PT643608E

PT643608E - Purificacao de proteinas

Info

Publication number: PT643608E
Application number: PT93908538T
Authority: PT
Inventors: Gail Folena-Wasserman; John H O'grady; Thomas M Smith; John Lifter
Original assignee: Avant Immunotherapeutics Inc
Priority date: 1992-03-24
Filing date: 1993-03-24
Publication date: 2000-11-30
Also published as: KR100241172B1; FI109202B; CA2132533A1; WO1993018835A1; EP0643608A4; CA2132533C; FI944412A; TW321651B; JP3335629B2; MX9301655A; ZA932015B; ATE193839T1; NZ251601A; ES2149206T3; AU3932493A; DK0643608T3; NO943546D0; DE69328864D1; JPH07505469A; NO943546L

Description

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“Purificação de proteínas”

Campo do invento

Este invento refere-se ao campo da purificação de proteínas. Mais especificamente, este invento refere-se à aplicação de cromatografia em combinação para a purificação das proteínas do receptor para o complemento. Em particular, este invento refere-se à aplicação de diversas combinações de cromatografia de permuta iónica, precipitação facultativa, HIC e de exclusão por tamanho, para a purificação de moléculas semelhantes às do receptor para o complemento.

Antecedentes do invento

Historicamente, os esquemas para purificação de proteínas têm sido baseados em diferenças nas propriedades moleculares de tamanho, carga e solubilidade entre a proteína a ser purificada e os contaminantes proteicos indesejados. Protocolos baseados nestes parâmetros incluem cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de permuta iónica, precipitação diferencial e similares. A cromatografia de exclusão por tamanho, também conhecida como cromatografia de filtração por gel ou de permeaçào por gel, conta com a penetração de macromoléculas numa fase móvel para os poros de partículas em fase estacionária. A penetração diferencial é uma função do volume hidrodinâmico das partículas. Por conseguinte, sob condições ideais, as moléculas maiores são excluídas do interior das partículas enquanto que as moléculas mais pequenas têm acesso a este volume e a ordem da evasão pode ser prevista com base no tamanho da proteína dado existir uma relação linear entre o volume de evasão e o logaritmo do peso molecular. São úteis na prática deste invento suportes cromatográficos para exclusão por tamanho baseados em dextranos reticulados, e.g. SEPHADEX®, em pérolas de agarose esféricas, e.g. SEPHAROSE® (ambos comercialmente disponíveis a partir de Pharmacia AB., Uppsala, Suécia), baseados em poliacrilamidas reticuladas, e.g. BIO-GEL® (comercialmente disponível a partir de BioRad Laboratories, Richmond, Califórnia), ou baseados em copolímero de etilenoglicol-metacrilato, e.g. TOYOPEARL HW65S (comercialmente disponível a partir de ToyoSoda Co., Tóquio, Japão).

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Os métodos por precipitação baseiam-se no facto de, nas misturas de proteínas em bruto, ser provável que as solubilidades das proteínas individuais variem amplamente. Embora a solubilidade de uma dada proteína num meio aquoso dependa de uma diversidade de factores, para o objectivo desta discussão pode ser afirmado, duma forma geral, que uma proteína será solúvel se a sua interacção com o solvente for mais forte do que a sua interacção com as moléculas proteicas do mesmo tipo ou de tipo semelhante. Sem desejar ficar vinculado a qualquer teoria mecanicista particular descritiva do fenómeno da precipitação, verifica-se contudo que a interacção entre uma proteína e as moléculas de água ocorre por meio de ligações de hidrogénio com diversos tipos de grupos sem carga e electrostaticamente como dipolos, com grupos com carga, e que precipitantes tais como sais de catiões monovalentes (e.g. sulfato de amónio) competem com as proteínas pelas moléculas de água, deste modo em concentrações salinas elevadas, as proteínas tomam-se “desidratadas” reduzindo a sua interacção com o meio aquoso e aumentando a agregação com proteínas iguais ou semelhantes tendo como resultado a precipitação a partir do meio. A cromatografia de permuta iónica envolve a interacção de grupos funcionais com carga na amostra com grupos funcionais iónicos de carga oposta sobre uma superfície adsorvente. São conhecidos dois tipos gerais de interacção. A cromatografia de permuta aniónica mediada por cadeias laterais de aminoácidos carregados negativamente (e.g. ácido aspártico e ácido glutâmico) interagindo com superfícies carregadas positivamente, e a cromatografia de permuta catiónica mediada por resíduos de aminoácidos carregados positivamente (e.g. lisina e arginina) interactuando com superfícies carregadas negativamente.

Mais recentemente foram desenvolvidas técnicas de cromatografia por afinidade e de cromatografia por interacção hidrófoba a fim de suplementar os protocolos cromatográficos de exclusão por tamanho e de permuta iónica mais tradicionais. A cromatografia por afinidade conta com a interacção da proteína com um ligando imobilizado. O ligando pode ser específico para a proteína de interesse particular, caso em que o ligando é um substrato, análogo do substrato, inibidor ou anticorpo. Altemativamente, o ligando pode ser capaz de reagir com um certo número de proteínas. Os referidos ligandos gerais, como monofosfato de adenosina, difosfato de adenosina, dinucleótido nicotina adenina ou certos corantes podem ser empregues a fim de recuperar uma classe particular de proteínas.

84 966 ΕΡ Ο 643 608 ί ΡΤ A cromatografia por interacção hidrófoba foi inicialmente desenvolvida após a observação de que proteínas podem ficar retidas sobre geles de afinidade os quais compreendam braços espaçadores de hidrocarboneto mas não possuam o ligando de afinidade. Embora neste campo o termo cromatografia hidrófoba seja por vezes utilizado, é preferido o termo cromatografia por interacção hidrófoba (HIC) dado que é a interacção entre o soluto e o gel que é hidrófoba, não o processo cromatográfico. As interacções hidrófobas são mais fortes sob uma força iónica elevada, logo, esta forma de separação é convenientemente executada após processos por precipitações salinas ou de permuta iónica. A evasão a partir de suportes para HIC pode ser levada a cabo por alterações no solvente, no pH, na força iónica, ou pela adição de agentes caotrópicos ou de modificadores orgânicos, tal como o etileno glicol. Uma descrição dos princípios gerais da cromatografia por interacção hidrófoba pode ser encontrada em US-A-3 917 527 e US-A-4 000 098. A aplicação da HIC à purificação de proteínas específicas é exemplificada por referência às seguintes descrições: hormona de crescimento humano (US-A-4 332 717), conjugados de toxina (US-A-4 771 128), factor anti-hemolítico (US-A-4 743 680), factor de necrose tumoral (US-A-4 894 439), interleucina-2 (US-A-4 908 434), linfotoxina humana (US-A-4 920 196) e espécies de lisozima (Fausnaugh, J. L. e F. E. Regnier, J. Chromatog., 359: 131-146 (1986)).

Yeh, C. G. et al., The Journal of Immunologv 146: 250-256 (1991) descrevem a purificação do sobrenadante de cultura de células contendo sCRl utilizando cromatografia de permuta catiónica. O invento fornece um método, tal como definido na presente reivindicação 1, com algumas concretizações preferidas sendo o objecto das reivindicações dependentes, sendo particularmente preferidas as concretizações de acordo com as reivindicações 5 e 8.

Descrição detalhada do invento

Este invento refere-se a técnicas para a purificação de proteínas, as quais apresentam aplicação na purificação em grande escala de proteínas do receptor para o complemento. O invento é particularmente útil dado que permite a recuperação de proteínas do receptor com pureza proteica >95%. O invento pode ser aplicado à purificação de um certo número de proteínas do receptor para o complemento e de proteínas semelhantes às do receptor para o complemento.

