SE468653B - Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi - Google Patents

Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi

Info

Publication number
SE468653B
SE468653B SE8700949A SE8700949A SE468653B SE 468653 B SE468653 B SE 468653B SE 8700949 A SE8700949 A SE 8700949A SE 8700949 A SE8700949 A SE 8700949A SE 468653 B SE468653 B SE 468653B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
ligand
kdiss
affinity
weak
binding
Prior art date
Application number
SE8700949A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8700949D0 (sv
SE8700949L (sv
Inventor
S Ohlson
Original Assignee
Perstorp Biolytica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perstorp Biolytica filed Critical Perstorp Biolytica
Priority to SE8700949A priority Critical patent/SE468653B/sv
Publication of SE8700949D0 publication Critical patent/SE8700949D0/sv
Priority to EP88850057A priority patent/EP0290406B1/en
Priority to DE88850057T priority patent/DE3882797T2/de
Priority to US07/160,579 priority patent/US4879247A/en
Priority to JP63051438A priority patent/JPS63249052A/ja
Publication of SE8700949L publication Critical patent/SE8700949L/sv
Publication of SE468653B publication Critical patent/SE468653B/sv

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity
    • B01J20/28078—Pore diameter
    • B01J20/28083—Pore diameter being in the range 2-50 nm, i.e. mesopores
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/3092—Packing of a container, e.g. packing a cartridge or column
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3251—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising at least two different types of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulphur
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

