JP3355868B2 - 液体クロマトグラフへの試料導入方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生化学、薬理、医学など
の分野において、試料をサンプリングバルブのサンプル
ループに採取し、サンプリングバルブを切り換えてサン
プルループに採取した試料を液体クロマトグラフのカラ
ムに導入する試料導入方法とその装置に関し、例えば蛋
白質やペプチドのアミノ酸配列を決定するために、ペプ
チドシーケンサから１個のアミノ酸を切り出した溶液を
試料として液体クロマトグラフに導入するような、試料
量に限りのある場合に有効な試料導入方法と、そのよう
な場合に好都合な試料導入装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質又はペプチド（両者はいずれ
もアミノ酸がアミド結合によって結合したものであり、
分子量の大きさにより区別されるだけであるので、両者
を含めて以下単にタンパク質という）のアミノ酸配列を
決定するために、ペプチドシーケンサが用いられる。ペ
プチドシーケンサではフェニルイソチオシアネートを用
いて試料であるタンパク質のＮ末端（アミノ基末端）か
らただ１つのアミノ酸を３−フェニル−２−チオヒダン
トイン誘導体（ＰＴＨアミノ酸）として切り出し、３７
％アセトニトリル水溶液に溶解して、高速液体クロマト
グラフィにより同定する。この過程を１サイクルとし、
１つのアミノ酸が切り取られた試料タンパク質の残りの
部分に対して再び同様の処理を繰り返す。この処理をｎ
サイクル繰り返すことにより、もとの試料タンパク質の
Ｎ末端から数えてｎ個のアミノ酸の配列を決定すること
ができる。

【０００３】高速液体クロマトグラフィへの導入にあた
っては、その溶液を高速液体クロマトグラフの試料導入
装置のサンプリングバルブのサンプルループに導入した
後、サンプリングバルブの流路を切り換えて溶離液によ
りカラムに導入する。従来の試料導入方法を本発明方法
と比較して説明するために、本発明方法の実施例が適用
されるのと同じ試料導入装置に従来の試料導入方法を適
用した場合を説明する。本発明が適用される試料導入装
置は図１（Ａ）に示されるように、６ポートバルブにて
なるサンプリングバルブ２に一定容量のサンプルループ
４、試料供給流路６、廃液流路８、溶離液供給流路１０
及びカラム流路１２が接続され、試料供給流路６のサン
プリングバルブ近傍には液を検知する入口センサ１４、
廃液流路８のサンプリングバルブ近傍には液を検知する
出口センサ１６が設けられたものである。３はサンプリ
ングバルブ２内でポート間を接続するスリットであり、
サンプリングバルブ２の切換えにより、試料供給流路６
が廃液流路８に直接接続され、溶離液供給流路１０がサ
ンプルループ４を介してカラム流路１２に接続される第
１の流路と、試料供給流路６がサンプルループ４を介し
て廃液流路８に接続され、溶離液供給流路１０が直接カ
ラム流路１２に接続される第２の流路との間で流路を切
り換える。溶離液供給流路１０にはポンプ２２により溶
離液が供給され、カラム流路１２は分離カラム２６につ
ながる。２４はカラムオーブン、２８は検出器である。
ポンプ２２、カラムオーブン２４及び検出器２８は高速
液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を構成する。

【０００４】この試料導入装置が蛋白質のアミノ酸配列
を決定する装置に適用される場合には、試料供給流路６
はエドマン反応を行なってＮ末端のアミノ酸を１つずつ
切り出すペプチドシーケンサ２０から切り出されたアミ
ノ酸誘導体の溶液を供給する。

【０００５】入口センサ１４は図１（Ｂ）に示されるよ
うに、サンプリングバルブ２の近傍の試料供給流路６に
設けられおり、試料供給流路はフェルール２０を介して
ナット２２によりバルブ２に接続されている。廃液流路
８に設けられた出口センサ１６も入口センサ１４と同じ
ように取りつけられ、サンプリングバルブ２から等しい
距離に配置されている。サンプリングバルブ２からセン
サ１４，１６までの距離は例えば２５ｍｍであり、流路
６，８の内径は例えば０.５ｍｍである。

