JP4609494B2 - 液体クロマトグラフ - Google Patents

Description

本発明は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）などの液体クロマトグラフに関し、特に１次元目分析カラムで分離した成分をトラップカラムに捕捉し、その捕捉された成分を２次元目分析カラムで再度分離する２次元液体クロマトグラフに関するものである。

液体クロマトグラフィーにおける分離モードには順相、逆相、吸着、イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーなど種々のものがある。１次元液体クロマトグラフィーではこれらのうちの一の分離モードが使用される。

しかし、対象によっては１次元液体クロマトグラフィーでは十分に分析できない場合がある。例えば、タンパク質などの生体試料を扱うプロテオーム解析分野では、分析対象成分を１種の分離モードでの高速液体クロマトグラフィで分析を行なった場合、溶出成分が多すぎて成分のピークが重なり合い、検出器として高分解能が得られる質量分析計を使用してもその解析を行なうことは困難である。

そこで用いられる手法として、２種類の機構の異なる分離モードを組み合わせた２次元液体クロマトグラフィーがある。２次元液体クロマトグラフィーでは、一般に１次元目をイオン交換モードとしてイオン強度により分離を行ない、続いて、２次元目で１次元目のイオン交換カラムから溶出してきた成分を逆相モードで分析を行なう。

より具体的に示すと、１次元目分離用のイオン交換カラムと２次元目分離用の逆相カラムを直列に接続し、その下流に検出器を接続しておく。１次元目はイオン交換モードの移動相を流してイオン交換カラムによりイオン強度による濃度勾配をかけて分離を行なうが、１次元目ではすべての成分を溶出させず一部の成分のみ溶出させて逆相カラムに導く。その状態で移動相を逆相モードに切り替え、１次元目で溶出されてきた一部の成分のみを逆相カラムで脱塩と２次元目分離を行ない、検出器で検出する。２次元目の分離と分析が終了したら、再度移動相をイオン交換モードに切り替え、イオン強度を変えて次の溶出成分を１次元目カラムより溶出させる。そして、再び移動相を逆相モードに切り替えて脱塩と２次元目分離分析を行なう。このようにして、１次元目分離と２次元目分離を繰り返して２次元液体クロマトグラフィーを行なっていく。
しかし、このようなシステムの場合、系内の移動相の置換に多大な時間がかかり効率的な分析が行なえなかった。

そこで考えられたのがトラップカラムを使用する方法である。その方法では、１次元目分離用の流路と２次元目分離用の流路を別に設け、１次元目カラムから溶出した成分をいったんトラップカラムに捕捉し、流路を切り替えて、トラップカラムに捕捉された成分を２次元目分離用の流路で分離し分析するというものである。

このシステムは１次元目と２次元目の２つのカラムを直列に接続したものに比べると、１次元目分析のイオン交換モードに用いる移動相送液ポンプと２次元目分析の逆相モードに用いる移動相送液ポンプがそれぞれ別に設けられている点及びトラップカラムを用いている点で改良を行なっている。このシステムでは１次元目の分析においてあるイオン強度の濃度で分析対象成分の一部を溶出させてトラップカラムに捕捉させた時点で１次元日移動相送液ポンプを停止させ、トラップカラムが接続されている流路切替えバルブを切り替えて２次元目分析を行なう。２次元目分析が終了した時点で１次元目ポンプの送液を再度開始して濃度を変えて次の溶出成分をトラップカラムに捕捉させて１次元目ポンプの送液を停止させ、流路切替えバルブを切り替えて２次元目分析をする。これらの動作を繰り返すことによって２次元液体クロマトグラフィーを行なう。それぞれの移動相送液ポンプを別々に設けたことにより移動相を切り替える時間の短縮が行なえる点、トラップカラムを設けたことにより、１次元目で溶出してきた成分が濃縮された状態で２次元目分析が行なわれる点において改良が行なわれている。

しかし、１次元目送液ポンプを分析途中で複数回停止させなければならないので、分析間の再現性が乏しい点、１次元目分析から２次元目分析に切り替える際、流路切替えバルブの１次元目分析流路が開放系になるため流路内に残存する内圧による１次元目流路からの１次元目移動相の漏出がおこり、場合によっては重要な測定対象成分の一部が分析流路外に漏れ出る可能性がある。

