JP3868267B2 - マルチカラム・アフィニティー検出システム - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される、多数の機能分子の認識を可能にするアフィニティー検出システムに関する。
【0002】
【従来の技術】
特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するアフィニティー法検出は、大変鋭敏な検出法であり、例えば特定の酵素を用いて特定のタンパクを検出するアフィニティーカラムとして、液体クロマトグラフにおいて用いられてきた。しかしながら、この液体クロマトグラフ法におけるアフィニティー法は、特定の分子のみの情報を与えるにすぎず、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段にはなっていない。
【0003】
現在、例えば遺伝子の変異、特に一塩基(配列)の変異による多型の検出は、突然変異に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、薬剤応答性や副作用の指針に必要であり、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献する。この検出にアフィニティー法の一種である、いわゆるDNAチップの使用が有効であることが知られている。従来利用されてきた、短いDNA鎖を固定化したDNAチップ、Affymetrix社のいわゆるGene Chipは、通常約1cm角のシリコンもしくはガラス基板上に、フォトリソグラフィー技術を用いて1万以上のオリゴDNA断片(DNAプローブ)を作り込んだものである。このDNAチップ上に、たとえば蛍光標識した、調べたいDNA資料を流すと、上記DNAチップ上のプローブと相補的な配列を有するDNA断片はプローブと結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、DNA試料中のDNA断片の特定配列を認識・定量することができる。この方法により、既に、ガン遺伝子の突然変異の検出や、遺伝子多型の検出が可能であることが示されている。
また、cDNAをスライドガラス上に配列したマイクロアレーも用いられる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
これらのチップ化したアフィニティー法は、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段として大変有効であるが、反面、エリアが小さいことなどから充分な信号強度がとれないことなどから、液体クロマトグラフ法などで用いられるような吸光分析は使えず、もっぱら蛍光検出による高感度分析を用いており、特定の領域での分析に使えるだけであった。従って、いわゆるプロテオーム分析においては、二次元電気泳動などの手段で分析するほかなかった。
また、液体クロマトグラフィーにおけるアフィニティー法では、特定の分子に関する情報が得られるが、多数の分子に対する情報を同時に得ることは困難であった。
【0005】
従って、特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するだけではなく、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段であり、かつ無理なく高感度分析ができる検出手段が求められている。
本発明は、このような従来の課題に鑑みてなされたものであり、充分な信号強度がとれ、蛍光検出に伴う困難さを低減した、反応性プローブ物質を用い、多数の分子について同時にその存在を高感度分析できるマルチカラム・アフィニティー検出システムを提供することを課題とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、下記手段により上記課題を解決できる。
(1)同時に一定量ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラーと、それに結合された分岐ラインに結合し、分離基材上に塩基配列を合成によって得られた、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定した、一体構造をしたモノリス型カラムからなるアフィニティーカラムの複数に、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラムにサンプルを一斉ロード、一斉検出することを特徴とするマルチカラム・アフィニティー検出システム。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
(マルチカラム・アフィニティー検出システム)
図1は、マルチカラム・アフィニティー検出システムの2つのイメージを示す。 一個のカラム1は、それぞれ一種類の特異的反応プローブ(「プローブ分子」ともいう)2(図2参照)を固定しており、特定の反応性を持った物質と特異的親和性を示す。例えば、特定の抗体をプローブ分子2としたとき、これに反応する抗原は、強くこのプローブ分子2と吸着する。従って、通常の溶離条件に於いては溶出することなく、例えば保持を維持できなくなるような溶媒濃度下もしくは塩の存在下、あるいはpH条件によってしか溶出してこない。通常の液体クロマトグラフにおけるアフィニティーカラムの場合、この現象を用いて、特定の酵素を濃縮するなどの手段として用いられてきた。
【0009】
しかしながら、アフィニティー法クロマトグラムの場合、特異的吸着を起こすことだけに注目すれば、その分子の存在を示すのに、従来のように溶出させることを前提とせず、特異的保持することだけに着目した分離モードがあっても良い。しかもこのモードに於いては、極めて保持容量の小さなカラム1を用いることが好ましく、分離基材が膜状である、いわゆるメンブレンクロマトグラフ、あるいは一体化分離基材であるモノリスカラムシステムを用いることができるが、通常の充填型カラムを用いても良いことはいうまでもない。
