JP2003149218A - ２次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は高分離能を有し且つ自動的に
分析可能な高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用い
た蛋白質分析装置を提供することにある。 【解決手段】 前段送液手段２０ａ及び分離手段３８を
備えた前段分離部１２と、前段分離部１２で分離された
各分離成分をトラップするカラム４４を備え、該カラム
に洗浄液を流して脱塩処理を行う脱塩部１４と、後段送
液手段２０ｂ及び分離手段５０を備えた後段分離部１６
と、後段分離部１６と直結された質量分析部５２と、前
記各分離部で用いる溶離液及び脱塩部１４で用いる洗浄
液の流路の切り換えを制御する制御部５４と、を備えた
ことを特徴とする２次元高速液体クロマトグラフ装置及
びそれを用いた蛋白質分析装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は２次元高速液体クロ
マトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置、特に
分離能の改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、分離分析の分野においては分析器
のさらなる高性能化が要請されており、様々な角度から
研究開発が行われている。中でも高速液体クロマトグラ
フ装置は、分析装置の主力として汎用されており、高分
離能を有する装置が開発されている。

【０００３】一方、ここ数年の間で蛋白質の分離、同定
作業を大量同時に行おうとする技術を前提とした、包括
的蛋白質科学全体としてのプロテオミクスと呼ばれる技
術が生まれ、様々な研究が行われている。

【０００４】プロテオミクスのように、蛋白質分析を行
う分野では、高精度、高分離能の分析器が要求され、測
定の連続化、自動化及び高速化の要請もある。従来、プ
ロテオミクスの分野では、蛋白質の分離分析として２次
元電気泳動法が一般的に行われている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、様々な成分か
らなる混合物を分離する場合、従来の高速液体クロマト
グラフ装置では、用いるカラムの特性と各成分の特性と
の関係等から分離能に限界があった。すなわち、例えば
成分として多数の成分が混在しているときには、各成分
の極性等の性質やカラム特性により、よく分離される成
分もある一方でカラムを通しても十分に分離されない一
群の成分も同時に存在する場合がある。

【０００６】また、従来蛋白質の分離分析として一般的
に行われている電気泳動法では、高い分離能で分離でき
る一方で、自動化が困難で再現性や定量性の確保が難し
いという問題があった。本発明は前記従来技術の課題に
鑑み為されたものであり、その目的は高分離能を有し且
つ自動的に分析可能な高速液体クロマトグラフ装置及び
それを用いた蛋白質分析装置を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の２次元高速液体クロマトグラフ装置は、溶
離液及び試料をカラムに導入し、カラムにおいて分離さ
れた試料中の各成分を検出する高速液体クロマトグラフ
装置において、前段分離部、脱塩部、後段分離部、質量
分析部及び制御部を備えたことを特徴とする。

【０００８】前記前段分離部は、２００μｌ／ｍｉｎ以
下の定量で溶離液を送液する前段送液手段と、試料の分
離を行う分離手段を備える。また、前記脱塩部は前記前
段分離部で分離された各分離成分をトラップするカラム
を備え、該カラムに洗浄液を流して前記各分離成分につ
いて脱塩処理を行う。また、前記後段分離部は、１００
μｌ／ｍｉｎ以下の定量で溶離液を送液する後段送液手
段と、試料の分離を行う分離手段を備える。また、前記
質量分析部は、前記後段分離部に直結されている。ま
た、前記制御部は、前記各分離部で用いる溶離液及び前
記脱塩部で用いる洗浄液の流路の切り換えを制御する。

【０００９】また、前記装置において、前記前段分離部
で試料を各分離成分に分離し、前記脱塩部で脱塩処理を
行い、前記後段分離部で前記各分離成分についてさらに
分離を行う一連の分離操作を繰り返し行うために、前記
後段分離部を通した各分離成分を採取し前記前段分離部
へ導入する回帰部を備えることが好適である。

