SE468238B - Laekemedel med svag affinitet - Google Patents

Description

15 20 25 '30 35 468 258 Svampar är växter utan klorofyll. De är vanligen multicellulära men är inte differentierade. De varierar i storlek frán encel- liga till stora multicellulära strukturer.

Uppfinningen skall beskrivas utförligt i samband med bakterier, virus och tumörceller men den har sin tillämpning lika väl pá andra mikroorganismer och i viss mån toxiner.

Varje bakterie, virus eller tumörcell har en yttre begränsnings- yta som är unik och utgör en viktig enhet för kommunikation och skydd mot omvärlden. Den yttre avgränsningen i form av en cell- vägg eller kapsidvägg har en komplicerad sammansättning av pro- teiner, lipider och kolhydrater, och mosaiken av molekyler bildar integrerade enheter med definierad funktion, exempelvis finns receptorer för olika interagerande molekyler, såsom hormo- ner och andra igenkänningsmolekyler för bindning till olika mál- celler.

Ytstrukturen identifierar också den biologiska enheten och vissa så kallade ytantigener kan leda till en immunologisk (humoral eller cellförmedlad) reaktion hos värden, som syftar till att eliminera den främmande och förstörande inkräktaren, ett virus, en tumörcell eller någon annan mikroorganism. Ett flertal olika mekanismer finns för eliminering såsom komplementaktivering, fa- gocytos genom makrofager och granulocyter, verkan av lymfokiner t.ex. interferoner och interleukiner, attacker av cytotoxiska T- celler och K-celler och direkt verkan av blockerande antikrop- par.

För att få fram effektiva behandlingsmodeller har man som en central utgångspunkt inom läkemedelsindustrin haft att på bästa '01 sätt utforma läkemedel som pà olika sätt intefererar med det pa- togena agensets interaktion med omgivningen eller alternativt yr hur läkemedlet kan binda till málstrukturen pá cell/kapsid ytan.

Detta skall då ske så specifikt som möjligt utan att påverka om- givningen, dvs värden negativt och störa hans egna reaktioner.

Ett bra exempel pà specificitet gentemot en värd är klassiska 10 15 207 25 '30 35 .Ib- Ch CO PJ CN CX) antibiotika som penicillin som specifikt förhindrar cellväggs- syntesen hos vissa typer av bakterier så att tillväxten av bakteriepopulationen effektivt hämmas utan att de biologiska aktiviteterna hos värden skadas.

Inom den moderna läkemedelsindustrin, speciellt den farmaceu- tiska bioteknikindustrin, som utnyttjar de senaste landvin- ningarna inom rekombinant DNA- och hybridom teknologi, framstäl- ler man specifikt interagerande substanser ofta av makromoleky- lär natur t.ex. monoklonala antikroppar. Dessa 'biologiska"lä- kemedel kännetecknas av en stark bindning till sitt mål där de växelverkande strukturerna reversibelt binder varandra under hög affinitet, bindningskonstanten Kass > 105 M'1. Man försöker också att med rationell läkemedelsdesign göra små analoger av de 'biologiska' läkemedlen med samma igenkänningsegenskaper som de ovan beskrivna.

Dessa 'hög-affinitets' läkemedel är emellertid behäftade med en rad allvarliga problem. Pá grund av sin konstruktion med hög bindningsstyrka till sitt mål binder de ofta till irrelevanta strukturer utanför målet. En viktig 'skydds'mekanism hos en del patogener och tumörformer är att deras ytstrukturer (ytanti- gener) frisläpps i signifikanta koncentrationer som ett slags avledningsmolekyler. Man vet sålunda att tumörbärare ofta har cirkulerande komplex av tumörantigen-antikropp och sådana komp- lex har visats kunna blockera den cytotoxiska effekten av såväl effektor T-celler som K-celler.

På grund av denna dimridå av avledningsmolekyler når inte 'hög- affinitets' läkemedlet den relevanta ytstrukturen hos patogen/ värd och man får inte någon terapeutisk effekt. I andra samman- hang kan uppgiften vara att differentiera mellan ett infek- terande agens eller tumörceller med hög ytantigentäthet och värdstrukturer med låg eller ringa förekomst av antigen, varvid man ånyo har en situation där 'högaffinitets' systemet har svårt att skilja mellan vän och fiende och behandlingseffekten blir otillräcklig. 10 15 20 25 “so 35 468 238 Uppfinningen avser ett nytt sätt att utforma läkemedel där man använder sig av molekylära strukturer som svagt växelverkar med sitt mål, och den beskrives utförligare nedan med flera exempel pà tänkbara användningsområden utan att dock vara begränsad till dessa.

