JPS63249052A - 親和クロマトグラフイ用吸着材 - Google Patents

親和クロマトグラフイ用吸着材

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JPS63249052A
JPS63249052A JP63051438A JP5143888A JPS63249052A JP S63249052 A JPS63249052 A JP S63249052A JP 63051438 A JP63051438 A JP 63051438A JP 5143888 A JP5143888 A JP 5143888A JP S63249052 A JPS63249052 A JP S63249052A
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adsorbent
adsorbent according
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PERUSUTORUPU BAIORICHIKA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 親和クロマトグラフィは、分離（連結）されるべき物質
を、活性状態にある間に固定固体相に結合される相補的
物質（リガンド）と特異的にそして可塑的に相互作用さ
せることによって分離する方法である。実際には分離さ
れるべき物質を含有する移動性液体相が結合リガンドを
有する固体相を通過せしめられる、これによって分離は
固定相上に所望物質が特異的に吸着されることによって
生起する、一方他の種類の分子は通過する。所望の物質
は最後に種々の化学的方法及び物理的方法によって溶離
される。この方法で一段工程で実際の物質を何倍も（１
０−１００倍）精製することができる。
親和クロマトグラフィの最初の応用の一つは不溶性澱粉
上でのα−アミラーゼの精製と開運せしめられた［シタ
ルケンシュタインの論文。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、、　２４巻、（１９１０年）２１
０頁］。しかしながら１９６０年台の終りまでは、親和
クロマトグラフィは、活性化ゲルのアクセン合成［アク
セン等のネイチャー２１４巻（１９６７年）１３０２頁
〕及び結合リガント及び可逆性の所望物質の間の相互作
用についてのクアトレカサスの研究［Ｊ　、　Ｂｉｏ１
、Ｃｈｅｍ、　２４５巻（１９７０年）３０５９頁】と
の関連における分離法として確立されなかった。
これらの開発と平行して、伝統的な液体クロマトグラフ
ィが急速な発展をした。極度に小さい大きさの粒子（約
１０ＬＬｍ）の利用が、分離能力の著しい改良をもたら
し、同時に分析時間を極度に短縮させた。しばしば圧力
降下な生せしめるこの方法は高性能液体クロマトグラフ
ィ（）ＩＰＬｃ）と命名された。
１９７０年台の後半にＨＰＬＣへの親和クロマトグラフ
ィの導入〔オルセン等、ＦＥＤＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ９３
巻（１９７８年）５頁］、高性能液体クロマトグラフィ
　（ＨＰＬＡＣ）は、主として速度及び溶解に関して親
和法の最適化を示した。しかしながら例えば疎水性又は
イオン交換クロマトグラフィの如き他の種類のクロマト
グラフィとの比較において、１（ＰＬＡＣの効率はＨＰ
ＬＡＣ法が１ｍについて約１００〜２０００理論段を提
供するが、１ｍについて１００００〜５００００理論段
の発生を可能にする伝統的な）ＩＰＬＣの効率よりも約
１０倍も低かった。小さい大きさの粒子の如き親和クロ
マトグラフィにおけるより有効なキャリヤー材料の使用
が、物質と相補的リガンドの間分子相互作用によって決
るレベルにまで性能を増大させることができた。
特異性を完全に保持又は部分的に残しながら、効率、即
ち高溶解度を最適にするため、分離装置の設計について
のより良い理解のみならずリガンドの選択に対して完全
に新規な手段が要求されている。