20 25 30 35 468 653 2 affinitetstekniken optimerades med avseende på framför allt hastighet och upplösning. Det visade sig emellertid vid jäm- förelse med andra typer av kromatografi som t.ex. hydrofob- eller jonbyteskromatografi, att effektiviteten hos HPLAC låg ungefär en tiopotens lägre än hos traditionell HPLC där man 1 kan generera 10 000 till 50 000 teoretiska bottnar per m medan HPLAC-tekniken uppvisar ca 100-2000 teoretiska bottnar per m.
Genom användningen av effektivare bärarmaterial, typ mindre partiklar, vid affinitetskromatografi, kan man öka presta- tionsförmågan till en nivå som bestäms av den molekylära interaktionen i sig mellan substansen och den komplementära liganden.
För att nå en ökad effektivitet, dvs. hög upplösning. med bibehållen eller till en viss del kvarvarande specificitet så krävs dels helt ny strategi vid valet av ligand, dels ökade kunskaper om separationssystemets utformning.
Andamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett isokratiskt affinitetskromatografiskt system kännetecknat av hög effektivitet och kort separationstid. Ändamålet uppnås enligt uppfinningen med det system som definieras 1 efter- följande patentkrav och som kommer att beskrivas närmare i det följande.
Beskrivning av uppfinningen Det är viktigt för förståelsen att i korthet beskriva kineti- ken för bindningen av substans (ligat) till ligand och dess påverkan på den kromatografiska retentionen; t.ex. uttryckt i kapacitetsfaktorn, k'. Antag följande förenklade förhållanden som gäller i de flesta fall: Substansen (S) binder reversi- belt, icke kovalent till den kovalent bundna liganden (L) på ytan av den stationära fasen.
S + L <---- SL (1) nu 10 15 20 25 30 35 3 468 653 kass = associationshastighetskonstanten kdiss = dissociationshastighetskonstanten, och SL = bunden substans på den stationära fasen Den termodynamiska dissociationskonstanten (K diss) ges av l Kdiss = :diss = KCToT ESI.) * Cs (2) ass SL där CTOT = konc. av aktiva ligander CSL = konc. av komplexet SL CS = konc. av fri substans Det antas vidare att inga sekundära jämvikter föreligger.
Dessutom antas att adsorptionsisotermen är linjär, vilket innebär att de kromatografiska egenskaperna är oberoende av substanskoncentrationen. Vi antar också att 1 denna modell är C C = C Tor' sL TOT' Kapacitetsfaktorn k' är korrelerad till jämvikten, hastighets- konstanterna och ligandkoncentrationen via ekvationen: TOT * k kdiss ToT _ diss C _ ass C k'-3 K (3) Resonemangen ovan är delvis hämtade från Chaiken (Anal.
Biochem. 97 (1979) l).
För att nå en rimlig retention kl = 0,2-50 och företrädesvis k' = 1-10 i sådana system som karakteriseras av svag inter- aktion mellan ligand och ligat behövs en hög ligandkoncentra- tion (se ekvation 3), något som normalt är fallet i t.ex. jonbytes- eller hydrofobkromatografi.
Bandbreddningen 1 en kromatografisk process bestäms av en rad faktorer såsom diffusionen av provet i den mobila och statio- nära fasen. Teorin för denna process har i detalj utretts av Horvath och Lin (J. Chromatogr., 149 (1978) 43) och diskuteras i korthet nedan. Den totala bandbreddningen (effektiviteten) för en substans uttryckt i Htot (höjden av en teoretisk botten) är: 10 15 20 25 30 35 468 ess _ 4 H = H tot H + H + axt diff int diff (4) disp + Hkinetisk De tre första termerna motsvarar de icke-kinetiska bidragen till bandbreddningen och representerar provets spridning i den mobila fasen Hdísp, vid matrisens yta Hext diff. och inuti matrisens porer Hínt diff. Dessa parametrar är en funktion av kromatografiska och strukturella betingelser såsom parti- kelstorlek, provets diffusivitet och packningsspecifikationer.
Man kan generellt säga att ökad effektivitet nås (minskad Htot) genom t.ex. användningen av mindre partiklar, hög diffusivitet hos prov och jämnare packning hos matrisen. Den fjärde termen, Hkinetisk, representerar bandbreddningen orsakad av association och dissociation av ligat från sin immobiliserade ligand. Man kan visa att Hkinetisk är propor- tionell mot den linjära flödeshastigheten i systemet och om- vänt proportionell mot associationshastighets- resp. dissocia- tionshastighetskonstanten. Det betyder att vid svag bindning (hög Kdiss resp. hög kdíss) minskar Hkinetísk, dvs. de icke-kinetiska bandbreddningseffekterna kommer att dominera den totala effektiviteten (fltot). Med andra ord ger affini- tetssystemet. karakteriserat av 'svaga' bindningar, möjlighet til maximal effektivitet (minimal Htot). I dessa fall be- stäms bandbreddningen av de icke-kinetiska inslagen.
Vid användning av affinitetskromatografiska tillämpningar ut- nyttjar man idag moderata till starka affiniteter mellan den immobiliserade liganden och de växelverkande substanserna.
Dissociationskonstanten (Kdiss) ligger normalt i omrâdet 1o'4-1o'15 M. Detta faktum leder oftast t111 att det kromatografiska förfarandet blir en adsorptions/desorptions- teknik. Med andra ord så är kapacitetsfaktorn k' mycket stor, se ekv. 3 och 1 många fall kan den vara upp till tiotusentals kolonnvolymer. När man utnyttjar dessa starka affiniteter i HPLAC, där små, ca 10 pm, rigida partiklar används för att minimera de icke-kinetiska effekterna. är effektiviteten t.ex. ' uttryckt i teoretiska bottental, i huvudsak avhängig av den tröga kinetiken mellan ligand och ligat. Den långsamma disso- 10 15 20 25 30 35 5 I 468 653 ciationen av ligat från sin immobiliserade ligand spelar här en huvudroll (dissociationshastighetskontanten, kdissx 1o'5-1o selfl). vid svaga affiniteter.
Kdiss > l0'3, är hastighetskonstanterna snabba och likartade, medan vid starka affiniteter blir framför allt dissociationen allt långsammare, dissociationshastighets- konstanten sjunker. I t.ex. jonbytes- eller hydrofob HPLC baserar sig interaktionen mellan den stationära fasen och substanserna oftast på svaga. icke kovalenta bindningar (cól0_2 > Kdiss > 0) med snabba dissociationshastigheter.
Naturens egen ”kommunikation” mellan olika molekylslag och celler baserar sig 1 mångt och mycket på svaga affiniteter.
Exempel på sådana molekylinteraktioner är t.ex. komplement- faktorn ClQ:s förmåga att differentiera mellan monomera immun- globuliner (svag bindning: Kdissfii 10-2-10-3 M) och immunkomplex (stark bindning: Kdissflz l0'6-lO'9 M). I det här fallet utnyttjas kooperativiteten där flera indivi- duellt svaga bindningar samverkar och tillsammans ger hög bindningsstyrka (hög aviditet). Ett annat exempel är cell-cell interaktioner där man på grund av hög yttäthet av i och för sig svaga bindningssäten (Kdissfë 10-1-10-2 M) kan få en tillräckligt stor bindningsstyrka mellan cellslagen.
