JP3788909B2 - 親和力配位子について複合生理学的材料をスクリーニングする高処理量のサイズ排除法 - Google Patents
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Description
[関連出願との相互参照]
この出願は、1999年2月12日に出願された米国暫定特許出願第60/119,966号の利益を主張し、ここにその全体を参照によって組み入れる。
【0002】
[連邦補助研究または開発に関する表明]
適用なし
【0003】
[発明の背景]
本発明は、複合生理学的材料、例えば天然生成物および組み合わせライブラリを、サイズ排除分離、限界濾過、および質量分析法を使用して、親和力配位子についてスクリーニングすることに関する。
【0004】
新規薬品候補用の複合生理学的サンプルを高処理量のスクリーニングプログラムでテストすることは、医薬産業で使用される成功した戦略である。しかしながら、活性サンプルが同定されると、その活性サンプルを、特に天然生成抽出物から分離することが困難になる。
【0005】
天然抽出物は、単一の活性化合物の隔離を困難にする化合物の、高度に化学的な種々のコレクションを表す。殆どの成功した薬品化合物は、小さい分子量(2,000ダルトン以下)であるので、サイズに基づく分離は、活性化合物の隔離を支援する有用なツールになり得る。
【0006】
組み合わせ化学は、多数の異なった化学薬品を同時に生成する手段を提供する。最近の分析手法は、そのような組み合わせライブラリのスクリーニングが、所望の特性を保有したそれら化合物を選択することを可能にする。しかしながら、これらの方法は、それらの限界を有している。このため、活性配位子を同定するための生理学的標的に対する組み合わせライブラリの高処理量のスクリーニングを提供する成功した分析方法に対する必要性が残る。
【0007】
ライブラリのスクリーニングは、配位子−レセプターの相互作用の程度を判定するために、一般に結合または機能アッセイを包含する。しばしば、配位子またはレセプターのいずれも固体表面(例えば、ポリマービードまたはプレート)上で不動態化され、そして、結合または機能活性の検出後に、配位子は放出され、異なる手段、例えば質量分析法で同定される。固体相スクリーニングアッセイは、溶液ベースの方法よりも速い、活性アナライトの隔離および同定を提供する。一方で、組み合わせリサーチの可溶性非ペプチドライブラリへのシフトと、異種アッセイに関連した限界は、溶液状態での組み合わせライブラリの迅速で効率的なスクリーニング用の躍進的な技術に対する要請を作りだす。溶液相アッセイは、スクリーニングの特異性を増加することに望ましいものであるが、現在の方法論は、長く骨の折れる反復性のプロセスを包含する。
【0008】
近年、エレクトロスプレー式イオン化質量分析法(ESI−MS)もまたスクリーニングに、直接または溶液ベースのスクリーニング法と関連して使用されている。ESI−MSによる組み合わせライブラリの直接スクリーニングは、配位子と結合したプロテインの非共有錯体を特徴付ける(即ち、プロテイン標的とその配位子を、小さなものであっても、区別する)その能力を頼みにしている。この代わりに、生理学的活性化合物の構造的判定に対する最終次元として、質量分析法が、オンラインまたはオフラインで、溶液ベースのスクリーニング法と結合される。
【0009】
小さい分子のプロテインに対する結合研究用に最近使用された1つの方法であるフンメル−ドライヤー法は、レセプタープロテインとその配位子の、ゲル濾過による、サイズ分離に基づいたものである。レセプター(即ち、標的プロテイン)とレセプター−配位子の錯体を、サイズ差に基づいて他の小さな未結合の分子から分離する方法は、先ずペプチドライブラリの残りからの抗体−ペプチドの錯体に適用され、逆相高性能液体クロマトグラフィ(RP−HPLC)上での配位子の分析が後続する。(R. N. Zuckerman et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 89:4505-4509 (1992), J. M. Kerr et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:463-468 (1993)。
