DE69627333T2

DE69627333T2 - Automatisierte, kontinuierliche mehrdimensionale hochgeschwindigkeitsmolekularselektion und -analyse

Info

Publication number: DE69627333T2
Application number: DE69627333T
Authority: DE
Inventors: Satish Jindal; E. Fred REGNIER; Kevin Williams; B. Noubar AFEYAN; Sandeep Paliwal; David Evans; Aruna Pingali
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1995-06-26
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: DE69627333D1; JPH11509314A; EP0835446B1; US20020150926A1; US6358692B1; WO1997001755A2; JP4063687B2; JP2004003967A; JP3737516B2; EP0835446A2; WO1997001755A3; US6794148B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die mehrdimensionale integrierte Analyse von Lösungen einer großen Anzahl von Molekülspezies-Gemischen, die allgemein "Bibliotheken" genannt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Molekülformen, die bei einer Vielzahl von biologischen Zusammenhängen brauchbar sind, unter Einsatz des Hochfluss-Screenings natürlicher und synthetischer Bibliotheken zur Selektion von Liganden mit einer gewünschten Affinität für ein Zielmolekül von Interesse.
HINTERGRUND
Es ist bekannt, dass mehrdimensionale Systeme, d. h. Systeme, die die Anwendung von mehreren distinkten, physikalisch-chemischen Trennschritten umfassen, für viele Anwendungen brauchbar sind. Beispielsweise wird die Reinigung von Proteinen häufig unter Anwendung mehrerer Durchläufe durch verschiedene Chromatographiesäulen, die die differenzielle Verteilung ausnutzen, wie Adsorption und Größenausschluss, durchgeführt. Natürlicherweise besteht bei jedem mehrdimensionalen Verfahren die Notwendigkeit der Identifizierung der gewünschten Komponente aus dem Ergebnis der ersten Verteilung, um sie zu sammeln und sie der nächste Dimension des Systems zuzuführen. Die Nachteile solcher Systeme umfassen die langsame Analyse, die Lösungsmittel-Inkompatibilität zwischen aufeinanderfolgenden Verteilungsphasen, die Notwendigkeit einer arbeitsintensiven Handhabung und die folgliche Verunreinigung oder Probenverlust.
Die neue Technik offenbart verschiedene neue Verfahren zur Durchführung der Suche nach neuen Mitteln, wie beispielsweise pharmakologische oder therapeutischen Mittel (d. h. Arzneimittelentdeckung), Mittel, die bei der Tierpflege oder Tierhaltung brauchbar sind, in der Landwirtschaft brauchbare Chemikalien, selektive Biozide gegen Insekten, Unkräuter oder Schädlinge und katalytische und andere Formen, die bei industriellen Verfahren brauchbar sind. Sammlungen von Molekülen oder "Bibliotheken" werden hergestellt und auf Moleküle mit einer spezifischen biologischen Aktivität durchmustert, wie zunächst durch den Nachweis einer Bindung zwischen einer oder mehreren Spezies oder zwischen "Liganden" in der Bibliothek und einem "Zielmolekül", mit dem sie unter Beeinflussung einiger biologischer Prozesse reagiert, angedeutet. Insbesondere bestehen die Bibliotheken aus einer komplexen Sammlung von Molekülen, die einen oder mehrere Liganden enthalten, die an ein Ziel von Interesse binden können. Die Identifizierung von Liganden, die binden können, kann einen Hinweis zur Identifizierung von Verbindungen mit einer gewünschten biologischen Aktivität, z. B. als potentieller Arzneimittelkandidat, bereitstellen. Da Verfahren zum effektiveren Screening dieser komplexen Gemische verfügbar gemacht wurden, nimmt das Interesse an der Ausnutzung dieses neuen "rationellen Designs" oder dieser "gezielten Molekül-Entwicklung" zu.
Bibliotheken von Biopolymeren können durch die schrittweise Synthese auf der Grundlage einer randomisierten Zugabe von Aminosäure-, Nucleotid- oder Zuckerresten oder von Kombinationen hiervon unter Bildung von Peptiden, RNAs, Polysachariden, Glycosaminoglycanen oder dergleichen hergestellt werden, wodurch ein regelloses Gemisch von Oligomeren hergestellt wird. Techniken, die zur Herstellung von Protein- oder Peptid-Bibliotheken auf Nucleinsäureniveau durch Sichtbarmachen mit Phagen und ähnliche Technologien geeignet sind, sind ebenfalls bekannt. Diese allgemeinen Synthesewege können auch zur Herstellung von Peptidnucleinsäure(PNA)-Bibliotheken oder Bibliotheken von PNA/DNA oder PNA/RNA-Chimären und allerdings auch von anderen komplexen Gemischen von synthetischen Molekülen übernommen werden.
Das Screening löslicher Peptidbibliotheken wird häufig entweder durch Immuntests oder arbeitsaufwändiges Testen einer bestimmten biologischen Funktion (z. B. Blockieren der viralen Replikation) durchgeführt. Diese Verfahren sind nicht notwendigerweise Ziel-gerichtet, und in den meisten Fällen umfassen sie einen aufwändigen Aufbau. Siehe Scott und Craig, Curr. Opin. Biotech. 5, 40–48 (1994); Dooley et al. Proc. Natl. acad. Sci., 90: 10811–10815 (1993); Dooley et al., Life Sciences, 92: 1509–1517 (1990); Houghton et al., Biorg. Med. Chem. Lett., 3: 405–412 (1993). Beispielsweise wurden Inhibitoren der HIV-Protease durch Screening von Reihen äquimolarer Peptidgemische, die insgesamt mehr als 240000 lösliche Tetrapeptide enthielten, identifiziert. Siehe Owens et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 181: 402–408 (1991). Es wurde auch vorgeschlagen, zur Bestimmung der Sequenzspezifität der Peptidbindungsstellen von SH2-Domänen eine Phosphopeptidbibliothek unter Einsatz des an einer Säule immobilisierten GST-SH2-Fusionsproteins zu verwenden. (Siehe Songyang et al. Cell, 72, 767–778 (1993).
Die W093/07168 beschreibt ein Verfahren zur Auftrennung und Analyse von Proteinen unter Verwendung einer Anwendung, die zwei Säulen umfasst.
Die unmittelbar vorstehend beschriebenen Screeningverfahren beruhen auf der Identifizierung, welcher Ligand in einem Gemisch an ein Ziel von Interesse bindet. Das Binden wird typischerweise entweder mit den Liganden der Bibliothek oder dem an einer beliebigen Form von festem Träger immobilisierten Ziel getestet. Verschiedene Lösungsparameter können zur Nachahmung verschiedener Bindungsbedingungen und zum Erhalt verschiedener Liganden eingestellt werden. Oft besitzen Peptide, die durch die Verfahren, die ihre Immobilisierung an einem Träger umfassen, erhalten wurden, eine enttäuschende Affinität, das heißt, sie besitzen eine zu geringe Bindungskonstante, um brauchbar zu sein. Traditionsgemäß werden zur Affinitätsreinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen Antikörper verwendet. Probleme für die routinemäßige Anwendung von Antikörpern bei der Affinitätsreinigung stellen allerdings die Kosten der Erzeugung von Antikörpern, das potentielle Antikörper-Leaching und das Erfordernis relativ scharfer Elutionsbedingungen dar.
Die aus der Technik bekannten Screeningverfahren sind nicht vollkommend zufriedenstellend. Die bisherigen Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung von Liganden, die an ein Ziel von Interesse binden, versagen oft bei der Bereitstellung von Liganden mit ausreichend hoher Affinität, um geeignet zu sein, und zusätzlich besitzen sie den Nachteil des Probenverlusts, des Bedarfs großer Mengen an Liganden und der Notwendigkeit, Beladung, Binden oder Elutionsbedingungen zum Erhalt brauchbarer Ergebnisse zu variieren. Darüber hinaus vermögen die existierenden Systeme unter den relevanten Bedingungen eine Bibliothek nicht selektiv zu durchmustern und gleichzeitig die Affinität der gewählten Ligand(en) gegenüber dem Ziel zu bestimmen.
Eine Haupthürde bei der Ausnutzung der derzeitigen Screeningtechniken des vorstehend beschriebenen Typs besteht in der effektiven chemischen Charakterisierung der bei diesen Verfahren identifizierten Liganden. Die chemische Charakterisierung, z. B. die Bestimmung der Sequenz eines identifizierten Biopolymers, ist bestenfalls zeitraubend und komplex. Ein Hauptkonzentrationspunkt der bisherigen Screeningtechniken besteht darin, dass das Sammeln von genug an oder genügend Information über einen Ligand von Interesse möglich ist, so dass sich seine Struktur bestimmen lässt und größeren Mengen zum Testen und zur weiteren empirischen Strukturverbesserung synthetisiert werden können.
Es besteht demnach ein Bedarf an integrierten, mehrdimensionalen Screening-, Selektions- und Analysesystemen und Verfahren, die die automatisierte und direkte Übertragung von Proben ohne Verdünnung oder Verlust zwischen verschiedenen Dimensionen erlauben und die effektiv nach Liganden für ein Ziel von Interesse durchmustern und anschließend die Charakterisierung und Gewinnung auch bei Vorliegen in niedriger Konzentration ermöglichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demnach betrifft die Erfindung schnelle und wirksame automatisierte mehrdimensionale Verfahren zum Screening von Bibliotheken zur Selektion, Gewinnung und Charakterisierung eines Kandidaten-Liganden mit gewünschter oder vorgewählter Affinität K gegenüber einem vorgewählten Zielmolekül. Zusätzlich betrifft die Erfindung eine bestimmte Kombination einzelner Dimensionen eines solchen Verfahrens, das zum Erhalt eines gewünschten Ergebnisses angewandt werden kann, und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden für ein Ziel von Interesse, das die Nachteile der aus der Technik bekannten Verfahren behebt.
Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung dargelegt und gehen teilweise aus der Beschreibung und den Zeichnungen hervor, oder sie können durch die Praxis der Erfindung erlernt werden. Die Ziele und weitere Vorteile der Erfindung werden durch das Verfahren realisiert und erhalten, das insbesondere in der niedergeschriebenen Beschreibung, in der Zeichnung und in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt ist.
Zum Erreichen dieser und weiterer erfindungsgemäßer Vorteile, wie ausgeführt und ausführlich beschrieben, stellt die Erfindung neue Verfahren zum Screening einer Probe, zur Selektion eines Liganden für ein Ziel von Interesse und zum Erhalt von Informationen über den Liganden und seine Bindungsmerkmale bereit. Insbesondere umfassen die beanspruchten mehrdimensionalen Verfahren die Kombination einer Lösung von heterogenen Liganden mit dem Ziel von Interesse zum Screening der Liganden auf der Grundlage eines oder mehrerer Bindungsmerkmale. Die Liganden mit dem ersten Bindungsmerkmal binden unter Bildung eines Ziel/Ligandenkomplexes an das Ziel von Interesse. Anschließend wird der Komplex gegebenenfalls unter Anwendung einer von einer Vielzahl von Trenntechniken, z. B. Größenausschluss, von den ungebundenen Komponenten abgetrennt. Sodann wird mindestens einer der Komplexe oder der ungebundenen Komponenten einer zweiten "Dimension" zugeführt. Die zweite Dimension vermag die Komponenten auf der Grundlage eines zweiten Bindungsmerkmals zu trennen, dann wird der Ligand mit den gewünschten Bindungsmerkmalen eluiert.
Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Liganden mit einer gewünschten oder vorgewählten Affinität (K) gegenüber einem vorgewählten Zielmolekül in einer Probe von Liganden in einem Lösungsmittel durch Beladen einer Säule mit einer bekannten Konzentration von Zielmolekülen (T) und Hindurchleiten der Probe durch die Säule, so dass die Liganden in der Probe über das Zielmolekül an die Säule binden. Eine Serie (n) von Säulenvolumina von Lösungsmittel durchläuft dann die Säule, wobei n eine Zahl von Säulenvolumina zwischen 1 und 10000 ist. Eine Unterserie der Säulenvolumina, die die Säule verlassen, passiert einen Liganden-Akkumulator zur Immobilisierung an den Akkumulator von Liganden mit vorgewählter Affinität K. Dann können die Liganden mit der vorgewählten Affinität von dem Akkumulator eluiert und gegebenenfalls identifiziert und/oder in großtechnischen Mengen synthetisiert werden.
Bei einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Auftrennung von Speziesgemischen von Liganden, die in einem Lösungsmittel gelöst sind, in getrennte Fraktionen von Liganden, wobei jede Fraktion durch eine verschiedene Affinität oder einen verschiedenen Bereich von Affinitäten gegenüber einem vorgewählten Zielmolekül gekennzeichnet ist. Zunächst werden die Ligandenspezies-Gemische auf eine Säule aufgegeben, die immobilisierte Zielmoleküle umfasst, so dass die Liganden an das Ziel binden. Eine Serie von Säulenvolumina von Lösungsmittel durchläuft dann die Säule, und mindestens zwei Unterserien der Säulenvolumina von Lösungsmittel, die die Säule verlassen, werden sodann durch einen Liganden-Akkumulator geleitet, wodurch Liganden immobilisiert werden, die durch getrennte Bereiche von Affinitätskonstanten gekennzeichnet sind. Die Fraktionen, die die Liganden enthalten, die durch verschiedene Bereiche von Affinitäten gekennzeichnet sind, werden sodann gegebenenfalls von dem Akkumulator eluiert, um sie zum weiteren Screening oder zur weiteren Analyse chemisch aufzutrennen.
Bei wieder einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren unter Verwendung eines mehrdimensionalen Systems oder Geräts zum Erhalt und zur Identifizierung von Liganden mit vorgewählter Affinität gegenüber einem Ziel von Interesse. Das mehrdimensionale System besteht aus mindestens zwei Dimensionen, wobei die erste ein chromatographisches Element umfasst, an das eine Konzentration, vorzugsweise eine bekannte Konzentration T, von Zielmolekülen von Interesse gebunden ist. Das System besitzt als zweite Dimension ein weiteres chromatographisches Element, auf das ein Detektor folgt. Zusätzlich besitzt das System bei einigen Ausführungsformen des Verfahrens eine Schnittstelle zwischen jeder Dimension und einen Regler zur automatischen Regulierung der verschiedenen Dimensionen des Systems.
Bei wieder anderen Ausführungsformen umfasst das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbare Gerät mehrere Ventile, eine erste Säule mit an ihr immobilisierten Zielmolekülen; einen Akkumulator oder eine separate Säule zur Aufnahme von mindestens einem Teil des aus der ersten Säule austretenden Stroms, eine fakultative Schnittstelle zur Konditionierung des austretenden Stroms, um ihn mit dem Akkumulator oder der zweiten Säule kompatibel zu machen, und einen Detektor, wie ein Massenspektrometer. Die Schnittstelle kann bei einigen Ausführungsformen einen Pufferaustauscher, wie einen Mischbett-Ionenaustauscher, einen Kationenaustauscher oder einen Anionenaustauscher, und Mittel zur Lösungsmittel-Injektion, so dass der pH, die Ionenstärke etc. gesteuert werden können, umfassen, so dass eine weitere nachgeschaltete Verteilung der teilweise durchmusterten Ligandenspezies möglich ist.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bereitstellung eines kontinuierlichen Flusses durch die mehrfach verteilenden Dimensionen hängt in vielen Fällen von der Verwendung von Schnittstellensäulen ab. Diese konditionieren das Lösungsmittel, das die gelösten Liganden enthält, die aus einer vorgeschaltenen Säule austreten, zur effektiven Verteilung in einer nachgeschalteten Säule. An einer solchen Schnittstelle wird der salzreiche Auslauf durch Hindurchleiten über eine Reversed-Phase-Säule entsalzt. Die Liganden adsorbieren, das Salz wird ausgewaschen, und die Liganden werden dann mit salzfreiem oder salzarmem Lösungsmittel eluiert. In einer anderen Säule wird organisches Lösungsmittel, wie Acetonitril, durch Hindurchleiten der Lösung durch eine Ionenaustauschersäule, Binden der Liganden daran und anschließendes Eluieren mit einem wässrigen Elutionsmittel entfernt. In wieder einer anderen Säule wird der pH der sauren Lösungsmittel durch Binden an ein Kationenaustauscherharz, Auswaschen der Säure und Elution mit z. B. einem pH-neutralen Lösungsmittel erhöht. Ebenso kann der pH-Wert alkalischer Lösungsmittel durch Binden an ein Anionenaustauscherharz erniedrigt werden.
Bei wieder anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine Schnittstelle zur Probenentnahme aus einem Flüssigchromatographie(LC)-Austrittstroms und zur Abgabe der Probe an ein Massenspektrometer (MS). Der Probennehmer weist ein vorgegebenes Probenvolumen auf, das beispielsweise als Probenschleife angeordnet ist, alternativ ist er zur Entnahme aus einem LC-Austrittsstrom und zur Insertion in einen Analysestrom eines MS umschaltbar. Ein Probenregler dreht den Probennehmer zuerst bis zur Entnahme und anschließend zur Insertion der Probe. Bei verschiedenen Ausführungsformen kann der Probennehmer ein Ventil mit mehreren Öffnungen umfassen, und das Probenvolumen ist in einem Schlauch mit vorgegebenem Volumen angeordnet. Der Probenregler kann den Probennehmer drehen, um mehrmals während eines LC-Analysepeaks eine Probe des LC-Eluats zu entnehmen. Weitere Ausführungsformen können einen zweiten Probennehmer umfassen. Der erste und zweite Probennehmer können in Serie angeordnet sein.
Die Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren können gegebenenfalls einen Detektor zur Identifizierung eines gewählten Liganden umfassen. Der Detektor kann beispielsweise aus einem Massenspektrometer oder einem Fluoreszenzdetektor bestehen.
Zusätzlich betrifft die Erfindung bei weiteren Ausführungsformen ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden mit einer gewünschten hohen Affinität K zu einem vorgewählten Zielmolekül, wenn Ligand und Zielmolekül zusammen unter vorgewählten Lösungsmittelbedingungen vorhanden sind. Der nachzuweisende Ligand kann einer aus einer Vielzahl von Ligandenspezies in einer heterogenen Probe sein. Das Verfahren umfasst die Immobilisierung des Zielmoleküls an einer Säule, das Hindurchleiten der Probe durch die Säule unter beschleunigter Bindung von Liganden in der Probe an die Zielmoleküle und das anschließende Hindurchleiten einer Serie von Säulenvolumina eines Lösungsmittels, die die Lösungsmittelbedingungen definieren. Eine Unterserie (kp) der aus der Säule austretenden Säulenvolumina wird anschließend einem Liganden-Akkumulator unter Immobilisierung daran von Liganden mit der gewünschten Affinität zugeführt, und anschließend werden diese Liganden eluiert. Ein gewählter Ligand kann durch eine hohe Affinität K zu dem Zielmolekül, entsprechend etwa (kp)/T, gekennzeichnet sein, wobei T die Konzentration der Zielmoleküle in der Säule ist. In einigen Fällen sind die Bedingungen, unter denen die Probe durch die Säule geleitet wird (d. h. zum beschleunigten Binden von Liganden an Zielmoleküle) von den vorgewählten Lösungsmittelbedingungen verschieden.
Bei anderen Ausführungsformen betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren den Nachweis eines Liganden mit hoher Hingeschwindigkeit, Ko, wenn Ligand und Zielmolekül zusammen unter vorgewählten Lösungsmittelbedingungen vorhanden sind. Der Ligand wird in einer Probe nachgewiesen, die mehrere Ligandenspezies umfaßt, wovon mindestens eine mit einer Affinität von mindestens etwa 10⁴ M^–1 an ein vorgewähltes Zielmolekül bindet. Das Zielmolekül wird an einer Säule immobilisiert, und die Probe wird in einer Probenlösung bereitgestellt, die die vorgewählten Lösungsmittelbedingungen definiert. Die Probe wird bei hoher linearer Fluidgeschwindigkeit durch die Säule geleitet, so dass die Verweildauer der Liganden in der Säule minimiert wird und somit selektiv Liganden mit hoher Hingeschwindigkeit, bevorzugt gegenüber anderen Liganden in der Probe, an die Zielmoleküle binden. Anschließend kann die Säule unter Erhalt einer Ausgabe eluiert und die Liganden mit hoher Hingeschwindigkeit identifiziert werden. Gegebenenfalls kann die Ausgabe über einen Liganden-Akkumulator geleitet werden, der anschließend zur Erzeugung einer Ausgabe, die reich ist an einem Ligand mit hoher Hingeschwindigkeit, gespült wird.
Bei anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion von Liganden für ein Ziel von Interesse auf der Grundlage der Rückgeschwindigkeit des Liganden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen in bestimmten Aspekten auch ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden mit hoher Affinität zu einem Zielmolekül unter Bereitstellung einer Bibliothek, die durch den Abbau eines oder mehrerer Proteine oder anderer Biopolymere erhalten wird. Probelösung und ein Zielmolekül werden unter Bedingungen kombiniert, unter denen sich geeignete Liganden, sofern vorhanden, an das Ziel binden lassen, und anschließend werden die Liganden, die an das Ziel binden (unter Komplexbildung), von denjenigen abgetrennt, die nicht binden. Die Probelösungen können durch den Abbau von Proteinen, einschließlich von posttranslational modifizierten Proteinen, Antikörpern etc., erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen auch den Nachweis eines Liganden in einer Bibliothek, der bindet, wenn Ligand und Zielmolekül zusammen unter den vorgewählten Lösungsmittelbedingungen, z. B. physiologische Salzlösung, vorhanden sind. Wie zuvor wird ein Zielmolekül an einer Säule immobilisiert, und die Probe wird unter den vorgewählten Lösungsmittelbedingungen durch die Säule geleitet. Als nächstes wird eine Reihe von Säulenvolumina an Lösungsmittel durch die Säule geleitet, um einen gewünschten Liganden auszuwählen. Anschließend wird das Eluat einem Liganden-Akkumulator zugeführt.
Die Verfahren betreffen auch die Herstellung pharmazeutisch wirksamer Zusammensetzungen unter Anwendung der vorstehend beschriebenen mehrdimensionalen Verfahren und die anschließende großtechnische Herstellung solcher Zusammensetzungen.
Bei wieder anderen Aspekten betrifft die Erfindung Verfahren zur Wahl von Liganden auf der Grundlage von einem oder mehreren Bindungsmerkmalen unter Anwendung mehrerer Dimensionen.
Bei einem wichtigen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren bereit, die automatisiert und schnell sind und durch kontinuierlichen Fluss betrieben werden. Die Verfahren sind in der Lage, bei bevorzugten Ausführungsformen Liganden mit Affinität und Spezifität gegenüber im wesentlichen jedem Zielmolekül zu wählen, die Elemente der gewählten Gruppe voneinander zu trennen und die physikalisch-chemischen Daten zu erhalten, die für die Struktur der gewählten Liganden charakteristisch sind. Die Natur der bei dem System brauchbaren Bibliothek ist im wesentlichen nicht eingeschränkt. So können Gemische organischer Verbindungen verwendet werden. Der Abbau von Biopolymeren, entweder natürliche oder synthetische, ist besonders attraktiv. Solche Abbauprodukte können Gemische von Peptiden, Polysachariden, Polynucleotiden, verschiedene derivatisierte Formen hiervon und verschieden groß bemessene Fragmente hiervon umfassen. Die Biopolymere können aus pflanzlichem oder tierischem Gewebe, krank oder gesund, extrahiert, falls notwendig abgebaut oder als solche verwendet werden. Solche Bibliotheken stehen reichlich zur Verfügung, sind leicht herzustellen, können von geringer Toxizität und stabiler sein als synthetische Peptide und können variiert und systematisch durchmustert werden.
Selbstverständlich sind sowohl die vorgehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende ausführliche Beschreibung beispielhaft und erläuternd und zur Bereitstellung einer weiteren Erläuterung der Erfindung, wie beansprucht, beabsichtigt sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung einer TeilerSchnittstelle (Probennehmer) zwischen einer Flüssigkeitschromatographiesäule und einem Massenspektrometer in dem bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbarem Gerät (Position A).
2 ist eine schematische Darstellung einer TeilerSchnittstelle (Probennehmer) zwischen einer Flüssigkeitschromatographiesäule und einem Massenspektrometer in dem bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbarem Gerät (Position B).
3 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbaren Geräts.
4 ist eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform des bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbaren Geräts.
5 ist ein Diagramm einer BIOCAD^TM-Arbeitsplattform, die von der Firma PerSeptive Biosystems, Inc. im Handel ist, die im Tandemsäulenmodus verlötet ist. Säule 1 ist eine schwache Anionenaustauschersäule und Säule 2 ist eine Reversed-Phase-Säule.
6 beschreibt das zielbezogene Screening von humanem rHsp70.
Die 7A, 7B, 7C und 7D beschreiben MALDI-Spektren eines natürlichen Peptidbibliothek-Screenings auf rHsp70 und Dnak. 7A beschreibt das MALDI-Spektrum einer mit dem PDL inkubierten rHsp70-Probe. 7B beschreibt das MALDI-Spektrum einer Kontrollinkubation mit rHsp70 allein. 7C beschreibt das MALDI-Spektrum einer Kontrollinkubation mit PDL allein. 7D beschreibt das MALDI-Spektrum von Dnak, das mit PDL inkubiert wurde.
8 identifiziert Peptidsequenzen, die Zucker-spezifisch an Concanavalin A binden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Definitionen
Akkumulator -	Säule, die zur nicht spezifischen Adsorption von Liganden und gegebenenfalls und vorzugsweise zur Ermöglichung der Trennung der adsorbierten Liganden durch Elution ausgelegt ist.
Affinitätssäule -	Säule, die immobilisierte, für die hindurchlaufenden Liganden zugängliche Zielmoleküle enthält, so dass die Bildung eines Komplexes möglich ist.
Biopolymer -	polymeres Molekül biologischen Ursprungs, das mehrere angeheftete Monomere, derivatisiert oder nicht, einschließlich Aminosäuren, DNAs, RNAs, PNAs, Zuckerresten oder Kombinationen hiervon, einschließt.
Säule -	hier breit eingesetzt zur Bezeichnung von Labor- oder Mikrochromatographiesäulen, d. h. Röhren, die mit porösen oder nicht porösen, starren oder gelartigen Teilchen gepackt sind oder Einelement-Matrizen enthalten, die zur chromatographischen Trennung ausgelegt sind, oder funktionelle Äquivalente solcher Säulen, einschließlich von Membranen und Kapillaren oder Kapillarbündeln.

