JP4498186B2

JP4498186B2 - 液体クロマトグラフ分析方法及び装置

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Publication number: JP4498186B2
Application number: JP2005085944A
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Inventors: 真野上; 伸也伊藤
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Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2010-07-07
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Description

本発明は、生化学分析等に用いられる液体クロマトグラフ分析方法及び装置に関する。

生体試料分析や臨床試料分析などの様々な生化学分析を含めた化学分析に広く用いられる分析装置として液体クロマトグラフ装置がある。この液体クロマトグラフ装置においては、分離カラムを用いて試料中の測定対象物の分離を行なうが、測定対象物以外にも様々な混合物を含む試料を分析する場合、試料を一旦カラムに吸着させた後に、測定対象物以外の塩などの不純物を洗浄する工程が必要である。

この不純物洗浄工程において、カラムに試料を導入した後、洗浄のための溶液を、所定時間導入して不純物を洗浄した後に、溶離液をカラムに導入し、溶離された測定対象物を分析装置に導入して分析を行う。

複雑な混合試料に対して、高い分離能力を発揮させるための技術が特許文献１に記載されている。この特許文献１記載の、液体クロマトグラフ分析装置は、個々に、移動相と分析カラムとを有する２以上の分析部と、複数の濃縮カラムとを有している。

特開２００３−２５４９５５号公報

上記特許文献１に記載の液体クロマトグラフ分析装置にあっては、高い分離能力を発揮することができる。

しかしながら、従来技術では、分離カラムに試料を導入した後、洗浄のための溶液を、予め定めた一定時間導入して行っていた。そのため、分離カラムに残存する塩などの不純物の洗浄が充分か否かに関わらず、その分離カラムを使用し、塩を含む試料が分析装置に導入されてしまう事態が発生する場合があるという問題点を本願発明者は見出した。

また、分離カラムに残存する塩の洗浄が充分であるにも関わらず、さらに洗浄のための溶液を流し続ける場合もあり、そのため、分析時間が長くなるという問題点があることも、本願発明者は見出したものである。

本発明の目的は、液体クロマトグラフ分析方法及び装置の分析精度を向上することである。

本発明は、分離カラムを洗浄した後の洗浄液中の塩濃度を測定し、分離カラムに残存する塩濃度に基づいて溶離液をカラムに導入して、分離カラムの洗浄を適切に行うことに関する。

本発明によれば、塩を含む試料が分析装置に導入されてしまう事態を防止して、液体クロマトグラフ分析の分析精度を向上できる。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について添付図面を参照して説明する。
（第１の実施形態）
図１、図２は、本発明の第１の実施形態である液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。図１は、分離カラム１０３の洗浄時における状態を示す図であり、図２は、試料の分析時における状態を示す図である。

図１、図２において、液体クロマトグラフ装置は、流路の変更を行なうバルブ（流路切替手段）１０８と、試料のバルブ１０８への導入及び試料の脱塩・洗浄を行う送液部１１０と、溶離液１０７をバルブ１０８に送るポンプ（送液手段）１０５と、電気伝導度測定装置（塩濃度測定手段）１０１と、試料を分離するカラム（試料吸着・溶離手段）１０３と、制御装置１１１とを備え、分析装置１０２に接続されている。

まず、送液部１１０について説明する。送液部１１０は、溶液１０６をバルブ１０８に導入するポンプ１０４と、試料を溶液１０６に導入する試料導入装置１０９を備える。

溶液１０６には、水の比率が高い溶液が用いられる。この溶液１０６は試料溶液との混合の容易さを考慮にいれて選択される。第１の実施形態では、一例として、０．１％ＨＣＯＯＨ水溶液を用いることができる。

ポンプ１０４の送液速度は、分離カラム１０３の充填剤の種類及び内径によって適宜選択される。ここで、ポンプ１０４の送液速度は、例えば、１ｍｌ／ｍｉｎとすることができる。

試料導入装置１０９は、ポンプ１０４の吐出側であって、分離カラム１０３の流入側に配置され、試料をカラム１０３に導入する機能を有している。この試料導入装置１０９として、通常は、複数の試料を定量的に、かつ自動的に連続分析することが可能なオートサンプラーが用いられる。また、試料導入装置１０９として、自動的に連続分析することはできないが、定量的に試料を導入することができるマニュアルインジェクターも用いることができる。マニュアルインジェクターを使用するときは、シリンジ類の定量器具を用いて試料を定量することとなる。

ポンプ１０４から送液が行なわれ、試料導入装置１０９から試料の導入が開始される。そして、試料がバルブ１０８に送液され、カラム１０３に導入されて保持される。その後、ポンプ１０４からバルブ１０８への送液が続行され、カラム１０３に吸着した塩および汚れが洗い流される。

次に、ポンプ１０５について説明する。
ポンプ１０５は、バルブ１０８を介して溶液１０７をカラム１０３に送り、このカラム１０３から試料を溶出させる。この第１の実施形態においては、カラム１０３に逆相カラムを用いている。また、溶液１０７には、０．１％ＨＣＯＯＨを含む１００％ＣＨ_３ＣＮを使用することができる。

電気伝導度測定装置１０１は、溶液中のイオン種の伝導度を測定する装置である。この電気伝導度測定装置１０１は、ポンプ１０４から送液された洗浄液としての溶液が、カラム１０３を通過した後の溶液について、その電気伝導度の測定を行う。カラム１０３を通過した後の溶液の電気伝導度を測定することにより、カラム１０３の洗浄が充分に行われたか否かを判定することが可能となる。

