JP2005099015A - 液体クロマトグラフィー装置 - Google Patents

Abstract

【課題】処理効率が向上した液体クロマトグラフィー装置を提供すること。
【解決手段】第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、前記成分を検出する第一の検出器と、前記第一の分析カラムで分離された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路であって、前記トラップカラムが複数設けられたトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を取り出す取り出し用流路と前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【選択図】図２

Description

本発明は、液体クロマトグラフィー装置に関する。

複数の成分を含む試料中の成分を分離し、分離した成分をトラップカラムに捕捉し、濃縮する液体クロマトグラフィー装置が知られている（例えば非特許文献１および２参照。）。かかる液体クロマトグラフィー装置は、トラップカラムが１つ設けられているだけであり、トラップカラムでの成分の捕捉・濃縮動作を終了した後に、トラップカラムに捕捉された成分を溶出して第二の分析カラムに導入するというように、捕捉・濃縮動作とトラップカラムに捕捉された成分の溶出動作とを時系列に行うものであった。そのため、処理効率を向上させる上では限界があった。

高圧液体クロマトグラフィー ―その生化学・医化学への応用―，Ｐ.Ｒ.ＢＲＯＷＮ著，西村暹，関谷剛男，葛西宏共訳，東京化学同人発行（１９７９年），第２１頁第８行〜第２５頁第６行 バイオテクノロジー分野における液体クロマトグラフィー工業化技術総合資料集成，左右田健次監修，株式会社ＮＴＳ発行（昭和６２年１月２０日），第１６９頁〜第１７１頁

このような状況のもと、本発明者らは、処理効率が向上した液体クロマトグラフィー装置を開発すべく検討し、トラップカラムを複数設けるとともに、一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構を設けることにより、トラップカラムへの成分の捕捉・濃縮動作とトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作という異種の動作を同時に行うことができ、処理効率が向上することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、
１．第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、前記成分を検出する第一の検出器と、前記第一の分析カラムで分離された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路であって、前記トラップカラムが複数設けられたトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を取り出す取り出し用流路と、前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置；
２．取り出し用流路に、溶出させた成分を分離する第二の分析カラムおよび溶出させた成分を検出する第二の検出器が接続されてなる前項１に記載の液体クロマトグラフィー装置；
３．第二の分析カラムが、内径０．０３〜０．３ｍｍである前項２に記載の液体クロマトグラフィー装置；
４．トラップカラムが、充填型カラムであって、その充填剤の粒径が、１０〜６０μｍである前項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー装置；
５．トラップカラムが、モノリス型カラムである前項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー装置；
６．分取部に保持された成分を、搬送液により押し出しながらトラップカラムに送り出す前項１に記載の液体クロマトグラフィー装置；
７．第一の分析カラムで分離された成分を分画し、希釈液とともに分取部に保持する前項１に記載の液体クロマトグラフィー装置；
８．粒径が１０〜６０μｍである充填剤が充填された充填型カラムであって、内径が０．０３〜１．２ｍｍ、長さが１０〜１００ｍｍであることを特徴とする成分を捕捉し、濃縮するためのトラップカラム；
９．モノリス型カラムであって、内径が０．０３〜１．２ｍｍ、長さが１０〜１００ｍｍであることを特徴とする成分を捕捉し、濃縮するためのトラップカラム等を提供するものである。

本発明の液体クロマトグラフィー装置は、トラップカラムが複数設けられ、一のトラップカラムでの成分の捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムからの成分の溶出動作とを同時に行うための流路切替え機構が備えられているため、トラップカラムが１つで、成分の捕捉・濃縮動作と捕捉された成分の溶出動作とが時系列に行われる従来の装置に比べると、異種の動作を同時に行うことができるため、処理効率が向上する。

以下、図面を参照しながら、本発明を詳細に説明する。図１に、本発明の液体クロマトグラフィー装置の一つの実施態様を示した。図１に示した液体クロマトグラフィー装置は、２つのトラップカラムと２つの流路切替え機構が設けられた装置である。

送液ポンプ２ａおよび２ｂは、有機溶媒、水等の移動相として使用され得る溶媒を送液可能なものであればよい。かかる送液ポンプは、流量を任意に設定することができるものが好ましい。

