KR100241172B1 - 단백질의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보체 수용체 단백질의 정제에서 크로마토그래피의 병용에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

단백질의 정제 방법

[발명의 배경]

본 발명은 단백질 정제의 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 보체 수용체 단백질의 정제에 병용 크로마토그래피의 이용에 관한 것이다.

[발명의 배경]

전통적으로 단백질 정제안은 정제대상의 단백질과 원치 않는 단백질 오염물 사이의 분자 크기, 전하 및 용해성의 특성에서 차이를 기초로하여 설정되왔다. 이러한 변수를 근간으로 설정된 원안에는 크기별 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 차별침전 등이 포함된다.

겔 여과 또는 겔 침투 크로마토그래피로서도 알려져 있는 크기별 배제 크로마토그래피는 이동상내의 거대분자가 정지상 입자의 기공내로 침투하는 것에 의존한다. 차별침투는 입자들의 액체역학용적의 함수이다. 따라서, 이상조건하에서 더욱 큰 분자들은 입자들의 내부로부터 배제되는 한편 좀 더 작은 분자들은 이 용적에 근접하며 용출의 순서가 용출용적과 분자량의 로그 사이에 직선관계가 존재하기 때문에 단백질의 크기에 의해 예측될 수 있다. 가교된 덱스트란(예, SEPHADEX), 구형 아가로즈 비드(예, SEPHAROSE)(둘다 스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 에이비로부터 시판중에 있음), 가교 폴리아크릴아미드(예, BIO-GEL)(캘리포니아 리취몬드 소재의 바이오라드 레보라토리즈로부터 시판중에 있음), 또는 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체(예, TOYOPEARL HW65S)(일본국 토오쿄 소재의 토요소다 캄파니로부터 시판중에 있음)가 기본이 된 크기별 배제 크로마토그래피 지지체가 본 발명의 실시에 유용하다.

침전방법은 단백질의 조혼합물에서 개개 단백질의 용해성이 상당히 다양하다는 사실에 기초를 둔다. 비록 수성매질중에서 단백질의 용해성이 여러가지 요인에 의해 결정될지라도, 단백질과 용매와의 상호작용이 단백질과 동일종류 또는 유사종류의 단백질 분자와의 상호작용보다 더욱 강력하다면 단백질은 용해될 수 있다고 일반적으로 말한다. 침전현상을 설명하는 어떤 특별한 메카니즘 이론에 집착하지 않더라도, 단백질과 물분자 사이의 상호작용은 여러종류의 비전하 그룹과 정전기적으로 쌍즉자로서 전하그룹과의 수소결합에 의해 일어나며 일가 양이온의 염(예, 황산암모늄)과 같은 침전물이 물분자에 대해 단백질과 경쟁하고 그러므로써 높은 염농도에서 단백질은 탈수되어 수성환경과의 상호작용이 줄어들면서 동일하거나 유사한 단백질과 응집을 증가시킴으로써 매질로부터 침전물을 형성하게 되는 것으로 알려져 있다.

이온교환 크로마토그래피는 샘플중의 전하 작용그룹과 흡착표면상의 반대전하의 이온 작용그룹과의 상호작용과 연관된다. 두가지 유형의 상호작용이 알려져 있다. 즉, 양전하 표면과 상호작용하는 음전하 아미노산 측쇄(예, 아스파트산과 글루탐산)에 의해 조정되는 음이온교환 크로마토그래피와 음전하 표면과 상호작용하는 양전하 아미노산잔기(예, 라이신과 아르기닌)에해 조정되는 양이온교환 크로마토그래피가 있다.

보다 최근에 친화성 크로마토그래피와 소수성 상호작용 크로마토그래피 기술이 종래의 크기별 배제 크로마토그래피 원안과 이온교환 크로마토그래피 원안을 보완하기 위하여 개발되었다.

친화성 크로마토그래피는 단백질과 고정된 리간드와의 상호작용에 의존한다. 리간드는 목적하는 특정 단백질에 대해 특이적일 수 있으며, 이 경우에 리간드는 기질, 기질유사체, 억제제 또는 항체이다. 다른 방도로, 리간드는 많은 단백질과 반응할 수 있다. 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, 디포스페이트, 니코틴 아데닌 디뉴클레오타이드 또는 특정 염료와 같은 일반적인 리간드가 특정부류의 단백질을 회수하는데 사용할 수 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피는 탄화수소 스페이서 아암을 포함하지만 친화성 리간드가 없는 친화성 겔상에 단백질이 보유될 수 있다는 관찰에 따라 처음으로 개발되었다. 비록 이 분야에서 용어 “소수성 크로마토그래피”가 때때로 사용되고 있을지라도, 용어 “소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)”가 소수성인 겔과 용질 사이의 상호작용이며 크로마토그래피 절차는 아니기 때문에 바람직하다. 소수성 상호작용은 높은 이온강도에서 가장 강력하며, 그러므로서 이러한 유형의 분리방법은 염침전 또는 이온교환 절차후 통상적으로 수행한다. HIC 지지체로부터의 용출은 용매, pH, 이온강도를 변형시키거나 카오트로픽제 또는 유기 변형제(예, 에틸렌 글리콜)를 첨가하여 달성할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일반원리에 대한 설명은 미합중국 특허 제 3,917,527호 및 제 4,000,098호에서 찾아볼 수 있다. 특정 단백질의 정제에 HIC의 적용은 다음과 같은 문헌에 예시되어 있다 : 사람성장호르몬(미합중국 특허 4,332,717), 독소결합체(미합중국 특허 4,771,128), 항용혈인자(미합중국 특허 4,743,680), 종양괴사인자(미합중국 특허 4,894,439), 인터루킨-2(미합중국 특허 4,908,434), 사랄 림프독소(미합중국 특허 4,920,196) 및 리소자임 종류[Fausnaugh, J.L.and F.E.Regnier, J.Chromatog. 359 : 131-146(1986)].

본 발명은 보체 수용체분자와 보체 수용체-유사분자의 정제에 이온교환, 침전, HIC 및 크기별 배제 크로마토그래피의 병용 적용에 관한 것이다.

[발명의 간단한 설명]

본 발명은 양이온성 크로마토그래피 지지체, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체 및 크기별 크로마토그래피 지지체에 보체 수용체 단백질-혼합물을 차례로 적용시키고 각각의 지지체로부터 그 단백질을 선택적으로 용출시켜, 상기 혼합물로부터 보체 수용체 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

다른 관점에서 본 발명은 단백질 함유한 배지를 a) 양이온교환 크로마토그래피, b) 황산 암모늄 침전, c) 소수성 상호작용 크로마토그래피, d) 음이온교환 크로마토그래피, e) 추가의 양이온교환 크로마토그래피 및 f) 크기별 배제 크로마토그래피에 차례로 적용시켜 세포배양 배지로부터 보체 수용체 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 세포배양 배지를 농축시키고, (b) 보체 수용체 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼사에 흡착시키고, (c) 흡착된 단백질을 일회 이상 완충액으로 세척하고, (d) 세척된 단백질을 용출시키고, (e) 단백질을 황산암모늄으로 침전시키고, (f) 침전된 단백질을 재용해시키고, (g) 단계(f)로부터의 단백질을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체상에 흡착시키고, (h) 단백질을 선택적으로 용출시키고, (i) 단계(h)의 용출물을 음이온 교환수지상에 흡착시키고, (j) 흡착된 단백질을 용출시키고, (k) 단계(j)로부터의 용출물을 양이온교환 컬럼상에 흡착시키고, (l) 흡착된 단백질을 용출시키고, (m) 단계(l)로부터의 용출물을 크기별 배제 크로마토그래피에 적용시키고, (n) 이로부터 단백질을 회수하여, 세포배지로부터 보체 수용체 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 보체 수용체 단백질의 대규모정제에 적용되는 단백질 정제기술에 관한 것이다. 본 발명은 수용체 단백질의 회수율을 95% 이상의 단백질 순도로 제공할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 본 발명은 많은 보체 수용체 단백질과 보체 수용체-유사 단백질의 정제에 적용될 수 있다.

