｂutyl−６５０Ｍのカラムに１５０cm／時の流速で充填する。緩衝液およびカラムは、２〜８ ℃であることが重大である。充填が完了した後、該カラムを３〜５ベッド容量の緩衝液Ｈで洗浄し、結合したｓＣＲ１を緩衝液Ｉで溶離する。ｓＣＲ−１は、１ .５〜３ベッド容量溶出する。該カラムを０.２ＮＮaＯＨでストリップする。塩基洗浄により、測定可能なピークにおいてタンパク不純物を溶離し、これを中和し、アッセイのために保持する。カラムを清浄化し、０.５ＮＮaＯＨで少なくとも１時間処理し、ＷＦＩで洗浄し、緩衝液Ｈで平衡化することによってリサイクルする。使用しない場合、該カラムは、０.０１ＮＮaＯＨ中に貯蔵する。工程６：ｐＨ１１でのウイルス不活性化およびダイヤフィルトレーション（di afiltration）ブチル溶出液を、２.５ＭＮaＯＨの添加によってｐＨ１１に調整する。該溶液をすぐに水面下移動により第２容器に移し、ｐＨ１１で１６分間保持し、２. ５ＭＨＣlを使用してｐＨ９.０に再調整する。次いで、ｐＨ１１処理溶液を、３０kＤＭＷＣＯ低タンパク結合膜を装着したタンジェンシャル・フロー（tang ential flow）装置［例えば、フィルトロン・オメガ・シリーズ(Filtron Ｏmega series)］中で緩衝液Ｊに対して連続してダイヤフィルトレーションに付す。ダイヤフィルトレーションは、４〜５容量がパーミエート（permeate）を通過するまで続け、リテンテート（retentate）の導電率は、＜２mＳ／cmである。ｐＨ１１処理は、レトロウイルス不活性化を提供し、ダイヤフィルトレーションは、ＤＥＡＥクロマトグラフィーのためのｓＣＲ１溶液を調製する。工程７：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ−６５０Ｓクロマトグラフィー工程６からの溶液を、緩衝液Ｊで予め平衡化させたＴoyopearl ＤＥＡＥ−６５０Ｓのカラムに１５０cm／時の流速で充填する。充填後、該カラムを３〜５ベッド容量の緩衝液Ｊで洗浄する。結合したｓＣＲ１を、５カラム容量の、緩衝液Ｊ１００％から始まり緩衝液Ｋ１００％までの線形勾配液で溶離する。吸光度が最大吸光度の２０％に減少するまで、全溶離ピークを回収する。次いで、回収を、ピークの最後のために第２容器に換える。ｓＣＲ−１は、１〜２ベッド容量溶出する。該カラムを、３ベッド容量の緩衝液Ｌで洗浄することによってストリップさせる。該カラムを清浄化し、０.５ＮＮaＯＨで少なくとも１時間処理し、ＷＦＩで洗浄し、緩衝液Ｊで平衡化することによってリサイクルする。カラムを使用しない場合は、０.０１ＮＮaＯＨ中に貯蔵する。ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、タンパク、ＤＮＡおよび潜在するウイルス不純物を除去する。工程８：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５５ＦクロマトグラフィーＤＥＡＥ溶出液を、予め緩衝液Ｍで平衡化させたＴoyopearl ＨＷ−５５Ｆのカラムに２０cm／時の流速で充填する。充填の体積は、全ベッド容量の＜１０％であり、充填の濃度は、＜５mg／mＬである。吸光度が最大吸光度の１０％に減少するまで、全ピークを回収する。次いで、回収を、ピークの最後のために第２容器に換える。複数の注入が必要な場合、ピークフラクションをプールする。該物質は、最終濃縮の準備がされている。該カラムを清浄化し、０.５ＮＮaＯＨで少なくとも１時間処理し、ＷＦＩで洗浄し、緩衝液Ｍで平衡化することによってリサイクルする。カラムを使用しない場合は、０.０１ＮＮaＯＨ中に貯蔵する。サイズ排除クロマトグラフィーは、低分子量タンパク不純物の最後の痕跡を除去し、ｓＣＲ１は、最終配合緩衝液である緩衝液Ｎと適合した成分を含有する溶液中に移させられる。工程９：濃縮および最終濾過ＨＷ−５５Ｆ溶出液を、フィルトロン・オメガ・シリーズ３０kＤまたは１００kＤＭＷＣＯ膜を装着した、予想される最終容量にほぼサイズ化されたタンジェンシャルフロー限外濾過装置［例えば、ファルマシア・ミニセット・ウルトラフィルトレーション（Ｐharmacia Ｍinisette Ｕltrafiltration）ユニットまたはミリポア（Ｍilipore）ＣＵＦユニット］を使用して５〜６mg／mＬに濃縮する。濃縮後、該溶液を、連続して、５容量の緩衝液Ｎに対するダイヤフィルトレーションに付す。濃縮したｓＣＲ−１をミリポア（Ｍillipore）０.２ミクロンミリパック（Ｍillipak）フィルターを介して無菌容器中に濾過する。緩衝液緩衝液Ａ２０mＭリン酸ナトリウム、６０mＭＮaＣl、ｐＨ５.