次に考えられたのが複数のトラップカラムを使用する方法である（特許文献１参照。）。そのシステムでは、１次元目分析で濃度勾配をかけながらすべての成分を分離して溶出させ、その溶出成分を複数のトラップカラムによりすべて捕捉させてから、トラップカラムを順次２次元目分析用の流路に接続して２次元目分析を行なう。このシステムでは１次元目分析を途中で中断することがないので、分析再現性がよく、測定対象成分が漏れなく分析できる点で改善が行なわれている。
特開２００３−２５４９５５号公報

複数のトラップカラムを用いて、１次元目で分離された溶出成分をすべて捕捉する方法は、１次元目の溶出成分がトラップカラムの数しか分画できないという制約がある。試料の成分が多数になるに従い、トラップカラムの数を多くしなければならず、装置が大掛かりになっていくという問題がある。
本発明は最少のトラップカラムの数で幾らの成分でも分析できる２次元液体クロマトグラフを提供することを目的とするものである。

本発明は、試料注入部から注入された試料を分離用移動相により分離カラムに導いて分離する１次元目分離流路と、３つのトラップカラムと、分析用移動相を供給する分析用移動相流路と、前記トラップカラムに捕捉された成分を前記分析用移動相により分析カラムに導いて分析する２次元目分析流路と、脱塩用移動相を供給する脱塩用移動相流路と、

一のトラップカラムに前記１次元目分離流路を接続し、他の一のトラップカラムに前記脱塩用移動相流路を接続し、さらに他の一のトラップカラムに前記１次元目分析流路を接続するとともに、トラップカラムとそれらの流路との接続を切り替える流路切替え機構とを備え、前記流路切替え機構は、前記３つのトラップカラムの一端と他端が接続される第１及び第２の２ポジションバルブと、前記１次元目分離流路、前記脱塩用移動相流路、前記分析用移動相流路が接続されるとともに一端が前記第１の２ポジションバルブと接続される３つの流路の他端が接続される第３の２ポジションバルブと、一端が前記第２の２ポジションバルブと接続される３つの流路の他端及び前記２次元目分析流路が接続される第４の２ポジションバルブとからなることを特徴とする。

３つのトラップカラムのそれぞれに対して、１次元目分離流路、脱塩用移動相流路、分析用移動相流路が接続され、さらに、トラップカラムで濃縮された成分がから２次元目分離流路へ導く流路が構成される。

さらに、前記トラップカラムでは前記１次元目分離流路を接続してその溶離成分を濃縮する濃縮動作、前記脱塩用移動相流路を接続した脱塩動作及び前記２次元目分析流路へ接続した溶出動作をこの順に行なわせ、かつ一のトラップカラムにおける濃縮動作、他の一のトラップカラムでの脱塩動作及びさらに他の一のトラップカラムにおける溶出動作を同時に行なわせるように前記流路切替え機構を制御する制御装置を備えることが好ましい。

１次元目分析では最適の分離を行なうために１次元目分析用移動相が塩を含む場合が多い。その場合、２次元目分析の際にその塩が残っていると２次元目分離モードに支障が生じることがある。また、高感度で高選択性を得るために検出器として質量分析計を使用する場合は、質量分析計に塩が混入すると、エレクトロスプレーイオン化や質量分析計内への気化イオンの移動を妨げ、最適条件で分析を行なうことができないことがある。そこで、２次元目分析の前に脱塩処理を施すようにする。

本発明では、３つのトラップカラムに１次元目分析カラムで分離した成分を順次捕捉していき、捕捉した成分の２次元目分析を終了するとそのトラップカラムに１次元目分析カラムから残りの成分の一部を溶出させて捕捉するというように、一部の成分の捕捉、脱塩及び２次元目分析を、それらのトラップカラムで並行して同時に進めていくので、３つのトラップカラムで成分の数に制限されることなく２次元目分析を続けていくことができる。その結果、本発明ではトラップカラムの数も少なく、システムが簡易になるので、制御がしやすくコストも少なくなる。