보체는 체액면역성의 중요한 작동물질로서 한정된 단백질 분해에 의해 순차적으로 활성화되는 한 그룹의 혈청 단백질이다. 보체의 활성화는 초기작용성 보체 성분과 항원/항체 복합체와의 상호작용에 의해 일어난다. 단지 이와같은 활성화만으로 또는 다른 단백질과 함께에 의해 기인하는 단백질 분해 단편은 추가의 보체 단백질을 활성화시켜 결국 혈액응고 인자들의 작용에 의한 단백질 분해 케스케이드 흔적을 남긴다. 다른 방도로, 보체는 세균 세포벽 성분, 단백질 분해효소(예, 플라스민) 또는 복합 탄수화물(예, 이눌린)에 의해 활성화될 수 있다. 많은 생물학적 활성이 보체계의 성분에 의해 매개된다(예, 면역 세포용해, 아나필라독소 생성, 세균용해, 화학주성, 용혈, 옵소닌작용 및 색작용).

4가지 부류의 보체 수용체(CR)가 알려져 있다(CR1-CR4). 보체 수용체 1(CR1)은 보체성분 C3b 및 C4b에 대한 수용체이다. 보체 수용체 2(CR2)는 성분 C3dg 또는 C3d에 대한 수용체이다. 보체 수용체 3(CR3)은 C3bi에 대한 수용체이다. 보체 수용체 4(CR4)는 C3dg에 대한 수용체이다.

보체 수용체 1(CR1)은 적혈구, 단구/대식세포, 과립구, B세포, 일부 T세포, 비장포상 수지상세포 및 사구체 포도세포의 막상에 존재한다. CR1은 C3b 및 C4b와 결합하고 C3b/C4b 수용체로서 언급한다. 이의 주요서열은 결정되어 있다. [참조, Klickstein et al., J. Exp. Med. 165 : 1095-1112(1987), Klickstein et al., J. Exp. Med. 168-1699-1717(1988); Hourcade et al., J. Exp. Med. 168 : 1255-1270(1988)]

이것은 60-70개 아미노산을 함유한 30개의 짧은 컨센서스 반복체(SCR)로 구성되어 있고, SCR당 평균 65개 아미노산 중 29개는 보존되어 있다. 각각의 SCR은 디설파이드로 제3 및 제1하프-시스틴이 디설파이드 연결되고 제4 및 제2하프-시스틴이 디설파이드 연결되어 삼차원 트리플 루프를 형성한다. SCR은 추가로 7개 SCR의 긴 동족 반복체(LHR) 4개로 조직된다. 리더 서열뒤로 이 분자는 C4b결합 도메인을 함유한 N-말단 LHR-A, 뒤이은 두개의 반복체, C3b결합 도메인을 함유한 LHR-B 및 LHR-C, C말단 LHR-D, 두개의 추가 SCR, 25개 잔기 추정전이막영역과 43개 잔기 세포질 테일로 차례로 구성된다.

CR1은 SCR상동성에 의해 특징지워진 슈퍼패밀리의 일원이다. 이 슈퍼패밀리는 또한 C3/4결합기능을 갖는 일원, 예컨데 CR2, C4bp, 인자H, 인자B 및 C2 뿐만아니라 이러한 기능이 없는 단백질, 예컨데 인터루킨-2 수용체, ß2-당단백질 I, Clr, 합토글 로빈 α쇄 및 인자 XIIIb를 포함한다.

CR1은 당단백질로 알려져 있으며 이의 유추된 아미노산 서열을 세포외 영역에서 N-연결된 올리고사카라이드에 대한 24개 잠정부위를 갖는다. 그러나, 투니카마이신의 존재하에 CR1의 합성(Lublin et al., J. Boil. Chem. 261 : 5736(1986)) 및 글루코사민 함량의 분석(Sim, Biochem J. 232 : 883(1985))은 이용되는 부위중 단지 6-8개만이 실질적으로 올리고사카라이드에 연결되고 있음을 제시해 주었다. 당단백질의 N-말단은 차단된 것으로 나타난다.

4개의 상이한 CR1 동종이인자형이 존재하며 이들은 30-50kD까지 크기가 상이하다. 이들 대립동질다형(동종이인자형)의 유전자 빈도는 사람집단에서 상이하다[Holer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 2459-2463(1987)]. F(또는 A) 동종이인자형은 4개의 LHR로 구성되며 약 250kD이다; 좀 더 큰 S(또는 B)동종이인자형은 LHR-B의 5 ‘반과 LHR-A의 3’반의 키메라이고 제3C3b결합부위(Wong et al., J. Exp. Med. 169 : 847(1989))를 갖는 것으로 예상되는 제5LHR를 함유하며 약 290kD이다. 가장 작은 F′(또는 C)동종이인자형은 전신성 루푸스 홍반증(SLE)의 환자 발생율을 증가시켰으며[Van Dyne et al., Clin. Exp. Immunol. 68 : 570(1987) 및 Dykman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 80 : 1698(1983)]십중팔구 LHR-B 및 한개의 C3b결합부위의 결실에 의한 것이다.

CR1의 천연 가용성 형태가 정상인 및 특정 SLE환자의 혈청에서 검출되었다(Yoon ＆ Fearon J.Immunol. 134 : 3332-3338(1985)). 이의 특징은 적혈구(세포-표면) CR1의 것과 구조적 및 기능적으로 유사하다.

아우어케이드(Hourcade)등은 또한 문헌[J. Exp. Med. 168 : 1255-1270(1988)]에서 분비형의 CR1을 생성하는 것으로 예측된 사람 CR1 전사단위에서 또다른 폴리아데닐화 부위를 관찰한 것으로 보고하였다. 이 절삭된 서열로부터의 mRNA는 CR1의 처음 8.5 SCR(예, C4b 결합 도메인)을 함유하고 약 80kD의 단백질을 암호화할 수 있다. 이 절삭된 서열에 상응하는 cDNA를 COS세포에 형질감염시키고 발혈시켰을때, C3b결합활성이 아닌 예상된 C4b활성이 입증되었다(Kyrch et al., F.A.S.E.BJ. 3 : A368(1989)). 크리흐는 또한 몇가지 사람세포주내의 예상되는 것과 유사한 mRNA를 관찰하고 C4b와 결합할 수 있는 CR1의 절삭된 가용성 형태가 사람에게서 합성될 수 있음을 가정하였다.

CR1의 몇가지 가용성 단편이 또한, DNA재조합 절차에 따라 발현되는 DNA로부터 막전이 영역을 절단시킴으로써 형성되었다(1989년 10월 5일 공개된 국제특허공개번호 WO 89/09220(Fearon et al.) 및 1991년 4월 18일 공개된 국제특허공개번호 WO 91/05047(Fearon et al)). 가용성 CR1 단편은 C3b 및/또는 C4b와 결합할 수 있으며 이들이 함유한 영역에 따라 인자I 보조인자 활성을 입증하기 때문에, 기능적으로 활성을 나타낸다. 또한, 이들은 호중구 산화붕괴, 보체매개용혈 및 C3a 및 C5a생성과 같은 시험관내 CR1작용의 억제제로서 작용할 수 있다. 프라스미드 sCR1/pBSCR1c에 의해 암호화되어 있는 가용성 CR1작제물도 또한 역수동 아르튀스 반응에서 생체내 활성을 증명해 주었고 [Fearon et al. 1989 ＆ 1991 및 Yeh et al., J. Immunol(1991)] 후-허혈심근염증 및 괴사를 억제시켜 주었다[Fearon et al. 1989 ＆ 1990 및 Weisman et al., Science 249 : 146-151(1990)]. sCR1/pBSCR1c 생성물과 p-아니소일화된 사람 플라스미노겐-스트렙토키나제-활성화제 복합체(APSAC)와의 공동-제제는 APSAC단독상태에서의 항용혈 활성과 유사한 결과를 낳았으며 보체 억제제 sCR1과 혈전용해제와의 배합이 유용한 병합요법이 될 수 있음을 가리킨다[1981년 4월 18일 공개된 국제특허공개번호 WO91/05047(Fearon et al.)].