２緩衝液Ｂ２０mＭリン酸ナトリウム、１００mＭＮaＣl、ｐＨ６.０緩衝液Ｃ１００mＭリン酸ナトリウム、５００mＭＮaＣl、ｐＨ８.０緩衝液Ｄ１００mM酢酸塩、１ＭＮaCl、ｐＨ４.０緩衝液Ｅ５０mＭイミダゾール、１００mＭリン酸ナトリウム、５００mＭＮ aＣl、ｐＨ８.０緩衝液Ｆ６Ｍグアニジン・塩酸園、１００mＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.０緩衝液Ｇ１.８Ｍ硫酸アンモニウム、１００mＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７. ０緩衝液Ｈ０.９Ｍ硫酸アンモニウム、１００mＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７. ０緩衝液Ｉ１００mＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.０緩衝液Ｊ５０mＭトリス／トリス、ＨＣl、ｐＨ９.０緩衝液Ｋ５０mＭトリス／トリス、ＨＣl、０.２ＭＮaＣl、ｐＨ９.０緩衝液Ｌ５０mＭトリス／トリス、ＨＣl、１.０ＭＮaＣl、ｐＨ９.０緩衝液Ｍ１０mＭリン酸ナトリウム、０.９％ｗ／ｖＮaＣl、ｐＨ７.０緩衝液Ｎ１６.３mＭリン酸カリウム、２５mＭＮaＣl、２％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ６.９溶液ＷＦＩ２.５Ｍ水酸化ナトリウム０.５Ｍ水酸化ナトリウム０.２Ｍ水酸化ナトリウム０.０１Ｍ水酸化ナトリウム２.５Ｍ塩酸１Ｍ酢酸０.２％（ｗ／ｖ）硫酸銅・五水和物（ＣuＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ）５０mＭエデテート（edetate）二または四ナトリウム（Ｎa₂ＥＤＴＡまたはＮ a₄ＥＤＴＡ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/715 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ワッサーマン−フォレナ，ゲイルアメリカ合衆国ペンシルベニア州18954、リッチボロ、グレニファー・ヒル・ロード 163番

Claims

【特許請求の範囲】１．連続的に、補体レセプタータンパクを含有する混合物を、陽イオンクロマトグラフィー支持体、金属親和性クロマトグラフィー支持体、サイズ排除クロマトグラフィー支持体と接触させ、各支持体から該タンパクを選択的に溶離させることからなることを特徴とする、補体レセプタータンパクを含有する混合物からの補体レセプタータンパクの精製方法。２．レセプターがＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３およびＣＲ４からなる群から選択される請求項１記載の方法。３．レセプターがＣＲ１およびそのフラグメントである請求項２記載の方法。４．レセプターがＣＲ１の可溶性フラグメントである請求項３記載の方法。５．レセプターがＴＰ１０ＨＤである請求項４記載の方法。６．陽イオンクロマトグラフィー支持体がＣＭ−２３−、ＣＭ−３２−、ＣＭ −５２−セルロース、ＣＭ−およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ、ＣＭ−およびＳ− ＳＥＰＨＡＲＯＳＥならびにＣＭ−６５０ＳＴＯＹＯＰＥＡＲＬからなる群から選択され、溶離が緩衝化塩溶液の添加による請求項１記載の方法。７．支持体がＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥであり、塩がＮaＣlである請求項６記載の方法。８．塩溶液が１００mＭリン酸ナトリウム、５００mＭＮaＣll、pＨ８.０である請求項６記載の方法。９．金属親和性支持体がシリカ、アガロースおよびポリビニル−メタクリレートコポリマーからなる群から選択される請求項１記載の方法。１０．置換基がＩＤＡおよびＴＥＤからなる群から選択される請求項９記載の方法。１１．支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−ＣＨＥＬＡＴＥ６５０Ｍである請求項１０記載の方法。１２．金属親和性支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−ＣＨＥＬＡＴＥ６５０Ｍであり、補体レセプターがイミダゾール塩緩衝液で選択的に溶離される請求項１記載の方法。１３．イミダゾール塩溶離緩衝液が５０mＭイミダゾール、１００mＭリン酸ナトリウム、５００mＭＮaＣl、pＨ８.