JP4158712B2 - 液体クロマトグラフ - Google Patents

Description

本発明は、高速液体クロマトグラフなどの液体クロマトグラフに関し、特に分離した成分をトラップカラムに捕捉して濃縮する機能を備えた液体クロマトグラフに関するものである。

２次元高速液体クロマトグラフィでは、1次元目分析において分画された分析対象成分は一時滞留場所としてフラクションループなどに入れられ、濃縮行程においてフラクションループなどの分取部に一時滞留していた分析対象成分を濃縮液によってトラップカラムへと導き吸着させて濃縮する。その後、トラップカラムに吸着している分析対象成分を離脱させて２次元目の分析で再分析を行なう（特許文献１参照。）。

濃縮行程では濃縮液は、分析対象成分が一時滞留している分取部の上流から供給され、トラップカラムへと導かれるが、1次元目の分析での移動相が分取部より上流で濃縮液の流路と兼用される流路内に満たされているため、濃縮を行なう前にそれらの流路の移動相を濃縮液で置換しなければならない。その際、置換される移動相はトラップカラムを通って追い出される。
特開２００３−６６０２０号公報

１次元目分析で流路内に満たされた移動相を流路外に追い出す際，基本的には流路内の容量分を追い出す。ここで、例えば、１次元目分析用の移動相と濃縮液を流路切替バルブで切り替えて共通の送液ポンプ部で送液する流路構成をとっているとして、流路切替バルブからポンプまでの容量、ポンプ内の圧力ダンパを含めた容量などを勘案すると置換する流路内の容量は約１ｍＬとなる。流路内に残った１次元目分析移動相を完全に追い出すには流路内容量の５倍量、すなわち５ｍＬの量の濃縮液を送液する必要がある。トラップカラムが通常の内径４.６ｍｍ程度であれば、このとき送液する流量はたとえば４ｍＬ／分程度まで許容されるため約１.２５分で追い出し操作は完了する。しかし、トラップカラムの内径が小さくなればなるほど移動相の置換に時間がかかり、濃縮行程は時間のかかる行程となる。たとえば、トラップカラムがミクロスケール（内径０.３ｍｍ）となって、流すことのできる流量が４０μＬ／分であった場合、置換すべき移動相をその流路から追い出すのに要する時間が１２５分となってしまう。
そこで、本発明は、濃縮行程における液の置換に要する時間を短縮することによって、液体クロマトグラフの処理効率を向上させることを目的とするものである。

本発明の液体クロマトグラフは、1次元目分析用移動相の流路に配置された試料注入部、前記試料注入部から注入された試料を1次元目分析用移動相により分離する１次元目分析カラム、及び分離された成分を1次元目分析用移動相とともに分画して保持する分取部を備えた分画用流路と、前記分取部に保持された成分と1次元目分析用移動相を送り出す濃縮液の流路に配置され、前記成分を捕捉して濃縮するトラップカラムを備えたトラップ用流路と、前記トラップカラムに捕捉された成分を溶出して送り出す２次元目分析用移動相の流路に配置され前記成分を分離する２次元目分析カラム、及び前記２次元目分析カラムで分離された成分を検出する検出器を備えた分析流路と、前記分取部と前記トラップカラムとの間の流路に設けられ、その流路を廃液側に切り替えることのできる流路切替えバルブとを備えている。
本発明では、濃縮行程で分析対象成分をトラップカラムへ導入する溶媒を濃縮液と呼んでいる。

1次元目分析移動相を流路より追い出す行程では流路切替バルブを廃液側に切り替え、置換される移動相がトラップカラム内を通過しないようにし、濃縮の際には流路切替バルブをトラップカラム側に切り替える。

トラップ用流路はトラップカラムを複数備えたものとする。その場合、一のトラップカラムでの捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムからの２次元目分析動作とを同時に行なわせる流路を形成し、かつトラップカラム間で動作を切り替えるように流路を切り替える流路切替え機構を備えている。
1次元目分析用移動相と濃縮液を共通の送液ポンプにより供給するようにすることもできる。

本発明では、濃縮行程では、1次元目分析移動相を流路より追い出すために流路切替バルブを廃液側に切り替えて置換される移動相がトラップカラム内を通過しないようにすることができるので、移動相の置換が短時間で完了し、濃縮行程の時間が短縮されて液体クロマトグラフの処理効率が向上する。