【０００６】図２はこのような試料導入装置を用いて試
料をカラムに導入する方法を示したものである。 （Ａ）サンプリングバルブ２を図２（Ａ）のように第２
の流路構成にし、試料（太い実線）を試料供給流路６か
ら供給してサンプルループ４を経て廃液流路８へ流し、
溶離液（太い破線）を溶離液供給流路１０から直接カラ
ム流路１２へ流す。そして出口センサ１６が液を検知し
たら試料の送液を停止する。このとき、入口センサ１４
が液を検知していることを確認することにより、サンプ
ルループ４が試料で満たされていると判断する。 （Ｂ）図２（Ｂ）のようにサンプリングバルブ２を時計
廻りに切り換える。これによりサンプルループ４に採取
された試料が溶離液によって分離カラムに導入される。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】サンプルループ４の容
量を例えば２０μｌ、スリット３の１つの容量を０.３
μｌ、スリット３からセンサ１４，１６までの容量を
４.９μｌとし、送液を停止する場合にセンサ１６が液
を検知してから送液が停止するまでに流路内残圧のため
に１０ｍｍ程度液が進むので、出口センサ１６の下流側
には２μｌの無駄な試料が存在する。また入口センサ１
４の上流側には送液停止後の残圧による液の移動の制御
が困難であるため、２０ｍｍ程度の安全量を見込む必要
があるので、４μｌ程度が無駄になる。そこで、図２の
方法により１回の試料導入で必要な試料量は、 ２０＋０.３×２＋４.９×２＋２＋４＝３６.４（μｌ） となる。このうち実際にカラムに導入されるのは（２０
＋０.３）μｌであるので、使用される試料のうちの５
６％だけが有効に分析されたことになる。

【０００８】ペプチドシーケンサ２０でアミノ酸誘導体
として切り出したＰＴＨアミノ酸を溶液とした試料は、
流路をガスで加圧することによって試料供給流路６から
サンプリングバルブ２に送液され、サンプルループ４に
試料が満たされたか否かは入口センサ１４と出口センサ
１６の出力により判断している。しかし、ガス圧のみに
よる送液では流速を制御するのが困難であるため、出口
センサ１６で確実に液を検知するためには、液が出口セ
ンサ１６を有る程度通過した後で送液を停止する必要が
ある。そのためサンプルループ４の容量に対して過剰の
試料が必要になり、例えばペプチドシーケンサの場合に
は必要なＰＴＨアミノ酸溶液の量が多くなるため溶解量
が多くなり、濃度が低下する。そこで、本発明の第１の
目的は、サンプリングバルブを用いて液体クロマトグラ
フに試料を導入する際の無駄な試料量を減少させること
である。本発明の第２の目的は、サンプリングバルブを
用いて液体クロマトグラフに試料を導入する際の導入液
量を正確に把握して送液制御を行なうことである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の試料導入方法
は、図１（Ａ）に示されるような試料導入装置を用いて
サンプリングバルブを切り換えることにより一定量の試
料を液体クロマトグラフに導入する方法であり、次のス
テップ（Ａ）から（Ｃ）を順に行なう。 （Ａ）試料供給流路が廃液流路に直接接続され、溶離液
供給流路がサンプルループを介してカラム流路に接続さ
れる第１の流路において、試料の送液を開始し、入口セ
ンサが試料を検知したら試料の送液を停止する。 （Ｂ）試料供給流路がサンプルループを介して廃液流路
に接続され、溶離液供給流路が直接カラム流路に接続さ
れる第２の流路に切り換えて試料の送液を再開して試料
をサンプルループに送り込み、出口センサが溶離液を検
知した後、その溶離液検知が中断したら試料の送液を停
止する。 （Ｃ）再び第１の流路に切り換え、溶離液によってサン
プルループ中の試料を分離カラムに導入する。

【００１０】本発明の試料導入装置は、図１（Ａ）に示
されるような試料導入装置において、廃液流路に三方切
換えバルブを介して分岐流路を設け、その分岐流路には
モータにより駆動されるシリンジを接続し、第２の流路
において試料をサンプルループに送り込む際の送液速度
をそのシリンジにより制御するようにしたものである。