【００１０】また、前記装置において、前記前段分離部
では分離手段としてイオン交換カラムを用い、前記後段
分離部では分離手段として逆相カラムを用い、前記一連
の分離操作の繰り返しごとに、前記前段分離部の溶離液
として、該繰り返しごとにイオン強度が異なる一定組成
の溶離液を用いて分離を行い、前記後段分離部の溶離液
として、溶出強度がそれぞれ異なる、揮発性の酸を含む
逆相系の各溶離液を用い、溶出強度勾配を有する一連の
溶離液として逆相カラムへ送液してグラジエント分離を
行うことが好適である。

【００１１】また、前記装置において、後段分離部、又
は前段及び後段分離部に、組成の異なる各溶離液を別個
に所定量格納する溶離液格納手段と、前記溶離液格納手
段に格納された各溶離液を選択し、カラム側に前記所定
量の選択された溶離液を送液する溶離液選択手段を備
え、前記後段分離部の溶離液流量が５００ｎｌ／ｍｉｎ
以下であることが好適である。

【００１２】また、前記装置を用いた本発明の蛋白質分
析装置は、あらかじめ分析対象の蛋白質をペプチドに分
解する前処理を行った、該ペプチドを含む混合物を試料
として用い、前記各分離部での分離により前記混合物か
ら各ペプチドを分離し、前記質量分析部で該分離された
ペプチドについて質量分析を行い、該ペプチドのアミノ
酸配列を同定することを特徴とする。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、図面に基づき本発明の実施
形態について説明する。

【００１４】２次元高速液体クロマトグラフ装置 図１には、本発明の一実施形態にかかる２次元高速液体
クロマトグラフ装置の概略図が示されている。同図の該
２次元高速液体クロマトグラフ装置１０は、前段分離部
１２、脱塩部１４及び後段分離部１６を備えている。

【００１５】前段分離部１２は、定量ポンプ２０ａ（前
段送液手段）と、イオン交換カラム３８（分離手段）を
備えている。

【００１６】脱塩部１４は、前段分離部１２で分離され
た各分離成分について脱塩処理を行うトラップカラム４
４を備えている。

【００１７】後段分離部１６は、定量ポンプ２０ｂ（後
段送液手段）と、脱塩部１４で脱塩処理された各分離成
分ごとに、さらに分離を行う逆相カラム５０（分離手
段）を備えている。以下、測定の進行順に本装置につい
て説明する。

【００１８】２種類の各溶離液成分が２つの定量ポンプ
２０ａからそれぞれ圧送され、ミキサー２１ａで各成分
を混合することにより、各溶離液成分が任意の組成比率
で混合された溶離液が調整され、イオン交換カラム３８
へ導入される。なお、該組成比率の調整は、コンピュー
タ５４により制御されている。

【００１９】前段分離部の溶離液流量としては、極微量
試料に対する高分離能での分離を可能とするために２０
０μｌ／ｍｉｎ以下が好適である。前段分離部の溶離液
流量は、多数成分からなる試料をよく分離できるように
試料負荷を考慮して決定される。

【００２０】本実施形態では、まず一定組成比率の溶離
液をイオン交換カラム３８へ導入し、インジェクタ３６
より溶離液流路に導入された試料について、該溶離液の
溶出強度に基づき各分離成分への分離が行われる。

【００２１】ここで、イオン交換カラム３８の固定相と
しては、イオン交換クロマトグラフの固定相として用い
られる各種イオン交換体が、試料の性質等に応じて適宜
用いられる。

【００２２】前段分離部１２では、試料中の各成分のイ
オン性等に基づいてある程度までの分離は可能である
が、必ずしも十分な分離が行えない場合がある。特に蛋
白質分析における試料のように様々なペプチドを含む混
合成分を用いた場合には、前記各分離成分は単一のペプ
チドまでには分離されず、複数のペプチド成分を含んだ
状態である場合がある。そこで、本実施形態では、さら
に後段分離部で逆相分離を行い前記各分離成分ごとに２
段階目の分離を行う。