Komplex -	nicht kovalente Assoziation eines Kandidaten-Liganden und eines Zielmoleküls.
Kontinuierlicher Fluss -	Systeme, wobei die vorwärts getriebenen Lösungen, die die Liganden enthalten, die von einer Pumpe vorwärts getrieben werden, nacheinander verschiedene Säulen, Ventile, Detektoren, Schnittstelleneinheiten etc. innerhalb des Systems durchlaufen, ohne dass die Sammlung oder Trennanalyse manuell oder robotisch erforderlich ist, bis die Lösung das System verlässt.
Eluat -	Flüssigkeitsfraktion, die aus einer Säule austritt, die gelöste Stoffe enthält, die an die Säule sorbiert waren und anschließend durch verschiedene Elutionstypen, einschließlich Gradientenelution und isokratischer Elutionstechniken, desorbiert wurden, und die durch pH-Änderung, Ionenstärkeänderung oder Änderung anderer Parameter von Lösungen in der Säule oder einfach durch Hindurchleiten eines großen Puffervolumens durch die Säule eluiert werden.

Austrittsstrom -	Sammelbezeichnung, die entweder den aus einer Säule austretenden Teil von Flüssigkeit, der die gelösten Stoffe enthält, die nicht an die Säule binden konnten, oder ein Eluat bezeichnet.
Bibliothek -	Sammlung von strukturell distinkten Ligandenspezies, umfassend intakte oder fragmentierte organische Moleküle oder Moleküle biologischen Ursprungs, wie Peptide, Nucleotide, Polysacharide und verschiedene derivatisierte Formen hiervon.
Ligand -	generische Bezeichnung, die strukturell distinkte chemische Spezies bezeichnet, die in einem Lösungsmittel gelöst sind und eine Bibliothek darstellen.
Massenspektrometer -	Gerät, das zum Einbringen von Mikroproben, die einen gewählten Liganden oder Fragmente eines Liganden enthalten, ausgelegt ist oder das Ligandenfragmente erzeugt und das Masse-zu-Beladungsverhältnis von gelösten Stoffen in der Probe unter Bereitstellung von Daten misst, die zur Bestimmung der Struktur des Liganden hilfreich oder ausreichend sind.

MS/MS -	Massenspektrometer-Detektor des Typs, der das Masse-zu-Beladungsverhältnis sowohl eines darin eingeführten Liganden als auch anschließend von Fragmenten dieses Liganden, die durch Ionisierung oder anderweitig erzeugt wurden, bestimmt.
Reverse Phase -	chromatographische Oberfläche, die durch das reichliche Vorliegen von hydrophoben Gruppierungen gekennzeichnet ist.
Zielmolekül -	Verbindung, wie Rezeptor, Enzym, DNA, RNA, etc., umfassend entweder a) die Gruppierung, an die ein gewählter Ligand mindestens etwas selektiv und mit annehmbar hoher Affinität bindet, d. h. das Molekül, das während der Verwendung des gewählten Liganden ausgenutzt wird, oder b eine Gruppierung, für die der gewählte Ligand speziell so gewählt ist, dass er nicht bindet, so dass Kreuzreaktivität oder dergleichen vermieden wird.