送液ポンプ２ａの上流側に、流路Ｌ１により切替えバルブ１０が接続されており、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する有機溶媒４ａとは、流路Ｌ２で接続されている。流路Ｌ２の途中にはオンラインデガッサ８が設けられている。オンラインデガッサ８は、流路内を流れる有機溶媒４ａおよび希釈液６ａ中への気泡の噛み込みを防止する機能を有するものであり、安定した送液状態を保つ点で設けておくことが好ましい。また、切替えバルブ１０には、希釈液６ａとの流路Ｌ３が接続されている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ１と流路２とを接続したり、流路Ｌ１と流路Ｌ３とを接続したりするようになっている。

同様に、送液ポンプ２ｂの上流側には、流路Ｌ４により切替えバルブ１０が接続され、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する水４ｂとが流路Ｌ５で、切替えバルブ１０と搬送液６ｂとが流路Ｌ６でそれぞれ接続されている。さらに、流路Ｌ５およびＬ６の途中に、オンラインデガッサ８が設けられている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ４とＬ５とを接続したり、流路Ｌ４とＬ６とを接続したりするようになっている。なお、図１に示す実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと希釈液６ａとを、切替えバルブ１０を介して、送液ポンプ２ａにより送液するようになっているが、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。また、第一の移動相を構成する水４ｂと搬送液６ｂについても、同様に、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。

希釈液６ａは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅから押し出された成分を希釈しながらトラップカラム３０ａおよび３０ｂへ送り出す液であり、搬送液６ｂは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラム３０ａおよび３０ｂに押し出す液であり、それぞれ同じ溶媒であってもよいし、異なる溶媒であってもよく、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂ、成分等に応じて、トラップカラム３０ａおよび３０ｂへの成分の吸着効率を高めるような溶媒を選択することが好ましい。また、かかる希釈液６ａおよび搬送液６ｂとしては、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない水もしくは水溶液も使用することができる。緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合に、かかる緩衝剤を含まない搬送液を用いることにより、成分をトラップカラムへ捕捉・濃縮させる際に、脱塩処理を行うことができる。

送液ポンプ２ａおよび２ｂの下流側の流路Ｌ７およびＬ８は、切替えバルブ１２を介して両流路を流れる液を混合するミキサ１４に接続されており、ミキサ１４で混合された溶液の流路が、試料注入部であるオートサンプラ１６を介して第一の分析カラム１８に接続されている。

送液ポンプ２ａおよび２ｂの流量は、試料、第一の分析カラム等に応じて適宜選択すればよく、それぞれの送液ポンプの流量は一定であってもよいし、それぞれ独立に、経時的に変化させてもよい。なお、図１に示した実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと水４ｂとを２つの送液ポンプで送液し、ミキサ１４で混合し、所定の組成の第一の移動相を調製し、第一の分析カラム１８に送液するようにしているが、あらかじめ有機溶媒４ａと水４ｂを所定の割合で混合しておき、一つの送液ポンプにより送液するようにしてもよい。また、第一の移動相の組成も、有機溶媒と水との混合溶液に限らず、単独の有機溶媒としてもよいし、異なる二種の有機溶媒の混合溶液としてもよく、試料やその成分、分析カラム等に応じて適宜選択すればよい。また、試料中の成分の分離をよくするため、不揮発性塩等の緩衝剤が溶解した緩衝溶液等を第一の移動相を構成する溶媒として用いてもよい。

本発明において、試料とは、濃縮したい成分を含むものであればよく、あらゆる形態の試料を意味し、試料成分自体、試料成分含有製剤等を溶液にしたものの他、例えば、血液、血漿、尿等を媒体とした試料成分等も挙げることができる。

第一の分析カラム１８としては、順相カラム、逆相カラム、イオン交換カラム、アフィニティカラム、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム等種々のカラムが使用でき、分離しようとする試料中の成分に応じて、適宜選択すればよい。かかる分析カラムの内径や長さも特に制限されない。