【００２３】しかし、前記各分離成分をそのまま逆相分
離系へ導入した場合、該成分中に含まれる塩が後続の質
量分析器５２に混入してしまい、その性能に影響してし
まうという問題がある。

【００２４】そこで、本実施形態では、前記各分離成分
の脱塩処理を行うための脱塩部１４を備えている。前記
各分離成分は、前段分離部に後続するトラップカラム４
４にトラップされた後、ポンプ４０により３方ティ４２
を経由して送液される、例えば有機酸の水溶液等の洗浄
液によりトラップカラム４４中で脱塩処理される。さら
に場合によってはその他の不純物も同時に前記各分離成
分から洗い流され、濃縮された各分離成分が得られる。

【００２５】トラップカラム４４で脱塩処理された前記
各分離成分は、後段分離部１６に導入された後、逆相分
離用の溶離液により、逆相カラム５０へ導入され、グラ
ジエント分離が行われる。

【００２６】後段分離部１６では、２種類の各溶離液成
分が２つの定量ポンプ２０ｂからそれぞれ圧送され、ミ
キサー２１ｂで各成分を混合することにより、各溶離液
成分が任意の組成比率で混合された溶離液が調整され、
逆相カラム５０へ導入される。なお、該組成比率の調整
は、コンピュータ５４により制御されている。

【００２７】溶離液の組成比率はコンピュータ５４の制
御により段階的に変えられ、溶出強度勾配を有する一連
の溶離液として逆相カラム５０へ導入され、グラジエン
ト分離が行われる。そして、溶離液と共に逆相カラム５
０へ導入された前記各分離成分ごとに、溶離液の溶出強
度に基づいてさらに各成分に分離される。

【００２８】逆相分離用の溶離液としては揮発性の酸を
含む逆相系の溶媒が好適に用いられ、試料や逆相カラム
の性質等により適宜調整される。また、逆相カラム５０
の固定相としては、逆相クロマトグラフの固定相として
用いられる各種固定相が、溶離液や試料の性質等に応じ
て適宜用いられる。

【００２９】なお、後段分離部の溶離液流量としては、
極微量試料に対する高分離能での分離を可能とするため
に１００μｌ／ｍｉｎ以下が好適である。

【００３０】このようにして２段階の分離により前記試
料中の各成分ごとにまで分離されたら、後段分離部に直
結する質量分析器５２（質量分析部）により各成分の定
性、定量分析が行われる。しかし、２段階の分離を経た
後に各成分にまで分離されていない分離成分が残存する
場合には、質量分析器５２で分析を行う前に、該分離成
分を採取して前記前段分離部へ再び試料として導入し、
前段分離部−脱塩部−後段分離部を通して分離を行う一
連の分離操作を複数回繰り返すことも可能である。本実
施形態では、このような場合に前記分離成分を採取し前
記前段分離部へ導入する回帰部４８を備えている。

【００３１】回帰部４８により前段分離部へ再び試料と
して導入された前記分離成分は、イオン交換カラム３８
でさらに各成分へ分離される。この際、各溶離液成分の
組成比率を変更した一定組成の溶離液を用いて分離を行
う。また、さらに回帰部４８を通して繰り返し一連の分
離操作を行う場合には、さらに各溶離液成分の組成比率
を変更した一定組成の溶離液を用いて分離を行う。この
ように、各一連の分離操作ごとに組成比率を変更し、イ
オン強度がそれぞれ異なる溶離液を用いてイオン交換分
離を行うことで効果的な分離が可能となる。

【００３２】このようにして前記試料中の各成分ごとに
まで分離された後、後段分離部に直結された質量分析器
５２（質量分析部）により各成分の定性、定量分析が行
われる。高速液体クロマトグラフと質量分析計のインタ
ーフェースとしては、ＥＳＩ（エレクトロスプレー）、
ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）等が用いられる。ま
た、質量分析計としては場合によりＭＳ／ＭＳ分析の構
成も適用される。

