JP2002543387A - 質量分析を用いるオーファン受容体のリガンドの同定 - Google Patents

質量分析を用いるオーファン受容体のリガンドの同定

Info

Publication number
JP2002543387A
JP2002543387A JP2000614042A JP2000614042A JP2002543387A JP 2002543387 A JP2002543387 A JP 2002543387A JP 2000614042 A JP2000614042 A JP 2000614042A JP 2000614042 A JP2000614042 A JP 2000614042A JP 2002543387 A JP2002543387 A JP 2002543387A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
affinity
type
analyte
mass spectrometer
column
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000614042A
Other languages
English (en)
Inventor
デル グリーフ、ヤン ファン
イルス、フベルタス
Original Assignee
スクリーン テク ベスローテン フェンノートシャップ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by スクリーン テク ベスローテン フェンノートシャップ filed Critical スクリーン テク ベスローテン フェンノートシャップ
Publication of JP2002543387A publication Critical patent/JP2002543387A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/468—Flow patterns using more than one column involving switching between different column configurations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/84—Preparation of the fraction to be distributed
    • G01N2030/8429—Preparation of the fraction to be distributed adding modificating material
    • G01N2030/8435—Preparation of the fraction to be distributed adding modificating material for chemical reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オーファンアナライト、すなわち既知リガンドを持たない親和性分子の検出のための、連続流分離法への質量分析（ＭＳ）のオンライン連結に関する。さらなる実施態様において、本オンライン検出方法は、未知リガンドを有するアッセイのためのスクリーニング法として使用される。さらに、本発明は、この方法により検出される化合物、および親和性分子に対するリガンドとしてのこのような化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、「オーファン」アナライト、すなわち既知リガンドを持たない親和
性分子の検出のための、連続流分離法への質量分析（ＭＳ）のオンライン連結に
関する。さらなる実施態様において、本オンライン検出方法は、未知リガンドを
有するアッセイのためのスクリーニング法として使用することができる。さらに
、本発明は、この方法により検出される化合物、および親和性分子に対するリガ
ンドとしてのこのような化合物の使用に関する。
【０００２】 近年、連続流生化学的検出に基づく一連の生化学的アッセイが開発されている
。典型的には、不均一または均一生化学的検出方策を使用して、高感度の、通常
蛍光標識したレポーター分子の濃度を測定することにより、リガンドと親和性タ
ンパク質との親和性相互作用が監視されている。しかし「オーファン」受容体、
すなわちこれまでその「親和性」リガンドが見つかっていない受容体を扱う時は
、親和性リガンドのいわゆる「非標識検出」を可能にする新しい方策を開発する
必要がある。レポーター分子とともに試料から非結合アナライトを同時溶出する
ことを可能にする、標識に基づくアッセイと比較して、オーファン受容体の非標
識アッセイは、結合リガンドと非結合リガンドの厳密な分離が要求される。
【０００３】 システムの生化学的部分においてアクセス制限カラムと中空繊維モジュールを
形成することにより、複雑な生物マトリックスから親和性リガンドを単離するこ
とができる。次に、生化学的構成を質量分析に連結することにより、オーファン
親和性分子に対する親和性を示すリガンドのオンライン検出が可能になる。
【０００４】 先行技術から、生化学的アッセイは、生物特異的相互作用の選択性を、レポー
ター分子として使用される標識物の高感度検出と組合せた、高感度検出法である
ことは知られている。 このような技術の一例は、ＷＯ９１／１３３５４に記載されている。この文献
は、親和性分子に対して特異的な抗体が支持体に固定化されている、フロー免疫
センサーを記載している。抗体の結合部位は、標識型の既知リガンドで飽和され
ている。分析すべき液体を抗体と接触させると、その液体中に存在する親和性分
子が標識抗原と置き換わることができる。最後に、置換された標識抗原を検出す
る。
【０００５】 しかしさらに、生化学的アッセイには交差反応性（抗体が２つ以上のアナライ
トと反応することを意味する）という問題があることも知られている。このため
誤った結果が得られる。このため生化学的アッセイは、しばしば分画工程、例え
ば、ＨＰＬＣまたは別の型の液体クロマトグラフィーを用いる分離工程と組合せ
られる。
【０００６】 本発明が関係する分野において、分画工程と生化学的アッセイ検出システムと
のオンライン連結に対するニーズが存在する。連続流生化学的アッセイを実施す
るために、いくつかのアプローチが提案および記載されている。このような生化
学的アッセイの多くは、逐次添加型の生化学的アッセイに基づくポストカラム（
postcolumn）反応検出システムの形式である。