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ Ο complemento é um grupo de proteínas séricas, sequencialmente activadas por proteólise limitada, que são importantes efectores da imunidade humoral. A activação do complemento ocorre por interacção de componentes do complemento de actuação precoce com complexos antigénio/anticorpo. Os fragmentos proteolíticos resultantes desta activação, isolados ou com outras proteínas, activam proteínas do complemento adicionais, originando uma cascata proteolítica que recorda o funcionamento dos factores de coagulação do sangue. Altemativamente, o complemento pode ser activado por componentes da parede celular bacteriana, enzimas proteolíticos (e.g. plasmina) ou hidratos de carbono complexos (e.g. inulina). Um certo número de actividades biológicas são mediadas por componentes do sistema do complemento (e.g. citólise imunitária, produção de toxina anafilática, bacteriólise, quimiotaxia, hemólise, opsonização, e fagocitose). São conhecidas quatro classes de receptores para o complemento (CR) (CR1-CR4). O receptor para o complemento 1 (CRI) é um receptor para os componentes do complemento C3b e C4b. O receptor para o complemento 2 (CR2) é um receptor para o componente C3dg ou C3d. O receptor para o complemento 3 (CR3) é um receptor para C3bi. O receptor para o complemento 4 (CR4) é um receptor para o componente C3dg. O receptor para o complemento do tipo 1 (CRI) encontra-se presente nas membranas de eritrócitos, monócitos/macrófagos, granulócitos, células B, algumas células T, células dendríticas foliculares esplénicas, e podócitos glomerulares. O CRI liga o C3b e o C4b e é designado por receptor C3b/C4b. A sua sequência primária foi determinada (Klickstein et ai, J. Exp. Med.. 165: 1095-11 12 (1987), Klickstein et ai, J. Exn. Med,. 168: 1699-1717 (1988), Hourcade et al. J. Exn. Med.. 168: 1255-1270 (1988)). É composta por 30 repetições consensuais curtas (SCR) que contêm 60-70 aminoácidos, dos quais são conservados 29 da média de 65 aminoácidos por SCR. É proposto que cada SCR forma uma estrutura tridimensional em alça tripla através de ligações dissulfureto com a terceira e a primeira e a quarta e a segunda semi-cistinas em ligações dissulfureto. As SCR são adicionalmente organizadas em 4 repetições homólogas longas (LHR) de 7 SCR cada. Após uma sequência de comando, a molécula é composta pela LHR-A mais próxima do terminal N compreendendo um domínio de ligação para C4b, pelas duas repetições seguintes, LHR-B e LHR-C, compreendendo domínios de ligação para C3b, e pela LHR-D mais próxima do terminal C seguida por duas SCR adicionais, uma região trans-membrana putativa de 25 resíduos e uma extremidade citoplasmática de 43 resíduos. O CRI é um membro de uma superfamília caracterizada por homologia de SCR. Esta superfamília contém membros que também apresentam uma função de ligação a C3/C4, tais 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ como CR2, C4bp, factor Η. factor Β, e C2, bem como proteínas sem esta função, tais como receptor para a interleucina-2, p2-glicoproteína I, Clr, cadeia α da haptoglobina, e factor XHIb. O CRI é conhecido como sendo uma glicoproteína e a sua sequência de aminoácidos deduzida apresenta 24 locais potenciais para oligossacáridos ligados a N na região extracelular. No entanto, a síntese de CRI na presença de tunicamicina (Lublin et al., J. Biol. Chem. 261: 5736 (1986)) e a análise do teor em glucosamina (Sim, Biochem. J. 232: 883 (1985)) sugeriram que apenas 6-8 dos locais disponíveis se encontram de facto ligados a oligossacáridos. O término N da glicoproteína parece estar bloqueado.

Existem quatro alotipos diferentes do CRI que diferem em tamanho por incrementos de 30-50 kD. As frequências dos genes destes polimorfismos alélicos (alotipos) diferem na população humana (Holer et ai. Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 84: 2459-2463 (1987)). O alotipo F (ou A) é composto por 4 LHR e tem cerca de 250 kD; o alotipo maior S (ou B) contém uma quinta LHR que é uma quimera da metade 5’ de LHR-B e da metade 3’ de LHR-A e prevê-se que possua um terceiro local de ligação para C3b (Wong et ai, J. Exp. Med. 169: 847 (1989)), e tem cerca de 290 kD. O alotipo mais pequeno F’ (ou C) apresenta incidência aumentada em doentes com lúpus eritematoso sistémico (LES) (Van Dyne et ai, Clin. Exp. Immunol. 68: 570 (1987) e Dykman et cã., Proc. Natl. Acad. Sei.. USA 80: 1698 (1983)) e resulta o mais provavelmente da delecção de LHR-B e de um local de ligação para C3b.

Uma forma solúvel de CRI ocorrendo naturalmente foi detectada no plasma de indivíduos normais e de certos indivíduos com LES (Yoon & Fearon, J. Immunol. 134: 3332-3338 (1985)). Estas características são semelhantes às do CRI do eritrócito (superfície da célula) quer estruturalmente quer funcionalmente.

Hourcade et ai (J. Exp. Med. 168: 1255-1270 (1988)) também observaram um local de poliadenilação alternativo na unidade de transcrição do CRI humano que foi previsto como produzindo uma forma segregada de CRI. O ARNm que resulta desta sequência truncada compreende os primeiros 8,5 SCR do CRI; e.g. o domínio de ligação para C4b, e pode codificar uma proteína de cerca de 80kD. Quando um ADNc correspondente a esta sequência truncada foi transfectado em células COS e expresso, demonstrou o esperado C4b, mas não a actividade de ligação do C3b (Kyrch et ai, F.A.S.E.B J. 3: A368 (1989)). Krych et al. também observaram um ARNm semelhante ao previsto em diversas linhas de células 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 6

humanas e postularam que a referida forma solúvel truncada do CRI, que é capaz de ligar o C4b, pode ser sintetizada em humanos.

Diversos fragmentos solúveis do CRI também foram produzidos por meio de processos de ADN recombinante por eliminação da região trans-membrana a partir dos ADN a serem expressos (Fearon et ai, pedido internacional número WO-A-89/09220, publicado em 5 de Outubro de 1989 e Fearon et al., pedido internacional WO-A-91/05047, publicado em 18 de Abril de 1991). Os fragmentos de CRI solúveis eram funcionalmente activos, dado que eles eram capazes de ligar o C3b e/ou o C4b e demonstraram actividade de cofactor do factor I dependendo das regiões que continham. Além disso, foram capazes de actuar como inibidores das funções do CRI in vitro, como o rebentamento oxidativo dos neutrofilos, a hemólise mediada pelo complemento, e a produção de C3a e C5a. Uma construção de CRI solúvel, codificada pelo plasmídeo sCRl/pBSCRlc, também demonstrou actividade in vivo numa reacção de Arthus passiva revertida (Fearon et ai, 1989 & 1991 e Yeh eí a/., J. Immunol. (1991)) e suprimiu a inflamação e a necrose miocárdica pós-isquémica (Fearon et al., 1989 & 1990 e Weisman et ai, Science 249: 146-151(1990)). Além disso, a co-formulação do produto de sCRl/pBSCRlc com o complexo activador estreptoquinase plasminogénio humano p-anisoilado (APSAC) resultou numa actividade anti-hemolítica semelhante à do APSAC isolado, indicando que a combinação do inibidor do complemento, sCRl, com um agente trombolítico, pode ser uma terapia de combinação útil (Fearon et al., pedido de patente internacional WOA-91/05047, publicado em 18 de Abril de 1991).