本発明の目的は高効率及び短い分離時間によって区別さ
れるイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　）親和ク
ロマトグラ法を達成することにある。本発明によればこ
の目的は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲に規定し
た方法によって達成される。
理解を容易にするため、リガンドに物質（リゲート）を
結合させるための理論及び例えば利用率（ｃａｐａｃｉ
ｔｙ　ｆａｃｔｏｒ　）　ｋ　’で表わしたクロマトグ
ラフィ保持率についてのその影響を簡単に説明する。殆
んどの場合広く行われる下記の簡略化した条件を想定す
る：物質＜Ｓ）は固定相の表面上に共有的に結合したリ
ガンド（Ｌ）に可逆的に及び非共有的に結合する。
に、１□＝会合速度定数 ｋｄｌｍｍ　＝解離速度定数、及び ＳＬ＝固定相上に結合した物質。
熱力学的解離（Ｋａｌ−）は次式で与えられる：式中Ｃ
ｔｏＴ＝活性リガンドの濃度 Ｃｓ＋、　＝　Ｓ　Ｌ錯体の濃度 Ｃｇ＝遊離物質の濃度 更に二次平衡はないものとする。また吸着等温式は線状
であると仮定する、これはクロマトグラフィツク性質が
物質濃度に無関係であることを意味する。更にこの性能
において、 ＣＴ６？　　　Ｃ１Ｌ　　＝　Ｃｔｏｔと仮定する。
利用率に′は、式 によりリガンドの濃度及び速度常数、平衡に相関する。
上述した推論の一部はチャイケン（Ａｎａ　ｌ　。
Ｂｉｏｃｈｅｎｒ、　９７巻（１９７９年）１頁〕から
誘導された。
リガンドとりゲートの間の弱い相互作用によって特徴付
けられる系中の合理的な保持率に＋＝０．２〜５０、好
ましくはに′＝１〜ｌＯに達するため、通常例えばイオ
ン交換又は疎水性クロマトグラフィにおける場合、高リ
ガンド濃度（式３参照）が要求されるであろう。
クロマトグラフ法におけるバンド拡大は移動相及び固定
相における資料の拡散の如き多くの要因によって決る。
この方法の理論は、ホルバト及びリンによって完全に研
究された（　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。
１４９巻（１９７８年）４３頁参照〕、以下にこれを簡
単に述べる。
Ｈｌ。ｔ　（理論段の高さ）で表わされる物質の全（４
）Ｈｔ、、＝　Ｈａ□、＋Ｈ０□ｄ＋ｉｆ　　＋ＨＩｒ
＋□Ｉｆｔ　＋ＨｋＩ７．１１１始めの３項はバンド拡
大への非力学的寄与に相当し、マトリクス面Ｈ＊ｘｔａ
Ｉｔｔで及びマトリックス孔Ｈ１□６□□内での移動相
Ｈ０゜中の資料の展開を表わす。これらのパラメーター
は粒度、資料拡散性及び充填特異性の如きクロマトグラ
フィ及び構造条件の作用を構成する。一般的に言えばよ
り小さい粒子の使用は、資料中における高拡散性及びよ
り大なるマトリックス充填さえも増大した効率（低下し
たＨｔ、、ｔ）に寄与するファクターである。第４項Ｈ
ｋｉｎｅｔｉｃは不動化されたリガンドからのりゲート
の会合及び解離によって生ぜしめられるバンド拡大を表
わす。Ｋ　ｋｉｎｅｔｉｃは系中の線状流速に比例し、
会合速度及び解離速度の定数に反比例する。これは弱い
結合（それぞれ高Ｋ　ｄｉｍｓ及び高ｋｄｒｍｓ）が減
少したＨ　ｋｌｎｌｔｌｅを生ぜしめる、即ち非力学的
バンド拡大効果が全効率（Ｈｔ、ｔ）を支配するであろ
う。換言すれば、弱い結合によって特徴付けられる親和
系は最高効率（最小Ｈｔ、、）を可能にするであろう。
これらの場合バンド拡大は非力学的素因によって決る。
今日の親和クロマトグラフィ応用においては、不動化さ
れたリガンドと相互作用性物質の間の中程度から強力親
和度まで利用されている。解離定数（Ｋｄｉ、、）は通
常１０−’　〜１０−”　Ｍ（７）範囲内にある。殆ん
どの場合この状況は吸着／脱着性となるクロマトグラフ
ィ法をもたらす。換言すれば、利用率に′は極度に大で
あり（式３参照）、シばしばカラム容量の１万倍の量で
ありうる。非力学的効果を最小にするため小さい約１０
μｍの剛性粒子を使用するＩ（ＰＬＡＣにおけるかかる
強力な親和力を使用すると、効率は主としてリガンド及
びリゲートの間の不活性動力学に依存する例えば理論段