【0010】
サイズ排除分離はまた、小さい分子の組み合わせライブラリにも適用されている。サイズ排除錯体隔離処理および質量分析法を使用して、生理学的標的に対し高親和力を有する配位子を選択および同定するための方法を開発することが研究されている。例えば、Y. Dunayevskiy et al., Rapid Comm. Mass Spec. 11:1178-84 (1997); M. M. Siegel et al., J. Mass Spec. 33:264-273 (1998)。組み合わせライブラリと他の化合物の錯体混合物とを、サイズ排除分離に基づいて、スクリーニングするこれらの試みは、実際の応用、特に高処理量スクリーニングの励行下では限られた成功しかない。1つの主要な問題は、高処理量のサイズ排除錯体分離スクリーニングプロトコルに使用される移送ラインと他の導管、特に逆相HPLCカラムへの移送ラインの、1〜2時間の動作後に目詰まりして通過できなくなる傾向である。このような目詰まりは、HPLCカラムの固定相上のプロテインの不可逆性回収に起因して起こり、移送ラインの頻繁な交換を必要とする。それはまた、そのようなスクリーニングプロトコルの全体の有効性とオンライン自動化を制限する要因でもある。この効果は、大きなMWの生体分子を含有する天然サンプルのような複合生理学的混合物を扱うときに更に言われる。それ故、高処理量の条件に耐え得るサイズ排除スクリーニング法に対する要求が残る。
【0011】
[発明の簡単な要約]
本方法は、親和力相互作用とサイズ排除法を組み合わせて、小さな分子の化合物を、高度な複合混合物、例えば天然サンプルから迅速に隔離して特徴付けすることを可能にする。
【0012】
また、本方法の技術の組み合わせの利点は、化合物のプールを、一時に一化合物ではなく、同時にスクリーニングすることを可能にすることである。本発明は、サイズ排除分離(例えば、ゲル濾過による)工程と限界濾過工程双方の独特な組み合わせを、質量分析法と共に使用して、親和力配位子用に迅速にスクリーニングする改良された方法を提供する。本方法の1つの利点は、維持された高処理量のスクリーニングを、HPLCカラムを少なくとも7日間交換することなしに、可能にする点である。
【0013】
一般に、この発明の迅速なスクリーニング方法は、
(i)プロテイン標的(TG)と、小さい分子量を有する生理学的サンプル親和力配位子(L)とを混合および培養して、溶液状態で配位子/標的(L/TG)の錯体形成に導く条件下で、反応混合物を形成する工程と、
(ii)分子量差に基づいて、小さい分子の化合物は分離して保持するが、プロテインや配位子/プロテイン標的(L/TG)錯体は通過させるサイズ排除媒体を使用して、前記反応混合物から生理学的サンプル中に存在する未結合の小さい分子量の材料を除去する工程と、
(iii)未結合のプロテインや結合したL/TG錯体のような大きな分子量の材料だけを今は含有するサイズ排除された反応混合物を、自由で小さい分子量の配位子(L)と標的(TG)を溶液状態で生じさせるために、L/TG錯体解離に導く条件下に置き、そして第2のサイズ排除媒体、例えば限界濾過メンブレンを使用して、工程(ii)からのサイズ排除された反応混合物に残存するプロテイン標的および他の大きな分子から、自由配位子を分離する工程と、そして
(iv)隔離された配位子を、その構造を同定するために、質量分析法(MS)にかける工程と、
を含む主工程を所定の順序で備える。
【0014】
[発明の詳細な説明]
この発明は、サイズ排除分離、限界濾過、および質量分析法を使用して、複合生理学的材料をスクリーニングする改良された高処理量のサイズ排除法を提供する。この方法は、いくつかのプールの化合物を、錯体混合物や非常に異なったMWサイズの分子を含有する天然サンプルと同様に、一度にスクリーニングすることを可能にする。
【0015】
この発明は、小さい分子量の親和力配位子(L)をプロテイン標的(TG)に溶液状態で結合させる工程と、未結合の標的−不活性材料から配位子/プロテイン(L/TG)錯体をサイズ排除分離する工程と、後続するL/TG錯体の解離、および大きい分子(即ち、標的および他のプロテイン)から小さい分子を分離するもう1つのサイズベースの分離(限界濾過)による標的結合配位子の隔離工程と、そして質量分析法(MS)を単独でまたは液体クロマトグラフィと関連させて(LC−MS)使用して配位子を同定する工程、の独特な組み合わせを使用する。