分析装置１０２は、分離カラム１０３から溶離した各試料成分を分析する装置であり、バルブ１０８の切替操作により、分離カラム１０３の下流側に接続される。

なお、この第１の実施形態において、分析装置１０２には、試料の定性・定量分析が可能な質量分析装置を適用した。また、この第１の実施形態では、エレクトロイオンスプレーイオントラップ質量分析装置を適用することができる。

なお、ここでいう質量分析装置とは、四重極型質量分析装置や飛行時間型質量分析装置、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置である。また、流路と質量分析装置とのインターフェースとしては、ＥＳＩ（エレクトロイオンスプレー）を用いた。なお、インターフェースとしては、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）も用いることが可能である。

また、分析装置は、質量分析装置以外にも、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度検出器や蛍光検出器、電気化学検出器を用いることも可能である。

カラム１０３は、バルブ１０８の流路内に配置され、バルブ１０８の流路が切替わることにより、ポンプ１０４から溶液が供給されるか、１０５から溶液が供給されるかが変更するように配置されている。カラム１０３は試料の中の測定対象成分を吸着し、その後、グラジエント溶離液が導入されることにより、吸着した測定対象成分が溶出し、カラム１０３からの分離が行なわれる。

なお、本発明の第１の実施形態においては、最も一般的な分離カラムとして使用されている逆相カラムを用いることができる。

カラム１０３においては、様々なカラムを使用することが可能である。ただし、カラムから各測定対象成分を溶出させる際に用いる溶液１０７が分析装置１０２の測定精度に影響を与えるものは使用できない。例えば、カラム１０３にイオン交換カラムを使用した場合、大量の塩が分析装置１０２に導入されてしまうため、カラム１０３には、イオン交換カラムを使用することはできない。

制御装置１１１は、バルブ１０８の流路の切替え、ポンプ１０４、ポンプ１０５の送液、試料導入装置１０９の測定操作、分析装置１０２、電気伝導度測定装置１０１の測定操作を制御している。

図３は、制御装置１１１と、その制御対象との関係を示す図である。図３に示すように、制御装置１１１は、インターフェース１１３を介して、バルブ１０８、ポンプ１０４、ポンプ１０５、試料導入装置１０９、分析装置１０２、電気伝導度測定装置１０１と信号送受を行なう。そして、分析の経過情報や、分析結果、分離カラム１０３の洗浄度、汚染度等を出力装置１１２に表示させる。

次に、制御装置１１１によって、ポンプ１０４、１０５、バルブ１０８等の動作を制御する手順について説明する。図４は、制御装置１１１によって行われる動作制御フローチャートである。なお、この第１の実施形態においては、試料として１成分組成でかつ塩を含む試料を用いて測定を行った。

まず、ステップＳ４０１において、ポンプ１０４により溶液１０６をバルブ１０８に送液し、カラム１０３に試料を導入する。その後、そのままの流路で、ステップＳ４０２において測定対象成分以外の成分をカラム１０３から除去するため、ポンプ１０４からの洗浄液でカラム１０３を洗浄する。

このとき、ステップ４０３において、電気伝導度測定装置１０１で、カラム１０３から排出された洗浄液のイオン濃度について測定を行うことにより、カラム１０３に吸着した目的の測定対象成分以外の塩が取り除かれたか否かが確認される。

つまり、電気伝導度測定装置１０１により測定された洗浄液の電気伝導度は、制御装置１１１に伝送され、伝送された電気伝導度から、洗浄液のイオン濃度を算出し、カラム１０３の洗浄状態（脱塩状態）が判断される。カラム１０３の洗浄が十分された（脱塩が行なわれた）と判断するまで、カラム１０３の洗浄が行なわれる。

カラム１０３からの脱塩を確認した後、制御装置１１１は、図１の状態から図２の状態にバルブ１０８の流路を切替える。すなわち、カラム１０３への流路がポンプ１０４→カラム１０３→電気伝導度測定装置１０１となる流路からポンプ１０５→カラム１０３→分析装置１０２となる流路に変更される。

そして、溶液１０７から溶離液がカラム１０５に送られることで試料成分が溶出し分析装置１０２に導入され、試料の測定が行なわれる（ステップＳ４０４、Ｓ４０５）。

制御装置１１１の制御によって、この一連の測定は少なくとも１回行うことが可能である。

上述したように、電気伝導度測定装置１０１で測定を行い、カラム１０３の脱塩が完全に行われた後に、流路を切り替えて、ポンプ１０５からカラム１０３に溶液が送液され、分析装置１０２に測定対象成分が供給される。

したがって、試料中の塩濃度が高い場合であっても、十分に脱塩処理が行われた状態のカラム１０３から測定対象物を含む溶液が分析装置１０２に導入されることになる。

本発明の第１の実施形態では、分析装置として質量分析装置を用いている。一般的に、カラム１０３の脱塩が完全に行われていないと、試料成分に含まれる塩が質量分析装置に混入してしまい、塩の析出により、その性能に影響を与えてしまう。

その点、第１の実施形態では、カラム１０３から脱塩が完全に行われたことを確認できるので、試料成分に含まれる塩が質量分析装置に混入するという事態を防止でき、分析精度を向上できるとともに、質量分析装置の汚染を防ぐことができる。

以上のように、本発明の第１の実施形態によれば、分析精度の向上化が可能な液体クロマトグラフ分析方法及び装置を実現することができる。

また、分離カラムを適切に洗浄することが可能であるため、分離カラムの汚染を抑制し、長寿命化することが可能である。

また、従来技術では、実際には脱塩が完了しているか否かに関係なく、脱塩操作は一定時間だけ行なわれていた。このため、脱塩が完了している場合であっても、所定時間が経過するまで、洗浄溶液をカラムに通過させることとなり、時間と洗浄溶液の過剰使用となる場合があった。