【００３３】なお、本実施形態ではバルブ４６及びその
他の各バルブの切換等一連の測定操作はコンピュータ５
４（制御部）により制御されており、前段分離部におけ
る溶離液、脱塩部における洗浄液及び後段分離部におけ
る溶離液の流路を適切に分離が行われるよう自動的に切
り替えられるように制御されているので、高分離能での
分析が連続的、自動的に行われる。

【００３４】図２には、本発明の他の実施形態にかか
る、ｎｌ／ｍｉｎオーダーの溶離液流量での分析が可能
な２次元高速液体クロマトグラフ装置の概略図が示され
ている。同図の該２次元高速液体クロマトグラフ装置１
０は、前段分離部１２及び後段分離部１６に、組成が異
なる各溶離液を別個に所定量格納する分岐流路３０ａ、
３０ｂ（溶離液格納手段）と、該各溶離液から所望の溶
離液を選択し、後続のカラム側へ送液するロータリー型
のバルブ３２ａ、３２ｂ（溶離液選択手段）を備えてい
る。以下、測定の進行順に本装置について説明する。

【００３５】イオン交換カラム３８へ導入する溶離液と
して、それぞれイオン強度が異なり、分離対象に対する
溶出強度が異なる複数の各溶離液が調整され、それぞれ
所定の容量を有する分岐流路３０ａ、３０ａ…にあらか
じめ格納されている。各溶離液は、定量ポンプ２０ａに
より圧送され、バルブ２４ａのポートを通過した後、１
０ポートの多岐管２８ａに接続された１０本の分岐流路
３０ａ、３０ａ…にそれぞれ格納される。

【００３６】なお、多岐管２８ａとしては、例えばＶＩ
ＣＩ社製のＺ１０Ｍ１等が用いられる。また、分岐流路
３０ａ、３０ａ…の数及び形状等は特に限定されず、分
析目的に応じて適宜選択されるが、本実施形態では１０
本の分岐流路がそれぞれ内径０．２５ｍｍ、長さ２００
ｍｍ、容量１０μｌのＰＥＥＫ管で形成されており、所
定量の各溶離液を格納する。

【００３７】ここで、バルブ２４ａのポート２６ａの開
閉切り換えによって、各分岐流路３０ａ、３０ａ…に対
して、シリンジ２２ａから直接溶離液を充填できるよう
にしてもよい。これにより、配管をその都度調整して溶
離液の交換又は補充を行う手間が解消される。

【００３８】また、ロータリー型のバルブ３２ａは各分
岐流路３０ａ、３０ａ…に一時格納された各溶離液を選
択するための手段（溶離液選択手段）として機能し、所
定のポート３４ａを開放することによって所望の溶離液
を後続のカラム側に向けて流すことができる。なお、バ
ルブ３２ａの出口部分には、図示しないコントローラが
接続されており、コンピュータ５４（制御部）からの電
気信号により、バルブ位置の選択を制御している。

【００３９】ここで、前記分岐流路に対する各溶離液の
充填を、コンピュータ５４による自動制御で行うように
してもよい。具体的には、各分岐流路３０ａ、３０ａ…
に対して、所定組成の各溶離液を自動調合作成し、順次
自動で各分岐流路３０ａ、３０ａ…に送液及び格納する
ようにする。この手段を採用すると、溶離液の充填精度
を高めることができるので、分析精度を向上させること
が可能となる。

【００４０】イオン交換分離に用いられる各溶離液とし
ては、溶媒組成、ｐＨ等によりイオン強度を段階的に変
化させたものが用いられるが、特に限定されず、試料や
イオン交換カラムの性質等により適宜調整したものが用
いられる。本実施形態では、まず各分岐流路３０ａ、３
０ａ…の内１本の分岐流路に格納された一定組成の溶離
液をイオン交換カラム３８へ導入し、インジェクタ３６
より溶離液流路に導入された試料は該溶離液の溶出強度
に基づいて各分離成分に分離される。