【0016】
「小さい分子」または「小さい分子量」は、およそ2,000ダルトン以下の分子量を有する化合物を指すものと従来から理解されている。この方法が、選別された複合生理学的サンプルから、およそ2,000ダルトン以下、好ましくは1,000ダルトン以下の標的結合配位子を検出して隔離できると都合がよい。本方法によって同定される小さい分子量の配位子の例は、限定されるものではないが、複合生理学的材料の範囲内の化合物、例えば組み合わせライブラリ(例えば、ペプチド等の);天然の生成物、サンプルまたは抽出物;および純粋な化合物の混合物を含む。
【0017】
大きな分子量の化合物は、一般におよそ8,000、より典型的には10,000ダルトン以上の分子量を有する化合物である。例としては、プロテインや、小さな分子の配位子に非共有的に結合したプロテインの錯体が挙げられる。
【0018】
この発明の一般的な方法の概略が、図1のフローチャートに示されている。
【0019】
この発明の1つの形態は、プロテイン標的に結合する親和力配位子について複合生理学的材料をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、
(1)プロテイン標的と複合生理学的材料を溶液状態で混合して反応混合物を形成する工程と、
(2)この反応混合物を、サンプル中に存在する標的および標的結合配位子による錯形成を可能にする条件下で培養する工程と、
(3)前記反応混合物を、第1のサイズ排除媒体を通過させ、それぞれが第1のプリセット値より小さい分子量を有した小さい分子量の化合物を前記反応混合物から除去する工程と(例えば、前記第1のプリセット値は、5000ダルトン以下の範囲にあり、3000Daでカットオフされる)、
(4)工程(3)からのサイズ排除された反応混合物を、配位子/標的の錯体を自由配位子および自由標的に解離することを促進する条件下に置く工程と、
(5)工程(4)で得られた反応混合物を、第2のサイズ排除媒体を通過させ、第2のプリセット値より大きい分子を前記反応混合物から除去する工程と、
(6)工程(5)で得られた反応混合物を、(a)質量分析法、または(b)質量分析法とオンライン結合された配位子クロマトグラフィ法で分析させ、これにより工程(5)から生じた反応混合物中に残存する小さい分子量の配位子を特徴付ける工程と
を与えられた順序で備える。
【0020】
もう1つの形態では、この発明の方法は、工程(6)からの分析結果を参照標準と比較する工程を更に備える。この参照標準は、好ましくは、プロテイン標的単体のサンプル、またはプロテイン標的と非標的結合複合生理学的材料サンプルの混合物いずれかを、工程(2)〜(6)を経させた分析結果(MSまたはLC−MS結果)である。
【0021】
この発明の迅速なスクリーニング法は、オンラインまたはオフライン形式で行うことができる。加えて、この方法は、競合結合の実施形態を、この方法によって検出された配位子が特異的に(既知の競合配位子と同じ部位で)、または非特異的に(例えば、疎水性相互作用により、他の部位で)選択されたプロテイン標的と結合するか否かを判定する対照として、更に含むことができる。
【0022】
[オフライン実施形態]
標的プロテインは、最初に、溶液状態の生理学的混合物によって、LC/MSまたは標的に対する配位子の平衡または近平衡結合に到達するに十分な時間(例えば、約5〜60分、好ましくは5〜10分)培養される。それから、未結合の小さい分子の化合物からのL/TG錯体の物理的分離が、サイズ排除媒体、例えば小さい分子量の化合物から大きな分子(例えば、サンプル中の標的プロテイン(TG)と他のプロテイン)と大きな錯体(即ち、L/TG錯体)を分離するゲル濾過カラム(例えば、Pharmacia社のHR10/10カラム)上で行われる。標的/サンプルの混合物中の小さい非結合分子は、ゲル濾過カラム上に保持される。大きな分子は、空きカラム体積内に溶離する。それ故、この分離工程後に、サイズ排除反応混合物は、生理学的サンプル中に最初から存在していた他の大きい分子と同様に、未結合のTGおよびL/TG錯体を含み、それらは全て空きカラム体積中に溶離する。
【0023】