また、この検出法としては、カラム1に分析対象分子を一定量ロードしたときに非保持物質として溶出するか、あるいは保持されてしまうことを利用したネガティブデータを利用し、特定の構造を持つ分子を検出することに特化したカラムを用いることに特徴があり、特定分子に特化したプローブ分子2が固定化された複数のカラム1をマルチに使用することを特徴とする。
【0010】
プローブ分子2としては、DNA、RNAあるいはPNA(peptidenucleic acid)およびその断片、任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチド、抗原、抗体あるいはエピトープ、酵素、タンパク質あるいはその機能部位ポリペプチド鎖を用い、cDNAあるいは各種タンパクを検出することに使用出来るが、いわゆるアフィニティー法に属する検出プローブ及び対象物の組み合わせであれば、これら以外の組み合わせも使用できる。
【0011】
また、ここで言う分離材が膜状である、いわゆるメンブレンクロマトグラフの素材は、ガラス繊維不織布、ガラス繊維ろ紙などの無機素材、再生セルロースメンブレン、アセテートメンブレンなどであり、上記プローブ分子2を固定出来るものであれば形態・素材を問わず、あるいはプローブ分子2を固定した粒子を固定しても良い。これらのメンブレンカラムの場合、厚さは好ましくは0.1〜1mm程度であり、直径5mm程度で何らかの方法でカラムに保持されていればよい。
【0012】
一体化分離基材であるモノリスカラムシステムの場合、多孔質ガラス柱状体、ポリマー焼結体が使用でき、サイズは厚さ2〜5mm、直径2〜5mm程度が好ましく、特に厚さ3〜4mm、直径3〜4mmが好ましいが、当然これ以下の大きさであれ以上であれ使用できる。例えば、モノリスカラムの場合、厚さ4mm、直径4mmの一体の多孔質ガラス柱状体を用いるとき、これは周囲を合成樹脂製の筒状体ないしリング状体で囲み、それを筒状体のホルダーに入れてカラムを形成するが、前記の多孔質ガラス柱状体は内部がほぼ同一内径の連通孔を有しているため、液体クロマトグラフ法において極めて大きい分離段数を得ることができるものであり、優れている。このカラムは極めて小型でコストも僅かなため、多数個のカラムを組み合わせても全体のシステムのコストは安いものとなる。
カラム1は、1個ずつ独立したものを多数組み合わせても良いが集合し一体化したものでも良い。
【0013】
サンプルの導入検出法としては、(a)連続的に作動するサンプラー3と連動した切り替えバルブ4と切り替えられたラインに結合し、それぞれに異なった特異な結合反応を起こすプローブ分子2を固定した複数のカラム1に、同一のサンプルを同一量ずつ順次導入し、これを合流させた後に一個の検出器5に導入することにより、異なった複数のカラム1にサンプルを順次ロード、順次検出する方法、あるいは(b)同時に一定量ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラー(分配サンプラー)6と、それに結合された分岐ラインからそれぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子2を固定した複数のカラム1に、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラム1にサンプルを一斉検出する方法のいずれを採用しても良く、前者(a)はコストメリット、後者(b)は短時間検出という特徴を持つ。
【0014】
図2は、この分離基材11内部にプローブ分子を固定したものの概念図である。図2は、分離基材11として多孔質ガラスを用いた場合の例であり、多孔質ガラスは多数の均一な内径をもつ細孔14を有しており、細孔14の内面にプローブ分子2が固定されている。図3及び4は、これらのプローブ分子2の固定方法を示す図であるが、例えば、いわゆるcDNAとして知られているプローブ分子2を固定するときには、何らかのリンカー7を用い、分離基材11内部に固定すればよい。なお、このとき分離基材11はたくさんの単独分離基材11をまとめて、反応容器中で同時に結合反応させることができるので大変効率がよく、また、これらの分離基材11は同一の品質が保たれることから、抜き取り検査によりプローブの担持量など管理しやすい。
【0015】
同じく、いわゆるオリゴヌクレオチドをプローブ分子2として使用する場合は、例えばホスホアミダイト法として知られる手法を用いて、分離基材11内部に塩基配列を合成していけばよく、これもたくさんの単独分離基材をまとめて、反応容器中で同時に結合反応させることができるので大変効率がよく、また、これらの分離基材11は同一の品質が保たれることから、抜き取り検査によりプローブ2の担持量などを管理しやすいだけでなく、切り出し精製などの必要がなく、低コストで作製できる。また比較的大きな孔の中で合成するために、100塩基などある程度大きなオリゴヌクレオチドプローブも容易に作製することができる。なお、8は塩基ブロックである。図5はこれらの各種分離基材11をカラムに装着する工程を示した概念図であるが、機械的に組み合わせて大きな束にして配列させるが、どのプローブ分子を固定したカラムがどの位置にくるかが、明確化されなければならない。図5中、9はPTFE(ポリテトラフルオロエチレン)リング、10はホルダーである。
【0016】
(反応)
アフィニティー検出分析チップへのサンプルの反応は、図6に示すように順次カラム1にサンプルが導入されることによりおこる。この際、図7に示すようにサンプル12はカラム1内部を流れ、特異反応があればカラム分離基材11内部にある細孔14に保持される。この際流すサンプルに、吸収が無ければ、何らかの標識染料13により染色してもよく、場合によれば蛍光剤によりラベルしてもよい。
【0017】
(検出)
通常のクロマトグラフ分析においては、経時的なサンプルの溶出を検出することにより、検出対象物を特定する、あるいは溶離液の組成を変化させて、それに伴う溶出を検出することが検出の要点であった。その中で、これまでカラムに強く吸着されて溶出しない現象は、カラム劣化の視点でしか捉えられてこなかった。