【００４１】溶離液格納手段及び溶離液選択手段を用い
た上述の送液システムを用いれば、ｎｌ／ｍｉｎオーダ
ーの溶離液流量で送液することが可能である。通常の高
速液体クロマトグラフ装置の構成ではこのような極低流
量での安定した送液は不可能であり、本発明において好
適に適用される。特に、５００ｎｌ／ｍｉｎ以下の溶離
液流量で前段における分離を行う場合には該システムが
用いられる。

【００４２】前記各分離成分は前段分離部から前述の脱
塩部１４へ送られ、トラップカラム４４で脱塩処理され
た後、後段分離部１６に導入される。そして逆相分離用
の溶離液により逆相カラム５０へ導入され、グラジエン
ト分離が行われる。

【００４３】逆相カラム５０へ導入する溶離液として、
それぞれ前記各分離成分に対する溶出強度が異なる複数
の各溶離液が調整され、それぞれ所定の容量を有する分
岐流路３０ｂ、３０ｂ…にあらかじめ格納されている。
各溶離液は、定量ポンプ２０ｂにより圧送され、バルブ
２４ｂのポートを通過した後、１０ポートの多岐管２８
ｂに接続された１０本の分岐流路３０ｂ、３０ｂ…にそ
れぞれ格納される。

【００４４】なお、本実施形態では、多岐管２８ｂ、分
岐流路３０ｂ、３０ｂ…として前述の前段分離部におけ
る多岐管２８ａ、分岐流路３０ａ、３０ａ…と同様のも
のを用いており、内径０．２５ｍｍ、長さ２００ｍｍ、
容量１０μｌのＰＥＥＫ管で形成された、所定量の各溶
離液を格納する１０本の分岐流路を用いている。分岐流
路の数及び形状等は特に限定されず、分析目的に応じて
適宜選択される。

【００４５】ここで、バルブ２４ｂのポート２６ｂの開
閉切り換えによって、各分岐流路３０ｂ、３０ｂ…に対
して、シリンジ２２ｂから直接溶離液を充填できるよう
にしてもよい。これにより、配管をその都度調整して溶
離液の交換又は補充を行う手間が解消される。

【００４６】ロータリー型のバルブ３２ｂは、各分岐流
路３０ｂ、３０ｂ…に一時格納された各溶離液を選択す
るための手段として機能し、所定のポート３４ｂを順次
開放することによって所望の各溶離液を、順次後続のカ
ラム側に向けて流すことができる。なお、バルブ３２ｂ
の出口部分には、図示しないコントローラが接続されて
おり、コンピュータ５４（制御部）からの電気信号によ
り、バルブ位置の選択を制御している。

【００４７】ここで、前記分岐流路に対する各溶離液の
充填を、コンピュータ５４による自動制御で行うように
してもよい。具体的には、各分岐流路３０ｂ、３０ｂ…
に対して、所定組成の各溶離液を自動調合作成し、順次
自動で各分岐流路３０ｂ、３０ｂ…に送液及び格納する
ようにする。この手段を採用すると、溶離液の充填精度
を高めることができるので、分析精度を向上させること
が可能となる。

【００４８】分岐流路３０ｂ、３０ｂ…中に所定量格納
された各溶離液は、その所定量ごとに順次逆相カラム５
０へ連続的に導入される。すなわち、１０本の分岐流路
に格納された１０種類の溶出強度が異なる各溶離液によ
って、１０段階の溶出強度勾配を有する一連の溶離液と
して逆相カラム５０へ導入され、グラジエント分離が行
われる。そして、溶離液と共に逆相カラム５０へ導入さ
れた前記各分離成分ごとに、前記各溶離液の溶出強度に
基づいてさらに各成分に分離される。

【００４９】逆相分離用の溶離液としては揮発性の酸を
含む逆相系の溶媒が好適に用いられ、試料や逆相カラム
の性質等により適宜調整される。

【００５０】また、溶離液格納手段を用いた上述の送液
システムを用いれば、前段における送液システムと同様
にｎｌ／ｍｉｎオーダーの溶離液流量で送液することが
可能である。通常の高速液体クロマトグラフ装置の構成
ではこのような極低流量での安定した送液は不可能であ
り、本発明において好適に適用される。