I. NATUR DER BIBLIOTHEK
Eine "Bibliothek", wie hier verwendet, umfasst praktisch jede Lösung von Verbindungen, die auf einen Ligand mit einer Aktivität von Interesse, durchmustert wird. Die Bibliothek kann beispielsweise eine natürliche oder synthetische Kombinationsbibliothek; natürlich erhaltene Lösungen, wie aus Körperfluiden, Pflanzenfluiden,; oder praktisch alle anderen natürlichen oder synthetischen Substanzen, die in Lösung gebracht und durch ein physikalisches oder chemisches Merkmal nachgewiesen werden können, umfassen. Somit existieren grenzenlose Probenmöglichkeiten, und der Fachmann kann eine Probe auf der Grundlage seiner bestimmten Anwendung wählen.
Bei verschiedenen Ausführungsformen ist die Verwendung einer natürlichen Bibliothek von Molekülen, die durch den Abbau von einer oder mehreren natürlichen Substanzen erhalten wird, bevorzugt. Beim Screening nach Leitverbindungen für pharmazeutische Anwendungen (d. h. Arzneimittelentdeckung) kann die Probe durch den Abbau von einem oder mehreren aus dem Wirtsorganismus erhaltenen Molekülen erhalten werden. Es kann bevorzugt sein, ein von Natur aus zum Wirt gehöriges Molekül, das die gewünschte biologische Aktivität aufweist, abzubauen. Die Erfinder haben festgestellt, dass diese Bibliotheken mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Fragment mit der gewünschten Aktivität gegenüber einem Ziel von Interesse enthalten.
Natürliche Bibliotheken können durch enzymatischen Abbau oder eine andere Manipulation einer Probe vor dem Screening hergestellt werden, oder sie können in bestimmten Fällen eine Lösung sein, wie sie in der Natur vorkommt, ohne vorherige Manipulation. Die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Erzeugung von Peptiden aus bereits existierenden Aminosäurensequenzen durch einfachen Abbau der existierenden Proteine ist gut bekannt (U.S.-Patentschrift Nr. 3 855 196; Pieczenik, W087/01374; U.S.-Patentschrift Nr. 5 366 862). Vorzugsweise kann das Zielmolekül oder ein verwandtes Molekül unter Erzeugung einer Bibliothek potentieller Liganden, die mit dem Zielpeptid verwandt sind, abgebaut werden. Wenn somit ein Ligand gewünscht ist, der mit einer zuvor gewählten Affinität an ein Wachstumshormon bindet, könnte durch Abbau eines bekannten Liganden für das Wachstumshormon eine Bibliothek potentieller Liganden hergestellt und anschließend nach dem gewünschten Liganden durchmustert werden. Beispielsweise können proteolytische Abbautprodukte von Gemischen gängiger Proteine, die im Handel von einer Firma wie SIGMA erhältlich sind, erhalten werden. Diese Gemische werden entweder als natürliche tryptische Peptidgemische oder als natürliche tryptische/chymotryptische Peptidgemische bezeichnet. Gleichermaßen können beispielsweise polyklonale Antiseren für ein vorgewähltes Zielmolekül gezüchtet und das Immunglobulin in den Seren unter Erzeugung eines Gemisches von Kandidaten-Liganden abgebaut werden.
Zusätzlich betrifft die Erfindung die Verwendung von natürlichen Bibliotheken, die vor dem Screening keinen Abbau erfahren haben. Somit kann eine Probe durch Extraktion von tierischen oder pflanzlichen Zellen, Gewebe oder Fluiden, wie Körperfluide, wie Speichel, Samen-, Vaginalfluid und Blut, sowie als natürlich vorkommende Bibliotheken, wie Zelllysate oder Fermentationsbrühen erhalten werden. Solche Bibliotheken können gegebenenfalls vor dem Screening durch verschiedene Verfahren bearbeitet werden.
Solche natürlich erhaltenen Bibliotheken sind aus einer Reihe von Gründen zweckmäßig. Erstens wird die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung eines Liganden, der für einen Wirt toxisch ist, vermindert, wenn die Bibliothek beispielsweise durch enzymatischen Abbau unter Verwendung von Trypsin oder Chymotrypsin erzeugt wird, da diese Enzyme im menschlichen Körper gefunden werden und somit wahrscheinlich keine toxischen Wirkungen aufweisen. Zweitens können, da beispielsweise viele Proteine posttranslational modifiziert werden, Fragmente mit diesen Modifikationen erhalten werden. Dies ist besonders bei Anwendungen hilfreich, wobei die Modifikation die biologische Aktivität des Moleküls oder Fragments betrifft. Solche posttranslational modifizierten Proteine können beispielsweise Proteine einschließen, die sulfatiert, amidiert, carboxyliert, phosphoryliert, disulfidgebunden oder lipidiert sind.
II. DER MEHRDIMENSIONALLE WEG
A. THEORETISCHE GRUNDLAGE DES SCREENINGS
Peptidkombinationsbibliotheken und natürliche proteolytische Gemische enthalten drei Typen von Peptiden; diejenige, die i) keine Affinität gegenüber einem Protein aufweisen, ii) an eine große Anzahl von Proteinen binden oder iii) Affinität zu einem spezifischen Protein zeigen. Die letzte Gruppe kann außerdem je nach Bindungsaffinität und spezifische Stelle an der Proteinoberfläche, an die das Peptid bindet, unterteilt werden. Es ist notwendig, bei einem "Screeningsystem" zwischen diesen verschiedenen Peptiden zu unterscheiden.
Vorstehend wurde angedeutet, dass Protein, das hier auch als Ziel(R)/Ligand(L)-Assoziation bezeichnet wird, durch die Formel
[R] + [L] → [RL](A)
und die Gleichung
Kb = k1/k2 = [RL]/[R][L] (1)
beschrieben werden kann, wobei K_b die Bindungskonstante ist und die Geschwindigkeitskonstanten k₁ und k₂ jeweils die Geschwindigkeitskonstanten der Hin- bzw. Rückreaktion bezeichnen. Der allgemeine Weg, auf dem Peptide synthetischer Bibliotheken durchmustert werden, ist i) die Verwendung eines Peptidüberschusses, ii) die Kontrolle der Assoziationsbedingungen, iii) Äquilibrierenlassen des Systems und iv) anschließende schnelle Abtrennung der ungebundenen Peptide von dem RL-Komplex. Ab hier unterscheiden sich die verschiedenen Screeningsysteme bei der Identifizierung von gebundenen Peptiden.
Der beanspruchte Weg ist recht verschieden von dem von anderen eingesetzte Weg. Die hier beschriebenen Verfahren gestatten uns die Wahl auf der Grundlage der Hinreaktionsgeschwindigkeitskonstante eines Liganden an den Rezeptor, der Rück(Umkehr)reaktionsgeschwindigkeitskonstante oder der Gleichgewichtskonstante unter Bedingungen, unter denen es möglich ist, Ionenstärke, pH, Konzentration kompetitiver Bindungsmittel, organische Lösungsmittelkonzentration und Temperatur, um nur einige zu nennen, zu variieren. All diese Bedingungen beeinflussen potentiell die Komplex(RL)-Bildung.
Die Selektion von Peptiden auf der Grundlage ihrer Bindungskonstante kann auf mehreren unterschiedlichen Wegen erreicht werden. Einer besteht in der Verwendung einer Chromatographiesäule mit immobilisiertem Rezeptor (R). Ein anderer besteht in einem Chromatographiesystem, in dem die Komponenten des RL-Komplexes als Komplex-Dissoziate getrennt werden.
Bei dem Weg über den immobilisierten Rezeptor wird der Rezeptor (R) an einer Chromatographiesäule immobilisiert. Da die Assoziation von Ligand und immobilisiertem Rezeptor biospezifisch ist, ist die Affinität dieser Assoziation durch das Gleichgewicht, wie in Gleichung 1 vorstehend gezeigt, vorgegeben. Die Gleichgewichtskonstante (K_b) kann über die Gleichung Kb[R] = [RL]/[L] = Fd = k'/θ (2)
wobei K_d der chromatographische Verteilungskoeffizient und θ das Phasenverhältnis ist, mit dem chromatographischen Verhalten (k') zusammenhängen. Durch Umformen der Gleichungen vorstehend kann gezeigt werden, dass
k' = Kb[R]/θ (3)
Wenn die Rezeptorkonzentration [R] relativ zu [RL] groß ist, dann kann [R] als konstant angenommen werden. Da das Phasenverhältnis (θ) auch konstant ist, ist k' beim isokratischen Elutionsmodus direkt proportional zur Bindungskonstante Kb.
Der Einfluss der Bandenverbreiterung auf das Screeningverfahren muss ebenfalls berücksichtigt werden. Die Abschätzung der Bandenverbreiterung hängt in der Regel mit den theoretischen Böden (N) zusammen, wobei
N = 16(Ve/v)2 (4)
wobei V_e das Elutionsvolumen des Analyten entweder in ml/min oder in Säulenvolumina (CV) ist und v die Peakbreite in den gleichen Volumeneinheiten ist. Bei mittlerer bis hoher mobiler Phasengeschwindigkeit ist es wahrscheinlich, dass die Säulen 100 Böden oder weniger aufweisen und die Bodenhöhen 2 mm oder mehr betragen. Dies würde bedeuten, dass
Ve = 2,5 v (5)
Aus diesen Gleichungen kann geschlossen werden, dass die Peaks sehr breit sind und dass es schwierig ist, das Peakmaximum, das heißt k', zu bestimmen. Außerdem zeigt die Auflösung, wie durch die Gleichung
R5 = (Ve2 – Ve1)/v (6)
definiert, dass wenn v = 0,4 V_e2, dies einer 100-bödigen Säule entspricht.
Wenn somit die Peaks sehr breit sind, ist die Nachweisempfindlichkeit ernsthaft beeinträchtigt, und die Bestimmung von k' ist schwierig, wie vorstehend festgestellt. Eine Lösung besteht in der Sammlung und Konzentrierung von Fraktionen des Liganden, die während eines festgelegten Zeitraums von der Affinitätssäule eluieren, und in der Bestimmung der Ligandenkonzentration in der akkumulierten Fraktion. Dies kann unter Verwendung einer Reversed phase-Chromatographiesäule als Akkumulator durch ihre Tandem-Kopplung mit der Affinitätssäule erreicht werden. Zur Bestimmung von k' durch dieses Verfahren müssen mehrere Proben gesammelt und quantifiziert werden, damit sich der Chromatographiepeak wieder herstellen lässt. Unter der Annahme, dass der Peak immer die gleiche Form besitzt, kann k' durch Bestimmung der Peakbreite und der Fraktionsmenge des Analyten, der zu jedem Zeitpunkt eluiert wird, abgeschätzt werden.
Die Chromatographiesäule ist im wesentlichen ein theoretischer Boden, das heißt 1–10 mm Länge, der mit dem Ligand (L) unter Bildung des RL-Komplexes gesättigt ist. Obwohl während des Beladungsverfahrens nennenswerte Mengen an RL gebildet werden können, ist es immer noch möglich, dass eine endliche Menge von Restrezeptor (R), insbesondere wenn der Ligand von der Säule eluiert, vorhanden ist. Die Elution von Ligand (L) von dieser Säule hängt vom Dissoziationsprozess (Formel B) ab, wobei
[RL] → [R] + [L] (B).
Freier Ligand wird aus dem System gespült, bevor er die Möglichkeit zur Neukomplexierung mit R unter Bildung von RL besitzt. Da die Bindungskonstante sehr groß ist, das heißt >10⁶, existiert der größte Teil des Liganden in der Säule als RL-Komplex. Dies bedeutet, dass die Elutionsgeschwindigkeit des Liganden von der Säule durch die Gleichung
D [RL]/dt = –F[L]/Vc (7)
beschrieben wird, wobei F die volumetrische Fliessgeschwindigkeit (ml/min) ist, [L] die Ligandenkonzentration ist und V_c das Säulenvolumen (ml) ist.
Die Integration zeigt, dass
log [RL] = {[L]F/Vc)log 1/t (8)
Allerdings wissen wir dass
Kb= {[RL]i – [L]}/{[R]i + [L]}[L] (9)
wobei K_b die Bindungskonstante ist, [RL]_i die Anfangskonzentration des RL-Komplexes ist und [R]_i die Anfangskonzentration des freiem Rezeptors ist. Der Austausch von [L] in der integrierten Form der Gleichung gestattet die Vorhersage der Elutionsgeschwindigkeit von Ligand von der Säule als Funktion der Bindungskonstante.
Man kann das System in einem iterativen Prozess am Computer modellieren, wobei jedes Mal, wenn ein mit Ligand gesättigtes Säulenvolumen von der Säule gespült wird, ein neues Gleichgewicht errechnet wird. Dadurch wird angenommen, dass das System zu allen Zeiten im Gleichgewicht ist und dass keine nennenswerten Massenübertragungseinschränkungen existieren.
Unter Verwendung von Bindungskonstanten, die um Größenordnungen variieren, kann gezeigt werden, dass eine hohe Selektivität für Spezies mit großen Bindungskonstanten, die an die Säulen gebunden bleiben, besteht, während Spezies mit kleineren Bindungskonstanten eluiert werden.
Wenn i) ein Gemisch von Liganden (L₁, L₂, L₃ ... L_n) mit Bindungskonstanten für einen Rezeptor (R) von größer als 10⁶ mit immobilisiertem (R) in Kontakt gebracht wird und ii) die Summe der Konzentration dieser Liganden diejenige des Rezeptors übersteigt, ist der Rezeptor gesättigt. Wenn man dieses System außerdem ins Gleichgewicht kommen lässt, wird die relative Konzentration der verschiedenen Spezies durch die Gleichung
Kb1[L1]/[RL1] = Kb2 [L2]/[RL2] = Kb3[L3]/[RL3] = Kbn[Ln]/[RLn] (9a)
dargestellt. Da die Anfangskonzentration der verschiedenen Liganden unbekannt ist, ist die Abschätzung der Bindungskonstanten, entweder relativ oder absolut, nicht möglich.
Dies ist als Gleichgewichtsverschiebungsverfahren bekannt. Das Gleichgewichtsverschiebungsverfahren beruht auf dem folgenden Protokoll. Erstens wird eine immobilisierte Rezeptorsäule, die an einem der Ventile eines Mehrventil-Flüssigkeitschromatographen angebracht ist, mit Ligand en) gesättigt, und die adsorbierten Liganden werden anschließend von der immobilisierten Ligandensäule desorbierten und konzentrieren sich durch eine Ventilumschaltung, die den Rezeptor und die Reversed-Phase-Säulen als Tandem koppelt, wieder auf einer Reversed-Phase-Säule. Die Rezeptorsäule wird anschließend von dem System ausgeschaltet, und die Liganden werden durch Gradientenelution von der Reversed-Phase-Säule abgetrennt und quantitativ bestimmt.
Zweitens wird der immobilisierte Rezeptor erneut mit dem Ligandengemisch gesättigt. Sodann werden freie Liganden schnell mit 1,5 Säulenvolumina Waschflüssigkeit, die als Abfall verworfen werden, aus dem System eluiert. Die Rezeptorsäule wird anschließend zu einer Fluidschleife geschaltet, in der Flüssigkeit von einem Reservoir eines Volumens (V') durch eine Hochdruckpumpe in die Rezeptorsäule und dann zurück in das Reservoir gepumpt wird. Das Volumen von Pumpe, Verbindungsschläuchen und Rezeptorsäule beträgt V " . Das Flüssigkeitsvolumen (V) des Systems ist die Summe von V' + V'' . Der Rezeptor:Ligand-Komplex [RL] dissoziiert, bis das System wieder ins Gleichgewicht kommt, wie durch Gleichung 1, vorstehend, beschrieben.
Es wird eine Chromatographiesäule mit der spezifischen Oberfläche As betrachtet, die mit Ligand gesättigt ist, in der die Rezeptordichte [R] beträgt, die Dichte an Komplex (RL)[R] = [RL] beträgt, und die Menge an Ligand, der an die Säule adsorbiert ist, [RL]_iAs beträgt. In dem speziellen Fall, wobei 50% des ursprünglich an die Säule adsorbierten Liganden von der Oberfläche desorbieren und in die flüssige Phase eintreten, d. h.
[RL]As = [L]V = 1/2[RL]iAs = [R]As (10)
dann gilt:
Kb[L]V = 1 (11)
Im allgemeineren Fall gilt:
Kb{a/(1-a)}[L]V = 1 = (Kb{a/(1-a)}[RL]V)/2 (12)
wobei a der Bruchteil des ursprünglich adsorbierten Liganden ist, der dissoziiert und in die flüssige Phase eintritt, und (1-a) die Fraktion des RL-Ausgangskomplexes ist, die nach der Reäquilibrierung zurückbleibt. Wenn zwei Substanzen an die Säule gebunden sind
Kb1{a1/(1-a1)}[RL1]v = 1 = Kb2{a2//1-a2)}[RL2]V = 1 (13)
und K_b2 bekannt ist, gestattet die Gleichung
Kb1 = Kb2{a2/(1-a2)}[RL2]{(1-a1)/a1}(1/[RL1]) (14)
die Berechnung der Bindungskonstante K_b1 auf der Basis der relativen Menge der beiden Substanzen, die von der Säule eluiert wurden, wenn sich das Gleichgewicht zur Kompensation der Zunahme im Volumen (V) verschiebt.
Wie vorstehend angegeben, kann das Screening in einem Chromatographiesystem auch durch Chromatographie des RL-Komplexes und Abtrennung des Rezeptors (R) von dem Ligand (L), wenn der Komplex RL dissoziiert, unter Verhinderung der Reassoziation erreicht werden. Bei diesem Verfahren ist es am wahrscheinlichsten, dass der RL-Komplex derjenigen Liganden mit der höchsten Bindungsaffinität den Durchlauf durch das Chromatographiesystem ohne Dissoziation übersteht. Die Geschwindigkeit, mit der R von L getrennt wird, d. h. die Auflösung (R_S) als Funktion der Zeit (dR_S/dt), ist ein wichtiger Punkt. Die Auflösung in einem Chromatographiesystem ist in Gleichung 6 gezeigt, wobei R_S = (V_e2 – V_e1)/v. Da dt mit der mobilen Phasengeschwindigkeit (Vm) umgekehrt verknüpft ist, wird die Gleichung zu
DRS/dt = Vm(Ve2 – Ve1)/v (15)
Wenn die Elutionsvolumina in Kapazitätsfaktor und Peakbreite, ausgedrückt in Bodenhöhe und Säulenlänge, umgewandelt werden, wird die Gleichung 15 zu
DRS/dt = [(k'2 – k'1)Vm(LH) 1/2]/4(k'2 + 1) (16)
Im Falle der Größenausschlusschromatographie (SEC), wenn sowohl R als auch RL von den Poren ausgeschlossen sind, gilt: k'₁ = 0, und Gleichung 16 reduziert sich auf
DRS/dt = [(k'2Vm(LH)1/2]/4 (k'2 + 1) (17)
Da Peptide klein sind, eluieren sie in der Regel von einer SEC-Säule in dem insgesamt eingeschlossenen Volumen, das heißt V_o + V_i. Dies bedeutet, dass
K'2 = Vi/vo (18)
In diesem speziellen Fall. wird Gleichung 18 zu
DRS/dt = [(Vi/vo)Vm(LH)1/2]/[4{(Vi/Vo) + 1}] (19)
Der Fall der Größenausschlusschromatographie (SEC) ist einem Dialysesystem sehr ähnlich, in dem das Unvermögen eines makromolekularen Rezeptors zum Durchdringen einer Porenmatrix ihn von bestimmten flüssigen Elementen des Systems ausschließt. In dem SEC-System dissoziiert der RL-Komplex, und der Ligand L diffundiert in die Poren der SEC-Matrix, aus der RL und R ausgeschlossen sind. Da sich der makromolekulare Rezeptor R schneller durch eine SEC-Säule bewegt als der niedermolekulare Ligand (L), bewegt sich R von der Zone von L in den Poren des Trägers weg. Dies schließt die Reassoziation zu RL aus. Wenn diese Trennung von R und L erfolgt ist, muss zur Aufrechterhaltung des Gleichgewichts in Gleichung 1 mehr RL disoziieren. Wenn diese Trennung von R und L sehr schnell erfolgt, wird die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts von der Rückgeschwindigkeit (k₂) abhängig. Dies bedeutet, dass eine niedrige Mobilphasengeschwindigkeitswahl von der Gleichgewichtskonstante (Kb) abhängt, während eine hohe Mobilphasengeschwindigkeitswahl auf der Geschwindigkeitskonstante k₂ beruht.
Das Screening auf der Basis der Dissoziationsgeschwindigkeit des RL-Komplexes kann auf mehreren Wegen erreicht werden, wie vorstehend beschrieben. In den vorstehend beschriebenen Systemen nimmt die Konzentration des Rezeptors [R] zu, wenn der Ligand von einem Abschnitt der Säule eluiert. Da die Geschwindigkeit der Komplexbildung viel höher ist als die Geschwindigkeit der Dissoziation, ist es unmöglich, die Rückgeschwindigkeitswahl in porösen chromatographischen Sorbensmaterialien durchzuführen. Das nachstehend beschriebene Konzept gestattet die Rückgeschwindigkeitswahl unter Ausnutzung der Tatsache, dass nach der Komplexdissoziation eine geringe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass der Ligand, wiederum vor der Elution von dem System, eine Rezeptor-tragende Oberfläche kontaktiert.
Die Massenübertragung auf die Wände von Offenrohrsäulen, die mit wässrigen mobilen Phasen eluiert werden, ist bekanntlich schlecht. Die Massenübertragung auf die Wände von Offenrohrsäulen nimmt mit dem reziproken Quadrat der Zunahme des Säulendurchmessers und dem Quadrat der Zunahme der linearen Geschwindigkeit der mobilen Phase ab. Säulen von 300–1000 μm mit immobilisiertem Rezeptor (R) werden durch Füllen der Säule mit einer Reihe von Liganden und Äquilibrieren lassen des Systems bei einer mobilen Phasengeschwindigkeit von Null beladen. Ist die Summe der Konzentration von Ligandenspezies ([L₁ ... [L_a]) > [R] , konkurrieren die Liganden um eine Bindungsstelle. Die Menge eines gebildeten RL-Komplexes ist eine Funktion sowohl der Konstante des bestimmten Liganden für den Rezeptor als auch der Konzentration dieses Liganden. Nach Erreichen des Gleichgewichts werden nicht gebundene Liganden aus der Säule gespült. Die Elution von L in dem gebundenen RL-Komplex beruht auf der Rückgeschwindigkeit. Unter der Annahme, dass nach der Dissoziation von RL zu L keine Reassoziation erfolgt, ist die Geschwindigkeit der Liganden(L)-Elution von der Säule durch die Gleichung
–d [RL]/dt = k2[RL] (20)
gegeben, wobei k₂ die Rückgeschwindigkeitskonstante ist. Die Integration zwischen der Grenze der Anfangskonzentration [RL]_i des Komplexes und der Konzentration [RL], zur Zeit t ergibt die Gleichung
2,3 log([RL]/[RL]i) = –k2t (21)
Die Rückgeschwindigkeit und die Geschwindigkeit, mit der der Ligand von der Säule gespült wird, kann auch bezogen auf die Halbwertszeit (t_1/2), d. h. die Zeit, die zur Elution der Hälfte des Liganden von der Säule benötigt wird, ausgedrückt werden. Aus der vorstehenden Gleichung kann gezeigt werden, dass
t1/2 = 0, 693/k2 (22)
Zusammenfassend besteht die Grundannahme in diesem Modell der Wahl der Rückgeschwindigkeit darin, dass nach aufgetretener Dissoziation keine Reassoziation von R und L an den Wänden der Kapillaren stattfindet. Dies trifft wahrscheinlich nicht vollkommen zu. Die Wände einer Kapillare sind nicht gut gespült, d. h. es existiert eine Stagnationsschicht von Flüssigkeit an den Wänden. L muss durch diese Schicht hindurch diffundieren, bevor er in die schnell bewegende Flüssigkeit in der Mitte der Kapillare entweicht, wo er schnell aus der Kapillare abtransportiert wird. Der Wert der Verwendung dieses Models besteht darin, dass die Massenübertragung i) die Selektionsverfahren in den Chromatographiesäulen dominiert und ii) sie in großen Offenrohrkapillaren um Größenordnungen schlechter ist als in porösen Teilchen.
Eine Familie von Chromatographiesäulen wurde während der letzten 10 Jahre auf der Basis des Konzepts entwickelt, dass Flüssigkeitschromatographie-Trennungen erreicht werden können durch i) Verwendung von porösen Matrizen, in denen der Zugang von Analyten zum Inneren eines Teilchens durch die molekulare Größe gesteuert wird und durch ii) das Vorliegen der stationäre Chromatographiephase nur im Inneren des Teilchens. Diese restriktiven Zugangsmedien sind teilweise bei der Abtrennung niedermolekularer Arzneimittel im Serum von Proteinen hilfreich. Die ersten dieser Säulen waren die "internal surface reversed phase (ISRP)"-Medien.
Diese Säulen, wie sie zum Screening angewandt werden, kann man sich folgendermassen vorstellen. Da große Rezeptormoleküle vom Zugang zum Inneren der ISRP-Medien ausgeschlossen sind, können sie als einer Dialysemembran ähnlich betrachtet werden. In einem Dialysesystem ist der makromolekulare Rezeptor auf eine Seite der Membran beschränkt, da er aufgrund seiner physikalischen Größe von einem Durchtritt durch das Porennetzwerk der Membran ausgeschlossen ist. Im Gegensatz dazu können kleine Liganden die Poren der Membran durchdringen und gewinnen Zugang zum gesamten Flüssigkeitsraum im System. Die Dialyse wird durch wiederholte Entfernung von Flüssigkeit, die Ligand enthält, von der nichtproteinhaltigen Seite der Membran erreicht.
Das ISRP-Chromatographiesystem funktioniert beim Screening dadurch, dass i) nur dem Ligand (L) die Gewinnung des Zugangs zum Inneren der Teilchen, die die stationäre Phase enthalten, ermöglicht wird, ii) L mit hoher Affinität an der internen reversen Phase zurück gehalten wird, wenn der Komplex RL dissoziiert und L in das Innere des ISRP-haltigen Teilchens diffundiert, und durch iii) Transportieren des RL-Komplexes durch die Chromatographiesäule. Dieses System liegt bezüglich der Tatsache, dass i) es die niedermolekularen Spezies (L), die aus dem Protein entfernt werden, aktiv zurück hält und ii) dass der Strippingprozess in den Chromatographiesäulen viel häufiger wiederholt wird als es in einem Dialysesystem praktikabel ist.
Noch ein weiteres Merkmal des ISRP-Wegs besteht darin, dass Diffusionsentfernungen zur Oberfläche des Teilchens, an dem L fest gehalten wird, klein sind und L nach der Dissoziation aus dem RL-Komplex schnell fest gehalten wird. Dies bedeutet, dass die Geschwindigkeit der Entfernung von L von der Dissoziationsgeschwindigkeit und nicht von der Gleichgewichtskonstante Kb abhängt und es auch möglich ist, aus Gemischen von vielen RL-Spezies zu wählen.
B. KONFIGURATIONEN
Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Erfindung eine erste Säule mit dem daran immobilisierten Ziel von Interesse umfassen. Wenn somit die Probe über die erste Säule geleitet wird, werden die Liganden, die an das Ziel binden, unter Bildung eines Ziel/Ligand-Komplexes daran immobilisiert. Der von der ersten Säule fest gehaltene Komplex wird durch Variation der Waschvolumina dissoziiert.
Die beanspruchte Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalt von Information über einen bestimmten Ligand ohne das Erfordernis manueller Manipulationen, ohne Rücksicht auf die Größe der Probe oder die Menge des in der Probe vorhandenen Liganden bereit. Diese Verfahren stellen bemerkenswerterweise erstmalig ein schnelles automatisierbares Mittel zur Arzneimittelentdeckung bereit. In kurzer Zeit können praktisch Millionen von Verbindungen auf eine bestimmte biologische Aktivität durchmustert werden und führen somit zu wesentlichen Fortschritten auf dem Gebiet der Biotechnologie, der pharmazeutischen Entwicklung, der Diagnostik und Therapeutik. Diese erfindungsgemäßen Verfahren gestatten dem Fachmann Liganden für ein Ziel von Interesse auf der Basis von einem oder mehreren Merkmalen zu wählen, wie (1) Hingeschwindigkeitskonstante eines Liganden zum Ziel, d. h. die Hingeschwindigkeit (2) Umkehrgeschwindigkeitskonstante, d. h. die Rückgeschwindigkeitskonstante oder die Gleichgewichtskonstante unter Bedingungen, unter denen die Variation von Ionenstärke, pH-Wert, Konzentration der kompetitiven Bindungsmittel, organischer Lösungsmittelkonzentration und beispielsweise Temperatur möglich ist. Sämtliche Bedingungen, die potentiell die Bildung eines Ziel/Ligand-Komplexes beeinflussen, können variiert und als Selektionskriterien verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren gestatten auch die schnelle Wahl eines Liganden für ein Ziel von Interesse, die Charakterisierung praktisch sämtlicher potentieller Bindungsmerkmale des Liganden und die Gewinnung des Liganden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden eine Tandemsäulen-Chromatographietechnik: Jede Säule, die zur Trennung von Molekülen in der Lage ist, kann bei den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Somit können in Abhängigkeit des gesuchten Ergebnisses die Säulen in dem System aus der Gruppe, bestehend aus Affinitätssäulen, Größenausschlusssäulen und/oder Reversed-Phase-Säulen ausgewählt werden. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Tandemmodus", dass mindestens zwei Säulen an dem System, entweder simultan oder nacheinander, beteiligt sind. Wenn die Säulen simultan im Tandemmodus betrieben werden, kann die Probenlösung aufgespalten und jeder Säule zugeführt werden. Wenn sie nacheinander betrieben werden, sind die Säulen so angeordnet, dass das Eluat einer Säule direkt der zweiten Säule zugeführt wird.
Die beanspruchten Verfahren können in verschiedenen Ausführungsformen eine Säule auf Affinitätsbasis einsetzen. Bei einem auf der Affinität basierenden Screening werden Tandem-Chromatographiesäulen zum Screening auf Liganden in einer Probe verwendet.
Es wird nun ausführlich auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen. Die mehrdimensionalen erfindungsgemäßen verfahren in verschiedenen Ausführungsformen betreffen den Nachweis des Vorliegens eines Liganden mit einer Affinität K zu einem vorgewählten Zielmolekül in einer Probe von in einem Lösungsmittel gelösten heterogenen Liganden. Die Erfindung gestattet die Gewinnung von zielgebundenen Liganden sowie die gleichzeitige Wahl von Liganden und die Bestimmung ihrer relativen Affinitäten während des Screeningverfahrens. Wie hier ausgeführt, betrifft die Erfindung ein mehrdimensionales Verfahren zum Hochempfindlichkeitsnachweis und zur Hochempfindlichkeitsanalyse von Liganden oder Analyten in Proben und die Test und weitere "Dimensionen" des Systems. Die Erfindung umfasst ein mehrdimensionales System, das beispielsweise das Screening von Bibliotheken, die Wahl von Liganden und die Gewinnung von Liganden mit bestimmter Aktivität und die anschließende Identifizierung umfassen kann. Insbesondere können die Dimensionen jedes beliebigen Verfahrens zur Verteilung von Komponenten einer Probe, einschließlich beispielsweise Immuntests, wie Affinitätschromatographie, Reversed phase-Chromatographie und Größenausschlusschromatographie umfassen. Die hier in der Spezifikation und in den Ansprüchen beschriebenen Techniken stellen einen mehrdimensionalen Weg zum Screening von Proben dar, wobei die Trennungen, chemischen Reaktionen und die Massenspektrometrie integriert und vorzugsweise automatisiert sind.
Das mehrdimensionale Verfahren kann bei verschiedenen Ausführungsformen die folgenden Schritte umfassen: (1) Erzeugung einer Probe von potentiellen Liganden; (2) Bereitstellen eines Trägers mit einer Konzentration eines daran immobilisierten Zielmoleküls; (3) Screening nach einem Liganden für das Zielmolekül, wobei der Ligand eine oder mehrere gewünschte Eigenschaften aufweist; (4) Abtrennung derjenigen Liganden, die gewünscht sind; (5) Gewinnung des erhaltenen Liganden; (6) Identifizierung der gewählten Liganden; und (7) Synthese des Liganden oder Derivate hiervon in großem Maßstab zu diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen. Die wirksamste Kombination von Analysedimensionen kann leicht von einem Fachmann auf der Basis der gewünschten bestimmten Ergebnisse bestimmt werden.
Solche bei dem erfinderischen Verfahren brauchbaren mehrdimensionalen Systeme gestatten das schnelle Screening von Bibliotheken von Liganden auf ihre Fähigkeit, ein bestimmtes "Zielmolekül" ("Ziel" oder "Rezeptor") von Interesse zu binden. Das Zielmolekül kann jedes beliebige Molekül sein, für das ein Ligand gewünscht ist, wie beispielsweise Proteine, Peptide, Nucleinsäure, monoklonale oder polyklonale Antikörper etc.
Das Screening löslicher Bibliotheken von Peptiden oder kleinen Molekülen zur Identifizierung von Liganden, die an ein spezielles Zielmolekül binden, wird in der pharmazeutischen Industrie zu einer breit eingesetzten Technik. Das Screening dieser Bibliotheken kann zur Entwicklung neuer Therapeutika und/oder Diagnostika führen. Das Screening erfordert sowohl ein Selektionsverfahren als auch ein Verfahren zur Bewertung der relativen Affinitäten der Liganden. Verfahren, die aus der Technik bekannt sind, erfordern somit zwei getrennte Schritte zur Bestimmung der Akzeptanz eines bestimmten Liganden. Oft wird nach dem Screening der Probe und Gewinnung eines gewünschten Liganden festgestellt, dass der gewählte Ligand eine unerwünschte Affinität zu dem Ligand besitzt. Wie von einem Fachmann erkannt wird, erfordern verschiedene Anwendungen oft Liganden mit spezifischer Affinität. Zur Bestimmung der Brauchbarkeit des gewählten Liganden für die gewünschte Anwendung müssen zahlreiche Variablen berücksichtigt werden. Beispielsweise kann ein Ligand mit einer bestimmten Hin- oder Rückgeschwindigkeit oder ein Ligand, der an ein Zielmolekül, jedoch nicht an ein anderes Zielmolekül bindet, bevorzugt werden. Bis zur vorliegenden Erfindung umfasste darum das gesamte Selektionsverfahren mehrere getrennte Schritte, um nicht nur einen Ligand für ein Ziel zu identifizieren, sondern um weiterhin auf der Grundlage zusätzlicher Merkmale die Wahl zu treffen.
Die beanspruchten Verfahren gestatten die neue und schnelle Bestimmung von relativen Affinitäten für Liganden, die an ein gewähltes Zielmolekül binden, zusätzlich stellen die Verfahren die Gewinnung der zielgebundenen Liganden bereit und bieten die gleichzeitige Wahl von Liganden und die Bestimmung ihrer relativen Affinitäten oder anderer Bindungsmerkmale während des Screenings einer Bibliothek von Verbindungen.
Mehrdimensionale Analysesysteme, wie hier offenbart, stellen mehrere Ausführungsformen bereit, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Screening, zur Selektion und Gewinnung von gewünschten Liganden geeignet sind. Die Automatisierung dieser Tests ist bevorzugt, allerdings war historisch gesehen die Lösungsmittelkompatibilität ein nennenswerter Nachteil dieses Wegs. Die Erfinder haben dieses Problem durch Einführung eines universellen Lösungsmittelaustauschverfahrens in ihre mehrdimensionalen, bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Testsysteme vermieden.
Bei verschiedenen Ausführungsformen betrifft die Erfindung die mehrdimensionalen Trennungen, die die hohe Auflösung komplexer Gemische bereitstellt. Auf Grund der Möglichkeit der direkten Kopplung verschiedener analytischer Komponenten können die Probenhandhabungs- und Übertragungsschritte praktisch weggelassen werden. Dies ist besonders kritisch, wenn versucht wird, Liganden, die auf sehr geringen Nachweisniveaus vorhanden sind, zu isolieren und nachzuweisen.
Das System, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar ist, betrifft ein mehrdimensionales System, das eine Reihe von Chromatographiesäulen, wie Größenausschluss-, Ionenaustauscher- und Reversed-Phase-Säulen, sowie einen oder mehrere Detektoren, wie ein Massenspektrometer, umfasst.
Das integrierte Koppeln verschiedener Dimensionen, wie Mikrosäulenaffinitätschromatographie mit kapillarer Reversed phase-HPLC/Elektrosprühionisationsmassenspektrometrie, in einem automatisierten mehrdimensionalen System sollte einen hoch empfindlichen und hoch selektiven Weg zur Entschlüsselung komplexer Gemische ermöglichen. Das System sollte die schnelle Säulen- und Lösungsmittel-Umschaltmöglichkeit erlauben. Ein Fachmann kann dem System leicht zusätzliche Dimensionen hinzufügen, indem mit der Probe oder einer Unterserie hiervon mehr Trenn- oder Identifikationsverfahren durchgeführt werden. Dem System kann jede geeignete "Dimension" hinzugefügt werden, d. h. alle Trennverfahren, wie zwei verschiedene Chromatographiesäulen oder alle anderen Trennverfahren, die verschiedene räumliche oder zeitliche Verteilungen der einzelnen Komponenten des Systems erzeugen.
Die beanspruchte Erfindung betrifft ein Verfahren unter Verwendung eines mehrdimensionalen Systems, das zwei oder mehrere chromatographische oder andere Trenndimensionen umfasst, die im Tandemmodus zusammengelötet sind. Bei einer Grundausführungsform sind zwei Chromatographiesäulen im Tandemmodus zusammengelötet. Die erste Säule wird auf der Grundlage der gewünschten Anwendung und auf der Grundlage der Probe gewählt. Die erste Säule kann eine Affinitätschromatographiesäule sein, d. h. eine Säule, die ein stationäres poröses Medium enthält, das zu den verschiedenen Komponenten in der Probe eine unterschiedliche Affinität besitzt; allerdings kann auch ein nicht poröses Medium verwendet werden. Diese Säule kann jeder feste Träger sein, wobei das Ziel von Interesse daran immobilisiert ist. Solche vorgewählten Ziele können Moleküle sein, wie Rezeptoren, Enzyme, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Mucopolysaccharide, Antikörper oder Bindungsproteine. Zusätzlich geeignete Zielmoleküle umfassen major histokompatibility Moleküle, T-Zellrezeptoren, Antigene, Zelladhäsionsmoleküle, Zellrezeptoren für Hormone und wachstumsregulierende Faktoren und Virusrezeptoren. Liganden für diese Ziele von Interesse stellen eine Sammlung von möglichen Immunagonisten, – antagonisten, antiviralen Liganden und strukturellen Leitverbindungen für den Aufbau kleiner Moleküle mit gewünschter Bioaktivität bereit. Beim Durchströmen des Trägers der Probe adsorbieren die Liganden an das Ziel an den Bindungsstellen und werden an der Säule zurück gehalten. Ferner kann eine bestimmte Menge von Lösungskomponenten nicht spezifisch an den Träger binden.
Die bei der Erfindung zu verwendenden Affinitätssäulen können jeden beliebigen festen Träger umfassen, der die Bindungsaktivität des Zielmoleküls nicht beeinflusst. Träger, die üblicherweise verwendet werden, sind kontrolliert poröses Glas, Kieselgel, Silicagel, Membranen, Trägerperlen auf Polystyrolbasis, Glasfaserfritten und Papierfilter. Obgleich Perfusionsmatrixmaterialien bevorzugt sind, kann die Erfindung auch mit einer nicht-porösen Matrix in den gekrümmten Kanälen, die im interstitiellen Raum zwischen den nicht porösen gepackten Teilchen ausgebildet sind, durchgeführt werden. Diese Matrizen besitzen eine geringere Nettokapazität als die Perfusionsmatrizen, allerdings können sie für die Mikroanalyse sehr brauchbar sein. Zusätzlich zu gepackten Teilchen können Matrizen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Gerät brauchbar sind, als Bündel von Mikrokapillaren ausgeführt sein. Ein hohes Verhältnis von spezifischer Oberfläche/Volumen kann durch die Verwendung von sehr kleinen Innendurchmesser-Kapillaren bereitgestellt werden, wobei ein Reaktionsgefäß von einigen Mikrolitern/Zentimeter bereitgestellt wird. Gleichermaßen kann das Bindungsprotein auf die Innenfläche der Kapillarröhre aufgebracht werden. Gelöste Stoffe können durch Konvektion durch die Kapillarröhrenmatrix transportiert werden. Das große Verhältnis von spezifischer Oberfläche zu Volumen der Kapillarröhren vergrößert das verfügbare Reaktionsvolumen. Die Matrizen können außerdem eine Membranstruktur umfassen.
Die Matrix ist vorzugsweise ein starres, im wesentlichen nicht mikroporöses teilchenförmiges Material mit hydrophiler Oberfläche und ist vorzugsweise auch eine Perfusionschromatographiematrix. Die Matrix kann auch durch die innere Oberfläche einer Kapillare definiert werden. Die Verfahren umfassen zuerst das Beladen einer Säule mit bekannter Konzentration T an Zielmolekülen.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann die erste Säule eine Größenausschlusssäule oder ein Dialysesystem umfassen, das in der Lage ist, Komponenten der Probe auf der Basis der Größe aufzutrennen. Verschiedenen Komponenten der Probe wandern mit verschiedenen Geschwindigkeiten durch die Säule; Liganden, die an das Ziel gebunden waren, und dadurch einen Komplex bilden, eluieren vor Elution kleinerer Molekülspezies. Somit enthält der erste Teil des austretenden Stroms den Liganden, der an das Ziel gebunden ist. Es ist bevorzugt, Teilchen zu verwenden, die zur Perfusionschromatographie in der Lage sind, da die Perfusionsteilchen den Betrieb des Systems bei sehr hohen Fließgeschwindigkeiten gestatten, während sowohl die hohe Probenbeladungskapazität als auch die chromatographische Auflösung beibehalten werden. Vorzugsweise sind die Perfusionsteilchen POROS^®-Perlen, die von der Firma PerSeptive Biosystems Inc. (Framingham, MA) erhältlich sind.
Bei verschiedenen Ausführungsformen ist eine zweite Säule, die im Tandemmodus mit der ersten Säule verlötet ist, noch eine weitere chromatographische Trennsäule. Insbesondere kann die zweite Säule eine Affinitätssäule, wie vorstehend beschrieben, sein, wobei daran ein zweites Ziel von Interesse immobilisiert ist, das im Vergleich zu dem an der ersten Säule immobilisierten Ziel unterschiedlichen physikalischchemischen Eigenschaften aufweist. Diese Konfiguration gestattet die Wahl und Trennung von Liganden auf der Grundlage von einer oder mehreren verschiedenen physikalischchemischen Eigenschaften. Es kann auch beabsichtigt sein, dass sowohl die erste als auch die zweite Säule daran das immobilisierte Zielmolekül von Interesse aufweisen, wie bei einem Nachweistest.
Die zweite Säule ist ein Akkumulator, das heißt, eine Säule, die zur nicht spezifischen Adsorption von Liganden und gegebenenfalls zur Ermöglichung der Trennung der adsorbierten Liganden durch Elution ausgelegt ist. Eine Reversed-Phase-Säule ist ein bevorzugter Akkumulator.
Zunehmende Waschvolumina ergeben die am stärksten affinen Liganden, die auf der Säule am längsten zurück gehalten werden. Umgekehrt besitzen niedrig affine Liganden eine kürzere Retentionszeit auf der Säule. Es besteht eine direkte Korrelation zwischen den Waschvolumina, die zum Waschen der an die erste Säule gebundenen Liganden eingesetzt werden, und ihren relativen Affinitäten.
Bei verschiedenen Ausführungsformen sind die Waschvolumina, die durch die erste Säule geleitet werden ein Anzeichen für die Dissoziationsgeschwindigkeit von dem Ziel. Wenn beispielsweise verschiedene Liganden über die erste Säule geleitet und bis zum Gleichgewicht inkubiert werden, muss die Gegenwart eines bestimmten Liganden in dem Eluat ein Faktor der Dissoziationsgeschwindigkeit von dem Ziel sein. Die Dissoziationsgeschwindigkeit ist von der Zeit, der Verdünnung und den Assoziations-/Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten abhängig. Die Zeit- und Verdünnungsfaktoren können gesteuert werden, und somit sollte der Verlust an Ligand, der an sein Ziel gebunden ist, unter diesen Bedingungen direkt mit der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (d. h. der Rückgeschwindigkeit) des Liganden zusammen hängen. Das Zielmolekül kann mit vor der Immobilisierung oder vor dem Einbringen der löslichen Bibliothek einem Ligand äquilibriert werden.
Somit wird bei bestimmten Ausführungsformen die erste Affinitätssäule mit einem daran immobilisierten Ziel im Tandemmodus mit einem Akkumulator, wie eine Reversed-Phase-Säule zur Immobilisierung daran von Liganden mit gewünschter Affinität, verlötet.
Durch Elution der Reversed-Phase-Säule lassen sich die Liganden gewinnen, und die Peakhöhen der entsprechenden Peaks stellen ein Maß für die Menge des Liganden bereit, die bei einem bestimmten Waschvolumen an das Ziel gebunden ist. Unter diesen Bedingungen korreliert das Waschvolumen mit den Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten der Liganden und kann einen Hinweis auf die relativen Affinitäten der Liganden liefern, die mit einem Ziel auf ähnliche Weise Wechselwirken. Die Verfahren können zum Screening einer Bibliothek von Verbindungen angewandt werden, wobei die Wahl von Liganden und die Bestimmung ihrer relativen Affinitäten gleichzeitig erreicht werden können, was die Wahl von Bindern der gewünschten Affinität ermöglicht.
Somit ist dem Praktiker zum ersten Mal in der Lage, einen Ligand auf der Grundlage nicht nur seiner Fähigkeit, an ein Ziel zu binden, sondern auch auf der Grundlage seiner Affinität zu diesem Ziel, d. h. der Hingeschwindigkeit oder der Dissoziationsgeschwindigkeit (Rückgeschwindigkeit), zu wählen. Diese Fähigkeit ist besonders bei Arzneimittelscreening-Anwendungen relevant, wobei die Dissoziationsgeschwindigkeit für die Wirksamkeit der Zusammensetzung kritisch sein kann. Da die an das Ziel gebundenen Liganden später entfernt werden können, kann eine weitere Charakterisierung oder Entwicklung der gewählten Binder durchgeführt werden, wie nachstehend ausführlicher erläutert.
Die Verfahren erlauben es dem Praktiker, unter Anwendung praktisch jedes Affinitätsselektionsverfahrens Liganden für das Ziel von Interesse zu wählen. Beispielsweise kann durch Variation der Gebundenheit, d. h. Variation der Waschvolumina auf der Grundlage beispielsweise von (1) Affinität, (2) Hin- oder Rückgeschwindigkeit, (3) Waschbedingungen (pH, Innenstärke, Temperatur) gewählt werden.
Die Verfahren erlauben es dem Praktiker unter Anwendung praktisch eines jeden Affinitätsselektionsverfahrens, Liganden für das Ziel von Interesse zu wählen. Die wirksamste Kombination von Analysedimensionen kann von einem Fachmann leicht auf der Grundlage der gewünschten speziellen Ergebnisse bestimmt werden. Das beanspruchte System ist insofern zweckmäßig, als durch die direkte Kopplung verschiedener Einheitsvorgänge über Mikrolitervolumen-Verbindungen Verdünnung, Verlust und Kontamination von Proben durch Umgehen des Fraktionssammelns und der manuellen Probenübertragungen vermindert werden. Ein zweiter Vorteil ist die Verwendung der direkten Übertragung mit einer Analytenanreicherung am Einlass der nachgeschalteten Säulen, entweder direkt oder durch Verwendung von Mobilphasenaustauschersystemen. Beispielsweise kann ein Akkumulator, wie eine Reversed-Phase-Säule, zwischen beliebigen Dimensionen des Systems angeordnet werden. Dadurch fallen die manuellen Vorgänge der Konzentrierung und des Austauschs von mobilen Phasen zwischen den Trennschritten weg.
Zusätzlich können die vorstehend beschriebenen Verfahren so konfiguriert werden, dass die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Liganden charakterisiert ist. Diese Experimente können zweckmäßigerweise durch Zusammenlöten verschiedener Säulen im Tandemmodus und ohne dass das Anbringen einer Markierung an dem Liganden erforderlich ist, durchgeführt werden. Ein oder mehrere der Faktoren kann kombiniert werden, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen.
Somit kann der Praktiker die erfindungsgemäßen Verfahren in bestimmten Ausführungsformen zum Screening von Liganden auf ihre Fähigkeit, an ein bestimmtes erstes Zielmolekül zu binden, und ihre Unfähigkeit, an ein zweites Ziel zu binden, anwenden. Diese Technik sollte in der Regel zur Wahl von Liganden anwendbar sein, die zwischen zwei verschiedenen Zielen differenzieren. Die beanspruchten Verfahren gestatten es dem Fachmann bemerkenswerterweise, Liganden schnell auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, an bestimmte Ziele und nicht an andere Ziele zu binden, zu wählen. Diese Fähigkeit ist besonders auf pharmazeutischem Gebiet kritisch, wo potentielle neue Arzneimittel nicht nur fremde oder pathogene Ziele, sondern auch Wirtsmoleküle beeinflussen können. Dies beruht auf der stark konservativen Natur von pathogenen Zielen und Wirtszielen. Unter Anwendung der beanspruchten Verfahren kann ein Ligand gewählt werden, der beispielsweise an ein pathogenes Ziel, d. h. ein Bakterienprotein, allerdings nicht an das homologe Wirtsziel, bindet. Die als subtraktives Screening bezeichnete Technik kann zur Differenzierung zwischen zwei beliebigen Bindungsmerkmalen angewandt werden. Beispielsweise kann die Technik nicht nur zwischen Pathogenen und Wirten differenzieren, sondern sie kann auch zur Differenzierung zwischen einer chiralen oder einer nicht chiralen Molekülform; zwischen Wildtypziel und mutierten Proteinen und verschiedenen Unterklassen oder Varianten eines Ziels verwendet werden.
Alternativ kann eine Unterklasse an einer Säule immobilisiert und sowohl die Probelösung als auch das zweite UnterklassenZielmolekül eingeführt werden. Die Liganden, die vorzugsweise an das zweite Unterklassenziel binden, verbringen mehr Zeit in der mobilen Phase und werden somit zuerst von der Säule eluiert. Liganden, die vorzugsweise an das erste Unterklassenziel binden, eluieren zuletzt von der Säule. Das mittlere Eluat ist offenbar eine Kombination aus variierenden Affinitäten sowohl der Unterklasse eins als auch zwei.
Bei anderen Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemässen Verfahren und Systeme weitere Techniken zur Wahl von Liganden für ein Ziel von Interesse. Die Erfinder haben neue Verfahren nicht nur zur Wahl bestimmter Liganden auf der Grundlage von Affinität oder subtraktivem Screening, sondern auch zur Wahl von Liganden, die an einer bestimmten Bindungsstelle an ein Ziel von Interesse binden, entwickelt. Bei den letzteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Verwendung eines ersten Trennsystems, gefolgt von einem Akkumulator, wie eine Reversed-Phase-Säule. Wie vorstehend diskutiert, umfassen die Verfahren zwei Dimensionen, die im Tandemmodus zusammen gelötet sind.
Die erste Dimension, ein Größenausschluss-Chromatographiesystem, ist einem Dialysesystem sehr ähnlich, in dem die Unfähigkeit eines Ziel oder eines Rezeptors zum Durchdringen einer Porenmatrix es von bestimmten flüssigen Elementen des Systems ausschließt. In der Tat kann diese erste Dimension ein Dialysesystem oder jedes beliebige andere System sein, das zum Auftrennen von Ziel/Ligand-Komplexen und ungebundenen Komponenten in der Lage ist. Somit kann eine Probelösung mit dem Ziel von Interesse zusammengebracht werden, und die Liganden für das Ziel binden daran. Sodann kann die Lösung ein Gemisch von ungebundenen Probenkomponenten und den Ligand/ Ziel-Komplex enthalten, das in eine SEC-Säule übergeführt werden kann. Alternativ können Ziel und Probe direkt auf die SEC-Säule aufgegeben werden. Wird dieses Gemisch auf eine SEC-System aufgegeben, diffundieren ungebundene Komponenten in die Poren der SEC-Matrix, allerdings sind der Komplex und das Ziel aufgrund ihrer Größe ausgeschlossen. Da sich der makromolekulare Ziel/Ligand-Komplex schneller durch eine SEC-Säule bewegt als die niedermolekularen Komponenten, eluiert der Komplex zuerst von der Säule. Das Eluat, das Ziel/Ligand-Komplexe enthält, kann sodann einer zweiten Dimension, wie einer Affinitätssäule, zugeführt werden. Ein bekannter Ligand wird an der Bindungsstelle von Interesse an der Affinitätssäule immobilisiert. Liganden, die von dieser zweiten Säule eluieren, sind diejenigen Liganden, die an die Stelle von Interesse binden und die von dem bekannten, an der Säule immobilisierten Ligand verdrängt wurden. Durchläuft das Eluat die immobilisierte Säule, können schwach gebundene Komplexe dissoziieren, wenn die Trennung von Ziel und Ligand sehr schnell erfolgt, wobei die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts von der Rückgeschwindigkeit (k₂) abhängig wird. Dies bedeutet, dass die Wahl einer wenig mobilen Phasengeschwindigkeit von der Gleichgewichtskonstante abhängt, während bei einer hohen Geschwindigkeit der mobilen Phase die Wahl auf der Geschwindigkeitskonstante k₂ beruht.
Somit kann ein Ligand gewählt werden, der mit der Bindungsaffinität des natürlichen Paars von Ligand/Ziel interferiert. Liganden, die durch diese Technik identifiziert werden, sind besonders gut zur Verwendung als Pharmazeutika oder diagnostische Hilfen geeignet. Beispielsweise haben Wissenschaftler die Beziehung zwischen CD4 und gp120 in mit dem human immunodeficiency virus (HIV) Infizierten erkannt. Somit wäre der Erhalt eines Liganden hilfreich, der die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Molekülen unterbrechen und dadurch den aktiven Komplex inaktivieren kann. Unter Verwendung einer Affinitätssäule können Liganden gewählt werden, die an das Ziel von Interesse binden. Diejenigen Liganden, die binden, werden von der Affinitätssäule eluiert und einer anderen Affinitätssäule zugeführt. Die zweite Säule kann eine Größenausschlusssäule sein. Die von der ersten Säule eluierten Ziel/Ligand-Komplexe werden dann zusammen mit einem bekannten Ligand in die zweite Säule eingebracht. Der bekannte Ligand kann jeder beliebige Ligand sein, der bekanntlich an das bestimmte Epitop bindet, für das ein Binder gesucht wird. Somit konkurriert der bekannte Ligand mit dem Ligand am Ziel/Ligand-Komplex und verdrängt die Liganden, die an die gewählten Stelle auf dem Zielmolekül binden.
Es können Anwendung dieser Technik betrachtet werden, wobei auf der zweiten Säule ein DNA-Transkriptionsfaktor immobilisiert wird, wodurch der Nachweis eines Liganden erleichtert wird, der auf dem Transkriptionsfaktor an die gleiche Stelle wie DNA bindet.
Unter Anwendung der beanspruchten Verfahren existieren alternative Techniken zum Erhalt des gleichen Ergebnisses. Beispielsweise kann das Eluat aus einer Säule, die sowohl das Zielmolekül als auch einen bekannten Ligand enthält, mit dem Eluat aus einer Säule, die nur das Zielmolekül enthält, zur Wahl ortspezifischer Binder verglichen werden.
Das Screening auf der Grundlage der Geschwindigkeit der Dissoziation des Ligand/Ziel-Komplexes kann auf mehreren Wegen erreicht werden. In den vorstehend beschriebenen Systemen erhöht sich die Konzentration des Ziels bei Elution des Liganden von einem Abschnitt der Säule. Da die Geschwindigkeit der Komplexbildung viel höher ist als die Geschwindigkeit der Dissoziation, ist es unmöglich, die Wahl der Rückgeschwindigkeit in porösen chromatographischen Sorbentien durchzuführen. Die nachstehend beschriebene Ausführungsform gestattet die Wahl der Rückgeschwindigkeit durch Ausnutzung der Tatsache, dass nach der Komplexdissoziation eine geringe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass der Ligand eine Ziel-tragende Oberfläche wiederum vor der Elution aus dem System kontaktiert.
Bei verschiedenen Ausführungsformen betreffen zusätzliche Dimensionen die Wahl und Gewinnung von Liganden mit einer vorgewählten Affinität gegenüber einem Ziel von Interesse. Die vorgewählte Affinität bezieht sich auf die Fähigkeit des Liganden zur spezifischen Bindung an das Zielmolekül, d. h. auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Ziel und Ligand. Typische Werte für die vorgewählte Affinität liegen in der Größenordnung von 10^–3 l/mol bis etwa 10^–4 l/mol minimal und betragen vorzugsweise etwa 10^–8 bis etwa 10^–10 l/mol. Der vorgewählte Affinitätswert hängt von der Umgebung, in der der Ligand und das Zielmolekül vorkommen, sowie von ihrer Konzentration ab. Bei einigen Anwendungen ist eine niedrigere Affinität akzeptabel, während bei anderen Anwendungen der Affinitätswert viel höher sein kann. Ein Fachmann kann die gewünschte Affinitätskonstante in Abhängigkeit des bestimmten Ziels und der Anwendung von Interesse routinemäßig bestimmen.
Es ist auch möglich, die spezifischen Bindungsbedingungen durch Wahl der mobilen Phase zu wählen, mit der die Säule nach der Peptidbindung gewaschen wird. Zur Bestimmung von T für eine bestimmte Anwendung kann ein Fachmann unter Anwendung eines beliebigen der aus der Technik bekannten Verfahren eine Affinitätssäule kalibrieren. Beispielsweise kann die Säule durch Einbringen einer reinen Probe eines Liganden mit einer zum Binden an das immobilisierte Ziel bekannten Affinitätskonstante kalibriert werden. Sodann wird der Ligand auf die Säule geladen. Anschließend werden serielle Säulenvolumina über die Säule gegeben und direkt dem Akkumulator zugeführt, bis der Ligand mit der bekannten Affinitätskonstante K' erhalten wird. T kann sodann auf der Basis der folgenden Gleichung:

berechnet werden. Somit ist K', das auch als Retentionsfaktor bekannt ist, durch die Gleichung
K' = K × (T)
definiert. In der Praxis könnte darum, wenn der Erhalt eines Liganden mit einer Affinitätskonstante K von 10¹⁰ gewünscht ist, T beispielsweise auf 10^–8M eingestellt werden. Der Ligand mit der vorgewählten Affinität K wird durch Hindurchleiten von etwa 100 Säulenvolumina an Lösungsmittel durch die Säule erhalten.
Nach Hindurchleiten der Probe durch die Säule, so dass Liganden an die Zielmoleküle binden, werden eine Reihe von Säulenvolumina durch die Säule geleitet, wobei n eine Zahl von Säulenvolumina zwischen 1 und 10000 ist. Sodann wird eine Unterserie kp der Volumina, die die Säule verlassen, einem Liganden-Akkumulator zur Immobilisierung der Liganden mit der vorgewählten Affinität K daran zugeführt.
Die Elution des affinitätsgebundenen Materials wird typischerweise unter salzreichen oder sauren pH-Bedingungen durchgeführt. Nach der Elution kann die lösliche Probe zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit des Liganden an dem Ziel von Interesse oder zur Charakterisierung eines Liganden für das Ziel von Interesse analysiert werden. Die Analyse kann durch jedes zur Bestimmung von Komponenten geeignete Verfahren durchgeführt werden.
Bei noch anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Trennung von Liganden in einer Probe in Gruppen mit ähnlichen Affinitätskonstanten. Ein Fachmann kann für jede Anwendung den von jeder Gruppe umfaßten Bereich von Affinitätskonstanten in Abhängigkeit von dem gewünschten Ergebnis bestimmen.
Bei dieser Ausführungsform wählt der Fachmann zuerst, welche Gruppe von Affinitätskonstanten gewünscht ist. Wenn beispielsweise T 10^–5 beträgt und die Volumina 200–30 und 500– 800 vom Akkumulator gesammelt wurden, dann kann K für die Liganden in jeder Gruppe wie folgt bestimmt werden:

und K für die Volumina 500–800 liegt zwischen

und
Das Screeningverfahren kann wiederholt zum Nachweis von Liganden oder Analyten mit vorgewählter Affinität aus diesen Probenbibliotheken angewandt werden. Der Bindungskonstantengradient, der für einen Liganden für das Ziel von Interesse erhalten wird, kann, in Abhängigkeit von den gewünschten Elutionsbedingungen, gegenüber demjenigen für einen anderen Ligand bevorzugt werden. Beispielsweise kann die Bindungsstärke in einer Serie von Lösungen, die Methanol in zunehmenden Konzentrationen enthalten, oder von Lösungen mit zunehmenden Salzkonzentrationen, die die Elutionsgradienten nachbilden, verwendet werden. Auf diese Weise kann das Vergleichsverhalten einer Anzahl von Liganden unter einer Vielzahl von Elutionsbedingungen bewertet werden.
Die Ziel-immobilisierte Säule kann direkt mit einem Akkumulator, wie einer Reversed-Phase-Säule, gekoppelt werden. Das Verfahren setzt in verschiedenen Ausführungsformen eine Tandemsäulenchromatographietechnik ein; wobei der von der ersten Säule zurück gehaltene Ziel-Ligand-Komplex dissoziiert und direkt auf einen Akkumulator, wie eine Reversed-Phase-Säule zum zurück Halten der dissoziierten Liganden eluiert wird. Sodann kann der gebundene Komplex von der Säule dissoziiert und der RP-Säule zugeführt werden. Der Akkumulator sollte zur Wahl der gebundenen Ligand-Ziel-Komplexe, die von der Chromatographiesäule eluiert wurden, geeignet sein. Wenn der Akkumulator beispielsweise eine Größenausschlusschromatographiesäule ist, kann angenommen werden, dass bei schneller Fließgeschwindigkeit durch die SEC-Säule wenig Zeit für die Dissoziation des Ziel-Ligand-Komplexes besteht. Bei niedriger Fließgeschwindigkeit ist das Gegenteil der Fall. Wie nachstehend ausführlicher diskutiert, besteht eine direkte Korrelation zwischen der Waschmenge des Komplexes auf der ersten Säule und den relativen Affinitäten der Liganden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen auch die Herstellung von pharmazeutisch aktiven Zusammensetzungen, wobei ein Ligand von Interesse mit vorgewählter Affinität K gegenüber einem Zielmolekül in einer Probe identifiziert wird. Der Ligand wird durch Beladen einer Säule mit einer bekannten Konzentration T von Zielmolekülen; Hindurchleiten einer Probe durch die Säule unter Bindung von Liganden in der Probe und Hindurchleiten einer Reihe von Säulenvolumina an Lösungsmittel duch die Säule identifiziert. Sodann wird eine Unterserie der Säulenvolumina, die die Säule verlassen, auf einen Akkumulator zur Immobilisierung von Liganden mit der vorgewählten Affinität daran aufgegeben. Anschließend wird der Ligand eluiert, und der Ligand oder ein Derivat davon wird zur Erzeugung einer biologisch aktiven Komponente zur Einarbeitung in ein pharmazeutisches Präparat verwendet. Falls gewünscht, können geeignete Hilfsmittel, therapeutische Träger etc. eingearbeitet werden. Ein pharmazeutisches Präparat, das durch jedes der obigen Verfahren erhalten wurde, kann eine Behandlungsmethode zur Verabreichung des Präparats bereitstellen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen Verfahren zum Nachweis eines Liganden mit einer gewünschten hohen Affinität K zu einem vorgewählten Zielmolekül, wenn Ligand und Zielmolekül zusammen unter den vorgewählten Lösungsmittelbedingungen vorhanden sind. Der Ligand kann in einer heterogenen Probe, die eine Vielzahl von Ligandenspezies umfasst, vorhanden sein. Diese Verfahren umfassen die Immobilisierung eines Zielmoleküls an einer Säule, das Hindurchleiten der Probe durch die Säule unter Bedingungen zur Beschleunigung des Bindens von Liganden in der Probe an die Zielmoleküle und das anschließende Hindurchleiten durch die Säule einer Serie von Säulenvolumina von Lösungsmittel, die die Lösungsmittelbedingungen definieren. Anschließend wird eine Unterreihe kp der Säulenvolumina, die die Säule verlassen, zur Immobilisierung von Liganden mit der gewünschten hohen Affinität über einen Liganden-Akkumulator geleitet. Sodann werden die Liganden eluiert und gegebenenfalls identifiziert. Der erhaltene Ligand kann durch eine hohe Affinität K zu dem Zielmolekül, entsprechend etwa kp/T, gekennzeichnet sein, wobei T die Konzentration von Zielmolekülen in der Säule darstellt. Gegebenenfalls kann die Probe zur Beschleunigung des Bindens von Liganden unter von den vorgewählten Lösungsmittelbedingungen verschiedenen Lösungsmittelbedingungen durch die Säule geleitet werden.
Bei anderen Aspekten der Erfindung wird ein Ligand mit hoher Hingeschwindigkeit, Ko, wenn Zielmolekül und Ligand zusammen unter den vorgewählten Lösungsmittelbedingungen vorliegen, nachgewiesen. Der Ligand kann in einer heterogenen Probe vorhanden sein, die mehrere Ligandenspezies umfaßt, wovon mindestens eine ein vorgewähltes Zielmolekül mit einer Affinität von mindestens etwa 10⁴ M^–1 bindet. Wie bei anderen Ausführungsformen ist das Zielmolekül an einer Säule immobilisiert. Eine heterogene Probe in einem Lösungsmittel, das vorgewählte Lösungsmittelbedingungen definiert, wird bereitgestellt und anschließend mit hoher linearer Fluidgeschwindigkeit durch die Säule geleitet, so dass die Verweilzeit von Liganden in Proben minimiert wird. Somit werden selektiv Liganden mit hoher Hingeschwindigkeit bevorzugt gegenüber anderen Liganden in der Probe an die Zielmoleküle gebunden. Anschließend wird die Säule zur Erzeugung einer Ausgabe eluiert, und man erhält oder identifiziert den Ligand mit der hohen Hingeschwindigkeit. Gegebenenfalls kann die Ausgabe durch einen Liganden-Akkumulator geleitet werden, und anschließend wird der Akkumulator zur Erzeugung einer Ausgabe, die reich ist an Ligand mit hoher Hingeschwindigkeit, eluiert.
C. DIE SCHNITTSTELLEN
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbare System und Gerät können auch eine Kopplungsschnittstelle umfassen, um das Eluat von einer Dimension zurückzuhalten und es einer oder mehreren verschiedenen Dimensionen zuzuführen. Die Schnittstelle kann gegebenenfalls ein Puffersystem zur effektiven Entsalzung, Verdünnung oder Entfernung eines organischen Lösungsmittels aus dem Eluat einer Dimension vor dem Beladen der nächsten Dimension enthalten. Somit kann bei einigen Situationen in die Schnittstelle ein Pufferaustausch eingearbeitet werden. Der Pufferaustausch kann eine mit Kationen- und Anionenaustauschersorbens gepackte Mischbettmatrix sein. Alternativ kann der Pufferaustausch jeweils eine getrennte Säule für Kationen- und Anionenaustauschersorbens umfassen.
Tandemsäulen von Kationen- und Anionenaustauscher oder ein Mischbettaustauscher können zum Zurückhalten von Biomolekülen aus dem Eluat einer Säule verwendet werden. So könnte beispielsweise, wenn ein gewünschter Ligand von einer beliebigen Säule in dem System mit einer Säure eluiert wird, das Eluat zur Änderung des pH-Werts vor dem Auftragen auf die nächste Säule einem Tandempufferaustausch zugeführt werden. Das Eluat kann zuerst auf eine Kationenaustauschersäule aufgegeben werden, die die Liganden aus dem Eluat zurück hält. Anschliessend wird die Kationensäule mit einem pH-neutralen Puffer gewaschen, und die gewünschten Liganden werden an der folgenden Säule, d. h. einer Anionenaustauschersäule, zurückgehalten. Die Liganden können sodann von dieser zweiten Säule mit einem zum Einbringen in die nächste Dimension des Systems optimierten Puffer oder Lösungsmittel eluiert werden.
Die Pufferaustausch-Schnittstelle ist besonders in mehrdimensionalen Systemen wertvoll, wobei der Elutionspuffer beispielsweise einer Affinitätssäule nicht zum Einbringen in ein Massenspektrometer geeignet ist. Somit werden die gewünschten Liganden von der Affinitätssäule gespült, und vor dem Einbringen in das Massenspektrometer über eine Kationensäule und eine Anionensäule geleitet.
Bei einer alternativen Ausführungsform betrifft die beanspruchte Erfindung die Tandemverwendung einer Affinitätssäule und einer Säule mit einem daran immobilisierten Abbauenzym. Somit kann ein gewünschter Ligand in der ersten Säule, einer Affinitätssäule, zurückgehalten und mit Säure eluiert werden. Sodann kann der Ligand in dem Eluat auf einer Kationenaustauschersäule zurückgehalten werden. Anschließend kann der gewünschte Ligand von der Kationenaustauschersäule mit einem für die nächste Säule, d. h, eine Trypsinsäule, optimierten Puffer eluiert werden. Beim Hindurchleiten durch die Trypsinsäule wird der Ligand verdaut und kann beispielsweise auf einer Reversed-Phase-Säule zurückgehalten werden.
Entweder der pH oder das Salz kann zur Elution verschiedener Säulen manipuliert werden; es werden verschiedene Konfigurationen der Anionen- und Kationensäule betrachtet und können so konfiguriert sein, dass die Puffer für die anschließenden Dimensionen optimiert werden. Es wäre möglich, dass diese Technologie auf die Qualitätskontrolle und Prozessüberwachung bei biotechnologischen Anwendungen, auf das Studium von therapeutischem Protein und Arzneimittelmetabolismus und auf großtechnische Screeningprogramme von allgemeiner und klinischer Bedeutung ausgeweitet werden könnte.
Vorzugsweise umfasst die Schnittstelle ferner ein Mehrventilsystem, das zur direkten Übertragung von gelösten Stoffen von einer Dimension auf die nächste ohne Verdünnung oder manuellen Eingriff in der Lage ist. Die beanspruchte Erfindung kann in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung sowohl die vorstehend beschriebene Puffer-Schnittstelle als auch die Ventil-Schnittstelle aufweisen.
Die beanspruchte Erfindung betrifft ein Ventilsystem, das das aufwändigen Verfahren des Sammelns von gelösten Stoffen von jeder Säule und das Wiederauftragen auf eine zweite Säule vermeidet. Bei mehreren Ausführungsformen ist das Ventilsystem ein "Probenteiler", durch den sich an der Schnittstelle ein Flüssigkeitschromatographie-Eluat mit einem Massenspektrometer kombinieren lässt (1 und 2). Der Vorteil der beanspruchten Schnittstelle besteht darin, dass die Fließgeschwindigkeit des Massenspektrums (MS) und der Flüssigchromatographiesäule (LC) unabhängig und variabel sein kann, d. h. die MS- und LC-Geschwindigkeiten können unabhängig optimiert werden, während die MS-Probenentahme von der LC-Fließgeschwindigkeit entkoppelt ist. Die Erfindung betrifft auch eine Schnittstelle, die zum gleichzeitigen Probenentnehmen aus dem LC-Eluat mehrerer LC-Säulen und Entsalzen einer LC-Eluatprobe vor dem Einbringen der Probe in MS in der Lage ist.
Beispielsweise kann die erfindungsgemässe Schnittstelle eine Schnittstelle zur Probenentnahme aus dem Eluat eines LC-Stroms und zur Injektion in einen anderen Strom oder ein Detektor, wie ein Massenspektrometer, sein. Somit beschreiben die 1 und 2 eine Ausführungsform eines analytisch-chemischen Systems 10, das durch eine Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie-Probenspaltungs-Schnittstelle gekennzeichnet ist. Die Flüssigkeitschromatographiesäule 12 mit einem Flüssigkeitsstrom 14, wird mit einer für die Flüssigkeitschromatographiesäule gewünschten Geschwindigkeit von einer Pumpe 16 angetrieben, und ein Massenspektrometer 44 mit einem Flüssigkeitsanalysestrom 38, wird von einer Präzisionspumpe 36 mit der für das Massenspektrometer gewünschten Geschwindigkeit angetrieben. Ein Probenventil 32 wird mit einer vorgegebenen Probenentnahmegeschwindigkeit bis zur Insertion eines Probenvolumens in den Flüssigkeitschromatographiestrom, zum Entnehmen einer Probe des Flüssigkeitschromatographie-Eluats und bis zu seiner anschließenden Einführung in den Massenspektrometerstrom zur Analyse der Probe weiter gedreht.
Insbesondere fließt das Flüssigkeitschromatographie-Eluat 18 von der LC-Säule 12 in eine Eingabeöffnung 20 eines Probenentnahmeventils 22 und durch eine durch die gewählte Position des Ventils bestimmte Ausgabeöffnung. An eine Ausgabeöffnung 28 des Probenentnahmeventils 22 kann ein LC-Detektor 26 angeschlossen sein, um das LC-Eluat aus der über das Probenventil ausgerichteten LC-Säule aufzunehmen. Alternativ kann der LC-Detektor zwischen LC-Säule und Eingabeöffnung 20 des Probenentnahmeventils 22 mit ähnlichen Ergebnissen angeordnet sein.
Das Probenentnahmeventil 22 kann beispielsweise ein Mehröffnungsdrehventil sein, das zu zwei Umleitungskonfigurationen in der Lage ist und durch einen Probenregler 24 kontrolliert wird. 1 zeigt das Probenentnahmeventil in einer ersten Position A, und 2 zeigt das Probenentnahmeventil in einer zweiten Position B. In Ventilposition A, LC-Strom-Probenentnahmeposition, tritt das Eluat 18 von der LC-Säule 12 durch die Eingabeöffnung 20 in das Probenentnahmeventil ein und verlässt das Ventil durch die Ausgabeöffnung 30. Die Ausgabeöffnung 30 ist über eine Schlauchlänge 32, die eine Probeschleife mit einem vorgegebenen Probevolumen definiert, mit einer anderen Eingabeöffnung 34 verbunden. In Position A strömt das LC-Eluat durch das Probenvolumen in die Eingabeöffnung 34 und wird der Ausgabeöffnung 28 zur Detektion zugeführt.
Eine MS-Präzisionspumpe 36 pumpt den MS-Analysestrom 38 in eine andere Probenentnahmeventil-Eingabeöffnung 34 und MS 44 übernimmt seinen Analysenstrom von einer anderen Probenentnahmeventil-Ausgabeöffnung 42. In Ventilposition A verläuft der MS-Strom 38 durch die Eingabeöffnung 40 direkt zur Ausgabeöffnung 42 und zu MS 44.
Beim Umschalten des Probenentnahmeventils 22 von Position A zu Position B (2), MS-Injektionsposition, wird das vorgegebene Probenvolumen von LC-Eluat im Schlauch 32 zurück gehalten und in den MS-Analysestrom 38 übergeführt. Insbesondere leitet das Probenentnahmeventil 22 in Position B das LC-Elutionsmittel durch Eingabeöffnung 20 direkt zu Ausgabeöffnung 28 und LC-Detektor 26. Allerdings wird nun der MS-Analysestrom 38 durch den Probenschleifenschlauch 32 auf MS 44 gerichtet, wodurch das in Schlauch 32 eingeschlossene Probevolumen von LC-Eluat in den MS-Analysestrom injiziert wird.
In Betrieb kann die Fließgeschwindigkeit des Stroms für die LC-Säule 12 im wesentlichen von der Fließgeschwindigkeit des Analysestroms für das MS 44 verschieden sein. Beispielsweise kann eine typische LC-Fließgeschwindigkeit größer sein als 100 μl/min. Eine MS-Fließgeschwindigkeit kann typischerweise von 1 bis 10 μl/min reichen. Außerdem können entweder die LC- oder MS-Fliessgeschwindigkeit oder beide Fliessgeschwindigkeiten dynamisch variabel sein.
Der Probenregler 24 arbeitet unter Drehung des Probenventils 22 zum Aufspalten des LC-Stroms, derart, dass nur ein kleiner Teil des Stroms aus dem LC-Eluatstrom in den MS-Analysestrom injiziert wird. Das Probenvolumen des Probenschleifenschlauchs 32 kann so gewählt sein, dass es auf den LC-Strom eine vernachlässigbare, doch für die MS-Analyse noch ausreichende Wirkung besitzt. Beispielsweise würde ein 1-μl-Probenvolumen, das aus dem LC-Strom entnommen wurde, eine vernachlässigbare Wirkung auf einen LC-Strom von 100 μl/min haben, und wäre doch eine ausreichende Probe für einen MS-Strom von 10 μl/min.
Wird das Probenentnahmeventil 22 in die Position A gedreht, wird das LC-Eluat von der LC-Säule 12 dazu gebracht, durch den Probenschleifenschlauch 32, der das Probenvolumen füllt, zu fliessen. Beim Drehen des Probenentnahmeventils 22 von Position A zu Position B wird das in Probenschleifenschlauch 32 eingeschlossene Probenvolumen an LC-Eluat mit der MS-Fliessgeschwindigkeit von beispielsweise l bis 10 μl/min aus der Schleife in das MS gepresst. Bei einer angenommenen MS-Analysestrom-Fließgeschwindigkeit von 10 μl/min werden pro Sekunde 166 nl MS-Analysestrom durch das Probenschleife 32-Probenvolumen getrieben. Wenn das Probenentnahmeventil in Position A zurückkehrt, wird jede in der Probenschleife 32 zurückbleibende Restprobe je nach Konfiguration des Systems in den Chromatographiedetektor 26, den Fraktionsakkumulator oder den Abfall gepumpt.
In Betrieb wird das Probenentnahmeventil 22 zum Zurückhalten und Übertragen eines Aliquots von LC-Eluat zum MS-Analysestrom wiederholt mehrmals über jeden LC-Peak gedreht. Durch wiederholte Probennahme während des Chromatographiepeaks der Probe ist es möglich, die Chromatographie aus diesen diskreten Proben zu rekonstruieren.
Je nach gewünschter Anwendung kann das Probeventilsystem zur gleichzeitigen Aufzeichnung von zwei oder mehreren Flüssigkeitschromatographieströmen konfiguriert sein.
Der mehrdimensionale Apparat, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, kann auch aus einer Schnittstelle, wie einem Fluid-Handhabungssystem mit Pumpen zur Abgabe der Proben an die verschiedenen Dimensionen, einer oder mehreren Chromatographiesäulen und einem Massenspektrometer zum Nachweis, bestehen. Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare System und Gerät können eine Software-Schnittstelle aufweisen, d. h. einen Regler, der eine breite Vielzahl von Testformaten zulässt, und gegebenenfalls einen spektralfotometrischen Detektor umfassen. Die Software-Schnittstelle kann auf einen breiten Bereich von Spezifikationen zugeschnitten sein und umfasst drei Funktionsbereiche: Instrumentenkontrolle, Verfahrensentwicklung und Analyse. Die Instrumentenkontrolle kann eine graphische Schnittstelle für jedes physikalisches Element des Systems, von der Pufferwahl über die Probenpräparation bis zur Detektion und Fraktionssammlung bereitstellen. Der Status des Systems kann kontinuierlich aufgezeichnet und auf dem Computerbildschirm widergegeben werden.
D. NACHWEIS
Jedes aus der Technik bekannte Nachweisverfahren ist zur Verwendung bei der beanspruchten Erfindung geeignet. So können Liganden oder Zielmoleküle, um sie nachweisbar zu machen, markiert werden. So kann entweder das Ziel oder der Ligand mit einer nachweisbaren Gruppierungen, wie Enzyme, Fluorophore, Chromophore, Radioisotope, elektrochemische Gruppierungen und chemoluminiszente Gruppierung, markiert werden. Zusätzlich betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen ersten Bindungspartner mit einer von Natur aus vorhandenen nachweisbaren Gruppierung, z. B. eine funktionelle Gruppe, die zum Nachweis in der Läge ist, umfasst.
Zusätzliche Nachweisverfahren umfassen beispielsweise jedes Gerät zum Erhalt des Masse-zu-Beladungsverhältnisses, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf: matrixunterstützte Laserdesorptionsionisations-/Plasmadesorptionsionisation, Elektrosprühionisation, Thermosprühionisation und FAB-Ionisation. Zusätzlich ist jeder Massenanalysemodus zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf: Flugzeit, Quadrupol, Ioneneinschluss und Sektoranalyse. Das bevorzugte Nachweis- und Analyseverfahren ist ein verbessertes Flugzeitinstrument, das die unabhängige Potentialkontrolle an Proben- und Extraktionselementen gestattet, wie in der mitanhängigen USSN 08/446 544 (Anwalts-Nr SYP-111, eingereicht am 19. Mai 1995) beschrieben.
Die Verfahrensentwicklungskomponenten gestattet es dem Anwender, automatisierte Testverfahren, einschließlich Erstellung von Injektionsreihenfolgen und Probenpräparation, zu erstellen. Verdünnung und Derivatisierung können in der Probenpräparation eingeschlossen sein.
Die Testanalyse gestattet die Quantifizierung einzelner Durchgänge und kann Parameter, wie herzustellende Standardkurven oder Dosisniveaus umfassen. So kann aus einer Reihe von Tests durch automatisches Messen der Detektorreaktion und Anpassen dieses Ergebnisses an die injizierte Probenmenge eine Standardkurve entwickelt werden. Dies bedeutet, dass eine gesamte Serie von Tests, einschließlich Standardkurven-Erstellung, unter minimalem Betreibereinsatz durchgeführt und somit die Genauigkeit erhöht und die Kontaminierung des Tests herabgesetzt werden kann.
Der Fachwelt ist bekannt, dass die beanspruchte Erfindung nicht nur den Nachweis des Vorliegens eines Liganden mit vorgewählter Affinität, sondern auch die Gewinnung dieses Liganden und seine anschließende Verwendung betrifft.
Beispielsweise können Liganden mit vorgewählter spezifischer Affinität zu einem Zieltoxin als Fänger in vivo und in vitro verwendet werden. Die so erhaltenen Liganden können therapeutisch eingesetzt werden. Zusätzlich können die erfindungsgemässen Verfahren zum Auffinden von Leitverbindungen zur Arzneimittelentdeckung eingesetzt werden. Die beanspruchte Erfindung betrifft nicht nur die Leitverbindungen, sondern auch die Verwendung dieser Leitverbindungen zur Identifizierung neuer Arzneimittel. Die Erfindung betrifft auch Präparationen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Liganden hergestellt werden.
Die Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen ein Gerät, das zur Durchführung mindestens einer "Dimension" oder eines Verfahrens, das vorstehend beschrieben ist, in der Lage ist. Es ist bevorzugt, dass die Kits beispielsweise zum automatischen Nachweis eines Liganden in einer Probe, der eine vorgewählte Affinität K zu einem vorgewählten Zielmolekül besitzt, in der Lage sind. Solche Kits können eine Säule mit bekannter Konzentration des daran immobilisierten vorgewählten Zielmoleküls und einen Akkumulator, der zur Aufnahme von Eluat von der Säule und zur Immobilisierung daran eines Liganden mit vorgewählter Affinität K in der Lage ist, enthalten. Die Kits können für jedes oder alle der vorstehend beschriebenen und hier beanspruchten Verfahren ausgelegt sein.
Die Kits können gegebenenfalls zum Nachweis von Liganden sowie zur Analyse und zum Erhalt der Liganden konfiguriert sein und können beispielsweise eine Schnittstelle umfassen, um eine Probelösung mit zusätzlichen Analysen kompatibel zu machen. Die Kits können zur Identifizierung und zum Erhalt von Liganden in Proben verwendet werden. Die Liganden oder Derivate oder Modifikationen hiervon können für eine Vielzahl von Zwecken, wie als Leitverbindungen zur Arzneimittelentdeckung, verwendet werden. Gegebenenfalls können die Liganden oder Modifikationen oder Derivate hiervon zur Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Zusammensetzung verwendet werden.
Pharmazeutisch aktive Zusammensetzungen werden durch Identifizierung der Liganden in Proben mit vorgewählter Affinität K zu einem Zielmolekül von Interesse hergestellt. Der Ligand kann durch Beladen einer Säule mit bekannter Konzentration T an Zielmolekülen, Hindurchleiten einer Probe durch die Säule unter Bindung von Liganden in der Probe daran und anschließendes Hindurchleiten einer Serie von Säulenvolumina an Lösungsmittel durch die Säule identifiziert werden. Eine Unterserie der aus der Säule austretenden Säulenvolumina kann einem Akkumulator zugeführt werden, um daran Liganden mit vorgewählter Affinität zu immobilisieren, und der Ligand kann eluiert werden.
Die Zusammensetzungen können gegebenenfalls Hilfsstoffe einschließen.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung umfassen Geschwindigkeit, Reproduzierbarkeit und Automatisierung. Es ist bevorzugt, Teilchen zu verwenden, die zur Perfusionschromatographie in der Lage sind, da es Perfusionsteilchen dem System gestatten, bei sehr hohen Fließgeschwindigkeiten unter Aufrechterhaltung sowohl der hohen Probenbeladungskapazität als auch der chromatographischen Auflösung zu arbeiten.
Wie es aus der obigen Beschreibung und den nachstehend gegebenen Beispielen verstanden wird, ist die Erfindung zahlreichen Konfigurationen zugänglich, die auf der Grundlage der gewünschten Anwendung der Probe gewählt werden können. Zur weiteren beispielhaften Erläuterung der Erfindung werden nachstehend mehrere Konfigurationen ausführlicher aufgezählt. Bei bestimmten Ausführungsformen, wie in 3 beschrieben, umfasst das Gerät einen Probeneingang 112 zum Einbringen von Probe in das Gerät 110 in eine ersten Säule 114 zur Verteilung auf der Grundlage einer ersten physikalisch chemischen Eigenschaft von Kandidaten-Liganden oder Komplexen hiervon auf ein Zielmolekül unter Erzeugung eines ersten Austrittstroms 116. Der erste Austrittsstrom 116 wird gegebenenfalls zur Verteilung von Kandidaten-Liganden auf der Basis einer zweiten verschiedenen physikalisch chemischen Eigenschaft unter Erzeugung eines zweiten Austrittsstroms 120 einer zweiten Säule 118 zugeführt.
Bei verschiedenen Ausführungsformen existiert gegebenenfalls eine Schnittstelle 122 zwischen erster Säule 114 und zweiter Säule 118 zur Konditionierung des Lösungsmittels im ersten Austrittsstrom 116 zum Einbringen in die zweite Säule 118. Gegebenenfalls kann der erste Mehrventilteiler 124 zwischen erster Säule 114 und zweiter Säule 118 positioniert sein, um den ersten Austrittsstrom 116 zur Schnittstelle 122 und zu Detektor 125 weiter zu leiten, wo der Austrittsstrom 116, falls Ligand vorhanden ist, wiederum in das Ventil 124 eingeführt wird, oder der Austrittsstrom 116, falls kein Ligand vorhanden ist, dem Abfallstrom 126 zugeführt wird.
Der Mehrventilteiler 124 kann ein Mehröffnungsdrehventil sein, das zu zwei oder mehreren möglichen Umleitungskonfigurationen in der Lage ist und das über einen Probenregler 128 kontrolliert wird.
Der zweite Austrittsstrom 120 wird gegebenenfalls einem zweiten Mehrventilteiler 130 zugeführt, der den zweiten Austrittsstrom 120 an eine dritte Säule 132 weiter leitet. Eine Probe des dritten Austrittstroms 134, der einen gewählten Liganden enthält, kann gegebenenfalls in einen dritten Probenteiler 140 und anschließend zum Nachweis des Beladungs-zu-Masse-Verhältnisses des Liganden in ein Massenspektrometer 136 eingebracht werden. Daran kann eine Anzeige 138 angeschlossen sein.
Bei verschiedenen Ausführungsformen ist die erste Säule 114 eine Affinitätssäule zur Verteilung einer Bibliothek auf der Grundlage einer ersten physikalisch chemischen Eigenschaft, und die zweite Säule 118 ist eine weitere Affinitätssäule zur Verteilung des ersten Austrittsstroms 116 auf der Grundlage einer zweiten physikalisch chemischen Eigenschaft. Die dritte Säule 132 kann eine Reversed-Phase-Säule sein, die den gewünschten Ligand vor der Elution des gewünschten Liganden in einem dritten Austrittsstrom 134 daran zu akkumulieren vermag.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann die erste Säule 114 ein Dialyse- oder Größenausschlusssystem sein, das zur Verteilung auf der Grundlage der Größe in der Lage ist. Die zweite Säule 118 ist eine Affinitätssäule, die zur Verteilung auf der Grundlage einer zweiten physikalisch chemischen Eigenschaft in der Lage ist.