これに対して、本発明の第１の実施形態においては、時間経過に関係なく、カラム１０３の脱塩が完全に終了したときには、カラムの脱塩処理を終了し、次のステップに移行することとしているので、適正な時間のみ脱塩が行われる。つまり、脱塩処理時間と洗浄溶液の過剰使用となることが回避でき、結果的に、分析時間を短縮でき、分析のスループットを向上することができる。

また、カラムに導入された塩が確実に洗浄されることになるので、カラムの劣化を防ぎ、長寿命化を図ることが可能になる。さらに、カラムによる分離能の低下も防ぐことが可能になり、分析精度が向上する。

さらに、従来技術では、洗浄（脱塩）時間を考慮しプログラムを適宜決定する必要があった。その点、本発明の第１の実施形態では、自動的に洗浄（脱塩）工程が終了したことを判断することが可能である。すなわち、測定開始時のわずらわしいパラメーターの決定作業を省くことができ装置の利便性が向上する。

（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。
現在、国家レベルでの様々なゲノムプロジェクトの結果、ゲノム配列が明らかになっている生物種は人や植物、微生物など多岐にわたっている。このゲノム情報を基にして、ゲノムの発現情報を把握し、生命現象を特定の器官・組織・細胞の中で生産される蛋白質の動態を包括的に解析しようとする活動領域がプロテオミクスである。プロテオミクスは、蛋白質をプロファイリングする技術を用いて分析することで器官・組織・細胞の中での蛋白質の動態を解析することに焦点をおいたものである。

このプロファイリング技術には、２次元電気泳動と質量分析装置の組合せで解析を行うことが一般的であった。

しかし、最近のプロテオーム分野の技術革新により２次元電気泳動に変わり、種類の異なるカラムを組み合わせた高速クロマトグラフを使用して試料成分を分離し、質量分析装置に導入する方法が利用されている。

本発明の第２の実施形態は、プロテオミクスの分野で蛋白質をプロファイリングする際に用いる多次元高速クロマトグラフィーについて、簡便で高効率に精度よく分離を行うための方法および装置に関しての実施形態である。

図５、図６は、本発明の第２の実施形態である多次元高速クロマトグラフ装置の概略構成図であり、図５は、濃縮カラム５０４への試料濃縮時及び洗浄時における状態を示す図であり、図６は、試料の分析時における状態を示す図である。

本発明の第２の実施形態は、５つの構成要素で構成される。
第１の構成要素は、マイクロフローレベル（μｌ／ｍｉｎ）の定量でグラジエント溶離液を送液流路へ導入する前段送液手段（ポンプ）５１２と、試料を送液流路へ導入する試料導入装置５０６、および試料を各成分へ分離する１次元目分離カラム５０３を備えた１次元目分離部５２３である。

第２の構成要素は、１次元目分離部５２３で分離された各分離成分を保持させるカラム５０４を備え、第１の構成要素におけるポンプ５１２から溶液を送液し各分離成分について洗浄（脱塩）を行い、洗浄液を測定する電気伝導度測定機５０１からなる脱塩部５２４である。

第３の構成要素は、ナノフローレベル（ｎｌ／ｍｉｎ）の定量でグラジエント溶離液を送液流路へ導入する後段送液手段５１８と、１次元目分離部５２３で分離された各成分毎にさらに分離を行う２次元目分離カラム５０５を備えた２次元目分離部５２５である。

第４の構成要素は、第１〜第３の構成要素及び分析装置部５２６の制御を行う制御装置５２２である。

第３の構成要素である２次元目分離部５２５で分離された各成分は、分析装置部５２６で分析される。

まず、１次元目分離部５２３の構成について説明する。

試料導入装置５０６は、複数の試料を定量的にかつ自動的に連続分析することが可能なオートサンプラーを使用した。マニュアルインジェクターとシリンジを用いて試料導入を行うことも可能である。

ポンプ５１２は、マイクロフローレベル（μｌ／ｍｉｎ）の流量で二つの溶液５０８、５０９を低圧グラジエント方式、即ち、電磁弁５１０、５１１のオン／オフで溶液５０８、５０９の組成比を決めて混合し送液を行うことが可能である。なお、溶液５０８、５０９の組成比率は、制御装置５２２により自動的に制御可能である。

ポンプ５１２から送られる溶液はミキサー５１３で混合された後、１次元目分離カラム５０３へ送られる。溶液５０８、５０９の組成は１次元目分離カラム５０３の特性によって決定される。

第２の実施形態では、１次元目分離カラム５０３にイオン交換カラムを用いているため、イオン強度が異なるグラジエント溶離液を作成し用いることができる。このポンプ５１２は、３あるいは４種類の複数の溶液を用いて混合する低圧グラジエント方式を用いる場合も適用可能である。

溶液５０８には、０．１％ＨＣＯＯＨを含む２％ＣＨ_３ＣＮ水溶液、溶液５０９には０．１％ＨＣＯＯＨおよび１ｍｏｌ／ｌＨＣＯＯＮＨ_４を含む２％ＣＨ_３ＣＮ水溶液を用いることができる。

１次元目分離カラム５０３は、イオン交換カラムであり、試料の性質等において、固定相として各種イオン交換樹脂が溶離液や試料の性質によって適宜用いられる。

試料導入装置５０６から導入が行われた試料は、イオン交換カラム５０３で試料中の各成分のイオン性等に基づいて保持される。その後、ポンプ５１２で作成されたイオン強度が異なるグラジエント溶離液がイオン交換カラム５０３に導入されることにより、イオン交換カラム５０３に充填されたイオン交換樹脂に対する親和力の違いによって試料が分離される。