トラップカラムの数を３つとした場合に、１次元目で分離した成分の濃縮動作、脱塩動作及び２次元目での分析動作をそれぞれ異なるトラップカラムで同時に行なわせるようにすれば、さらに生産性を上げることができる。

図１は本発明の基礎的な構成を示す参考例を表わす。
２は１次元目分離流路であり、グラジエント分離を行なうことができるように２種類の移動相４，６がデカッサ８を介してそれぞれの送液ポンプ１０，１２により供給され、ミキサー１４により混合されて１次元目用分析カラム１６へ供給されるようになっている。ミキサー１４とカラム１６の間には試料を注入するインジェクタ１８が設けられている。インジェクタ１８はオートサンプラを構成しており、試料が自動的に注入されるようになっている。

カラム１６で分離された成分を濃縮して捕捉するために、２つのトラップカラム２０,２２が、流路を切り替えるための２つの六方バルブ２４，２６の間に接続されており、カラム１６の下流はバルブ２４に接続されている。

２８は脱塩用移動相流路で、脱塩用移動相３０をデガッサ８を介して送液ポンプ３２により供給するものであり、六方バルブ３４に接続されている。
３６は分析流路であり、グラジェント分析を行なうための２種類の移動相３８，４０がデガッサ４２を介してそれぞれの送液ポンプ４４，４６により送られ、ミキサー４８で混合され、バルブ３４を介して２次元目分析カラム５０に供給される。カラム５０の下流には紫外線吸光度を検出するＵＶ検出器５２と、さらにその下流に質量分析計５４が検出器として接続されている。

バルブ２４，２６，３４は一方のトラップカラム２０(又は２２)に１次元目分離流路２を接続し、他方のトラップカラム２２(又は２０)に脱塩用移動相流路２８又は分析流路３６を接続するとともに、トラップカラム２０,２２とそれらの流路２，２８，３６との接続を切り替えるように流路が接続される。流路切替え機構はバルブ２４，２６，３４とその流路接続により実現される。

図２はこの参考例で、１次元目分離された成分を一方のトラップカラムで捕捉して濃縮する濃縮動作と、他方のトラップカラムで脱塩を行なう動作を同時に行なうための流路である。流路の切替えは図示されていない制御装置が行なう。バルブ２４，２６，３４の設定によりカラム１６で分離された成分がトラップカラム２０に捕捉され、同時にトラップカラム２２では先に捕捉されていた成分に脱塩用移動相が供給されて脱塩処理が行なわれる。脱塩は、１次元目分析で使用された塩を含んだ移動相が満たされているトラップカラム及び流路を脱塩用移動相で置換することである。分析流路３６ではカラム５０を安定化させるために２次元目分析用移動相が供給される。

図３は脱塩処理が終わったトラップカラムの成分を分析する２次元目分析動作を行なうようにバルブ３４が切り替えられた状態である。２次元目分析用移動相はトラップカラム２２に供給され、トラップカラム２２に捕捉されていた成分が溶出して分析用カラム５０に送られ、分離されて検出器５２，５４で検出される。

分析が終わると、次にトラップカラム２０の脱塩処理が行なわれ、トラップカラム２２にはカラム１６が接続されて１次元目分離された成分が捕捉されるようにバルブ２４，２６，３４が切り替えられる。

このようにしてカラム１６で分離される成分が順次トラップカラム２０,２２に交互に捕捉されていき、各トラップカラム２０,２２では濃縮、脱塩及び溶出がこの順に繰り返されていく。しかも、一方のトラップカラム２０（又は２２）における濃縮動作と他のトラップカラム２２（又は２０）での脱塩動作又は溶出動作を同時に行なわせるように流路が切り替えられる。１次元目分析が終了するまでトラップカラム２０，２２の切り替えが続けられる。

図４は実施例を表わす。この実施例ではトラップカラムが３つになり、それらのトラップカラム６０，６２，６４が独立して動作を行なうことができるようにバルブ６６，６８，７０，７２により流路が接続されている。バルブ６６，６８，７０，７２は、６ポート２ポジションバルブである。