その後、少なくとも1つの有機溶媒と少なくとも1つの有機酸とを含む溶液(例えば、0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含有するアセトニトリルACN溶液100μLが、ゲル濾過カラムからのサイズ排除反応混合物に添加される。この工程は、プロテイン変性に対する条件と、続く結合配位子の標的からの放出、即ち結合L/TG錯体の解離に対する条件を作成する。結果として得られる混合物全体は、それから第2のサイズ分離媒体、例えば小さい分子量のカットオフ、例えば1,000〜5000ダルトン(Da)、好ましくは2,000〜4,000の範囲内、最も好ましくは約3,000Daの限界濾過メンブレン上に装填される。限界濾過メンブレンのカットオフより小さい分子だけが通過できる。このようにして、この第2のサイズ分離工程は、スクリーニングされた生理学的サンプル中の全ての大きい分子から、解離された配位子の分子を隔離する。第1のサイズ分離工程後に混合物中に残存する小さい分子(即ち、プロテイン標的に対して所望の親和力を有する親和力配位子)は、限界濾過メンブレンを通過し、そのメンブレン表面は、全ての大きい分子(即ち、このサンプルに由来する標的および他の大きなMWの分子)を保持する。
【0024】
残りの、限界濾過された反応混合物または材料は、MS単体に向けられるか、またはオンラインでMSと結合した液体クロマトグラフィ(LC−MS)により、限界濾過工程によって隔離された標的結合配位子を分析する。
【0025】
[オンライン実施形態]
オンライン形式では、サイズ排除カラム(SEC)、限界濾過メンブレン、および液体クロマトグラフィ−質量分析法(LC−MS)システムがオンラインで一緒に組立られる。この発明の方法を遂行する可能性のある機器的構成の1つは、図2A、2Bおよび2Cに示されている。これらの図は、異なる時点の方法と装置を図示している。図2Aは、ループ内の大きい分子量の生体分子の隔離と捕獲を示している。図2Aは、隔離された大きい分子量の生体分子の、限界濾過メンブレン上への移送を、配位子/標的の錯体解離へ導く条件の適用と共に示し、更に解離された配位子の標的からの分離と、隔離された配位子の逆相LCカラム上への配置とを示している。図2Cは、LC−MS分析による、限界濾過後の、配位子の特徴付けを示している。
【0026】
オンライン法では、標的−配位子結合を可能にするに十分な時間(例えば、5〜60分)の反応混合物の培養後に、その混合物は、SECに注入され、そしてSECのSEC固定相によって保持されない、大きい分子が先ず取り出される。小さい分子は、SEC固定相の孔内に保持される。大きい分子に対応するクロマトグラフのピークは、サンプルループに転送され(図2a)、そしてSECからの残りの流れは、廃棄へと迂回される。それから、L/TG錯体解離用の条件を提供するために、有機溶媒(例えば、アセトニトリル(ACN)酸(TFA))と有機酸(例えば、酢酸またはトリフルオロ酢酸(TFA))とを含有した溶液が、ループ中でサンプルに添加される。同時に、サンプルは、限界濾過メンブレンのチャンバ内に移送される(図2b)。その後、サンプルは、更に放出された配位子のLC−MS分析をするために、限界濾過メンブレンを通してMS内へ、あるいはLCカラム内へ直接ポンプ輸送される(図2c)。放出された小さい分子の配位子だけがメンブレンを通過することができ、そして後にMSまたはLC−MSによって同定される。
【0027】
[競合結合実施形態]
この発明の他の1つの実施形態は、競合結合の使用と、既述されたスクリーニングアッセイとを組み合わせるものである。選択された標的に結合する既知の競合配位子(CL)の利用は、生理学的混合物から抽出された活性配位子が標的プロテインの特異的結合部位または既知の部位に結合するか否かを判定可能にする。この場合、既知のS.H.に結合するCLが標的と生理学的サンプルとの反応混合物に添加される。この生理学的サンプルは、最初の混合および培養段階で、小さい分子量の親和力配位子を含有している。そして質量分析中に、LおよびCL信号がモニタされる。抽出された配位子LのMS信号が、結合混合物中のCLの存在による影響を受けていない場合は、同定された配位子Lが、TGのCL結合部位とは異なる部位に結合しているものと結論づけることができる。