As proteínas semelhantes às do receptor para o complemento, as quais podem ser purificadas pelo protocolo aqui descrito, incluem alotipos e alelos dos CR, formas truncadas, formas quimicamente modificadas por exemplo por tratamento com PEG, e proteínas de fusão contendo uma porção de CR. Estas proteínas são designadas como semelhantes às do receptor para o complemento, dado que possuem ou conservam propriedades da proteína do CR suficientes para admitirem a purificação pelo processo deste invento. Excepto se especificamente identificado doutro modo, o termo proteína do receptor para o complemento também inclui proteínas semelhantes às do receptor para o complemento. As proteínas semelhantes às do CR-1 representam uma subsérie de proteínas semelhantes às do CR incluindo alelos, truncados, proteínas modificadas quimicamente e proteínas de fusão derivadas a partir do alotipo CR-1. O receptor para o complemento 1 solúvel (sCRl), aqui definido como uma forma solúvel do CRI humano contendo todos os 30 domínios SCR extracelulares, é um exemplo específico de uma proteína semelhante à do CR-1. 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 7

As proteínas do receptor para o complemento a serem purificadas de acordo com este invento podem ser produzidas por uma multiplicidade de técnicas. Se são requeridas cadeias nativas de comprimento total, então as moléculas nativas podem ser extractadas a partir das fontes de células identificadas acima. Quando são desejadas formas solúveis, são preferidos fragmentos das moléculas nativas de comprimento total. Consequentemente, os ADN que codificam os fragmentos de cadeia desejados, são expressos como fragmentos de proteína produzidos por recombinação. Este invento é particularmente útil para a purificação de sCRl a partir do meio de cultura de células condicionado de uma variedade de sCRl que produz linhas de células recombinantes. Embora se possa esperar alguma variação de linha de células para linha de células e entre os diversos produtos do receptor para o complemento, com base na descrição aqui contida, situa-se bem dentro da esfera de acção de qualquer perito nesta arte adaptar o invento a uma combinação particular de proteína do receptor para o complemento e de linha de células produtoras.

Duma forma geral, os genes que codificam proteínas tais como os receptores para o complemento podem ser clonados por incorporação dos fragmentos de *ADN que codificam as regiões desejadas do polipéptido num veículo de ADN recombinante (e.g. vector) e transformação ou transfecção em hospedeiros procarióticos ou eucarióticos adequados. Hospedeiros procarióticos adequados incluem, mas não se encontram limitados a Escherichia. Streptomvces. Bacillus e similares. Hospedeiros eucarióticos adequados incluem, mas não se encontram limitados a leveduras, tal como Saccharomvces. e células animais em cultura tais como VERO, HeLa, ratinho Cl27, ovário de hamster chinês (CHO), WI-38, BHK, COS, MDCK. e linhas de células de insectos. Hospedeiros particularmente preferidos são linhas de células CHO deficientes em di-hidrofolato-redutase tais como ATCC CRL 1793, CRL 9096 e outras linhas de células descritas aqui em seguida. As referidas técnicas recombinantes tomaram-se agora bem conhecidas e encontram-se descritas em Methods in Enzvmology. (Academic Press), volumes 65 e 69 (1979), 100 e 101 (1983), e nas referências aí citadas. Uma discussão técnica ampla concretizando as metodologias de ADN recombinante mais habitualmente utilizadas pode ser encontrada em Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ou Current Protocols in Molecular Bioloav. Greene Publishing (1988, 1991).

Uma forma de obtenção de um fragmento de ADN que codifica um polipéptido desejado tal como um receptor para o complemento é por meio de clonação do ADNc. Neste processo, ARN mensageiro (ARNm) é isolado a partir de células reconhecidas ou suspeitas de produzirem a proteína desejada. Através de uma série de reacções enzimáticas, a população de ARNm das células é copiada para um ADN complementar (ADNc). O ADNc 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 8

resultante é de seguida inserido em veículos de clonação e subsequentemente utilizado para transformar um hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado. A “biblioteca” de ADNc resultante é composta por uma população de células hospedeiras transformadas, cada uma das quais contém um gene simples ou um fragmento do gene. A biblioteca completa, em teoria, proporciona uma amostra representativa da informação codificadora presente na mistura de ARNm utilizada como o material de partida.

As bibliotecas podem ser pesquisadas utilizando sondas de ácido nucleico ou anticorpo a fim de identificar sequências de ADN específicas. Uma vez isoladas, estas sequências de ADN podem ser modificadas ou podem ser montadas em genes completos. Altemativamente, tal como descrito neste invento, fragmentos específicos dum gene podem ser obtidos por engenharia independentemente do resto do gene. Os fragmentos de proteína codificados por estes fragmentos de gene obtidos por engenharia podem não ser encontrados na natureza, podendo no entanto apresentar utilidade significativa no tratamento de condições fisiológicas indesejáveis. A obtenção por engenharia genética do receptor para o complemento solúvel para a prevenção e/ou tratamento de alterações envolvendo a actividade do complemento constitui um desses casos.

Uma vez clonado o gene ou fragmento de gene, o ADN pode ser introduzido num vector de expressão e essa construção pode ser utilizada para transformar uma célula hospedeira apropriada. Um vector de expressão é caracterizado por possuir sequências de controlo da expressão tal como aqui definidas, de tal modo que quando a sequência de ADN de interesse está funcionalmente ligada a ele, o vector é capaz de dirigir a produção do produto codificado pela sequência de ADN de interesse numa célula hospedeira contendo o vector. Com referência específica a este invento, é possível montar fragmentos de uma sequência de codificação simples de modo que, por expressão, é formada uma proteína de receptor solúvel. Uma aplicação particularmente eficaz deste protocolo à produção de SCR1 recombinante é encontrada em Fearon et cã., pedidos PCT WO-A-89/09220, publicado em 5 de Outubro de 1989, e WO-A-91/05047, publicado em 18 de Abril de 1991, citados acima.

Depois do produto recombinante ser produzido, é desejável recuperar o produto. Se o produto é exportado pela célula que o produz, o produto pode ser recuperado directamente a partir do meio de cultura das células. Se o produto é retido intracelularmente, as células devem ser fisicamente rompidas por meios mecânicos, químicos ou biológicos a fim de obter o produto intracelular.

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No caso de um produto proteico, o protocolo de purificação deve não só proporcionar um produto proteico que seja essencialmente isento de outras proteínas, o que significa que seja pelo menos 80% e preferencialmente mais do que 95% puro em relação à proteína total na preparação, mas também eliminar ou reduzir até níveis aceitáveis outros contaminantes da célula hospedeira, ADN, ARN, pirogénios potenciais e similares.

Tal como anteriormente mencionado, pode ser utilizada uma diversidade de células hospedeiras para a produção dos receptores deste invento. A escolha de uma célula hospedeira particular situa-se bem dentro da esfera de acção do artesão regularmente especializado tendo em consideração, inter alia, a natureza do receptor, a sua taxa de síntese, a sua taxa de degradação e as características do vector recombinante que dirige a expressão do receptor. A escolha do sistema de expressão da célula hospedeira dita em grande parte a natureza dos processos de cultura das células a serem empregues. A selecção de um modo de produção particular, seja ele por lotes ou em contínuo, levantamento giratório ou por ar, líquido ou imobilizado, pode ser efectuada uma vez que tenha sido seleccionado o sistema de expressão. Assim, bio-reactores de leito fluidificado, bio-reactores de fibra oca, culturas em frasco cilíndrico, ou bio-reactores de tanque agitado, com ou sem microportadores celulares, podem ser diversamente empregues. Os critérios para a referida selecção são apreciados na arte da cultura de células. Eles não são aqui pormenorizados, dado que se situam fora do âmbito deste invento. Este invento refere-se à purificação de receptores para o complemento conhecida a sua existência num meio de cultura de células condicionado.