この第２の実施形態では、１次元目分離カラム５０３に、一例として、内径３００μｍ×長さ１５０ｍｍのものを使用することができる。

次に、脱塩部５２４について説明する。
脱塩部５２４は、１次元目分離部５２３の１次元目分離カラム５０３であるイオン交換カラムにより分離を行った各試料成分の脱塩を行う機能を有する。

１次元目分離部５２３で分離された各試料成分は、バルブ５０７へ送られ、濃縮カラム５０４に導入されて試料の濃縮が行われる。この濃縮カラム５０４は、試料の性質等において、固定相として各種の充填剤が用いられ、分離カラムに比較して低容積の充填剤が充填されているカラムである。

ここで、上述した１次元目分離部５２３のポンプ５１２はマイクロフローレベル（μｌ／ｍｉｎ）の流量で溶液５０８、溶液５０９を送液する。そして、このポンプ５１２は試料を送液する機能の他、脱塩部５２４の濃縮カラム５０４に濃縮された各試料成分を洗浄（脱塩）する機能も兼ね備えている。

この濃縮カラム５０４の洗浄のための洗浄液として、２次元目分離部５２５で用いられる初期溶離液と成分が同様な組成を持つものが用いられる。一般的には、低濃度の有機酸を含んだ溶液を使用することが多い。この第２の実施形態では、溶液５０８は０．１％ＨＣＯＯＨを含む２％ＣＨ_３ＣＮ水溶液を使用することができる。

脱塩部５２４の電気伝導度測定装置５０１は、溶液中のイオン種の伝導度を測定する装置である。この電気伝導度測定装置５０１は、洗浄液としてポンプ５１２から送液された溶液が、濃縮カラム５０４を通過した後の溶液について、その伝導度の測定を行う。なお、電気伝導度測定装置５０１において、導電率検出器、紫外線吸収検出器、電気化学検出器を用いても同様な効果が得られる。

続いて、２次元目分離部５２５について説明する。
ポンプ５１８は、ナノフローレベル（ｎｌ／ｍｉｎ）の流量で二つの溶液５１４、５１５を低圧グラジエント方式、即ち、電磁弁５１６、５１７のオン／オフで、これらの組成比率を決めて混合し送液を行う。なお、これらの組成比率は、制御装置５２２により制御されている。

ポンプ５１８から送られる溶液は、ミキサー５１９で混合された後、バルブ５０７へ送られる。溶液５１４、５１５の組成は２次元目分離カラム５０５の特性によって決定される。この第２の実施形態では２次元目分離カラム５０５に逆相カラムを用いているため、極性が異なるグラジエント溶離液を作成し用いることができる。

このポンプ５１８は、３あるいは４種類の複数の溶液を用いて混合する低圧グラジエント方式を用いる場合もある。また、溶液５１４には０．１％ＨＣＯＯＨを含む２％ＣＨ_３ＣＮ水溶液、溶液５１５には０．１％ＨＣＯＯＨを含む９８％ＣＨ_３ＣＮ水溶液を用いることができる。

２次元目分離カラム５０５は、逆相カラムであり、試料の性質等において、固定相として各種固定相が溶離液や試料の性質によって適宜選択される。

バルブ５０７が、図５に示す状態から図６に示す状態に切替わることで、ポンプ５１８から濃縮カラム５０４、２次元目分離カラム５０５を通る流路に切り替えられる。

そして、各試料成分が濃縮された濃縮カラム５０４にポンプ５１８からのグラジエント溶液が順次送液され試料が溶出し、２次元目分離カラム５０５に順次各試料成分が到達する。

次に、分析装置部５２６について説明する。
分析装置５０２としては、通常、質量分析装置が用いられる。この多次元高速クロマトグラフ装置と質量分析装置とを組合せた装置は、プロテオーム解析、つまり生体内、細胞内で複雑に相互作用を行っている蛋白質を解析する手段として広く用いられている。

通常の試料を測定する場合は、一種類のカラムで分離し、分析装置で検出するが、この第２の実施形態においては、様々な蛋白質からなる混合試料を分析して検出することを主眼においており、２種類の分離カラム５０３、５０５を用いて試料の分離を行なっている。

分析試料としての蛋白質の混合物試料は、酵素により消化処理が行われ、予めペプチド断片にまで分解を行ったものを用いることが多い。このため、１次元目分離部５２３でイオン交換カラム５０３に導入され、イオン強度、つまり、イオン交換樹脂への親和性により分離される。そして、脱塩部５２４の濃縮カラム５０４で濃縮が行なわれ、ポンプ５１２からの洗浄液の送液により洗浄（脱塩）が行われる。続いて、２次元目分離部５２５の逆相カラム５０５に導入され、さらに分離が行われる。

このように、分離された試料成分は、質量分析装置部５２６に導入され、ペプチド断片のアミノ酸配列が同定される。その同定されたアミノ酸配列情報はアミノ酸配列情報検索データベースと照合が行われることによって蛋白質の同定が行われる。

質量分析装置としては、エレクトロイオンスプレーイオントラップ質量分析装置を用いた。ここで用いる質量分析装置は、四重極型質量分析装置や飛行時間型質量分析装置、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置も適用可能である。

また、分析装置は、質量分析装置以外に、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度検出器や蛍光検出器、電気化学検出器を用いることができる。

次に、制御装置５２２について説明する。
制御装置５２２は、ポンプ５１２、５１８における、溶液の組成比率および送液操作、試料導入部（オートサンプラー）５０６からの試料の導入、バルブ５０７の流路切替え、電気伝導度測定装置５０１の測定操作、分析装置５０２の測定操作を制御している。図７は、制御装置５２２と、その制御対象との関係を示す図である。図７に示すように、制御装置５２２は、インターフェース５２７を介して、バルブ５０７、ポンプ５１２、ポンプ５１８、試料導入装置５０６、分析装置５０２、電気伝導度測定装置５０１と信号送受を行なう。そして、分析の経過情報や、分析結果、濃縮カラム５０４の洗浄度、汚染度等を出力装置５２８に表示させる。

