JP2011503548A - 質量分析装置をクロマトグラフィシステムに連結するための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年11月2日に出願された米国仮特許出願第61/001,595号および2007年11月2日に出願された米国仮特許出願第61/001,597号の優先権を主張する。これら出願の各々の全体が本明細書に参考として援用される。
本発明は、概して、流体試料の高スループットスクリーニングに関し、より具体的には、流体試料の試料スループットを増加させるための自動システムおよび方法に関する。
創薬および薬剤開発、環境試験、および診断等の多くの用途において、効率的かつ再現可能な様態で多数の試料を分析する必要がある。流体試料を分析するために用いられる手法の多くは、試料を連続的な様態で試験することを必要とする。このような用途において、連続分析法は、コンピュータ制御のロボット工学および自動化の使用を通して自動化することができる。このような装置は、概して自動注入器と呼ばれ、また、クロマトグラフィシステム、質量分光計、および分光学的検出器が挙げられるが、これに限定されない、あらゆる種類の連続分析システムに共通に結びつけられる。
本発明は、例えばクロマトグラフィおよび/または質量分析を用いて、複合の生物学的、化学的、または環境マトリクス中の選択された成分の分析のスループットを増加させるためのシステムおよび方法を説明する。種々の実施形態では、特定の用途に応じて、1試料あたり30秒〜1試料あたり1秒以下の範囲のスループット率が達成可能である。本発明のさらなる実施形態は、スループットを増加させ、かつ試料のキャリーオーバーを最小化する、自動注入システムを含む。
例示的実施形態では、試料スループットを増加させる、および/または複合の生物学的、化学的、または環境マトリクス内の選択された成分を分析するための、自動システムおよび方法を提示する。概して、システムは、クロマトグラフィカラムと、複数の試料を質量分析計等の分析器に迅速に出力することができる、流体回路とを含む。種々の実施形態では、特定の用途に応じて、1試料あたり30秒〜1試料あたり1秒以下の範囲の試料スループット率が達成可能である。本発明のさらなる実施形態は、スループットを増加させ、かつ試料のキャリーオーバーを最小化する、自動注入システムを含む。詳細を以下に論じる。
マトリクス225の出力における(ピーク高さの1/2における)試料ピーク幅は、送出系221、222、および223からの適切な流量を選択することによって、および混合複合物および試料が流体回路104を通って移動する時の線形拡散をさらに最小化する管系の直径を選択することによって、さらに最小化することができる。一般的に、狭径の管系は、高スループットを可能にする鋭いピークを生じるが、流体送出系内の高背圧にもつながる。同様に、高流量も、概してより鋭いピークをもたらすが、同様に高背圧につながる。高流量は、不完全な試料イオン化により、質量分析計内の信号強度の減少につながる可能性もある。したがって、システムの最大スループットの決定は、モデル化することができる、または経験的に決定することができる、複数の因子間の妥協点である。不溶性マトリクスの性質およびタイプ、送出流量および圧力、管系の仕様、高速クロマトグラフィを実施するために使用される流体の性質、および流体弁206と207との切り替えのタイミングを含む、使用される種々のパラメータは、分析される化学化合物ファミリーごとに最適化されなければならない。この一組の最適化されたパラメータは、高スループットの質量分析のための化合物特異的方法を構成する。本発明の種々の実施形態によれば、管系の直径の通常の範囲は、20μm〜300μmであり、また、流量は、0.1mL/分〜5mL/分であり、およそ5〜6000psiに到達し得る背圧をもたらす。
試料スループットの最大化における主な問題点は、試料間キャリーオーバーの除去である。図1に戻ると、1回の分析後に、流体回路104、マトリクス102、および分析器インターフェース130から除去されていない、いずれかの試料は、次の試料への干渉を引き起こし得る。低レベルの検体を伴う試料が、高レベルの検体を伴う試料の後にある場合、第1の試料からのキャリーオーバーは、第2の低検体試料における不正確な分析をもたらし得る。キャリーオーバーの最小化は、一般的に、着目検体がシステム100から除去されるように、流体回路104、マトリクス102、および分析器の界面130を、着目検体を完全に可溶化する溶媒で洗浄することによって達成される。本発明の種々の実施形態もこの手法を用いており、流体回路104、マトリクス102、および分析器インターフェース130は、試料のキャリーオーバーを最小化するように、溶出緩衝剤/洗浄液で洗い流され得る。
本発明の種々の実施形態によれば、流体回路104内の流体弁は、クロマトグラフィマトリクス102を横断する流れの方向を逆転させるように作動させる。一般的に、マトリクス102を横断する流れは、マトリクス102からの各試料出力について2回逆転させる必要がある。最初に、複合混合物102がマトリクス102に一方向に搭載されて、検体が結合されるが、他の成分(例えば、塩、緩衝剤、洗浄剤等)は結合されない。次いで、流れが逆転され、検体は、マトリクス102から搭載された方向とは逆の方向に溶出されて、分析のために分析器116に分流される。最後に、流れは、次の試料に備えて再び逆転される。このようなマイクロ流体用途で使用される多くの流体弁では、弁を通る液体の流れは、弁が作動している間、物理的に停止される。標準的な電子作動の弁モジュール106は、100ミリ秒以上で状態を切り替えることができる。空気圧作動の弁は、非常に速く切り替えることができ、30〜40ミリ秒の作動時間に到達し得る。この作動時間中の短い流れの遮断は、一般的に運転が数分間続く従来のLCの中では問題ではない。