【００１１】

【作用】サンプリングバルブでの無駄な試料量が減少す
れば、サンプリングバルブへ供給する試料量が少なくて
すむため、例えばペプチドシーケンサでは試料を溶解す
る溶媒の量を少なくして試料を濃縮した状態で液体クロ
マトグラフに導入することができ、それだけ感度が向上
する。

【００１２】

【実施例】図３は図１（Ａ）に示された試料導入装置を
用いて液体クロマトグラフに試料を導入する第１の実施
例を示したものである。 （Ａ）試料供給流路６が廃液流路８に直接接続され、溶
離液供給流路１０がサンプルループ４を介してカラム流
路１２に接続される第１の流路において、試料（太い実
線）の送液と溶離液（太い破線）の送液を開始し、入口
センサ１４が試料を検知したら試料の送液を停止する。

【００１３】（Ｂ）試料供給流路６がサンプルループ４
を介して廃液流路８に接続され、溶離液供給流路１０が
直接カラム流路１２に接続される第２の流路に切り換え
て試料の送液を再開する。 （Ｃ）試料をサンプルループ４に送り込み、出口センサ
１６が溶離液を検知した後、その溶離液検知が中断した
ら試料の送液を停止する。 （Ｄ）再び第１の流路に切り換え、溶離液によってサン
プルループ４中の試料を分離カラムに導入する。

【００１４】図３の実施例で、（Ｃ）又は（Ｄ）の流路
に示されるように、１回の試料導入に必要な試料量は、
サンプルループ４の容量２０μｌ、１つのスリットの容
量０.３μｌ、スリットから入口センサ１４までの容量
４.９μｌ、送液停止時に液が進む容量２μｌ、及び入
口センサ１４の上流側で安全を見越した量４μｌの合計
３１.２μｌである。そのうち２０.３μｌが分離カラム
に導入されるので、試料の有効率は６５％であり、図２
の従来の方法に比べると１６％向上する。

【００１５】図４は第２の実施例を表したものである。
この実施例では、（Ａ）に示されるように、入口センサ
１４の上流に第２の入口センサ１４ａを設け、その２つ
の入口センサ１４と１４ａの間の流路の容量をサンプル
ループ４の容量、スリット１つ分の容量及び＋αとす
る。

【００１６】図４の実施例の動作を説明する。 （Ａ）第１の流路において、試料の送液を開始し、入口
センサ１４が試料を検知したら試料の送液を停止する。
このとき、入口センサ１４ａも試料を検知していること
を確認する。 （Ｂ）第２の流路に切り換えて試料の送液を再開し、試
料をサンプルループ４に送り込み、出口センサ１６が溶
離液を検知した後、その溶離液検知が中断したら試料の
送液を停止する。 （Ｃ）再び第１の流路に切り換え、溶離液によってサン
プルループ４中の試料を分離カラムに導入する。

【００１７】図４の実施例の場合、１回の試料導入に必
要な試料量は、図４（Ａ）のセンサ１４と１４ａの間の
流路２６の容量であり、具体的にはサンプルループ４の
容量２０μｌ、スリット１つ分の容量０.３μｌ、送液
停止時に液が進む量２μｌ、及びセンサ１４ａの上流側
で安全を見込んで残す量４μｌの合計２６.３μｌであ
り、その内２０.３μｌが分離カラムに導入されるの
で、試料の有効率は７７％となり、図２の従来の方向に
比べて３７％向上する。

【００１８】図５は廃液流路にシリンジを設けてサンプ
ルループ４に試料を供給するときの流速を制御するよう
にした発明の実施例を表わしたものである。３０はペプ
チドシーケンサの反応容器であり、切り出されたアミノ
酸誘導体を溶解するために溶媒３２が反応容器３０へ供
給される。溶媒３２はガス供給部３４から開閉弁３６を
介して供給される加圧ガスにより、開閉弁３８を介して
供給される。反応容器３０の試料溶液を試料供給流路６
へ送り出すために、ガス供給部３４からの加圧ガスが開
閉弁４０を介して反応容器３０に供給され、反応容器３
０の試料溶液は開閉弁４２を介してサンプリングバルブ
２へ供給される。廃液流路８には三方バルブ４４により
分岐流路が接続され、その分岐流路にはシリンジ４６が
接続されている。シリンジ４６はパルスモータ４８によ
り駆動される。