Enligt uppfinningen åstadkommes ett affinitetskromatografiskt system där den immobiliserade ligandens växelverkan med andra substanser karakteriseras av låg affinitet (Kdiss > l0"3 H). Den önskvärda specificiteten uppås genom multipla svaga interaktioner med den stationära fasen som är tillräckligt många för att systemet kan skilja på molekyler utan intresse, dvs. sådana som är helt i avsaknad av bind- ningsförmåga till liganden och sådana som har affinitet. För att nå dessa resultat enligt uppfinningen bör bäraren vara beskaffad på ett sådant sätt (se nedan) som ger stor effekti- vitet i form av t.ex. en hög upplösningsförmåga. Det är också av vikt att bärarmaterialet är av sådan karaktär att det kan binda stora mängder aktiv ligand (>24l mM). Detta uppnås genom bl.a. lämpligt val av porositet hos bäraren och av milda immo- biliseringsbetingelser. 10 15 20 25 30 35 468 655 _ 6 Enligt uppfinningen skapas ett isokratiskt affinitetskromato- grafiskt system där de olika substanserna separeras baserade på sin retardation. Detta kan få betydelse för preparativ affinitetskromatografi där man ofta förlorar material pga användningen av olika kraftfulla elueringstekniker. Den immo- biliserade liganden kännetecknas därav att den är immobilise- rad pâ en mikropartikulär bärare av företrädesvis poröst mate- rial. Exempel på dylika material kan vara oorganiska material såsom glas och silika eller organiska såsom olika plaster eller polysackarider. Enligt uppfinningen bör matrisen vara mikropartikulär med storlekar upp till 25 um, företrädesvis 3-10 um. Porstorleken hos materialet kan vara upp till 1000 Å. företrädesvis 10-500 A.
Den immobiliserade aktiva liganden är inte begränsad till någon annan typ av ligand, annat än att den skall ha de ovan beskrivna egenskaperna. Exempel pâ sådana ligander kan vara antikroppar eller fragment därav. antigener eller fragment därav, kolhydrater, enzymer med sina substrat och inhibitorer och receptorinteragerande substanser.
De ligander som tidigare har studerats i affinitetskromatogra- fin har typiskt kännetecknats av hög affinitet i sin bindning till ligat. Ligander som kan användas i uppfinningen har tidigare varit svårtillgängliga. men med uppkomsten av den s.k. hybridomteknologin för framställning av monoklonala antikroppar (Köhler och Milstein, Nature, 256 (1975) 495) kan idag affinitetsligander med förutbestämd låg affinitet fram- ställas reproducerbart och i stora kvantiteter. Vi har nu i praktiken fått det redskap som behövs för att realisera upp- finningen.
Den immobiliseringsteknologi som tillämpas i uppfinningen är av sådan karaktär att den effektivt binder liganden kovalent och med största möjliga bibehâllna funktion. Beträffande alternativa kopplingsmetoder för immobilisering av liganden hänvisas till Methods in Enzymology vol. XLIV. 1976. Exempel på sådana metoder kan vara koppling av ligander till iso- W) 10 15 20 25 30 35r 7 468 653 cyanat-, isotiocyanat-, merkapto-. epoxi-, aldehyd, tosyl-, karbonyldiimidazol- och bromcyan-aktiverad matris samt bind- ning till aktiverade syra- och estergrupper på den stationära fasen.
Användningen av det affinitetskromatografiska systemet enligt uppfinningen är inte begränsad till tillämpningar där affini- tetsseparationen användes isolerad utan kombinationer med andra typer av kromatografi är möjliga, s.k. multidimensionel- la kromatografitekniker.
I det följande kommer uppfinningen att beskrivas med hjälp av ett utföringsexempel där immobiliserade monoklonala anti- kroppar används för separation av kolhydratantigener. a) Framställning av monoklonal antikropp kovalent immobilise- rad på mikropartikulär kiselgel: Den monoklonala antikroppen som studeras i det här exemplet är en mus IgG2a som är riktad mot en specifik kolhydratdetermi- nant. Antikroppen är selekterad på så sätt att den visar en 'svag' affinitet mot sin epitop (antigendeterminant). Beroende på de fysikaliska förhållandena (pH, temperatur etc.) varierar den svaga bindningen (Kdissëu l0'3-l0'l H). Antikroppen är framdragen i mus (ascites) och är renad 1 flera steg (inkl. ammoniumsulfatutfällning och protein A-kromatografi). Renhets- graden uppskattas till >95 % (elektrofores) med en kvarvarande antigenspecifik aktivitet av >9O %.
En 10 cm x 5 mm I.D. Selectißpher-10 Aktiverad Tresylkolonn (Perstorp Biolytica, Lund, Sverige) tvättades med 40 ml H 0 och 40 ml 0,2 M NaH2PO4, 0,5 M NaCl pH 7,5 (kopplings- buffert) vid ett flöde av 1,0 ml/min. Immobiliseringen gjordes i en Shimadzu LC 4 HPLC-maskin (Japan) utrustad med UV-detek- tor. En lösning om 60 ml monoklonal mus IgG2a med 2 mg/ml i kopplingsbuffert innehållande 0,1 mg/ml kolhydratantigen för att förhindra inbindning till antikroppens antigenbindande säte pumpades genom kolonnen vid l ml/min. Kolonnen tvättades 2 10 15 20 25 :30 35 468 653, 8 sedan med 40 ml kopplingsbuffert och med 60 ml 0.2 H tris-HCl, pH 8 med 1 ml/min. Skyddande kolhydratantigen eluerades ut med 100 ml 0,1 M citrat pH 3.0 vid l ml/min. Alla förfaranden ut- fördes vid rumstemperatur, 20-22°C. En referenskolonn utan monoklonalt mus IgG2a framställdes på analogt sätt enligt ovan.
Mängden immobiliserad mus IgG2a uppskattades till 95 mg/g silika (torr). Den immobiliserade antikroppen var fullt aktiv i sin bindning till sitt kolhydratantigen, vilket innebar att koncentrationen aktivt immobiliserad ligand var ca 0,8 x 10-3 M (tvâ kolhydratantigener antages binda varje antikropp). b) Kromatografi med monoklonal antikropp-silika: Ovan beskrivna kolonner användes i en Varian LC 5500 (USA) med RI/UV detektor. All kromatografi utfördes vid rumstemperatur, 20-22°C, med ett normalt tryck av 30 ATM vid l ml/min och injektionsvolymer om 10 ul. Som rörlig fas användes 0.1 M NaH2P04 pH 7.5.
Ett flertal olika kolhydratantigener med olika affiniteter studerades i det kromatografiska systemet. Dessa kolhydratan- tigener retarderades av kolonnen och gav k'=0,3-0,8. De er- hållna retardationerna motsvarade ett Kdiss på l0'2- -l0'3 H. Analystiden var <5 min. Kolonnens effektivitet för dessa antigener uppskattades till ca 104 bottnar per m eller alternativt till 0,1 mm som är höjden av en teoretisk botten.
Slutsatsen är att dessa affinitetssystem som beskrivs i exemp- let ovan är högpresterande uttryckt i upplösningsförmâga och hastighet. Resultatet skall jämföras med traditionell affini- tetskromatografi där man arbetar med bottental om ca 102- -103 bottnar/m.
Industriell användbarhet Användningen av ett högpresterande affinitetskromatografiskt system (HPLAC) kännetecknat av svaga interaktioner med inbyggd 9 468 653 önskad selektivitet kan komma att revolutionera de nuvarande kromatografiska teknikerna. Tillämpningsomràdet för separation i vid bemärkelse kommer att vidgas avsevärt. Uppfinningens användbarhet omfattar härvid såväl analytiska som preparativa applikationer för exempelvis diagnostik och karakterisering av molekylinteraktioner men också skonsam och snabb isolering av t.ex. läkemedelssubstanser och diagnostikareagens från olika utgångsmedier som fermentationslösningar, syntesmedier och blodvätskor.