次に、制御装置５２２の制御動作について、図８に示した動作フローチャートを参照して説明する。

まず、ステップＳ８０１において、試料導入装置５０６から試料がポンプ５１２からの送液により１次元目分離カラム５０３に導入される。ポンプ５１２からの送液は制御装置５２２により組成比率が制御されており、予めプログラムした一定時間１次元目分離カラム５０３に導入される。

次に、ステップＳ８０２において、ポンプ５１２から塩濃度勾配グラジエントを用いて、分離カラム５０３から目的試料を溶出し、濃縮カラム５０４に濃縮する。その後、ポンプ５１２からの溶離液により、濃縮カラム５０４の脱塩処理を開始し、電気伝導度測定装置５０１で濃縮カラム５０４から排出される溶液の塩濃度の測定を行なって、濃縮カラム５０４の脱塩が完了するまでその処理を行う（ステップＳ８０３、Ｓ８０４）。

なお、ステップＳ８０１〜Ｓ８０４は、図９に示したような傾斜的に増加する塩濃度となるように、濃縮カラム５０４へ試料の導入と、この濃縮カラム５０４の脱塩処理とが、所定の塩濃度となるまで交互に繰り返して行われる。つまり、図９の（ａ）の時点０からｔ１まで、傾斜状に塩濃度が上昇された後、カラム５０４の脱塩処理が開始され、カラム５０４から排出される溶液の塩濃度が０となる時点ｔ２まで脱塩処理が行われる（図９の（ｂ））。そして、脱塩処理の終了後、次の塩濃度となるように時点ｔ２からｔ３まで、塩濃度が上昇された後、カラム５０４の脱塩処理が開始され、カラム５０４から排出される溶液の塩濃度が０となる時点ｔ４まで脱塩処理が行われる。以降、同様にして、所定の濃度となるまで塩濃度が傾斜状に増加され、脱塩処理が行われる。

続いて、バルブ５０７の流路を切り替え、濃縮カラム５０４に溶液が供給される流路をポンプ５１２からポンプ５１８に切り替える。つまり、図５に示す流路から図６に示す流路に切り替える（ステップＳ８０５）。

そして、ポンプ５１８からの溶離液を用いて、濃縮カラム５０４からの試料成分のうちの対象成分を２次元目分離カラム５０５で分離する（ステップＳ８０６）。２次元目分離カラム５０５で分離された対象成分は、ポンプ５１８からの送液により分析装置５０２に導入され、試料成分が測定される（ステップＳ８０７）。

分析装置５０２による測定が終了すると、バルブ５０７の流路が図６に示した状態から図５に示した状態に切り替えられ（ステップＳ８０８）、ステップＳ８０１２に戻る。

以上のように、本発明の第２の実施形態によれば、電気伝導度測定装置５０１で測定を行い、濃縮カラム５０４の脱塩が完全に行われた後に、制御装置５２２より、ポンプ５１２からの送液からポンプ５１８への送液に切替わる。

したがって、この第２の実施形態においても、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。

（第３の実施形態）
本発明第３の実施形態は、上述した第２の実施形態と同様に、多次元高速クロマトグラフ装置に本発明を適用した場合の例である。この第３の実施形態と第２の実施形態との相違は、１次元目分離カラムへの溶離液の導入方法が異なるところである。つまり、一次元目分離部の構成と、制御装置の動作が異なっている。他の点については、第２の実施形態と同様であるので、説明は省略する。

図１０は、本発明の第３の実施形態の概略構成図である。図１０において、１次元目分離部１０１９のポンプ１００９は、マイクロフローレベル（μｌ／ｍｉｎ）の流量で溶液１００８から溶液を送り、試料導入装置１００６を介して１次元目分離カラム１００３に試料を導入する。ここで、溶液１００８は、この第３の実施形態では、０．１％ＨＣＯＯＨを含む２％ＣＨ_３ＣＮ水溶液を用いることができる。

試料導入装置１００６は、ポンプ１００９の下流側（排出側）であり、１次元目分離カラム１００３の上流側に配置されている。通常は、試料導入装置１００６として、複数の試料を定量的にかつ自動的に連続分析することが可能なオートサンプラ−が用いられる。この試料導入装置１００６は、試料を１次元目分離カラム１００３に導入する機能及び溶離液を１次元目分離カラム１００３に導入する機能を有する。この第３の実施形態においては、１次元目分離カラム１００３としてイオン交換カラムを用いることができる。

試料導入装置１００６が有するバイアル１に試料、バイアル２に２％ＣＨ_３ＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、１０ｍＭのＨＣＯＯＮＨ_４水溶液、バイアル３に２％ＣＨ_３ＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、２０ｍＭのＨＣＯＯＮＨ_４水溶液、バイアル４に２％ＣＨ_３ＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、５０ｍＭのＨＣＯＯＮＨ_４水溶液、バイアル５に２％ＣＨ_３ＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、１００ｍＭのＨＣＯＯＮＨ_４水溶液、バイアル６に２％ＣＨ_３ＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、２００ｍＭのＨＣＯＯＮＨ_４水溶液、バイアル７に２％ＣＨ_３ＣＮ、０．１％ＨＣＯＯＨ、５００ｍＭのＨＣＯＯＮＨ_４水溶液を用いることができる。