数で表わされる。不動化されたリガンドからのりゲート
の遅い解離はここで主導的役割を果す（解離速度定数、
ｋ　＋１１１１−１０−’〜１０５ｅｋ−’　）。弱い
親和力ｋｄｌ□＞１０−’に対しては速度定数は速く等
しい、一方強力親和力に対しては特に解離速度は徐々に
遅くなり、解離速度は減速する。
例えばイオン交換又は疎水性１（ＰＬＯにおいては、固
定相と物質の間の相互作用は、一般に高解離速度を有す
る弱い非共有結合（夕１０−”＞　ｋ　ａｓ−＞　０）
を基本にしている。
多くの点で、細胞及び分子の異なる種類間の自然のコミ
ュニケーション（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　）は弱
い親和力に基づいている。かかる分子相互作用の例とし
ては、単量体免疫グロブリン（弱い結合＝ｋａ１−”　
１０−”〜１０−’Ｍ　）及び免疫錯体（強力結合：　
ｋ　ａｌ−ｚｌ　Ｏ−６〜１０−’Ｍ　）　（７）間に
差をつけるための相補的要因Ｃ１０の能力を挙げること
ができる。この場合、高結合強度（高結合活性）を−緒
になって生ぜしめる幾つかの個々には弱い結合間の反応
を含むの利点をとる。別に例には細胞−細胞相互作用が
あり、これによって弱い結合部位自体の高表面密度（ｋ
　ａ＋ｍ５＝１０−”〜１０−”Ｍ）が各種細胞間で充
分に高度の結合強度を与えることができる。
本発明によれば、不動化されたリガンドと他の物質の間
の相互作用が低親力（ｋ　ｍｓ−＞　１０−’Ｍ）を特
徴とする親和クロマトグラフィ系を達成する。目的とす
る特異性は、固定相との多重弱相互作用の数が、この系
を、関心のない分子を区別すること、即ちリガンドに全
く結合できないものと親和力を有するものとの間を区別
することを可能にするに充分な大きさであることで得ら
れる。所望の結果をつるため、キャリヤーの性質は例え
ば高度の拡散性の形で高効率を提供するよう（後述する
）なものであるべきである。又キャリヤー材料の種類が
それを大容量の活性リガンド（〉ζ１ｍＭ）に結合する
ことができることが必須であり、この要件は適切なキャ
リヤー多孔度を選択し、強すぎない不動化条件を与える
ことによって合致せしめられる。
本発明によれば、異なる物質を、それらの遅延に基いて
分離されるようなアイソクラチック親和クロマドグライ
系が提供される。これには種々の強度の溶離法を利用す
ることによる何倍もの材料損失を含む分取り親和クロマ
トグラフィにおいて重大な関心のものである。不動化さ
れたリガンドは、例えばガラスもしくはシリカの如き無
機材料、又は各種のプラスチックもしくはポリサッカラ
イドの如き有機材料であることができる好ましくは多孔
性材料の微細粒子キャリヤー上で不動化されることを特
徴としている。本発明によれば、マトリックスは２５μ
ｍ以下、好ましくは３〜１０μｍの粒度な有する微細粒
子であるべきである。
材料は１０００Ａ以下、好ましくは１０〜５００Ａの孔
の大きさを有することができる。
不動化される活性リガンドは上述した性質について要件
を越えた特種なリガンドに限定されない、かかるリガン
ドの例には抗体又はそのフラグメント、抗原もしくはそ
のフラグメント、炭水化物、基質及び阻害剤を有する酵
素及び受用体相互作用性物質がある。
親和クロマトグラフィについて従来研究されたリガンド
は、リゲートに結合したとき代表的にはそれらの高親和
性を特徴としている。過去において、本発明で使用する
のに好適なリガンドを得ることは困難であった、しかし
単クローン性抗体の製造のためのいわゆる雑種細胞の開
発と共に（ケーラー及びミルシュタイン、ネイチャー２
５６巻（１９７５年）４９５頁〕、予め測定された低親
和力を有する親和性リガンドが今日再現性をもって大量
に入手できる。実際に本発明を実施するに必要な装置は
現在入手できる。
本発明により使用する不動法は、同時に最良の機能を保
持しながら、共有的に効率的にリガンドを結合する特長
を有する。リガンドを不動化するためカップリングする
別の方法についてはメソッズ・イン・エンザイモロジイ
ＸＬＩＶ巻１９７６年に記載された方法を参照できる。
例えばリガンドのイソシアネート−、インチオシネート