Bei einer weiteren beispielhaften Konfiguration des bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Geräts (4) sind verschiedene Lösungsmittelreservoirs 146 über ein Ventil 148 mit einem Ventil 150 verbunden. Die Probe wird über den Probeneinlass 112 eingebracht und an Ventil 150 mit dem Lösungsmittel kombiniert. Anschließend wird die Lösung der ersten Säule 114 zugeführt, und der Austrittsstrom 116 kann dann über ein Ventil 124 einem Detektor 125 zugeführt werden, wo der Austrittsstrom 116, falls Ligand vorhanden ist, wieder dem Ventil 124 zugeführt wird, oder der Austrittsstrom 116 wird, wenn kein Ligand vorhanden ist, dem Abfallstrom 126 zugeführt. Alternativ oder zusätzlich kann der Austrittsstrom 116 an eine zweite Säule 118 weiter geleitet werden, die zur Verdünnung, Entsalzung oder Entfernung von organischem Lösungsmittel aus dem Austrittsstrom 116 vor der Wiedereinführung in das System über das Ventil 124 geeignet ist. Sodann wird der Austrittsstrom 152 in die dritte Säule 132 eingeführt. Anschließend kann der dritte Austrittsstrom 134 einem Teiler 140 zugeführt werden, und eine Probe wird an das Massenspektrometer 136 weiter geleitet und schließlich die Information an eine Ausgabeanzeige 138 übertragen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Screening einer synthetischen Peptidkombinationsbibliothek (SPCL) unter Verwendung eines Antikörpers auf
β-Endorphin als Ziel
Beispiel 1A: Herstellung der Ziel-immobilisierten Affinitätssäule und der Kontrollsäule
Ein gewählter monoklonaler Antikörper (mAb) (Mäuse-IgG2a, Klon 3E-7, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde gegen humanes β-Endorphin gezüchtet und erkennt den Aminoterminus von β-Endorphin, YGGFL. Der aus dem Handel bezogene mAb (280 mg, resuspendiert in 1 ml H₂O) wurde über einen XL-Patrone (2,1 × 30 mm), bestehend aus Protein G, gekoppelt an POROS^®-Perfusionschromatographiemedien (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), geleitet, indem 10 × 100 ml Injektionen auf einer BioCAD^TM20-Arbeitsplattform (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) durchgeführt wurden. Das Protein G bindet mit hoher Affinität an die Fc-Region der Antikörper. mAb wurde anschließend unter Anwendung von Standardverfahren und -materialien, die mit der XL-Säule mit geliefert wurden, mit dem Protein G vernetzt. Kurz gesagt, bestand dies darin, dass 14 ml Vernetzungslösung (100 mM Triethanolamin, pH 8,5, 7,8 mg/ml Dimethylpimelimidat (DMP)) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durch die Säule geleitet wurden. Das Vernetzungsreagens wurde durch anschließende Injektion von 2 ml 100 mM Monoethanolamin, pH 9,0, gestoppt. Die Sensorpatrone wurde mit PBS, pH 7,4 bei 0,5 ml/min, 2 min gewaschen, und anschließend folgte eine weitere Injektion von 2 ml Stopplösung, und es wurde wie oben gewaschen. Der Antikörper wurde an der Säule wirksam immobilisiert, wie durch die mangelnde Reaktivität des Durchflusses gegenüber einer Anfärbung mit Coomassie bei der SDS-PAGE gezeigt. Eine zweite XL-Säule (ohne Antikörper) wurde mit Vernetzungsmitteln behandelt und wie die Affinitätssäule zur Verwendung als "Kontrollsäule" gewaschen.
Beispiel 1B: Kontrollscreening des immobilisierten Ziels mit dem bekannten Epitop
Die vorstehend hergestellte Ziel-immobilisierte Affinitätssäule wurde im Tandemmodus mit einer Vydac-Reversed phase-C₁₈-Säule auf einer BioCAD^TM-Arbeitsplattform unter Anwendung der in 5 gezeigten Konfiguration verschweißt. Diese Konfiguration gestattete die unabhängige Äquilibrierung und das unabhängige Waschen der Affinitäts- und der Vydac-Säule, während die inline Elution des an die mAb-Säule gebundenen Materials direkt auf die Vydac-Säule möglich war. Die Vydac-Reversed-Phase-Säule konnte so dann unabhängig von der Affinitätssäule eluiert werden.
Zur Erforschung der Bindung des immobilisierten Antikörpers an sein Epitop YGGFL wurde das synthetische Peptid YGGFL (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; 1 mg/ml in PBS, pH 7,4) auf die Affinitätssäule (Fließgeschwindigkeit 0,2 ml/min) injiziert. Nach Waschen mit 10 Säulenvolumina (CV), PBS, pH 7,4, wurde das gebundene Peptid mit 12 mM HCl von der Affinitätssäule direkt auf die Vydac-C₁₈-Säule eluiert. Diese Reversed-Phase-Säule wurde anschließend mit, einem Gradienten von Acetonitril (4% ACN/12 mM HCl bis 80% ACN/6 mM HCl, während 18 min; Fliessgeschwindigkeit 1 ml/min) entwickelt. Beide Säulen wurden vor der nächsten Injektion in ihren entsprechenden Ausgangspuffern reäquilibriert.
Beispiel 1C: Synthese der löslichen Peptidkombinationsbibliothek (SPCL)
Die SPCL der allgemeinen Formel NH₂-XXXFL-COOH (worin X jede der natürlichen L-Aminosäuren mit Ausnahme von Cystein und Tryptophan darstellt) wurde synthetisiert, wie beschrieben (siehe Sebestyen, F. et al. Bioorganic Med. Chem. Letts. 3; 413–418, 1993). Nach der Standardpraxis wurden die Peptide unter Verwendung von "Reagenz B" von dem Harz abgespalten und mit Ether gefällt. Berechnungen der Menge von jedem Peptid ergaben eine theoretische Menge von 70 nmol von jedem der ungefähr 5832 potentiellen Sequenzmöglichkeiten in der Bibliothek (unter der Annahme einer äquimolaren Kupplung jeder Aminosäure in jedem Schritt in der Synthese und einer relativ gleiche Gewinnung für jedes Peptid bei der Etherausfällung). Die jeweiligen Sequenzen der einzelnen Peptide, die durch Immunaffinitätsreinigung erhalten wurden, oder die "Pool"-Sequenz der rohen Bibliothek" wurde durch Sequenzierung auf einem Hewlett Packard G1000A-Proteinsequenziergerät unter Verwendung der Standard HP2.2 Chemie (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) erhalten.
Beispiel 1D: Kontrollbindungsexperiment
Im ersten Schritt wurde untersucht, ob der an der XL-Patrone immobilisierte mAb seine Fähigkeit zum Binden des Peptids YGGFL beibehielt. Die Peptidlösung (20 nmol) wurde auf die Affinitätssäule injiziert, und anschließend wurde das ungebundene Peptid durch Waschen der Säule mit PBS, pH 7,4 entfernt. Die Peptide mit Affinität, die von dem Antikörper zurück gehalten wurde, wurde zur Auflösung direkt von der "Zielsäule" auf die C₁₈-Säule eluiert. Die Menge des gewonnenen Peptids, wie aus der Peakfläche berechnet, betrug etwa 1,2 nmol. Die theoretische Kapazität auf der Basis der Menge an mAb, der auf die Affinitätssäule geladen wurde, betrug 3,8 nmol, was zeigt, dass etwa 25% der Bindungsstellen von mAb in einer konformationsmäßig aktiven Form verfügbar sind.
Beispiel 1E: Bestimmung der Kapazität der Ziel-immobilisierten Affinitätssäule
Die Kapazität der Säule wurde durch Injektion zunehmend größerer Mengen des Peptids (YGGFL) unter Verwendung des Beladungstemplats der BioCAD^TM-Arbeitsplattform überprüft. Die Menge des gebundenen Peptids (wie berechnet aus der Peakhöhe) erreichte bei etwa 1,2 nmol die Sättigung. Interessanterweise war die Menge des an den Antikörper gebundenen Peptids unabhängig von dem Fluss, der zur Injektion des Peptids angewandt wurde. Die Erhöhung der Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min auf 5 ml/min beeinflusste die Gewinnung nicht. Dieses Ergebnis legt eine schnelle Wechselwirkung des Peptids mit dem Antikörper während des Beladungsprozesses nahe, wenn ein Perfusionspackmaterial und Elutionsbedingungen angewandt werden. Der EC₅₀-Wert (50% der Sättigungsmenge) für das Peptid beträgt ungefähr 30 nmol. Dieser Wert korreliert gut mit den Affinitätskonstanten, die zuvor für die Bindung von YGGFL-Peptid an 3E-7 durch kompetitive radioaktiv markierte Bindungstests (siehe Lam et. al., Biorganic Med. Chem. Letts. 3: 419–424 (1993)) bestimmt worden waren.
Beispiel 1F: Screening der SPCL unter Verwendung der Ziel-immobilisierten Affinitätssäule
Die Verschiedenheit der Bibliothek wurde zuerst durch Hindurchleiten eines kleinen Aliquots über die Vydac-C₁₈-Säule unter den gleichen Bedingungen, die zur Elution von gebundenem Material von der XL-Säule angewandt wurden, bewertet. Die große Anzahl von Peaks, die bei der angegebenen Wellenlänge eine nennenswerte Extinktion zeigten, ist für die Verschiedenheit der Bibliothek naheliegend.
Unter Anwendung der zur Reinigung von YGGFL, das an die mAb-Säule bindet, aufgestellten Bedingungen wurde die XXXFL-Bibliothek auf Gruppierungen durchmustert, die von der Ziel-immobilisierten mAb-Affinitätssäule erkannt wurden. Die Bibliothek (die jeweils 2,8 nmol Peptids enthielt), wurde auf die "Zielsäule" geladen, das ungebundene Material wurde mit 10 Säulenvolumina PBS, pH 7,4 abgewaschen. Schließlich wurde das affinitätsgebundene Material mit 12 mM HCl direkt auf die Vydac-C₁₈-Säule eluiert. Die Elution der C₁₈-Säule (mit einem ACN-Gradienten von 4–80%, wie vorstehend beschrieben) ergab etwa 10–12 auflösbare Peaks. Das Elutionsprofil zeigt, dass einer der beobachteten Peaks eine Retentionszeit aufwies, die mit derjenigen vergleichbar ist, die für reines YGGFL festgestellt wurde. Unter Anwendung der für die Immunaffinitätssäule gewählten Waschbedingungen (10 CV) vermochten wir aus einer Bibliothek mit potentiell mehr als 5800 einzelnen Peptiden selektiv eine einzige Gruppierung abzutrennen. Die Identität des isolierten YGGFL wurde durch Massenspektrometrie und Peptidsequenzierung bestätigt.
Beispiel 1G: Kontrolle
Zur Bestätigung der Spezifität der Ziel-immobilisierten Affinitätssäule auf YGGFL wurden Proben des im Handel bezogenen Peptids und der Bibliothek (XXXFL) in einem Parallelexperiment unter Verwendung der in Experiment 1 hergestellten Kontrollsäule analysiert. Das Chromatogramm war mit Ausnahme des Peaks, der YGGFL entsprach, identisch.
Beispiel 2:
Screening einer Peptidkombinationsbibliothek unter Anwendung von Endotoxin (Lipopolysaccharid) als Ziel
Beispiel 2A: Vorexperimente
Mehrere Mittel, einschließlich einiger Peptide, binden an Endotoxin und vermindern die letalen Wirkungen dieses Mittels in Tieren. Allerdings sind diese Mittel aufgrund ihrer von Natur aus eigenen Toxizität von begrenzter Anwendbarkeit. Eine lineare SPCL der allgemeinen Struktur XXXFL (entsprechend der Kernregion von Polymixin B (PmxB)) wurde auf Gruppierungen durchmustert, die an LPS und eine zyklische Bibliothek (der allgemeinen Formel CXXXC), die aufgrund der Disulfidbindung zwischen den beiden Cysteinmolekülen zyklisiert ist, zu binden vermochten.
Wir verwendeten ein Tandemsäulenverfahren unter Einsatz von POROS^®-Säulen auf einer BioCAD^TM20-Arbeitsplattform. Säule 1 war eine schwache Anionenaustauschersäule (PI/M; 4,6 × 100 mm), während Säule 2 eine Reversed-Phase-Säule (R2/H; 4,6 × 100 mm) war. Eine schwache Anionenaustauschersäule wurde als Säule Nr. 1 gewählt, da sich zuvor gezeigt hatte, dass die Mittel, die LPS zu binden vermochten, einen gewissen kationischen Charakter besitzt und daher erwartungsgemäß nicht notwendigerweise an diese Säule binden. Zunächst wurde gezeigt, dass die Moleküle Pentamidin und Polymyxin B (von denen zuvor gezeigt wurde, das sie an die Lipid A-Region von LPS binden), auf der Säule 1 unter den Bedingungen zurückgehalten wurden, die nur nach Vorinkubation in Gegenwart von LPS angewandt wurden. Allerdings würde erwartet werden, dass LPS aufgrund dieses Vorliegens zweier geladener Phosphatgruppen in der Lipid A-Region des Moleküls mit dieser Säule wechselwirkt. Daher würden kationische Moleküle, die an LPS zu binden vermögen, auf der Säule 1 nur dann zurückgehalten werden, wenn sie an dieses Molekül gebunden wären. Das Material, das auf der Säule 1 zurückgehalten wurde, wurde direkt auf Säule 2 eluiert, wo es zurückgehalten wurde. Durch Elution von Säule 2 ließen sich die Peaks auflösen, die von der Säule 1 stammten.
Beispiel 2B: Synthese der XXXFL-Bibliothek
Die Bibliothek XXXFL wurde auf Fmoc-Leu-Harz der Firma WANG unter Anwendung von Standardverfahren in einem Advanced Chemtech-Peptidbibliothek-Synthesegerät hergestellt. Vor dem Screening der Bibliothek (bestehend aus ungefähr 5800 Pentameren) wurde sie auf der Basis der Retention an der schwachen Anionenaustauschersäule in eine anionische und eine kationische Fraktion unterteilt (Material, das bei Injektion in 50 mM Tris, pH 6,7, an die Säule bindet, wurde als anionische Fraktion bezeichnet, während die hindurch laufende Fraktion die kationische Fraktion war). Nur die kationische Fraktion wurde unter Anwendung dieses Schemas durchmustert. Allerdings stellte die kationische Fraktion bezogen auf die Peakfläche für beide Fraktionen > 2/3 der gesamten Bibliothek dar.
Beispiel 2C: Durchmusterung der XXXFL-Bibliothek
Das Screening der Bibliothek auf Binden an LPS wurde wie folgt durchgeführt. Die kationische Fraktion der XXXFL-Bibliothek wurde mit 1–3 mg/ml LPS (Serotyp O55;B5; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 50 mM Tris, pH 6,7, inkubiert (30 min/RT). Zu diesem Zeitpunkt wurde das Inkubationsgemisch injiziert und über Säule 1 auf der BioCAD^TM-Arbeitsplattform (äquilibriert im gleichen Puffer) geleitet. Die Säule wurde bei 4 ml/min betrieben. Nach dem Waschen mit der entsprechenden Anzahl von Säulenvolumina an Äquilibrierungspuffer (1 CV = 1,66 ml), wurde die Säule gespült und durch Schalten der letzten Säule in Reihe mit Säule 1 während des Elutionsverfahrens direkt auf Säule 2 eluiert (unter Verwendung von 8 mM HCl, 1 M NaCl). Material, das auf Säule 2 festgehalten wurde, wurde unter Verwendung eines Gradienten von 12 mM HCl in Wasser bis 80% ACN, 6 mM HCl, eluiert. Die Peaks wurden gesammelt, durch erneutes Hindurchleiten durch eine Vydac-C₁₈-Säule (4,6 × 250 mm) weiter gereinigt und durch Massenspektrometrie (auf einem Voyager^TM-MALDI-TOF-Instrument; Per Septive Biosystems, Framingham, MA) und Peptidsequenzierung (Hewlett Packard) analysiert. Identifizierte Peptide wurden synthetisiert, und die Bindung dieser Moleküle an die Lipid-A-Region des LPS wurde durch Messen der Fähigkeit von PmxB oder Pentamidin zur Konkurrenz mit dem Peptid um diese Stelle bestätigt.
Außerdem ergab die zunehmende Anzahl von Säulenvolumina, die zum Waschen von Säule 1 vor der Elution auf Säule 2 angewandt wurde, eine Abnahme in der anschließenden Gewinnung dieser Moleküle, vermutlich aufgrund der Dissoziation dieser Mittel von dem LPS in Säule 1. Die Anzahl der Waschvolumina, die für diese Mittel zur Verkleinerung des Peaks erforderlich war, korrelierte mit den angegebenen Affinitäten dieser Mittel gegenüber LPS; PmxB (Kd 0,4 mM) war nach 42 CVs Waschen der Säule 1 um 50% reduziert, während Pentamidin (Kd 100 nM) für eine ähnliche Verminderung eine höhere Anzahl von Wäschen (46 CVs) erforderte. Unter Anwendung dieses Verfahrens konnten wir schnell überprüfen, welche Peaks aus der Bibliothek zum Binden an LPS mit höchster Affinität in der Lage war, da bei Exposition gegenüber einer höheren Anzahl von Waschvolumina nur die Peptide mit höherer Affinität gegenüber dem Ziel zurück gehalten wurden. Die relative Verminderung in der Peakfläche (oder Höhe) für jeden Peak, der von der Reversed-Phase-Säule eluierte, beim Auftragen gegen die zum Waschen der Säule 1 verwendete Anzahl von CVs konnte zur Unterscheidung der Peaks mit höherer Affinität verwendet werden, da dies unter den gleichen Bedingungen eine niedrigere Geschwindigkeit für die Verminderung ergab. Drei solche Peaks aus der XXXFL-Bibliothek und drei Peaks aus der CXXXC-Bibliothek wurden weiter gereinigt und durch MS und Peptidsequenzierung gekennzeichnet. Die Ergebnisse dieser Sequenzierungsdaten für die XXXFL-Kandidaten legt die Strukturen RRRFL, RRKFL oder KKRFL nahe. Das letztere Peptid wurde synthetisiert, und es wurde von ihm gezeigt, dass es unter Anwendung des vorstehenden Schemas an LPS bindet. Obgleich dieses Peptid allerdings durch Pentamidin in einem Konkurrenzexperiment verdrängt wird, ist seine Affinität gegenüber LPS viel geringer als diejenige des letzteren Moleküls. Die anderen Peptide werden in ähnlicher Weise synthetisiert und studiert, obwohl ein anderer Weg in Erwägung gezogen wird, der darin besteht, dass eine Unterbibliothek des Formats ZZZFL (wobei Z entweder R oder K darstellt) zur Identifizierung des Elementes mit der höchsten Affinität durchmustert wird. Kandidaten, die aus der zyklischen Bibliothek gereinigt wurden, erwarten immer noch die Sequenzierung.
Beispiel 2D: Affinitäsbasierendes Screening - Wahl von hochaffinen Bindern - Wirkung der Waschvolumina
Tandemsäulen, bestehend aus einer Affinitätssäule, die in Reihe mit einer Reversed phase-(RP)-Säule verschweißbar ist, können zum Screening von Bibliotheken zur Wahl der Binder einer bekannten Affinität auf der Grundlage des Waschvolumens der Affinitätssäule verwendet werden.
Eine BioCAD^TM-Arbeitsplattform wurde in Tandemsäulenkonfiguration verschweißt. Säule 1 war eine immobilisierte rHsp70-Affinitätssäule (2,1 × 30 mm), und Säule 2 war eine POROS^®R2-Reversed-Phase-Säule (2,1 × 100 mm). Die Affinitätssäule (Säule 1) wurde mit Screeningpuffer gewaschen, bevor die Bibliothek (natürliche Proteinabbau-Bibliothek [PDL], 100 μg) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min auf die Affinitätssäule injiziert wurde. Anschließend wurde die Affinitätssäule mit Screeningpuffer mit einer zunehmenden Anzahl (5, 10, 20 & 40) an Säulenvolumina (CVs) bei 0,2 ml/min (1 CV = 100 μl) gewaschen. Die POROS^®R2-Säule wurde anschließend stromabwärts von der Affinitätssäule in Serie geschaltet. Gebundenes Material wurde mit Säure von der Affinitätssäule direkt auf die in Serie geschaltete RP-Säule eluiert. Die Affinitätssäule wurde so dann aus der Serienschaltung heraus genommen und mit Screeningpuffer nachgewaschen. Schließlich wurde die POROS^®R2-Säule mit einem ansteigenden Acetonitrilgradienten (0–80%) in TFA (0,1%) eluiert.
6 zeigt den RP-Säulenteil des Experiments, das heißt, Elution auf eine in Serie geschaltete RP-Säule nach Selektion durch eine rHsp70-Affinitätssäule von PDL nach einer 0 verschiedenen Anzahl von Waschvolumina. Bei 40 CVs wird nur ein einziger Peak gewählt ("**" bedeutet hochaffiner Binder), was nahe legt, dass das durch diesen Peak dargestellte Protein eine hohe Affinität gegenüber rHsp70 besaß. Bei niedrigeren Waschvolumina, z. B. 5 CVs, sind weitere Peaks ("*" bedeutet einen affinitätsarmen Binder) zu sehen. Diese Peaks fehlen bei 10 und mehr CV-Waschungen, was nahe legt, dass es affinitätsarme Binder sind.
Beispiel 2E: Subtraktive Screeningwahl Ziel-spezifischer Binder
Ein Mehrziel-Säulenformat kann bei einem einzigen Verfahren zum Screening von Liganden auf ihre Fähigkeit zur Bindung an ein bestimmtes Ziel und auf ihre Fähigkeit zur Bindung an ein zweites Ziel verwendet werden. Diese Technik sollte zur Wahl von Bindern, die zwischen zwei verschiedenen Zielen differenzieren, allgemein anwendbar sein. Beispielsweise können Binder gewählt werden, die zwischen Wild-Typ- und Mutantenprotein differenzieren. Für ein anderes Beispiel können Liganden gewählt werden, die an ein pathogenes Ziel, jedoch nicht an das homologe Wirtsziel binden. Die Subtraktion kann in einem chromatographischen Verfahren oder in parallelen Chromatographieläufen erfolgen, wobei die Subtraktion auf analytischem Niveau erfolgt.
Eine Bibliothek wurde unter Verwendung eines subtraktiven SEC-Screeningprotokolls mit humanem Hsp70 als Wirtsprotein und seinem E. coli-Gegenspieler, DnaK, als pathogenes Ziel durchmustert. Eine BioCADTM-Arbeitsplattform wurde in Tandemsäulenkonfiguration zusammengebaut. Säule 1 war eine Größenausschlusssäule (SEC) und Säule 2 eine POROS^®R2-Reversed phase-(RP)-Säule (2,1 × 100 mm). Protein (50 μg) wurde mit der Bibliothek (100 μg) vorinkubiert, und Proben (100 μl) wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min auf die SEC injiziert. Der Proteinpeak wurde entweder für die massenspektrometrische Analyse gesammelt, oder die POROS^®R2- Säule wurde in Reihe stromabwärts von der SEC geschaltet. Der Proteinpeak wurde direkt auf die in Serie geschaltete RP-Säule geschnitten und die SEC wurde aus der Serie abgeschaltet. Anschließende wurde die POROS^®R2-Säule mit einem ansteigenden Acetonitrilgradienten (0–80 %) in TFA (0,1 %) eluiert. Schließlich wurde die SEC in Screeningpuffer rückäquilibriert.
Alle Peptide, die von rHsp70 und DnaK eluiert wurden, wurden durch MALDI-TOF analysiert. Die 7A, 7B, 7C und 7D zeigen die MALDI-TOF-Spektren für solche Experimente. In der rHsp70-Probe, die mit dem PDL (7A) inkubiert wurde, ist eine Anzahl von Peaks vorhanden, die in den Kontrollinkubationen mit rHsp70 (7B) oder PDL (Figur 7C) allein nicht festgestellt werden. Dies zeigt, dass diese Peptide an rHsp70 selbst binden oder dass eine unzureichende Trennung von gebundener und ungebundener Bibliothek existiert. DnaK, inkubiert mit PDL (7D), bindet auch Peptide, die dieser Bibliothek entstammen. DnaK bindet eine verschiedene Gesamtheit von Peptiden, obwohl einige mit rHsp70 gemeinsam sind.
Beispiel 2F: Biomolekulare Sreening-Wahl ortsspezifischer Binder
Tandemsäulen, bestehend aus einer Affinitätssäule, die mit eine RP-Säule in Reihe verbunden ist, können über einen Vergleich der Eluate von einer Säule, die sowohl Zielmoleküle als auch einen bekannten Liganden enthält, wobei die Eluate von einer Säule nur Zielmoleküle enthalten, zum Screening von Bibliotheken auf Liganden verwendet werden, die an einen speziellen Ort im Zielmolekül binden.
Es wurde Lectin-Concanavalin A (Con A) verwendet. Als Beispiel der biomolekularen Möglichkeit zum Screening eines Gemisches von Komponenten zur Wechselwirkung mit einem Ziel wurden die Liganden auf die spezifische Bindung an die Zuckerstelle von Con A durchmustert. Biotinyliertes Succinyl-Con A wurde auf einem Streptavidin-POROS^®-Träger (BA-Patronen, 2,1 × 30 mm) immobilisiert. Eine Bibliothek, bestehend aus der Sequenz XXXXX (wobei X jede der 20 natürlichen Aminosäuren darstellt, ausschließlich Cystein), wurde über die Affinitätssäule geleitet, und Material das mit diesem Träger wechselwirkt, wurde anschließend eluiert und auf einer RP-Säule zurückgehalten. Zur Identifizierung von Liganden mit Spezifität für die Zuckerbindungsstelle wurde die Peptidbibliothek in Gegenwart und Abwesenheit eines Liganden für Con A (Methyl-α-D-mannopyranosid, 33 mg/ml) über die Testsäule geleitet. Nach Exposition der Säule gegenüber 10 CVs CAB-Puffer (0,2 ml/min) wurden die verbleibenden Peptide mit Säure auf eine RP-Säule eluiert. Diese Peptide wurden unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten von einer RP-HPLC-Säule eluiert, und die Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und sequenziert. Die Gewinnung von jeder Aminosäure wurde als Prozentsatz der Gesamtmenge von Aminosäuren, der in jedem Cyclus der Sequenzierung gewonnen wurde (AA%), ausgedrückt. Sodann wurde die Aminosäureanreicherung für jede i Aminosäure wie folgt ausgedrückt:
Die Gewinnung einer jeden AA aus jedem Cyclus konnte somit der Wichtigkeit nach eingestuft werden, und die Sequenz des 5-mer-Peptids mit den Sequenzen, die in jedem Cyclus die größten AA-Gewinnungen zeigen, wurde aus diesen Daten "benannt".
8 zeigt die Ergebnisse dieser Daten. Aus diesen Daten "benannten" wir das Peptid HHRSY als bestehend aus denjenigen Aminosäuren, die die größte Zunahme an % AA zeigten, wenn der Säule, relativ zu seinen % AA in Gegenwart von Zucker, Zucker fehlte. Die Synthese dieses Peptids und die Charakterisierung seiner Bindungsfähigkeit ergab, dass es zur spezifischen Bindung an Con A, das an der Säule immobilisiert war, mit geringer Bindung an die Kontrollsäule, in der Lage war. Außerdem konnte dieses Peptid durch Einschließen einer hohen Konzentration des konkurrierenden Zuckerliganden etwas verdrängt werden. Diese Daten legen nahe, dass die Identifizierung von Liganden für eine spezifische Stelle in einem Molekül unter Anwendung dieses bimolekularen Wegs für das Screening möglich ist.
Beispiel 2G: IgG-Reinigung
Traditionsgemäß werden immobilisiertes Protein A und Protein G zur Reinigung von Immunglobulinen (IgG) aus Serum, Aszites, Hybridomzellen und Zellkulturüberständen verwendet. Dieses Beispiel stellt einen alternativen Weg zu den Proteinen A und G dar, da immobilisierte Proteine zum Auslecken aus der Säule neigen und mit den sauren Bedingungen inkompatibel sind, die zur Elution von gebundenem IgG erforderlich sind.
Zum Screening auf IgG als Ziel wurden Peptidbibliotheken von jeder der folgenden Quellen erzeugt: 1) Natürliche Peptidbibliotheken generischer Proteine, 2) polyklonale Antikörperbibliotheken, und 3) Protein A- und G-Abbau. Jede dieser obigen Bibliotheken wurde auf Peptide durchmustert, die spezifisch an Maus-IgG (Gesamtmolekül) oder Maus-IgG, Fc-Fragment, binden. Eines der beiden Screeningverfahren war wie folgt: i)Lösungsphasenpeptid(e)-Screening oder ii) Festphasenpeptid-Screening. Das Lösungsphasenpeptid-Screening umfasst die Inkubation der Peptidbibliothek mit Maus-IgG (gesamt oder Fc-Fragment) in Lösung und die Abtrennung des IgG und der gebundenen Peptide von den ungebundenen Peptiden durch weitere Trennung des Proteins und der gebundenen Peptide durch herkömmliche Reversed phase-Chromatographietechniken unter sauren Bedingungen. Das Festphasenpeptid(e)-Screening umfasste das Hindurchleiten der Peptidbibliothek durch eine immobilisierte IgG-Säule unter physiologischen Bedingungen und die Elution der gebundenen Peptide auf eine RP-HPLC-Säule unter sauren Bedingungen. Das (die) Peptid(e), die durch eines der beiden obigen Screeningverfahren gewählt wurde(n), wurde(n) durch Massenspektrometrie (MALDI-TOF) und Edman-Sequenzierungsmethoden charakterisiert. Das (die) Peptid(e) wurde(n) anschließend auf POROS^®-Medien immobilisiert und auf seine (ihre) Spezifität, Selektivität und Kapazität zum Binden von IgG aus Serum bewertet. Die unterschiedliche Kupplungschemie (direkte Synthese oder unabhängige Immobilisierung), die Wirkung der Ligandendichte, die Aktivierungschemie und die Natur der Wechselwirkung mit IgG wurde für einige der gewählten Peptid(e) erforscht.
Beispiel 3: Screening
Sämtliche Proteine und Reagentien für Puffer wurden, wenn nicht anders angegeben, von Sigma Chemical Co (St. Louis, MO) erhalten. Anti-IgG(Fc-spezifische)-Antikörper wurden von der Firma Biodesign International (Kennebunk, ME) bezogen. Das Screening durch SEC- und RP-Chromatographie wurde auf der INTEGRAL^TM-Chromatographie-Arbeitsplattform (PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA) durchgeführt. Das Screening durch die immobilisierte Ziel(IgG)-Säule gleichzeitig mit einer RP- Säule wurde auf der BioCAD^TM-20-Arbeitsplattform (Per Septive Biosystems, Inc., Framingham, MA) durchgeführt. Die Größenausschlusssäule (Superdex 200 HR 10/30, molekulare Ausschlussgrenze 150000 Dalton bis 6000 Dalton) wurde von Supelco (Bellefont, PA) erhalten. Die Vydac-RP-C₁₈-Säule (4,6 mD × mmL) wurde von Separation Science, Hesperia, CA erhalten. Die POROS^®-Selbstpackvorrichtung, die POROS^®-Protein A-, POROS^®HQ- und POROS^®-CM-Säulen wurden von PerSeptive Biosystems (Framingham, MA) erhalten. Die Massenspektrometrieanalyse wurde auf der Voyager^TM-BioSpektrometry-Arbeitsplattform mit linearem Analysator und einem Stickstofflaser von 337 nm von PerSeptive Biosystems, Inc./Vestec Mass.Spectrometry Products, Framingham, MA durchgeführt. Die Peptidsequenzierung durch Edman-Abbau erfolgte auf einem Flüssigkeitschromatographen von Hewlett Packard der Serie II 1090. Das SDS-Gelelektrophoresekit wurde von Novex Biochemicals (San Diego, CA) erhalten.
3A: Erzeugung der Peptidbibliothek