０からなる請求項１２記載の方法。１４．サイズ排除クロマトグラフィー支持体がＳＥＰＨＡＣＲＹＬＵＴＲＯＧＥＬ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ、ＳＵＰＥＲＯＳＥおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ５５−Ｆからなる群から選択される請求項１記載の方法。１５．支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ５５−Ｆであり、溶離が１０mＭリン酸ナトリウム、０.９％ｗ／ｖＮaＣl、pＨ７による請求項１４記載の方法。１６．連続的に、補体レセプタータンパクを含有する調整細胞培養培地を、（ａ）第１の陽イオン交換クロマトグラフィー、（ｂ）固定化金属親和性クロマトグラフィー、（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーおよび（ｅ）サイズ排除クロマトグラフィーに付すことからなることを特徴とする、補体レセプタータンパクを含有する調整細胞培養培地からの補体レセプタータンパクの精製方法。１７．第１の陽イオン交換クロマトグラフィーがＣＭ−２３−、ＣＭ−３２− 、ＣＭ−５２−セルロース；ＣＭ−およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ、ＣＭ−およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥおよびＣＭ−６５０ＳＴＯＹＯＰＥＡＲＬからなる群から選択され、溶離が緩衝化塩溶液による請求項１６記載の方法。１８．支持体がＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥであり、塩がＮaＣlである請求項１７記載の方法。１９．塩溶液が１００mＭリン酸ナトリウム、５００mＭＮaＣl、pＨ８.０である請求項１８記載の方法。２０．金属親和性支持体がシリカ、アガロースおよびポリビニル−メタクリレートコポリマーからなる群から選択される請求項１７記載の方法。２１．置換基がＩＤＡおよびＴＥＤからなる群から選択される請求項２０記載の方法。２２．支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−ＣＨＥＬＡＴＥ６５０Ｍである請求項２１記載の方法。２３．金属親和性支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−ＡＦ−ＣＨＥＬＡＴＥ６５０Ｍであり、補体レセプターがイミダゾール塩緩衝液により選択的に溶離される請求項１６記載の方法。２４．イミダゾール塩溶離緩衝液が５０mＭイミダゾール、１００mＭリン酸ナトリウム、５００mＭＮaＣl、pＨ８.０からなる請求項２３記載の方法。２５．疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体がアルキルＣ２−Ｃ８−アガロース、アリール−アガロース、アルキル−シリカ、アルキル−有機ポリマー樹脂からなる群から選択される請求項１６記載の方法。２６．支持体がブチル−、フェニル−およびオクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥならびにブチル−、フェニル−およびエーテル−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬからなる群から選択される請求項２５記載の方法。２７．支持体がブチル−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬである請求項２６記載の方法。２８．支持体がブチル−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬであり、タンパクが低塩緩衝液により選択的に溶離される請求項２０記載の方法。２９．タンパクが１００mＭリン酸ナトリウム、pＨ７.０を含有する緩衝液により選択的に溶離される請求項２８記載の方法。３０．陰イオン交換クロマトグラフィーがＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ− 、ＱＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ、ＤＥＡＥ−、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ６５０Ｓからなる群から選択される支持体を使用する請求項１６記載の方法。３１．