Claims (1)

10 15 20 25 30 35 468 655 _ m Patentkrav
1. Adsorbent för separation av substanser med isokratisk affinitetskromatografi, varvid ligander av antikroppar eller fragment därav, antigener eller fragment därav, kolhydrater, enzymer med substrat och inhibitorer, receptorintegrerande substanser etc, kopplas till en stationär mikropartikulär bärare av oorganiskt material såsom glas eller silica eller organiskt material såsom olika polymerer med i och för sig kända metoder med isocyanat, isotiocyanat, merkapto, epoxi, aldehyd, tosyl, tresyl, karbonyldiimidazol och bromcyan- aktiverad matris samt bindning till aktiverade syra- och estergrupper på den stationära fasen, k ä n n e t e c k - n a d av identiskt lika ligander för åstadkommande av en jämn, svag och likformig bindningsstyrka mellan ligat och ligand med en termodynamisk dissociationskonstant 3 Kdiss > omkring 10- , där K = kdiss =
SE8700949A 1987-03-06 1987-03-06 Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi SE468653B (sv)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8700949A SE468653B (sv) 1987-03-06 1987-03-06 Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi
EP88850057A EP0290406B1 (en) 1987-03-06 1988-02-19 Low affinity adsorbent for affinity chromatography
DE88850057T DE3882797T2 (de) 1987-03-06 1988-02-19 Schwach affinitives Adsorbens für Affinitätschromatographie.
US07/160,579 US4879247A (en) 1987-03-06 1988-02-26 Method and apparatus for isocratic affinity chromatography
JP63051438A JPS63249052A (ja) 1987-03-06 1988-03-04 親和クロマトグラフイ用吸着材