【０００７】 キャシディー（Cassidy）ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４（１９９２），１９
７３−１９７７は、１分未満でアルブミンおよびトランスフェリンに関する免疫
測定法を実施する、抗体、試料およびプロテインＡカラム上の標識の逐次添加に
基づく、動力学的に制御された免疫測定法を開示している。
【０００８】 ニルソン（Nilson）ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５９７（１９９
２），３８３−３８９は、酵素標識抗体を伴う連続流競合アッセイを記載してい
る。記載されるシステムは、活性の監視が可能になるようにサイズ排除カラムに
連結された。
【０００９】 逐次的であるこれらの先行技術は、分画流出液の連続監視が可能ではないため
、液体クロマトグラフィーまたは他の分画システムへのオンライン連結には適し
ていない。
【００１０】 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８（１９９６），４２２６−
４２３６中の論文において、ネドベド（Nedved）らは、ベンゾジアゼピン類を性
状解析するための方法を記載している。この方法は、タンパク質−６−カラム上
の抗体に対するベンゾジアゼピンの結合を包含する。形成される複合体は、ｐＨ
ステップを使用して溶出される。ベンゾジアゼピンは、アクセス制限（ＲＡ）カ
ラムを使用して、抗体から分離され、ベンゾジアゼピンがカラム物質中に残る。
この３つの工程（これらは、連続的プロセスで使用することはできない）後、ベ
ンゾジアゼピンは、ＲＡカラムから溶出され、検出のために質量分析計に移され
る。
【００１１】 シーゲル（SIegel）らは、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ．３３（１９９８），
２６４−２７３において、プロテアーゼとインヒビターを含有する試料を１時間
インキュベートし、次に試料を分子量による分離に付す方法を記載している。
【００１２】 Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ
ｏｍｅｔｒｙ １１（１９９７）、１１７８−１１８４でヅナエフスキー（Duna
yevskiy）らが記載した方法も、連続オンライン検出法に適していない。この方
法は、非結合成分を捕捉しタンパク質性物質を通過させるのにゲル濾過カラムを
必要とする。
【００１３】 Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．１（１９９９），８２−９０で
ブロム（Blom）らは、タンパク質／リガンド複合体と非結合リガンドの混合物を
サイズ排除カラムで分離し、ここで複合体をタンパク質トラップに捕捉した方法
を記載している。複合体は、勾配ＬＣポンプを使用してこのトラップから溶出さ
れる。流出液は、ＭＳに導かれる。
【００１４】 ゲル濾過スピンカラムを使用して非結合酵素からペプチド−酵素複合体を分離
し、次にＣ18カートリッジを使用してオンライン濃縮し、ＭＳに注入する、Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５８（１９９８）、１９−３
０でフイヤー（Huyer）らが記載した連続オンライン法も、適していない。
【００１５】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ６３３（１９９３）
，６５−７２におけるイルス（Irth）らの論文、ならびにＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．
６６（１９９４），４２９５−４３０１、およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ６５３（１９９４），５５−６１におけるウースター
カンプ（Oosterkamp）らの論文に、ジゴキシゲニンおよびその代謝物のオンライ
ン検出のための方法が記載されている。このオンライン検出プロセスは、ジゴキ
シゲニンとその代謝物を含む試料の直接注入、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）
分画分離工程、ＬＣカラムの流出液とジゴキシゲニンに対するフルオレセイン標
識抗体との混合、抗原結合支持体を充填した小カラムの通過による混合物からの
遊離標識抗体の除去、および強蛍光性生化学的複合体の検出を含む。 記載されているジゴキシゲニンシステムは、抗体と、分析用カラムから溶出す
る抗原との結合反応に基づく。フルオレセイン標識抗体の使用により、ナノモル
範囲の検出限界が得られる。
【００１６】 この先行技術のアッセイは、不均一検出システムである。これは、遊離標識物
と結合標識物との分離工程を必要とする。遊離／結合標識物分離法の例には、ア
クセス制限相および中空繊維モジュールがある。
【００１７】 前述の先行技術のアッセイにおける生化学的試薬は、免疫精製され、かつ市販
されている抗ジゴキシゲニン抗体のフルオレセイン標識断片よりなる。しかし精
製された標識抗体が市販されていることは例外的である。ほとんど全ての場合に
、抗体は、粗精製抗血清で未標識状態でのみ利用可能である。抗体（または他の
親和性タンパク質）の標識および精製スキームは当業者に公知であるが、市販さ
れている抗血清を前処理なしに使用することが好ましい。
【００１８】 フシエ（Hsieh）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１９９
６），１８９−１９６）は、質量分析と連結したクロマトグラフィーを用いるス
クリーニング方法を記載している。これらの方法は、２回の測定（最初は標的タ
ンパク質のライブラリー無しで、次にこのようなライブラリー有りで）を必要と
する。これは、バックグラウンド化合物、特に質量スペクトルの広い範囲にわた
って大きなバックグラウンドシグナルを引き起こす親和性タンパク質が、この型
の測定法には常に存在し、そしてこれが、本法の効率、選択性および融通性を大
きく限定していることを意味する。
【００１９】 カウア（Kaur）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ １６，Ｎｏ ５（１９９７））は、コンビナトリアルライブラリーにおけ
る活性成分が、受容体に結合し、サイズ排除クロマトグラフィーにより単離され
てカラムに捕捉され、次に脱着溶媒を使用して親和性タンパク質／リガンド複合