【００５１】特に、後段分離部でこのようなｎｌ／ｍｉ
ｎオーダーの極低流量での送液を行うことにより、後段
分離部通過後の各分離成分を前記回帰部で採取する際
に、溶離液による希釈を極力抑えて高濃度での採取が可
能となり、一方で後段分離部に直結された質量分析部で
の測定精度が改善されることにより、高分離能、高精度
での測定が可能となる。特に５００ｎｌ／ｍｉｎ以下の
溶離液流量で後段における分離を行う場合には該システ
ムが用いられる。

【００５２】このようにして２段階の分離により前記試
料中の各成分ごとにまで分離されたら、後段分離部に直
結する質量分析器５２（質量分析部）により各成分の定
性、定量分析が行われる。しかし、２段階の分離を経た
後に各成分にまで分離されていない分離成分が残存する
場合には、質量分析器５２で分析を行う前に、該分離成
分を採取し、前述の回帰部４８を経由して前記前段分離
部へ再び試料として導入し、前段分離部−脱塩部−後段
分離部を通して分離を行う一連の分離操作を複数回繰り
返すことも可能である。

【００５３】すなわち、回帰部４８により前段分離部へ
再び試料として導入された前記分離成分は、イオン交換
カラム３８でさらに各成分へ分離される。この際、前述
したあらかじめ１０本の分岐流路３０ａ、３０ａ…に格
納されている１０種類の各溶離液の内、最初の分離操作
ですでに消費されている溶離液以外の９種類の溶離液の
内から選択された１種類、一定組成の溶離液を用いて分
離を行う。また、さらに回帰部４８を通して繰り返し一
連の分離操作を行う場合には、消費されていない各溶離
液から選択された１種類の溶離液を用いて分離を行う。
このように、各一連の分離操作ごとにイオン強度が異な
る溶離液を用いてイオン交換分離を行うことで効果的な
分離が可能となる。

【００５４】なお、本実施形態においてもバルブ４６及
びその他の各バルブの切換等一連の測定操作はコンピュ
ータ５４（制御部）により制御されており、前段分離部
における溶離液、脱塩部における洗浄液及び後段分離部
における溶離液の流路を適切に分離が行われるよう自動
的に切り替えられるように制御されているので、高分離
能での分析が連続的、自動的に行われる。

【００５５】蛋白質分析装置 以下、上記の実施形態にかかる２次元高速液体クロマト
グラフ装置を用いた蛋白質分析について説明する。蛋白
質分析を行う場合には、分析対象である蛋白質を含む混
合物について、あらかじめ酵素による消化処理で該蛋白
質を多数のペプチドに分解したものを試料として用い
る。

【００５６】前段分離部１２に導入された試料は、主に
イオン性に基づきある程度の分離が行われる。しかし、
試料は様々なペプチドを含んでおり、各分離成分は単一
のペプチドまでには分離されず、複数のペプチド成分を
含んでいる。そこで、脱塩部１４を通して後段分離部１
６で逆相分離を行い更に前記各分離成分ごとに２段階目
の分離を行う。

【００５７】このようにして、２段階の分離により試料
中の測定対象である各ペプチド成分ごとにまで分離され
た後、直結された質量分析計５２において各ペプチド成
分のアミノ酸配列の同定が行われる。

【００５８】なお、２段階の分離を経た後に各ペプチド
成分にまで分離されていない分離成分が残存する場合に
は、前述のように質量分析器５２で分析を行う前に、該
分離成分を前記回帰部を経由して前記前段分離部へ再び
試料として導入し、前段分離部−脱塩部−後段分離部を
通した一連の分離操作を複数回繰り返すことも可能であ
る。

【００５９】質量分析により同定されたペプチド断片の
アミノ酸配列は、各アミノ酸と遺伝子コードとの相関か
ら遺伝子コード配列へ翻訳される。さらに、すでに配列
がわかっている染色体の全遺伝子コード配列中の、前記
配列に該当する部分が同定され、当該配列部分の周囲の
配列から前記ペプチド断片を構成成分とする、試料中の
特定蛋白質の存在及びそのアミノ酸配列が明らかにな
る。