【００１９】図５の実施例の動作について説明する。 （Ａ）開閉弁４２が開けられ、反応容器３０がガス加圧
されて試料溶液がサンプリングバルブ２のサンプルルー
プ４へ供給され、三方バルブ４４はシリンジ４６側に設
定されてシリンジ４６が吸引しながら試料溶液をサンプ
ルループ４内に導く。このとき、試料溶液が入口センサ
１４を通過している間のパルスモータ４８のパルス数が
カウントされる。 （Ｂ）パルスモータ４８のカウント数から計算された液
量が所定量を超えていることを条件として、出口センサ
１６が液を検知したらサンプリングバルブ２が切り換え
られ、サンプルループ４に計量された試料が分離カラム
へ導入される。

【００２０】もし、入口センサ１４を試料が通過した時
点で入口センサ１４を通過した液量が所定量に達してい
なければ、サンプルループ４には必要な試料量が採取さ
れなかったことになるので、サンプリングバルブ２が切
り換えられることなくシリンジ４６が押し戻され、試料
溶液が反応容器３０に戻される。その後、反応容器３０
をいったん乾燥させて溶媒を揮散させた後、再度溶媒３
２が反応容器３０に供給されて溶解がやり直され、再度
サンプリング動作が繰り返される。

【００２１】この実施例ではシリンジ４６で液量を測定
しているので、流速を正確に制御することができ、出口
センサ１６が液を検知した後に液が進む距離は、シリン
ジ４６を設けていない場合は１０ｍｍ程度であったもの
が、図５では約３ｍｍ（０.６μｌ）に減少させること
ができ、それだけ無駄な試料が少なくてすむ。ここで
は、１回の試料導入に必要な試料量は、サンプルループ
４の容量２０μｌ、スリット２個分の容量０.６μｌ
（＝０.３μｌ×２）、スリットから出口センサ１６ま
での容量４.９μｌ、及び上流側と下流側で安全を見込
んだ量０.６μｌ（＝０.３μｌ×２）の合計２６.７μ
ｌである。そのうち２０.３μｌが分離カラムに導入さ
れるので、試料の有効率は７６％以上に改善される。

【００２２】さらに、シリンジ４６を駆動するモータ４
８のパルス数のカウントによる液の所定量をスリットか
ら出口センサ１６までの容量４.９μｌ分減らすため
に、出口センサ１６で液を検知した後、４.９μｌ分の
パルス数だけシリンジを戻してやればよい。この場合
は、１回の試料導入に必要な試料量は、サンプルループ
４の容量２０μｌ、スリット２個分の容量０.６μｌ
（＝０.３μｌ×２）、及び上流側と下流側で安全を見
込んだ量０.６μｌ（＝０.３μｌ×２）の合計２１.８
μｌである。そのうち２０.３μｌが分離カラムに導入
されるので、試料の有効率は９０％以上に改善される。
また、図５の実施例ではモータ４８のパルス数により液
量を測定することができるため、入口センサ１４による
液の確認が不要になり、サンプリングバルブ２から入口
センサ１４までの正確な容量の設定も不要になる。

【００２３】図５の実施例を用いると、液体クロマトグ
ラフでの保持時間確認などのためにスタンダードサンプ
ルを導入する際の構成が簡単になる。図６（Ａ）は従来
の手法を示したものである。スタンダードサンプルを導
入するために、溶離液供給流路１０に手動で導入を行な
うマニュアル・サンプリングバルブ５０を設け、サンプ
リングバルブ５０に設けたサンプルループ５２に標準液
を採取し、サンプリングバルブ５０を切り換えることに
よってサンプリングバルブ２を介して分離カラムにスタ
ンダードサンプルを注入している。