1) Natürliche Peptidbibliothek: Zur Erzeugung der Peptidbibliothek wurden 23 Proteine verwendet. 60 mg von jedem der 23 Proteine wurden 1/2 h mit 6 N Guanidiumchlorid bei Raumtemperatur vermischt. Dem Gemisch wurden 36 mM EDTA und 30 mM Dithiothreithol zugesetzt und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Denaturierung der Proteine und der Reduktion der Disulfide wurde dem Gemisch 30 mM Iodacetamid zugesetzt, das sodann bei 37°C über Nacht unter konstantem Schütteln inkubiert wurde. Das Proteingemisch wurde dialysiert, lyophilisiert und zum enzymatischen Abbau bei 37°C, für 24 h, in drei Chargen aufgeteilt. Eine Charge wurde mit Trypsin (Protein-zu-Trypsinverhältnis 25 : 1 Gew./Gew.) behandelt, die zweite Charge wurde mit Chymotrypsin (Protein-zu-Chymotrypsinverhältnis 15 : 1 Gew./Gew.) behandelt, und die dritte Charge wurde sowohl mit Trypsin (1 : 25 Gew./Gew.) als auch Chymotrypsin (1 : 15 Gew./Gew.) behandelt. Der verwendete Abbaupuffer war 0,1 M Ammoniumbicarbonatpuffer, der 0,12 mM Calciumchlorid (pH 8,3) enthielt. Nach 24 h wurden die drei Chargen bei 90°C für 30 min zur Inaktivierung der Enzyme wärmebehandelt. Die Wirksamkeit des Abbaus wurde durch RP-Chromatographie und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bewertet.
2) Polyklonale anti-IgG(Fc-spezifische) Antikörperbibliothek: polyklonale Anti-IgG(Fc-spezifische) Antikörper wurden aus Kaninchen, Ziegen und Schafen erhalten. Jeweils 30 mg der polyklonalen Antikörper wurden denaturiert, reduziert und wie vorstehend beschrieben, alkyliert. Das Gemisch wurde mit Trypsin (Enzym : Proteinverhältnis 1 : 25) behandelt, und der Abbau wurde vereinigt und lyophilisiert.
3) Protein A- und Protein G-Abbauprodukte: jeweils 1 mg von rekombinantem Protein A und Protein G wurden denaturiert, reduziert und wie vorstehend beschrieben alkyliert. Die denaturierten Proteine und jeweils 15 mg der nativen Proteine A und G wurden über Nacht, wie vorstehend beschrieben, mit Trypsin (Enzym : Proteinverhältnis 1 : 25) und Chymotrypsin (Enzym : Proteinverhältnis 1 : 15) behandelt. Das resultierende Gemisch aus nativem und denaturiertem Abbau wurde vereinigt und lyophilisiert.

3B: Vielfältigkeit der Peptidbibliothek:
Zur Bestimmung der Vielfältigkeit von jeder der Peptidbibliotheken wurden die Sequenzen aller zur Erzeugung einer Bibliothek verwendeten Proteine über das Entrez-Progamm erhalten und in das GPMAW-Programm eingespeist. Das GPMAW-Programm simuliert den enzymatischen Abbau und erzeugt Informationen über Anzahl, Sequenzen und Masse aller möglichen Peptide, die durch einen solchen Drei-Chargen-Abbau erzeugt werden. Diese Information ist sehr wertvoll bei der Vorhersage des Vielfältigkeitsgrades und bei der Bestätigung der Quelle, Masse und Sequenz des (der) nach dem Screening erhaltenen Peptids (e).
3C: Immobilisierung von IgG(s):
1 mg POROS^®EP (Epoxy) wurde in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 9), der 20 mg IgG enthielt, suspendiert. Nachdem die Perlen gut suspendiert waren, wurden dem Gemisch 4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 9), enthaltend 2 M NA₂SO₄, zugesetzt, und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Sodann wurden die Perlen mit 10 mM PBS (pH 7,5) gewaschen und im Kühlschrank gelagert, bevor sie in die Säulen gepackt wurden.
3D: Peptidscreeningprotokoll:

1) Lösungsphasenpeptid(e)-Screening durch Größenausschluss-Reversed-Phase-Säulen: 5 mg von jeweils entweder Maus-IgG (gesamt) oder des Fc-Fragments wurden mit 20 mg natürlicher Bibliothek und mit Protein A- bzw. G-Abbau inkubiert. Das
Gemisch wurde über Nacht bei 4°C in 1 ml eines Gemisches von 25 mM Natriumphosphatpuffer und 0,15 M NaCl (pH 7) gelöst.