För att förtydliga och förenkla det följande användes begreppet ligand för de molekylkonfigurationer som är immobiliserade på cell/kapsidytor hos patogen/tumörcell och begreppet ligat för med ligand interagerande lösliga alternativt bundna strukturele- ment pá cellytor hos en värd.

Uppfinningens syftemàl är att åstadkomma ett drogsystem, vars màlstyrningsmekanism kännetecknas av ett antal svagt växelver- kande sites, som med låg individuell affinitet växelverkar med sin target, sitt mål. Målet kan därvid vara ligandstrukturer av typen ytantigener pà virus och bakterier etc. alternativt tumör- celler eller ligatstrukturer hos värdorganismen. Med svag växel- verkan avses här bindningsstyrkor på Kass < approx 104 M'1. Till- räcklig specificitet mot målstrukturen uppnås genom samverkan av flera svagt växelverkande sites på drogsystemet som då till- sammans leder till en adekvat bindning av target. Med andra ord ástadkommes den avsedda specifika bindningen genom molekylär ko- operativitet som ger den nödvändiga aviditeten för en stark och specifik bindning av màlstrukturen. Om sålunda bindningsstyrkan hos de individuella igenkänningssiten på drogsystemet är Kass = 102 M'1, som i sig är alltför svaga för att åstadkomma en rele- vant bindning, kan man genom kooperativ bindning av t.ex. tre sites nà en aviditet av Kass = 105 M'1 som är tillfyllest för en stark och specifik förankring till målet.

På detta sätt kan man undvika många av de olika problem som kän- netecknar traditionella màlstyrningsenheter med starkt bindande monoklonala antikroppar. Exempel på problemställningar med tra- ditionell drug-targeting som med det nya 'svag'affinitets-kon- ceptet kan attackeras och bearbetas med ett helt ny infallsvin- kel är: fqx 10 15 20 25 30 35 _12...

OK Of ) I\J UI CI) Ligandstrukturer av typ antigener pà bakterier, virus och tumör- celler som kan förekomma i varierande koncentrationer och enbart skiljer sig kvantitativt fràn t.ex. värdceller. Följaktligen kan man få för hög specificitet hos hög-affinitetsdrogen som däri- genom missar målet och binder icke önskvärt till värden.

Utsläpp av cirkulerande ligand av typen antigener fràn invade- rande agens som kan inaktivera hög-affinitetsdrogen genom allt- för stark individuell bindning.

Vid låg substitution av ligand på t.ex. en cellyta kan en vanlig hög-affinitetsdrog av typ monoklonal antikropp med pákopplad cy- tostatika vara otillräcklig för att få avsedd effekt.

När man studerar den naturliga växelverkan som förekommer i bio- logiska system finner man att den till sin natur ofta är av svag karaktär. Man säkerställer därmed dynamiken i systemet och bio- logiska effekter kan vara direkt beroende av förändringar i om- givningen. Ett exempel pá detta är olika enzymers svaga växel- verkan med sina substrat och inhibitorer där enzymets aktivitet är direkt beroende av förändringar i koncentrationen av inter- agerande substanser.

Specificiteten vid igenkänning i biologiska system uppkommer ofta genom kooperativitet av sinsemellan svaga interaktioner som då tillsammans leder till önskad signal. Ett bra exempel är komplementaktiveringens igenkänningsmekanism. Komplementets upp- 'gift är att genom lysis oskadliggöra främmande celler av typ bakterier och tumörceller eller fragment därav. Den första komp- lementfaktorn; Clq har till uppgift att binda till dessa främ- mande cellytor eller fragment genom att känna igen aggregat el- ler sammankopplingar av antikroppar.Clq är ett stort protein med sex globulära subenheter som var och en för sig binder svagt (Kass = 103 M'1) till antikroppen.

En stark och specifik bindning av Clq till aggregat av antikrop- par t.ex. antikroppstäckta bakterier sker emellertid genom en samverkan av flera av bindningssiten pá Clq-molekylen. Det är 10 15 20 25 30 35 468 238 detta som är utmärkande för systemet att Clq kan differentiera mellan monomert och polymert immunoglobulin genom kooperativitet av svaga bindningar.