体を解離する方法を記載している。続いて質量分析により同定が行われるが、こ
れは親和性タンパク質のバックグラウンドを伴う。 従ってフシエ（Hsieh）およびカウア（Kaur）が記載した方法は、存在する親
和性タンパク質の質量分析計における大きなバックグラウンドシグナルにより妨
害される。
【００２０】 本発明の利点の１つは、ＭＳ中のタンパク質バックグランド無しで未知のリガ
ンドを検出する可能性を提供することである。特に低濃度については、これは測
定法の成功のために必要である。 本発明の１つの目的は、既知リガンドを使用する必要の無い技術を提供するこ
とにより、既知の測定法に対する改良を提供することである。
【００２１】 上記問題は、分画工程の流出液の質量分析計（ＭＳ）へのオンライン連結を特
徴とするオンライン検出法を提供することにより克服され、この方法は、制御量
の親和性分子（例えば、親和性タンパク質）を分画工程の流出液に加え、こうし
て親和性分子が流出液中のアナライトに結合し、次にアクセス制限支持体を使用
して分離工程を行い、こうしてアナライト−親和性分子複合体が透過し、次に適
当な解離工程によりアナライト−親和性分子複合体を解離させ、次に第２の分離
工程で、解離したアナライトと親和性分子を分離し、次に質量分析計を用いてア
ナライトを検出することからなる。
【００２２】 第１のアクセス制限カラムの使用は、より小さい分子を保持しながらアナライ
ト−親和性分子の透過を提供する。 解離工程は、複合体を解離させる。流出液から親和性分子を逐次分離して、ア
ナライトをＭＳに向ける。 特に、検出されるアナライトの適切な親和性分子（この親和性分子は、親和性
タンパク質でもよい）は、液体クロマトグラフィーまたは毛細管電気泳動カラム
の流出液に加えて、カラムから溶出するアナライトと反応させる。
【００２３】 第２の分離工程は、アクセス制限支持体または中空繊維支持体を使用して行わ
れる。 第２の分離ＲＴ−ＰＣＲでアクセス制限支持体を使用するとき、親和性分子は
保持され、次に適切な担体流を使用してアクセス制限支持体から親和性分子を溶
出し、溶出流を質量分析計に向ける。親和性分子の溶出前に、洗浄工程を行って
、アクセス制限カラムから解離溶媒と受容体タンパク質を除去する。擬陽性を防
止するために、溶媒のような化合物の濃度に関して、第２のアクセス制限カラム
の条件が、実質的に一定であり、かつ第１のアクセス制限カラムと実質的に同じ
であることが重要である。
【００２４】 第２の分離工程で中空繊維支持体を使用する時、リガンドは透過され、透過物
は質量分析計に向けられる。 好ましくは解離工程は、低ｐＨショック（例えば、ｐＨが２．５未満の塩酸溶
液の注入）、高イオン強度溶液との接触、有機溶媒との接触および／またはカオ
トロピック試薬との接触である。
【００２５】 本発明の分画工程は、液体クロマトグラフィー分離、毛細管電気泳動工程また
はコンビナトリアル化学システムであってよく、この後に、随時分離工程を行っ
て高分子量バックグラウンドを除去してもよい。
【００２６】 好ましい液体クロマトグラフィー分画工程は、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、毛細
管電気泳動（ＣＥ）、毛細管通電クロマトグラフィー（ＣＥＣ）、等電点電気泳
動（ＩＥＦ）またはミセル動力学的クロマトグラフィー（micellar electrokine
tic chromatography）（ＭＥＫＣ）を含むが、これらの全ての方法は、当業者に
公知である。
【００２７】 当該分野において公知のすべてのＭＳオプションを使用することができる。好
ましくはＭＳは、電子スプレーイオン化型、大気圧イオン化型、四重極型、磁気
セクター型、飛行時間型、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳn、ＦＴＭＳ型、イオン捕捉型およ
びこれらの組合せ型のものである。
【００２８】 本発明は、オーファン受容体のリガンドの検出を可能にする。従って本発明は
、上記方法で見いだされるそのような新しいリガンド、ならびにオーファン受容
体のためのリガンドとしてのこれらのリガンドの使用に関する。
【００２９】 本発明の分画工程とＭＳ検出工程との組合せは、両方の技術の性能を大きく増
強する。この組合せ技術は、高選択性と高感度を特徴とする分析法を提供する。
さらに、交差反応性に関連する問題は、本発明の方法を用いるときには発生しな
い。
【００３０】 本発明の方法は、受容体のような生物親和性分子を使用して、該親和性分子の
リガンド結合部位に対して高い親和性を示す任意の化合物を検出する。検出すべ
き化合物は、生化学的化合物でもよいが、これらに制限されない。
【００３１】 薬物発見で使用される高処理量スクリーニングシステムは、例えば、以下の工
程からなる。例えば、上流のコンビナトリアル化学システムにより生成する複合
試料を、例えば、固相抽出法または電気泳動的試料取り扱い原理を用いて、極性
が類似した化合物を含む画分に前分画する。各画分は、例えば、分析用または分
取用規模の液体クロマトグラフィー分離カラムを用いて、さらに分離してもよい
。該ＬＣカラムから溶出する化合物は、適切な親和性分子検出法を用いてオンラ
イン検出する。分取用規模の分離カラムを適用する場合、一般にポストカラム分
流が作られる。２つの流れのうちの一方は、親和性分子検出法を用いる検出に付
し、もう一方の流れは、フラクションコレクターに向ける。親和性分子検出器か
ら得られるシグナルに依存して、陽性応答を引き起こす化合物を含む画分を回収
し、一方陰性応答を引き起こす画分は廃棄する。この完全なスクリーニング方法
は、既知のバルブ−スイッチングプロセスを用いて自動化することができる。
【００３２】 本発明の方法において使用される適切な分画法は、液体クロマトグラフィー分
画または毛細管電気泳動工程を含む。しかし当業者に公知でありかつ比較的連続
した出力流を与える、他の分離または分画法も、同様に使用することができる。 好適な実施態様において、液体クロマトグラフィー分離工程は、逆相ＨＰＬＣ
工程である。
【００３３】 本発明では、異なる化合物の混合物が注入されるフロー注入工程（場合により
、次に例えばアクセス制限カラムを用いる捕捉工程が続く）の流出液も、分画工
程の流出液として考えるべきであることを理解されたい。次に本発明の方法の分
離工程は、目的の化合物が分離工程により分画して分画を実現する。必要な選択
性は、ＭＳのＭＳ選択的トレーシングを実施することにより得ることができる。
【００３４】 フロー注入法は、融通性があり迅速なスクリーニング法を提供するため、本発