Nach der Inkubation erfolgten mehrere Chromatographiedurchgänge über die Superdex SEC-Säulen, und die RP-Säulen wurden mit dem Protein- und Peptidgemisch betrieben, das während jedes Durchgangs durch die Superdex-Säulen injiziert wurde. Die Fließgeschwindigkeit der Superdexsäule betrug 0,75 ml/min mit einem Gemisch von 25 mM Natriumphosphatpuffer und 0,15 M NaCl (pH 7). Der zeitig eluierende Proteinpeak wurde direkt auf der RP-Säule gesammelt. Der verbleibende Teil des Peaks wurde von der SEC abgewaschen. Das Maus-IgG (gesamt) oder das Fc-Fragment und seine zugehörigen Peptide wurden dann unter den folgenden Bedingungen von der RP-Säule eluiert:

Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Lösungsmittel A:	0,1% TFA/DIW
Lösungsmittel B:	0,1% TFA/85% ACN/15% DIW
Gradientenbedingungen:	0–100% B für 30 CVs gesammelt und lyophilisiert wurden 1,5-ml-Fraktionen

Die folgenden Kontrollen wurden unter ähnlichen Bedingungen über die SEC-RP-Säulen geleitet:

Kontrolle 1:	vereinigte Peptidabbauten über SEC, mit einem Ausschluss bei dem Elutionsvolumen von Maus-IgG (gesamt) oder dem Fc-Fragment. Dies dient als Kontrolle zur Coelution von Peptiden.
Kontrolle 2:	Maus-IgG (gesamt) oder das Fc-Fragment durch die Säulen. Dies dient als Kontrolle für alle Peptide/Fragmente, die durch den Proteinabbau entstehen.
Kontrolle 3:	Blindprobe, Lauf mit 0,1% TFA/DIW über eine Rp-Säule zur Sicherstellung, dass die Säule rein war.

Fraktionen, die gebundenen Peptidpeaks entsprachen, wurden lyophilisiert und zur Massenspektralanalyse durch MALDI-TOF wieder in 0,1% TFA/DIW gelöst.

2) Festphasen eptid(e)-Screening mit immobilisierten Ziel- und Reversed-Phase-Säulen als Tandem: Das IgG-aktivierte POROS^® wurde unter Verwendung eines SelfPack^®-Aufbaus auf BioCAD^TM bei 20 ml/min Fließgeschwindigkeit in 4,6 mmD × 100 mm L PEEK-Säulen gepackt. 5 bis 50 mg Peptidbibliothek (natürliche Peptidbibliothek oder polyklonaler Antikörperabbau), gelöst in 0,5 bis 2,5 ml 10 mM PBS (pH 7,5), wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min auf die Säule injiziert. Nach Waschen mit 5 CVs PBS wurde der gebundene Teil mit 10 mM HCl eluiert und manuell gesammelt. Die Fraktion wurde bis auf etwa 500 μl auf konzentriert, und mindestens 80% hiervon wurden bei 1 ml/min auf eine Vydac-C₁₈-Säule, 4,6 mm D × 250 mm L, injiziert. Die RP-Säule wurde mit 0,1% TFA/DIW äquilibriert, und die Peptide wurden mit 15 CVs eines Acetonitrilgradienten von 0–40% bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen, die den gebundenen Peptiden entsprachen, wurden in Speed-Vac konzentriert und durch MALDI-TOF und Edman-Sequenzierung analysiert. Als Kontrolle für eine nicht spezifische Bindung wurde die Peptidbibliothek in Serie mit der RP-Säule über eine POROS^®OH-Säule (kein IgG) laufen gelassen.

3E. Analysen:

1) Matrixunterstützte Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS): Die verwendete Matrix war eine α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, gelöst in 1 ml 50% Acetonitril in 0,1% TFA/deionisiertem Wasser. Bradykinin und Insulin wurden als externe Standards zur Kalibrierung verwendet.
2) Edman-Sequenzierung: erfolgte nach dem Standardprotokoll auf einem HP 1090-Sequenziergerät.

3F: Oberflächenaufbau und Affinitätschromatographie:

1) Immobilisierung von Peptiden über das N-terminale Ende: 1 g POROS^®AL (Aldehyd) wurde in 10 mM PBS (pH 7,5), enthaltend 100 mg Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH₃), suspendiert. 5 bis 20 mg von jedem der Peptide, ausgewählt durch verschiedene Screeningverfahren, wurden dem Harz zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Sodann wurden 100 mg Natriumborhydrid (NaBH₄) zugesetzt, und das Gemisch wurde noch 2 h geschüttelt. Die Perlen wurden anschließend mit PBS gewaschen und unter Verwendung der POROS^®SelfPack^®-Vorrichtung in eine 4,6 mm D × 100 mm L Säule gepackt.
2) Direkte Synthese von Peptiden auf POROS^®: Das 19-mer-Peptid (TVTEKVIDASELTPAVT), ausgewählt aus dem Protein A- und Protein G-Abbau, wurde durch die FMOC-Standardchemie direkt an 20 μm Amin-funktionalisierten Teilchen synthetisiert. Etwa 700 mg Harz wurden trocken in eine PEEK-Säule, 4,6 mm D × 50 mm L, ausgestattet mit 2 μm Fritten, gepackt. Die gepackte Säule wurde mit entsprechenden Adaptern an ein kontinuierliches Strömungspeptidsynthesegerät 9050 plus von PerSeptiv Biosystems angeschlossen. Nach beendeter Synthese wurde das Harz getrocknet und unter Verwendung von 95% TFA/5 Triisopropylsiln für 24 h von den Schutzgruppen befreit.

Das Peptid-Träger-Endkonjugat wurde zur Bewertung als Affinitätsträger unter Verwendung einer POROS^®SelfPack^®-Säulenpackvorrichtung mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min auf eine Säule, 4,6 mm D × 50 mm L, gepackt.
3G: Analytische Verfahren:

1) Reinigung von IgG (gesamt) aus Humanserum auf einer Peptidsäule: 100 μl von 1 : 10 verdünntem Serum wurde auf die Peptidsäule injiziert, die bei 5 ml/min mit 20 mM Tris (pH 8,0) äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem 0–1 M NaCl-Gradient in 15 CVs eluiert. Die Fraktionen wurden manuell gesammelt und zur anschließenden Analyse durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durch Speed-Vac konzentriert.
2) Reinigung von IgG (gesamt) aus Humanserum auf POROS^®-Protein-A-Säule: 100 μl von 1 : 10 verdünntem Serum wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min in die Protein-A-Säule injiziert, die mit 10 mM Phosphatpuffer, enthaltend 0,15 M NaCl (pH 7,5), äquilibriert worden war. Nach Injektion und 5 CVs Wäschen wurde der gebundene Teil in einem einzigen Schritt mit 10 mM HCl eluiert. Die gebundenen Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
3) Reinigung von IgG (gesamt und Fc-Fragment) auf POROS^®-Peptid: (TVTEKPEVIDASELPAVT)-Säule: Die 19-mer-Peptidsäule (4,6 mm D x 50 mm L) wurden mit 20 CVs Äquilibrierungspuffer, 20 mM Tris (pH 7) äquilibriert. Etwa 500 μl von 1 mg/ml jeweils der folgenden Proben wurden auf die 19-mer-Peptidsäule injiziert (4,6 mm D x 50 mm L): 1) Reine IgGs, entweder aus Menschen oder Mäusen oder Hühnern, 2) IgA (Gesamtmolekül), 3) Humanserum, 4) fetales Rinderserum (1 : 10 Verdünnung), oder 5) 500 μl von 1 mg/ml Maus-Igc, Fc-Fragment. Nach Injektion wurde die Säule mit 20 CVs eines Gemisches von 20 mM Trispuffer und 0,4 M NaCl (pH 7) gewaschen. Die restlichen gebundenen Proteine wurden mit 20 CVs von 12 mM HCl eluiert. Experimente mit einer POROS^®-NH₂(kein Peptid)-Kontrollsäule erfolgten gleichermassen. Die gebundenen Fraktionen wurde gesammelt und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
4) Reinigung von Human-IgG (gesamt) und Maus-IgG (gesamt und Fc-Fragment) auf einer POROS^®-Protein-A-Säule: eine POROS^®-Protein-A-Säule (2,1 mm D × 30 mm L) wurde mit 20 mM Tris (pH 7) in 20 CVs äquilibriert. Etwa 500 μl 1 mg/ml von jeder der folgenden Proben wurde auf die POROS^®-Protein-A-Säule (2,1 mm D × 30 mm L) injiziert: 1) Reines Human-IgG (Gesamtmolekül), 2) Humanserum (1 : 10 Verdünnung), und 3) 500 μl von 1 mg/ml Maus-IgG, Fc-Fragment. Nach der Injektion wurde die Säule mit 20 CVs eines Gemisches von 20 mM Trispuffer und 0,4 M NaCl, (pH 7), gewaschen. Die restlichen gebundenen Proteine wurden mit 20 CVs 12 mM HCL eluiert. Experimente mit der POROS^®-OH-Kontrollsäule (kein Peptid) erfolgten gleichermassen. Die gebundenen Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
5) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese: Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der gebundenen Salz- und Säure-eluierten Fraktionen wurde auf vorgegossenen 4–20% oder 12% (1 mm × 10 cm) Tris-Glycin-Gelen unter reduzierenden Bedingungen laufen gelassen. Probenpräparation, Anfärben und Entfärben erfolgten nach den Empfehlungen des Herstellers.

Natürliche Peptidbibliothek:
Sowohl Lösungsphasen- als auch Festphasenpeptid(e-)-Screening von Maus-IgG (Gesamtfragment) mit der natürlichen Peptidbibliothek ergab ein Peptid der Masse 1633 Dalton und die Aminosäuresequenz CAQCHTVEK. Die Datenbasissuche ergab, dass dieses Peptid ein tryptischer Abbau von Cytochrom c (eines der Proteine in der Bibliothek) ist, wobei eine Hämgruppe kovalent an die beiden Cysteine in den Aminosäurepositionen 14 und l7 des Proteins gebunden ist.
Das CAQCHTVEK-Peptid mit der Hämgruppe wurde über das N-terminale Ende an POROS^®-AL (Aldehyd) immobilisiert. Dieses POROS^®-Peptidkonjugat wurde zur Abtrennung von IgG aus dem Serum bei pH 8 mit einem 0–1 M NaCl-Gradienten verwendet. Bei pH 8 wurde IgG mit einer zu derjenigen von auf einer POROS^®-Protein-A-Säule abgetrenntem IgG vergleichbaren Reinheit gereinigt. Die Kapazität der POROS^®-Peptidsäule wurde zu 10 mg/ml Säulenvolumen bestimmt, was mit der Bindungskapazität der POROS^®-Protein-A-Säule vergleichbar ist. Zur Bestimmung der Natur der Wechselwirkung wurde das Reinigungsprofil von auf der POROS^®-Peptidsäule getrenntem IgG mit dem IgG verglichen, das über Standard-Ionenaustauschersäulen, wie POROS^®-CM und POROS^®-HQ, gereinigt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Peptidsäulen unter ähnlichen Bedingungen überwiegend Ionenaustauschermerkmale mit sekundären hydrophoben Wechselwirkungen zeigten und eine höhere Selektivität gegenüber IgG aus Serum besitzen, als die beiden Ionenaustauschersäulen. Die Wirkung der variierenden Peptid Beladungsdichten (von 10 mg/g POROS^® bis 100 mg/g POROS^®) auf die Spezifität und Kapazität für die IgG-Bindung wurde ebenfalls untersucht. Die Spezifität des Peptids für die IgG-Bindung wurde ebenfalls untersucht. Die Spezifität des Peptids gegenüber IgG variierte nicht mit variierenden Ligandendichten, allerdings variierte die Natur der Wechselwirkung von IgG. Bei niedriger Beladungsdichte (10 mg/g POROS^®) band IgG hauptsächlich über ionische Wechselwirkung, was die Elution von gebundenem IgG mit einem Salzgradienten erforderte. Bei höherer Beladungsdichte (100 mg/mg) band IgG stark und eluierte mit Säurepuffer. Die Bindungskapazität variierte von 1–2 mg/ml Säulenvolumen bei einer niedrigeren Ligandendichte bis zu 30 mg/ml Säulenvolumen bei höheren Ligandendichten. Das Hämpeptid-POROS® band sehr schwach an HSA und nur unter sehr hydrophoben Bedingungen (200 mM Natriumsulfat, Puffer pH 7).
Bei Immobilisierung des Hämpeptids über die Carboxylgruppen von Häm und über das freie C-terminale Ende wurde keine IgG-Bindung festgestellt, was anzeigte, dass die freien Carboxylgruppen des Peptids zum Binden an IgG sehr wichtig waren.
Ein vereinfachtes Analoges des Hämpeptids (GAQGHTVEK) wurde synthetisiert und über das N-terminale Ende an POROS^®AL immobilisiert. Bei pH 8 band dieses GAQGHTVEK-POROS^®-Konjungat spezifisch und mit einer zu dem IgG, das aus menschlichem Serum an einer POROS^®-Protein-A-Säule gereinigt wurde, vergleichbaren Reinheit. Das gebundene IgG wurde mit 100 mM NaCl von der GAQGHTVEK-POROS^®-Säule eluiert. Die IgG-Bindungskapazität wurde als 5 mg/ml Säulenvolumen bestimmt. Die Beladungsdichten von 20 mg/g bis 40 mg Peptid/g POROS^® wurden bewertet. Bei diesen Ligandendichten war die Spezifität der IgG-Bindung nicht beeinflusst, allerdings war die Kapazität vermindert.
Protein A- und Protein G-Abbau:
Die Fc-Bindungsdomäne von rekombinantem Protein A und Protein G und der Aminosäuren, die an der Bindung von Protein A an IgG beteiligt waren, wurde durch ortsgerichtete Mutagenese kartiert (Fahnestock, S.R., Alexander, P. Nagle, J. und Filpula, D., J. Bacter (1986) 167(3): 870–880). Allerdings existieren keine Aufzeichnungen über Peptide, die aus diesen Bakterienproteinen, die an IgG binden, isoliert wurden. Durch Lösungsphasenpeptid(e)-Screening mit nativen und denaturierten rekombinanten Protein A- und Protein G-Abbauprodukten gegen Maus-IgG (Fc-Fragment) wurden vier Peptide mit bemerkenswerten Überlappungssequenzen identifiziert. Die Peptid(e) waren wie folgt: TVGTEKPE, EKEPEVID, GDAPTPEKEPEASI und TVTEKPEVIDASELPAVT. Die Sequenzen der längeren Peptide korrelierten mit den Massenspektrumdaten. Keines dieser Peptide stellt einen typischen tryptischen Abbau dar, was anzeigte, dass diese Peptide wahrscheinlich aus dem nativen Protein G-Abbau gewählt wurden. Die Datenbasissuche ergab, dass alle diese Peptide von rekombinantem Protein G stammten. Außerdem ist die TVTE-Sequenz Teil der Fc-Bindungsdomäne von rekombinantem Protein G.
Das TVTEKPEV-Peptid wurde synthetisiert und über das N-terminale Ende an POROS^® immobilisiert. Es wurde festgestellt, dass dieses POROS^®-TVTEKPEV IgG aus Humanserum bei pH 8 mit vergleichbarer Spezifität wie das POROS^®-Protein-A-Konjungat bindet. Das gebundene Protein wurde mit einem 0–1 M NaCl-Gradient eluiert. Das TVETEKPEVIDASELTPAVT-Peptid wurde über das C-terminale Ende direkt an POROS^®-NH₂-Harz synthetisiert. Dieses Peptid band Maus-IgG, Fc-Fragment, mit geringer Kapazität, allerdings hoher Selektivität. Das gebundene IgG wurde mit Säurepuffer eluiert. Dieses Peptid war für IgG selektiver als für IgA. Humanes IgG band selektiver an die 19-mer-Peptidsäule als IgG aus Kaninchen, Ziegen oder Mäusen.
Eines der wichtigen und neuen Merkmale besteht darin, dass von den Proteinen A und G, die bekanntlich mit hoher Affinität IgG binden und zur Elution des gebundenen IgG saure Bedingungen erfordern, Peptide isoliert wurden und es sich gezeigt hat, dass mindestens eines davon (TVTEK) IgG bindet, allerdings mit geringerer Affinität, die nur einen Salzgradienten zur Elution des gebundenen Proteins erfordert. Zweitens wurden die Peptid(e) unterschiedlicher Affinitäten und Selektivität gegenüber IgGs verschiedener Spezies identifiziert. Drittens ist es bemerkenswert, dass zwei der Peptide, nämlich TVTEKEPEVIDASELTPAVT und TVTEKPEV, Teil der Fc-Bindungsdomäne von rekombinantem Protein G sind.
Polyklonaler Antikörperabbau:
Polyklonale Antikörper sind eine interessante und logische Quelle für Peptide, da sie spezifische Antigen-Bindungsstellen besitzen. Ein synthetisches Antikörperfragment gegen Lysozym wurde als Ligand bei der Immunaffinitätschromatographie verwendet. Dieses Fragment wurde durch Molekül-Modellieren von Lysozym und seinem Antikörper erzeugt (Welling, G.W. et al., (1990) J. Chrom., 512: 337–343). Auch Einzelketten-Antikörper, die mit schwacher Affinität binden, wurden gegen viele Ziele durch Phagen-Anzeige erzeugt (Griffiths, A.S. et al., (1994) The EMBO J., 13(14): 3245–3260). Bis jetzt wurde die Wahl von zielspezifischen Peptid(en), die aus den polyklonalen Antikörperabbauprodukten isoliert wurden, noch nicht beschrieben. Tryptische Abbauprodukte von denaturiertem polyklonalem Anti-IgG(Fc-spezifisch)-Antikörper, der in Kaninchen, Ziegen und Schafen gezüchtet wurde, wurden über eine POROS^®-Epoxysäule, immobilisiert mit IgG, laufen gelassen. Die gebundenen Peptide wurden auf eine RP-Säule eluiert und charakterisiert. Die Aminosäuresequenz wurde als GAQGHTVEK bestimmt. Ein Datenbasissuche ergab, dass die GAQGHTVEK-Sequenz Teil der variablen Region der leichten Kette von IgG ist. Zu beachten ist, dass das HTVEK-Motiv auch in dem Hämpeptid von Cytochrom c festgestellt wird. Wie oben hat sich gezeigt, dass das Hämpeptid IgG bindet. Zusätzlich ist das TVEK-Motiv der TVTEK-Sequenz ähnlich, die in der IgM-Schwerkette, im T-Zellrezeptor (β-Kette) und auch in IgG-Bindungsproteinen, wie Protein G und Protein LG, vorkommt. Protein LG, ein Hybridmolekül von Protein L und G bindet an intakte IgGs, sowie Fc- und Fab-Fragmente und IgG-Leichtketten. Die Merkmale des GAQGHTVEK-Peptids als Affinitätsoberfläche zur IgG-Bindung wurden vorstehend besprochen. Das besonders wichtige und neue Merkmal besteht darin, dass aus einem Gemisch von denaturierten Antikörpern ein Peptid isoliert wurde, das gegenüber IgG selektiv war.
Durch die Wahl verschiedener Bibliotheken wurden Peptide gewählt, die selektiv an verschiedene Teile von IgG (entweder das Fab- oder das Fc-Fragment) binden. Es besteht eine bemerkenswerte Ähnlichkeit in den Sequenzen von einigen der IgG-Bindungspeptid(e), die aus verschiedenen Proteinquellen isoliert wurden. Bisher hat sich nicht gezeigt, dass eines dieser Peptide IgG bindet. Die Spezifität der Peptid(e) gegenüber IgGs von verschiedenen Spezies variiert in Abhängigkeit von Orientierung, Aktivierungschemie und Dichte des immobilisierten Liganden. Schließlich stellt die Erfindung den Beweis für das Konzept dafür bereit, dass beide chromatographischen Peptid(e)-Screeningstechniken {Festphasen und Lösungsphasen) vergleichbar sind und glaubhafte Ergebnisse ergeben.

Claims

Ein automatisiertes, durchfluss, mehrdimensionales Verfahren zur Trennung von Liganden in einer Bibliothek von Kandidaten-Liganden basierend auf ihrer relativen Affinität zu einem Zielmolekül, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: A. Hindurchleiten einer Lösung, die die Bibliothek von Kandidaten-Liganden umfasst, durch eine erste Säule, um die Liganden an ein immobilisiertes Zielmolekül in der ersten Säule zu binden; B. Hindurchleiten einer Reihe von Säulenvolumina Lösungsmittel durch die erste Säule, wo zumindest zwei Teilmengen Säulenvolumina Lösungsmittel, die diese erste Säule verlassen, unabhängig und direkt durch einen Liganden-Akkumulator hindurch geleitet werden, der eine Säule ist, die so gestaltet ist, dass sie nicht-spezifisch Liganden absorbiert; und C. Eluieren unabhängig die zumindest zwei Teilmengen von Säulenvolumina Lösungsmittel aus dem Liganden-Akkumulator, um die Liganden, die an das Zielmolekül in der ersten Säule banden, basierend auf ihren verschiedenen Affinitätsbereichen zu dem immobilisierten Zielmolekül zu charakterisieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste Säule eine Affinitätssäule ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Liganden-Akkumulator eine Reversed-Phase-Säule ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das die zusätzlichen Schritte umfasst: D Probennahme eines Austrittstroms aus dem Liganden-Akkumulator, der einen ausgewählten Liganden enthält nach Schritt C; und E. Einführen der Probe in ein Massenspektrometer zur Bestimmung des Beladung-zu-Masse Verhältnisses des Ligandens oder eines Fragments davon.
Ein automatisiertes, mehrdimensionales Verfahren zum Erhalten physiochemischer Daten charakteristisch für einen oder mehrere Liganden in einer Bibliothek von Kandidaten-Liganden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: A. Hindurchleiten einer Lösung, die die Bibliothek von Kandidaten-Ligamden umfasst, durch eine erste Säule, um die Liganden an ein immobilisiertes Zielmolekül in der ersten Säule zu binden; B. Waschen der ersten Säule mit einer geeigneten Anzahl von Säulenvolumina Lösungsmittel; C. Eluieren der ersten Säule direkt auf einen Liganden-Akkumulator, der eine Säule ist, die so gestaltet ist, dass sie nicht-spezifisch Liganden absorbiert; D. Eluieren des Liganden-Akkumulators zur Bestimmung der Anwesenheit von Liganden; und E. Wiederholen der Schritte A bis D, wobei Schritt B die erste Säule spült mit einer abweichenden Anzahl von Säulenvolumina Lösungsmittel, um den Liganden mit einer höheren Affinität zu dem immobilisierten Zielmolekül zu erkennen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die erste Säule eine Affinitätssäule ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Liganden-Akkumulatoren eine Reversed-Phase-Säule ist.
Das Verfahren nach Anspruch 5, umfassend die zusätzlichen Schritte: F. Probennahme eines Austrittstroms aus dem Liganden-Akkumulator, der einen ausgewählten Liganden enthält, nach Schritt D; und G. Einführen der Probe in ein Massenspektrometer zur Bestimmung des Beladungs-zu-Masse Verhältnisses des Ligandens oder eines Fragments davon.