보체 수용체-유사 단백질은 본원에 기술된 원안에 의해 정제될 수 있는 단백질이다. 이러한 원안은, 필요한 경우, 과중한 실험을 수반하지 않는 통상적인 비-발명 조정에 의해 변형된다. 그러한 단백질로는 CR의 동종이인자형 및 대립인자형, 절삭형태, PEG처리에 의한 것과 같이 화학적으로 변형형태 및 CR잔기를 함유한 융합단백질이 포함된다. 이들 단백질은 본 발명의 방법에 의해 정제되기에 충분한 CR 단백질 성질을 갖고 있거나 유지하기 때문에 보체 수용체-유사하다고 언급된다. 특별히 다르게 언급되지 않는한, 용어 “보체 수용체 단백질”은 보체 수용체-유사 단백질을 포함한다. CR-1-유사단백질은 대립인자형, 절삭형태, 화학적변형형태 및 CR-1동종이인자형으로부터 유도된 융합단백질을 포함한 아세트의 CR-유사 단백질을 나타낸다. 모든 30개 세포외 SCR 도메인을 함유한 사람 CR1의 가용성 형태로서 본원에 정의된 가용성 보체 수용체1(sCR1)은 CR-1-유사 단백질의 특정예이다.

본 발명의 보체 수용체 단백질은 여러가지 기술에 의해 제조될 수 있다. 전체길이의 천연상태쇄가 필요한 경우, 상기한 세포원으로부터 그 천연상태쇄를 추출할 수 있다. 가용성 형태 필요한 경우에는 천연상태의 전체길이 분자의 단편이 바람직하다. 따라서, 원하는 쇄단편을 암호화한 DNA는 재조합으로 생성된 단백질 단편으로서 발현된다. 본 발명은 여러가지의 sCR1-생성 재조합세포주의 세포배양배지로부터 sCR1을 정제하는데 특히 유용하다. 비록 세포주간에 및 여러 보체 수용체 생성물간에 약간의 변이는 있을 수 있지만, 본 발명을 보체 수용체 단백질과 생성세포주의 특정배합에 응용하는 것은 본 분야의 통상적인 기술수준의 범주에 속한다는 것이다.

일반적으로, 보체 수용체와 같은 단백질의 암호 유전자는 폴리펩타이드중의 목적하는 영역을 암호화한 DNA단편을 재조합 DNA비히클(예, 벡터)내로 삽입시키고 적합한 원핵 또는 진핵 숙주를 형질전환 또는 형질감염시켜 클로닝시킬 수 있다. 적합한 원핵숙주로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 에스케리키아, 스트렙토마이세스, 바실러스 등이 포함된다. 적합한 진핵세포숙주로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 삭카로마이세스와 같은 효모 및 VERO, HeLa, 마우스 c127, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), WI-38, BNK, COS, MDCK 및 곤충세포주와 같은 배양중의 동물세포가 포함된다. 특히 바람직한 숙주는 ATCC CRL 1793, CRL 9096 및 하기원 다른 세포주와 같은 디하이드로폴레이트 리덕타제가 결실된 CHO세포주이다. 그러한 재조합 기술은 널리 알려져 있으며 문헌[Methods in Enzymology, (Academic Press) Vol.65 내지 69(1979)]에 기술되어 있다. 이 문헌의 내용은 본원에 참조사항으로 인용된다. 가장 흔히 사용되는 DNA재조합 방법률에 관한 광범위한 기술적 논의는 문헌[Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1992) 또는 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing(1988, 1991)]에서 찾아볼 수 있다.

보체 수용체와 같은 목적하는 폴리펩타이드의 암호화 DNA단편을 얻는 한가지 방법은 cDNA클로닝에 의한 것이다. 이 방법에서는 목적하는 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있거나 예상되는 세포로부터 mRNA를 분리한다. 일련의 효소반응을 거쳐 세포의 mRNA군을 상보 DNA(cDNA)로 복제한다. 그런다음, 생성된 cDNA를 클로닝비히클내로 삽입하고 이를 사용하여 적합한 원핵 또는 진핵숙주를 형질전환시킨다. 생성된 cDNA “라이브러리”는 형질전환 숙주세포의 군으로 구성되며 이들 세포각각은 하나의 유전자 또는 유전자단편을 함유한다. 이론상으로, 전체라이브러리는 출발물질로서 사용된 mRNA혼합물에 존재하는 암호정보의 대표적인 샘플을 제공한다.

특정 DNA서열을 동정하기 위하여 핵산 또는 항체를 사용하여 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 일단 분리된 이들 DNA서열은 변형되거나 완전한 유전자 내로 결집될 수 있다. 다른 방도로서, 기술된 바와 같이 유전자의 특정단편을 유전자의 나머지 부분과 독립적으로 공학적으로 처리할 수 있다. 이들 공학적 조작된 유전자 단편에 의해 암호화된 단백질 단편은 자연계에서 발견될 수 없지만 이들은 바람직하지 못한 생리학적 상태의 치료에 중요한 이용성을 제공할 수 있다. 보체 활성과 연관된 질병의 치료 및/또는 예방을 가용성 보체 수용체의 유전공학조작이 그러한 한 사례이다.

유전자 또는 유전자 단편이 클로닝 된 후, 그 DNA를 발현벡터내로 삽입하고 이 곽제물을 사용하여 적절한 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 발현벡터는 본원에 정의된 발현조절서열을 갖는 것으로 특징지워지며, 그러므로 원하는 DNA서열이 그에 자동적으로 연결됐을 때 그 벡터는 이를 함유한 숙주 세포내에 더 목적하는 DNA서열에 의해 암호화된 생성물을 생성할 수 있다. 본 발명을 참조로하여 발현시켰을때 가용성 수용체 단백질이 형성되도록 하나의 암호서열의 단편을 결집시킬 수 있다. 이 원안의 SCR1 재조합 생성에 특히 효율적인 적용은 피어론의 1989년 10월 5일 공개된 PCT WO 89/09220 및 1991년 4월 18일에 공개된 WO 91/05047에서 찾아볼 수 있다.

재조합 생성물이 생성된 후 이 생성물을 회수하는 것이 바람직하다. 만일 이 생성물을 생성한 세포에 의해 그 생성물이 분비된다면, 이 생성물은 세포배양배지로부터 직접 회수할 수 있다. 만일 그 생성물이 세포내에 보유되어 있을 경우는 그 세포를 기계적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 물리적으로 분쇄하여 그 세포내 생성물을 수득한다.

단백질 생성물의 경우에 정제원안은 다른 단백질로부터 거의 유리된(이의 의미는 제제내의 총 단백질을 기준으로 80% 이상, 바람직하게는 95%순도는 말한다) 단백질 생성물을 제공할 뿐만 아니라 다른 숙주세포오염물, DNA, RNA, 피로겐을 허용되는 수준으로 제거하거나 줄여준다.