トラップカラムを複数設け、一のトラップカラムでの捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムからの２次元目分析とを同時に行なえるようにしたので、トラップカラムが１つで捕捉・濃縮動作と２次元目分析とが時系列に行なわれるのに比べると、処理効率が向上する。
さらに、1次元目分析用移動相と濃縮液を共通の送液ポンプにより供給するようにしたので、流路が簡素化される。

次に、図面を参照して実施例を詳細に説明する。
［実施例１］
図１は第１の実施例を表す。
一次元目分析用移動相と濃縮液を供給するために互いに独立に流量を設定することのできる２台の送液ポンプ２ａと２ｂが設けられている。送液ポンプ２ａには１次元分析用移動相である有機溶媒４ａと濃縮液６ａの流路が接続されている。有機溶媒４ａと濃縮液６ａはガスの混入を防止するオンラインデガッサ８から切替えバルブ１０を介して送液ポンプ２ａに接続されており、切替えバルブ１０によって有機溶媒４ａと濃縮液６ａの何れかの流路が切り替えて接続されるようになっている。同様に、他方の送液ポンプ２ｂには１次元分析用移動相である水４ｂと濃縮液６ｂの流路が接続されている。水４ｂと濃縮液６ｂもオンラインデガッサ８から切替えバルブ１０を介して送液ポンプ２ｂに接続されており、切替えバルブ１０によって水４ｂと濃縮液６ｂの何れかの流路が切り替えて接続されるようになっている。

濃縮液６ａと６ｂは同じものであり、移動相４ａ，４ｂに応じてトラップカラムへの吸着効率を高めるような溶媒を選択して使用する。
送液ポンプ２ａと２ｂの下流の流路は切替えバルブ１２を介して両流路の液を混合するミキサ１４に接続され、ミキサ１４で混合された溶液の流路が試料導入部であるオートサンプラ１６を介して１次元目分析カラム１８に接続されている。

分析カラム１８の下流の流路はＵＶ（紫外線）検出器２０に接続され、分析カラム１８で分離された成分が検出器２０で検出されるようになっている。
検出器２０の下流の流路は切替えバルブ２２を介してフラクションループ２４に接続されている。フラクションループ２４は２つの分配バルブ２６ａと２６ｂの間に複数の流路を並列に備え、分画した成分と移動相をそれぞれの流路に保持できるようになっている。切替えバルブ２２には廃液側へつながる流路も接続されている。

バルブ１２と２２の間には２つの流路が接続され、一方の流路は分岐し、流路切替えバルブ５２を介してトラップ用流路に接続されている。流路切替えバルブ５２は分岐流路をトラップ用流路と廃液側とに切り替えることのできるものである。
トラップ用流路ではトラップカラムが３０ａと３０ｂとして示されるように２つ設けられ、切替えバルブも２８ａと２８ｂとして示されるように２つ設けられ、トラップカラム３０ａと３０ｂがともに切替えバルブ２８ａと２８ｂに接続されて同時に使用できるようになっている。バルブ１２と２２の間の一方の流路から分岐した流路は切替えバルブ２８ｂに接続され、その切替えバルブ２８ｂには更に２次元目分析カラム３２も接続されている。分析カラム３２の下流の流路にはＵＶ検出器３４が接続されている。

２次元目分析用移動相を供給するために２台の送液ポンプ３６ａと３６ｂが設けられている。送液ポンプ３６ａ，３６ｂには２次元目分析用移動相である有機溶媒３８ａと水３８ｂ用の流路がオンラインデガッサ３９を介してそれぞれ接続されている。送液ポンプ３６ａと３６ｂの下流の流路は両流路の液を混合するためのミキサ４０を介して切替えバルブ２８ａに接続されている。
４２はカラムオーブンであり、カラム１８と３０ａ，３０ｂを一定の温度に保持する。

分析カラム１８，３２としては、順相カラム、逆相カラム、イオン交換カラム、アフィニティクロマトカラム、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィ）カラムなど、種々のカラムを分離分析しようとする成分に応じて選択して使用すればよい。トラップカラム３０ａ，３０ｂとしては分析カラム１８，３２と同種のカラムで短いものを使用することができる。

次に、この実施例の動作について説明する。
（１次元目分析）
図１は１次元目分析及び分画の行程を表わしたものである。流路で太線で表わされている部分は当該行程の動作を示す流路である。以下の図の説明でも同じである。