Tal como mencionado acima, este invento refere-se, inter alia, à aplicação de cromatografia por interacção hidrófoba (HIC) para a purificação e análise de proteínas do receptor para o complemento. As moléculas hidrófobas, num solvente aquoso, irão auto-associar-se. Esta associação é devida a interacções hidrófobas. É actualmente valorizado que macromoléculas tais como proteínas apresentam na sua superfície placas hidrófobas extensas para além dos esperados grupos hidrófilos. A HIC é baseada, em parte, na interacção destas placas com ligandos hidrófobos fixados a suportes cromatográficos. Um ligando hidrófobo acoplado a uma matriz é aqui diversamente designado como um suporte para HIC, gel para HIC ou coluna para HIC. É adicionalmente valorizado que a força da interacção entre a proteína e o suporte para HIC seja não só uma função da proporção de superfícies não polares em relação às polares na proteína, mas também pela distribuição das superfícies não polares.

Pode ser empregue um certo número de matrizes na preparação de colunas para HIC, sendo a mais amplamente utilizada a agarose. Podem ser utilizadas sílica e resinas de 10 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ polímero orgânicas. Ligandos hidrófobos úteis incluem, mas não se encontram limitados a, grupos alquilo apresentando desde cerca de 2 até cerca de 10 átomos de carbono, tais como butilo, propilo ou octilo; ou grupos arilo tal como fenilo. Produtos para HIC convencionais para geles e colunas podem ser obtidos comercialmente a partir de fornecedores tais como Pharmacia LKB AB, Uppsala, Suécia, sob os nomes de produto butyl-SEPHAROSE®, phenyl-SEPHAROSE® CL-4B, octyl-SEPHAROSE® FF e phenyl-SEPHAROSE® FF; Tosoh Corporation, Tóquio, Japão, sob os nomes de produto TOYOPEARL Butyl 650M (Fractogel TSK Butvl-650) ou TSK-GEL Phenyl-5PW; Miles-Yeda, Rehovot, Israel, sob o nome de produto alkyl-agarose, em que o grupo alquilo contém de 2-10 átomos de carbono, e J. T. Baker, Phillipsburg, N. J., sob o nome de produto Bakerbond WP-HI-propyl.

Também é possível preparar a coluna para HIC desejada utilizando química convencional. Por exemplo, combinações de matriz / ligando da forma NH, i '

I M-0-C-NH-CHr(CH;)(rCH3, em que M é uma matriz tal como agarose, podem ser formadas após activação pelo brometo de cianogénio da agarose por acoplamento com uma alquilamina tal como é ensinado por Er-el, Z. et ai, Biochem. Biophvs. Res. Comm, 49: 383 (1972). Altemativamente, combinações da forma

OH OH M-0-CH2-CH-CH2-0-(CH2)6-CH, ou m-o-ch2-ch-ch2-o-a em que M é uma matriz tal como agarose e A é arilo, podem ser preparadas por um processo de acoplamento a éter glicidílico (Ulbrich, V. et al., Coll. Czech. Chem. Commum. 9: 1466 (1964)). Resumidamente, um gel, geralmente agarose, é transferido para um solvente orgânico, e.g. dioxano. Isto é efectuado passo a passo (porções de 100 ml para 100 ml de gel sedimentado) num funil de Btichner: (1) uma lavagem com água-dioxano (4:1), (2) uma lavagem com água-dioxano (3:2), (3) uma lavagem com água-dioxano (2:3), (4) uma lavagem com água-dioxano (1:4) e (5) sete lavagens com dioxano. São adicionados 100 ml de dioxano a 100 ml de gel sedimentado e 2 ml de uma solução a 48% de eterato de trifluoreto de boro em éter dietílico são adicionados e agitados durante cinco minutos. E adicionado 1 ml do éter glicidílico apropriado dissolvido em 10 ml de dioxano, gota a gota a partir de um funil separador. A reacção demora cerca de 40 minutos. No final da reacção, o gel derivado é transferido de volta para um meio aquoso mas invertendo os passos (4) a (1)

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 11 anteriores e terminando com uma lavagem final em água. A quantidade de ligando a ser acoplada ao gel pode ser controlada por variação da quantidade de éter glicidílico adicionado à mistura reaccional. A reacção pode ser representada duma forma geral como se segue:

O OH / \ BF,Et;0 |

M - OH + CH: - CH - CH: - OR-► M - O - CH, - CH - CH, - OR em que M é uma matriz tal como agarose e R é alquilo ou arilo. A densidade do ligando é um parâmetro importante, dado que influencia não apenas a força da interacção mas também a capacidade da coluna. A densidade do ligando dos geles de fenilo ou de octilfenilo comercialmente disponíveis encontra-se na ordem de 40 Limoles/ml de leito do gel. A capacidade do gel é uma função da proteína particular em questão, bem como do pH, temperatura e concentração salina, mas duma forma geral pode esperar-se que se situe na gama de 3-20 mg/ml de gel. A escolha de um gel particular pode ser determinada pelo perito na arte. Em geral, a força da interacção da proteína e do ligando da HIC aumenta com o comprimento da cadeia dos ligandos alquilo, mas ligandos que possuam de 4 a cerca de 8 átomos de carbono são adequados para a maior parte das separações. Um grupo fenilo apresenta aproximadamente a mesma hidrofobicidade que um grupo pentilo, embora a selectividade possa ser bastante diferente em virtude da possibilidade da interacção. pi-pi com grupos aromáticos na proteína. A adsorção das proteínas a uma coluna HIC é favorecida por concentrações salinas elevadas, mas as concentrações reais podem variar ao longo de uma ampla gama dependendo da natureza da proteína e do ligando da HIC particular escolhido. Diversos iões podem ser ordenados numa série denominada solufóbica, dependendo se eles promovem interacções hidrófobas (efeitos dessalinizantes) ou se rompem a estrutura da água (efeito caotrópico) e conduzem ao enfraquecimento da interacção hidrófoba. Os catiões são ordenados em termos de efeito dessalinizante crescente tal como Ba" < Ca"* < Mg"* < Li" < Cs" < Na" < K" < Rb" < NH4". Entretanto, os aniões podem ser ordenados em termos de efeito caotrópico crescente tal como PO/" < S04" < CH3COO‘ < Cf < Br < NO./ < CIO/ < Γ < SCN'.

Assim, podem ser formulados sais que influenciem a força da interacção tal como determinada pela seguinte relação:

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Na,S04 > NaCl > (NH4);S04 > NH4C1 > NaBr > NaSCN

Em geral, são úteis concentrações salinas de sulfato de amónio entre cerca de 0,75 a cerca de 2 M ou de NaCl entre cerca de 1 e 4 M. A influência da temperatura sobre as separações da HIC não é simples, embora geralmente uma redução na temperatura diminua a interacção. No entanto, qualquer benefício que poderia advir do aumento da temperatura também deve ser pesado contra efeitos adversos que um tal aumento pode apresentar sobre a actividade da proteína. A eluição, quer passo a passo quer sob a forma de um gradiente, pode ser obtida de diversas maneiras: (a) por modificação da concentração salina, (b) por alteração da polaridade do solvente ou (c) por adição de detergentes. Pela diminuição da concentração salina as proteínas adsorvidas são eluidas pela ordem da hidrofobicidade crescente. Alterações na polaridade podem ser afectadas por adições de solventes tais como etilenoglicol ou (iso)propanol, desse modo reduzindo a força das interacções hidrófobas. Os detergentes funcionam como deslocadores de proteínas e foram utilizados primariamente em conexão com a purificação de proteínas da membrana.