【００２４】しかし、図５の実施例によれば、図６
（Ａ）のようなマニュアル・サンプリングバルブ５０は
不要になり、図６（Ｂ）に示されるように試料供給流路
６に三方バルブ５４を介してスタンダードサンプル注入
用ライン５６を接続するだけですむ。５８はスタンダー
ドサンプルである。これは、廃液流路にシリンジ４６を
設けているからであり、サンプリングバルブ２を図６
（Ｂ）のように第２の流路に切り換え、三方バルブ５４
をスタンダードサンプル５８側に切り換えた状態でシリ
ンジ４６により吸引することにより、スタンダードサン
プル５８をサンプリングバルブ２のサンプルループ４に
導入する。

【００２５】このように、注入頻度の少ないスタンダー
ドサンプルのために、新たにサンプリングバルブを取り
つける必要がなくなり、構成が簡単で低コストになる。
また、実試料とスタンダードサンプルとを異なるサンプ
ルループで定量することにより発生する相対誤差を解消
することができる。

【００２６】また、図６（Ｂ）に示される実施例によれ
ば、分離カラムに注入される試料量の測定が容易にな
り、自動化が可能になる。次に、サンプルループ４の内
容積を測定する方法を説明する。 （１）スタンダードサンプル５８が入れられる容器（ス
タンダードサンプル容器という）に不揮発性の液（例え
ば水であるが、他の液でもよい）を入れておく。三方バ
ルブ５４をスタンダードサンプル容器側にする。 （２）スタンダードサンプル容器内に入れた不揮発性の
液をシリンジ４６により吸引する。 （３）入口センサ１４が液を検知したら、シリンジ４６
を駆動しているモータのパルス数をカウントする。 （４）液がサンプルループ４を満たし、出口センサ１６
に到達したらカウントを終了する。このときのカウント
数をＮ１とする。 （５）シリンジ４６で液をスタンダードサンプル容器内
に戻した後、サンプリングバルブ２を時計方向に６０°
回転して流路を切り換える。 （６）上記の（２）から（４）の操作を繰り返す。ただ
し、このときは液はサンプルループ４を通らずに出口セ
ンサ１６に到達する。このときのカウント数をＮ２とす
る。 Ｎ＝Ｎ１−Ｎ２ を求めると、その量Ｎはサンプルループ４の容量とスリ
ット１つ分の容量の合計であり、実際に分離カラムに注
入される試料量が計算されたことになる。

【００２７】図６（Ｂ）に示される実施例の計量精度
は、モータのパルス数とシリンジの動きとの直線性に依
存するが、シリンジを駆動するのにピッチ１ｍｍのボー
ルネジを使用した場合には、１パルスあたりの送液量が
０.０２μｌとなり、誤差は小さい。分離カラムに注入
される試料量を測定する上記の例では、スタンダードサ
ンプル容器に入れた液を使用したが、装置に装着してい
る洗浄液などを使用すれば、分離カラムに注入される試
料量の測定が自動化される。しかし、この場合、上記の
工程（５）でサンプルループ４を満たした液を元に戻す
ことはできないので、その液はガスにより廃液ボトルに
排出されることになる。

【００２８】

【発明の効果】本発明では液体クロマトグラフへの試料
導入の際の試料の無駄な量を少なくすることができる。
廃液流路にシリンジを設けてサンプルループへの試料供
給の際の流速を制御するようにすれば、試料導入の際の
試料の無駄な量を少なくすることができる。このよう
に、試料の無駄な量を少なくできることから、例えばペ
プチドシーケンサなどのように限られた試料しか得られ
ない場合には試料をより濃縮して分析することができる
ようになり、感度が向上する。また、ペプチドシーケン
サでは、アミノ酸誘導体を溶媒に溶解する際のバブリン
グなどにより溶液量が所定量より少なくなってしまった
ような場合、ガス圧のみで送液する場合には、送液終了
時に仮に液量がサンプルループの容量に足らなくなる
と、いったんサンプリングバルブに供給した試料をもと
の反応容器に復帰させる手段がなく、その回の測定はエ
ラーとして処理されてしまう。しかし、廃液流路にシリ
ンジを設けることにより、サンプルループに供給した試
料溶液をシリンジにより再び反応容器に戻すことができ
るため、溶解をやり直して再度サンプリングバルブに導
入することができるようになる。そのため従来ならエラ
ーとして処理された操作を有効に生かすことができるよ
うになる。また、スタンダードサンプルを導入する際
に、サンプルループを持ったマニュアル・サンプリング
バルブを別途設ける必要がなく、構成が簡略化される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明が適用される試料導入装置を示す図であ
り、（Ａ）は概略流路図、（Ｂ）は液センサ部分を示す
断面図である。