明の好適な実施態様である。 フロー注入様式ではＭＳ−操作の全ての様式が可能であるが、高いバックグラ
ウンドのため、特に選択した単数ｍ／ｚトレースまたは選択した複数ｍ／ｚトレ
ースのイオンを検出することを特徴とする非常に選択的な様式が適しており、従
って好ましい。
【００３５】 アクセス制限支持体は、当業者に周知である。一般に、Ｃ18−シリカ充填カラ
ム（例えば、メルク（Merck）製のリクロスファー（Lichrospher）（登録商標）
Ｃ１８ ＡＤＳ）のようなアクセス制限支持体は、大きな分子を透過させながら
、サイズのより小さい分子を保持することができるであろう。アクセス制限支持
体の型およびこれが操作される条件は、測定法の型に依存する。当業者は、通常
の実験を行って、各場合の最適条件と物質を確立することができるであろう。
【００３６】 例えば、ポリスルホン（アミコン（Amicon）（アイルランド）から入手可能）
から作られる中空繊維材料は、当業者には周知である。一般に、中空繊維モジュ
ールは、大きな分子を保持しながら、サイズのより小さい分子を透過することが
できる。中空繊維支持体の型およびこれが操作される条件も、測定法の型に依存
するであろう。当業者は、通常の実験を行って、各場合の最適条件と物質を確立
することができるであろう。
【００３７】 前述したように、分画工程は、液体クロマトグラフィー分離、毛細管電気泳動
工程またはコンビナトリアル化学システムであってよい。この分画工程に続いて
、例えば、中空繊維モジュールを用いて分離工程を行うと高分子量バックグラウ
ンドを除去できるため、非常に有利であることが見い出された。好ましい液体ク
ロマトグラフィー分画工程は、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ＣＥ、ＣＥＣ、ＩＥＦ
またはＭＥＫＣを含むが、これらの全ての方法は、当業者に公知である。
【００３８】 当該分野において公知のＭＳ法における全ての可能な変法は、本発明の利益を
受けるであろう。好ましくはＭＳは、電子スプレーイオン化型、大気圧イオン化
型、四重極(QQQ)型、磁気セクター型、飛行時間型、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳn、ＦＴＭ
Ｓ型、イオン捕捉型およびこれらの組合せ型のものである。
【００３９】 例えば、化合物を追跡するための走査様式では、全ての可能な機器設計のＭＳ
による低分解能ＭＳ、特に四重極、磁気セクター、飛行時間、ＦＴＭＳおよびイ
オン捕捉を使用することができる。これによって、典型的には公称の質量正確度
で分子量データが得られる。
【００４０】 全ての可能な高分解能機器設計を使用して高分解能ＭＳ（特に磁気セクター、
飛行時間、ＦＴＭＳおよびイオン捕捉）を適用するとき、高い質量正確度を持つ
分子量データは、化合物の元素組成と組合せて得ることができる。
【００４１】 他の公知のＭＳ法は、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳn（例えばＭＳ3）のようなタンデ
ムＭＳを含む。これらの方法を適用することにより、本発明の好適な実施態様で
あるリガンドの構造情報を集めることができる。走査様式におけるデータは、観
測される各ピークについて自動的にタンデムＭＳ測定が行われることを意味する
、データ依存性様式で獲得することができる。これに加えて、タンデムＭＳ測定
において誘導される断片化は、さらに洗練された操作法（例えば、広帯域励起）
と連結することができ、そしてこれがまた、天然物スクリーニングにおける［プ
ロトン化分子−Ｈ2Ｏ］+ピークのような、あまり重要でない目的断片を断片化す
る。
【００４２】 ＭＳはまた、高度に選択的な検出に使用可能な、単数／複数イオン監視様式に
おいて操作することができる。
【００４３】 単数／複数イオン監視様式は、高度に選択的な検出のために使用することがで
きる。全ての可能な低分解能機器設計を有する低分解能ＭＳ（特に四重極、磁気
セクター、飛行時間、ＦＴＭＳおよびイオン捕捉）を、単数／複数イオン監視様
式において使用すると、前もって測定されたｍ／ｚトレースの監視に基づく選択
的な検出が得られる。高分解能ＭＳを適用すると、ＭＳの全ての可能な機器設計
（特に四重極、磁気センサー、飛行時間、ＦＴＭＳおよびイオン捕捉）を使用す
ることができる。これにより典型的には、高分解能で前もって測定されたｍ／ｚ
トレースの監視に基づく非常に選択的な検出が可能になる。タンデムＭＳを適用
すると、全ての可能な機器設計（特にイオン捕捉、四重極−飛行時間（Ｑ−ＴＯ
Ｆ）、ＦＴＭＳ、および四重極およびイオン捕捉とのセクター機器の組合せ）を
使用することができる。これにより、ＭＳ／ＭＳおよび／またはＭＳn測定にお
いて生じるピークの監視に基づく非常に選択的な検出が可能になる。
【００４４】 本発明のリガンド測定法は、高分子量バックグラウンドを除去するための分離
工程（例えば中空繊維工程による）後のＨＰＬＣ流出液の連続監視に基づいてい
る。ＭＳは、典型的には単数／複数イオン様式オプションの一方で操作するよう
に設定される。
【００４５】 本発明の測定法により、複雑な溶液（例えば生物学的流体または抽出物、天然
物抽出物、バイオテクノロジープロセスからの溶液または抽出物、コンビナトリ
アル技術およびプロセスのような化学実験から生じる溶液または抽出物など）に
おいて（生物）活性化合物を、高い効率、選択性および融通性で追跡することが
できる。さらに本発明は、バックグラウンド化合物の妨害を限定する可能性を提
供する。 本発明はさらに、従来の質量スペクトル、高分解能データまたはＭＳnに基づ
くスペクトルに基づく化合物の同定を可能にする。
【００４６】 本発明の方法により、種々の質量分析実験に基づくライブラリー検索を実施す
ることも可能であり、これにより化合物を完全に同定する必要なく、多量の試料
をスクリーニングし、かつこれらを同様な活性の化合物に基づき分類することが
できる。
【００４７】 本発明のアッセイ方法は、アッセイに基づくシステムの小型化形式、例えば、
チップ技術に基づくスクリーニングシステムに適用することができる。 本発明の方法において、他の分子と相互作用できるか、または結合できる全て
の分子を親和性分子として使用することができる。
【００４８】 本発明の方法において使用されるオンライン連結は、カラム外の広帯域化を最
小にするために、短い反応時間が必要である。このことは、時間というよりも分
のオーダーで反応時間を有する親和性分子−リガンド相互作用を考慮すべきであ