Tal como mencionado acima, a HIC é particularmente útil quando utilizada em combinação com outras técnicas para a purificação de proteínas. Isto significa que é preferida a aplicação da HIC a material que foi parcialmente purificado por outros processos para a purificação de proteínas. Pelo termo “parcialmente purificado” designa-se uma preparação proteica na qual a proteína com interesse se encontra presente em pelo menos 5 por cento em peso, mais preferencialmente em pelo menos 10% e o mais preferencialmente em pelo menos 45%. Consequentemente, a aplicação da HIC é melhor apreciada no contexto de um protocolo de purificação global para proteínas do receptor para o complemento. Verificou-se ser útil, por exemplo, submeter uma amostra do meio de cultura de células condicionado a purificação parcial antes da aplicação da HIC. Pelo termo "meio de cultura de células condicionado” designa-se um meio de cultura de células o qual sustentou o crescimento de células e/ou a manutenção de células e contém produto segregado. Uma amostra concentrada do referido meio é submetida a um ou mais passos para purificação das proteínas antes da aplicação de um passo de HIC. De acordo com o presente invento, a amostra é primeiro submetida a uma cromatografia de permuta catiónica antes da HIC ser executada. Tal como mencionado anteriormente, diversos substituintes aniónicos ou catiónicos podem ser fixados a matrizes a fim de formar suportes aniónicos ou catiónicos para cromatografia. Substituintes

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 13 de permuta aniónica incluem dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo quaternário (QAE) e grupos amina quaternária (Q). Substituintes de permuta catiónica incluem carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) e sulfonato (S). As resinas celulósicas de permuta iónica tais como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 e CM-52 encontram-se disponíveis a partir de Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido. São igualmente conhecidos permutadores iónicos reticulados e baseados em SEPHADEX®. Por exemplo, DEAE-, QAE-, CM-, e SP-SEPHADEX® e DEAE-, Q-, CM-, e S-SEPHAROSE® encontram-se todos disponíveis a partir de Pharmacia AB. Mais, ambos os derivados DEAE e CM do copolímero etilenoglicol-metacrilato, tais como TOYOPEARL DEAE-650S e TOYOPEARL CM-650S, encontram-se disponíveis a partir de Toso Haas Co., Filadélfia, Pa. Uma vez que a eluição a partir de suportes iónicos geralmente envolve a adição de sal e dado que, tal como mencionado anteriormente, a HIC é intensificada sob concentrações salinas aumentadas, o presente invento compreende um passo de HIC após um passo cromatográfico de permuta catiónica, e facultativamente após um outro passo de purificação mediada por sal. É preferido que o passo cromatográfico de permuta catiónica e o passo de precipitação de sulfato de amónio precedam a aplicação da HIC. De acordo com o presente invento, um passo de cromatografia de exclusão por tamanho é levado a cabo depois do passo de HIC. Podem ser adicionados protocolos adicionais de purificação, incluindo mas não necessariamente limitados a cromatografia de permuta iónica adicional, cromatografia de exclusão por tamanho, inactivação virai, concentração e criodessecagem.

Quando o eluído resultante da HIC é submetido a cromatografia de permuta iónica adicional, é preferido que sejam empregues ambos os processos aniónico e catiónico.

Tal como mencionado anteriormente, a cromatografia de filtração por gel afecta a separação baseada no tamanho das moléculas. Constitui na realidade uma forma de peneiração molecular. É desejável que não ocorra qualquer interacção entre a matriz e o soluto, sendo por isso preferidos materiais de matriz totalmente inertes. Também é desejável que a matriz seja rígida e altamente porosa. Para processos em grande escala a rigidez é o mais importante dado que aquele parâmetro estabelece a taxa de fluxo global. Materiais tradicionais, e.g. SEPHADEX® ou BIO-GEL®, mostraram-se suficientemente inertes e disponíveis numa gama de tamanhos de poro. no entanto estes geles mostraram-se relativamente moles e não particularmente bem adaptados para a purificação em grande escala. Mais recentemente, foram desenvolvidos geles de rigidez aumentada (e.g. SEPHACRYL®, UTROGEL®, FRACTOGEL® e SUPEROSE®). Todos estes materiais se encontram acessíveis em tamanhos de partícula que são mais pequenos do que aqueles

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 14 disponíveis em suportes tradicionais, de modo que a resolução é mantida mesmo para taxas de fluxo mais elevadas. São preferidas matrizes de série TOYOPEARL HW (Toso Haas).

Apenas com fins de ilustração, este invento foi aplicado à purificação de um receptor para o complemento do tipo solúvel. Mais especificamente, a uma construção CRI solúvel contendo regiões de comando, LHR-A, LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR29, SCR30 até e incluindo o primeiro resíduo de alanina da região trans-membrana; e correspondendo às sequências que codificam CRI no plasmídeo pBSCRlc de Fearon et al., 1989, pedido de patente internacional número WO-A-89/09220, publicado em 5 de Outubro de 1989 (daqui por diante “TP10HD”). A construção de um sistema recombinante para a produção de TP10HD encontra-se detalhada no pedido PCT acima mencionado e resumido como se segue. Células CHO foram tripsinizadas e semeadas a 5 x ÍCF por placa de 60 mm e deixadas no meio de crescimento (meio nutriente Hams F12 (041-1765) com caldo de glutamina a 1% (043-05030), caldo de pen/strep a 1% (043-05070) e soro bovino de vitelo fetal a 10% (011-6290), Gibco, Paisley, Escócia) a 37°C, numa incubadora humidificada sob uma atmosfera de 5% de CO:/95% de ar. Após 21 horas as células foram utilizadas para transfecção do ADN. Um plasmídeo de expressão contendo a sequência codificadora sCRl do pBSCRlc foi co-transfectado com pSV2dhfr para uma linha de células de Ovário de Hamster Chinês necessitando de dhfr (CHODUXBII). A transfecção foi executada em meio de crescimento e empregou o processo de coprecipitação em cálcio/' choque por glicerol tal como descrito em DNA Cloning, D. M. Glover ed. (Capítulo 15, C. Gorman). Após a transfecção com pBSCRlc/pTCSgpt e pSV2dhfr, as células foram mantidas em meio de crescimento durante 46 horas sob condições de crescimento (tal como descrito acima) antes do processo de selecção. O processo de selecção e co-amplificação foi levado a cabo essencialmente tal como descrito por R. J. Kaufman et al. (Mol. Cell. Biol. 5: 1750-1759 (1985)). Quarenta e seis horas após a transfecção as células foram mudadas para meio selectivo MEM ALPHA (041-02571), caldo de glutamina a 1%, caldo de pen/strep a 1% (043-05070) e soro bovino de vitelo fetal dialisado (220-6300AJ) (Gibco, Paisley, Escócia). As células foram mantidas no meio selectivo durante 8-10 dias até surgirem colónias dhfr'. Quando as colónias foram estabelecidas as células foram mudadas para um meio selectivo contendo metotrexato, (A6770, Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). A concentração em metotrexato foi inicialmente de 0,02 μΜ e foi aumentada passo a passo até 5 μΜ. Durante o processo de amplificação, alíquotas de meio de crescimento das células em crescimento foram analisadas quanto à 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 15

produção de TP10HD por ELISA. Qualquer linha de células recombinante secretora de receptor para o complemento (e.g. ATCC CRL 10 052) pode ser utilizada para fornecer o meio condicionado para purificação de acordo com este invento, mas não é certamente necessária uma linha de células particular.