この競合結合手法は、このようにして、標的の異なる部位に結合している配位子を同定できるようにする。例えば、このことは、このスクリーニング法の間に検出された非特異的バインダーを、標的プロテインの活性を調節するための候補化合物として、迅速に評価することに使用することができる。代わりに、スクリーニング、テストおよび/または特徴付けの努力を、配位子分子の標的への結合が反応混合物中の既知の競合配位子の包含を減少させるような、配位子分子(L)に集中することもできる。そのような結果は、スクリーニングされたサンプルからの候補配位子が、このようにして、既知の競合配位子がするように、プロテイン標的上の同じ部位に結合することを示唆している。
【0028】
この方法の競合結合実施形態では、スクリーニングされたサンプルが特定的標的結合配位子を含んでいるか否かを判定するための参照標準は、プロテイン標的と既知の競合結合配位子の混合物を、他の標的結合配位子の不存在下で、工程(2)〜(6)を経させた、MSまたはLC−MSの結果である。
【0029】
(例示的プロトコルおよび材料)
[例示的ゲル濾過隔離プロトコル]
プロテイン標的(例えば、ヒトのカルボニックアンヒドラーゼII(CAII)への結合を検定することに使用される候補化合物のストック溶液は、それらをアセトニトリル (HPLC Grade; Fisher Scientific, Springfield, NJ, USA) (ACN)と緩衝液Aの1:1(v/v)混合物中に溶解し、さらに結合アッセイで所望とされる濃度より10倍高い濃度まで希釈することによって調製することができる。この標的プロテインストック溶液は、緩衝液A中で標的を溶解して希釈することで調製することができる。結合混合物は、50μLの標的ストックと5μLの候補化合物ストックからなる。反応混合物は、ピペットによって静かに混合した後に、室温で1時間培養される。ゲル濾過カラム(例えば、この発明のオフライン形式の、Sephadex社のG25高速脱遠スピンカラムか、Pharmacia社のHR10/10カラム)は、製造者の指示に従って扱われた。例えば、G25カラムは最初に100μLの水で洗浄され、そして4℃で5分間、3000rpm(−900g)で遠心分離された。反応混合物は、それからカラム上に装填され、前と同様に遠心分離された。未結合の化合物は、カラム上に維持されるべきであるが、低分子量の候補化合物に結合したプロテインまたは未結合のプロテインは、カラムを通して流れるべきである。スピンカラムの流中のプロテイン錯体は、回収される。溶出したフラクション中のプロテイン−配位子の錯体は、それからトリフルオロ酢酸(TFA)(Sigam Chemical CO.)を0.1%含有するACN溶液100μLを加え、室温で5分間培養し、そして15秒間渦巻き運動させることによって変性される。変性されたプロテインは、10000gの遠心分離を30秒行うことによって取り除かれる。
【0030】
[例示的限界濾過プロトコル]
ゲル濾過プロトコルの結果生じた上澄み液は、それから第2のサイズ排除分離媒体、好ましくは限界濾過メンブレンに投入される。例としては、マイクロコン−3(Microcon-3, Amicon社, Beverly, MA, USA) として販売されている20,000、10,000または30,000ダルトンのカットオフを有した限界濾過メンブレンがある。約10,000Da以下のカットオフを有したメンブレン(それは30,000Da以上の分子の約1%を通過させる)が好ましい。3,000Daのカットオフのメンブレンは、30,000Da以上の分子の約0.1%だけを通過させる。最も好ましい限界濾過メンブレンは、有機溶媒(例えば、ACN)と有機酸(例えば、TFAまたは酢酸)に100%耐えることができるものである。
【0031】
小さい分子量、例えば約1000〜5000Da、好ましくは2000〜4000Daの範囲内の他のカットオフを有する限界濾過メンブレンもまた市販されている(例えば、All Filtron社, Northborough, MAの5000Daカットオフ)。
【0032】
[例示的MSまたはLC−MSプロトコル]
限界濾過された液体(標的に結合した候補配位子を含んでいる)は、小さい体積内での凍結乾燥および再懸濁後に、質量分析法単独によって、または質量分析法と結合された液体クロマトグラフィによって、放出された小さい分子量の化合物の存在について分析される。