１次元目分離流路２のカラム１６の下流はバルブ６６に接続され、脱塩用移動相流路２８ａはバルブ６６に接続されている。脱塩用移動相流路２８ａは２種類の溶媒を混合して使用できるように移動相３０ａと３０ｂがデガッサ８を介してミキサー３１により混合され、送液ポンプ３２から供給されるようになっている。２次元目分析用移動相を供給する流路はバルブ６６に接続されている。これらの４つのバルブ６６，６８，７０，７２による流路切替え機構は、濃縮動作、脱塩動作及び溶出動作をそれぞれ異なるトラップカラム６０，６２，６４で同時に行なわせることができるように接続がなされている。

次に，この実施例の動作について説明する。図４はトラップカラム６０で濃縮、トラップカラム６２で脱塩、トラップカラム６４で溶出が同時に行なわれるように流路が接続された状態を示している。

図５はバルブ６６，６８，７０，７２が切り替えられて、トラップカラム６０で脱塩、トラップカラム６２で溶出、トラップカラム６４で濃縮が同時に行なわれるように流路が接続された状態を示している。

図６はバルブ６６，６８，７０，７２がさらに切り替えられて、トラップカラム６０で溶出、トラップカラム６２で濃縮、トラップカラム６４で脱塩が同時に行なわれるように流路が接続された状態を示している。

本発明の液体クロマトグラフは、化学、生化学、医薬、環境その他多岐にわたる分野において生化学分析や生体試料分析を含む化学分析全般に利用することができる。

参考例を示す流路図である。 参考例における１つの動作モードを示す流路図である。 参考例における他の動作モードを示す流路図である。 一実施例を第１の動作モードで示す流路図である。 同実施例の第２の動作モードを示す流路図である。 同実施例の第３の動作モードを示す流路図である。

符号の説明

２ １次元目分離流路
４，６ １次元目分析用移動相
８，４２ デカッサ
１０，１２，３２，４４，４６ 送液ポンプ
１６ １次元目用分析カラム
１８ インジェクタ
２０，２２６０，６２，６４ トラップカラム
２４，２６，３４，６６，６８，７０，７２ 六方バルブ
２８，２８ａ 脱塩用移動相流路
３６ 分析流路
５０ ２次元目分析カラム
５２ ＵＶ検出器
５４ 質量分析計

Claims (1)

1. 試料注入部から注入された試料を分離用移動相により分離カラムに導いて分離する１次元目分離流路と、
   ３つのトラップカラムと、
   分析用移動相を供給する分析用移動相流路と、
   前記トラップカラムに捕捉された成分を前記分析用移動相により分析カラムに導いて分析する２次元目分析流路と、
   脱塩用移動相を供給する脱塩用移動相流路と、
   一のトラップカラムに前記１次元目分離流路を接続し、他の一のトラップカラムに前記脱塩用移動相流路を接続し、残りの他の一のトラップカラムに前記１次元目分析流路を接続するとともに、トラップカラムとそれらの流路との接続を切り替える流路切替え機構とを備え、
   前記流路切替え機構は、前記３つのトラップカラムの一端と他端が接続される第１及び第２の２ポジションバルブと、
   前記１次元目分離流路、前記脱塩用移動相流路、前記分析用移動相流路が接続されるとともに一端が前記第１の２ポジションバルブと接続される３つの流路の他端が接続される第３の２ポジションバルブと、
   一端が前記第２の２ポジションバルブと接続される３つの流路の他端及び前記２次元目分析流路が接続される第４の２ポジションバルブと、
   前記トラップカラムでは前記１次元目分離流路を接続してその溶離成分を濃縮する濃縮動作、前記脱塩用移動相流路を接続した脱塩動作及び前記２次元目分析流路へ接続した溶出動作をこの順に行なわせ、かつ一のトラップカラムにおける濃縮動作、他の一のトラップカラムでの脱塩動作及び残りの他の一のトラップカラムにおける溶出動作を同時に行なわせるように前記流路切替え機構を制御する制御装置と、
   を備えたことを特徴とする２次元液体クロマトグラフ。

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