ることを意味する。適切な結合条件は、親和性分子とアナライトの間に最適な結
合を与える条件である。温度、保持時間、化学組成のような正確な条件は、測定
法の型およびそこで使用されるタンパク質に大きく依存することは、理解される
であろう。
【００４９】 以下の例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。
【００５０】 例１ アクセス制限分離 リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）担体相溶液（ＰＢＳ）、親和性タンパク質
溶液、解離溶液および脱着溶液は、クナウア（Knauer）ミニスターポンプで供給
した。流水洗浄溶液は、ミニパルス（Minipuls）３ペリスタポンプを使用して加
えた。レオダイン（Rheodyne）六口弁を使用して、流水洗浄溶液とカラムを切り
替えるようにした。ループ注入（注入容量５μl）を行うために、第３のレイオ
ダイン注入弁を使用した。担体相はＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）からなり、これ
を４０μl／分の流速でポンプで供給した。ＰＢＳ中のジゴキシゲニンＦab断片
の溶液（５μＭ）を８０μl／分で担体相に加えた。対照実験の時にＦab断片を
、ＰＢＳまたは２μＭのヤギ抗ビオチンを含有するＰＢＳ溶液と切り替えた。解
離溶液は、１Ｍ塩酸からなり、これは２６０μl／分で加えた。脱着緩衝液は、
８０％のＭｅＯＨと２mMの酢酸アンモニウムから構成された。洗浄溶液は、５％
イソプロパノール／２mM酢酸アンモニウムからなり、３００μl／分で捕捉後第
２のカラムを１分間流水洗浄するのに使用した。第１および第２のアクセス制限
カラムの大きさは、それぞれ４×１５mmと２×１０mmであった。使用したＲＡ物
質は、リクロスファー（Lichrospher）Ｃ１８ ＡＤＳ（登録商標）（メルク（M
erck））である。反応は、堅く結合した開管式のテフロン（登録商標）反応コイ ル（０．５mmＩＤ）中で、第１と第２の生化学的反応についてそれぞれ３０秒と ３０秒の反応時間を使用して行った。検出は、フィニガン（Finnigan）ＬＣＱ質 量分析計で行った。
【００５１】 担体相に注入後、ジゴキシンを、抗ジゴキシゲニンＦab断片と３０秒反応させ
た。反応後、Ｆab結合ジゴキシンは、第１のアクセス制限カラムを通過すること
ができ、一方過剰の非結合分子は第１のＲＡカラム上に捕捉された。第１のＲＡ
カラムを通過後、親和性複合体は、塩酸を使用してｐＨショックにより解離させ
た。再度混合物を３０秒反応させ、次にリガンドを第２のＲＡカラムに捕捉する
ことができた。注入の３分後、第２のＲＡカラムを１分間流水洗浄し、次に第２
のＲＡカラムを脱着溶液に切り替え、ジゴキシンを脱着させ、次にＭＳで検出し
た。
【００５２】 図１は、ジゴキシンの典型的なＭＳスペクトルを示す。プロトン化分子（７８
０．８）と異なり、アンモニウムクラスターは、７９７．９で観察され、一方ｍ
／ｚ比７６２．８と６５１．１は、それぞれ水と糖基の喪失を意味する。プロト
ン化分子の４５％衝突エネルギーでの広帯域活性化（７８０．８±１８）は、親
質量ならびにアンモニウム複合体を６５１．１に断片化し、これは、使用した条
件下でＭＳ／ＭＳスペクトルの基礎ピークとして観察することができる（図２）
。アッセイ操作の間、ジゴキシンはＭＳとＭＳ／ＭＳの両方を使用して検出され
た（ｍ／ｚ それぞれ７９７．９と６５１．１）。
【００５３】 ジゴキシゲニンＦab断片の有りおよび無しでアッセイ系に５、５０、５００ng
のジゴキシンを注入すると、親和性タンパク質が存在しない時ジゴキシンは完全
に捕捉された。しかし抗ジゴキシゲニンＦab断片を添加すると、ジゴキシンの応
答は上昇（ｍ／ｚ ６５１．１で測定）し、ＭＳに基づくオーファン測定法を使
用してジゴキシンを検出する系の能力を証明している。
【００５４】 ｍｓ−ｂｃｄ系の堅固さをチェックするために、抗ジゴキシゲニンＦab断片溶
液を、ヤギ抗ビオチンで置換した。０、５、５０、５００ngのジゴキシンを注入
すると、５００ngで得られるシグナルはまだブランクと匹敵し、過剰のジゴキシ
ンが第１のアクセス制限カラム上に充分捕捉されていることを意味する。
【００５５】 例２ 中空繊維分離 この設定は、移動相と親和性タンパク質溶液を供給する２つのファルマシア（
Pharmacia）（ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）Ｐ３５００ポンプ、酸性溶液
を供給する１つのギルソン（Gilson）３０６ＬＣポンプ、そしてそれぞれ保持物
出口で背圧を作り出し、透過物相にリン酸緩衝液を加える２つのギルソンミニパ
ルス（Gilson Minipuls）３ペリスタポンプからなる。移動相、親和性タンパク
質溶液および酸性溶液は、流速０．２ml／分でポンプで供給した。透過物相の酸
性状態は、リン酸緩衝液（１００μｌ／分）を添加して中和した。注入は、２つ
のレオダイン（Rheodyne）六口弁を備えたアスペック（Aspec）オートサンプラ
ーにより行った（注入容量２０μｌ）。検出は、フィニガン（Finnigan）ＬＣＱ
質量分析計で行った。
【００５６】 各１μＭ範囲で８０のランダムに選択した薬物を含む０．１５ml／分ＰＢＳ担
体（１３６．９mmol/l ＮａＣｌ、２．７mmol/l ＫＣｌ、９．２mmol/l Ｎａ 2 ＨＰＯ4および１，８mmol/l Ｋ2ＰＯ4）を、逆Ｙ字管を用いて１０nMのヤギ抗
ビオチン（０．１５ml／分、ピアス（Pierce）、ロックフォ−ト（Rockford）、
イリノイ州、アメリカ合衆国、から入手）と混合した。混合物を、反応コイル中
で４８秒間反応させてから、非結合リガンドと親和性複合体をアクセス制限カラ
ム（Ｃ１８アルキルジオール、メルク（Merck）リクロスファー（Lichrospher）
（登録商標）、１５×４mm）で分離した。次にアクセス制限カラムを通過した後
、塩酸を加え（０．３ml／分）て移動相のｐＨを２に下げ、１０秒間の反応時間
内に反応コイル中で親和性複合体を解離させた。次に中空繊維モジュール（ポリ
スルホン、アミコン（Amicon）からエタノール、０．５mmＩ．Ｄ．、３０kDaカ
ットオフ、モジュールＩ．Ｄ．は０．８５mmであった）は、親和性分子をリガン
ドから分離する。次にリガンドはＭＳによりすべて検出された。
【００５７】 例３ 天然抽出物中のジゴキシンと関連化合物の検出 本例は、ジゴキシンを加えた大きいセットと、モデル化合物としての構造が関
連した分子を使用して、迅速にオーファン受容体のリガンドを測定するための、