상기 언급된 바와 같이 본 발명의 수용체의 생성을 위해 여러가지 숙주 세포가 사용될 수 있다. 특정 숙주 세포의 선택은 특히 수용체의 성질, 합성속도, 분해속도 및 수용체의 발현을 유도하는 재조합벡터의 특징을 고려하여 이루어지는 통상의 기술수준이다. 숙주세포 발현체계의 선택은 대체로 사용되는 세포배양 절차의 성질에 의해 결정된다. 일단 발현시스템이 선택되었으면 생성방식을 배취식 또는 연속식, 스피너 또는 에어리프트, 액체상 또는 고정상으로든 선택할 수 있다. 따라서, 유동상 생체반응기, 유공성기 생체반응기, 롤러병 배양기, 또는 교반탱크 생체 반응기를 세포 미소수용체와 함께 또는 없이 다양하게 사용할 수 있다. 이런 선택기준은 세포 배양분야에서 잘 알려져 있다. 이에 관한 것은 본 발명 범위 밖이기 때문에 본 원에 상세히 기술하지 않는다. 본 발명은 세포배양배지로부터 보체 수용체를 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 언급된 바와 같이 본 발명은 특히 보체 수용체 단백질의 정제 및 분석에 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 적용에 관한 것이다. 수성 용매중의 소수성 분자는 자가 결합한다. 이러한 결합은 소수성 상호작용에 기인한다. 단백질과 같은 거대분자가 표면상에 거대한 소수성 패취를 예상되는 친수성 그룹과 함께 갖는다. HIC는, 부분적으로는 크로마토그래피 지지체에 연결된 소수성 리간드와 그들 패취와의 상호작용에 기초를 두고 있다. 매트리스에 연결된 소수성 리간드는 HIC지지체, HIC겔 또는 HIC컬럼으로서 본원에서 다양하게 언급된다. 단백질과 HIC지지체 사이의 상호작용 세기는 단백질상의 비-극성표면대 극성표면의 비율의 함수일뿐만 아니라 비극성 표면의 분포에 의한 것임은 자명하다.

HIC컬럼의 제조에 많은 매트릭스를 사용할 수 있으며, 가장 많이 사용되는 것은 아가로즈이다. 실리카 및 유기중합체 수지가 사용될 수 있다. 유용한 소수성 리간드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 탄소수 약 2 내지 10의 알킬그룹(예, 부틸, 프로필 또는 옥틸) 또는 아릴그룹(예, 페닐)이 포함된다. 겔 및 컬러용의 통상적인 HIC상품을 스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 엘케비 에비로부터 상품명 부틸-세파로즈, 페닐-세파로즈 CL-4B, 옥틸-세파로즈FF 및 페닐-세파로즈(SEPHAROSE) FF로서, 일본국 토쿄 소재의 토쇼 코포레이션으로부터 상품명 토요펄(TOYOPEARL) 부틸 650M(Fractogel TSK Butly-650) 또는 TSK-겔페닐-5PW로서, 이스라엘 레호보트 소재의 마일즈-예다로부터 상품명 알킬-아가로즈(여기서, 알킬 그룹은 2 내지 10개의 탄소원자를 함유한다)로서, 미합중국 뉴져지 필립스버그 소재의 제이. 티. 베이커로부터 상품명 베이커본드 WP-HI-프로필(Bakerbond WP-HI-proply)로서 구입할 수 있다.

또한, 통상의 화학적 방법을 사용하여 원하는 HIC컬럼을 제조할 수 있다. 예를들면, 문헌[Er-elL, Z. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 49 : 383(1972)]에 교시된 바와 같이 알킬아민과 결합시킴으로써 아가로즈를 시아노겐 브로마이드 활성화 시킨 후 하기 형태의 매트릭스/리간드 결합을 형성할 수 있다 :

상기식에서, M은 아가로즈와 같은 매트릭스이다. 다른 방법으로서, 글리시딜 에테르 결합절차[Ulbrich, V. et al. Coll. Czech, Chem. Commum. 9 : 1466(1964)]에 따라 하기 형태의 결합을 제조할 수 있다 :

상기식에서, M은 아가로즈와 같은 매트릭스이고, A는 아릴이다. 요약하면, 보통 아가로즈인 겔을 디옥산과 같은 유기용매에 옮긴다. 이것은 부크너(Buchner) 깔대기 상에서 단계별로 수행한다(100mL 침층된 겔에 100mL 분량씩) : (1) 물-디옥산(4 : 1)으로 일회 세척, (2) 물-디옥산(3 : 2)으로 일회 세척, (3) 물-디옥산(2 : 3)으로 일회 세척, (4) 물-디옥산(1 : 4)으로 일회 세척 및 (5) 디옥산으로 칠회 세척. 100mL 디옥산을 100mL의 침층겔에 첨가하고 디에틸 에테르중의 보론 트리플루오라이드 에테레이트의 48% 용액 2mL를 첨가한 다음 5분동안 교반시킨다. 디옥산 10mL중에 용해된 적절한 글리시딜 에테르 1mL를 분리깔대기로부터 적가한다. 반응은 약 40분 진행한다. 이 반응후에, 유도체화된 겔을 수성 환경하에 상기 단계(4) 내지 (1)을 역으로 실시하고 마지막으로 물중에서 세척하여 마무리한다. 겔에 결합되는 리간드의 양은 반응혼합물에 첨가된 글리시딜 에테르의 양을 바꾸어 줌으로써 조절할 수 있다. 이 반응은 일반적으로 다음과 같이 나타낼 수 있다 :

상기식에서, M은 아가로즈와 같은 매트릭스이고 R은 알킬 또는 아릴이다.

리간드 밀도는 상호작용의 세기에 뿐만아니라, 컬럼의 성능에 영향을 미친다는 점에서 중요한 변수이다. 시판되고 있는 페닐 또는 옥틸 페닐겔의 리간드 밀도는 40μmoles/mL겔 베드의 차수에 따른다. 겔 성능은 목적하는 특정 단백질 뿐만아니라 pH, 온도 및 염농도의 함수이지만 일반적으로 겔 3-20mg/mL의 범위에 속한다고 예상될 수 있다.

특정 겔의 선택은 전문가에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 단백질과 HIC리간드의 상호작용 세기는 알킬리간드의 쇄길이에 비례하여 증가하지만 분리하는데 가장 적합한 것은 탄소수 약 4 내지 약 8의 리간드이다. 비록 선별성은 pi-pi의 단백질상의 방향족그룹과의 상호작용 가능성 때문에 아주 상이할 수 있지만 페닐그룹은 펜틸그룹과 거의 동일한 소수성을 가진다.

HIC컬럼에 단백질의 흡착은 높은 염농도에 의해 증가될 수 있으나 실질적인 농도는 단백질의 성질 및 특정된 HIC리간드에 따라 다양한 범위에서 변화시킬 수 있다. 여러가지 이온이 소수성 상호작용(염석효과)을 촉진하거나 물의 구조를 파괴(카오트로픽 효과)하여 소수성 상호작용의 약화를 유도하는가의 여부에 따라 소위 소용성 시리즈로 배열할 수 있다. 양이온들은 염석효과의 증가 측면에서 그 순서가 다음과 같다 : Ba²⁺〈Ca²⁺〈Mg²⁺〈Li⁺〈Cs⁺〈Na⁺〈K⁺〈Rb⁺〈NH₄ ⁺. 음이온들은 카오트로픽 효과의 증가측면에서 그 순서가 다음과 같다 : PO₄ ^3-＜SO₄ ^2-＜CH₃COO^2-＜Cl^-＜Br^-＜NO₃ ^-＜ClO₄ ^-＜I^-＜SCN^-. 따라서, 상호작용의 세기에 영향을 주는 염을 다음의 관계식으로 나타낼 수 있다 :

일반적으로, 약 0.75 내지 약 2M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M NaCl의 염농도가 유용하다.

일반적으로 온도의 감소는 상호작용을 감소시키지만, HIC 분리에 미치는 온도의 영향은 간단하지 않다. 그러나, 온도를 높임으로써 발생황산암모늄는 어떠한 이점도 그러한 온도증가가 단백질의 활성에 미칠 수 있는 역효과로 인해 상쇠될 수 있다.

용출은 단계별로든 구배의 형태로든 여러가지 방법으로 달성될 수 있다; a) 염농도를 변화시킴으로써, (b) 용매의 극성을 변화시킴으로써, 또는 (c) 세정제를 첨가함으로써, 염농도를 감소시킴으로써 흡착된 단백질은 증가하는 소수성의 순서로 용출된다. 극성에서의 변화는 에틸렌 글리콜 또는 (이소)프로판올과 같은 용매의 첨가에 의해 그러므로써 소수성 상호작용의 세기를 감소시킴으로써 달성할 수 있다. 세정제는 단백질의 치환제로서 작용하며 주로 막 단백질의 정제와 관련하여 사용되왔다.