コントローラ125または別のプロセッサによって実行され得る、分析器116によって生成されるデータを分析するために使用されるソフトウェアは、高スループット分析の多くの特徴を有効にする。例えば、高スループットでの長い分析の終了時の質量分析計の出力は、一連のデータ点から成り、時間対強度値は、分析されている各質量チャネルで記録される。直交座標系でプロットされる場合、これらのグラフは、一連のピークで構成されるクロマトグラムをもたらし、各ピーク下の面積の積分は、分析される試料の濃度に相関させることができる。
本発明の種々の実施形態では、高速クロマトグラフィおよび試料間洗浄に必要な時間は、マトリクスの出力時点での試料の(ピーク高さの1/2における)ピーク幅よりもはるかに長い。このような実施形態では、次に分析される試料が質量分析計に送達される前に、数秒の基線質量分析計(または他の分析器)の信号が存在し得る。この期間は、質量分析計が能動的に試料を定量化していないので、事実上、生産性の損失である。
図4は、本発明の一実施形態による、単一の注入弁405を含む、自動注入装置400の概略図である。自動注入装置400は、上述の実施形態にあるように、さらなる弁と組み合わせて使用され得、また、試料を試料貯蔵容器から、これに限定されないが、分析器および/またはクロマトグラフィカラムを含み得る流体回路への移動に使用され得る。
多くの生体異物化合物は、主に肝臓内の、シトクロームP450として周知の、酵素ファミリーによって生体内で代謝される。P450酵素による代謝活性は、大多数の小分子医薬品も含む。多くの医薬的活性化合物の治療活性は、非常に用量依存性があるので、これらの化学薬品の代謝的運命を理解することは有利である。多くの場合、ある高用量の化学薬品は、有毒であり得るか、または長期的な有害作用を有する可能性がある。
本発明の種々の実施形態によれば、システムのある属性は、スループットを犠牲にして有利に強化され得る。このような応用の一実施例は、代謝安定性検定である。代謝安定性検定は、試験分子に対する肝臓酵素の活性を評価する。それは、一般的に、緩衝系内にエネルギ源(例えば、NADPH)および試験化合物とともに細胞内肝臓調製物(例えば、肝ミクロソームまたはS9フラクション)を培養することによって実施される、生体外検定である。肝臓酵素は、試験化合物を代謝し得、その速度は、質量分析法を用いて、制御された時間での試験化合物の量を定量化することによって定量することができる。
一部の応用例では、分析される試料は、すでに質量分析法と適合する緩衝液中にある。このような応用例は、いかなる精製も必要とせずに、API源内に直接的に噴霧することができる、水性または有機緩衝液中の試験化合物の品質管理分析であり得る。上述の実施形態の種々の局面は、このような応用例に対する試料スループットを増加させるために用いることができる。
上述のように、流体系全体は、所与の試料からのキャリーオーバーが列内の次の試料の分析と交絡しないようにするために、分析の間に適切に清潔にされる。流体系の清潔化は、交絡化合物がそこに溶解しやすい溶媒を使用して流体系を洗い流すことによって達成される。本明細書で説明される流体系は、弁アセンブリと各々が関連する2つの主要な構成要素で構成される。第1の弁は、注入ループと、分析される流体試料の分割量がそれを通して注入ループ内に吸引される、試料吸引管とを含む。この弁の配設は、分析の前に試料を精製することができる不溶性マトリクスを含有するクロマトグラフィシステムを含む、第2の弁と流体連通する。
図6(A)〜(D)は、上述の3弁および3ポンプ配設を用いた本発明の一実施形態を示す。図6(A)は、液体試料を試料注入ループ内に搭載する、第1の検定段階を示す。2弁の実施形態に関して概ね上述したように、シッパー管604を、試料貯蔵容器まで下げて、試料注入弁601を介して試料の分割量を注入ループ内に吸引する。いかなる過剰に吸引した試料も、ループの下流の真空トラップ621内に回収される。この間に、新鮮な溶出溶媒を、安定したESIまたはACPIの噴霧、および質量分析計からの対応する安定した基線信号を確立するように、第1の溶出溶媒ポンプ624から分析器640へと送達する。カラム625は、洗浄溶媒ポンプ622から洗浄緩衝剤(一般的に、水溶液)を送出することによって平衡化される。第2の溶出溶媒ポンプ623は、溶媒弁603によって廃棄物に直接的に分流される。
本発明の別の実施形態は、複数の試料の高速で逐次的な分析のための装置および方法を提供する。装置は、流体試料の分割量を試料貯蔵容器から流体注入弁内の注入ループ内に吸引する、コンピュータ制御のロボットシステムを備える。この改善は、現在の注入時に、装置が、より高いスループットを実現し、一方で、試料のキャリーオーバーを最小化できるようにする。