Uma linha de células CHO transfectada capaz de produzir TP10HD pode ser cultivada por uma diversidade de técnicas de cultura de células. Para a aplicação deste invento o método particular de cultura não é crítico, no entanto para fins de ilustração, um método para a cultura de células o qual pode ser utilizado é um processo em perfusão contínua baseado na tecnologia de leito fluidificado Verax tal como concretizada em US-A-4 861 714; US-A-4 863 856; US-A-4 978 616 e US-A-4 997 753. Assim, células transfectadas tais como aquelas descritas acima, são escalonadas em meio CCM-3 (uma mistura de DMEM, F-12 de Ham. albumina sérica bovina e outros suplementos nutrientes) suplementado com soro bovino fetal (FBS) a 10% e 5 mM de metotrexato (MTX). A população de células foi expandida em frascos cilíndricos até estar disponível um número suficiente de células para inoculação de um bio-reactor. Antes da inoculação, um bio-reactor S200 foi submetido a ciclos de limpeza no local (CIP) e de vaporização no local (SIP). Foi de seguida cheio com meio CCM-3 contendo 5% de FBS e carregado com 450 gramas de microesferas. As microesferas foram condicionadas com meio antes da inoculação. O reactor foi inoculado com células e os parâmetros de funcionamento foram: pH 7,2, 37°C, 02 dissolvido na admissão (fundo do leito fluidificado) entre 100 e 400 torr (1 torr = 133 Pa), O, dissolvido na saída (cimo do leito fluidificado) entre 0 e 200 torr. Após uma fase inicial por lotes, foi iniciada a perfusão do meio, com aumentos periódicos na taxa de modo a manter a concentração de glucose em 1,0 g/1. Isto prosseguiu até um número suficiente de células se ter acumulado no reactor a fim de inocular um bio-reactor S2000. Após CIP e SIP, um reactor S-2000 foi cheio com meio CCM-3 suplementado com 5% de FBS e 5 mM de MTX e carregado com 5000 gramas de microesferas. Estas microesferas foram condicionadas com meio antes da inoculação. As condições de funcionamento quanto à temperatura, arranjo do reactor e O, dissolvido são tal como as fornecidas acima. As microesferas do reactor S-200 foram assepticamente transferidas para o reactor S-2000 a fim de iniciar a fase por lotes. Quando a concentração da glucose caiu abaixo de 1,5 g/1, a fase de crescimento foi desencadeada pela iniciação da perfusão do meio (CCM-3, 5% de FBS e 5 mM de MTX) a uma taxa suficiente para manter a concentração de glucose em 1,0 g/1. O crescimento das células foi monitorizado em-linha pela medição das taxas de incorporação do oxigénio e de consumo da glucose. Quando um número suficiente de células se acumulou dentro do reactor, o meio de perfusão foi trocado para meio de transição, CCM-3 suplementado com 1% de FBS e 5 mM de MTX. Novamente, esta taxa de perfusão foi modificada de modo a

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EP 0 643 608 / PT 16 manter uma concentração de glucose de 1,0 g/1. Após crescimento adicional no meio de transição, o meio de perfusão foi uma vez mais trocado para o meio de produção, CCM-3 suplementado com 5 mM de MTX. A taxa de perfusão foi aumentada a fim de manter uma concentração de glucose de LO g/1. Daí em diante, os pontos de acerto quer do O, dissolvido na saída quer da velocidade do fluxo de recirculação foram reduzidos a fim de manter o controlo sobre o reactor. A fase de produção tipicamente dura cerca de 60 dias.

Entre 400 e 1600 litros de permeado do reactor, armazenado a 4-8°C, foram processados através de uma Unidade de Microfiltração Millipore Prostak. O permeado isento de células proveniente desta operação abasteceu o passo de ultrafiltração. O permeado foi concentrado 30-60 X com um Sistema de Enrolamento em Espiral Millipore. Depois da concentração, o retido foi drenado para um tanque de manutenção e o sistema foi cheio com 5-20 l de tampão de fosfato 50 mM, pH 7,5. O tampão de lavagem foi drenado do sistema e combinado com o retido. O concentrado da ultrafiltração foi filtrado através de um pré-filtro e de um filtro terminal de 0,22 mm para um frasco de Nalgene, previamente submetido a autoclave. Nominalmente, 800 ml de concentrado são dispersos para dentro de cada frasco e armazenados sob congelação.

Tal como anteriormente mencionado, o sistema de produção recombinante particular e o protocolo de cultura de células particular encontram-se fora do âmbito deste invento. O sistema e o protocolo discutidos acima são representativos das muitas opções disponíveis para o perito na arte e são aqui apenas incluídos para fins de ilustração. O protocolo para purificação que é o objectivo deste invento é aplicável, apenas com modificações de rotina, a uma diversidade de proteínas do receptor para o complemento recombinantes e semelhantes ao receptor independentemente da forma como elas são produzidas ou cultivadas.

As proteínas do receptor para o complemento purificadas obtidas pela prática do processo deste invento apresentam as seguintes propriedades: 1) mais do que 95% em peso de proteína CR; 2) estabilidade à degradação proteolítica a 4°C durante pelo menos três meses; 3) endotoxina baixa (<1 E.U./mg de proteína); 4) ADN baixo (<1 pg/mg de proteína); 5) proteína não CR <5% em peso; e 6) viralmente inactiva. Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente este invento, mas não são apresentados com a intenção de limitar as reivindicações em anexo.

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Exemplo I Introdução Ο processo delineado abaixo foi desenvolvido para o isolamento e purificação do receptor para o complemento solúvel 1 (sCRl) a partir de concentrado de meio de cultura de células condicionado. Este processo é projectado a fim de preparar sCRl com pureza proteica >95%, ao mesmo tempo que são removidas impurezas derivadas da célula hospedeira, meio de cultura de células, ou outros materiais em bruto. O processo de recuperação é composto por nove passos incluindo cromatografia de permuta catiónica e aniónica, por interacçào hidrófoba, e de exclusão por tamanho; uma precipitação em sulfato de amónio; e dois tratamentos de inactivaçào virai. Cada passo encontra-se detalhadamente descrito abaixo. Os passos 1 até 5 são levados a cabo a 2-8°C, e os passos 6 até 9 são executados a 20-25°C.

Passo 1: Pré-tratamento do meio

Sob agitação, concentrado de meio condicionado é ajustado até pH 5,2 pela adição de HC1 1 N. Quando a adição é completa, a agitação é continuada e o pH monitorizado durante 10 min. O ajuste do pH produz um precipitado pesado. A clarificação é obtida por microfiltração através de uma série de 3 filtros Millipore Polygard-CR ligados em série (5 pm para 0,5 pm para 0,1 pm). O sCRl é recuperado no filtrado. A acidificaçào e filtração do concentrado do meio remove quer a proteína não sCRl quer o material não proteináceo; e ajusta o filtrado contendo sCRl até ao pH apropriado para a subsequente cromatografia em S-SEPHAROSE.

Passo 2: Cromatografia de fluxo rápido em S-SEPHAROSE de Pharmacia O filtrado a pH 5,2 é carregado para uma coluna de gel de Fluxo Rápido S-SEPHAJROSE de Pharmacia previamente equilibrada com Tampão A, a uma velocidade de escoamento de 60 cm/h, e uma capacidade de <3 gramas de sCRl/Ι de volume do leito. A coluna é lavada a 150 cm/h com 3 a 5 volumes do leito de Tampão A, seguidos por 5 a 10 volumes do leito de Tampão B. O sCRl liga-se à coluna e é eluído com Tampão C. A coluna é despojada por lavagem com 3 volumes do leito de Tampão D.