第一の分析カラム１８の下流側には、第一の検出器であるＵＶ（紫外光）検出器２０が接続され、第一の分析カラム１８で分離された試料中の成分が第一の検出器２０で検出されるようになっている。第一の検出器２０は、切替えバルブ２２を介して、分画用流路２４が接続されている。分画用流路２４は、２つの分配バルブ２６ａおよび２６ｂとの間に分取部を有した流路を複数、並列に備え、切替えバルブ２２と、流路Ｌ９およびＬ１０により接続されており、第一の分析カラム１８で分離された成分が、分配バルブの分配操作により分画され、分画された成分が移動相とともに、分取部２５ａ〜２５ｅに保持されるようになっている。切替えバルブ２２には、ドレインへつながる流路Ｌ２２も接続されている。図１では、分取部は５つ設けられているが、その数は制限されない。

切替えバルブ１２と切替えバルブ２２との間には２つの流路Ｌ１１およびＬ１２が接続されており、一方の流路Ｌ１１は、途中で分岐してトラップ用流路に接続されている。トラップ用流路は、前記分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめる流路であり、前記トラップカラムが複数設けられている。図１に示した実施態様のトラップ流路は、２つのトラップカラム３０ａおよび３０ｂが設けられている。トラップカラム３０ａは流路Ｌ１４で切替えバルブ２８ａと、流路Ｌ１５で切替えバルブ２８ｂとそれぞれ接続されており、トラップカラム３０ｂは流路Ｌ１６で切替えバルブ２８ａと、流路Ｌ１７で切替えバルブ２８ｂとそれぞれ接続されている。さらに、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂの切替え操作により、２つのトラップカラム３０ａおよび３０ｂが同時に使用できるようになっており、トラップ流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うことができる。前記流路Ｌ１１から分岐した流路Ｌ１３は切替えバルブ２８ｂに接続されており、該切替えバルブ２８ｂには、トラップカラム３０ａおよび３０ｂに捕捉・濃縮された成分を取り出す取り出し用流路３２が設けられている。

トラップカラム３０ａおよび３０ｂとしては、通常その内径が、前記第一の分析カラム１８の内径よりも小さいカラムが用いられ、第一の分析カラム１８の内径にもよるが、通常０．０３〜１．２ｍｍ、好ましくは０．０３〜０．３ｍｍの内径のカラムが使用される。また、トラップカラムとしては、例えば筒状部材内に充填剤を充填した充填型カラム、モノリス型カラム等を用いることができる。充填型カラムをトラップカラムとして用いる場合には、トラップカラム内の圧力を小さくするという点で、その粒径が１０〜６０μｍである充填剤が充填された充填型カラムを用いることが好ましい。また、トラップカラムの長さは特に制限されないが、通常は１０〜１００ｍｍ程度である。

切替えバルブ２８ａには、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂを供給するための送液ポンプ３６ａおよび３６ｂが、ミキサ４０を介して接続されている。有機溶媒３８ａおよび水３８ｂと送液ポンプ３６ａおよび３６ｂとを接続する流路には、オンラインデガッサ３９が設けられている。また、切替えバルブ２８ａには、ドレインへの排出流路Ｌ２３が接続されている。

第二の移動相は、トラップカラムからの成分の溶出をより容易にするため、成分やトラップカラムに応じて適宜決めればよい。また、第二の移動相は、トラップカラム３０ａおよび３０ｂに捕捉・濃縮された成分を溶出させるものであるため、成分の分離をよくするための不揮発性塩等の緩衝剤等を用いなくてもよい。

第一の分析カラム１８、トラップカラム３０ａおよび３０ｂは、カラムオーブン４１中に設けられており、略一定の温度に保持されている。図１に示した実施態様では、第一の分析カラム１８、トラップカラム３０ａおよび３０ｂが一つのカラムオーブンに設けられているが、それぞれのカラムごとにカラムオーブンを設けてもよい。

続いて図１〜図３に基づき、本発明の一実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について説明する。図１は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図２および図３は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程が同時に行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。

まず、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態について、図１に基づいて説明する。

＜試料中の成分の分離工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ２とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ５とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂが起動されると、有機溶媒４ａおよび水４ｂがそれぞれ送液ポンプ２ａおよび２ｂにより送液され、それぞれ流路Ｌ７およびＬ８を通り、切替えバルブ１２を経てミキサ１４で混合され、第一の移動相となり、オートサンプラ１６を経て第一の分析カラム１８に送液される。試料をオートサンプラ１６により注入すると、注入された試料は第一の移動相により第一の分析カラム１８に導かれ、試料中の成分が、第一の分析カラム１８で分離される。