ＭＳに基づくオーファンバイオアッセイ法の応用を示す。いくつかのソフトウェ
アに支持されたバックグランドサブトラクションのオプションを使用する生物活
性化合物の偏りのない測定を示す。
【００５８】 バイオアッセイの説明。親和性タンパク質を、アナライトを含む流れに加えた
。次にこの混合物を、開管式の堅く結合したテフロン反応コイルに入れ、こうし
て親和性タンパク質と試料化合物を３０秒間反応させた。親和性相互作用後、移
動相をアクセス制限カラムに導き、親和性複合体と非生物活性化合物とを分離し
た。アクセス制限物質の性質は、「大きい」親和性複合体が保持されずにカラム
を通過することを可能にし、一方より小さい非結合化合物は、物質の疎水性孔内
に捕捉されることが可能になる。
【００５９】 アクセス制限カラムを通過した後、親和性複合体は、ｐＨショックを導入する
（すなわちかなり酸性の溶液を加えて、ｐＨを２に下げる）ことにより解離され
る。解離反応は、わずか１０秒間で進行する。次に移動相を第２のアクセス制限
カラムに導き、これは生物活性化合物を捕捉し、一方親和性タンパク質は効率的
に除去される。次にアクセス制限カラムをミリＱ水で流水洗浄して、過剰のバッ
クグランドイオンと妨害化合物を除去し、次にＲＡカラムを脱着溶液に切り替え
る。ＲＡカラムに捕捉された化合物は溶出し、ＤＥＣＡ質量分析計に導入され、
これは生物活性化合物の存在を検出かつ性状解析する。
【００６０】 生化学的アッセイ構成。このシステムの生化学的アッセイ部分は、５つのクナ
ウア（Knauer）ミニスターＬＣポンプから構成された。１つのＬＣポンプは、担
体相、１０mMトリス、および１０％ ＤＭＳＯ（ｐＨ７．５）を流速２００μｌ
／分で供給した。第２のＬＣポンプは、担体溶液中に溶解した親和性タンパク質
の「栓」を、最大流速１００μｌ／分で供給した。１０％アセトニトリルと０．
２５％ＴＦＡからなる解離溶液を、第３のＬＣポンプで流速２００μｌ／分で供
給した。さらに第２のアクセス制限カラムを、各注入後にミリＱ水で流速１ml／
分で１分間流水洗浄した。第５のＬＣポンプは、脱着相、７５％メタノールおよ
び２mM酢酸アンモニウムを供給し、流速１００ml／分で運転し、ＤＥＣＡ質量分
析計に直接導入した。
【００６１】 親和性複合体を試料中に存在する非生物活性化合物から分離するために、２＊
１５mmのＣ１８ ＡＤＳアクセス制限カラムを使用した。親和性タンパク質を活
性化合物から分離するために使用される第２のアクセス制限カラムは、同様の物
質（しかし、異なる大きさ、２＊５mm）からなっていた。
【００６２】 使用した反応コイルは、堅い開管式のテフロンコイルで、内径０．５mmである
。反応コイルの長さは、親和性相互作用と解離反応についてそれぞれ３０秒と１
０秒の反応時間を可能にするように選択された。
【００６３】 質量分析計仕様。すべての測定は、フィニガン（Finnigan）ＤＥＣＡイオント
ラップ質量分析計で行い、これはＥＳＩプローブが取り付けてある。普通は興味
ある化合物に関する情報量が限定されているため、広いｍ／ｚ範囲にわたって受
容できる感度が得られるように装置を調整した。実験は、陽性電子スプレーイオ
ン化と毛細管温度１７０℃を使用して行った。システムの生化学的アッセイ部分
から出る移動相は、７５％メタノールと２mM酢酸アンモニウムからなり、流速１
００μｌ／分で導入した。
【００６４】 データ評価。ＤＥＣＡ質量分析計のオペレーティングソフトウェアであるエク
スカリバー（Xcalibur）１．１を使用して、集めたデータセットについていくつ
かのソフトウェア操作を行ってデータを評価した。まず、試料について単純なバ
ックグランドサブトラクションを行って、生のデータファイルをバックグランド
について補正した。このために、一連の天然抽出物を測定する時にいくつかの「
ブランク」を含めた。
【００６５】 バックグランドを除去した後、ｍ／ｚ値について再構成イオン電流スペクトル
（ＲＩＣ）を作成することにより、活性化合物について補正ＭＳスペクトルを解
析したが、これはまだ比較的強い強度を示し、見かけのノイズレベルより高い強
度であることを意味する。ブランク試料で観察されたｍ／ｚ値と天然抽出物で測
定されたｍ／ｚ値の強度比を決定して、活性化合物は容易に追跡できた。
【００６６】 天然抽出物のスクリーニング。複合抽出物中のオーファン受容体のリガンドを
発見するための方法への応用を証明するために、真菌から高等植物の抽出物まで
のいくつかの天然抽出物に、ジゴキシンと交差反応化合物（すなわち、ギトキシ
ン（gitoxin）、３、１２−ジアセテートジゴキシゲニン、ジゴキシゲニンおよ
びギトキシゲニン）を加えた。いくつかの濃度の生物活性化合物を抽出物に加え
た。オーファン受容体とリガンドとの相互作用を模倣するために使用した親和性
タンパク質は、抗ジゴキシゲニンＦabであり、これは、ある範囲のジゴキシン関
連分子に対する反応性を示す。
【００６７】 結果 天然抽出物のスクリーニング。許容されるバイオアッセイ適合レベルまでＤＭ
ＳＯ濃度を下げるために、１００％ＤＭＳＯに溶解した天然抽出物を、担体溶液
で１０倍希釈した。次にこれらの抽出物に種々の濃度のジゴキシン、３、１２−
ジアセテートジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン、ギトキシン、およびギトキシゲ
ニン（すなわち、親和性相互作用の親和性定数が互いに異なるだけでなく、イオ
ン化効率（ＭＳ検出性を意味する）も異なる化合物）を加えた。これらの添加試
料を使用して、大量のセットの天然抽出物中で選択化合物の検出限界を測定した
。
【００６８】 ジゴキシンに関して最小検出限界は、高等植物抽出物中で約６pmolと測定され
た。異なるタイプの試料のマトリックス効果のために検出限界にある程度の変動
はあったが、最大検出限界は、１３pmolと測定された。
【００６９】 さらにすべての他の化合物も同様に、天然抽出物中で検出された。ジゴキシン
に対する低いイオン化効率のために、ジゴキシゲニンとギトキシゲニンは、検出
が最も困難であった。これは、これらの化合物の検出限界（２５〜３０pmolであ
った）に反映される。
【００７０】 データ評価。実験セクションに記載した、集めたデータを評価するために使用
した方法は、生物活性化合物を偏り無く割り当てるのに非常に適していた。エク
スカリバー（Xcalibur）により提供されたバックグランドサブトラクションを使
用して、バックグランドイオンは効率的に除去され、こうして生物活性化合物の
認識が促進された。