支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＤＥＡＥ６５ＯＳである請求項３０記載の方法。３２．サイズ排除クロマトグラフィーがＳＥＰＨＡＣＲＹＬＵＴＲＯＧＥＬ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ、ＳＵＰＥＲＯＳＥおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ５５Ｆからなる群から選択される支持体を使用する請求項１６記載の方法。３３．支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ５５Ｆである請求項３２記載の方法。３４．（ａ）調整細胞培地を濃縮し、（ｂ）陽イオンクロマトグラフィー支持体に補体レセプタータンパクを吸着させ、（ｃ）吸着したタンパクを少なくとも１種類の緩衝液で洗浄し、（ｄ）洗浄したタンパクを固定化金属親和性クロマトグラフィー支持体に溶出させ、（ｅ）工程からの溶出したタンパクを吸着させ、（ｆ）吸着したタンパクを少なくとも１種類の緩衝液で洗浄し、（ｇ）洗浄したタンパクを溶出させ、（ｈ）工程（ｇ）からの溶出したタンパクを疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体に吸着させ、（ｉ）該タンパクを選択的に溶出させ、（ｊ）工程（ｈ）からの溶出液を陰イオン交換支持体に吸着させ、（ｋ）吸着したタンパクを溶出させ、（ｌ）工程（ｋ）からの溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに付し、次いで、（ｍ）それらからタンパクを回収することからなることを特徴とする、調整細胞培地からの補体レセプタータンパクの精製方法。３５．ウイルスが存在する場合に該ウイルスを不活性化する任意の工程を含む請求項３４記載の方法。３６．ウイルス不活性化工程が、工程（ｉ）後および工程（ｊ）前、および／または、工程（ｇ）後および工程（ｈ）前に行われる請求項３５記載の方法。３７．ウイルス不活性化工程が塩基またはグアニジン・塩酸塩による溶出液の処理からなる請求項３６記載の方法。３８．工程（ｂ）の陽イオン交換支持体がスルホネート−置換ＳＥＰＨＡＲＯＳＥである請求項３４記載の方法。３９．固定化金属親和性支持体がＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−ＣＨＥＬＡＴＥ６５０Ｍである請求項３４記載の方法。４０．工程（ｊ）の陰イオン交換支持体がジエチルアミノエチル、第４級アミノエチルおよび第４級アミン置換樹脂、ＳＥＰＨＡＤＥＸ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥまたはＴＯＹＯＰＥＡＲＬからなる群から選択される請求項３４記載の方法。４１．陰イオン交換支持体がジエチルアミノエチル置換ＴＯＹＯＰＥＡＲＬである請求項４０記載の方法。４２．工程（ｈ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体がアルキルＣ２ −Ｃ８−アガロース、アリール−アガロース、アルキル−シリカ、アルキル−有機ポリマー樹脂からなる群から選択される請求項３４記載の方法。４３．支持体がブチル−、フェニル−およびオクチル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥならびにフェニル−、エーテル−およびブチル−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬからなる群から選択される４２記載の方法。４４．支持体がブチル−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０である請求項４３記載の方法。４５．サイズ排除クロマトグラフィーがＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ５５Ｆを使用する請求項３５記載の方法。４６．タンパクが、限外濾過によりクロマトグラフィー工程（１）からのタンパク含有フラクションをプールし、濃縮することによって回収される請求項３４記載の方法。４７．補体レセプタータンパク含有混合物を固定化金属親和性支持体に吸着させ、吸着したタンパクを洗浄し、溶離し、該タンパクを回収することからなることを特徴とする、補体レセプタータンパクを含有する混合物からの補体レセプタータンパクの精製方法。４８．固定化親和性クロマトグラフィー支持体への吸着前または後に１つ以上のタンパク精製工程を付加することからなる請求項４７記載の方法。