Ett annat exempel är den klassiska agglutineringsreaktionen där ofta Ig M (en pentamer med tio möjliga bindningsställen) med svag individuell bindning växelverkar specifikt så att flera bindningssites utnyttjas samtidigt.

Man ser liknande mekanismer vid cell-cell interaktioner t.ek. uppbyggnad av specifika vävnadstyper där multipla svaga bind- ningar ofta via speciella celladherensmolekyler utgör grunden för igenkänning och differentiering.

Det finns exemplifierat enligt ovan många naturliga system som arbetar enligt den princip som kännetecknar uppfinningen.

Ett omfattande material stöder således den bakom uppfinningen liggande teorin.

Principen att utnyttja svag affinitet för olika separationstek- niska ändamål har utnyttjas tidigare, Ohlson, svenska patentet 8700949-4, där man separerat och analyserat strukturellt lik- artade substanser med användning av svagt interagerande monoklo- nala antikroppar. Man har visat att dessa svaga bindningar, Kass = 102-104 M'1 kan användas i ett kromatografiskt system där man åstadkommer tillräcklig selektivitet och olikartade retentioner genom ett upprepat antal svaga men något olika interaktioner mellan den fasta fasen med immobiliserad växelverkande substans och omgivande ämnen.

Ett läkemedelssystem enligt uppfinnigen àstadkommes med ett an- tal svagt växelverkande sites, svagaffinitetssites, som màlstyr- ningsenheter och som indviduellt binder sin target dåligt men i samverkan åstadkommer den önskvärda specificiteten och därmed är förankringen till màlet fullbordad.

Dessa svagaffinitetssites är uppbundna till en bärare i ett '(3) 10 15 20 25 30 35 sådant antal och med en sådan konfiguration att man når optimal verkan i målet. Samverkan kan ske mellan minst 2 ofta 3-6 affi- nitetssites till att uppnå den önskade effekten. Som potentiella bärarstrukturer kan användas mikropartikulära bärare, makromo- lekyler och definierade làgmolekylära substanser. En samling av naturliga och konstgjorda partiklar och molekyler kan användas som mikropartikulära bärare. Lämpliga är kolloidala system med diametrar av storleksordningen 5-1000 nm. Materialet i bärarna kan vara t.ex. fosfolipider (liposomer), polysackarider såsom cellulosa, gelatin, polyakrylamid, proteiner såsom denaturerat albumin och hela cellulära strukturer såsom kroppsegna celler.

Lösliga makromolekyler kan också användas som effektiva bärare för làgaffinitetssites. Här finns en oerhört stor mångfald av varianter; plasmaproteiner såsom lipoproteiner, nukleinsyror så- som DNA, polysackarider såsom dextran, glykoproteiner och hel- och halvsyntetiska polymerer som polyetylenglykol och polyami- nosyror. Såsom ytterligare ett alternativ kan làgmolekylära sub- stanser användas som definierade peptid- och oligosackaridsek- venser samt organiska molekyler med bindningspunkter för svaga affinitetssites.

Ett lågaffinitetssite är enligt uppfinningen en definierad mole- kylär struktur som växelverkar svagt (se ovan) med sin target.

Dessa làgaffina strukturer kan utgöra allt från små strukturele- ment till stora komplicerade molekyler.

Användningen av monoklonala antikroppar är numera helt etablerad 'och används inom vitt skilda områden som 'imaging', diagnostika och terapiprodukter. Svaga monoklonala antikroppar kan enligt uppfinningen användas som låg affinitetssites. Dessutom kan an- tikroppen styckas upp i sina bestånddelar; Fab, tunga- och lätta kedjor och 'single-domain' enheter, som alla kan vara làgaffini- tets molekyler. Rekombinanta enkel-kedje antikroppar kan också vara av intresse i det här sammanhanget. Vidare kan korta pep- tidsekvenser med 5-50 aminosyrarester vara tänkbara kandidater där de i vissa fall efterliknar delar av de hypervariabla regio- nerna i den intakta antikroppen. 10 15 20 25 30 35 468 238 Till yttermera visso kan rekombinanta protein- och peptidmoleky- ler med väldefinierad hög-affinitets funktion försvagas genom genmanipulering t.ex. 'site-directed mutagenesis' till intres- santa lágaffina molekyler. ï Vidare kan lágmolekylära receptoranaloger t.ex. peptider vara e viktiga lágaffinitetsstrukturer som då intefererar och förhind- rar bindningen av t.ex. virus till sin värdcell.