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ΕΡ Ο 643 608/PT 18 A cromatografía em S-SEPHAROSE remove uma grande proporção de impurezas derivadas das células e do meio (particularmente proteínas) e concentra o sCRl no Tampão C eluído da coluna para processamento adicional.

Passo 3: Precipitação em sulfato de amónio O Tampão C eluído de S-SEPHAROSE é ajustado até 1,2 M de sulfato de amónio pela adição de Tampão E. Quando a adição é completa, a agitação é parada, e a mistura é deixada repousar durante toda a noite. O precipitado contendo sCRl é recolhido por centrifugação a 8000 x G durante 10 min. O material em peletes é ressuspenso por agitação suave em aproximadamente 4 1 de Tampão F. Tampão F adicional é adicionado até a absorvância da solução a 280 nm ser de 1,5 unidades de O.D. A solução é agitada durante toda a noite, e filtrada através de um filtro de 0,1 pm Millipore Polygard-CR. A precipitação em sulfato de amónio remove impurezas adicionais, e prepara o sCRl para a cromatografía por interacçào hidrófoba.

Passo 4: Cromatografía em TOYOPEARL Butvl-650M A pelete de sulfato de amónio re-solubilizada e filtrada é ajustada até 0,8 M de sulfato de amónio pela adição de Tampão E sob agitação.

Quando a adição é completa, a mistura é carregada para uma coluna de gel TOYOPEARL Butyl-650 M previamente equilibrada com Tampão G, a uma velocidade de escoamento de 150 cm/h, e uma capacidade de < 4 gramas de proteína total/1 de volume da coluna. Os tampões e a coluna são mantidos a 2-8°C. Quando o carregamento é completado, a coluna é lavada com 2-3 volumes do leito de Tampão G, lavada com 3 volumes do leito de Tampão H, e o sCRl ligado eluído com Tampão I.

É adicionado GuHCl sólido ao eluído Butil-Tampão I até uma concentração de aproximadamente 2M e agitado até estar completamente dissolvido. O pH é monitorizado e se necessário ajustado até pH 7,0 utilizando NaOH 2,5 N.

Quando o GuHCl está completamente dissolvido, a solução é conservada durante 6 minutos e carregada para uma coluna de SEPHADEX G25 de Pharmacia, previamente equilibrada com Tampão J, a uma velocidade de escoamento de 60 cm/h. O volume da carga não deve exceder 25% do volume da coluna de SEPHADEX G25.

Depois do sCRl estar eluído (elui no volume de vazio), a coluna é lavada com Tampão J até o pico “do sal” ter eluído e a condutividade ter regressado até ao nível da linha de base. O produto do SEPHADEX G25 é ajustado até pH 11 pela adição de NaOH a 2,5 M, a solução é conservada a pH 11 durante 16 minutos, e reajustada até pH 9,0 utilizando HC1 a 2.5 Μ. O material está agora pronto para a cromatografia de permuta aniónica.

Os tratamentos com GuHCl e pH 11 proporcionam inactivação retroviral, se algum vírus estiver presente, e a cromatografia em SEPHADEX G25 prepara o produto sCRl para a cromatografia em DEAE TOYOPEARL.

Passo 6: Cromatografia em TOYOPEARL DEAE-650S O produto de SEPHADEX G25 é carregado para uma coluna do gel TOYOPEARL DEAE-650S, previamente equilibrada com o Tampão J, a uma velocidade de escoamento de 150 cm/h e uma capacidade de < 6 gramas de proteína/1 de volume da coluna. Após o carregamento, a coluna é lavada com 3 volumes do leito de Tampão J. O sCRl ligado é eluído com um gradiente linear de 5 volumes de coluna partindo de 100% de Tampão J e estendendo-se até 100% de Tampão K. A coluna é despojada por lavagem com 3 volumes do leito de Tampão L. A cromatografia em TOYOPEARL DEAE remove proteínas contaminantes, ADN, e impurezas virais potenciais.

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Passo 7: Cromatografia em TOYOPEARL CM-650S

Diluir o produto do DEAE com 2 volumes de Tampão M e ajustar até pH 5,5 com HC1 2,5 N. Carregar a mistura diluída para uma coluna do gel TOYOPEARL CM-650S, previamente equilibrada com o Tampão M, a uma velocidade de escoamento de 150 cm/h, e uma capacidade de < 11 gramas de proteína/1 de volume da coluna. Após o carregamento estar completo, lavagem com 3 volumes do leito da coluna de Tampão M e eluição do sCRl ligado com um gradiente linear de 5 volumes de coluna, estendendo-se desde 100% de Tampão M até 100% de Tampão N. A coluna é despojada com 3 volumes do leito de Tampão O. O eluído contendo o produto é neutralizado com 1/10 volumes de fosfato de sódio dibásico 0,5 M, e encontra-se agora pronto para a cromatografia de exclusão por tamanho. A cromatografia em TOYOPEARL CM remove proteínas contaminantes, ADN, e impurezas virais potenciais.

Passo 8: Cromatografia em TOYOPEARL HW65S O produto de TOYOPEARL CM é carregado para uma coluna de TOYOPEARL HW65S, previamente equilibrada com o Tampão F, a uma velocidade de escoamento de 30 cm/h. O volume da carga não deve exceder 5% do volume total da coluna de TOYOPEARL HW65S. Recolha do pico do produto completo até a absorvância diminuir até 10% da absorvância máxima. O material encontra-se agora pronto para a concentração final. A cromatografia de exclusão por tamanho remove os últimos vestígios de impurezas de proteínas de baixo peso molecular, e serve para permutar o sCRl de tampão para o tampão alvo final.

Passo 9: Concentração e filtração final A combinação de TOYOPEARL HW65S é concentrada até 5-6 mg/ml utilizando uma unidade de ultrafiltração Minisette de Pharmacia adaptada com uma membrana Omega 100 K MWCO. O produto concentrado é filtrado através de um filtro Millipore Millipak de 0,2 um. 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 21

Tampões Tampão A Tampão B Tampão C Tampão D Tampão E Tampão F Tampão G Tampão H Tampão I Tampão J Tampão K Tampão L Tampão M Tampão N Tampão O 20 mM de fosfato de sódio, 60 mM de NaCl, pH 5,2 20 mM de fosfato de sódio, 100 mM de NaCl, pH 6,0 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 7,0 1 M de NaCl 3 M de sulfato de amónio, 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 10 mM de fosfato de sódio, 0,9% p/v de NaCl, pH 7 0,8 M de sulfato de amónio, 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 0,7 M de sulfato de amónio, 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 0,09 M de sulfato de amónio, 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 50 mM de Tris/Tris.HCl, pH 9.0 50 mM de Tris/Tris.HCl, 0,2 M de NaCl, pH 9,0 50 mM de Tris/Tris.HCl, 1,0 M de NaCl, pH 9,0 50 mM de MES/MES.Na, pH 5,5 50 mM de MES/MES.Na. 0,25 M de NaCl, pH 5,5 50 mM de MES/MES.Na, 1,0 M de NaCl, pH 5,5 (Segue Tabela)

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Lisboa, 16. ΛδΟ. 2300

Por AVANT IMMUNOTHERAPEUTICS, INC.