しかしながら、本発明者は、アフィニティー条件下での検出に於いてはカラムに吸着されてしまう現象そのものが検出に役立つことに思い至った。即ち、反応したカラム1からはサンプル12が溶出しない、あるいは一定の保持挙動を示す。従って特定分子に対するアフィニティーカラムに於いては対象分子が特定される。またこの際、特定の分子に対する吸着現象は極めて短いカラムで検出可能である。もちろん、場合によっては、保持させた後、アフィニティー条件を解消し溶出する条件で溶出する分子を検出しても良く、カラムを再生して繰り返し使用することも可能である。
【0018】
(システム及び装置)
本発明のシステム及び装置は、以上述べた検出システムを実行する、サンプル12を、それぞれ特定のプローブ分子2を持ったカラム1に正確に導入し、検出データを管理するコンピューターを備えた検出システムと装置である。
【0019】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。ただし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものでない。
【0020】
実施例1
細孔の内径2ミクロン、全体の大きさが直径4mm、長さ4mmの多孔質ガラス製分離基材をアミノ化処理した後、グルタルアルデヒドをリンカーとして各種ライブラリーから得たcDNAを結合した。これをポリテトラフルオロエチレンフロンリングを用いてステンレス製ホルダーに固定したモノリスカラムを50個用意し、連続的に作動するサンプラーと連動した切り替えバルブと切り替えられたラインに結合した。
これに、蛍光標識を付けた対象cDNAを流した。特定のカラムから溶出しなかった。
【0021】
実施例2
フィラメント径5ミクロンのガラス繊維ろ紙を活性化させ、アミノ化処理した後、コハク酸をリンカーとしてホスホアミダイト法を用いて、各種の50塩基のオリゴヌクレオチドを合成した。これを10枚重ねた構造のホルダーに固定しメンブランカラムを100個用意し、同時に一定ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラーとそれに結合された分岐ラインに結合し、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定した複数のカラムに、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラムにサンプルを一斉ロード、一斉検出した。
【0022】
【発明の効果】
本発明によれば、フォトリソグラフィー設備等の特別な設備を要することなく、任意の構成を持つタンパク質もしくは任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドなどの反応性プローブ物質、すなわち、特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するだけではなく、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段であり、かつ無理なく高感度分析ができ、検出速度が大きい検出手段を容易に提供することができる。
【0023】
また、各種反応性物質を担持したカラムを準備しておけば、様々な種類の反応性物質プローブを固定化したアフィニティー検出分析システムを、必要なときに必要な組み合わせでより簡便に供給できる。本発明は、さらに低コストかつ安定性の高いアフィニティー検出分析システムを提供することができる。従って、各個人の必要に対応したDNAなどのアフィニティー検出分析システムの作製が可能となり、オーダーメイドの医療に貢献できる。
【0024】
また、より高感度かつサンプルに負担のない検出、すなわちサンプルの蛍光指示薬とのマッチング等が不要であったり、各種色素を同時に使用できることから、同時多種分析法が可能になったり、これまでのいわゆるDNAチップと異なり、タンパク検出など新しい領域の検出手段を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のマルチカラム・アフィニティー検出システムの全体イメージ像を示す説明図で、(a),(b)ともマルチカラムとサンプル導入部及び検出概念の説明図である。
【図2】本発明のアフィニティー検出システムの内部にプローブ分子が固定されたカラムの概念図である。
【図3】分離基材内部へのブローブ分子、cDNAの固定を示す概念図である。
【図4】分離基材内部へのブローブ分子、オリゴヌクレオチドの固定を示す概念図である。
【図5】分離基材のホルダーへの装着法の一例を示す概念説明図である。
【図6】アフィニティー検出システムへのサンプル導入の一例を示す概念図である。
【図7】システムを構成する単カラム中の分離基材へのサンプルのアフィニティー結合操作を説明する斜視図である。
【符号の説明】
1 カラム
2 プローブ分子
3 サンプラー
4 切り替えバルブ
5 検出器
6 分配サンプラー
7 リンカー
8 塩基ブロック
9 ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)リング
10A 上部ホルダー
10B 下部ホルダー
11 分離基材
11A モノリス型分離基材
12 サンプル
13 標識染料
14 細孔
Claims (1)
- 同時に一定量ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラーと、それに結合された分岐ラインに結合し、分離基材上に塩基配列を合成によって得られた、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定した、一体構造をしたモノリス型カラムからなるアフィニティーカラムの複数に、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラムにサンプルを一斉ロード、一斉検出することを特徴とするマルチカラム・アフィニティー検出システム。
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