【0033】
質量分析法:分析は、例えばイオントラップ3重4極質量分析計LCQ(Thermo-Quert Corporation, San Jose, CA, USA)またはAPCI上で行われる。エレクトロスプレー電圧は、約+4.5〜4.75kVの範囲内に概ね維持される。イオン光学系の設定値は、イオンの最大効率を検出器に与えるために、分析の日に最適化される。効果的な質量範囲は、約1秒/スキャンのレートで概ねm/z150からm/z700である。
【0034】
液体クロマトグラフィ:例えば、サンプルは、流率1ml/分の勾配モードで動作するHP1100(Hewlett Packard Paulo Alto,CA, USA)クロマトグラフィを通して導入される。メタケムテクノロジー社(MetaChem Technologies, Torrance, CA, USA)のInertsilC18ベースの不活性化されたマイクロボアカラム(4.6mm×10cm)がサンプル分離用に使用された。移動相勾配は、15分間で、Milli−Q H2O+ACN 90/10(v/v)からH2O+ACN 0/100(v/v)へ変化するものである。サンプルは、10μLの外部ループを有するRheodyneモデル7125インジェクタ(Rheodyne Model 7125 injector, Cotati, CA, USA)を通して導入された。サンプル注入体積は、概ね1〜19μLであった。
【0035】
[実施例I(オフライン形式)]
この発明のオフライン式スクリーニング手順は、ヒトのカルボニックアンヒドラーゼII(CAII)を標的として使用し、またCAIIの活性部位に特異的に結合する既知の小さい分子の配位子アセタゾラミド(AZ)でスパイクされているCAIIに対し不活性な天然サンプル(NS)(例えば不活性カビ抽出物)を使用して実証される。リン酸塩で緩衝されたpH7.0の1%DMSO塩水のような緩衝液中で、約20μMのCAIIと、約10μMのAZを含有する約1μgの不活性天然サンプルとが、CAIIおよびAZの最終濃度を約1マイクロモルとするように混合され、培養された。サイズ排除クロマトログラフィは、pH7.0の酢酸アンモニウ200mMの移動相を使用するPharmacia社のHR10/10カラムを4ml/分で使用して行われた。典型的に、結合した配位子(AZ)を有する標的プロテイン(CAII)を含有して排除された体積は、そのような条件下で、0.6〜0.7分でカラムから溶出する。
【0036】
図3Aは、約20μMのCAIIだけが、この発明の方法全体を通過したブランク実験のLC−MSクロマトグラムを示している。図3Bは、不活性天然サンプル(NS)だけで培養されたCAIIの量と同じことを行ったLC−MSクロマトグラムを図示している。ブランク実験と比較した付加的なピークは図示されていない。このことは、不活性天然サンプルからの標的結合配位子の不存在を示している。図3C[Orig. Fig. 1c]は、約10μMのCAII結合配位子アセタゾラミド(AZ)を今は含有する天然(NS)サンプルに同じスクリーニングプロセスを行ったLC−MS結果を示している。活性配位子は、本発明のスクリーニング法の結果、不活性生理学的マトリクスから成功裏に抽出された。図3A〜3Cに示されるように、標的CAII(TG)ピークは、10.5分以上の持続時間を有する一連のクロマトグラフィのピークである。配位子AZのピークは、5.9分の持続時間を有する。
【0037】
当業者は、ここに説明された方法に対し、請求の範囲に規定された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、小さな変形を与えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 この方法の一般的工程のフローチャートである。
【図2A,2Bおよび2C】 本発明のスクリーニング法のオンライン実施形態を実施するためにセットアップされた装置の、本方法の異なる時点での、模式的説明図である。
【図3A〜B】 ヒトのカルボニックアンヒドラーゼIIに結合する配位子アセタゾラミドをスクリーニングするために、この方法のオフライン実施形態を使用した配位子クロマトグラフィ−質量分析(LC−MS)クロマトグラムを示す。