試料導入装置１００６により試料またはグラジエント溶離液の導入動作を説明する。

まず、ポンプ１００９の送液によって、あらかじめプログラムした一定時間、バイアル１から試料を１次元目分離カラム１００３に導入する。次に、試料導入装置１００６のラック上に、数種類の試料およびイオン強度が異なる溶液が配置されており、制御装置１０１８の制御により順次、１次元目分離カラム１００３に導入する。この動作によりイオン強度が異なる各溶離液が試料が吸着した１次元目分離カラム１００３に導入される。

つまり、バイアル１からの試料が１次元目分離カラム１００３で分離され、脱塩部５２４に導入される。バイアル１からの試料が導入された後、バイアル２から溶離液が送液され、１次元目分離カラム１００３で各試料成分に分離された後、濃縮カラム５０４で濃縮される。

その間もポンプ１００９による送液は行なわれており、濃縮カラム５０４の洗浄（脱塩）が行なわれている。つまり、図１１に示すように、時点ｔ１からｔ２、時点ｔ３からｔ４、ｔ５からｔ６、…の期間に濃縮カラム５０４の洗浄が行なわれる。

この洗浄（脱塩）工程の間、電気伝導度測定装置５０１により、濃縮カラム５０４から排出される洗浄液のイオン濃度が測定される。このとき、電気伝導度測定装置５０１が測定したイオン濃度が、予め設定した設定値より低くなれば濃縮カラム５０４の脱塩が終了したと判断される。そして、濃縮カラム５０４の脱塩が終了すると、制御装置１０１８により、バルブ５０７の流路が切替わり、ポンプ１００９から濃縮カラム５０４への送液からポンプ５１８から濃縮カラム５０４への送液に切替わる。この時点で脱塩処理は完了する。

このバルブ５０７の流路切り替えに同期して、ポンプ５１８から送り出される溶離液が濃縮カラム５０４を介して２次元目分離カラム５０５に送られ、２次元目の分離が始まる。このように分離された試料は、分析装置５０２に導入され測定が開始される。

分析装置５０２での測定が終了すると、バルブ５０７の流路が図１０の状態に切替えられ、バイアル３の溶離液が１次元目分離カラム１００３に導入され、以降、上述と同様にして試料の分離、濃縮、分離が行なわれた後、測定が行なわれる。

上述した一連の動作制御は、全て制御装置１０１８により実行され、自動的、かつ連続的に試料を測定することが可能である。

本発明の第３の実施形態においても、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。

ここで、上述した第１〜第３の実施形態においては、分離カラム又は濃縮カラムに試料を導入した後の、洗浄工程において、分離カラム又は濃縮カラムから排出される洗浄液のイオン濃度を電気伝導度測定装置で測定し、脱塩の終了を確認している。

本発明においては、洗浄工程のみならず、分離カラム又は濃縮カラムに試料を導入する前の段階で、分離カラム又は濃縮カラムに洗浄液を供給し、脱塩状態を電気伝導度測定装置により確認することもできる。

また、洗浄液そのもののイオン濃度を、電気伝導度測定装置、紫外線吸収検出器、電気化学検出器等により検出することもできる。これにより、洗浄液が汚染されていることを検出することができ、試料の分析前に、洗浄液を汚染されていないものに交換することができる。洗浄液が汚染されていると、試料の分析精度を低下させるからである。

本発明の第１の実施形態である液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。本発明の第１の実施形態である液体クロマトグラフ装置の動作説明図である。本発明の第１の実施形態における制御装置と、その制御対象との関係を示す図である。本発明の第１の実施形態における動作フローチャートである。本発明の第２の実施形態である液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。本発明の第２の実施形態である液体クロマトグラフ装置の動作説明図である。本発明の第２の実施形態における制御装置と、その制御対象との関係を示す図である。本発明の第２の実施形態における動作フローチャートである。本発明の第２実施形態におけるポンプからの送液の塩濃度と電気伝導度測定装置により測定される塩濃度との関係を示す図である。本発明の第３の実施形態である液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。本発明の第３実施形態におけるポンプからの送液の塩濃度と電気伝導度測定装置により測定される塩濃度との関係を示す図である。

符号の説明

１０１、５０１電気伝導度測定装置
１０２、５０２分析装置
１０３、分離カラム
１０４、１０５ポンプ
１０８、５０７バルブ
１０９、５０６試料導入装置
１１０送液部
１１１制御装置
５０３１次元目分離カラム
５０４濃縮カラム
５０５２次元目分離カラム
５１０、５１１電磁弁
５１２、５１８ポンプ
５１３ミキサー
５１６、５１７電磁弁
５１９電磁弁
５２２制御装置
５２３１次元目分離部
５２４脱塩部
５２５２次元目分離部
５２６分析装置部
１００３１次元目分離カラム
１００６試料導入装置
１００９ポンプ