På samma sätt kan korta kolhydratsekvenser med svag affinitet binda till sitt mål via lektiner pà cellytor etc.

Helsyntetiska ämnen som uppfyller villkoren för svag affinitet kan också användas som alternativ till de mer biologiska syste- men.

Extremt svaga bindningar, Kass < ca 1 M'1 hos de växelverkande 'siten' leder enbart till ospecifika effekter och utgör inga kandidater för den i uppfinningen beskrivna metodiken. Därmed kan t.ex. individuella jon- och hydrofoba grupper inte åstad- komma de effekter som är avsikten med uppfinningen. I vissa fall har dock önskad effekt erhållits med Kass = ca 0,5.

I bäraren kan slutligen, om nödvändigt, inkorporeras den ammuni- tion som behövs för att eliminera den främmande cellen/virus, exempelvis en rad olika cellgifter (toxiner), enzymer och ra- dioaktiva isotoper. I andra sammanhang t.ex. vid virusterapi kan en blockering av transporten till värdcellen vara tillräcklig för att få behandlingseffekt.

Den immobiliseringsteknologi som tillämpas enligt uppfinningen IJ är av sådan karaktär att den effektivt binder det aktuella ämnet - làgaffinitetsstrukturen eller verkanssubstansen - kovalent el- V) ler icke och med största möjliga bibehállna funktion. Olika kopplingsmetoder för immobilisering beskrives i Methods in Enzy- mology vol. XLIV, 1976, K.Mosbach, Academic Press, New York.

Vid utformningen av specifika droger måste man också ta hänsyn 10 15 20 25 30 35 468 238 till administrationssättet. Ett flertal olika sätt är möjliga subkutant och transdermalt. Det effek- tivaste sättet är ofta att utnyttja kroppens eget transportnät såsom intravenöst, oralt, nämligen det vaskulära. Om man skall nå en extra-vaskulär effekt mäste drogsystemet passera vissa biologiska barriärer. Det vas- kulära kapillärsystemet omges av flera hinder såsom endotelcel- ler, (RES) och makrofagsystemet som utgör en effektiv spärr för främmande basalmembran och inte minst det retikuloendoteliala- ämnen. Det beskrivna làg-affinitets drogsystemet enligt uppfin- ningen har beträffande administrationssättet samma möjligheter och begränsningar som ett mer traditionellt 'drug-delivery' sys- tem.

I det följande beskrives nâgra olika tillämpningsomráden för uppfinningen, men den är icke begränsad härtill.

AIDS är en mycket allvarlig immunbristsjukdom där det ännu inte finns nâgra effektiva behandlingsmetoder. Ett speciellt virus vanligen kallat HIV angriper och bryter ner kroppens immunför- svar, speciellt dess T-celler. Man har identifierat den molekyl (CD4) som utgör den T-cell receptor där HIV-viruset binder, in- nan det tränger in i cellen. En möjlig terapi kan vara att pá olika sätt förhindra viruset att nå sin värdcell genom att till- föra ett läkemedel som antingen binder till receptorn pà cell- ytan eller binder och neutraliserar viruset innan det når sitt mål.

-Forskaransträngningarna inom omrâdet har hittills varit koncent- rerade mot CD4 terapi där man injicerar löslig artificiell re- ceptor (CD4) som agerar som lockbete och 'suger upp' viruset in- nan det hinner attackera málcellen.

De preliminära resultaten tyder pà positiv effekt men halve- ringstiden för CD4 är mycket kort och det är svárt att upp- rätthàlla de koncentrationsnivàer som är nödvändiga för att för- hindra infektion. En möjlig väg är här att använda genterapi.

En ytterligare komplikation är att uppnå tillräcklig specifici- 10 15 20 25 30 35 10 268 tet hos drogen. HIV-viruset släpper loss en rad ämnen, däribland ytantigener som gp 120, som svarar för bindningen till CD4-re- ceptorn. Vid nedbrytningen av HIV-viruset kommer kroppens lymfa och vaskulära system att nå en hög belastning av fria virus an- 'U tigener som kan avsevärt försvåra behandlingen.