Claims (21)
- プロテイン標的に結合する親和力リガンドについて天然材料をスクリーニングする方法であって、
(1)プロテイン標的と天然材料を溶液状態で混合して反応混合物を形成する工程と、
(2)この反応混合物を、サンプル中に存在する標的および標的結合リガンドによる複合体形成を可能にする条件下で培養する工程と、
(3)前記反応混合物を、第1のサイズ排除媒体を通過させ、それぞれが第1のプリセット値より小さい分子量を有した小さい分子量の化合物を前記反応混合物から除去する工程と、
(4)工程(3)からのサイズ排除された反応混合物を、リガンド/標的の複合体を自由リガンドおよび自由標的に解離することを促進する条件下に置く工程と、
(5)工程(4)で得られた反応混合物を、第2のサイズ排除媒体を通過させ、第2のプリセット値より大きい分子を前記反応混合物から除去する工程と、
(6)工程(5)で得られた反応混合物を、少なくとも一つで分析する工程とを備えることを特徴とする方法。 - 前記第1のサイズ排除媒体は、約2,000ダルトン以下の分子量を有する分子を除去する請求項1の方法。
- 前記第1のサイズ排除媒体は、約1,000ダルトン以下の分子量を有する分子を除去する請求項1の方法。
- 前記第1のサイズ排除媒体は、ゲル濾過またはサイズ排除HPLCカラムを備える請求項1の方法。
- 工程(4)は、工程(3)からのサイズ排除混合物に、有機溶媒と有機酸とを含む溶液を添加する請求項1の方法。
- 前記第2のサイズ排除媒体は、限界濾過メンブレンを備える請求項1、4または5の方法。
- 前記第2のサイズ排除媒体は、約10,000ダルトン以上の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項1、4または5の方法。
- 前記第2のサイズ排除媒体は、約3,000ダルトン以上の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項1、4または5の方法。
- 前記第2のサイズ排除媒体は、約2,000ダルトン以上の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項1、4または5の方法。
- 前記限界濾過メンブレンは、約10,000ダルトン以下の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項6の方法。
- 前記限界濾過メンブレンは、約3,000ダルトン以下の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項6の方法。
- 前記限界濾過メンブレンは、約2,000ダルトン以下の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項6の方法。
- (7)工程(6)からの分析結果を参照標準と比較する工程を更に備える請求項1、4または5の方法。
- 前記参照標準は、プロテイン標的単体のサンプル、またはプロテイン標的と天然サンプルの混合物いずれかを、工程(2)〜(6)を経させた分析結果である請求項13の方法。
- 工程(1)において、工程(2)に先行して反応混合物中の前記標的と結合する既知の競合リガンドを含める工程を更に備える請求項1、4または5の方法。
- 前記既知の競合リガンドと前記標的の濃度は、ほぼ等モルである請求項15の方法。
- 前記既知の競合リガンドの濃度は、前記標的の濃度の約2倍から10倍の範囲にある請求項15の方法。
- 前記既知の競合リガンドの濃度は、前記標的の濃度の約5倍である請求項15の方法。
- (7)工程(6)からの分析結果を参照標準と比較する工程を更に備える請求項15の方法。
- 前記参照標準は、前記プロテイン標的と前記既知の競合リガンドの混合物を、他の標的結合リガンドの不存在下で、工程(2)〜(6)を経させた分析結果である請求項13の方法。
- 少なくとも一つで分析する工程は、(a)質量分析法、(b)質量分析法とオンライン結合された液体クロマトグラフィ又は(c)液体クロマトグラフィで分析させる工程、とからなることを特徴とする請求項1の方法。
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