Claims

液体クロマトグラフ分析方法において、
塩を含む溶液の塩濃度を調整して、この溶液を試料と共に、試料を選択的に吸着し溶離できる第１のカラムに導入して、測定対象物をこの第１のカラムに吸着させ、
上記第１のカラムに時間経過と共に所定の塩濃度となるまで傾斜状に増加する塩濃度の溶液を導入して、吸着されていた測定対象物を溶離し、
上記第１のカラムから溶離された測定対象物を、試料を選択的に吸着し溶離できる第２のカラムに導入して測定対象物を吸着させて、測定対象物の濃縮を行い、
上記第２のカラムに溶液を導入して洗浄して脱塩処理を行い、この第２のカラムから排出された溶液の電気伝導度を測定することにより塩濃度を測定して、測定した塩濃度に基づいて、上記脱塩処理を継続するか停止するかを判断して上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを上記溶液が所定の塩濃度となるまで交互に行い、
上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを停止すると判断した後、上記第２のカラムに溶液を導入して、上記第２のカラムに吸着させた測定対象物をこの第２のカラムから溶離させ、試料を選択的に吸着し溶離できる第３のカラムに導入して測定対象物を吸着させ、
その後、上記第３のカラムに溶液を導入して、上記第３のカラムに吸着させた測定対象物をこの第３のカラムから溶離させることを特徴とする液体クロマトグラフ分析方法。
液体クロマトグラフ分析方法において、
塩を含む溶液の塩濃度を調整して、この溶液を試料と共に、試料を選択的に吸着し溶離できる第１のカラムに導入して、測定対象物をこの第１のカラムに吸着させ、
上記第１のカラムに時間経過と共に所定の塩濃度となるまで階段状に増加する塩濃度の溶液を導入して、吸着されていた測定対象物を溶離し、
上記第１のカラムから溶離された測定対象物を、試料を選択的に吸着し溶離できる第２のカラムに導入して測定対象物を吸着させて、測定対象物の濃縮を行い、
上記第２のカラムに溶液を導入して洗浄して脱塩処理を行い、この第２のカラムから排出された溶液の電気伝導度を測定することにより塩濃度を測定して、測定した塩濃度に基づいて、上記脱塩処理を継続するか停止するかを判断して上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを上記溶液が所定の塩濃度となるまで交互に行い、
上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを停止すると判断した後、上記第２のカラムに溶液を導入して、上記第２のカラムに吸着させた測定対象物をこの第２のカラムから溶離させ、試料を選択的に吸着し溶離できる第３のカラムに導入して測定対象物を吸着させ、
その後、上記第３のカラムに溶液を導入して、上記第３のカラムに吸着させた測定対象物をこの第３のカラムから溶離させることを特徴とする液体クロマトグラフ分析方法。
液体クロマトグラフ分析装置において、
試料を選択的に吸着し溶離できる第１のカラムと、
塩を含む溶液を上記第１のカラムに送液する第１のポンプと、
上記第1のポンプから送液される溶液に試料を導入する試料導入器と、
上記第１のカラムから溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第２のカラムと、
上記第１のポンプにより上記第２のカラムに導入され排出された溶液の電気伝導度を測定することにより、塩濃度を測定する塩濃度測定器と、
上記第２のカラムに試料溶出溶液を導入し、第２のカラムに吸着された測定対象成分を溶出させる第２のポンプと、
上記第２のカラムから溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第３のカラムと、
上記第２のカラムに第1のポンプから溶液を導入する流路と、上記第２のカラムに第２のポンプから溶液を導入する流路とを有し、いずれかの流路を選択できるバルブと、
上記塩濃度測定器が測定した塩濃度に基づいて、上記第２カラムへの測定対象物の導入及び脱塩処理を継続するか停止するかを判断し、上記第１のポンプ、第２のポンプ、上記バルブの動作を制御する制御部であって、上記塩を含む溶液の塩濃度を調整して、上記試料と共に上記第１のカラムに導入して測定対象物をこの第１のカラムに吸着させた後、この第１のカラムに時間と共に所定の塩濃度となるまで傾斜状に塩濃度が増加する溶液を導入して、吸着されていた測定対象物を溶離して上記第２のカラムに導入させて、測定対象物を吸着させて濃縮させ、この第２のカラムから排出された溶液の塩濃度に基づいて上記溶液の第２のカラムの脱塩処理を継続するか停止するかを判断して上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを上記溶液が所定の塩濃度となるまで交互に行わせ、上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを停止すると判断した後、上記第２のカラムに溶液を導入して、上記第２のカラムに吸着させた測定対象物をこの第２のカラムから溶離させ、第３のカラムに導入して測定対象物を吸着させ、その後、上記第３のカラムに溶液を導入して、上記第３のカラムに吸着させた測定対象物をこの第３のカラムから溶離させる上記制御部と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
液体クロマトグラフ分析装置において、
試料を選択的に吸着し溶離できる第１のカラムと、
塩を含む溶液を上記第１のカラムに送液する第１のポンプと、
上記第1のポンプから送液される溶液に試料を導入する試料導入器と、
上記第１のカラムから溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第２のカラムと、
上記第１のポンプにより上記第２のカラムに導入され排出された溶液の電気伝導度を測定することにより、塩濃度を測定する塩濃度測定器と、
上記第２のカラムに試料溶出溶液を導入し、第２のカラムに吸着された測定対象成分を溶出させる第２のポンプと、
上記第２のカラムから溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第３のカラムと、
上記第２のカラムに第1のポンプから溶液を導入する流路と、上記第２のカラムに第２のポンプから溶液を導入する流路とを有し、いずれかの流路を選択できるバルブと、