Claims

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1 - Método para purificação de uma proteína do receptor para o complemento ou de um seu fragmento, uma proteína semelhante ao receptor para o complemento ou um seu fragmento a partir de uma mistura contendo o mesmo compreendendo: (a) contacto da mistura com um suporte cromatográfico para permuta catiónica e eluição selectiva da proteína, (b) contacto da proteína eluída do passo (a) com um suporte cromatográfico para interacção hidrófoba e eluição selectiva da proteína, (c) contacto da proteína eluída do passo (b) com um suporte cromatográfico para exclusão por tamanho e eluição selectiva da proteína. e facultativamente também compreendendo qualquer um ou mais dos seguintes passos: precipitação em sulfato de amónio antes da cromatografia por interacção hidrófoba, cromatografia de permuta iónica adicional, cromatografia de exclusão por tamanho, inactivação virai, concentração, e criodessecagem.
2 - Método de acordo com a Reivindicação l, em que a proteína é CRI e/ou seus fragmentos.
3 - Método de acordo com a Reivindicação 1 ou a Reivindicação 2, em que: (a) o suporte cromatográfico para permuta catiónica é seleccionado a partir do grupo constituído por celulose substituída com carboximetilo, dextranos reticulados substituídos com carboximetilo, dextranos reticulados substituídos com sulfopropilo, pérolas de agarose substituídas com carboximetilo, pérolas de agarose substituídas com sulfonato, copolímeros de etilenoglicol-metacrilato substituídos com carboximetilo e a eluição é por adição de uma solução salina tamponada; (b) o suporte cromatográfico para interacção hidrófoba é seleccionado a partir do grupo constituído por alquiloC2-C8-agarose, aril-agarose, alquil-sílica, resina orgânica de polímero de alquilo; e

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 2/6 (c) ο suporte cromatográfico para exclusão por tamanho é seleccionado a partir de poliacrilamidas reticuladas e copolímeros de etileno glicol-metacrilato.
4 - Método de acordo com a Reivindicação 3, em que: (a) o suporte cromatográfico para permuta catiónica é pérolas de agarose substituídas com sulfonato e o sal tamponado é 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 7,0; (b) o suporte cromatográfico para interacção hidrófoba é um copolímero de butiletilenoglicol-metacrilato e a proteína é selectivamente eluída com um tampão de 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 contendo 0,09 M de sulfato de amónio; e (c) o suporte cromatográfico para exclusão por tamanho é um copolímero de etileno glicol-metacrilato e a eluição é com 10 mM de fosfato de sódio, 0,9% p/v de NaCl, pH 7.
5 - Método de acordo com a Reivindicação 1 ou a Reivindicação 2, em que uma proteína do receptor para o complemento do tipo 1 ou um seu fragmento é purificada a partir de meio de cultura de células condicionado contendo o mesmo compreendendo os passos de: (a) submissão do meio de cultura a uma primeira cromatografia de permuta catiónica, (b) submissão do produto do passo (a) a precipitação em sulfato de amónio, (c) submissão do produto do passo (b) a cromatografia por interacção hidrófoba, (d) submissão do produto do passo (c) a cromatografia de permuta aniónica, (e) submissão do produto do passo (d) a uma segunda cromatografia de permuta catiónica, e (f) submissão do produto do passo (e) a cromatografia de exclusão por tamanho.
6 - Método de acordo com a Reivindicação 5, em que: 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 3/6

(a) a primeira cromatografia de permuta catiónica emprega um suporte seleccionado a partir do grupo constituído por celulose substituída com carboximetilo, dextranos reticulados substituídos com carboximetilo, dextranos reticulados substituídos com sulfopropilo, pérolas de agarose substituídas com carboximetilo, pérolas de agarose substituídas com sulfonato, copolímeros de etilenoglicol-metacrilato substituídos com carboximetilo e a eluição é por uma solução salina tamponada; (b) o sulfato de amónio encontra-se presente numa concentração de 1,2 M; (c) o suporte cromatográííco para interacção hidrófoba é seleccionado a partir do grupo constituído por alquiloC2-C8-agarose, aril-agarose, alquil-sílica, resina orgânica de polímero de alquilo; (d) a cromatografia de permuta aniónica emprega um suporte seleccionado a partir do grupo constituído por celulose substituída com dietilaminoetilo, dextranos reticulados substituídos com dietilaminoetilo ou substituídos com aminoetilo quaternário, pérolas de agarose substituídas com dietilaminoetilo ou substituídas com amina quaternária, e copolímeros de etilenoglicol-metacrilato substituídos com dietilaminoetilo; (e) a segunda cromatografia de permuta catiónica emprega um suporte de copolímeros de etilenoglicol-metacrilato substituídos com carboximetilo; (f) a cromatografia de exclusão por tamanho emprega um suporte seleccionado a partir de poliacrilamidas reticuladas e copolímeros de etilenoglicol-metacrilato.
7 - Método de acordo com a Reivindicação 6, em que: (a) o suporte para a primeira permuta catiónica é pérolas de agarose substituídas com sulfonato e a solução salina tamponada é 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 7,0; (b) o suporte cromatográfico para interacção hidrófoba é um copolímero de butiletilenoglicol-metacrilato e a proteína é selectivamente eluída com um tampão contendo 100 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 contendo 0,09 mM de sulfato de amónio;

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 4/6 (c) ο suporte para a permuta aniónica emprega um copolímero de etilenoglicol-metacrilato substituído com dietilaminoetilo; e (d) o suporte para a exclusão por tamanho é um copolímero de etilenoglicòl-metacrilato.
8 - Método de acordo com a Reivindicação 1, em que uma proteína do receptor para o complemento ou um seu fragmento, uma proteína semelhante ao receptor para o complemento ou um seu fragmento, é purificada a partir de um meio de cultura de células condicionado, compreendendo: (a) concentração do meio de cultura de células condicionado; (b) adsorçào da proteína do receptor para o complemento sobre um suporte cromatográfico para permuta catiónica; (c) lavagem da proteína adsorvida com pelo menos um tampão; (d) eluição da proteína lavada; (e) precipitação da proteína com sulfato de amónio; (f) re-solubilização da proteína precipitada; (g) adsorção da proteína solubilizada a partir do passo (f) sobre um suporte cromatográfico para interacção hidrófoba; (h) eluição selectiva da proteína; (i) adsorção do eluído do passo (h) sobre um suporte para permuta aniónica; (j) eluição da proteína adsorvida;

84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 5/6 (k) adsorção do eluído do passo (j) sobre um suporte para permuta catiónica; (l) eluiçào da proteína adsorvida; (m) submissão do eluído do passo (1) a cromatografía de exclusão por tamanho; e (n) recuperação da proteína a partir da mesma.
9 - Método de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 8, o qual inclui um passo facultativo após a cromatografía por interacção hidrófoba de inactivação de vírus.
10 - Método de acordo com a Reivindicação 8, em que: o suporte para permuta catiónica do passo (b) é pérolas de agarose substituídas com sulfonato; o eluído do passo (d) é ajustado até 1.2 M de sulfato de amónio; o suporte para permuta catiónica do passo (k) é um copolímero de etilenoglicol-metacrilato substituído com carboximetilo; o suporte para permuta aniónica é um copolímero de etilenoglicol-metacrilato substituído com dietilaminoetilo; o suporte cromatográfico para interacção hidrófoba é um copolímero de butiletileno glic ol-metacrilato; e a cromatografía de exclusão por tamanho emprega um copolímero de etilenoglicol-metacrilato.
11 - Método de acordo com a Reivindicação 8, em que o referido passo de recuperação (n) é executado por combinação e concentração das fracções que contêm proteína a partir do passo de cromatografía final (m) por ultrafiltração. 84 966 ΕΡ Ο 643 608 / ΡΤ 6/6
12 - Método de acordo com a Reivindicação 8 o qual inclui o passo após o passo (h) de eluição da cromatografia por interacção hidrófoba de inactivação de vírus, se presentes, por tratamento do eluído da cromatografia por interacção hidrófoba com base e com cloridrato de guanidina. Lisboa, <6. m 2800 Por AVANT IMMUNOTHERAPEUTICS, INC. - O AGENTE OFI( O

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