切替えバルブ１０により移動相４ａと４ｂが選択されている状態で送液ポンプ２ａと２ｂが送液を行なう。移動相は切替えバルブ１２を経てミキサ１４で混合され、オートサンプラ１６を経て分析カラム１８に流れる。オートサンプラ１６から注入された試料は分析カラム１８で分離され、溶出して検出器２０で検出される。検出器２０でピーク検出が行なわれると、その信号に応じて分配バルブ２６ａと２６ｂが働き、フラクションループ２４の何れかに分画された試料成分が移動相とともに保持される。

検出器２０によりピーク検出が行なわれる毎に分配バルブ２６ａと２６ｂが切り替えられてそれぞれのフラクションループ２４に分画された試料成分と移動相の保持がなされていく。
分析カラム１８から流出する移動相でフラクションループ２４に保持されなかったものは廃液側へ排出されていく。

この行程の間も、２次元分析用移動相３８ａと３８ｂがオンラインデガッサ３９を経て気泡が除去された状態でそれぞれ送液ポンプ３６ａと３６ｂにより供給され、ミキサ４０で混合されて送られ、切替えバルブ２８ａからいずれかのトラップカラム３０ａ又は３０ｂを経て２次元目分析カラム３２に移動相が流れてコンディショニングが行われる。

（濃縮と２次元目分析）
図２により、トラップカラム３０ｂによる濃縮と、トラップカラム３０ａに捕捉されていた試料成分を溶出して分析カラム３２で２次元目分析を行なう動作を説明する。

切替えバルブ１０が切り替えられて、濃縮液６ａと６ｂが送液ポンプ２ａと２ｂによって供給される。
まず、流路の１次元分析用移動相を濃縮液で置換するために、流路切替えバルブ５２が廃液側に切り替えられる。送液ポンプ２ｂにより供給される濃縮液は切替えバルブ１２，２２を通って分配バルブ２６ｂから分画成分を保持していないフラクションループ２４を通り、切替えバルブ２６ａから切替えバルブ２２，５２を通って排出される。ポンプ２ａから供給される濃縮液６ａは切替えバルブ１２を経て供給され、フラクションループ２４を経た濃縮液と合流し切替えバルブ５２を通って排出される。このとき、濃縮液６ａ，６ｂが通った流路に残っていた１次元分析用移動相は濃縮液６ａ，６ｂにより押し出され、切替えバルブ５２を通って排出される。

次に、流路切替えバルブ５２がトラップカラム側に切り替えられる。送液ポンプ２ｂにより供給される濃縮液は切替えバルブ１２，２２を通って分配バルブ２６ｂから所定のフラクションループ２４を通り、そのフラクションループ２４に保持されていた分画成分と移動相が切替えバルブ２６ａから切替えバルブ２２，２８ｂを通り、トラップカラム３０ｂに導かれる。このとき、濃縮液６ａがポンプ２ａから切替えバルブ１２を経て供給され、フラクションループ２４を経た濃縮液と合流し、その流路からの移動相を希釈しながらトラップカラム３０ｂへ導かれる。トラップカラム３０ｂでは試料成分が捕捉されることにより濃縮されていく。トラップカラム３０ｂを経た移動相と濃縮液は切替えバルブ２８ａを経て廃液側へ排出される。

一方、２次元分析用移動相３８ａと３８ｂがオンラインデガッサ３９を経て気泡が除去された状態でそれぞれ送液ポンプ３６ａと３６ｂにより供給され、ミキサ４０で混合されて送られる。その混合された移動相は切替えバルブ２８ａを経てトラップカラム３０ａに至り、トラップカラム３０ａに捕捉されていた試料成分を溶出して切替えバルブ２８ｂから２次元目分析カラム３２に導く。分析カラム３２に導かれた試料成分は更にその分析カラム３２で分離され、溶出して検出器３４で検出される。

切替えバルブ２８ａと２８ｂを切り替えると、トラップカラム３０ａによる濃縮と、トラップカラム３０ｂに捕捉されていた試料成分を溶出して分析カラム３２で２次元目分析を行なう動作を行なうようになる。

［実施例２］
図３は第２の実施例を表す。
図１の実施例と比較すると、トラップカラム３０ａ，３０ｂはそれぞれ複数個が並列に設けられ、それぞれ分配バルブ４２ａ，４２ｂと分配バルブ４４ａ，４４ｂによりいずれかが選択できるようになっている点で異なる。