상기 언급된 바와 같이 HIC는 다른 단백질 정제 개술과 병합하여 사용되었을 때 특히 유용하다. 다시 말하면 HIC는 다른 단백질 정제절차에 의해 부분적으로정제되어온 물질에 응용하는 것이 바람직하다. 용어 “부분적으로 정제된”은 목적하는 단백질이 적어도 5중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 가장 바람직하게는 적어도 45중량% 존재하는 단백질 제제를 의미한다. 따라서, HIC의 응용은 보체 수용체 단백질을 위한 전체 정제원안에 최상임이 자명하다. 예를들면, 세호배양배지의 샘플을 부분정제후 HIC를 적용하는 것이 융용한 것으로 밝혀졌다. 용어 “세포배양배지”는 세포성장 및/또는 세포유지를 지탱해오고 분비산물을 함유하고 있는 세포배양배지를 뜻한다. 이러한 배지의 농축샘플을 하나 이상의 단백질 정제단계에 적용한 후 HIC단계에 적용시킨다. 샘플은 일단계로서 이온교환 크로마토그래피에 적용시킬 수 있다. 상기 언급된 바와 같이 여러가지 음이온 또는 양이온 치환체는 크로마토그래피용 음이온 또는 양이온 지지체를 형성하기 위하여 매트릭스에 접착시킬 수 있다. 음이온 교환 치환체에는 디에틸아미노에틸(DEAE), 사급 아미노에틸(QAE) 및 사급아민(Q) 그룹이 포함된다. 양이온교환 치환체로서는 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)가 포함된다. DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52와 같은 셀룰로즈 이온교환 수지가 영국 켄트 메이드스톤 소재의 와트만 리미티드로부터 입수할 수 있다. 세파덱스기본 및 가교된 이온교환기가 또한 알려져 있다. 예를들면, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-세파덱스및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세파로즈이 파마시아 에비로부터 구입가능하다. 또한, 토요펄 DEAE-650S 및 토요펄 CM-650S와 같은 DEAE 및 CM 유도체화된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체가 미합중국 펜실바니아 필라델피아 소재의 토소 하스 캄파니로부터 구입가능하다. 이온지지체로부터의 용출은 보통 염의 첨가를 수반하고 전술된 바와 같이 HIC는 증가된 염농도하에서 강화되기 때문에, 이온교환 크로마토그래피 단계 또는 다른 염증재된 정제단계후 HIC단계의 도입이 특히 바람직하다. 양이온교환 크로마토그래피단계 및 황산 암모늄 침전단계후 HIC의 적용이 바람직하다. 이들로 한정도는 것은 아니지만 이온교환 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 농축 및 동결건조를 포함하여 추가의 정제원안이 추가될 수 있다.

HIC로부터 얻어진 용출물을 추가의 이온교환 크로마토그래피에 적용시켰을때, 음이온 및 양이온 절차 둘다를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 언급된 바와 같이, 겔여과 크로마토그래피는 분자의 크기를 기초로하여 분리한다. 이것은 실제로 분자체의 형태이다. 매트릭스와 용질사이의 상호작용이 없는 것이 바람직하며, 그러므로 완전히 불활성인 매트릭스물질이 바람직하다. 또한 매트릭스가 격자이고 고도로 다공인 것이 바람직하다. 대규모공정시에 격자성은 이 변수가 총유속을 설정하기 때문에 가장 주용하다 종래의 물질(예, 세파덱스 또는 바이오-겔)이 충분히 불활성이고 기공 크기의 범위로 이용되지만 이들겔은 비교적 연질이고 대규모정제에 특히 적합하지 않다. 보다 최근에 격자성이 증가된 겔이 개발되었다(예, 세파크릴, 우트로겔, 프락토겔및 수퍼로스). 이들 모든 물질은 입자크기로 이용되고 있으며, 종래의 지지체에서 이용되오던 것보다 크기가 작음에 따라 보다 큰 유속에서도 해리가 유지된다. 토요펄 HW시리즈 매트릭스(토소 하스제품)가 바람직하다.

단지 예시의 목적으로 본 발명을 가용성 형태의 보체 수용체를 정제하는데 적용하였다. 리더, LHR-A, LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR 29, SCR30 영역까지를 함유하고 막전이 영역의 제일 알라닌 잔기를 포함하고, 1989년 10월 5일에 공개된 국제특허원 공개번호 WO 89/09220(피어론 등)의 플라스이드 pBSCR1c내의 CR1 암호서열에 상응하는 가용성 CR1 작제물(이하 “TP10HD”라고 한다)에 적용하였다. TP10HD를 생성하기 위한 재조합 시스템의 작제는 상기 언급된 PCT특허원에 상세히 기술되어 있으며 다음과 같이 요약된다.

CHO세포를 트립신처리하고 60mm디쉬당 5×10⁵개로 플레이팅한 후 성장 배지 1% 스터글루타민(043-05030), 1% 스톡 펜/스트렙(043-05070) 및 10% 소태반 혈청(011-6290)을 함유한 Hams F12영양배지(041-05070), (영국 스코틀랜드 패이슬레이 소재의 깁코로부터 입수)에, 37℃하에, 5% CO₂/95% 공기의 대기하에 습식 배양기에서 성장시켰다. 21시간 후에, 이 세포들을 DNA 형질감염을 위해 사용하였다. pBSCR1c로부터의 sCR1암호 서열을 함유한 발현 플라스미드를 pSV2dhfr과 함께 dhfr-요구 차이니즈 햄스터 난소세포구(CHODUXBII)에 형질감염시켰다. 형질감염은 성장배지에 수행하고 문헌[DNA Cloning, D.M.Glover ed. (Chap. 15, C. Gorman)]에 기술된 바와같은 칼슘 공동침전/글리세롤 쇼크 절차를 수행하였다. pBSCR1c/pTCSgpt 및 pSV2dhfr로 형질감염 시킨 후, 세포를 선별절차 이전에 성장조건하에 성장배지에서 46시간 동안 유지시켰다.

선별 및 동시-증식 절차는 문헌[R.J.Kaufman, et al. (Mol. Cell. Biol. 5 : 1750-1759(1985)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 형질감염후 46시간 경과하여 세포를 선별배지 MEM ALPHA(041-02571), 1% 스톡 글루타민, 1% 스톡 펜/스트렙(043-05070) 및 투석된 소태반 송아지 혈청(220-6300AJ)(스코틀랜드 페이슬레이 소재의 깁코사로부터 입수)에 옮겼다. 세포를 dhfr⁺콜로니가 나타낼때까지 선별배지에서 8-10일동안 유지하였다, 콜로니가 설정되었을때 세포를 메토트렉세이트를 함유한 선별배지(A6770, 미합중국 미조리 세인트 루이스 소재의 시그마 케이스트리 캄파니로부터 입수)에 옮겼다. 초기의 메토트렉세이트 농도는 0.02μM이었고 단계별로 5μM로 높였다. 증식 절차동안에 성장세포로부터의 성장배지의 분취량을 ELISA로 TP10HD생성에 대해 검정하였다. 본 발명에 따른 정제용 배양배지를 공급하기 위하여 보체 수용체 분비 재조합 세포주 어떠한 것도(예, ATCC CRL 10052)사용할 수 있는 한편 특별한 세포주가 요구되는 것은 아니다.