＜分離された成分の分画工程＞
分離された成分は第一の分析カラム１８から溶出していき、第一の検出器２０で検出され、切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ９を通り、分画用流路２４へ流れる。第一の検出器２０で成分が検出されると、その検出信号に応じて分配バルブ２６ａおよび２６ｂとが働き、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅのうちのいずれかが選択され、分離された成分を分画し、選択された分取部に分画された成分が第一の移動相とともに保持される。図１では、分取部２５ｅが選択され、成分が分取部２５ｅに分画されている。第一の検出器２０で成分が検出される毎に分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、分画用流路２４内のいずれかの分取部が選択され、分離された成分毎に分画動作が行われ、分画された成分が第一の移動相とともに選択された分取部に保持される。第一の分析カラム１８から流出する第一の移動相により分画用流路２４の分取部に保持されなかったものは、分配バルブ２６ｂ、流路Ｌ１０、切替えバルブ２２、流路Ｌ２２を経て、ドレインから排出される。

一方で、送液ポンプ３６ａおよび３６ｂも起動され、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂがそれぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となり、切替えバルブ２８ａを経て、トラップカラム３０ａおよび３０ｂに送液され、コンディショニングが行われるようになっている。

次に、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程が同時に行われている状態について、図２に基づいて説明する。

＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８ｂ、流路Ｌ１７を通り、トラップカラム３０ｂへ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０ｂへ導かれる。トラップカラム３０ｂに導かれた成分は、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０ｂを経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１６を通り、切替えバルブ２８ａ、流路Ｌ２３を経てドレインから排出される。

＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程＞
一方で、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１４を通り、トラップカラム３０ａに導かれる。トラップカラム３０ａにすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１５を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、取り出し用流路３２へ導かれ、取り出される。

次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程が同時に行われている状態について、図３に基づいて説明する。

図２に示す上記したトラップカラム３０ａからの成分の溶出工程とトラップカラム３０ｂへの成分の捕捉・濃縮工程とが終了すると、図３に示すように、分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、別の分画された成分が保持されている分取部２５ｄが選択される。さらに、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂが切替えられ、分取部２５ｄに保持された成分が、第一の移動相、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとともに切替えバルブ２８ｂを経て、流路Ｌ１５を通り、トラップカラム３０ａに導かれ、トラップカラム３０ａに成分が捕捉され、濃縮される。一方で、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮されていた成分は、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１６を通った第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、取り出し用流路３２へ導かれ、取り出される。

このように、本発明の液体クロマトグラフィー装置では、トラップカラムを複数有し、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構を備えていることから、トラップカラムにおける成分の捕捉・濃縮動作と別のトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出動作を同時に、また連続的に行うことができるため、処理効率が向上する。

また、取り出された成分は、オートサンプラ１６から注入された試料と比較すると、濃縮された状態になっているため、試料中に含まれる成分の量がわずかであっても、取り出された成分を、例えば質量分析、ＮＭＲ等で分析することにより、高感度のデータを取得することができ、測定効率も向上する。しかも、不揮発性塩等の緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合には、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない希釈液や搬送液を用いることにより、脱塩処理も同時に行うことができるため、不揮発性塩等の緩衝剤の影響を受けやすい質量分析等に適した前記緩衝剤を実質的に含まない分析サンプルを調製することもできる。そのため、質量分析装置や核磁気共鳴装置を取り出し用流路３２に接続し、オンライン分析を行うこともできる。

なお、図１〜図３では、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分を、希釈液６ａおよび搬送液６ｂで希釈し、押し出しながらトラップカラム３０ａおよび３０ｂへ導くようにしているが、分画された成分を、搬送液６ｂとともに分取部２５ａ〜２５ｅに保持するようにしてもよい。

図４に、本発明の液体クロマトグラフィー装置の別の実施態様を示した。図４に示した液体クロマトグラフィー装置は、５つのトラップカラムが２組並列に設けられるとともに、流路切替え機構が設けられ、取り出し用流路に、溶出させた成分を分離する第二の分析カラムおよび溶出させた成分を検出する第二の検出器（ＵＶ検出器）が接続された装置である。図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、例えばトラップカラム３０ａでは、成分の捕捉・濃縮動作と成分の溶出動作が交互に行われるため、溶出しきれず、トラップカラム３０ａ内に成分が残存した場合には、次に捕捉・濃縮しようとする成分と混ざり合う可能性があり、例えば成分の溶出動作に要する時間を延ばす等の必要が生じる場合があるが、図４に示す実施態様では、成分を捕捉・濃縮させるトラップカラムを代えることができるため、より効率的に処理できる。