−、メルカプト−、エポキシ−、アルデヒド−、トシル
−、カルボニルジイミダゾール−及びブロモシアン−活
性化マトリックへの結合、及び固定相上の活性化酸及び
エステル基への結合をする方法を挙げることができる。
本発明による親和クロマトグラフ法の利用は、独占的に
親和分離を含む用途に限定されず、他の種類のクロマト
グラフィとの組合せ、いわゆる多次元クロマトグラフィ
法も可能である。
本発明を実施例によって以下に説明する、この例におい
ては炭水化物抗原の分離のために不動化された単クロー
ン性抗体を使用した。
実施例 （ａ）微細粒子シリカゲル上で共有的に不動化された単
クローン性抗体の製造： 本実施例で研究した単クローン性抗体は特殊炭水化物決
定因子に対し指向するマウスＩｇＧ２ａである。抗体は
そのエピトープ（抗原決定基）に対する弱親和性を示す
ように選択する。弱い結合（Ｋ　ａ＋−−”　１０−’
〜１０−’Ｍ　）は物理的条件（ｐｉ（、温度等）によ
って変化するであろう。抗体はマウス（腹水）からとり
、数段階で精製する（硫酸アンモニウム沈澱及び蛋白質
−へクロマトグラフィを含む）。精製度は〉９５％（電
気泳動）と評価され、残存抗原比活性は〉９０％°を有
する。
１０ｃｍＸ５ｃｍ内径のセレクトスヒアー（Ｓｅｌｅｃ
ｔｓｐｈｅｒｅ）　−１０活性化トレシル（Ｔｒｅｓｙ
ｌ）カラム（スエーデン国ルンドのＰｅｒｓｔｏｒｐ　
ＢｙａｌｙｔｉＣａ製）を４０ｍＩ２のＲ２０及び４０
ｎ＋Ｊ２の０．２ＭＮａＨｚＰＯ＜　、０．５　Ｍ　　
ＮａＣ１１ｐＨ７，５（カップリングバッファー）で１
．０ｍβ／分の流速で洗浄した。不動化はＵｖ検知器を
備えた島津ＬＣ４）ＩＰＬｃ機（日本）で生起させた。
抗体の高結合位に結合することを防ぐため炭水化物抗原
の０．１ｍｇ　／　ｎ＋４２を含有するカップリングバ
ッファー中２ｍｇ／ｒｎβを有する単クローン性マウス
ＩｇＧ２ａ　６０　ｍβの溶液を１ｍρ／分の速度でカ
ラム中に圧送した。次いでカラムを４０ｍβのカップリ
ングバッファー及び６０ｍＩ２の０．２Ｍトリス）ＩＣ
Ｉ　％ｐ）１８で、１　ｍ４／分で洗浄した。防御炭水
化物抗原を１ｍＩ２／分の速度で１００ｍｆｌの０．１
Ｍクエン酸塩、ｐ）１３．０で溶離した。全処理は室温
２０〜２２℃で行った。上述したのと同様にして単クロ
ーン性抗体を用いないで参考カラムを作った。
不動化されたマウスＩｇＧ２ａの容量はシリカ（乾燥）
の９５ｍｇ／ｇと評価された。不動化された抗体はその
炭水化物抗原に結合したとき完全に活性であった、これ
は活性不動化リガンドの濃度が約０．８　Ｘ　Ｉ　Ｏ−
’Ｍであったことを意味した（二つの炭化水素抗原が各
抗体を結合すると推定される）（ｂ）単クローン性抗体
シリカを用いたクロマトグラフィ： 上述したカラムをＲ１／ＵＶ検知機を有するパリアン（
Ｖａｒｉａｎ）　ＬＣ５５００（米国）中で使用した。
全クロマトグラフィは、室温２０〜２２℃、３゜ａｔｍ
の定圧力、１ｍＩ２７分の速度、及び１ｏ、１ｇの射出
容量で行なった。使用した可動相は０．１ＭのＮａＨｇ
ＰＯ４、ｐＨ７，５であった。
種々変化する親和性度を有する複数の異なる炭水化物抗
原をクロマトグラフ法で研究した。これらの炭水化物抗
原はカラムによって遅延され、ｋ’＝０．３〜０．８を
生ぜしめた。得られた遅延はＫｄ＋□１０−２〜１０−
’Ｍに相当した０分析時間はく５分であった。これらの
抗原は約１０４段／ｍと評価され、或いは理論段の高さ
を構成する０、１ｍｍと評価された。
到達した結論は、前記実施例に記載した親和性は拡散性
及び速度で表わした高性能を有することを示している。
結果は約１０−２〜１０−’段／ｍの段数で操作する従
来の親和クロマトグラフィに匹敵する。
工１皿月差 固有の所望選択性を有し、弱い相互作用を特徴とする高
性能親和クロマトグラフ法（ＨＰＬＡＣ）の応用は、今
日のクロマトグラフ法の向上をもたらすことができる。
最も広い意味における分離のための応用範囲は著しく拡
大される。この関係における本発明の有用性は、例えば
醗酵溶媒、合成媒体及び血清の如き種々の基体媒体から
の診断用試薬及び医薬物質の寛大及び迅速分離のみなら