TP10HD를 생성할 수 있는 형질감염 CHO세포주는 여러가지 세포배양기술에 의해 배양할 수 있다. 본 발명의 적용시에 특별한 배양방법은 중요하지 않지만 예시의 목적상 사용될 수 있는 세포배양의 한가지 방법은 미합중국 특허 제 4,861,714호, 제 4,863,856호, 제 4,978,616호 및 제 4,997,753호에 기술된 베락스(Verax) 유동상 기술에 내포된 연속 퍼퓨젼 공정이다. 이들 특허의 내용은 본원에 참조사항으로 인용된다. 따라서, 상술된 바와 같은 형질감염세포를 10% 소태반 혈청(FBS) 및 5mM메토트렉세이트(MTX)가 보충된 CCM-3배지(DMEM, Ham의 F-12, 소의 혈청알부민과 기타 영양보충물의 혼합물)에서 증식시킨다. 세포군을 생체반응기에 접촉하기에 충분한 세포주가 이용될 수 있을때까지 롤러병에서 증식시켰다. 접종하기에 앞서 S200생체반응기에 세정제처리(CIP) 및 스팀처리(SIP)를 수회 반복하였다. 이것을 5%FBS가 함유된 CCM-3배지로 채우고 450g의 미생물군체로 충진시켰다. 미생물군체를 접종하기전에 배지에서 배양하였다. 반응기에 세포를 접종하고 작동파라미터는 다음과 같이 하였다 : pH7.2, 37℃, 주입구(유동상의 바닥)용존 O₂100 내지 400토르, 출구(유동상의 상부)용존 O₂0 내지 200토르. 초기의 배취상에 이어, 글루코즈농도를 1.0g/L로 유리하도록 배지 퍼퓨젼을 주기적인 증가로 개시하였다. 이것은 S2000생반응기에 접종하기에 충분한 수의 세포가 반응기에 축적될때까지의 계속 수행하였다. CIP 및 SIP를 수행한 후, S-2000반응기에 5%FBS와 5mM MTX가 보충된 CCM-3 배지로 채우고 5000g의 미생물군체를 충진시켰다. 이들 미생물군체는 접종이전에 배지에서 배양해 두었다. 온도, 반응기 배치 및 용존 O₂의 관점에서 작용조건은 상기한 바와 같다.S-200반응기로부터의 미생물군체를 무균적으로 S-2000반응기로 옮겨 배취상을 개시하였다. 글루코즈 농도가 1.5g/L이하로 떨어졌을때, 글로코즈농도를 1.0g/L로 유지하기에 충분한 속도로 배지퍼퓨젼(CCM-3, 5%FBS 및 5mM MTX)을 개시함으로써 성장상을 개시하였다. 세포성장은 산소흡입율과 글루코즈 소비율을 측정하여 모니터하였다. 충분한 수의 세포가 반응기 내에 축적되었을때, 퍼퓨젼배지를 1% FBS 및 5mM MTX가 보충된 CCM-3의 임시배지로 바꾸어 주었다. 재차, 이 퍼퓨젼 속도를 1.0g/L의 글루코즈농도가 유지되도록 바꾸었다. 임시배지에서 추가로 성장시킨 후 퍼퓨젼배지를 5mM MTX가 보충된 CCM-3의 생장배지로 다시한번 바꾸었다. 퍼퓨젼속도는 1.0g/L의 글루코즈 농도를 유리하도록 증가시켰다. 그런후, 출구 용존 O₂또는 재순환 유속 세트포인트를 반응기에 대해 억제를 유지하도록 낮추었다. 생장단계는 전형적으로 약 60일간 계속한다.

4-8℃에 저장해둔 400 내지 1600L의 반응기 침윤물을 밀리포어 프로스탁 마이크로필트레이션 유니트를 통해 가공하였다. 이 작동으로부터의 세포-유리 침윤물을 초여과 단계에 적용하였다. 침윤물을 밀리포어 스피랄 운드 시스템으로 30-60배 농축시켰다. 농축후, 잔여물을 보유탱크내로 배수하고 이 시스템을 5-20L의 50mM인산염 완충액(pH7.5)로 채웠다. 이 시스템으로부터 세척완충액을 배수시키고 잔유물과 합하였다. 예비필터에 통과시켜 초여과 농축물을 여과하고 그런다음 0.22mm필터에 통과시켜 오토클레이브된 날진 병에 담았다. 800mL의 농축물을 각각 병에 분산시키고 동결시켜 저장해두었다.

전술한 바와 같이, 특별한 재조합 생성시스템 및 특별한 세포배양원안은 본 발명의 범위 밖이다. 상기 논의된 시스템 및 원안은 당업자가 이용할 수 있는 많은 옵션을 대표하는 것이며 이들은 단지 본 발명을 단지 예시하고자 본원에 포함된 것이다. 본 발명의 목적인 정제원안은 단지 통상적인 변형으로 다양한 재조합 보체 수용체 및 수용체-유사 단백질에 이들이 어떻게 생성되든 배양되든 상관없이 적용가능하다.

본 발명의 방법을 수행함으로써 수득된 정제된 보체 수용체 단백질은 다음의 성질을 가진다 : 1) 95중량% 이상의 CR단백질; 2) 4℃에서의 단백질분해에 적어도 3개월 이상 안정함; 3) 낮은 내독소(〈1 E.U./mg 단백질); 4) 적은 DNA(〈1pg/mg ; 단백질; 5) 비-CR 단백질 〈5중량; 및 6) 바이러스 불활성. 하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하여 준다. 그러나, 이들 실시예로 본 발명이 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.

[실시예 1]

[서론]

하기 요약된 절차는 세포배양배지 농축물로부터의 가용성 보체 수용체-1(sCR1)의 분리 및 정제를 위해 개발되었다. 이 방법은 숙주세포, 세포배양배지 또는 기타 천연물질로부터 유도된 불순물을 제거해 주면서 〉95% 단백질 순도의 sCR1을 제조하기 위해 설계된 것이다. 회수절차는 양이온 및 음이온 교환, 소수성 상호작용 및 크기별 배제 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전 및 두번의 바이러스 불활성화 처리를 포함한 9단계로 이루어진다. 각각의 단계 이하에 상세히 기술되어 있다. 단계 1 내지 5는 2-8℃에서 수행하며 단계 6 내지 9는 20-25℃에서 수행하였다.

[단계 1 : 배지 예비처리]

배양배지농축물에 1N HCl를 첨가하면서 교반시켜 pH를 5.2로 조절하였다. 첨가가 완결됐을때 계속 교반하고 10분동안 pH를 모니터하였다. pH조절로 육중한 침전물이 생성되었다. 차례로 연결된 일련의 세개 밀리포어 폴리가드-CR필터(5, 0.5, 0.1)에 통과시켜 미세여과시켜 정화를 달성하였다. 여과물에서 sCR1이 회수되었다.

배지 농축물을 산성화 및 여과시켜 비-sCR1 단백질 및 비-단백질성 물질을 제거하고, sCR1를 함유한 여과물을 후속의 S세파로즈 크로마토그래피에 적절한 pH로 조절하였다.

[단계 2 : 파마시아 S 세파로즈 급속 유동 크로마토그래피]

완충액 A으로 미리 평형시켜둔 파마시아 S 세파로즈 급속유동겔의 컬럼상에 60cm/hr의 유속 및 〈3gsCR1/L 베드용적의 용량으로 pH5.2 여과물을 부하시켰다. 이 컬럼을, 150cm/hr로, 3 내지 5회 베드용적의 완충액 A 및 5 내지 10회 베드용적의 완충액 B로 차례로 세척하였다. sCR1은 컬럼에 결합하고 완충액 C로 용출시켰다. 컬럼을 3회 베드용적의 완충액 D로 세척하여 스트리핑하였다.

S세파로즈 크로마토그래피하여 대부분의 세포 및 배지 유도된 불순물을 제거하고 완충액 C컬럼 용출물 내의 sCR1을 추가의 공정을 위해 농축시켰다.

[단계 3 : 황산 암모늄 침전]

완충액 E를 첨가하여 S세파로즈 완충액 C 용출물을 1.2M 황산 암모늄으로 조절하였다. 첨가가 완결되었을때, 교반을 중단하고 혼합물을 밤새 정체시켜준다.