【図２】従来の試料導入方法を工程順に示す流路図であ
る。

【図３】第１の実施例の試料導入方法を工程順に示す流
路図である。

【図４】第２の実施例の試料導入方法を工程順に示す流
路図である。

【図５】第３の実施例を表す流路図である。

【図６】スタンダードサンプルを導入する場合を示す流
路図で、（Ａ）は従来の場合、（Ｂ）は図５の実施例の
場合である。

【符号の説明】

２ サンプリングバルブ ４ サンプルループ ６ 試料供給流路 ８ 廃液流路 １０ 溶離液供給流路 １２ カラム流路 １４ 入口センサ １６ 出口センサ ２０ ペプチドシーケンサ ２２ 溶離液の送液ポンプ ２４ 高速液体クロマトグラフ ４６ シリンジ ４８ パルスモータ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/20 G01N 1/00 101 G01N 30/24

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプリングバルブに一定容量のサンプ
   ルループ、試料供給流路、廃液流路、液体クロマトグラ
   フの溶離液供給流路及び分離カラムへつながるカラム流
   路が接続され、試料供給流路のサンプリングバルブ近傍
   には液を検出する入口センサ、廃液流路のサンプリング
   バルブ近傍には液を検出する出口センサが設けられた試
   料導入装置を用い、 サンプリングバルブを切り換えることにより、試料供給
   流路が廃液流路に直接接続され、溶離液供給流路がサン
   プルループを介してカラム流路に接続される第１の流路
   と、試料供給流路がサンプルループを介して廃液流路に
   接続され、溶離液供給流路が直接カラム流路に接続され
   る第２の流路との間で流路を切り換えることにより一定
   量の試料を液体クロマトグラフに導入する方法におい
   て、 次のステップ（Ａ）から（Ｃ）を順に行なうことを特徴
   とする試料導入方法。 （Ａ）第１の流路において試料の送液を開始し、入口セ
   ンサが試料を検知したら試料の送液を停止する。 （Ｂ）第２の流路に切り換えて試料の送液を再開して試
   料をサンプルループに送り込み、出口センサが溶離液を
   検知した後、その溶離液検知が中断したら試料の送液を
   停止する。 （Ｃ）再び第１の流路に切り換え、溶離液によってサン
   プルループ中の試料をカラムに導入する。
2. 【請求項２】 サンプリングバルブに一定容量のサンプ
   ルループ、試料供給流路、廃液流路、液体クロマトグラ
   フの溶離液供給流路及び分離カラムへつながるカラム流
   路が接続され、サンプリングバルブを切り換えることに
   より、試料供給流路が廃液流路に直接接続され、溶離液
   供給流路がサンプルループを介してカラム流路に接続さ
   れる第１の流路と、試料供給流路がサンプルループを介
   して廃液流路に接続され、溶離液供給流路が直接カラム
   流路に接続される第２の流路との間で流路を切り換える
   ことにより一定量の試料を液体クロマトグラフに導入す
   る試料導入装置において、 前記試料供給流路のサンプリングバルブ近傍に液を検出
   する入口センサを設け、 前記廃液流路のサンプリングバルブ近傍に液を検出する
   出口センサを設け、 前記廃液流路に三方切換えバルブを介して分岐流路を設
   け、その分岐流路にはモータにより駆動されるシリンジ
   を接続し、前記第２の流路において試料をサンプルルー
   プに送り込む際の送液速度をそのシリンジにより制御す
   ることを特徴とする試料導入装置。