ず例えば分子相互作用の特性化及び診断のための分析及
び分取応用を含む。
特許出願人　　ベルストルブ・バイオリチカ代　埋入　
安　　達　　光　　雄町 手続補正書（１） 昭和ム３年Ｚ月ダ日 一特許庁蟲　官小用邦夫、ぞ １、　事件ノ表示１１１−ｐｂ３ｊｌ：Ｐ’ｆ灯酵’Ｊ
　ｌ−／４１３Ｊ’　　！２・ｔ−鵡４）贅・ Ｉｔｔロアｏ−２）グラフィ）＠ら灸４青り３、補正を
する者 卿１めオ肴忙デｒオ噛入の１面 １１；イ↓４プ（：、　ンＬＬ悼ν）１１１１肘、ｇ４

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、抗体、抗原又はそれらのフラグメント、炭水化物、
    基質及び阻害剤を有する酵素、受溶体相互作用性物質等
    のリガンドを、イソシアネート、イソチオシアネート、
    メルカプト、エポキシ、アルデヒド、トレシル、カルボ
    ニルジイミダゾール及びプロムシアン活性化マトリック
    スを用いそれ自体既知の方法により、ガラス又はシリカ
    の如き無機材料または種々の重合体の如き有機材料の固
    定微細粒子キャリヤーに結合し、固定相上の活性化酸お
    よびエステルに結合させることからなる物質の分離のた
    めの吸着剤において、リガンドが、熱力学的解離定数 Ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ＞１０＾−＾３ 〔式中 Ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ＝ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ／ｋ＿ａ＿ｓ
    ＿ｓ＝［（Ｃ＿Ｔ＿Ｏ＿Ｔ−Ｃ＿Ｓ＿Ｌ）＊Ｃｓ］／Ｃ
    ＿Ｓ＿Ｌであり、 ｋ＿ａ＿ｓ＿ｓ＝会合速度定数 ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ＝解離速度定数 Ｃ＿Ｔ＿Ｏ＿Ｔ＝活性リガンドの濃度 Ｃ＿Ｓ＿Ｌ＝ＳＬ錯体の濃度 Ｃ＿Ｓ＝遊離物質の濃度 Ｓ＿Ｌ＝固定相に結合した物質 である〕を有するリガンド及びリゲートの間に弱くかつ
    均一な結合強度を達成させるため全く同じであることを
    特徴とする吸着剤。 ２、利用率 ｋ′＝Ｃ＿Ｔ＿Ｏ＿Ｔ／Ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ＝（Ｃ＿Ｔ
    ＿Ｏ＿Ｔ×ｋ＿ａ＿ｓ＿ｓ）／ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ（各
    記号は前述した通りである）で表わされ、０．２〜５０
    である請求項１記載の吸着剤。 ３、利用率ｋ′が１〜１０である請求項２記載の吸着剤
    。 ４、リガンドが単クローン性抗体またはそのフラグメン
    トである請求項１〜３の何れか一つに記載の吸着剤。 ５、熱力学的解離定数 Ｋ＿ｄ＿ｉ＿ｓ＿ｓ＞１０＾−＾３ を有するリガンド及びリゲート間の結合強度を有し、正
    確に同じリガンドのカップリングバッファー中の溶液を
    キャリヤー上で不動化することを特徴とする固体微細粒
    子キャリヤー及びそれに共有的に結合したリガンドを有
    する請求項１記載の吸着剤の製造法。 ６、物質を吸着剤によって遅延させ、試料溶液によって
    除々に溶離させることで分離のため熱力学的解離定数＞
    １０＾−＾３を有するリガンド及びリゲート間の結合強
    度を有する固体微細粒状キャリヤーに共有的に結合した
    同じリガンドを有する請求項１記載の吸着剤の応用。
JP63051438A 1987-03-06 1988-03-04 親和クロマトグラフイ用吸着材 Pending JPS63249052A (ja)

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SE8700949-4 1987-03-06

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