8000×GDPTJ 10분간 원심분리하여 sCR1을 함유한 침전물을 수거하였다.

펠렛물질을 약 4L의 완충액 F에서 온화하게 교반시켜 재현탁시켰다. 용액의 흡광도가 280nm에서 1.5 O.D.가 될때까지 추가로 완충액 F를 첨가하였다. 용액을 밤새 교반시킨 후, 밀리포어 폴리가드-CR 0.1μ필터를 이용하여 여과시켰다.

황산암모늄 침전시켜 추가의 불순물을 제거하고 소수성 상호작용 크로마토그래피용 sCR1을 제조하였다.

[단계 4 : 토요펄 부틸-650M 크로마토그래피]

완충액 E를 첨가하면서 교반시켜 재용해되고 여과된 황산암모늄 펠렛을 0.8M 황산암모늄으로 조정하였다.

첨가가 완결되었을 때, 혼합물을 150cm/hr의 유속 및 ≤4g 총단백질/L 컬럼용적의 용양으로 완충액 G로 예비평형된 토요펄 부틸-650M겔의 컬럼상에 적하하였다. 완충액과 컬럼을 2-8℃에 유지시켰다. 적하가 완결되었을때 컬럼을 2-3회 베드용량의 완충액 G, 3회 베드용량의 완충액 H로 세척하고 결합된 sCR1을 완충액 I으로 용출시켰다.

[단계 5 : 바이러스 불활성파 및 파마시아 세파덱스 G 25 크로마토그래피]

고체 GuHCl을 부틸완충액 I 용출물에 약 2M의 농도로 첨가하고 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. pH를 모니터하고 필요한 경우 2.5N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하였다.

GuHCl이 완전히 용해될때까지, 용액을 6분간 유지하고, 60cm/hr의 유속으로 완충액 J로 예비평형된 파마시아 세파덱스 G25의 컬럼상에 적하한다. 적하용량은 세파덱스 G25 컬럼용량이 세파덱스 G25컬럼용량의 25%를 초과해서는 안된다.

sCR1이 용출된 후, “염” 피크가 용출되고 전도도가 최저치로 되돌아 올때까지 완충액 J로 세척하였다. 2.5M NaOH를 첨가하여 세파덱스 G25 생성물의 pH를 11로 조절하고, 용액을 16분간 pH11로 유지한다음 2.5M HCl을 사용하여 pH를 9.0으로 재조정하였다. 이 물질은 음이온 교환 크로마토그래피에 적용된다.

어떠한 바이러스라도 존재하는 경우 GuHCl 및 pH11 처리하여 레트로바이러스를 불활성화 시키고, 세파덱스 G25 크로마토그래피하여 DEAE 토요펄 크로마토그래피용 sCR1 생성물을 얻는다.

[단계 6 : 토요펄 DEAE-650S 크로마토그래피]

150cm/hr의 유속 및 ≤6g 단백질 /L컬럼용적의 용량에서 완충액 J로 예비평형된 토요펄 DEAE-650S겔의 컬럼상에 세파덱스 G25생성물을 적하시켰다. 적하후 컬럼을 3회 컬럼베드용적의 완충액 J로 세척하였다. 결합된 sCR1을 100% 완충액 J로 시작해서 100% 완충액 K로 끝나는 5회 컬럼용적 구배로 용출시켰다. 이 컬럼을 3회 베드용적의 완충액 L로 세척하여 스트리핑하였다.

토요펄 DEAE 크로마토그래피하여 오염 단백질, DNA 및 잠정 바이러스 불순물을 제거하였다.

[단계 7 : 토요펄 CM-650S 크로마토그래피]

DEAE생성물을 2회 용적의 완충액 M으로 희석시키고 2.5N HCl로 pH를 5.5로 조절하였다. 150cm/hr의 유속 및 ≤11g 단백질/L컬럼용적의 용량에서 완충액 M으로 예비 평형된 토요펄 CM-650S겔의 컬럼상에 희석 혼합물을 적하시켰다. 적하후 3회 컬럼베드용량의 완충액 M으로 세척하고 결합된 sCR1을 100% 완충액 M으로 시작해서 100% 완충액 N으로 끝나는 5회 컬럼용량 구배로 용출시켰다. 컬럼을 완충액 0의 3회 베드용량으로 스트리핑하였다. 생성물을 함유한 용출물을 1/10 용량의 0.5M 이가 인산나트륨으로 중화시키고 이를 크기별 배제 크로마토그래피에 적용시킨다.

토요펄 CM 크로마토그래피하여 오염 단백질, DNA 및 잠재적인 바이러스 불순물을 제거하였다.

[단계 8 : 토요펄 HW65S 크로마토그래피]

30/cm/hr의 유속으로 완충액 F로 예비 평형된 토요펄 HW65S의 컬럼상에 토요펄 CM생성물을 적하시켰다. 적하용량은 전체 토요펄 HW65S 컬럼용량의 5%를 초과해서는 안된다. 흡광도가 최대 흡광도의 10%로 감소될때까지 전체 생성물 피크를 수거하였다. 이 물질은 최종농축에 사용한다.

크기별 배제 크로마토그래피는 최종 미량의 저분자량 단백질 불순물을 제거해주고 sCR1을 최종 목적완충액으로 교환시켜주는 역할을 한다.

[단계 9 : 농축 및 최종여과]

100K MWCO 오메가 막이 끼워져있는 파마시아 미니세트 울트라필트레이션 유니트를 사용하여 토요펄 HW65S 풀을 5-6mg/mL로 농축시킨다. 농축된 생성물을 밀리포어 0.2μ밀리팩 필터를 통해 여과시켰다.

[완충액]

완충액 A 20mM 인산나트륨, 60mM NaCl, pH5.2

완충액 B 20mM 인산나트륨, 100mM NaCl, pH6.0

완충액 C 20mM 인산나트륨, 500mM NaCl, pH7.0

완충액 D 1M NaCl

완충액 E 3M 황산암모늄, 100mM 인산나트륨, pH7.0

완충액 F 10mM 인산나트륨, 0.9% w/v NaCl, pH7.0

완충액 G 0.8M 황산암모늄, 100mM 인산나트륨, pH7.0

완충액 H 0.7M 황산암모늄, 100mM 인산나트륨, pH7.0

완충액 I 0.09M 황산암모늄, 100mM 인산나트륨, pH7.0

완충액 J 50mM 트리스/트리스.HCl, pH9.0

완충액 K 50mM 트리스/트리스.HCl, 0.2 M NaCl, pH9.0

완충액 L 50mM 트리스/트리스.HCl, 1.0 M NaCl, pH9.0

완충액 M 50mM MES/MES.Na, pH5.5

완충액 N 50mM MES/MES.Na, 0.25 M NaCl, pH5.5

완충액 O 50mM MES/MES.Na, 1.0 M NaCl, pH5.5

a 280nm에서의 흡광도결과, a_s=1.17mL mg^-1cm^-1;

ε₂₈₀=2.53×10⁵M^-1cm^-1

b ELISA 결과

c 아미노산 분석결과

Claims (49)