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8700949A SE468653B (sv) 1987-03-06 1987-03-06 Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE8700949D0 SE8700949D0 (sv) 1987-03-06
SE8700949L SE8700949L (sv) 1988-09-07
SE468653B true SE468653B (sv) 1993-02-22

Family

ID=20367781

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8700949A SE468653B (sv) 1987-03-06 1987-03-06 Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4879247A (sv)
EP (1) EP0290406B1 (sv)
JP (1) JPS63249052A (sv)
DE (1) DE3882797T2 (sv)
SE (1) SE468653B (sv)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534620A (en) * 1987-09-30 1996-07-09 Beckman Instruments, Inc. Method of heterogenous purification using a bidentate conjugate
GB8822180D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Glaverbel Separation of product of biological process from fluid medium
DE3900272A1 (de) * 1989-01-07 1990-07-12 Mueller Schulte Detlef Dr Synthetisches polymeres traegermaterial fuer chromatographische trennverfahren, verfahren zu seiner herstellung und verwendung
GB8928501D0 (en) * 1989-12-18 1990-02-21 Unilever Plc Reagents
SE468238B (sv) * 1990-02-28 1992-11-30 Sten Ohlson Laekemedel med svag affinitet
US5290926A (en) * 1990-09-14 1994-03-01 Ciba-Geigy Corporation Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase
GB9310468D0 (en) * 1993-05-20 1993-07-07 Oxford Glycosystems Ltd Sugar complexes
US5491096A (en) * 1993-12-27 1996-02-13 Eli Lilly And Company Antigen detection with affinity chromatography and parallel processing a control
AU2781995A (en) * 1994-06-24 1996-01-19 Universite De Montreal Selective removal of volatile substances injected into a chromatographic packing filled column
DE69627333T2 (de) 1995-06-26 2004-02-12 PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham Automatisierte, kontinuierliche mehrdimensionale hochgeschwindigkeitsmolekularselektion und -analyse
US6131440A (en) 1996-10-15 2000-10-17 Universite De Montreal Selective removal of volatile substances injected into a chromatographic packing filled column
AU2358101A (en) * 1999-11-20 2001-06-04 Scinu Tec Gmbh Method for separating cells and biomolecules using counter-current chromatography
ES2557942T3 (es) * 2005-10-27 2016-01-29 Transientic Interactions Ab Método de examen de una diana biológica para determinar interacciones débiles usando cromatografía de afinidad débil
US8029743B2 (en) * 2007-09-19 2011-10-04 General Electric Company Microfluidic device with vertical injection aperture
US20090166201A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-02 General Electric Company Injection method for microfluidic chips
US20090166202A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-02 General Electric Company Injection method for microfluidic chips
US7740747B2 (en) * 2007-12-28 2010-06-22 General Electric Company Injection method for microfluidic chips
US7740748B2 (en) * 2008-10-27 2010-06-22 General Electric Company Electrophoresis system and method
US7927476B2 (en) * 2008-12-22 2011-04-19 General Electric Company Injection method for microfluidic chips
EP3042192A4 (en) 2013-09-04 2017-04-26 Sten Ohlson Weak affinity chromatography
CN109946399A (zh) * 2019-03-29 2019-06-28 李雪明 一种基于亲和色谱测定解离速率常数的方法及测定系统