図４に示した実施態様では、図１に示した実施態様と異なり、５つのトラップカラムが２組並列に設けられており、分配バルブ４２ａ、４２ｂ、４４ａおよび４４ｂによりいずれかのトラップカラムを選択するようになっている。トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちのいずれかのトラップカラムを選択する分配バルブ４２ａおよび４２ｂと、トラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちのいずれかのトラップカラムを選択する分配バルブ４４ａおよび４４ｂが設けられ、これら分配バルブと切替えバルブ２８ａおよび２８ｂの切替え操作により、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うことができる。なお、図４では、５本のトラップカラムが一組になっているが、トラップカラムの本数は特に制限されない。

第二の分析カラム６０を設けることにより、より濃縮された成分を取り出すことができる。かかる第二の分析カラム６０としては、トラップカラムから溶出した成分をさらに高濃度に濃縮するという観点から、内径０．０３〜０．３ｍｍのカラム、例えばミクロカラムやナノカラム、を用いることが好ましい。第二の分析カラム６０の長さは、通常１０〜３０ｃｍである。

図４および図５に基づき、本発明の別の実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について説明する。図４は、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われる状態を示したものであり、工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図１に基づいて上述したと同様に、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程が行われる。図４では、分取部２５ｅに、成分が分画されている。一方で、送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂとが送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１８を通り、分配バルブ４２ａおよび４２ｂで選択されたトラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの一つのトラップカラム、例えばトラップカラム５０ｃに導かれる。トラップカラム５０ｃ内に捕捉・濃縮されていた成分が、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１９を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム６０を通り、第二の検出器６１で検出される。

切替えバルブ２８ａおよび２８ｂを切替えると、第二の移動相は、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ２０を通り、分配バルブ４４ａおよび４４ｂにより選択されたトラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちのひとつのトラップカラムに導かれる。分配バルブ４４ａおよび４４ｂにより選択されたトラップカラム内に捕捉・濃縮されていた成分が、第二の移動相により溶出し、流路Ｌ２１を通り、分配バルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム６０へ導かれる。このように、本発明の液体クロマトグラフィー装置では、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程を同時に行うこともできる。

図５は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われる状態を示したものであり、図４と同様、工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。分配バルブ２６ａおよび２６ｂにより選択された分画用流路２４の分取部２５に保持されていた成分が、搬送液６ｂにより、第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８ｂ、流路Ｌ２１を通り、トラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちの分配バルブ４４ａおよび４４ｂで選択されたトラップカラムへ導かれる。該トラップカラムを経た第一の移動相と搬送液６ｂは、流路Ｌ２０を通り、切替えバルブ２８ａ、流路Ｌ２３を経てドレインから排出される。一方で、第二の移動相が、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１８を通り、トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの分配バルブ４２ａおよび４２ｂで選択されたトラップカラムに導かれる。該トラップカラムにすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１９を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム６０、第二の検出器であるＵＶ検出器６１へ導かれ、分析が行われる。

トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの分配バルブ４２ａおよび４２ｂで選択されたトラップカラムからの成分の溶出工程が終了すると、分配バルブ４２ａおよび４２ｂが切替えられて、トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの別のトラップカラムが選択され、上述と同様に、トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの別のトラップカラムからの成分の溶出工程が行われる。一方で、トラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちの分配バルブ４４ａおよび４４ｂで選択されたトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程が終了すると、分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、別の分画された成分が保持された分取部が選択され、さらに、分配バルブ４４ａおよび４４ｂが切替えられて、トラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちの別のトラップカラムが選択され、上述と同様に、トラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちの別のトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程が行われる。このようにして、トラップカラムからの成分の溶出工程とトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程とが同時に行われ、トラップカラム５０ａ〜５０ｅのすべてのトラップカラムからの成分の溶出工程とトラップカラム５０ｆ〜５０ｊのすべてのトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程が終了すると、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂが切替えられ、トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちのいずれかのトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程とトラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちのいずれかのトラップカラムからの成分の溶出工程が行われる。