上記塩濃度測定器が測定した塩濃度に基づいて、上記第２カラムへの測定対象物の導入及び脱塩処理を継続するか停止するかを判断し、上記第１のポンプ、第２のポンプ、上記バルブの動作を制御する制御部であって、上記塩を含む溶液の塩濃度を調整して、上記試料と共に上記第１のカラムに導入して測定対象物をこの第１のカラムに吸着させた後、この第１のカラムに時間と共に所定の塩濃度となるまで階段状に塩濃度が増加する溶液を導入して、吸着されていた測定対象物を溶離して上記第２のカラムに導入させて、測定対象物を吸着させて濃縮させ、この第２のカラムから排出された溶液の塩濃度に基づいて上記溶液の第２のカラムの脱塩処理を継続するか停止するかを判断して上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを上記溶液が所定の塩濃度となるまで交互に行わせ、上記第２のカラムへの測定対象物の導入と脱塩処理とを停止すると判断した後、上記第２のカラムに溶液を導入して、上記第２のカラムに吸着させた測定対象物をこの第２のカラムから溶離させ、第３のカラムに導入して測定対象物を吸着させ、その後、上記第３のカラムに溶液を導入して、上記第３のカラムに吸着させた測定対象物をこの第３のカラムから溶離させる上記制御部と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
液体クロマトグラフ分析装置において、
試料を選択的に吸着し溶離できる第１の試料吸着溶離手段と、
塩を含む溶液を上記第１の試料吸着溶離手段に送液する第１の送液手段と、
上記第1の送液手段から送液される溶液に試料を導入する試料導入手段と、
上記第１の試料吸着溶離手段から溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第２の試料吸着溶離手段と、
上記第１の送液手段により上記第２の試料吸着溶離手段に導入され排出された溶液の電気伝導度を測定することにより、塩濃度を測定する塩濃度測定手段と、
上記第２の試料吸着し溶離手段に試料溶出溶液を導入し、第２の試料吸着溶離手段に吸着された測定対象成分を溶出させる第２の送液手段と、
上記第２の試料吸着し溶離手段から溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第３の試料吸着溶離手段と、
上記第２の試料吸着溶離手段に第1の送液手段から溶液を導入する流路と、上記第２の試料吸着溶離手段に第２の送液手段から溶液を導入する流路とを有し、いずれかの流路を選択できる流路切替手段と、
上記塩濃度測定器が測定した塩濃度に基づいて、上記第２試料吸着溶離手段への測定対象物の導入及び脱塩処理を継続するか停止するかを判断し、上記第１の送液手段、第２送液手段、上記流路切替手段の動作を制御する制御部であって、上記塩を含む溶液の塩濃度を調整して、上記試料と共に上記第１の試料吸着溶離手段に導入して測定対象物をこの第１の試料吸着溶離手段に吸着させた後、この第１の試料吸着溶離手段に時間と共に所定の塩濃度となるまで傾斜状に塩濃度が増加する溶液を導入して、吸着されていた測定対象物を溶離して上記第２の試料吸着溶離手段に導入させて、測定対象物を吸着させて濃縮させ、この第２の試料吸着溶離手段から排出された溶液の塩濃度に基づいて上記溶液の第２の試料吸着溶離手段の脱塩処理を継続するか停止するかを判断して上記第２の試料吸着溶離手段への測定対象物の導入と脱塩処理とを上記溶液が所定の塩濃度となるまで交互に行わせ、上記第２の試料吸着溶離手段へ測定対象物の導入と脱塩処理とを停止すると判断した後、上記第２の試料吸着溶離手段に溶液を導入して、上記第２の試料吸着溶離手段に吸着させた測定対象物をこの第２の試料吸着溶離手段から溶離させ、第３の試料吸着溶離手段に導入して測定対象物を吸着させ、その後、上記第３の試料吸着溶離手段に溶液を導入して、上記第３の試料吸着溶離手段に吸着させた測定対象物をこの第３の試料吸着溶離手段から溶離させる上記制御部と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
液体クロマトグラフ分析装置において、
試料を選択的に吸着し溶離できる第１の試料吸着溶離手段と、
塩を含む溶液を上記第１の試料吸着溶離手段に送液する第１の送液手段と、
上記第1の送液手段から送液される溶液に試料を導入する試料導入手段と、
上記第１の試料吸着溶離手段から溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第２の試料吸着溶離手段と、
上記第１の送液手段により上記第２の試料吸着溶離手段に導入され排出された溶液の電気伝導度を測定することにより、塩濃度を測定する塩濃度測定手段と、
上記第２の試料吸着し溶離手段に試料溶出溶液を導入し、第２の試料吸着溶離手段に吸着された測定対象成分を溶出させる第２の送液手段と、
上記第２の試料吸着し溶離手段から溶離された測定対象物が導入され、試料を選択的に吸着し溶離できる第３の試料吸着溶離手段と、
上記第２の試料吸着溶離手段に第1の送液手段から溶液を導入する流路と、上記第２の試料吸着溶離手段に第２の送液手段から溶液を導入する流路とを有し、いずれかの流路を選択できる流路切替手段と、
上記塩濃度測定器が測定した塩濃度に基づいて、上記第２試料吸着溶離手段への測定対象物の導入及び脱塩処理を継続するか停止するかを判断し、上記第１の送液手段、第２送液手段、上記流路切替手段の動作を制御する制御部であって、上記塩を含む溶液の塩濃度を調整して、上記試料と共に上記第１の試料吸着溶離手段に導入して測定対象物をこの第１の試料吸着溶離手段に吸着させた後、この第１の試料吸着溶離手段に時間と共に所定の塩濃度となるまで階段状に塩濃度が増加する溶液を導入して、吸着されていた測定対象物を溶離して上記第２の試料吸着溶離手段に導入させて、測定対象物を吸着させて濃縮させ、この第２の試料吸着溶離手段から排出された溶液の塩濃度に基づいて上記溶液の第２の試料吸着溶離手段の脱塩処理を継続するか停止するかを判断して上記第２の試料吸着溶離手段への測定対象物の導入と脱塩処理とを上記溶液が所定の塩濃度となるまで交互に行わせ、上記第２の試料吸着溶離手段へ測定対象物の導入と脱塩処理とを停止すると判断した後、上記第２の試料吸着溶離手段に溶液を導入して、上記第２の試料吸着溶離手段に吸着させた測定対象物をこの第２の試料吸着溶離手段から溶離させ、第３の試料吸着溶離手段に導入して測定対象物を吸着させ、その後、上記第３の試料吸着溶離手段に溶液を導入して、上記第３の試料吸着溶離手段に吸着させた測定対象物をこの第３の試料吸着溶離手段から溶離させる上記制御部と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。