【００６０】

【実施例】人体中の血清アルブミン（ＨＳＡ）のトリプ
シン分解物（８０ｐｍｏｌ）を注入した２次元ＭＳ−Ｔ
ＩＣクロマトグラムを測定した。前段分離部の分離手段
としてイオン交換カラム（Ｂｉｏａｓｓｉｓｔ Ｑ：内
径１ｍｍ、３５ｍｍＬ、流量１００μｌ／ｍｉｎ）を、
後段分離部の分離手段として逆相カラム（Ｍｉｇｈｔｙ
ｓｉｌＲＰ−１８ ＧＰ ３μｍ：内径３２０μｍ、１
００ｍｍＬ、流量５μｌ／ｍｉｎ）を使用した。また、
脱塩部として、小型のトラップカラム（Ｍｉｇｈｔｙｓ
ｉｌＲＰ−１８ ＧＰ １５μｍ：内径０．５ｍｍ、
２．０ｍｍＬ）を２本の分離カラムの間に挿入し、１％
ぎ酸水溶液で洗浄後に試料を逆相カラムで分離し、質量
分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ）に導入した。

【００６１】なお、イオン交換カラムに導入する溶離液
として、Ａ液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．
０）及びＢ液（０．４Ｍ ＮａＣｌ）の混合液１０種類
（０，５，１０，１５，２０，２５，３０，４０，５
０，１００％Ｂ液）を調整した。これら１０種類の混合
液を用いて、前記回帰部を経由した一連の分離操作を、
イオン強度が順次高くなる順に各一連の分離操作ごとに
１種類の混合液を送液して前段での分離を行った。

【００６２】また、逆相カラムに導入する溶離液として
は、Ｃ液（０．２％ギ酸水溶液）及びＤ液（０．２％ギ
酸アセトニトリル水溶液）の混合液を用い、Ｃ液／Ｄ
液：９５／５〜６０／４０（３０分）、Ｃ液／Ｄ液：６
０／４０〜４０／６０（１０分）を１サイクルとして前
記各一連の分離操作ごとにグラジエント分離を行った。

【００６３】図３にその測定結果を示した。測定操作は
再現的に作動し、逆相カラムに吸着しない低分子ペプチ
ドを除く全てのＨＳＡフラグメントを自動的に分離、同
定できた。

【００６４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の２次元高
速液体クロマトグラフ装置によれば、前段と後段で試料
に対する分離特性がそれぞれ異なる分離部を設けたこと
により、高分離能での分析が可能になる。また、各分離
部の間に脱塩部を設けることとしたので、各分離部を連
結して測定することが可能であり、質量分析部との連結
も可能となる。また、回帰部を設け、質量分析を行う前
に一連の分離操作を複数回繰り返すことにより、さらに
高分離能での分析が可能になる。また、各分離部におけ
る溶離液及び脱塩部における洗浄液の流路を適切に分離
が行われるよう自動的に切り替えられるように制御する
制御部を設けることとしたので、高分離能での分析を連
続的、自動的に行うことが可能となる。また、分離部に
溶離液格納手段及び溶離液選択手段を設けることで、ｎ
ｌ／ｍｉｎオーダーの極低流量での送液が可能となり、
高分離能での分析が可能になる。また、本発明の２次元
高速液体クロマトグラフ装置を用いて蛋白質分析を行う
ことにより、複雑なペプチド混合物についてペプチドの
アミノ酸配列同定が自動的かつ高精度で可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の１実施形態にかかる２次元高速液体ク
ロマトグラフ装置の概略説明図である。