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU558931B2 (en) * 1981-02-26 1987-02-12 Unilever Plc A process and apparatus for the recovery of immunoglobulins
CA1209907A (en) * 1982-04-12 1986-08-19 Richard M. Bartholomew Method of affinity purification employing monoclonal antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
DE3882797D1 (en) 1993-09-09
SE8700949D0 (sv) 1987-03-06
SE8700949L (sv) 1988-09-07
US4879247A (en) 1989-11-07
JPS63249052A (ja) 1988-10-17
EP0290406A1 (en) 1988-11-09
DE3882797T2 (de) 1994-03-10
EP0290406B1 (en) 1993-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE468653B (sv) Adsorbent foer isokratisk affinitetskromatografi
Rodriguez et al. Affinity chromatography: A review of trends and developments over the past 50 years
Kumar et al. Affinity fractionation of lymphocytes using a monolithic cryogel
Ohlson et al. Novel approach to affinity chromatography using “weak” monoclonal antibodies
Mallik et al. Affinity monolith chromatography
US6610630B2 (en) Chromatography adsorbents utilizing mercapto heterocyclic ligands
Gunasena et al. Organic monoliths for hydrophilic interaction electrochromatography/chromatography and immunoaffinity chromatography
Chu et al. Application of click chemistry on preparation of separation materials for liquid chromatography
Schiel et al. Applications of silica supports in affinity chromatography
Dainiak et al. Chromatography of living cells using supermacroporous hydrogels, cryogels
CN102811805A (zh) 结合蛋白质和肽的特异性吸附剂及使用所述吸附剂的分离方法
Hage et al. Affinity chromatography: a historical perspective
HU196915B (en) Method and apparatus for separating one or more component being in solution by chromatography
JPH06510600A (ja) 痕跡量混入物の検出方法及び装置
Jadaun et al. HPLC for Peptides and Proteins: Principles, Methods and Applications.
Hedhammar et al. Chromatographic methods for protein purification
Gustavsson et al. Superporous agarose as an affinity chromatography support
Akkaya et al. Concanavalin A immobilized magnetic poly (glycidyl methacrylate) beads for antibody purification
Wan Mixed-mode chromatography: principles, methods, and applications
GB2221466A (en) Biologically reactive particles with biological, therapeutic and chromatographic applications
Pfaunmiller et al. Affinity chromatography
Acikara et al. Affinity chromatography and importance in drug discovery
KR910009283A (ko) 백일해 독소 및 또는 사상혈구 응집소 항원의 정제 방법(Process)
Schisla et al. Hollow fiber array affinity chromatography
Mattheus et al. Chitosan-alginate affinity microcapsules for isolation of bovine serum albumin

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 8700949-4

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8700949-4

Format of ref document f/p: F