【００７１】 実際の生命条件下でシステムを試験するために使用した生物活性化合物の場合
、対応するｍ／ｚ比は、この型のデータ評価を使用して容易に検出することがで
きた。最初に見たときに興味深いと思われた追加のピークは、スパイクとしてま
たは除去不完全なバックグランドイオンとして容易に廃棄できた。
【００７２】 単純な試料のクリーンアップ後とオーファンバイオアッセイ分析後に得られた
天然抽出物のＭＳスペクトルを比較することにより、複合マトリックス中のオー
ファン受容体に対する生物活性化合物を迅速に検出するこの方法の真の能力が、
明瞭に証明された。最初のスペクトルは、試料のクリーンアップ後にまだ多数の
化合物が存在することを示すが、第２のスペクトルは、きれいなＭＳスペクトル
を示し、主要なイオンとしてジゴキシンのｍ／ｚ値のみを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 FA40 FB03 FB05 FB06 4D006 GA02 HA01 HA95 JA02Z KA14 MA01 MB02 MC62 MC62X PA05 PB12 PB52 PC38

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 分画工程の流出液の質量分析計（ＭＳ）へのオンライン連結
    を含むオンライン検出法であって、制御量の親和性分子を分画工程の流出液に加
    え、こうして親和性分子が流出液中のアナライトに結合し、次にアクセス制限支
    持体を使用して分離工程を行い、こうしてアナライト−親和性分子複合体が透過
    し、次に適当な解離工程によりアナライト−親和性分子複合体を解離させ、次に
    第２の分離工程で、解離したアナライトと親和性分子を分離し、次に質量分析計
    を用いてアナライトを検出することことを含む、上記方法。
  2. 【請求項２】 第２の分離工程は、アクセス制限支持体を使用して行われ、
    ここで親和性分子は保持され、次に適切な担体流を使用してアクセス制限支持体
    からアナライトが溶出され、そして溶出流を質量分析計に向けることを特徴とす
    る、請求項１に記載のオンライン検出法。
  3. 【請求項３】 第２の分離工程は、中空繊維モジュールを用いて行われ、こ
    れによってアナライトは透過され、透過物は質量分析計に向けられる、請求項１
    に記載のオンライン検出法。
  4. 【請求項４】 解離工程は、低ｐＨショック、高イオン強度溶液との接触、
    有機溶媒との接触および／またはカオトロピック試薬との接触である、前記請求
    項のいずれかに記載のオンライン検出法。
  5. 【請求項５】 分画工程が、液体クロマトグラフィー分離、毛細管電気泳動
    工程またはコンビナトリアル化学システムであって、この後に、場合により高分
    子量バックグラウンドを除去する分離工程が続く、前記請求項のいずれかに記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 液体クロマトグラフィー分離工程は、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬ
    Ｃ、ＣＥ、ＣＥＣ、ＩＥＦまたはＭＥＫＣ工程である、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 質量分析計が、電子スプレーイオン化型、大気圧イオン化型
    、四重極型、磁気セクター型、飛行時間（time-off-flight）型、ＭＳ／ＭＳ、
    ＭＳn、ＦＴＭＳ型、イオン捕捉型およびこれらの組合せよりなる群から選択さ
    れる型のものである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 質量分析計が、走査様式または任意の逐次様式で、選択した
    単数ｍ／ｚトレースまたは選択した複数ｍ／ｚトレースのイオンを検出するよう
    に設定される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 親和性分子は親和性タンパク質である、前記請求項のいずれ
    かに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 親和性分子はオーファン受容体である、前記請求項のいず
    れかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前請求項のいずれか１項に記載の方法により検出される化
    合物。
  12. 【請求項１２】 親和性分子に対するリガンドとしての、前記請求項に記載
    の化合物の使用。
JP2000614042A 1999-04-26 2000-04-26 質量分析を用いるオーファン受容体のリガンドの同定 Pending JP2002543387A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99201301.1 1999-04-26
EP99201301A EP1048950A1 (en) 1999-04-26 1999-04-26 Identification of ligands for orphan receptors using on-line coupling of mass spectrometry to continuous-flow separation techniques
PCT/NL2000/000268 WO2000065353A1 (en) 1999-04-26 2000-04-26 Identification of ligands for orphan receptors using mass spectrometry

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002543387A true JP2002543387A (ja) 2002-12-17

Family

ID=8240148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000614042A Pending JP2002543387A (ja) 1999-04-26 2000-04-26 質量分析を用いるオーファン受容体のリガンドの同定

Country Status (6)

Country Link
EP (2) EP1048950A1 (ja)
JP (1) JP2002543387A (ja)
AT (1) ATE304710T1 (ja)