(S Genom att enligt uppfinningen exempelvis framställa små fragment av CD4, peptider eller liknande med definierad svag affinitet som på olika sätt genom lämplig bärarkonstruktion kan samverka och leda till en kooperativ specifik bindning till virusytan kan de allvarliga problemen med ospecificitet och snabb inaktivering som dagens teknologi brottas med undvikas. Rent generellt får man genom att fragmentera CD4 molekylen ofta ligat analoger som är svagt bindande och man ställs inför problemet hur dessa skall nyttjas.

I analogi med det ovanstående kan ligandanaloger eller monoklo- nala antikroppar eller fragment därav utgöra ett intressant al- ternativ som kännetecknas av svaga individuella bindningar där effektiv samverkan kan binda och blockera CD4-receptorn pá T- cell ytan.

Drogsystemet kan naturligtvis förses med den arsenal av verk- samma anti-virala substanser, som krävs för att få avsedd dest- ruktiv effekt på viruspopulationen.

Ett annat tillämpningområde för svagaffinitetstekniken är möj- ligheterna inom cancerterapi där man på olika sätt kan fram- ställa ligandanaloger eller andra igenkänningssubstanser såsom antikroppar eller fragment därav, likaledes karakteriserade av svag växelverkan till sin target. Genom samtidig verkan av många 'IW svaga sites uppnås en specifik och stark bindning av drogsyste- met till tumörcellen med efterföljande verkan av t.ex. olika cellgifter. För vissa tumörer som är behandlingsbara med immuno- logiska medel kan 'svagaffinitets'läkemedlen få betydelse medan andra tumörtyper har alltför dålig antigenitet för att nämnvärt kunna påverkas i sin tillväxt. 10 15 20 ll *P5 0\ O) RJ L~l CO Ytterligare ett omrâde som illustrerar uppfinningens potential är möjligheterna att utnyttja svagt bindande oligosackaridsek- venser för att styra droger till kolhydratbindande proteiner av typ lektiner i cellytor och på cellmembran. Svaga bindningsstäl- len kan här sättas samman i en polysackarid som binder effektivt till målet t.ex. bakteriespecifika lektiner. Man kan på så sätt förhindra bakteriers vidhäftning på olika värdcellytor eller al- ternativt attackera och förgöra de invaderande bakterierna med olika typer av gifter.

Användningen av 'svagaffinitets' interaktioner enligt den ovan beskrivna metodiken utgör ett nytt sätt att rationellt utforma läkemedel enligt mera biologiska principer.

Tekniken kan väntas få en stor och avgörande betydelse vid be- kämpning av infektionssjukdomar och vid vissa immunologiskt be- handlingsbara tumörformer. Om sålunda denna teknik kan leda till ett genombrott för AIDS-forskningens ansträngningar att finna botemedel kommer det att få en mycket betydande positiv effekt pá hela samhället. Svagaffinitetskonceptet enligt uppfinningen kan också väntas få viktiga tillämpningar inom andra verksam- hetsfält som t.ex. klassisk diagnostik och biosensorer.

Claims (7)

10 15 20 25 30 35 P a t e n t k r a v

1. Läkemedel, k ä n n e t e c k n a t av ett flertal på en bärare, företrädesvis kovalent, bundna, svaga affinitetssites i form av en partikel eller en molekyl, med den individuella svaga affiniteten för varje bindningssite liggande vid approximativt 1 < Kass < 104 M'1, för bindning och oskadliggörande av virus, bakterier, tumörceller eller andra sjukdomsalstrare genom multipel bindning.

2. Läkemedel enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t av att den multipla bindningen är samtidig.

3. Läkemedel enligt kravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att de svaga affinitetssitena utgöres av antikroppar eller fragment därav, rekombinanta enkelkedjiga antikroppar, korta peptid- eller sackaridsekvenser, helt syntetiska ämnen eller liknande.

4. Läkemedel enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t av att bäraren utgöres av mikropartiklar, före- trädesvis kolloidala system och/eller makromolekyler med diamet- rar i storleksordningen 5 - 1 000 nm.

5. Läkemedel enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t av att bäraren utgöres av fosfolipider, poly- sackarider, proteiner och/eller hela cellulära strukturer såsom kroppsegna celler.

6. Läkemedel enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att bäraren består av lösliga makromolekyler, såsom plasmaproteiner, nukleinsyror, hel- och halvsyntetiska polymerer, organiska mole- kyler med bindningspunkter för svaga affiniteter.

7. Läkemedel enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t av att i bäraren ingår cellgifter, enzymer eller radioaktiva isotoper, eller att bäraren består av sådana sub- stanser.