この実施例は１次元目分析動作及び分画の動作と、２次元目分析を同時に行なうとともに、トラップによる濃縮動作と２次元目分析を同時に行なうようにしたものである。

（１次元目分析と２次元目分析）
図３は１次元目分析及び分画の行程と２次元目分析とを同時に行なう動作を表わしたものである。
実施例１の図１に示した動作と同じく、１次元目分析及び分画の動作を行なう。

一方、２次元分析用移動相３８ａと３８ｂがオンラインデガッサ３９を経て気泡が除去された状態でそれぞれ送液ポンプ３６ａと３６ｂにより供給され、ミキサ４０で混合されて送られる。その混合された移動相は切替えバルブ２８ａを経て分配バルブ４２ａ，４２ｂにより選択されたトラップカラム３０ａの１つに至り、そのトラップカラム３０ａに捕捉されていた試料成分を溶出して切替えバルブ２８ｂから２次元目分析カラム３２に導く。分析カラム３２に導かれた試料成分は更にその分析カラム３２で分離され、溶出して検出器３４で検出される。

切替えバルブ２８ａと２８ｂを切り替えると、分配バルブ４４ａ，４４ｂにより選択されたトラップカラム３０ｂの１つに捕捉されていた試料成分を溶出して分析カラム３２で２次元目分析を行なう動作を行なうようになる。

（濃縮と２次元目分析）
図４は、分配バルブ４４ａ，４４ｂにより選択されたトラップカラム３０ｂの１つによる濃縮と、分配バルブ４２ａ，４２ｂにより選択されたトラップカラム３０ａの１つに捕捉されていた試料成分を溶出して分析カラム３２で２次元目分析を行なう動作を示したものである。この動作は図２の動作の説明と同じである。この場合も、濃縮に先立ち、流路切替えバルブ５２を廃液側に切り替えられ、流路に残っていた１次元目分析用移動相が排出される。

本発明の液体クロマトグラフは、化学、医薬品、生物化学などの分野において溶液中の成分の分析に利用することができ、特に微量成分の分析に適する。

第１の実施例を１次元目分析行程の状態で示す流路図である。 同実施例を濃縮行程と２次元目分析行程の状態で示す流路図である。 第２の実施例を１次元目分析行程と２次元目分析行程の状態で示す流路図である。 同実施例を濃縮行程と２次元目分析行程の状態で示す流路図である。

符号の説明

２ａ，２ｂ，３６ａ，３６ｂ 送液ポンプ
４ａ，４ｂ １次元分析用移動相
６ａ，６ｂ 濃縮液
８，３９ オンラインデガッサ
１０，１２，２２，２８ａ，２８ｂ 切替えバルブ
１４，４０ ミキサ
１６ オートサンプラ
１８，３２ 分析カラム
２０ ＵＶ検出器
２４ フラクションループ
２６ａ，２６ｂ，４２ａ，４２ｂ 分配バルブ
３０ａ，３０ｂ トラップカラム
４２ カラムオーブン
５２ 流路切替えバルブ

Claims (1)

1次元目分析用移動相の流路に配置された試料注入部、前記試料注入部から注入された試料を1次元目分析用移動相により分離する１次元目分析カラム、及び分離された成分を1次元目分析用移動相とともに分画して保持する分取部を備えた分画用流路と、
前記分取部に保持された成分と1次元目分析用移動相を送り出す濃縮液の流路に配置され、前記成分を捕捉して濃縮するトラップカラムを備えたトラップ用流路と、
前記トラップカラムに捕捉された成分を溶出して送り出す２次元目分析用移動相の流路に配置され前記成分を分離する２次元目分析カラム、及び前記２次元目分析カラムで分離された成分を検出する検出器を備えた分析流路と、
前記分取部と前記トラップカラムとの間の流路に設けられ、その流路を廃液側に切り替えることのできる流路切替えバルブとを備え、
前記トラップ用流路はトラップカラムを複数備え、一のトラップカラムでの捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムからの２次元目分析動作とを同時に行なわせる流路を形成し、かつトラップカラム間で動作を切り替えるように流路を切り替える流路切替え機構をさらに備え、
前記1次元目分析用移動相と前記濃縮液を共通の送液ポンプにより供給するようにした液体クロマトグラフ。

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