また、トラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの分配バルブ４２ａおよび４２ｂで選択されたトラップカラムからの成分の溶出工程とトラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちの分配バルブ４４ａおよび４４ｂで選択されたトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程とが終了した後、分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、別の分画された成分が保持された分取部が選択され、分配バルブ４２ａおよび４２ｂ、分配バルブ４４ａおよび４４ｂがそれぞれ切替えられるとともに、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂも切替えられて、トラップカラム５０ｆ〜５０ｊのうちの分配バルブ４４ａおよび４４ｂで選択された別のトラップカラムからの成分の溶出工程とトラップカラム５０ａ〜５０ｅのうちの分配バルブ４２ａおよび４２ｂで選択されたトラップカラムへの成分の捕捉・濃縮工程を同時に行うようにしてもよい。

なお、図１〜図５では、切替えバルブ１０を設けて、送液ポンプ２ａおよび２ｂにより、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂと、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとを、切替えて送液し、同じ流路を通り、分画用流路２４へ送液されるようになっているが、希釈液６ａおよび搬送液６ｂを送液する送液ポンプを別途設けるとともに、希釈液６ａおよび搬送液６ｂが、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂが流れる流路とは異なる流路を通るようにして、分画用流路２４へ送液するようにすることにより、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の溶出・取り出し工程もしくは成分の第二の分析カラムでの分析工程と、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出・取り出しもしくは第二の分析カラムでの分析工程とを同時に行うようにすることもできる。

本発明の一つの実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示す。 本発明の一つの実施態様である液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の取り出し工程が同時に行われている状態を示す。 本発明の一つの実施態様である液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の取り出し工程が同時に行われている状態を示す。 本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われる状態を示す。 本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われる状態を示す。

符号の説明

２ａ，２ｂ，３６ａ，３６ｂ 送液ポンプ
４ａ 第一の移動相を構成する有機溶媒
４ｂ 第一の移動相を構成する水
６ａ 希釈液
６ｂ 搬送液
８，３９ オンラインデガッサ
１０，１２，２２，２８ａ，２８ｂ 切替えバルブ
１４，４０ ミキサ
１６ オートサンプラ
１８ 第一の分析カラム
２０ 第一の検出器（ＵＶ検出器）
２４ 分画用流路
２５ａ〜２５ｅ 分取部
２６ａ，２６ｂ，４２ａ，４２ｂ，４４ａ，４４ｂ 分配バルブ
３０ａ，３０ｂ，５０ａ〜５０ｊ トラップカラム
３２ 取り出し用流路
３８ａ 第二の移動相を構成する有機溶媒
３８ｂ 第二の移動相を構成する水
４１ カラムオーブン
６０ 第二の分析カラム
６１ 第二の検出器（ＵＶ検出器）
Ｌ１〜Ｌ２３ 流路

Claims (9)

1. 第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
   前記成分を検出する第一の検出器と、
   前記第一の分析カラムで分離された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、
   前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路であって、前記トラップカラムが複数設けられたトラップ用流路と、
   第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を取り出す取り出し用流路と、
   前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
2. 取り出し用流路に、溶出させた成分を分離する第二の分析カラムおよび溶出させた成分を検出する第二の検出器が接続されてなる請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
3. 第二の分析カラムが、内径０．０３〜０．３ｍｍのカラムである請求項２に記載の液体クロマトグラフィー装置。
4. トラップカラムが、充填型カラムであって、その充填剤の粒径が、１０〜６０μｍである請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー装置。
5. トラップカラムが、モノリス型カラムである請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー装置。
6. 分取部に保持された成分を、搬送液により押し出しながらトラップカラムに送り出す請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
7. 第一の分析カラムで分離された成分を分画し、希釈液とともに分取部に保持する請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
8. 粒径が１０〜６０μｍである充填剤が充填された充填型カラムであって、内径が０．０３〜１．２ｍｍ、長さが１０〜１００ｍｍであることを特徴とする成分を捕捉し、濃縮するためのトラップカラム。
9. モノリス型カラムであって、内径が０．０３〜１．２ｍｍ、長さが１０〜１００ｍｍであることを特徴とする成分を捕捉し、濃縮するためのトラップカラム。
   

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