【図２】本発明の他の実施形態にかかる２次元高速液体
クロマトグラフ装置の概略説明図である。

【図３】実施例において測定した２次元ＭＳ−ＴＩＣク
ロマトグラムである。

【符号の説明】

１０…２次元高速液体クロマトグラフ装置；１２…前段
分離部；１４…脱塩部；１６…後段分離部；２０ａ、２
０ｂ…送液ポンプ；２１ａ、２１ｂ…ミキサー；２２
ａ、２２ｂ…シリンジ；２４ａ、２４ｂ…バルブ；２６
ａ、２６ｂ…ポート；２８ａ、２８ｂ…多岐管；３０
ａ、３０ｂ…分岐流路；３２ａ、３２ｂ…バルブ；３４
ａ、３４ｂ…ポート；３６…インジェクタ；３８…イオ
ン交換カラム；４０…送液ポンプ；４２…３方ティ；４
４…トラップカラム；４６…バルブ；４８…回帰部；５
０…逆相カラム；５２…質量分析計；５４…コンピュー
タ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/72 Ｇ０１Ｎ 30/72 Ｃ 30/88 30/88 Ｊ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶離液及び試料をカラムに導入し、カラ
   ムにおいて分離された試料中の各成分を検出する高速液
   体クロマトグラフ装置において、 ２００μｌ／ｍｉｎ以下の定量で溶離液を送液する前段
   送液手段と、 試料の分離を行う分離手段と、を備えた前段分離部と、 前記前段分離部で分離された各分離成分をトラップする
   カラムを備え、該カラムに洗浄液を流して前記各分離成
   分について脱塩処理を行う脱塩部と、 １００μｌ／ｍｉｎ以下の定量で溶離液を送液する後段
   送液手段と、 試料の分離を行う分離手段と、を備え、前記脱塩部で脱
   塩処理された各分離成分ごとに、さらに分離を行う後段
   分離部と、 前記後段分離部と直結された質量分析部と、 前記各分離部で用いる溶離液及び前記脱塩部で用いる洗
   浄液の流路の切り換えを制御する制御部と、を備えたこ
   とを特徴とする２次元高速液体クロマトグラフ装置。
2. 【請求項２】 請求項１記載の装置において、前記前段
   分離部で試料を各分離成分に分離し、前記脱塩部で脱塩
   処理を行い、前記後段分離部で前記各分離成分について
   さらに分離を行う一連の分離操作を繰り返し行うため
   に、前記後段分離部を通した各分離成分を採取し前記前
   段分離部へ導入する回帰部を備えたことを特徴とする２
   次元高速液体クロマトグラフ装置。
3. 【請求項３】 請求項２記載の装置において、前記前段
   分離部では分離手段としてイオン交換カラムを用い、 前記後段分離部では分離手段として逆相カラムを用い、 前記一連の分離操作の繰り返しごとに、前記前段分離部
   の溶離液として、該繰り返しごとにイオン強度が異なる
   一定組成の溶離液を用いて分離を行い、 前記後段分離部の溶離液として、溶出強度がそれぞれ異
   なる、揮発性の酸を含む逆相系の各溶離液を用い、溶出
   強度勾配を有する一連の溶離液として逆相カラムへ送液
   してグラジエント分離を行うことを特徴とする２次元高
   速液体クロマトグラフ装置。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の装置に
   おいて、後段分離部、又は前段及び後段分離部に、組成
   の異なる各溶離液を別個に所定量格納する溶離液格納手
   段と、 前記溶離液格納手段に格納された各溶離液を選択し、カ
   ラム側に前記所定量の選択された溶離液を送液する溶離
   液選択手段と、 を備え、前記後段分離部の溶離液流量が５００ｎｌ／ｍ
   ｉｎ以下であることを特徴とする２次元高速液体クロマ
   トグラフ装置。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の装置を
   用い、 あらかじめ分析対象の蛋白質をペプチドに分解する前処
   理を行った、該ペプチドを含む混合物を試料として用
   い、 前記各分離部での分離により前記混合物から各ペプチド
   を分離し、 前記質量分析部で該分離されたペプチドについて質量分
   析を行い、該ペプチドのアミノ酸配列を同定することを
   特徴とする蛋白質分析装置。