多くの生物学的分離は、イオン交換クロマトグラフィ(例えば、陽イオン交換または陰イオン交換)、またはゲルろ過クロマトグラフィを使用する。これらの手法は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および多くの他の検体の分離において特に重要な用途を有する。分離手法は、科学的な研究開発から医薬的活性化合物の製造に及ぶ、多くの用途を有する。
陽イオン交換クロマトグラフィを、薬理活性タンパク質の製造の品質管理ステップで使用する。製造されるロットごとに、確立された標準処理手順を用いて、60分のHPLC分離を実施しなければならない。着目タンパク質は、28〜30分でHPLCカラムから溶出することが分かっている。クロマトグラフィの運転全体は、220nmの波長で光学検出器1006によって監視される。HPLC1004は、0.6mL/分で運転し、分離を成立させるために0.1Mの塩化ナトリウムから1Mの塩化ナトリウムへの勾配を用いる。
全ての特許、公開特許出願、および本明細書で引用される他の参考文献は、その全体が本明細書に参考として援用される。
Claims (19)
- 質量分析装置による分析のために、液体クロマトグラフィ装置からの塩または緩衝剤を含有する溶出試料を調製する方法であって、
無極性溶媒を該質量分析装置に連続的に提供することと、
該液体クロマトグラフィ装置から該溶出試料を受容することと、
固相抽出カラム上で該溶出試料を流すことと、
該固相抽出カラム上で該無極性溶媒を流すことと、
該無極性溶媒および該溶出試料を該質量分析装置に提示することと
を含む、方法。 - 前記液体クロマトグラフィ装置は、イオン交換クロマトグラフィ装置である、請求項1に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィ装置は、陽イオン交換クロマトグラフィ装置である、請求項1に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィ装置は、ゲルろ過クロマトグラフィ装置である、請求項1に記載の方法。
- 光学データセットを生成するように、前記液体クロマトグラフィ装置からの前記溶出試料を光学的に分析することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記光学データセットを、前記質量分析装置によって生成されるデータセットと関連付けることをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記固相抽出カラム上で極性洗浄液を流すことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィ装置を質量分析装置に連結する試料注入システムであって、該システムは、
試料注入弁であって、
i.該液体クロマトグラフィ装置からの試料が、該試料注入システムを通過できるようにする、第1の位置と、
ii.該液体クロマトグラフィ装置からの試料を試料供給ループ上に搭載する、第2の位置と
を有する、試料注入弁と、
試料分析器への溶出溶媒の連続流を促進するように構成される、カラム制御弁であって、該カラム制御弁は、
i.同時に、該試料供給ループから固相抽出カラムへと該流体試料を第1の方向に送達し、溶出溶媒を該試料分析器に送達する、第1の位置と、
ii.該流体試料および該溶出溶媒を該試料分析器に送達するように、該固相抽出カラム上で該溶出溶媒を第2の方向に流す、第2の位置と
を有する、カラム制御弁と
を備える、システム。 - 前記液体クロマトグラフィ装置からの前記試料を分析する光学検出器をさらに備える、請求項8に記載のシステム。
- 前記液体クロマトグラフィ装置と前記試料注入弁との間に位置する、分流弁をさらに備える、請求項8に記載のシステム。
- 前記分流弁は、前記光学検出器によって生成される信号の結果として作動させられる、請求項10に記載のシステム。
- フラクションコレクタをさらに備える、請求項8に記載のシステム。
- 前記溶出溶媒は、極性溶媒である、請求項8に記載のシステム。
- 前記溶出溶媒は、無極性溶媒である、請求項8に記載のシステム。
- 質量分析装置による分析のために、液体クロマトグラフィ装置からの溶出試料を調製する方法であって、該方法は、
極性溶媒を該質量分析装置に連続的に提供することと、
該液体クロマトグラフィ装置から該溶出試料を受容することと、
HILICカラム上で該溶出試料を流すことと、
該HILICカラム上で該極性溶媒を流すことと、
該極性溶媒および該溶出試料を該質量分析装置に提示することと
を含む、方法。 - 前記液体クロマトグラフィ装置は、イオン交換クロマトグラフィ装置、陽イオン交換クロマトグラフィ装置、およびゲルろ過クロマトグラフィ装置から成る群より選択されるものである、請求項15に記載の方法。
- 光学データセットを生成するように、前記液体クロマトグラフィ装置からの前記溶出試料を光学的に分析することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記光学データセットを、前記質量分析装置によって生成されるデータセットと関連付けることをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記固相抽出カラム上で極性洗浄液を流すことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
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