1. 보체 수용체 단백질을 함유한 혼합물을 차례로 양이온 크로마토그래피 지지체, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체 및 크기별 배제 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고 그 단백질을 각각의 지지체로부터 선별적으로 용출시켜 언급된 혼합물로부터 보체 수용체 단백질을 정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 수용체가 CR1, CR2, CR3 및 CR4로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 수용체가 CR1 또는 이의 단편인 방법.
4. 제3항에 있어서, 수용체가 CR1의 가용성 단편인 방법.
5. 제4상에 있어서, 수용체가 TP 10HD인 방법.
6. 제1항에 있어서, 양이온 크로마토그래피 지지체가 CM-23-, CM-32-, CM52-셀룰로즈, CM- 및 SP-세파덱스, CM- 및 S-세파로즈 및 CM-650S 토요펄로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 용출이 완충염용액의 첨가에 의해 수행되는 방법.
7. 제6항에 있어서, 지지체가 S-세파로즈이고 염이 NaCl인 방법.
8. 제6항에 있어서, 염용액이 20mM 인산나트륨, 500mM NaCl, pH7.0인 방법.
9. 제1항에 있어서, HIC 지지체가 알킬 C₂-C₈아가로즈, 아릴-아가로즈, 알킬-실리카, 알킬 유기 중합체 수지로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
10. 제9항에 있어서, 지지체가 부틸-, 페닐- 및 옥틸-세파로즈 및 부틸-, 페닐- 및 에테르-토요펄로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
11. 제10항에 있어서, 지지체가 부틸-토요펄인 방법.
12. 제1항에 있어서, HIC 지지체가 부틸-토요펄이고 단백질을 저염완충액으로 선별용출시키는 방법.
13. 제12항에 있어서, 용출염이 황산암모늄이고 완충액이 인산나트륨, pH7인 방법.
14. 제13항에 있어서, 단백질을 0.09M 황산암모늄이 함유된 100mM 인산나트륨 완충액, pH7.0으로 선별용출시키는 방법.
15. 제4항에 있어서, TP10HD를 함유한 일부 정제된 혼합물 100mM 인산나트륨, pH7.0 중의 0.8M(NH₄)₂SO₄로 평형된 부틸-토요펄 컬럼상에 부하시키고, TP10HD를 0.09M(NH₄)₂SO₄가 함유된 100mM 인산나트륨 완충액, pH7.0으로 용출시키고, 컬럼을 평형완충액 및 100mM 인산나트륨, pH7.0 중의 0.7M(NH₄)₂SO₄로 차례로 세척하고, 용출물을 컬럼분획물로서 수거하여, 언급된 혼합물로부터 TP10HD를 정제하는 방법.
16. 제15항에 있어서, TP10HD를 함유한 수거된 분획물을 모으는 추가의 단계를 수행하는 방법.
17. 제1항에 있어서, 크기별 배제 크로마토그래피 지지체가 세파크릴 유트로겔, 프락토겔, 슈퍼로즈 및 토요펄 HW65S로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
18. 제17항에 있어서, 지지체가 토요펄 HW65S이고 용출을 10mM 인산나트륨 0.9% w/v NaCl, pH7로 수행하는 방법.
19. 보체 수용체 단백질을 함유한 세포배양배지를 (a) 일차 양이온 교환 크로마토그래피, (b) 황산암모늄 침전, (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피, (d) 음이온 교환 크로마토그래피, (e) 이차 양이온 크로마토그래피 및 (f) 크기별 배제 크로마토그래피에 차례로 적용시켜 언급된 배지로부터 보체 수용체 단백질을 정제하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 일차 양이온 교환 크로마토그래피가 CM-23-, CM-32-, CM52-셀룰로즈, CM- 및 SP-세파덱스, CM- 및 S-세파로즈 및 CM-650S 토요펄로 이루어진 그룹 중에서 선택된 지지체를 사용하고 용출이 완충염용액에 의해 수행되는 방법.
21. 제20항에 있어서, 지지체가 S-세파로즈이고 염이 NaCl인 방법.
22. 제20항에 있어서, 염용액이 인산나트륨, 500mM NaCl, pH7.0인 방법.
23. 제19항에 있어서, 황산암모늄이 1.2M의 농도로 존재하는 방법.
24. 제19항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체가 알킬 C₂-C₈아가로즈, 아릴-아가로즈, 알킬-실리카, 알킬 유기 중합체 수지로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
25. 제24항에 있어서, 지지체가 부틸-, 페닐- 및 옥틸-세파로즈 및 부틸-, 페닐- 및 에테르-토요펄로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
26. 제25항에 있어서, 지지체가 부틸-토요펄인 방법.
27. 제19항에 있어서, 지지체가 부틸-토요펄이고 단백질을 저염완충액으로 선별용출시키는 방법.
28. 제27항에 있어서, 용출염이 황산암모늄이고 완충액이 인산나트륨, pH7인 방법.
29. 제28항에 있어서, 단백질을 0.09mM 황산암모늄이 함유된 100mM 인산나트륨 완충액, pH7.0을 함유하는 완충액으로 선별용출시키는 방법.
30. 제1항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 DEAE-셀룰로즈, DEAE-, QAE-세파덱스, DEAE-, Q-세파로즈 및 토요펄 DEAE 650S로 이루어진 그룹 중에서 선택된 지지체를 사용하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 지지체가 토요펄 DEAE 650S인 방법.
32. 제19항에 있어서, 이차 양이온 교환 크로마토그래피가 지지체로서 토요펄 CM650S를 사용하는 방법.
33. 제19항에 있어서, 크기별 배제 크로마토그래피가 세파크릴 유트로겔, 프락토겔, 슈퍼로즈 및 토요펄 HW65SV로 이루어진 그룹 중에서 선택된 지지체를 사용하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 지지체가 토요펄 HW65S인 방법.
35. (a) 배양세포배지를 농축시키고; (b) 보체 수용체 단백질을 양이온 크로마토그래피 지지체상에 흡착시키고; (c) 흡착된 단백질을 일회 이상의 완충액으로 세척하고; (d) 세척된 단백질을 용출시키고; (e) 단백질을 황산암모늄으로 침전시키고; (f) 침전된 단백질을 재용해시키고; (g) 용해된 단백질을 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체상에 흡착시키고; (h) 단백질을 선별적으로 용출시키고; (i) 단계(h)의 용출물을 음이온교환지지체상에 흡착시키고; (j) 흡착된 단백질을 용출시키고; (k) 단계(j)의 용출물을 양이온 교환 지지체상에 흡착시키고; (l) 흡착된 단백질은 용출시키고; (m) 단계(l)의 용출물을 크기별 배제 크로마토그래피에 적용시키고; (n) 이로부터 단백질을 회수하여, 언급된 배지로부터 보체 수용체 단백질을 정제하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 존재할 수 있는 바이러스를 불활성화 시키는 임의 단계를 포함하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계를 단계(h)후 및 단계(i)전에 수행하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계가 용출물을 염기로 처리 및 구아니딘 염산염으로 처리를 포함하는 방법.
39. 제35항에 있어서, 단계(b)의 양이온 교환지지체가 설포네이트-치환된 세파로즈인 방법.
40. 제35항에 있어서, 단계(d)로부터의 용출물을 1.2M 황산암모늄으로 조정하는 방법.
41. 제35항에 있어서, 단계(k)의 양이온 교환 지지체가 카르복시메틸, 설포에틸, 솔포프로필 및 포스페이트 치환된 셀룰로즈수지, 세파덱스, 세파로즈 및 토요펄로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
42. 제41항에 있어서, 양이온 지지체가 토요펄 CM-650S인 방법.
43. 제35항에 있어서, 음이온 교환지지체가 디에틸아미노에틸, 사급 아미노에틸 및 사급 아민 치환된 셀룰로즈 수지, 세파덱스, 세파로즈 및 토요펄로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
44. 제43항에 있어서, 음이온 교환지지체가 디에틸아미노에틸-치환된 토요펄인 방법.
45. 제35항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체가 알킬 C₂-C₈-아가로즈, 아릴-아가로즈, 알킬-실리카, 알킬-유기 중합체 수지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
46. 제45항에 있어서, 지지체가 부틸-, 페닐- 및 옥틸-세파로즈 및 페닐-, 에테르- 및 부틸-토요펄롤 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
47. 제46항에 있어서, 지지체가 부틸-토요펄인 방법.
48. 제35항에 있어서, 크기별 배제 크로마토그래피가 토요펄 HW65S를 사용하는 방법.
49. 제35항에 있어서, 초여과에 의해 크로마토그래피 단계(m)으로 부터 단백질 함유분획을 모으고 농축시켜 단백질을 회수하는 방법.