AU (1) AU4624200A (ja)
DE (1) DE60022642D1 (ja)
WO (1) WO2000065353A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7329388B2 (en) 1999-11-08 2008-02-12 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having staggered passage configuration
US6406604B1 (en) 1999-11-08 2002-06-18 Norberto A. Guzman Multi-dimensional electrophoresis apparatus
DE10125258A1 (de) 2001-05-23 2003-01-09 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden
EP1706735B1 (en) 2003-11-07 2017-01-04 Princeton Biochemicals, Inc. Multi-dimensional electrophoresis apparatus
US8007725B2 (en) 2003-11-07 2011-08-30 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having valve system
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996037777A1 (en) * 1995-05-23 1996-11-28 Nelson Randall W Mass spectrometric immunoassay
EP0835446B1 (en) * 1995-06-26 2003-04-09 Perseptive Biosystems, Inc. High speed, automated, continuous flow, multi-dimensional molecular selection and analysis
AU2889097A (en) * 1996-05-10 1997-12-05 Novartis Ag Identification of members of combinatorial libraries by mass spectrometry
AU7713198A (en) * 1997-06-03 1998-12-21 Arqule, Inc. An automated, high throughput method for screening a plurality of compounds using mass spectrometry

Also Published As

Publication number Publication date
AU4624200A (en) 2000-11-10
EP1048950A1 (en) 2000-11-02
DE60022642D1 (de) 2005-10-20
EP1175617A1 (en) 2002-01-30
ATE304710T1 (de) 2005-09-15
EP1175617B1 (en) 2005-09-14
WO2000065353A1 (en) 2000-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2278556C (en) Characterising polypeptides
JP3788909B2 (ja) 親和力配位子について複合生理学的材料をスクリーニングする高処理量のサイズ排除法
JP2011504596A (ja) サンプル中の分析物を定量測定する際に使用するための内部標準および方法
Dunayevskiy et al. Mass spectrometric identification of ligands selected from combinatorial libraries using gel filtration
EP2545370B1 (en) Method for recognition and quantification of multiple analytes in a single analysis
CA3000178A1 (en) Amyloid beta detection by mass spectrometry
US7794947B2 (en) Affinity capture of peptides by microarray and related methods
JP2024113021A (ja) 無傷のタンパク質レベルでのＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の自動化試料ワークフロー
KR20140137353A (ko) 단일 분석에서의 다중 분석물을 위한 선별제 기반 인식 및 정량 시스템 및 방법
JP2002543387A (ja) 質量分析を用いるオーファン受容体のリガンドの同定
JP2002543388A (ja) 既知リガンドを用いる連続流バイオアッセイのための質量分析に基づく技術
JP4188229B2 (ja) 細胞内に存在するタンパク質又は当該タンパク質と相互作用する物質を分析する方法
US20150105280A1 (en) Selector based recognition and quantification system and method for multiple analytes in a single analysis
EP1330648B1 (en) Continuous-flow homogeneous biochemical assays based on mass spectrometric detection of known ligands
CN113302499A (zh) 用于基于LC-MS的HbA1c测量的高速样品工作流程
Brenner-Weiß et al. Approaches to bioresponse-linked instrumental analysis in water analysis
Wei A Step-Up LC-MS/MS for Proteomics
WO2005078451A1 (en) Method for peptide analysis
JPH11509922A (ja) 連続フロー分離技術への生化学的検出のオンライン結合